NO861809L - Fremgangsmaate for tilveiebringelse av cellulase-loese stammer av hvitraatesopp. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører delignifisering av råmateriale inne-holdene lignin og cellulose, så som ved, halm eller andre lignocelluloseholdige materialer, under anvendelse av lignin-nedbrytende organismer.

Det er kjent, f.eks. fra U.S. patent nr. 3 962 033, at deter mulig å utvinne cellulose fra tre eller anndet råmateriale inneholdende lignin og cellulose, ved å behandle råmaterialet med en organisme som produserer lignin-nedbrytende enzymer under betingelser hvor ligninet nedbrytes uten at cellulosen påvirkes i vesentlig grad. De organismene som spesielt er tilsiktet ved foreliggende patent er hvitråtesopp, som normalt produserer både lignin og cellulosenedbrytende enzymer. Patentet er spesielt rettet mot anvendelsen av hvitråtesoppen Sporotrichum pulverulentum. Ifølge patentbeskrivelsen kan behandlingen av det lignocelluloseholdige materialet utføres ved tilsats av stoffene, hovedsakelig sukker, som hemmer soppens produksjon av cellulosenedbrytende enzymer (cellulaser), slik at bare de lignin-nedbrytende enzymene er aktive.

Imidlertid er det også mulig å behandle råmaterialet ved å anvende en kunstig oppnådd mutant av mikro-organismen omtalt ovenfor, hvis evne til å danne cellulaser er eliminert eller redusert i forhold til den naturlig forekommende organismen. Det er følgelig angitt i patentbeskrivelsen at egnede mutanter av Sporotrichum pulverulentum kan oppnås ved ultrafiolett bestråling eller andre mutagene midler, og utsortering og ren-dyrking av de derved dannede cellulaseløse mutantene.

Sporotrichum pulverulentum synes, såvidt man idag vet, å være den beste lignin-nedbrytende soppen. Det har tidligere vært antatt at den har en ufullstendig kjønnssyklus. For å få frem de cellulaseløse mutantene har man derfor vært henvist til mutasjoner av conidia (ukjønnede sporer). Det er kjent at basidiomycetes generelt har to fremgangmsåter for sin reproduksjon og overlevelse, dvs. den kjønnede og den ukjønnede formen. Den kjønnede formen er kjennetegnet ved produksjon og frigivelse av basidiosporer, mens den ukjønnede formen kan innebære produksjon av ukjønnede sporer (oidia, conidia, chlamydosporer, arthrosporer) som kan spres eller forbli in situ.

Den ukjønnede formen betyr naturligvis en langt større genetisk variasjon innenfor populasjonen enn den ukjønnede formen.

Det er imidlertid nå funnet at de cellulaseløse mutantene av Sporotrichum pulverulentum oppnådd på denne måten uheldigvis har en betydelig redusert evne til å nedbryte lignin sammenlignet med vill-stammen. I et hvert tilfelle har det ikke vært mulig på denne måten å oppnå mutanter som nedbryter lignin (eller delignifiserer ved) i tilstrekkelig grad for kommersiell anvendelse. Dette synes bl.s. å henge sammen med at disse mutanente ikke bare er cellulaseløse men også xylanaseløse. Av denne grunn dannes det lite eller intet sukker som soppen trenger for å kunne produsere H2O2, som er uomvikelig påkrevet for lignin-nedbrytningen.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot eliminering av ulempene med den kjente teknikken ved tilveiebringelse av stammer av Sporotrichum pulverulentum (Phanerochaete chrysosporium K-3), som utmerker seg ikke bare ved vesentlig redusert eller også eliminert produksjon av cellulase, men fremfor alt ved opprettholdt, eller sågar forøket, evne til å nedbryte lignin.

Oppfinnelsen bygger på den oppdagelse at Sporotrichum pulverulentum har en fullstendig kjønnssyklud, den danner basidia og basidiosporer og tilhører følgelig basidiomycetene. Denne oppdagelsen i kombinasjon med bl.a. utviklingen av fremgangsmåter for rutinemessig produksjon av basidiosporer, utviklingen av fremgangsmåter for rutinemessig under-søkelse av høy lignin-nedbrytningsevne, fremgangsmåter for utsortering av selv-fertiliserende stammer, og fremgangsmåter for undersøkelse av kryssningsevnen har muliggjort anvendelsen av klassiske genetiske fremgangsmåter, dvs. krysning av utvalgte homokaryotiske stammer, for fremstilling av organismer med ønskede egenskaper, dvs. høy lignin-nedbrytningsevne i kombinasjon med cellulaseløshet.

Oppfinnelsen vedrører følgelig en fremgangmsåte for tilveiebringelse av mikro-organismer som er egnet for delignifisering av ved og annet lignocelluloseholdig materiale, ved krysning av homokaryotiske stammer av Phanerochaete chrysosporium K-3 (Sporotrichum pulverulentum) med høy lignin-nedbrytende evne med cellulaseløse mutanter oppnådd f.eks. ved ultrafiolett bestråling av conidia fra homocaryotiske myceler, som nærmere angitt i krav 1. Disse krysningene utføres med mange genera-sjsoner av soppen, hvorved bedre og bedre ligning-nedbrytning oppnås samtidig som egenskapen cellulaseløshet opprettholdes.

Oppfinnelsen vedrører videre en fremgangsmåte for utvinning av cellulose fra lignocelluloseholdig materiale ved behandlign med en lignin-nedbrytende organisme, som er kjennetegnet ved at behandlingen utføres med en stamme av Sporotrichum pulverulentum oppnådd som beskrevet ovenfor som er cellulaseløs, men har høy lignin-nedbrytningsevne.

Oppfinnelsen kan spesielt anvendes ved utvinning av cellulose (masse) fra ved, halm, bagasse elle annet lignocelluloseholdig materiale ved delignifisering av veden med organismen ifølge oppfinnelsen. Herved utsettes veden, fortrinnsvis i finfordelt form, f.eks. som flis, for mikro-organismen under betingelser som er egnet for dens utvikling inntil den ønskede mengden lignin er nedbrutt. Avhengig av omstendighetene kan denne mengden variere fra så lavt som 1% og opptil tilnærmet 100% av ligninet, mens cellulosen forblir i det vesentlige upåvirket, hvoretter cellulosen kan utvinnes. Vedrørende behandlingsbetingelsene kan det henvises til det ovenfor nevnte U.S. patent nr. 3 962 033.

En annen viktig anvendelse av mikro-organismen fremstilt ifølge oppfinnelsen er anvendelse ved nedbrytning av halm, bagasse og annet lignocelluloseholdig materiale med det formål å omvandle dette til et produkt som er mer egnet som dyrefdr. Treflis, f.eks. flis fra asp eller poppel, kan også delignifiseres på denne for anvendelse som dyrefdr.

Oppnåelsen av en cellulaseløs stamme av Sporotrichum pulverulentum (Phanerochaete chrysosporium K-3) skal beskrives detaljert i det følgende. Behandlingen er basert på den oppdagelsen at dannelsen av fruktlegemet og produksjonen av basidiosporer fant sted hos den anvendte stammen, og at soppen således er en basidiomycet med en fullstedig kjønnssyklus. Det ble funnet at fruktlegemene av Sporotrichum pulverulentum produserte basidia med 2-8 sterigmata, hvorved det dominerende antallet var 4. I undersøkelsen som her er beskrevet ble det benyttet basidiosporer fra basidia med 4 sterigmata i krysnings- forsøkene. Fra én av disse stammene, betegnet Phanerochaete chrysosporium K-3, ble det opnådd nye stammer ved en prosess innbe-fattende seleksjon og krysning av homokaryotiske basidiosporekulturer, denne fremgangsmåten er illustrert i figur 1. Disse stammene ble betegnet, for de cellulaseløse: 3113, 3132-85, 13132-118, 85118, og for de cellulasepositive: K-3, 31, 132, 13132. Den cellulaseløse (Cel~) stammen 3113 ble oppnådd ved ultrafiolett bestråling av stamme 31. Kulturene ble opprettholdt på granflis (Picea abies). 1. Seleksjon av énsporige stammer av S. pulverulentum Som omtalt ovenfor er det funnet at fruktlegemene av S. pulverulentum produserte basidia med 2-8 sterigmata. Dette viste seg å komplisere krysningen og tolkningen av resultatene ved krysning av utvalgte homokaryotiske stammer. Det ble observert at når utvalgte homokaryotiske myceler avledet fra basidiosporer fra basidia med 2-8 sterigmata ble krysset på bjerkevedmel-agarmedium utviklet svært få av stammene basidiosporer. I forsøk hvor cellulasepositive (Cel<+>) homokaryoter avledet fra basidiosporer fra basidia med bare 4 sterigmata ble krysset med cellulaseløse (Cel~) stammer avledet fra stammer som hadde varierende antall sterigmata, var bare 1 av 85 homokaryoter valgt fra F} Cel~. Etter flere mislykkede krysnings- og seleksjonsforsøk besluttet man å anvende utelukkende basidiosporer fra basidia med 4 sterigmata i drysningsforsøkene. Ettersom groning av enkle conidiosporer resulterte i hetrokaryoter var det mulig å velge énsporige conidiosporekulturer av S. pulverulentum for produksjon av basidia med bare 4 sterigmata.

Enkle, groende conidiosporer av S. pulverulentum ble isolert etter 16 timers vekst på perti-skåler inneholdende 5 ml 3% maltekstrakt og 2% agar, og ble inkubert ved 39° C. Isoleringen ble overvåket mikroskopisk for å sikre at koloniene oppsto fra separate conidiosporer. Når conidio-sporene fra disse koloniene ble overført til et fruktlegeme-induserende medium, viste alle de undersøkte stammene den for Panerochaete karakteristiske hetrokaryotiske fenotypen. 20 slike stammer ble anvendt i forsøk for å bestemme utviklingen av ^CC^ fra ^ C-ringmerket syntetisk lignin (som et mål for lignin-nedbrytningsevnen). En stamme (K-3) som viste høy<l>^^-utvikling ved disse forsøkene ble valgt for fortsatte krysningsforsøk.

2. Isolering av cellulaseløse stammer

Den homokaryotiske stannen 31 ble valgt for mutajsonsforsøk. Ved UV-behandling av conidiosporer av denne stammen, og ved utvelgelse av cellulasemutanter ved anvendelse av en i og for seg kjent teknikk, ble det oppnådd flere cellulaseløse stammer, og en av disse, Cel"-stamme 3113, ble benyttet til fortsatte krysninger med Cel<+->og Cel"-stammer, slik at man fikk Cel~-hetrokaryoter som viste høy<l>^cc^-utvikling fra 14c -ringmerket lignin.

3. Krysningsforsøk

Énsporige kulturer av basidiosporer ble anvendt for undersøkelse av ligninnedbrytningsevnens arvelighet. Homokaryotiske foreldre med forøket evne til å frigjøre 1<4>C02fra 14C -ringmerket lignin, sammenlignet med K-3, ble paret og utvalgt for homokaryotiske avkom.

4. Nedbrytning av lignin i ved

De cellulaseløse stammene 3113, 13132-85, 13132-118 og 85 118 sammen med P-chrysosporium K-3 ble undersøkt i vednedbrytningsforsøk, hvor skiver (2 x 20 x 50 mm) av gran (Pices abies) og bjerk (Betula verrucosa) ble anvendt. Vekttapet, og spesielt lignintapene, ble smamen-lignet mellom Cel--mutanter og stammen K-3. Resultatet viste at K-3, som nedbryter cellulosen, forårsaket et høyere vekttap enn Cel~-mutantene. Imidlertid var det av mutantene forårsakede vekttapet større enn det som K-3 forårsaket.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for tilveiebringelse av cellulaseløse stammer, som samtidig har høy evne til å nedbryte lignin, karakterisert ved at man med utgangspunkt i en hvitråtesopp, som har en fullstendig kjønnssyklus på i og for seg kjent måte, frembringer en cellulaseløs mutant derav, denne krysses med en naturlig homokariotisk stamme av den samme soppen, hvilken stammen har høy lignin-nedbrytningsevne, og at man deretter fra avkommet utvelger slike stammer som har høy lignin-nedbrytningsevne i kombinasjon med cellulaseløshet.

2. Fremgangmsåte ifølge krav 1, karakterisert ved at hvitråtesoppen er Phanerochaete chrysosporium.

3. Fremgangmsåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at krysningene utføres i flere generasjoner.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at den cellulaseløse mutanten oppnås enten ved behandling av conidiosporer fra homokaryotiske myceler eller basidiosporer fra en naturlig stamme av hvitråtesopp med ultrafiolett bestråling eller annet mutagent middel.

5. Fremgangsmåte for delignifisering av lignocelluloseholdig materiale, karakterisert ved at produktene utsettes for virk-ningen av en stamme av hvitråtesopp tilveiebrakt ifølge krav 1.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det behandlede produktet er ved.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at det behandlede produktet er halm, bagasse eller annet lignocelluloseholdig jordbruksavfall.