NO882469L - Fremgangsmaate for produksjon av proteiner ved bruk av induserbare ekspresjonssystemer i genetisk modifiserte eukaryote vertsceller formert in vivo. - Google Patents

Description

-i.

Foreliggende oppfinnelse vedrører biokjemisk fremstilling av proteiner som er av interesse ved bruk av genetiske konstru-er ingsteknikker og, mere spesifikt, ved å indusere uttrykking av gener som er av interesse i hensiktsmessige genetisk modifiserte eukaryote vertsceller.

Bruk av og fordelene ved å indusere uttrykking av gener under kontroll, bl.a., av varmesjokkekspresjonselementer for produksjon av genproduktene som er av interesse i forskjellige celletyper, har nylig vært beskrevet (se Internationale søknader PCT/EP86/00451 og EP 84 810 066,5; DREANO et al. Gene (1987) 49, 1-8).

Når det blir benyttet på et eukaryotisk ekspresjonssystem, har denne teknikken reelle fordeler idet at den har en effektiv, generell og sterkt induserbar karakter. Disse faktorene har stor interesse når det gjelder den kommersielle produksjon av proteinene som er av biologisk og farmasøytisk interesse, spesielt når disse proteinene er komplekse, modifiserte, ustabile eller når de er potensielt toksiske til cellen som produserer dem. Den økonomiske utføringen vil i stor grad avhenge av bruken av vert/vektor-modeller som har evnen til å sikre et høyt produksjonsnivå av helt kompetente proteiner, assosiert med billig cellevekst og proteinsrens-ing. Bruk av mikroorganismer som vertcelle-systemer har de-monstrert at den ideelle kvaliteten som er ventet fra et slikt system ikke finnes i en enkelt mikroorganismeart, og mere hensiktsmessig ekspresjonssystemer og vektorer er nødvendige. De fleste proteinene som er av terapeutisk interesse er utskilte proteiner, som ofte krever etter-translasjonsmodifikasjoner for aktivitet og immunologisk spesifisitet, og hvor slike modifikasjoner muligens mangler når translasjonen foregår i bakterier.

Utvikling av genetisk konstruerte eukaryote cellelinjer som inneholder rekombinante gener, innbefatter mest lovende mulighet til tross for det relativt primitive nivået av eukaryotisk cellekulturteknologi sammenlignet med de bakterielle systemene.

Til tross for at den nye utviklingen når det gjelder vevskultur, som benytter kjemisk definert media, står for et viktig gjennombrudd ved tilpassing av vevskulturfremgangsmå-ter til industriell produksjon, er det nødvendig med for-bedrede dyrkingsmåter for formering og massekultur av celler som er transformerte med genetisk konstruerte genekspre-sj onssystemer.

Noen av hovedproblemene assosiert med massekulturene er:

å oppnå et stort antall av celler (spesielt sterilitet,

materialer, kvalifisert personell, rom)

å redusere produksjonskostnadene, spesielt når det gjelder personell, men også når det gjelder kulturmedia som inneholder fetalt kalveserum (FCS kan representere

opptil 80$ av de totale produksjonskostnadene)

å rense de ventede proteinene som er av industriell interesse og spesielt når det gjelder utskillbare proteiner, å isolere disse fra hele suspensjonsmediumet som blir benyttet for celledyrking.

For å utvikle den induserbare ekspresjonen av genene som er av interesse inne i egnede vertsceller i en industriell skala, har foreliggende oppfinnere avdekket fremgangsmåten beskrevet i innlemmet krav 1.

Kort forklart, blir hensiktsmessige eukaryote vertscellelin-Jer som har evnen til å danne svulster når de blir inokulert i dyr med immunologiske forstyrrelser, blir transfektert med nukleinsyrekonstruksjoner som inneholder minst ett gen som er av interesse under kontroll av en stress-induserbar promoter. Med "normale" celler, blir et transformerende gen, f.eks. et onkogen, også tilsatt ved ko-transfeksjon for å tillegge cellene en uhemmet formeringskapasitet. Når de transformerte cellene som har evnen til å uttrykke nevnte gen som er av interesse ved induksjon blir innokulert til dyr med limnolo-giske forstyrrelser, hvorpå de blir formert i form av svulster som utvikles av dyrene. Det var overraskende at til tross for at cellene inneholdt transkripsjonsenheter„som ikke kommer til uttrykk under normale vekstbetingelser, var formeringshastighetene veldig høye (omtrent 10<5->10<6>ganger den inokulerte mengden i løpet av 1-2 uker) uten celledegene-rasjon eller tap av evnen til å uttrykke genet av interesse under stress. Denne fremgangsmåten er også spesielt nyttig for å oppnå rask og relativt billig identifikasjon og testmengder av konstruerte proteinvarianter til normale proteiner.

En bør merke seg at formering av visse cellelinjer ved tumortransplantasjon i varmblodige dyr ikke i seg selv er nytt. GB-A-2.083.826 (HAYASHIBARA) beskriver bl. a. formering av insulinproduserende, humane onkogene celler ved transplantasjon inn i varmblodige dyr så som nakne mus eller immunosuppresserte pattedyr (rotter, hamstere, osv.) og fugler. Cellelinjetypene som er innbefattet i denne tidligere typen innbefatter lett bevarende, stabile cellelinjer så som insuloma (svulst i hormonproduserende organer), lungevevs-kreft, lymfoblast eller hybridomaceller. Ingen korresponder-ende formering av celler som inkorporerer gener dominert av varmesjokkelementer er tidligere blitt rapportert, som foreliggende oppfinnere vet om. Den raske in vivo-formeringen av celletypene som her er involvert, dvs. inneholdende et rekombinant stress-indusertbart ekspresjonssystem, i veldig stort utbytte, uten produksjon av uønskede inhiberende produkter og fullstendig bevaring av varmesjokk induserbar-heten, står for et meget viktig teknisk steg vis-a-vis tidligere teknikker.

I korthet, innbefatter eksperimentene som støtter fremgangsmåten i kravene følgende fremstillinger: Gener som koder for produkter som er av interesse (hormoner, enzymer og andre proteiner som er av interesse for diagnos-tiseringsanvendelser og farmasøytiske anvendelser) ble plassert inn i egnede vektorer under transkripsjon- og translasjonskontroll av varmesjokk-promoterelementer^av eukariotisk opprinnelse (human, Drosophila, osv.)- Eventuelt, var også andre forløper- eller etter-translasjonssekvenser og varianter derav også introdusert inn i de aktuelle nuklein-syrene, hvor alt dette ble utført ved bruk av vanlig rekombinante DNA-teknikker. Mesteparten av dette er blitt beskrevet i en tidligere søknad (PCT/EP86/00451) som er inkorporert heri ved referanse.

Deretter, ble egnede vertceller transfektert med rekombinante DNA-er inbefattende et hybrid gen av interesse under kontroll av en hsp-70-sekvens og et onkogent transformerende gen. Når svulstvertsceller ble benyttet, var det ikke nødvendig med noe tilleggsonkogen for å fremme formering. I kontrast til dette, når vertsceller sås om NIH-3T3 ble benyttet, ble ko-transfeksjon utført ved bruk av en onkogen transformerings-sekvens av cellulær eller viral opprinnelse. Deretter, etter videre in vitro-ekspansjon og testing for ekspressjon av genet under varmesjokket, ble de transformerte cellelinjene injisert inn i dyr med immunologiske forstyrrelser (immuno-deficient), bl.a. nakne mus eller immunonedtrykte rotter og svulster ble latt vokse til omtrent lO^-lO<10>celler.

Svulstene ble fjernet, hakket og cellene ble dissosiert, bl. a. trypsinert og plassert inn i kulturmedia hvorpå de deretter kunne blitt stresset. Genet av interesse ledet av et varmesjokk-kontroll-elemerrt ble indusert, og cellene uttrykte proteinet av interesse. Produktet ble deretter samlet ved bruk av vanlige måter, f.eks. affinitetskromatografi. Detaljer av de forskjellige fremstillingene ifølge foreliggende oppfinnelse er beskrevet heretter og i kravene. Disse detaljene vil lettere bli forstått med referanse til vedlagte figurer, en liste som er oppført nedenfor.

Kort beskrivelse av vedlagte figurer ( fig. 1- 8 og 11- 13 er f otograf ier). Fig. 1 viser en naken mus som bærer en subkutan (s.c.) underhudsvulst produsert ved cellelinje (Cl.6) injeksjon. Fig. 2 viser en sencar-mus (Swiss-avledet) med en intramuskulær i.m.) svulst indusert ved transplantasjon av Cl.6 svulstceller fra nakne mus. Fig. 3 viser en cyklosporin-immunosuppresert rotte med en s.c. svulst indusert ved transplantasjon av Cl. 6 celler fra en naken mus. Fig. 4 viser det histologiske utseende av en s.c. svulst indusert av Cl.6 celler injeksjon i nakne mus. Fig. 5 viser en sterk forstørring av s.c. svulsten vist i fig. 4. Merk den store utbredelsen av den mitotiske indeksen. Fig. 6 viser en s.c. svulst Indusert av Cl.6 celleinjeksjoner i nakne mus. Merk de vaskulære områdene. Fig. 7 viser en lungesvulst (fibrosarcoma) indusert ved intratrachealinstillasjon av HBN2-celler i en naken mus. Fig. 8 viser en stor forstørrelse av den indre lungesvulsten vist i fig. 7. Fig. 9 representerer skjematisk konstruksjonen av plasmid pl7HBN. Fig. 9a representerer plasmid 17hGH dhfr (Dreano et al. Gene, i press) inneholdende et hsp70-hGH-hybrid-gen og musedihydrofolatreduktasegenet under kontroll av SV40 tidlig promotersekvens, og terminert av SV40 terminatorsekvensen. Fig. 9b representerer plasmid pV69 (Meneguzzi et al. 1984, EMBO J., 3; 365-371) inneholdende neomycin resistensgenet under kontroll av herpes simplex tymidin klnasepromoter og termlnator, og det 5, 4kb-bov.tn-papilloma-virus subgenome f ragmentet. Fig. 9c står for plasmid pl7hGH NEO (PCT/EP86/00.451 ) inneholdende hsp70-hGH-hybridgenet og neomycinresistensgenet under kontroll av SV40 tidlig promotorsekvens og terminert med SV40 termlnatorsekvensen. Fig. 9d står for plasmid phGH BPV som resulterer fra legeringen av et Hindlll-BamHI-fragment avledet fra pl7hGH dhfr og et 7,5 Kb -fragment som resulterer fra spalting av pV69 med Hind III og en delvis spalting med BamHI. Fig. 9e står for plasmid pl7K NEO som resulterer fra legering av et 1,8 Kb Hind 111-BamHI-fragment avledet fra pV69 (Hin-III-ekstremiteten er blitt fylt med DNA-polymerase I (stort fragment); og et 3,4 Kb-fragment resulterende fra spalting av pl7hGH NEO med PvuII og BamHI. Fig 9f representerer plasmid pl7HBN som resulterer fra ligeringen av et HindiII-BamHI-fragment avledet fra pl7K NEO, og et 6,8 Kb-fragment som resulterer fra spalting av phGH BPV med Hindlll og en delvis spalting med BamHI. Fig. 10 er en nøkkel til symbolene som er benyttet i fig. 9 for å definere de forskjellige DNA-sekvensene som er involvert. Den omtrentlige lengden (i base-par) til slike sekvenser i plasmidene.som er skjematiserte i fig. 9, er gitt i tabell I nedenfor. Fig. 11 viser Cl.6 svulstceller etter dissosiasjon og inokulering i en Petri-skål inkubert i serumsupplementert medium. Fig. 12 viser Cl.6 svulstceller etter dissosiasjon og

inokulering i en 1 liter biofermentor med inkubering i serumfritt medium.

Fig. 13 viser Cl.6 svulstceller etter dissociasjon og inokulering i en 2 liter biofermentor med inkubasjon i serumfritt medium i nærvær av 3g/l cytodeks 1 mikrobærere.

For å inneholde genet med rekombinant DNA-konstruksjonene, må egnede cellelinjer bli valgt. Cellelinjer (NIH3T3) som produserer høye nivåer av humant veksthormon (hGH) under varmesjokk-kontroll, er det beskrevet av Dreano et al., (Gene, (1987) 49, 1-8). Kort beskrevet, kan en transformert 3T3 musecellelinjeklon 6 (Cl.6) utskille 2 til 5 pg hGH pr. IO<6>celler over en tidsperiode på 20 timer etterfulgt av et 20 timers varmesjokk ved 42°C. Denne konsentrasjonen er 1200 ganger hGH-konsentrasjonen som blir målt I mediumet i til ikke-varmebehandlede C1.6-celler. Disse cellene kan i tillegg bli benyttet for gjentatte induksjonscykluser og de var der-for veldig egnede for bruk i foreliggende oppfinnelse.

Vi rapporterer nedenfor resultatene fra transplantasjonsfrem-gangsmåtene til tre genetisk modifiserte musecellelinjer: klon 6 (Cl.6), HBN2 og klon 18 (Cl.18). Disse tre cellelinjene uttrykte det humane hsp70-hGH-hybridgenet, og Inneholder følgende gener i tillegg; i Cl.6, det humane Harvey c-ras-onkogenet (Tabin et al. 1982, Nature, 300; 143-149); i HBN2 bovin papilloma virus (BPV) subgenomiske fragmentet, og et neomycinresistent gen (beny t tet for G418 reslstensseleksjon), og i Cl.18 neomycinresistensgenene (Cl.18 blir benyttet som en kontroll). Andre gener som er av interesse kan også bli satt under kontroll av hsp70 promotersekvensene i lignende DNA-konstruksjoner og uttrykt på lignende måte. Slike gener som er av interesse innbefatter bl.a. virale proteiner, hormoner, enzymer, blodproteiner og andre.

Når det gjelder varmesjokk-kontrollsekvenser, er det klart at andre varmesjokk-kontrollelementer kan bli benyttet i steden for sekvensene som er nevnt i de spesifikke eksperimentene som illustrerer foreliggende oppfinnelse. Genetisk modifiserte varianter tilveiebragt ved nukleotiddelesjon, mutasjon og insersjon, som beskrevet i vår søknad PCT-/EP86/00451, er også egnede.

Transplantering av de to første cellelinjene inn i nakne mus, induserte svulst i injiserte dyr. Etter proteolytisk dissosiasjon, eller behandling med kollagen kunne svulstcellene produsere, etter varmeinduksjon, samme mengden hGH som foreldrecellene. Ved bruk av denne fremgangsmåte kunne vi tilveiebringe omtrent 10lu svulstceller pr. svulst. Vi viste til slutt at disse cellene fra svulstene i dyrene, lett kan bli dyrket på cytodeks mikrobærere ill eller 2 1 bioreak-torer, og i tillegg, i kjemisk definert media serumfri medium (SFM), eller serum og proteinfritt medium (SPFM) (se Chesse-beuf og Padieu)., PCT/84/901363 , 6 ; FR-A-83/04843 ). Gjentatt varmeregulert produksjon av hGH ble igjen tilveiebragt.

1. Klon 6

BALB NIH-3T3-celler (tilveiebragt fra ATCC-organisasjonen) ble ko-transfektert med plasmid pl7hGHdhfr, se fig. 9a, som bærer det humane veksthormonet (hCH) som styres av det humane varmesjokkprotein 70 (hps70) promoter (plasmid pl7hGH dhfr er beskrevet i PCT/EP86/00451 ) , og med et plasmid som bærer det humane c-ras-onkogen. To uker senere ble foci isolert, dyrket og analysert for hGH-produksjon. Klon 6 ble funnet å utskille 3 jjg hGH pr. IO<6>celler i løpet av en 15 timers periode etter en enkelt varmebehandling på 2 timer ved 42"C.

1. 1 Transplantasjon inn i nakne mus

Spontant transformerte 3T3-celler injisert inn i nakne mus har evnen til å indusere svulstdannelse (Rubin og Arnstein, 1982, Cancer Res., 300; 143-149, Rubin 1984, J. Nati. Cancer Inst., 72, 375-381).

1. 1. 1 Subkutan ( underhuds) transplantasjon:

10^ celler i 0,1 ml styrkingsmedium uten serum ble subkutant injisert i det dorsale (vendende mot ryggen) område på nakne mus. Den første svulsten var klart synlig- 3 uker etter inokulering (fig. 1) når svulsten hadde en diameter på 20 mm (med vekt på omtrent 3g), ble den skåret ut. En del av denne første generasjonssvulsten (betegnet Gl/n) ble hakket i styrkingsmedium og en del ble resuspendert for å Inokulere en monolagskultur for påfølgende varmesjokk, og den andre delen ble reinjisert subkutant inn i andre nakne mus (for å produsere G2/n), deretter ble den gjenværende delen av svulsten fiksert med formaldehyd for histologisk undersøking. Disse svulstcellene hadde en stor evne til å feste seg på plastskå-ler. 30 min. etter såing i fullstendig medium var mesteparten av cellene festet, og presenterte et fibroblastaspekt. Etter en natt, dekket cellene skålen og bare noen få døde celler ble observert (fig. 11). Etter varmebehandling av svulstcellene (fra Gl/n) i cellekultur, utskilte disse 2,5 til 5 jjg hGH pr. 10^ celler; dette er innenfor det samme produksjons-området som for de opprinnelige Cl.6 cellene. I tillegg utskilte svulstbiter (0,5 til lg) etter varmebehandling, 20 til 100 pg hGH i suspensjonsmediumet. Identiske eksperimenter ble utført i celler fra svulster som ble sendt opptil 8 ganger i nakne mus (G8/n). Tabell II (se eksperimentell del) viser at varmeregulert produksjon innenfor Cl. 6 blir opprettholdt ved en konstant hastighet i løpet av 24 generasjoner i nakne mus, og 8 generasjoner i sencar-mus; med HBN2, som er en annen klon som blir beskrevet nedenfor, ble også et lignende resultat observert med cellene fra de første 2 generasjonene i nakne mus. Etter suksessive subkutane overføringer inn i nakne mus, ble tidspunktet for begynnende svulstdannelse redusert til bare to uker for dannelse av en 30 mm svulst, dette skjedde når svulstcellene kom fra en annen naken mus, sammenlignet med 4 uker som var nødvendig for å tilveiebringe svulster som kom fra cellekulturer. Det histologiske utseende (fig. 4 til 6) til de subkutane svulstene forble den samme (et fibrosarkom med en høy mitotisk indeks) i løpet av over-føringen til nakne mus. I svulster som hadde en diameter opp til 30 mm og som ble laget i nakne mus med Cl . 6, ble ikke noe særlig svulstcelledød observert. Periferien av svulsten var veldig irrigert av blodkapillærer (fig. 6).

1. 1. 2 Intraperitoneal Injeksjon

Cl.6 celler, avledet fra vevskultur (IO<6>celler), ble også Injisert intraperitonealt inn i en naken mus. Tre uker etter injeksjon, når en svelling av magen ble observert, ble musen ofret. Ved nekrose, ble svulster med en markert bukhulevæske observert, og svulstmetastaser ble funnet i de peritoneale lymfekjertlene og rundt nyrene, og i leveren. Mikroskopisk var denne svulsten lik svulstene tilveiebragt ved subkutan injeksjon av Cl.6 celler.

1. 2 . Transplantas. 1 on inn i sencar- mus

Sencar-stammen av mus (Swiss-avledet stamme, som forklart i den eksperimentelle seksjonen), som ikke genetisk har immunologiske forstyrrelser, ble benyttet som en vert for genetisk modifiserte transformerte celler, som en test på om disse cellene kan vokse i normale mus, etter tidligere overføring til nakne mus. Et forsøk på å danne svulster i sencar-mus rett fra cellekulturer var ikke vellykket. Men, C1.6-celler tilveiebragt etter en første generasjonssvulst i nakne mus, (Gl/n), injisert subkutant (s.c.) eller intraperitonealt (i.p.) inn 1 sencar-mus, dannet respektivt s.c. og i.p. svulster i sencar-mus (betegnet Gl/s/sc og Gl/s/ip fig. 2). Dette eksperimentet ble gjentatt med. en andre generasjonssvulst i nakne mus (G2/n) som, injisert s.c. inn i en sencar-mus, også dannet en s.c. svulst i sencar-mus. En direkte overføring av Cl.6 svulster fra sencar til sencar var også vellykket siden en i.p. svulst i sencar-mus (Gl/s/ip) ble transplantert inn i flere andre sencar-mus ved s.c, i.p. og intramuskulær (l.ni.) veier, for å danne G2/s-svulster. I.m. og s.c. svulster er blitt observerte og sencar-transplantasjoner kan fortsettes. Den histologiske strukturen til svulstene i sencar-mus ligner de som blir indusert i nakne mus.

1. 3 Transplantasjon inn i rottene

For å bekrefte om xenografter mellom artene av genetisk modifiserete, transformerte celler kunne bli dannet, ble svulster som vokste i nakne mus (G4/n) subkutant transplantert (stykker på omtrent 75 mm<3>) inn i tre albino-rotter. En rotte fikk cyklosporin for immunosuppresjon (se ekperimen-tell del), de to andre rottene fikk ikke noen medikamenter. To uker etter transplantasjonen, var svulsten gått tilbake i to normale rotter, mens en stor svulst (12 cm diameter etter 3 uker) ble utviklet i cyklosporin-immunosuppresert rotte (fig. 3). Ved nekropsi ble det oppdaget at denne svulsten bestod av et stort nekrotisk område omgitt av et lag på omtrent 2 cm av levende svulstceller (totalt omtrent 40 g). Den histologiske strukturen var igjen den samme som en fibrosarkom, som var lik svulstene indusert i mus tidligere. Varmeindusert produksjon av hGH fra cellen til denne svulsten var lik som fra nakne mus-svulster. Immunosuppreserte dyr er interessante verter for voksing av genetisk modifiserte celler og, i tilleg til rotter, er også andre varmblodige dyr egnede.

2 Klon HBN 2

HBN2 er også en klon avledet fra NIH-3T3-cellei injen, med inkorporering av plasmid pl7HBN, hvor konstruksjonen er beskrevet i fig. 9a-9f, inneholdende 3 transkrjLps j onsenheter: (1) hGH-genet fra den humane hsp70-promoteren, (2) neomycinresistensgenet under kontroll av herpes simplexvirus tymidinkinasepromoter (benyttet for celleseleksjon via G418-resistens) og (3) et subgenomt fragment av bovin papilomavi-rus som bærer sekvenser som er ansvarlig for opprettholdelse av multikoplplasmider i stabil form i musefibroblaster (Meneguzzi et al., 1984, EMBO J., 3~, 365-371 ).

2. 1 Transplantasjon inn i nakne mus

To typer transplantering av HBN2-celler fra kultur (ved bruk av IO<6>celler i 0,1 ml kulturmedium uten serum) ble" utført. I et tilfelle ble cellene injisert subkutant i poten til nakne mus. En måned senere ble vekst observert, denne første generasjonssvulsten (HBN2/Cl/n) ble tatt, kuttet med saks, og svulstceller ble Injisert inn i ryggen på nakne mus for å danne den andre generasjonen av svulster (HBN2/G2/n).

I det andre tilfelle ble IO<6>HBN2-celler i 0,5 ml medium uten serum introdusert gjennom luftrøret inn i lungene til en naken mus. Når dyret ble obdusert 2 måneder senere, ble en stor lungesvulst (10 mm diamter) som invaderte en lungelapp funnet. Svulsten (HBN2/Gl/s/it) ble undersøkt i mikroskopet og ble funnet å være et sarkom (fig. 7 og 8). Igjen var celler isolert fra svulsten avledet fra klon HBN2 stabile, og tilveiebragte de ønskede proteinene i et høyt utbytte under varmeinduksjon i kulturmediumet. (se tabell III).

3. Klon 18 (kokntroll)

NIH-3T3-celler ble ko-transfektert med plasmid pl7hGH dhfr sammen med plasmidbærende neomycinresistens-genet under kontroll av tidlig SV40-promoter (Southern og Berg 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1; 327-431). To uker senere ble G418-resistent (200 pg pr. ml suspensjonsmedium) kloner isolert og ekspandert. Klon 18 ble funnet å skille ut omtrentlig 1,5 jjg hGH pr. 10^ celler etter varmebehandling. To nakne mus ble injisert s.c. i fotpoten som beskrevet ovenfor. Tre måneder senere hadde ingen svulst vokst ved injeksjonsstedet, som indikerte at transplantasjonen ikke var vellykket.

4. Svulstceller som ble latt vokse på Petri- skåler i serumfritt media

Svulstceller (Cl.6) ble dissosiert ved påfølgende trypsin-behandlinger; en porsjon fra hvert trypslneringssteg ble inokulert på Petri-skåler i tre forskjellige typer media: - serum-supplemetert medium (SSN) bestående av Williams'E-oppløsning pluss 5$ fetalt kalveserum og 5$ nyfødt kalveserum (se fig. 11). - serumfritt medium (SFM) bestående av Wl11lams'E-medium plus 4 g/l bovin serumalbumin, og 7,6 pmol /l av en blanding av 6 frie fettsyrer (FFA). Disse seks FFA var uunnværlige hår det gjelder å forsikre Krebs-cyklusfunksjonene som tilveiebringer det nødvendige acetyl-CoA, som er nødvendig i fravær av serumlipider,

- serum og proteinfritt medium (SPFM) bestående av Williams ' E-medium og inneholdende 50 mg/l dekstran og 7,6 pmol/1 6 FFA. Etter dyrking ble cellene som vanlig utsatt for stress. Resultatene er ført opp i tabell II (se eksperimentell del).

Fordelene forbundet med bruk av SFM og SPFM er:

1) Lett seleksjon av et basalt syntetisk medium for optimal vekst eller cellefunksjon 2) reduksjon av kostnadene ved eliminering av bruk av fetalt kalveserum 3) Bruk av et definert kulturmedium som eliminerer de mange kjente og ukjente komponentene i serum 4) Supplementering med kjente mengder av effektorer og inhibitorer 5) forenkling av ekstraksjonsfremgangsmåten spesielt for ut-skylte proteiner slik som hGH

6) eliminering av de ytre effektene av serum.,

7) enkel formulering og bruk av et selektivt media

8) eliminering av mange forurensende stoffer bundet til albumin 9) fortsettelse av fundamental forskning på fenotypisk ekpresjon av diploide cellelinje 10) Innovasjon i anvendt forskning av ny syntetisk basal medium som Imøteser WHO- og FDA-kravene når normale eller rekombinante eukaryotiske celler blir dyrket for produksjon av terapeutisk eller biologisk aktive molekyler for. human administrasjon. Disse fordelene er beskrevet av Chesebeuf og Padleu (W084/03710 ). Etter reinokulasjon på Petri-skåler, hadde Cl. 6 akkurat den samme oppførsel 1 SFM og i SPFM som i SSM, dvs. veldig rask festing, dannelse av et fibroblastmønster og fullstendig kolonisering på overflaten av skålen.'-

Svulstcellene var lik foreldre Cl.6 cellene, uten noen synlig forrensende celler. Ved bruk av SFM og SPFM kulturmedium for dyrking av cellene i henhold til foreliggende fremgangsmåte var teknisk og økonomisk fordelaktige.

5. Cl. 6 celler i en biofermentor

5. 1 Blofermentator med mikrobæreren

Etter hvert trypsineringssteg ble porsjoner på omtrent 3,10^ celler introdusert inn i 3 biofermentatorer inneholdende respektivt 250 ml av en av hver av de 3 forskjellige media, sammen med 3 til 5 g/l cytodeksmikrobærere. 12 timer etter inokulering, var mikrobærerene fullstendig dekket med svulstceller. Trypan blåfarving indikerte tilstedeværelse av mindre enn 3$ døde celler i et hvilket som helst medium (fig. 13). Celler kan opprettholdes i biofermentorer for mere enn 23 dager og blir i løpet av denne perioden utsatt for flere 4 timers behandling ved 42°C. Produksjon av hGH ble oppdaget ved bruk av en RIA (Radioimmunanalyse) fremgangsmåte. Tabell III (se eksperimentell del) viser at cellene skyller ut hGH etter hver varmebehandling; produksjonen i SSM var mere viktig enn i SFM (se fig. 12) og enda viktigere enn i SPFM.

Det er interessant å merke seg at i SSM biofermentoren, ble omtrent 3 mg hGH utskilt inn i mediumet. En bør merke seg at disse cellene kom fra mindre enn 1 fullstendig svulst, og at en varmebehandling kunne bli benyttet daglig.

5. 2 Blofermentator uten mlkrobærere

Dissosierte svulstceller kan også opprettholdes i live i blofermentator uten mlkrobærere selv. om betingelsene 1 disse er mindre ønskelige. Det ble bl.a. observert at cellene ennå var i live 5 dager etter inokulasjonen.

EKSPERIMENTELLE DETALJER

Fremgangsmåten for å konstruere P17HBN ( fig 9)

Plasmid pBPV hGH : pl7hGH dhfr (Dreano et al., ibid) hie spaltet med Hindlll, og deretter delvis med Bglll. Et 1,4 kb-fragment inneholdende den humane hsp70 promoteren, hGH-genet og SV40-termineringssignalet ble ekstrahert fra lavt-smeltende agarose (Sigma, type VII). Plasmid V69 (Meneguzzl et al.,ibid) ble spaltet med Hindlll og delvis med BamHI, et 7,6 kb fragment inneholdende plasmid vektorsekvenser og 5,4 kb bovinpapillomavirus (BPV) subgenome fragmentet ble Isolert og ligert med fragmentet ovenfor.

Plasmid pl7K NEO: pV69 ble spaltet med Hindlll, behandlet med det store DNA plymerasefragmentet og spaltet med BamHI. Et 1,8 kb resulterende fragment inneholdende neomycinresistensgenet kontrollert av herpes simplex tymidln kinasetran-skripsjonssignalene (promoter og termlnator), ble renset og lignert til et PvuII BamHI-renset fragment fra pl7hGH NEO inneholdende det humane hsp70 promoter og pBR322 avledede sekvenser.

pl7HBN : pl7K NEO ble lineærisert ved spalting med Hindlll og BamHI. Dette fragmentet inneholdende hsp70 promoter og neomycinresistens-transkripsjonsenheten, ble ligert med et 6,8 kb fragmemnt fra pBPV hGH (tilveiebragt ved delvis spalting med Hindlll og en delvis spalting med BamHI) Inneholdende hGH-genet, SV40 termineringssignaler, og det BPV subgenome fragmemntet.

Resulterende plasmid pl7HBN inneholder tre fullstendige "transkripsjonsenheter" : det humane hsp70 -hGH-hybridgenet med SV40 termlnator det neomycinresistense- genet med TK transkripsjonssignaler

- "det BPV-subgenome fragment"

2. Fremgangsmåte benyttet, for å tilveiebringe cellelinje

2. 1 Seleksjon via fokusdannelse

Celler ble ko-transfektert rned pl7hGH dhfgr. (Dreano et al. 1986 ) og pEJ (Tabin et al. 1982, Nature 300, 143-149 ) ved bruk av CaCl£-fremgangsmåten (Graham and van der Eb, 1573, Virol, 52, 456-467 ). Etter to uker ble kloner som hadde evnen til fokusdannelse isolert og formert. 10^ celler av hver klon ble sådd på 20 cm<2>skåler, og etter 24 t i kultur, ble de varmebehandlet i 2 timer ved 42°C, og deretter inkubert ved 37°C i 15 timer. Klon 6 produserte 3 pg hGH pr. IO<6>celler under disse varmesjokkbetingelsene.

2. 2 G418 Seleksjon

Celler ble ko-transfekter med pl7hGH dhfr og pSV2 NEO (Southern og Berg, 1982 J. Mol. Åppl.Genet. 1, 327-341), eller de ble transfektert med pl7HBN ved bruk av CaCl2-fremgangsmåten. Etter to uker med dyrking i fullstendig suspensjonsmedium, inneholdende 200 mg G418 (GIBCO), ble synlige resulterende kloner observert etter 2 uker, de ble isolert og analysert videre som ovenfor. Cl.18 og HBN2 ble funnet å utskille respektivt 1,4 og 0,7 pg hGH pr. IO<6>celler ved induksj on.

3. Eksperimenter med bruk av mus og rotter

3. 1 Genetisk modifiserte celletransplantasjoner inn i nakne mus .

Nakne (nu/nu) mus med en alder på 4 til 6 uker, fra Iffa-Credo (L'Arbresle, Frankrike) ble oppbevart i Macrolon-bur med et dekkende filter.og plassert i et luft-fi 1trert bur. De mottok autoklavert mat og normalt springvann etter behov.

Porsjoner på 10^ genetisk modifiserte celler ble trypsinert,. skylt to ganger i Dulbecco's modifiserte Eagle's medium uten serum og resuspendert I omtrent 0,1 ml av det samme mediumet for intramuskulær (i.m.), intraperitoneal (I.p.) og subkutane (s.c).injeksjoner, og I 0,5 ml for inn i luftrøret instilla-s j on.

3. 2 Transplantasjon fra nakne mus til nakne eller til sencar- mus

Klon 6 celler, s.c. transplantert inn i nakne mus, utviklet s.c. svulster. Når en svulst oppnådde en størrelse på 20 mm i diameter (omtrent 4 uker etter inokulering), ble musen ofret og svulsten (omtrent 3g) ble skåret ut, hakket i kulturmedium uten serum, og en del av den hakkede svulsten (1/10) ble reinjisert inn i nakne eller sencar-mus.

Battelle-Geneva driver oppdrett av sencar-stammemus, og albinomus avledet fra Swiss-mus ved seleksjon for dennes sensitivitet til hudkarsinogener. (sencar resulteres fra "ømfintlig til karsinogener"). I motsetning til de nakne mus, er denne musestammen ikke genetisk immunodeprivert.

3. 3 Transplantasjon inn i rotter

Stykker på omtrent 75 mm<3>av en Cl.6 svulst, som var utviklet i nakne mus (4.generasjon), ble subkutant transplantert inn i Spraque Dawley albino-rotter (IFFA-CREDO, Frankrike). Transplantasjonen ble utført i 3 rotter; 2 normale rotter, og en rotte som var kjemisk immunosuppressert, ved ti daglige s.c. injeksjoner av 60 mg/kg cyklosporin (Sandoz, Bennet et al., Cancer Res., 45, 4963-4969).

3. 4 Histologi

Når en svulst ble tatt for retransplantasj on, ble en del plassert i en fikseringsoppløsning (10$ buffret formalin) deretter behandlet, og deler ble farvet med hemalin-floksin-saffron for mikroskopiske observasjoner som beskrevet i M. Gabe (1968), Technique Hlstologiques Ed. Masson et Cie, Paris. 4. Detaljert fremgangsmåte for å overføre svulstceller fra mus til biofermentorer.

4. 1 Beskrivelse av de tre kulturmedlumene

Sammensetningen av de tre kulturmediumene benyttet i denne seksjonen er:

- serumsupplementert medium (SSM) bestående av Williams E medium (Gibco) plus 5$ fetalt kalveserum (FCS) og 5$ nyfødt kalveserum (begge fra Boehringer). - serumfritt medium (SFM) bestående av det samme mediumet, med tilsetting av 4 g/l bovin serumalbumin (BSA) fraksjon V (Sigma) (ekvivalent til 10$ FCS) og 7.6 p mol/l av en blanding av 6 langkjedede frie fettsyrer (FFA) i molare proporsjoner som ligner det som er tilstede i rotteplasma (med unntagelse av større mengder cls-llnolensyre) dvs. palmitinsyre 31,0$, cis-palmitolensyre 2,8$, stearlnsyre 11,6$, cls-oleinsyre 13,4$, cis-linolensyre 35,6$, cis-linolensyre 5,6$ (Sigma). - serum og proteinsyrefrittmedium (SPFM) bestående av det samme mediumet inneholdende 50 mg/l 2,10^ dalton dektran (Pharmacia) som var like effektivt som 4 g/l BSA for å oppløse 7,6 jjmol/1 6 FFA. Hvert medium Inneholder 50 pg/ml gentamicin (gentalin, Unilabo) som antibiotika. 4. 2 Overføring av svulstceller fra mus til blofermentorer Musen ble ofret, huden ble kuttet og svulsten ble lett ekstrahert. Etter kutting med saks, ble svulstfragmentet overført til en trypsineringsflaske på 50 ml, tilknyttet en magnetisk rører. Til dette ble et likt volum av en oppløsning fortynnet 3 ganger med trypsinskyllemedium 1:250 tilsatt (ekvivalent til trypsin som hydrolyserer 250 ganger dets vekt av kaseln) tilveiebragt fra Microbiological Associates Company, Bethesda, MD, USA. Den ble omrørt 1 10 min. ved 100 rpm, ved 37°C, deretter ble cellesuspensjonen dekantert Inn i "Ham F10 medium" avkjølt på is (2 volum medium pr. cel-levolum) og ble sentrifugert ved 30 g. I parallell, ble trypsineringsfremgangsmåten omgjort i flasken. Den sekven-sielle spalte med trypsin var gjentatt helt til dissosiasjonen var fullstendig, generelt 10 til 13 ganger. Etter hvert sentrIfugeringssteg, ble cellene suspendert 1 omtrent 4.3 ml kulturmedium. 1/10 ble overført til en 20 cm<2>Petri-skål (Falcon), og 9/10 inn i en 1 liters biofermentor (Techne, Cambridge, U.K.). Etter noen trypsineringssteg var trypsinoppløsningen ikke lenger fortynnet. I en annen fremgangsmåte, ble sammenlignbar dissosiasjon tilveiebragt ved bruk av en kollagenaseoppløsning (Boehringer, 0,55 g/l).

Når dissosiasjonen var fullstendig, ble suspensjonsmedium (SSM, SFP eller SPFM, qsp 250 ml) cytodeks mlkrobærere (Pharmacia France, F78340, 3 til 5 g/l) tilsatt. Mediet ble behandlet med C02ved bobling av en 5$ C02/luftblanding i omtrent 10 min.

Til slutt ble cellene inkubert ved 37°C overnatt. Mediet ble byttet og biofermentorene ble plassert i et 42°C vannbad i 3 eller 4 timer etterfulgt av en inkubasjonstid på 20 timer ved 37°C. Mediet ble fjernet, og erstattet med friskt medium før varmebehandling eller ikke som beskrevet i tabell II.

Tabell II: kvantitering av hGH produsert av Cl.6 celler etter overføring i nakne eller sencar-mus. Svulster ble skåret ut fra mus, klippet med saks, og behandlet med trypsin. Dissosierte celler ble sådd på 20 cm<2>Pateri-skål (Falcon) med 10^ celler i 5 ml Dulbecco's modifiserte Eagle's medium supplementert med 10$ fetalt kalveserum. Neste dag ble cellene varmebehandlet i 1 til 2 timer ved 42° C, eller Ikke be-handlede (kontroller). Etter 20 timer ved 37°C, ble hGH utskilt i prøvemediet kvantitert ved bruk av et hGH RIA kit fra Cambridge Inc.,Mass. USA. Antallet 1 celleldentifika-sjonskoden indikerte svulstdannelsesmengden (se seksjon 1.1.1).

Tabell III : hGH utskilling i transformerte NIH 3T3-celler opprettholdt i en biofermentor. Hver biofermentor ble tilført 2,2 10^ svulstceller 1 et volum på 250 ml av hver av de tre kulturmediene beskrevet før, inneholdende 3 til 5 g/l cytodeks mlkrobærere. Cellene ble varmebehandlet, noen dager etter inokulering (se første kolonne i tabell III), i 3 til 4 timer ved 42°C og holdt ved 37°C i 20 timer deretter og, til. slutt satt i friskt medium. CO2konsentrasjonen i mediumet ble opprettholdt ved bobling abv en 5$ C02i luftblanding inn i mediumet. 12 timer etter inokulering var mikrobærerne dekket med svulstceller. Trypanblå farve Indikerte tilstede værelse av mindre enn 3$ døde celler 1 de forskjellige medlene som ble benyttet.

I eksperiment 2, ble hver biofermentor tilsatt 50.IO<6>svulstceller i et volum på 100 ml av det mediumet som er vist nedenfor inneholdende 2 g/l citodeks mlkrobærere. Cellene ble varmebehandlet i 2 t ved 43°C, holdt ved 37°C i 24 t til, og deretter satt i friskt medium. Suspensjonsmediumet ble analysert for hGH tilstedeværelse ved RIA (tilveiebragt av Institut Pasteur Production), eller EIA.

Cellene ble opprettholdt i Williams' E medium (eksperiment 1) eller i William's E/HAM F-10 (50:50, v/v) (eksperiment 2) supplementert med:

SSM; 5$ fetal kalveserum og 5$ nyfødt kalveserum,

- SFM; 4 g/l bovinserumalbumin og 7,6 pmol/l seks FFA (frie f ettsyrer) - SPFM; 50 mg/l dekstran og 7,6 pmol/1 seks FFA. 5. I en annen eksperimentserie, ble et DNA-fragment kodende for hepatitt B virus overflateantigen (HBsAG) satt under kontroll av det humane 70 kb varmesjokkproteinpromoteren. Den resulterende plasmidkonstruksjonen (pl7MS neobærende et neomycin resistensseleksjonsgen) ble benyttet i trans^fek-sjonseksperimenter for å etablere en stabil amnion cellelinje av human opprinnelse (Wish), uttrykkende HBsAg-genet på en varmeregulert måte. Etter-translasjonsmodlfikasjoner, så som samling, glykosylering, utskilling og produksjon av både hoved- og gjennomsnittlige S-proteiner virket normalt. I tillegg var produksjonen av HBsAg under forskkjellige varmeinduksjonsprotokoller mulig. Etter inokulering i nakne mus, ble utvikling av svulster observert ved injeksjonsstedet. Svulstceller, løst ved bruk av kollagenase eller trypsinbehandling fra utkuttede svulster ble deretter sådd ut på Petri-skåler og skilte ut de samme mengdene HBsAg etter varmeinduksjon som cellene fra den opprinnelige cellelinjen.

Resultatene av antigenproduksjon til svulstcellene er gitt i Tabell IV nedenfor.

Tabell IV: HBsAg utskilt av WB4-celler før og etter overfør-ing som svulster Inn i nakne mus. Foreldrecellene (rundt 10^) ble injisert i ryggen på nakne mus; tre uker senere utviklet musene svulster. Musene bie ofret, svulstene ble klippet med sakser og svulstfragmentene ble enten injisert inn i nakne mus for å danne den neste svulstgenerasjon, eller deretter behandlet med trypsin for å dissosiere svulstcellene som ble sådd på Petri-skålene. Svulstceller i en tetthet på 10^ celler pr. 25 cm<2>skål ble varmebehandl et (HS) eller ikke (kontroll) i 2 t ved 43°C og etterinkubert overnatt ved 37°C. HBsAg ble målt ved bruk av et ELISA-kit tilveiebragt fra Abbot.

Fullstendige detaljer på konstruksjon av plasmid pl7MS neo er publisert i M. DREANO et al., Virus Research (1987), 8, 43-59 .

Claims (16)

Fremgangsmåte for biokjemisk produksjon av proteiner som er av interesse med et induserbart rekombinant genekspresjonsen-het/vertcellesystem, karakterisert ved at man:

1) velger en egnet cellelinje av eukaryotisk opprinnelse,

2) genetisk modifiserer disse cellene ved å transformere med rekombinant DNA inneholdende følgende elementer:

a) et gen som kode for et protein av interesse, hvor dette genet er under kontroll av en stressinduserbar trans-kripsjonspromoter av eukaryotisk opprinnelse,

b) et onkogen eller et onkogen som formerende gen av cellulær eller viral opprinnelse,

3) inokulerer de transformerte cellene Inn i spesielle laboratorlevarmblodige dyr som har evnen til å la svulster vokse under påvirking av inokulering;

4) lar svulstene vokse i dyret helt til svulster på 10^ ® celler eller mere er tilveiebragt,

5) Fjerner nevnte svulster og utfører dissosiasjon derav, deretter introduserer de dissosierte cellene ..inn I in vitro kulturmedlum og utsetter disse for stress for å indusere ekspressjon av genet som er av interesse;

6) Isolerer det uttrykte proteinet.

2.

Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de valgt cellelinjene (1) er svulstceller, hvorved element (b) er utelatt.

3.

Fremgangsmåte Ifølge krav 1, karakterisert ved at transkripsj onspromoter (b) er et humant 70 Kd varmesjokk (hsp70) promoterfragment.

4 .

Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at onkogen eller det transformerende genet er valgt fra (i) det humane c-ras-okogenet og (il) et subgenomt fragment fra bovin papilloma virus.

5.

Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at genet av interesse er (a) et humant veksthormon (hGH) gen eller et hepatitis B virusoverflateantigen (HBsAG).

6.

Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte rekombinant DNA (2) er valgt fra (I) plasmid pl7hGH dhfr bærende hGH genet under kontroll av hsp70 promoter; (ii) plasmid pl7HBN bærende hGH genet under kontroll av hsp70 promoter, neomycinresistensgenet under kontroll av herpes simplex virus tyimidinkinasepromoter og det transformerende fragmentet til bovin papilloma virus (klone HBN2).

7.

Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte transformering i steg (2) tilveiebringes ved ko-transfeksjon med plasmid pl7hGH dhfr og plasmid pEJ,

hvor det siste bærer det humane c-ras-onkogenet (klon 6).

8.

Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at nevnte transformering i steg (2) tilveiebringes ved co-transfeksjon med plasmid pl7hGH dhfr og plasmid pSV2NE0, et plasmid som bærer neomycinresistensgenet under kontroll av tidlig SV40 promoter.

9.Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at de valgte cellelinjene er NIH-3T3. ^ 10.

Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at de valgte dyrene innbefatter nakne mus og kjemisk immunosuppresserte dyr.

11.

Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at man etter steg (4) utfører det mellomliggende steg:

4b) fjerner svulsten og inokulerer en porsjon derav inn i immune dyr så som sencar-mus.

12 .

Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at steg (5) innbefatter dyrking 1 kulturmedia valgt fra (i) serum supplementert medium (SSM), (ii) serumfritt medium (SFM) supplementert med fettsyrer og (ili) serum og proteinfritt medium supplementert med fettsyre og dekstran (SPFM).

13.

Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at den utføres 1 en fermentator i nærvær av homogent distribuerte mikrobærere (Cytodex) eller hult f iber-kultur-system.

14 .

Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at isolering av protein av interesse utføres ved teknikker valgt blant affinitetskromatografi, dialyse, ionebytting, og gelkromatografi.

15..

Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at nevnte rekombinant DNA (2) er et plasmid pl7MS Neo bærende HBsAg-genet under kontroll av hsp70 promoter.

16.

Fremgangsmåte Ifølge krav 3, karakterisert ved at vertscellelinjene blir valgt fra NIH-3T3, og WISH (ATCC-CCL25).