NO803356L - Fremgangsmaate ved fremstilling av macrolidantibiotika - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår nye antibiotisk aktive substanser, fremgangsmåter for fremstilling av disse og preparater inneholdende slike substanser. Nærmere bestemt angår oppfinnelsen et nytt antibiotisk kompleks betegnet antibiotikumet AR-5 og dets medlemmer, spesielt antibiotikum AR-5 komponent 1, antibiotikumet AR-5 komponent 2 og derivater derav. Enkelte av de nye antibiotisk aktive substanser kan erholdes ved dyrkning av en hittil ubeskrevet art av slekten Micromonospora. Disse substanser kan overføres til deres kjemiske derivater. Gentamicin C, en kjent antibiotisk aktiv substans samproduseres ved dyrkningen av den hittil ubeskrevne mikroorganisme.

De nye macrolide antibiotika ifølge oppfinnelsen

er forbindelser av generell formel I

hvori R er H e]]er :0H; M er 0 eller (H,OH); Z er gruppen av formel II

hvori X er hydrogen, OH, mesyloxy, tosyloxy, trifluormethansulfonyloxy, halo, azido, amino, isocyanato, isothiocyanato, guanidino, -NHR<6>, -NR<6>R<7>, -NHR<8>, -NHC(0)OR<6>, -NHC(0)OR<8>,

-NHC(NH)R6,-NH(CH2)pOH eller -NH(CH,)pOR<10>, hvori p er et helt tall fra 2 til 18, eller -NHCOR når Y er hydrogen; eller hvor Y i kombinasjon med X er oxo, =N-NH9, =N-NHR<11>

11

eller =NR ; A betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling, eller betegner sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring; B betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 10- og 11-stilling, eller forutsatt at R er H, M er O, X er OH, Y er H og A

sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling betegner en oxiranring, kan B også være en enkeltbinding mellom carbonatomene i 10- og 11-stilling, eller, forutsatt at A sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling betegner en oxiranring og X er OH og Y er H, kan B sammen med carbonatomene i 10- og 11-stilling også betegne gruppen -CH„-CH(Q<1>)- eller -CH2-CH(Q ? )-, hvori Q 1 er en nitrogenholdig gruppe og Q 2 er en svovelholdig gruppe (nitrogenet eller svovelet er bundet til carbonatomet i 11-stilling,), hvori -Q<1>er~NH2, -NHC(0)R<6>, -NHR<6>, -NR<6>R<7>, -NHR<10>OH, -N=CHR<6>, -NHC(S)NHR<6>, -NHC(NH)R<6>,

-NHC(0)0R<6>, -NHC(0)NHR<6>, -NHC(NH)NH o,

9 9

-NH-C(O) N N-CH^CH., -NH

en aminosyrerest,

en forestret aminosyrerest eller et heterocyklisk radikal med 3 til 7 ledd inneholdende enten nitrogen som det eneste heteroatom eller nitrogen og et annet heteroatom som er nitrogen, oxygen eller svovel; -Q er -S-R , thioxanthyl,

-S-R<l0->NHR<6>, -S-R<8>, S-<R9,>-S-R<10->R<9>, -S-R<1>°-R<8->R<9>, -S-R<8->R<9>, -S-R<10->C(O)OR<6>, -S-R<10>-COOH, en svovelholdig aminosyrerest eller en svovelholdig forestret aminosyrerest; og hvori, forutsatt at A og B betegner .dobbeltbindinger, Z også kan være -CH2OH, -CHO, -CH2N<H>2, -CH2NHR<2>, -CH2NR<2>R<3>, -CH2OCOR<2>, -CH20-glycosyl, bortsett fra -CH20-mycinosyl og -CH20-(3"-desmethyl-mycinosyl), -CH2~ureido eller -CH2-thioureido,

hvori R 2 og R 3 uavhengig av hverandre betegner en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer>en aralkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer eller en heterocyklisk gruppe inneholdende 3-7 carbonatomer og et heteroatom som er svovel, nitrogen eller oxygen, eller hvori en av substituentene R^ o og R 3 i aminogruppene er hydrogen og den andre

er gruppen -(CH2)mOR^ eller

hvori m er et helt tall fra 2 til 10, n er et helt tall fra 2 til 6 og R 4 er en alkylgruppe inneholdende 1 - r 18 carbonatomer, en • aralkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer eller en heterocyklisk gruppe inneholdende 3-7 carbonatomer og et heteroatom som er svovel, nitrogen eller oxygen: og R 5 er 2 hydrogen, R eller

fi 7

; R og R er uavhengig av

hverandre .en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer,

en aralkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer; R g er en arylgruppe; R 9 er en heterocyklisk gruppe som inneholder 3-7 ledd, hvori heteroatomene er valgt fra svovel, nitrogen og oxygen; og R<1>^ er en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer; R 1 betegner en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer, en aralkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer eller en heterocyklisk gruppe inneholdende 3-7 ledd

hvori heteroatomene er valgt fra svovel, nitrogen og oxygen;

og ikke-toksisk farmasøytisk akseptable estere derav og syreaddisjonssalter av forbindelsene av formel I og deres estere.

Det nye antibiotiske kompleks betegnet antibiotikum AR-5 kan produseres ved dyrkning av en ny art av slekten Micromonospora som nedenfor beskrevet. Dette antibiotiske kompleks inneholder fire forbindelser av formel I: antibiotikum AR-5 komponent 1 (også angitt som antibiotikum AR5-1) og antibiotikum AR-5 komponent 2 (også angitt som' antibiotikum AR5-2), hvori M er oxo, Z er gruppen av formel II og hvori X er hydr.oxy og Y er hydrogen, A er sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring og B betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 10- og 11-stilling, og hvori R er hydrogen (antibiotikum AR5-1) eller hydroxy (antibiotikum AR5-2), og de tilsvarende 12., 13-desepoxy-12,13-dehydro-derivater (også angitt som 12,13- desepoxy-12,13-dehydro-antibiotikum AR5-1 og 12,13-desepoxy-1,213-dehydro-antibiotikum AR5-2).

I disse forbindelser har gruppen av formel II konfigurasjonen av / / mycinose. Britisk patentskrift

2 020 647 publisert 21. november 1979 synes.å beskrive antibiotikum AR5-1, antibiotikum AR5-2 og deres 12,13-desepoxy-12,13-dehydroanaloger. Imidlertid skal det bemerkes at US-PS 93 080 fra hvilket det kreves prioritet, ble innlevert 9. november 1979. Det nye antibiotiske kompleks betegnet antibiotikum AR-5 kan fremstilles ved dyrkning av den nye art betegnet Micromonospora polytrota. De andre forbindelser av formel I kan erholdes fra disse forbindelser ved kjemiske prosesser som vil bli beskrevet i det etterfølgende. Forbindelser av formel I hvori M er (H,OH) og/eller B er -CH2~CH (Q1') - eller -CH2-CH(<q2>)- og/eller Y (når Z er gruppen av formel II) er hydrogen, kan eksistere i isomere former på grunn av det faktum at de inneholder minst ett ytterligere asymetrisk carbonatom i 9- stilling og/eller 11- og/eller 4"-stilling. Oppfinnelsen innbefatter alle mulige optisk aktive former og racemiske blandinger av forbindelsene. Mikroorganismen ble isolert fra en jordprøve oppsamlet i Campeche, Mexico. En kultur av denne mikroorganisme utgjør en del av den perma-nente samling i Northern Utilization and Research Division, Agricultural Research Service, U.S. Department of Agriculture, hvor den er blitt angitt NRRL 12066. Underkulturer av Micromonospora polytrota NRRL 12066 er tilgjengelig fra det ovenfor angitte departement. En kultur av denne mikroorganisme utgjør en del av samlingen i the American Type Culture Collection (ATCC), hvor det er blitt gitt nummer ATCC 31584. Underkulturer av Micromonospora polytrota ATCC 31584 er tilgjengelig fra ATCC.

Micromonospora polytrota (enkelte ganger angitt

som M.polytrota) er aerob og vokser godt på et utall faste og flytende næringsmedia. Den utviser spesielt god vekst og antibiotisk produksjon under submerse aerobe betingelser.

Mikroorganismen kan skilles fra andre kjente arter av slekten Micromonospora ved et utall taxonomiske parametre. •

Eksempelvis danner Micromonospora polytrota sporer, vokser

på D- og L-arabinose og fruetose, vokser ikke på rhamnose og D-xylose, utnytter citrat, formiat, lactat og oxalat,

vokser i nærvær av 50 mikrogram pr. milliliter av gentamicin, sisomicin, kanamycin, lincomycin og clindamycin, utviser følsomhet overfor rosaramicin og kloramfenieol; hydrolyserer hypoxanthin og hippurat; hydrolyserer ikke xylan og chitin.

Mikroorganismen danner også urease og allantionase;

overlever ved en temperatur på 50° C i 8 timer.

Andre kjennetegn er karakteristika som er med på å bestemme at Micromonospora polytrota er ny, er dets vekstkarakteristika på forskjellige media.

De foregående kjennetegnende karakteristika ble bestemt under anvendelse av følgende prosedyrer hvis resul-tater er angitt i detalj i den etterfølgende beskrivelse.

Stammeoppretthol_d_else

Det opprinnelige kildemateriale var et frisk-tørret preparat. Innholdet i ampullen ble suspendert i 10 ml næringsvæske bestående av 5 g gjærekstrakt, 10 g dextrose, 20 g løselig stivelse, 5 g NZ-amin type A (Difco), 1 g CaCC^,

1000 ml kranvann, i 25 ml<1>s rør tettet-med Morton-propper.

pH ble justert til 7,2 før autoklavering. Næringssuspensjo-

nen ble inkubert ved 30° C på en rotasjonsrister (New Brunswick, Model G-52) ved 250 omdr. minutt i 3 - 4 dager.

Etter vekst ble 5 ml av den resulterende biomasse overført

til 50 ml friskt medium med den beskrevne sammensetning i en 250 ml's Erlenmeyer-kolbe tettet med bomull. Kulturer ble inkubert som overnfor beskrevet og høstet etter 3-4 dager.

5 ml's alikoter av den resulterende biomasse ble aseptisk

fylt over i 17 x 60 mm sterile ampuller utstyrt med skru-

korker og ble lagret ved -18° C.

F_remst i 11 ing .AY_...R°Ae_stof f

1 ml tint cellesuspensjon ble anvendt for å inoku-lere 25 mm's rør inneholdende 10 ml av stamme-oppholdelses-væsken, inkubert som ovenfor beskrevet, og 5 % podestoff overført til to rør frisk næringsvæske. Etter 3 dager ved 30° C ble cellene høstet ved sentrifugering (Sorvall, Model GLC-1) ved 450 x g i 15 minutter i 15 ml's. graderte rør,

vasket to ganger med sterilt destillert vann, og resuspen-

dert i vann til tre ganger det komprimerte cellevolum. Den resulterende vaskede suspensjon ble anvendt som podestoff ved de taxonomitester som er beskrevet i det etterfølgende.

En 1 %-ig overføring av Micromonospora polytrota

blé foretatt in duplo i 25 x 150 mm's rør inneholdende 10 ml av et medium bestående av 1 g gjærekstrakt, 1 g løselig stivelse, 1 g dextrose, 1 g CaC03og 1000 ml kranvann, eller et medium bestående av 10 g gjærekstrakt, 20 g løselig stivelse, 1 g CaC03og 1000 ml kranvann, eller et medium bestående av 5 g gjærekstrakt, 10 g dextrose, 1 g CaCO^og 1000 ml kranvann, eller et medium bestående av 1 g gjær-

ekstrakt, 10 g dextrose, 1 g CaCO^og 1000 ml kranvann.

Rørene ble lukket med Morton-propper og inkubert ved 35° C

på en rotasjonsryster (New Brunswick Scientific, Model G-52)

ved 250 omdr. pr. minutt. Etter 3, 5, 7 og 14 dager ble en prøve fra rørene tynt spredd ut på overflaten av dekk-

glass, ble lufttørket og snudd over på et skyveglass i en dråpe fortynnet krystallfiolettløsning (1:10 med destillert vann). Skyveglassene ble undersøkt under fasemikroskopet med en forstørrelse opp til 2000.

Micromonospora polytrota ble inokulert på overfla-

ten av forskjellige agarmedia i petriskåler: en agar bestående av 10 g gjærekstrakt, 10 g dextrose, 15 g agar,

1000 ml kranvann; pH 7,0; en vannagar bestående av 1000 ml kranvann, 15 g agar, pH 7,0, og en halvsterk stivelsesagar bestående av 1,5 g gjærekstrakt, 5,0 g potetstivelse, 1000 ml destillert vann, 15.g agar, pH 7,0. Doble plater av hvert medium ble inokulert, inkubert ved 30° C i 5, 10, 15 og 20

dager og undersøkt ved hvert tidspunkt direkte under mikro-skopet. Representative plater ble skyllet med sterilt vann, overflateveksten ble forsiktig skrapet og prøver ble under-

søkt mikroskopisk med hensyn til bevegelige sporer. Når luftmycelium ble observert, ble dekkglass (1 mm) sluppet på overflaten av veksten, som ble snudd over på et rent skyve-

glass og undersøkt under mikroskop ved en forstørrelse på

1000 X.

Kjemisk analyse av h ele celler

Nærvær og form av diaminopimelinsyre (DAP) og nærvær av carbohydrater i helcellehydrolysater ble bestemt ved metoder ifølge Becker et al (Appl. Microbial 12: 421-423, 1964) og Lechevalier (J. Lab. Clin. Med. 71:934-944, 1968).

Vekstkarakteristika

Micromonospora polytrota ble dyrket på standard actinomycete medium som beskrevet av Shirling and Gottlieb (int. J. Syst. Bacteriol 16:313-340, 1966) og Waksman 1. (The Actinomycetes, Williams and Wilkins Co., Baltimore, Md. 1961, Vol. 2. s. 328-334). Mediumplater ble inokulert og inkubert i 14 - 21 dager ved 35° C. Fargebetegnelsene som tilskrives vegetativ.myceliumpigmenter besto av et farvenavn 2 (Des-criptive Color Names Dictionary, Taylor, H.D.; Knoche, L.; Granville, W.C., Container Corp, of America. 1950) og et farveprøvetall 3 (Color Harmony Manual, Ed. 4, Chicago, Container Corp. of America, 1958).

Utnyttelse av carbohydrater

Til 5 ml av et sterilt, smeltet basalcarbohydrat-medium bestående av 5 g gjærekstrakt, 1 g CaC03, 15 g agar og 1000 ml kranvann i 16 x 150 mm rør utstyrt med skrukorker ble 0,5 ml av en 10 %-ig steril løsning av hvert testcarbohy-drat tilsatt, innholdene ble grundig blandet og rørene skrå-stilt. De skråstilte rør ble inokulert med Micromonospora polytrota under anvendelse av en steril pipette. Rørene ble observert med hensyn til vekst etter 21 dager ved 35° C.

Spaltning av organiske forbindelser

Spaltning av adenin, tyrosin, hypoxanthin, xanthin, xylan, urea og allantoin ble målt etter de prosedyrer som er beskrevet av Lechevalier i den ovenfor angitte publikasjon.

Chitinhydrolyse ble målt ved en modifikasjon av den prosedyre som er beskrevet av Veldkamp (Veldkamp H.: "A study of the aerobic decomposition of chitin by micro-organisms", Neded Landbouw Wageningen 55:127-174, 1955). 10 ml av stivnet vannagar utlevert i 16 x 50 mm petriskåler ble overhelt med 2,5 ml kolloidal chitinagar fremstilt som beskrevet i det etterfølgende. Platene ble inokulert med en strek ned fra sentrum, ble inkubert i 7, 14 og 21 dager ved 3 5° C og ble undersøkt med hensyn til oppløsning av chitin. Hydrolyse av hippurat ble bestemt under anvendelse av et modifisert Baird-Parker-medium (10 g natriumhippurat, 2 g dextrose, 2 g trypton, 1 g kjøttekstrakt, 2 g gjærekstrakt, 5 g Na2HP04, 1000 ml destillert vann, pH lik 7,9). Mediet ble oppdelt i 10 ml<1>s alikoter i 25 ml's rør lukket

med Morton-deksler. Rørene ble inokulert med testkulturen og inkubert ved 3 0° C på en rotasjonsryster ved 250 omr. pr. minutt. Etter.7 og 14 dager ble kulturen testet med hensyn til benzoesyre ved at 1 ml av kulturvæsken, fri-for klumper, ble blandet med 1,5 ml av 50 %-ig svovelsyre i et 16 mm's testrør. Tilsynekomst av krystaller i syreblandingen etter 4 timer ved romtemperatur indikerte hydrolyse av hippuratet.

Temperaturforhold

Testorganismens evne til å vokse ved 28° C, 35° C, 40° C og 45° C og til å overleve ved 50° C ble testet på " skråagar bestående av 5 g fjærekstrakt, 10 g dextrose, 20 g løselig stivelse, 5 g NZ Amin A (Difco), 1 g CaCO^, 15 g agar, 1000 ml kranvann, under anvendelse av den teknikk såm er beskrevet av Gordon et al (Gordon RE; Barnett DA;

Henderhan JE; PANGCH: Nocardia coeliaca, Nocardia autotrophica og nocardin-stamme. Int.J. Syst. Bacteriol. 24, 54-63, 1974).

Antibiotikum-følsomhet av den nyestamme

Testantibiotika ble løst i det egnede løsningsmid-del ved en konsentrasjon basert på en aktivitet på 1000 meg/ ml. Råløsninger ble fortynnet i'sterilt destillert vann til en sluttkonsentrasjon på 500 mcg/ml og filter-sterilisert (0,45 mm's filter, Millipore Corporation). Til 10 ml av de sterile antibiotiske løsninger ble det tilsatt 90 ml av smeltet agar bestående av 10 g gjærekstrakt, 10 g dextrose,

15 g agar, 1000 ml kranvann, pH 2,0, avkjølt til 45° C, og

20 ml av den resulterende blanding ble aseptisk pipettert i sterile petriskåler (100 x 150 mm). Sluttkonsentrasjonen av hvert antibiotikum i agaren var 50 mcg/ml.

Utnyttelse av organiske syrer

Utnyttelse av organiske syrer ble bestemt under anvendelse av de prosedyrer som er beskrevet av Gordon et al.

i den ovenfor angitte publikasjon.

Morfologi

Morfologisk utviser enkelte næringsvæskepreparater

av Micromonospora polytrota et vegetativt mycelium dannet i store klumper som er vanskelig å bryte opp. Hyfene er fine,

0,8 til 1,2 micrometer, og er rikelig forgrenet. De for-

grenede hyfer utviser svelling som danner uvanlige strukturer. Sporer dannes ikke i noen vesentlig grad i det anvendte næringsmedium selv etter 10 dagers inkubering. Når sporene er til stede fremstår de bare langs lengden av hyfen, enten bundet direkte til myceliet eller på sporoforene.

I motsetning til dette observeres rikelig sporula-

sjon på det første og tredje (stivelse) agarmedium som anr vendes i de morfologiske tester. Elektronmikroskopisk observasjon av sporesilhuettene viser nærvær av utvekster eller vorter langs sporeoverflaten.

Hydrelyserte helceller inneholder mesoisomeren av diaminopimelinsyre. Arabinose og xylose er de karakteristis-

ke sukkere.

Makroskopiske observasjoner av vekst, eller mangel

på vekst av M. polytrota på et utall media er angitt i tabell 1.

Makroskopiske observasjoner av utnyttelsen eller

mangel på utnyttelse av carbohydrater og organiske syrer av M. polytrota er angitt i tabell 2.

Tabell 3 viser vekst eller mangel på vekst av M. polytrota i nærvær av representative antibiotika.

Tabellen angir envidere mikroorganismens vekst

eller mangel på vekst i nærvær av uorganiske salter ved forskjellige konsentrasjoner.

I tillegg viser tabell 3 mikroorganismens evne

eller mangel på evne til å hydrolysere et utall forbindelser som er carbon- og nitrogenkilder.

Det antibiotiske kompleks (antibioticum AR-5)

ifølge oppfinnelsen bygges opp når M.polytrota fermenteres under regulerte, submerse, aerobe betingelser i et vandig næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder av carbon og assimilerbare kilder av nitrogen. Eksempler på slike assimilerbare carbonkilder er carbohydrater. Eksempler på slike assimilerbare kilder av nitrogen er ekstrakter fra proteiner. Foretrukne carbohydrater er tryptose, stivelse, dextrose, cerelose, mannitol, glucose og lignende. Foretrukne nitrogenkilder er maisstøpvæske, gjærekstrakt, soyabønnemel, kjøtt-peptoner, caseinhydrolysat og lignende.

pH på fermenteringsmediet og på det vegetative

inoculum justeres før podning og opprettholdes fortrinnsvis ved fra 6,0 til 8,5 ved innarbeidelse av en buffer slik som kalciumcarbonat i fermenteringsmediet eller i det vegatative inoculum. Det foretrukne pH-område er fra 6,8 til 7,2.

Produksjon av antibiotica kan utføres i de fleste temperaturer som fører til tilfredsstillende vekst av mikroorganismen, f.eks. mellom 20 og 40° C, fortrinnsvis mellom 27 og 35° C. Den mest foretrukne temperatur for å fremstille det vegetative inoculum og å utføre fermenteringen er ca.

30° C.

Generelt fremstilles næringsmedia i et egnet fermenteringskar eller kolbe som steriliseres og avkjøles før podningen. Imidlertid kan mediet lagres under aseptiske betingelser ved lave temperaturer før bruk.

For å fremstille det antibiotiske kompleks ifølge oppfinnelsen foretrekkes et kraftig voksende vegetativt

inoculum. Generelt utføres inoculum-fremstilling i to

eller flere trinn. For fermenteringer i stor skala (f.eks.

ca. 50 liter) foretrekkes det at inoculumet fremstilles i

tre trinn.

Egnede media for fremstilling av vegetativt ino-

cula er som følger:

2 ml friskt tinet helkraft av M. polytrota ble anvendt for å inoculere 50 ml sterilt medium A. Kolben ble inkubert ved ca. 30° C i fra 48 til 96, fortrinnsvis ca. 72 timer på en rotasjonsrister ved ca. 300 omdr./min og 5,08 cm slaglengde. 25 ml av det første inoculium ble anvendt for å inoculere en serie av 500 ml<1>s porsjoner av sterilt medium B i 2-liters Erlenmeyer-kolber. Kolbene ble inkubert med rotasjonsristing ved ca. 30° C i fra 24 til 7'2, fortrinnsvis 48 timer. 25 ml av det andre inoculium ble anvendt for å inoculere hver av en serie av 500 ml's porsjoner av sterilt medium B i 2-liters Erlenmeyer-kolber. Kolbene ble inkubert med rotasjonsomrøring ved ca. 30 o Ci fra 24 til 72, fortrinnsvis 48 timer. Følgende medium ble funnet å gi både tilfredsstil lende og reproduserbare utbytter av antibiotikaproduksjon

For produksjon av det antibiotiske kompleks ble

10 liter sterilt Medium C inokulert med 500 ml av annet trinns inokulium fremstilt som ovenfor beskrevet. Fermenterings-blandingen ble inkubert ved fra 27 til 35° C, fortrinnsvis ved ca. 30° C med rotasjonsomrøring og gjennomluftning ved ca. 350 omdr./min og ved 0,3 5 vbm. pH på fermenteringsblan-dingen ble opprettholdt ved fra 6,8 til ca. 7,2 ved tilsetning av fortynnet alkali.

Fermenteringen tillates å forløpe i fra 48 til

84, fortrinnsvis ca. 72 timer før man starter å overvåke den antibiotiske aktivitet. For å overvåke fermenteringen ble en prøve av helkraften trukket ut og ekstrahert med et vannublandbart organisk løsningsmiddel. Eksempler på sli-

ke løsningsmidler er methylenklorid, kloroform, benzen, toluen, ethylacetat, amylacetat eller lignende. Det foretrukne løsningsmiddel er ethylacetat. Overvåkningen utføres ved tynnskiktskromatografi på silicagel under anvendelse av den nedre fase av et løsningsmiddelsystem bestående av kloroform:methanol:petroleumether:vann i volumforhold 3:3:1:1. Kvantitering av antibiotisk produksjon kan foretas under anvendelse av "High Performance Liquid Chromatography" (HPLC) eller annen analytisk teknikk kjent innen faget.

Når optimal antibiotisk konsentrasjon oppnås kan

det antibiotiske kompleks AR-5 isoleres ved ekstraksjon som beskrevet for overvåkningsprosedyren, under anvendelse av ca. to volumer av ublandbart organisk løsningsmiddel pr. ekstrakt, og ved ekstraksjonen av væsken to ganger. Ekstraktene kombineres, fordampes til et residuum og oppløses i methanol. Utfelling av produktet ved tilsetning av petroleumether til methanolløsningen gir det antibiotiske AR-5-kompleks.

Separasjon av det antibiotiske kompleks i det komponenter kan utføres ved kromatografi på Sephadex (R)LH-20 under anvendelse av et konsentrat av et ethylacetatekstrakt. Eluering av det bioaktive materiale kan utføres med ethanol. Ethanoleluatet inneholdende de bioaktive fraksjoner konsen-treres og absorberes på en silicagelkolonne. Eluering utfø-res under anvendelse av det tidligere beskrevne kloroform, methanol, petroleumether og vannsystem. Kolonnen overvåkes ved anvendelse av tynnskiktkromatografi under anvendelse av silicagelplater, og løsningsmiddelsystemet anvendes for å eluere.kolonnen. Fraksjoner med Rf på 0,51 og 0,43 inneholder antibiotikum AR5-1, antibiotikum AR5-2, og de tilsvarende 12,13-desepoxy-12,13-dehydro-derivater derav, betegnet som 12,13-desepoxy-12,13-dehydro-antibiotikum'AR5-1 og 12,13-desepoxy-12,13-dehydro-antibiotikum AR5-2.

Ved den ovenfor beskrevne fermentering som produseres er gentamincin C-kompleks, et velkjent antibiotikum (US-PS 2 091 572 og 3 136 704), som består av tre distinkte enheter, nemlig gentamicin C-^, gentamicin C^aog gentamin C^. Den ovenfor beskrevne løsningsmiddelekstraksjonsprosedyre (ved hvilken komponentene i antibiotikum AR-5-komplekset isoleres) etterlates gentamicin-komplekset i kraften. Dette kan isoleres fra fermenteringskraften etter kjente metoder slik som følgende isolasjonstrinn: Surgjøring av kraften til pH 2,0 (for eksempel med svovelsyre), filtrering, nøytrali-sering av filtratet med ammoniumhydroxyd, absorpsjon på en IRC-50 harpikskolonne i ammoniumsyklus, desorpsjon av genta-micinkomponentene med fortynnet ammoniumhydroxyd, konsentre-ring av eluatet og lyofilisering.

Antibiotikum AR5-1, antibiotikum AR5-2 og andre forbindelser av formel I hvori A sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling representerer en oxiranring, kan omdannes til deres respektive 12,13-desepoxy-12,13-dehydro-derivater ved reduksjon. Denne prosess kan utføres med alkalimetall-bromider eller fortrinnsvis med alkalimetalljodider i en organisk syre over romtemperatur. Carboxylsyrene inneholder fortrinnsvis 1-4 carbonatomer. Denne reaksjon kan også utføres i aromatiske hydrocarboner slik som for eksempel benzen, toluen eller xylen, inneholdende konsentrert hydro-jodsyre. En annen mulighet ligger i behandling av utgangsmaterialet med fosfortrialkoxyder, trialkylfosfiner, trifenyl-fosfiner eller hexaalkylfosfoimidater.

Et medium for utførelse av denne reaksjon er kaliumjodid i tilbakeløpskokende syre. Reaksjonsproduktet kan med fordel isoleres ved fortynning av reaksjonsblandingen med isvann, ekstraksjon av produktet med et vannublandbart, organisk løsningsmiddel, vasking av ekstraktet og isolering av produktet. Produktet ved denne prosess består av betyde-ligemengder av både cis- og trans-isomerene av reaksjonsproduktet .

Denne reduksjonsprosess kan også utføres i en fortrinnsvis fortynnet mineralsyreløsning inneholdende kromioner i en inert atmosfære. Reduksjonsmidlet, dvs. kromionene, tilføres fortrinnsvis i form av en løsning inneholdende et kromsalt hvori anionet er avledet fra en uorganisk syre, for eksempel kromklorid, kromsulfat eller kromjodid. Det foretrukne reduksjonsmiddel er kromklorid^ som med fordel kan fremstilles ved den prosedyre som er beskrevet i Inorganic Synthesis, Volume III, side 148 - 150, publisert av McGraw-Hill (1950) . Det foretrekkes at kromkloridløsningen fremstilles umiddelbart før bruk for å dempe krom(III)-ion-dannelsen. Produktet er rikt på transisomer, og krever der-

for ikke kromatografisk separasjon av isomcreno.

10,11-dihydro-antibiotikum AR5-1 (en forbindelse

av formel I hvori M er oxo, R er hydrogen, Z er en gruppe av formel II hvori X er hydroxy og Y er hydrogen, A er sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring og B er en enkelbinding mellom carbonatomene i 10- og 11-stilling)

er metabolitten av antibiotikum AR5-1. Den kan erholdes ved enzymatisk, fortrinnsvis metabolisk, reduksjon av antibioti-

kum AR5-1. Antibiotikum AR5-1 kan for eksempel gies til dyr, (f.eks. hunner) som er i stand til å redusere denne ved dob-beltbindingen mellom carbonatomene i 10- og 11-stilling, og 10,11-dihydro-antibiotikum AR5-1 isoleres fra urinen av disse dyr ved ekstraksjon. Ekstraksjonen utføres fortrinnsvis med vann-ublandbare løsningsmidler slik som f.eks. ethylacetat.

Forbindelsen av formel I avledet fra antibiotikum-kompleks A-5, kan fremstilles ved en egnet prosess eller en kombinasjon av prosesser som beskrevet i det etterfølgende. Prosessen er kjent innen faget.

Forbindelser av generell formel I hvori R er hydro-

gen eller hydroxy, M er oxo, A og B betegner dobbeltbindinger mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling og 10- og 11-

stilling, og Z er -Cr^OH, kan fremstilles ved hydrolyse av forbindelser av formel I hvori R, M, A og B er som ovenfor definert og Z er -Cr^O-glycosyl. Denne hydrolyse kan utføres ved syrehydrolyse. Vanligvis utføres denne hydrolyse ved forhøyet temperatur (f.eks. 60 - 100° C, fortrinnsvis ca.

100° C) under anvendelse av fortynnet syre, fortrinnsvis en uorganisk syre (f.eks. 0,5 NH2S04). Det ønskede produkt isoleres ved justering av løsningens pH til 9,0, etterfulgt av

ekstraksjon og kjent rensetrinn.

Når for eksempel denne prosess anvendes for hydrolyse av 12 , 13-desepoxy-1.2 ,13-dehydro-antibiotikum AR5-1 og/eller 12,13-desepoxy-12,13-dehydro-antibiotikum AR5-2 kan reaksjonen utføres med 0,5 N svovelsyre ved ca. 96° C i 5 timer.

En foretrukket metode for fremstillingen av desmycinosylforbindelsene (forbindelser av formel I hvori Z er

-CH2OH), er hydrolysen av den respektive forbindelse av formel I hvori Z er -CH20-glycosyl av formel II, hvori Y i kombinasjon med X er oxo, ved hjelp av methanolisk silicagel. Eksempelvis kan 4"-dehydro-12,13-desepoxy-12,13-dehydro-antibiotikum AR5-1 (fortrinnsvis 2'-esteren, for eksempel 2'-acetatet derav) behandles med methanolisk silicagel ved romtemperatur i løpet av 4 dager. Det ønskede desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro-antibiotikumAR5-l isoleres fra reaksjonsblandingen, for eksempel ved kolonnekromagotrafi og erholdes i høye utbytter. Desmycinosylforbindelsene av generell formel III

kan omdannes til de tilsvarende forbindelser av formel I hvori Z er -CHO-, -CH9NH9, -CH-NHR<2>, -CH~NR<2>R<3>, -CHo0R<2>,

-CH2OCOR 2 , -CH-NHCOR 2 , -CH-NR^3 COR 2,

.NH ..„SL°

<//>2</>m 5</>\

_CH 2 NH-C-R , -CH2NHC-NHR , -CH2NHCO-NN x /XN-CH2CH3 ,

-CH20-glycosyl, unntatt -CH20-mycinosyl og -NH20-(3"-des-methyl-mycinosyl), -CH2~ureido eller -CH2-thioureido, hvori

hvori R 2 og R 3 uavhengig av hverandre betegner en alkyl-

gruppe inneholdende 1-18 carbonatomer, en aralkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer eller en heterocyklisk gruppe inneholdende 3-7 carbonatomer og et heteroatom som er svovel, nitrogen eller oxygen, eller én av substituenteae

2 3

R og R i aminogruppene er hydrogen og den andre er gruppen

hvori m er et helt tall fra 2 - 10, n er et helt tall fa 2 - 6 og R qer en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer, en aralkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer eller en heterosyklisk gruppe inneholdende 3-7 carbonatomer og et heteroatom som er 5 2 svovel, nitrogen eller oxygen; og R er hydrogen, R eller

Forbindelsene av formel III kan oxyderes til de tilsvarende forbindelser av formel I hvori Z er -CHO og M er oxo.- Denne oxydasjon kan for eksempel utføres ved hjelp av Jones-reagens (krom III-syreanhydrid i fortynnet svovelsyre).

Forbindelsene av formel III kan underkastes gluco-siddannelse. Denne glycosiddannelse utføres etter kjente metoder, slik som omsetning av en forbindelse av formel III eller et reaktivt derivat derav med det egnede sukker i nærvær av en katalysator (f.eks. 1 % HC1) og i fravær av vann.

I særdeleshet kan glycosidene ifølge oppfinnelsen fremstilles ved de prosesser som er beskrevet i Angew. Chem. International Edition 1974, nr. 3, sider 157 - 170 og de publikasjoner som er angitt deri. Det foretrekkes å anvende forbindelser av formel III hvori M er oxo. Eksempler på sukkere er (3-g-glucose, 3-Q-allose, 2-deoxy-3_Q-glucose, 2-deoxy-3-D-allose, 2 , 3-di-0-methyl-(3-D-glucose , 2,3-di-O-methyl-3-Q-allose, 2-deoxy-3-0-methyl-3-Q-allose, 2-O-methyl-3-D-allose, 6-deoxy-3-D-allose, 6-deoxy-2 ,3-di-0-methyl-3~ D-glucose, 2,6-dideoxy-3-0-methyl-3-D^allose, 6-deoxy-2-0-methyl-3-D-allose, 3-D-galactose, 2,3-di-O-methyl,3~D-galactose, 2-0-methyl-3-D-galactose, 2-0-methyl-3-D-galactose, 6-deoxy-2,3-di-0-methyl-3-D-galactose, 6-deoxy-2-0-methyl-3~D-galactose, 2-0-methyl-3-D-galactose, 6-deoxy-p-D-galactose og 6-deoxy-2,3-di-0-methyl-3-D-galactose.

Forbindelsene av formel III kan også forethres i 21-stilling under dannelse av tilsvarende forbindelser av

2 2

formel I hvori Z er -CH2OR , R er som ovenfor definert. Forethringen utføres etter kjente metoder. Hydroxygrupper

i andre stillinger og aminogrupper i utgangsmaterialet kan beskyttes med vanlig beskyttende grupper under forethringsprosessen. (En hensiktsmessig måte å beskytte hydroxygruppene på er å acylere utgangsmaterialet i den relevante stilling, epseielt 2'-hydroxygruppen, og underkaste produktet fra forethringsprosessen solvolyse, hvorved de fri hydroxygrupper i andre stillinger enn 21 regenereres). Forethringen kan også utføres ved omsetning av forbindelsene av gene-reil formel III med de respektive R 2-jodid og sølvoxyd eller alternativt med natriumhydrid og deretter med det respektive R 2-halogenid i et organisk løsningsmiddel slik som tetrahydrofuran.

Forbindelsene av formel I hvori Z er -CHO kan over-føres til de forbindelser av formel I hvori Z er -CH^NH-,

-CH2NHR eller -CH^NR R (R og R er som ovenfor angitt)

ved reduktiv aminering. Eksempelvis kan denne overføring utføres med et reduksjonsmiddel slik som natriumcyanoborhydrid og et amineringsmiddel slik som ammoniumklorid under dannelse av det C-21 primære aminderivat. De substituerte

2 2 3

aminoderivater (Z er -CH«NHR eller -CH-NR R ) kan erholdes hvis det i denne reaksjon anvendes et R - eller R 2 -R 3-substituert amineringsmiddel.

Hvis utgangsmaterialet som anvendes i denne prosess er en forbindelse av formel I hvori M er oxo, reduseres denne oxo-gruppe til 9(a,3)-dihydrogruppen (M er H, OH).

Om ønsket kan det således erholdte produkt omdannes til den tilsvarende 9-oxoforbindelse ved kjent oxyderingsprosedyre slik som de prosedyrer som gjør bruk av mangandioxyd eller Jones-reagens.

Forbindelser av formel I hvori Z er •

-CH2-ureido eller -CH2-thioureido, hvor R , R og R er som ovenfor definert, kan fremstilles ved omsetning av en forbindelse av formel IV

hvori M og R er som ovenfor angitt, eller en 2'-ester derav, med en forbindelse av formel V L-Q, hvor Q er den del som skal innføres i den primære aminogruppe i 21-stilling i utgangsmaterialet og L er en forlatende gruppe. Egnede forlatende grupper er grupper slik som for eksempel halogen, alkoxy og thioalkyl.

En forbindelse av formel I hvori Z er -CH-NHR<2>

2 3

eller -CH^NR R kan fremstilles ved omsetning av,den til-

* 2 svarende forbindelse av formel IV med et aldehyd (R CHO) eller et keton (R 2 COR 3), i nærvær av et reduksjonsmiddel slik som for eksempel natriumcyanoborhydrid og natriumborhydrid. ;Reaksjonen utføres i et ikke-reaktivt løsningsmid-del slik som lavere alkohol (for eksempel methanol). Hvis substituenten M i utgangsmaterialet av formel IV er oxo, reduseres denne 9-oxo-gruppe også ved denne reaksjon, og en blanding av 9-a-og arp-dihydroderivatet erholdes. Denne blanding kan oppløses etter kjente metoder, eller om ønsket kan 9-dihydroderivatet oxyderes under dannelse av den til- ;svarende forbindelse av formel I hvori M er oxo.;Forbindelsene av formel I hvori Z er -CH~NHCOR<2>eller -CH2NR 3 COR 2 kan fremstilles ved acylering av den tilsvarende forbindelse av formel IV eller en tilsvarende forbindelse inneholdende en sekundær aminogruppe (-NHR 2) ved carbonatornet i 21-stilling. Et egnet acyleringsmiddel er anhydridet eller halogenidet av syren R 2 COOH hvori R 2er som ovenfor definert. ;En forbindelse av formel I (definert ovenfor),;hvori M er oxo, kan fremstilles fra den tilsvarende 9-hydroxyforbindelse ved oxydering. Egnede midler er for eksempel mangandioxyd og Jones-reagens (krom(III)anhydrid i fortynnet svovelsyre tilsettes til en løsning av utgangsmaterialet i et ikke-reaktivt løsningsmiddel, for eksempel aceton). ;Hvis Z i utgangsmaterialet er -CH2OH eller X i;gruppen av formel II er OH, oxyderes denne gruppe også.;En forbindelse av formel I hvori M er (H,OH) og;A, B, R og Z er som ovenfor definert, forutsatt at Z er forskjellig fra -CHO, og - hvis Z er gruppen av formel III - ;at Y er hydrogen, kan fremstilles ved reduksjon av en forbindelse av formel I hvori M er 0. Egnede reduksjonsprose- ;dyrer gjør bruk av natriumborhydrid i et ikke-reaktivt løs-ningsmiddel slik som en alkohol (for eksempel methanol), natriumcyanborhydrid i vandig sur buffer (pH 3-5) eller lithium-tri-tertiær butoxyaluminiumhydrid (LiAIH[0C(CH3)3]3, fortrinnsvis i et ikke-reaktivt løsningsmiddel slik som f.eks. tetrahydrofuran. Ved disse prosedyrer erholdes en blanding av henholdsvis 9-a-dihydroderivatet og 9-fJ-dihydroderivatet. Komponentene i disse blandinger kan isoleres etter kjente metoder innen faget slik som f.eks. kolonne-kromatografi. Ved denne reaksjon reduseres også oxogruppen i 4"- og 21-stilling i utgangsmaterialet og det tilsvarende 4"-(I-l,OH)-derivat og/eller 21-CH2OII-derivat erholdes. ;Ved å underkaste antibiotikum AR-1, antibiotikum;AR5-2, 10,11-dihydro-ll-amino-antibiotikum AR5-1, 10,11-dihydro-ll-amino-antibiotikum AR5-2, 4"-dehydro-antibiotikum AR5-1, 4"-dehydro-antibiotikum AR5-2 eller estere av disse ;forbindelser denne reduksjonsprosedyre, erholdes de tilsva-;rende derivater inneholdende gruppen (H,OH) i 9- og 4"-stilling. ;Forbindelser av generell formel VIII eller IX ; -ir rhvori R er H eller OH, M er 0; Q er -NH-, -NHR , -NR R , -NHC(NH)NH2, -NHC(NH)NHR , en aminosyrerest, en forestret aminosyrerest eller et heterocyklisk radikal med 3-7 ledd inneholdende enten nitrogen som det eneste heteroatom eller nitrogen og et annet heteroatom som er nitronge, oxygen eller svovel; og hvor Q2 er -S-R6, thioxanthyl, -S-R<10->NHR<6>, -S-R8, - S-R9, -S-R10-R9, -S-R10-R<8->R9, -S-R<8->R<9>, -S-Rf°-C(0)OR<6>, ;-S-R^-COOH, en svovelholdig aminosyrerest, .eller en svovelholdig forestret aminosyrerest; og R,6, R7, R8, R9 og R1(^ er ;som definert for formel I, kan fremstilles ved omsetning av antibiotikum AR5-1, antibiotikum AR5-2 eller estrene av disse forbindelser med en egnet forbindelse av formel' HQ"*" (VI) eller HQ 2"(VII), eller med et reaktivt derivat av forbindelsen av formel VI eller VII. Generelt foretrekkes det å anvende' antibiotikum AR5-1 eller antibotikum AR5-2 som utgangsmateriale.

Denne prosess diskuteres mer detaljert for fremstilling av utvalgte forbindelser eller utvalgte grupper av forbindelser. Imidlertid skal det forstås slik at trekkene ved den beskrevne prosess kan anvendes for andre forbindelser av formel VIII og IX.

Forbindelser av formel VIII hvor M er oxo og Q<1>er

6 6 7 -NH2, NHR eller -NR R , kan fremstilles ved omsetning av antibiotikum AR5-1 eller antibiotikum AR5-2 med den egnede forbindelse av formel VI, HQ<1>(NH3, NH2R<6>og NHR<6>R<7>), eller et reaktivt derivat derav, i et ikke-reaktivt løsningsmiddel. Egnede løsningsmidler er for eksempel lavmolekylære alkoholer (fortrinnsvis methanol). Det således erholdte 11-Q^-derivat kan isoleres ved fjerning av løsningsmidlet, og kan renses etter generelt kjente metoder innen faget slik som kromatografi eller saltdannelse og krystallisering, etterfulgt av regenerering av det fri amin.

En forbindelse av formel VIII hvor M er oxo og Q<1>

er -NH-C(NH)NHR<6>kan fremstilles på analog måte ved omsetning av antibiotikum AR5-1 eller antibiotikum AR5-2 med R c-guana-

din (NH^ -C(NH)NHR6).1

En forbindelse av formel VIII hvori M er oxo og Q

er en aminosyre eller forestret aminosyrerest, kan fremstil-

les ved omsetning av antibiotikum AR5-1 eller antibiotikum AR5-2 med den egnede aminosyre eller dens ester, for eksempel

av generell formel X

eller dets salt, for eksempel dets hydroklorid, i et ikke-reaktivt løsningsmiddel slik som for eksempel en cyklisk ether (for eksempel, tetrahydrofuran) eller et dialkylacylamid (for eksempel dimethylformamid), i nærvær av en tertiær base slik som triethylamin. Hvis aminosyren anvendes, foretrekkes det å anvende dets salt i en buffret løsnings (pH 7). Reaksjonen utføres vanligvis i nærvær av et svakt overskudd av en tertiær base slik som triethylamin.

Forbindelser av formel VIII hvor Q<1>er et heterocyklisk radikal som ovenfor definert, spesielt forbindelser hvori M er oxo og Q er thiomorfolino, l-methyl-4-piperazinyl, morfolino eller 1-piperidinyl, kan fremstilles ved omsetning av antibiotikum AR5-1 eller antibiotikum AR5-2 med den egnede forbindelse av formel VI, eller dets reaktive derivat, hvori Q er som ovenfor definert. Reaksjonen utføres under anvendelse av aminet som løsningsmiddel.

En forbindelse av formel IX hvori M er oxo og Q 2 er 6 10 6

som ovenfor definert, fortrinnsvis -SR , -S-R -NH-R (spe-

sielt -S-(CH2)2NH-R<6>),

-S-C(S)-SR<6>, °-C(0)OR6, -S-R<10>-COOH (fortrinnsvis hvori 0 -(CH2)n, hvori n er et helt tall fra 2 til 6),

-S-C(CH3)2-CH(NH2)-COOH eller -S-CH2~CH(NH2)COOH,

kan fremstilles ved omsetning av antibiotikum AR5-1 eller antitiotikum AR5-2 med den egnede forbindelse av formel VII hvori Q 2er som ovenfor definert, eller dets reaktive derivat. Fortrinnsvis utføres reaksjonen i et ikke reaktivt løsnings-middel slik som for eksempel en vandig blanding av en lavere alkohol (f.eks. methanol), en cyklisk ether (f.eks. tetrahydrofuran) og et dialkylacylamid (f.eks. dimethylformamid). Denne prosess kan for eksempel anvendes for fremstilling av forbindelser av formel IX hvori Q 2 er avledet fra en svovelholdig aminosyre slik som cystein, homocystein, pinicillamin og glutathion eller fra et mercaptan slik som et alkyl, aryl eller aralkylmercaptan slik som en ethyl, butyl, fenethyl eller p-methoxybenzylmercaptan.

En forbindelse av formel VIII, hvori Q<1>er -NH-C(0)NHR<6>eller -NHC(S)NHR<6>, R er H eller OH og M er 0 eller (H,OH), kan fremstilles ved omsetning av en tilsvarende forbindelse av formel VIII hvori Q<1>er amino med et isocyanat eller isothiocyanat av generell formel R<6>NCO (XI) eller R NCS (XII), vanligvis i et ikke-reaktivt organisk løsningsmiddel slik som benzen eller toluen. Fortrinnsvis er substituenten M i utgangsmaterialet oxo.

En forbindelse av formel VIII, hvor Q ■i er -NHR r,

R<6>

fi7 '7

-NR R eller en forestret aminosyre -NHCH-COOR , R er H

eller OH og M er 0 eller (H,OH), kan fremstilles ved omsetning av en tilsvarende forbindelse av formel VIII, hvori Q<1>

er -NH9 med det egnede aldehyd (R<6>CH0), keton (R<6>COR<7>) eller 2-oxo-carboxylsyre (R 6 C(0)COOR 7) i nærvær av et reduksjonsmiddel slik som natriumcyanoborhydrid, natriumborhydrid eller lithiumtri-tertiær butoxy-aluminiumhydrid. Reaksjonen utføres i et ikke-reaktivt løsningsmiddel slik som en lavere alkohol (f.eks. methanol), eller tetrahydrofuran. Hvis substituenten M i utgangsmaterialet av formel VIII er oxo, reduseres denne 9-oxogruppe ved denne reaksjon, og en blanding av 9-a- og 9-(3-dihydroderivatet erholdtes. Denne blanding kan oppløses etter kjente metoder, og om ønsket kan 9-dihydroderivatet oxyderes til den tilsvarende forbindelse av formel VIII hvori M er oxo og Q<1>er som definert i det foregående avsnitt. Det foretrekkes å anvende 2'-estere i denne prosedyre.

Eh forbindelse av formel VIII hvori Q<1>er

-NHC(0)R<6>, -NHC(0)OR<6>,

eller -N=CHR<6>, R er H eller OH og M er 0 eller (H,OH), kan fremstilles ved omsetning av en tilsvarende forbindelse av formel VIII, hvori Q er -NH2med en forbindelse inneholdende, ved siden av en forlatende gruppe, gruppen -C(0)R<6>, -C(0)OR<6>,

eller =CHR 6. Reaksjonen utføres i et

ikke-hydroxylisk løsningsmiddel slik som tetrahydrofuran. Det foretrekkes å anvende 2'-esteren av det ovenfor angitte utgangsmateriale og å anvende denne prosess på en forbindelse hvori M er oxo.

Forbindelser av generell formel XIII

hvori R er H eller OH; M er oxo eller (H,OH); A betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling, eller er sammen med carbonatomene i 12- og/ 13-stilling en oxiranring, og X er hydrogen, OH, mesyloxy, tosyloxy, tri-fluor, methansulfonyloxy, halo, azido, amino, isocyanato, isothiocyanato, guanidino, -NHR<6>, -NR<6>R<7>, -NHR<8>, -NHC(0)OR<6>,

-NHC(0)0R8, -NHC(NH)R6, -NH(CH2)pOH eller -NH(CH2pOR10, hvori p er et helt tall fra 2 til 18, eller -NHCOR6 når Y er hydrogen; eller hvor Y i kombinasjon med X er oxo, =N-NH2, =N_NHR11 eller =NHR<1]>-, hvori R<6>og R<7>uavhengig av

hverandre betegner en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer, eller en aralkylgruppe inneholdende 7-19 carbon-8 lo

atomer; R er en arylgruppe; R er en alkylgruppe inne-

holdende 1-18 carbonatomer, og R<11>er en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer, en aralkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer eller en heterocyklisk gruppe inneholdende 3-7 ledd hvori heteroatome.ne er valgt fra svovel, nitrogen og oxygen; kan fremstilles ved å underkaste en forbindelse av generell formel XIV

én eller flere prosesstrinn som ytterligere beskrevet i det etterfølgende. I formel XIV er R lik H eller OH, M er oxo eller (H,OH); A betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling, eller er sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring. Det foretrekkes å anvende utgangsforbindelsen i form av dens 2'-ester, og hvis M er (H,OH) dens 9,2'-diester. I utgangsmaterialet av formel XIV for disse prosesstrinn er substituent R og M og A identisk med R, M og A i det ønskede sluttprodukt.

(I eksepsjonelle tilfeller kan det imidlertid være fordelaktig å anvende et utgangsmateriale av formel XIV hvori M er forskjellig fra M i det ønskede sluttprodukt, og derpå innføre den ønskede substituent M). Prosesstrinnene er

meget anvendbare for fremstilling av forbindelser av generell' formel XIII hvori M er oxo. Invasjonen finner sted i flere av disse prosesstrinn. Epimeren av en forbindelse av formel XIII kan fremstilles ved utførelse av én eller flere av prosesstrinnene i en hensiktsmessig rekkefølge.

Prosesstrinnene er kjent innen faget. Det foretrekkes å anvende utgangsmaterialene i form av deres estere, spesielt 2'-estere. Estere avledet fra carboxylsyrer inneholdende 2-5 carbonatomer, fortrinnsvis avledet fra eddiksyre, er anvendbare. I den etterfølgende beskrivelse er forestringen av utgangsmaterialet og solvolysen av sluttproduktet (hvis sluttproduktet skal foreligge i fri form)

ikke spesifikt nevnt.

For fremstilling av en forbindelse av formel XIII hvori X er mesyloxy, omsettes esteren av en egnet substituert forbindelse av formel XIV med mesylklorid i tørr pyridin ved romtemperatur, (f.eks. 2'-esteren av antibiotikum AR5-1 eller AR5-2 underkastes denne reaksjon for å oppnå dets mesylat). Tosylater og trifluormethansulfonater (triflater) av forbindelsene av formel XIII kan likeledes fremstilles.

For fremstilling av en forbindelse av formel XIII hvori X sammen med Y betegner oxo, kan esteren av en egnet substituert forbindelse av formel XIV underkastes oxydasjon. Oxydasjonen utføres som beskrevet av Pfitzner and Moffatt, J.A.C.S. 1963, 85, 3027 ff. Eksmpelvis kan denne prosess anvendes for 2'-acetyl-antibiotikum AR5-1 eller 2'-acetyl-antibiotikum AR5-2 under dannelse av 2'-acetyl-4"-dehydro-antibiotikum AR5-1 eller 2<1->acetyl-4"-dehydro-antibiotikum AR5-2.

For fremstilling av ehforbindelse av formel XIII hvori X er azido, omsettes esteren av den tilsvarende forbindelse av formel XIII hvori X er trifluormethansulfonyloxy med natriumazid. I denne reaksjon finner det sted inversjon. Eksempelvis kan en 2'-ester av antibiotikum AR5-1 eller

AR5-2 underkastes denne reaksjon under dannelse av det tilsvarende 4"-epi-azid.

For fremstilling av en forbindelse av formel XIII hvori X er halogen, omsettes esteren av den tilsvarende for-

bindelse av formel XIII hvori X er trifluormethansulfonyloxy,

med et alkalimetallhalogenid i et ikke-reaktivt løsnings-middel slik som aceton. I denne reaksjon finner det sted inversjon. Hvis for eksempel dette prosesstrinn anvendes på 2'-esteren av triflatet av antibiotikum AR5-1 eller antibiotikum AR5-2 (erholdt ovenfor), under anvendelse av natriumjodid i aceton, erholdes det tilsvarende 4"-epi-jodid (hvori jod i 4"-stilling har den motsatte konfigurasjon enn konfigurasjonen av hydroxygruppen i antibiotikum AR5-1 eller antibiotikum AR5-2 erholdt ved fermentering).

For fremstilling av en forbindelse av formel XIII

hvori X er hydroxy, som har motsatt konfigurasjon enn hydroxygruppen i antibiotikum AR5-1 eller antibiotikum AR5-2 erholdt ved fermentering, omsettes det tilsvarende triflat som ovenfor erholdt (erholdt uten inversjon) med natrium-

acetat i eddiksyre (se for eksempel JACS 83, 3235,- 3244

(1961). Det således erholdte 4"-acetat er epimert med tri-Elatet og ved hydrolyse under basiske betingelser dannes 4"-epi-hydroxyderivater. Ved denne hydrolyse hydrolyseres også

de andre estergrupper i 2'-stilling og eventuelt 9-stilling.

Ved denne prosess kan eksempelvis epimeren av antibiotikum

AR5-1 og AR5-2 erholdes.

For fremstilling av en forbindelse av formel XIII

hvori X er 0=C=N- eller S=C=N-, omsettes esteren av en tilsvarende forbindelse av formel XIII hvori X er azido, med trifenylfosfin og carbondioxyd eller trifenylfosfin og carbondisulfid. Eksempelvis kan denne prosess anvendes på 2'-esteren av 4"-epi-azidet av antibiotikum AR5-1 eller antibiotikum AR5-2 erholdt som ovenfor beskrevet, for å fremstille det tilsvarende isocyanat eller isothiocyanat.

Esteren av 4"-epi-azidet (forbindelser av formel

XIII hvori X er azido) erholdt som ovenfor beskrevet, kan omdannes til den tilsvarende 4"-aminoforbindelse ved omset-

ning med trifenylfosfin ifølge Chem.Ber. 89, 2433 (1956).

I denne prosess finner inversjonen ikke sted slik at 4"-epi-aminderivatet av forbindelsen av formel XIV eller dens ester erholdes.

Eksempelvis kan 2'-esteren av 4 "-deoxy-4"-epi-

azido antibiotikum AR5-1 eller AR5-2 erholdt ifølge den ovenfor beskrevne prosess, underkastes denne prosess etter-

fulgt av hydrolyse, under dannelse av 4"-deoxy-4"-epi-amino antibiotikum AR5-1 eller AR5-2.

Esteren av 4"-epi-halogenforbindelsen av formel

XIII som ovenfor erholdt, kan omdannes til den tilsvarende 4"-aminoforbindelse ved omsetning med hexamethylentetraamin.

I denne reaksjon finner det sted inversjon.og 4 "-deoxy-4"-aminoderivatet (eller dens ester) av forbindelsen av formel XIV erholdes. Hvis for eksempel esteren av 4"-deoxy-4"-epi-jod-antibiotikum AR5-1 eller AR5-2 underkastes denne reak-

sjon, erholdes 4"-deoxy-4"-amino antibiotikum AR5-1 eller 4"-deoxy-4"-amino antibiotikum AR5-2.

. Esteren av 4"-epi-halogenforbindelsen av formel

XIII som ovenfor erholdt, kan dehalogeneres til det til-

svarende 4"-deoxyderivat. Dehalogeneringen kan utføres ved omsetning med tributyltinnhydrid, fortrinnsvis i toluen.

Hvis for eksempel esteren av 4"-deoxy-4"-epi-jod antibiotikum AR5-1 eller -AR5-2 (erholdt ifølge den ovenfor beskrevne

prosess) underkastes denne reaksjon og derpå underkastes solvolyse, erholdes 4"-deoxy antibiotikum AR5-1 eller 4"-

deoxy antibiotikum AR5-2.

En forbindelse av formel XIII hvori X er -NHR ,

6 7 8 -NR R eller -NHR , kan fremstilles ved omsetning av den tilsvarende 4"-aminoforbindelse (erholdt ifølge én av de ovenfor beskrevne prosesser), fortrinnsvis dens ester,

med et aldehyd (R<6>CHO eller R<8>CHO) eller keton (R<6>COR<7>),

i nærvær av et reduksjonsmiddel slik som natriumcyan-

borhydrid, natriumborhydrid eller lithiumtritertiær butoxyy aluminiumhydrid. Reaksjonen utføres i et ikke-reaktivt løsninqsmiddel slik som en lavere alkohol (f.eks. methanol).

6 7 8

R , R og R er som ovenfor definert.

Hvis substituenten M i utgangsmaterialet av formel

XIII er oxo, reduseres også denne 9-oxogruppe ved denne

reaksjon, og en blanding av 9-a- og 9-3-dihydroderivat erholdes. Denne blanding kan oppløses etter kjente metoder,

og om ønsket kan 9-dihydroderivatet oxyderes til den til-

svarende forbindelse av formel XIII hvori M er oxo.

En forbindelse av formel XIII hvori X er

-NHC(0)OR<6>eller -NHC(0)OR<8>kan fremstilles ved omsetning av den tilsvarende 4"-aminoforbindelse (erholdt ved én av de ovenfor beskrevne prosesser), fortrinnsvis i form av dens ester, med det egnede klorformiat (C1C00R eller C1C00R<8>), f.eks. methyl, ethyl, benzyl eller fenylklorfor-

miat, i nærvær av natriumcarbonat og vann. R 6 og R 8 er som ovenfor definert.

En forbindelse av formel XIII hvori X er -NHCOR<6>

(R er som ovenfor definert) kan fremstilles ved omsetning

av den tilsvarende 4"-aminoforbindelse erholdt ved én av de ovenfor beskrevne prosesser, fortrinnsvis i form av deres ester, med anhydridet eller halogenidet, fortrinnsvis klo-ridet,i et ikke-reaktivt løsningsmiddel slik som klorert hydrocarbon, methanol eller tetrahydrofuran.

En forbindelse av formel XIII eller dens ester,

hvori X er guanidino eller -NHC(NH)R<6>(R<6>, R, M og A er som ovenfor definert) kan fremstilles ved omsetninq av den tilsvarende 4"-aminoforbindelse eller dens ester med S-methyl-isothiourea eller en iminoether (f.eks. R 6 C(NH)OC2H5). Fortrinnsvis anvendes ekvivalente mengder av reaktantene, og S-methyl-isothiourea og iminoetheren er i ethanolisk løsning. Vanligvis utføres reaksjonen ved romtemperatur. Produktet isoleres fra reaksionsblandingen etter velkjente prosedyrer innen faget.

En forbindelse av formel XIII eller dens ester

hvori X er -NH(CH2)pOH eller -NH(CH)2pOR^^ hvori p er et helt tall fra 2 til 18, og R<10>, R, M og A er som ovenfor definert, kan fremstilles ved omsetning av den tilsvarende 4 "-aminof orbindelse eller dens ester med hal-(CII2) pOII eller hal-(CH2)pOR<10>(R<10>og p er som ovenfor definert, hal beteg-

ner halogen) i nærvær av en base slik som kaliumcarbonat i fortrinnsvis ethanol ved tilbakeløpstemperatur. Reaksjons-blandinqen fortynnet med vann og produktet isoleres etter veikjente.metoder innen faget.

En forbindelse av formel XIII (fortrinnsvis dens

ester) hvori Y sammen med X betegner oxo, kan reduseres til

en tilsvarende 4"(a,3)-hydroxyforbindelse. Et egnet reduksjonsmiddel er lithiumtri-tertiær butoxyaluminiumhydrid LiAIH [OC (CH-j) 3] 3 . Fortrinnsvis utføres denne reaksjon i et ikke-reaktivt løsningsmiddel slik som tetrahydrofuran.

Hvis utgangsmaterialet inneholder en 9-oxogruppe, erholdes

det tilsvarende 9(a,3)-dihydroderivat ved denne prosess.

Hvis for eksempel en 2'-ester av 4"-dehydro antibiotikum

AR5-1 eller 4"-dehydro antibiotikum AR5-2 underkastes denne reaksjon, erholdes en blanding av isomerene av de tilsvarende 9,4"-dihydroxyforbindelser.

Om ønsket kan det således erholdte produkt underkastes oxydasjon ved hjelp av Mn02under dannelse av de tilsvarende 9-oxo-4"-hydroxyforbindelser. Epimerene kan separeres fra hverandre før eller fortrinnsvis etter denne oxydasjon.

En forbindelse av formel XIII hvori X i kombinasjon med Y er =N-NH2, =N-NHR<1:L>eller^NR<11>, kan fremstilles ved omsetning av den tilsvarende forbindelse av formel XIII (fortrinnsvis dens ester), hvori X i kombinasjon med Y er oxo, erholdt ved den ovenfor beskrevne prosess, med hydrazin, substituert hydrazin (R<1->NH-NH9eller et primært amin

11

R NH2. Eksempelvis kan en 2'-ester av 4"-dehydro antibiotikum AR5-1 eller av 4"-dehydro antibiotikum AR5-2 omdannes til 2'-esteren av den tilsvarende Schiff-base (X i kombinasjon med Y er =NR11), eller av det tilsvarende hydrazon (X

i kombinasjon med Y er =N-NHR11). R<11>er som ovenfor definert.

Som det fremgår fra de ovenfor beskrevne prosesser er forbindelser av formel XIII hvori X er mesyloxy, tosyloxy, halogen, azido eller amino og hvori X i kombinasjon med Y er oxo, hyttige mellomprodukter.

I flere av de ovenfor beskrevne prosesser erholdes blandinger av isomerer. Disse isomerer kan separeres ved hjelp av kjente metoder innen faget, slik som kromatografi. Separasjonen kan utføres med de fri forbindelser eller deres estere.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen inneholder hydroxylgrupper i stillingene 2' og/eller 4" og/eller 9 og/eller 14 og/eller 21, som kan forestres til ikke-toksiske farmasøytisk akseptable estere med hydrocarboncarboxylsyrer. Typiske acyleringsmidler er anhydrider, klorider eller aktiverte estere av hydrocarboncarboxylsyrer. Forestringen utføres vanligvis i et ikke-reaktivt^løsningsmiddel slik som aceton, tertiært amin (pyridin), tetrahydrofuran oq dimethylformamid.

Reaktiviteten av disse hydroxygrupper er forskjellig, og følgelig kan forbindelser inneholdende fri og for-es trede hydroxygrupper eller hydroxygrupper forestret med' forskjellige syrer fremstilles ved egnede forestrings- og hydrolysetrinn. (Hydrolyse kan for eksempel utføres i lavere alkohol, f.eks. methanol). Dette forklares ved følgende eksempler: Hydroxygruppen i 2'-stilling har størst reaktivitet. 2'-monoestrene kan fremstilles direkte ved behandling av det fri uforestrede antibiotikum med en støkiometrisk mengde (eller et svakt overskudd) av et acyleringsmiddel, slik som et acylhalogenid eller acvlanhydrid i fravær av en base ved omgivende temperatur, fortrinnsvis i et ikke-reaktivt løs-sningsmiddel slik som aceton. Reaksjonen fortsettes i fra 1 til 20 timer inntil forestringen er hovedsakelig fullført og etterfølqes av isolering av 2 •' -monoesteren fra reaks jons-blandingen.

2',4"-diestrene kan fremstilles direkte ved behandling av de fri antibiotika med et overskudd av acyleings-middel ved omgivende temperatur i fra 1 til 7 daqer inntil forestrinqen er fullført, og isolering av 2<1>,4"-diesteren fra reaksjonsblandingen.

Alternativt kan 2',4"-diestrene fremstilles ved behandling av en 2'-monoester med et overskudd av acyleringsmiddel under hovedsakelig samme betingelser som beskrevet ovenfor for den direkte forestring. Denne prosedyre er spesielt fordelaktig for fremstilling av blandede estere hvori den ønskede forbindelse har en forskjellig acylfunk-sjon på hver av stillingene 2' og 4". 4"-monoesteren fremstilles hensiktsmessig ved solvolyse av en 2<1>,4"-diester.

C-21-hydroxylgruppen som er en primær alkohol,

er foresterbar med kjente acyleringsmidler innen faget.

I lys av den større reaktivitet av 2<1->hydroxvlgrup<p>en i desosamingruppen, fremstilles imidlertid C-21-estrene ved indirekte metoder. Ved behandling av desmycinosylderivatet med et overskudd av acylerinqsmiddel slik som eddiksvre-

anhydrid i et tertiært amin (pyridin), dannes eksempelvis 2',21-diesteren (f.eks. 2',21-diacetatet). For å frem-

stille 21-monoesteren underkastes 2',21-diesteren selektiv solvolyse slik som beskrevet i US-PS 4 056 616 av 1. nov. 1977.

I en forbindelse inneholdende hydroxy i 2',4"-

og 9-stilling har 2'-hydroxygruppen den høyeste reaktivitet. Mono-, di- oq tri-estere kan fremstilles ved egnet sekvens

av forestrings- og hydrolysetrinn.

Hvis en forbindelse inneholdende en fri amino-

gruppe og én eller flere fri hydroxygrupper underkastes acylerinq som ovenfor beskrevet, kan alle disse grupper acyleres (unntatt hydroxygruppen i 14-stilling). For å fremstille en forbindelse inneholdende fri hydroxyqrupper i stillinqer 9 og/eller 2' og/eller 4", underkastes produk-

tet selektiv hydrolyse ved metoder som har mer fordel av den større stabilitet overfor hydrolyse av acylaminogrupper enn de acylerte hydroxygrupper.'

Estrene ifølge oppfinnelsen er avledet fra carboxylsyrer med fra 2 til 18 carbonatomer, som'vanligvis anvendt innen det farmasøytiske fag.

Omfattet er alifatiske, cycloalifatiske, aroma-

tiske og heterocykliske innbefattet hemiestrene dannet med dicarboxylsyre. Eksempler på egnede syrer er eddiksyre, propionsyre, valerinsyre, stearinsyre, vinsyre, maleinsyre, oxalsyre, eplesyre, malonsyre, sitronsyre, oljesyre,

palmitinsyre, laurinsyre, melkesyre, fumarsyre, ravsyre, cyclopropylcarboxylsyre, cyclopentylcarboxylsyre, adamantoin-syre, furlonsyre, nicotinsyre, thenoinsyre, picolinsyre, benzoesyre, fenyleddiksyre og lignende.

Farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter

ifølge oppfinnelsen er avledet fra syrer som generelt

anvendes innen det farmasøytiske fag, innfattet uorganiske syrer slik som for eksempel svovelsyre, fosforsyre og hydrohalogensyre (f.eks. saltsyre), og borsyre og carboxylsyrer med 2-18 carbonatomer slik som de ovenfor eksempli-fiserte for estrene.

Syreaddisjonssalter har øket vannløselighet og er derfor anvendbare for parenteral administrering.

Følgende forbindelser eksemplifiserer forbindelsene av formel I og deres estere, som kan fremstilles etter de ovenfor beskrevne prosesser:

antibiotikum AR5-1,

antibiotikum AR5-2

12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1, 12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2,

2'-acetyl antibiotikum AR5-1,

2'-acetyl antibiotikum AR5-2,

2'-acetyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2, 4 "-acetyl antibiotikum AR5-2,

4"-acetyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2, 2',4"-diacetyl antibiotikum AR5-2,

2',4"-diacetyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2, desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1, desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2, desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro-21-acetyl og -21,2'-diacetyl antibiotikum AR5-2,

desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro-2'-acetyl antibiotikum AR5-2,

ll-amino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-1, ll-amino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, ll-ethylthio-10,11-dihydro antibiotikum AR5-1, ll-ethylthio-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2,

11-(p-methoxybenzylthio)-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, 2',4"-diacetyl-ll-acetamido-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, 2<1->acetyl-ll-acetamido-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, ll-acetamido-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2,

11-(l-piperidinyl)-lO,11-dihydro antibiotikum AR5-2, 11-morfolino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2,

11-4-methylpiperazinyl-lO,11-dihydro antibiotikum AR5-2,

11-thioraorfolino-10,11-dihydro antibiotikum. AR5-2, ll-L-cysteinyl-ethylester-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, 10,11-dihydro-11-(4-ethyl-2,3-dioxo-piperazinocarbonylamino) antibiotikum AR5-1,

10,11-dihydro-11-(4-ethyl-2,3-dioxo-piperazinocarbonylamino) antibiotikum AR5-2,

9,9,10,11-tetrahydro-ll-(4-ethyl-2,3-dioxo-piperazino-carbonylamino) antibiotikum AR5-2,

10,11-dihydro-ll-(p-methoxybenzylthio) antibiotikum AR5-1, 10,11-dihydro-ll-(p-methoxybenzylthio) antibiotikum AR5-2, 10,11-dihydro-ll-(ethylthioxanthyl) antibiotikum AR5-1, 10,11-dihydro-ll-(ethylthioxanthyl) antibiotikum AR5-2, 10,11-dihydro-ll-(penicillaminyl) antibiotikum AR5-1, 10,11-dihydro-ll-(penicillaminyl) antibiotikum AR5-2, 10,11-dihydro-ll-(cysteinyl) antibiotikum AR5-1, 10,11-dihydro-ll-(cysteinyl) antibiotikum AR5-2,

9-dihydro antibiotikum AR5-1,

9-dihydro antibiotikum AR5-2,

2<1->acetyl-4"-dehydro-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2,

2'-acetyl-4"-dehydro antibiotikum AR5-2,

2'-acetyl-4"-dehydro antibiotikum AR5-1,

9-dihydro-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1, 2'-acetyl-4"-methansulfonyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2,

9-dihydro-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2, 9,2',4"-triacetyl-9-dihydro-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2,

4"-methansulfonyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2,

2<1->acetyl-9-dihydro-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2,

10,11-dihydro antibiotikum AR5-1,

21-dimethylamino-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1,

21-dimethylamino-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2,

21-amino-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro

antibiotikum AR5-1, 21-amino-desmycinosvl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro

antibiotikum AR5-2, 9-dihydro-21-amino-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1,

9-dihydro-21-amino-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2,

21-oxo-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro anti-

biotikum AR5-1,

21-oxo-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro anti-

biotikum AR5-2,

9-dihydro-21-guanidino-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-

dehydro antibiotikum AR5-1,

9-dihydro-21-guanidino-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-

dehydro antibiotikum AR5-2,

9-dihydro-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1,

9-dihydro-desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2,

Basert på klassiske kjemiske analyser slik som kjernemagnetisk resonansspektrometri (NMR),

infrarød spektroskopi (IR), ultrafiolett spektroskopi (UV), massespektroskopi (MS) og også på kromatografi mot kjente antibiotica, ble det fastslått at medlemmene av AR-5-

komplekset er macrolider. Hydrolyse av de individuelle komponenter fastslo nærvær av to sukkere, mycinose og desosamin. Begge sukrene er blitt funnet å være bestand-

deler av andre velkjente antibiotica. Imidlertid har de tidligere ikke blitt funnet å være bestanddeler av samme macrolide antibiotikum og i samme stillinger.

Fysikalske data for representative forbindelser

ifølge oppfinnelsen er vist de etterfølgende tabeller 6 - 10.

I de foregående kromatografiske sammenligninger skal det bemerkes at ingen av systemene separerer fullstendig antibiotikaene ifølqe oppfinnelsen fra hverandre. De tjener imidlertid til å skille antibiotikum AR-S kompleks fra enkelte av de kjente macrolider.

Tabell 10

Karakteristiske infrarøde absorpsjonstopper

De karakteristiske infrarøde absorpsjonstopper

er angitt som bølgenummerverdier og er nøyaktige innen 3 cm 1. Spektraene ble erholdt på en Perkin-Elmer modell 180 I.R. gitter spektrofotometer som løsninger i kloroform.

De angitte bokstaver har følgende betydninger:

s = sterk, m = middels, W = svak og vs = meget sterk.

På basis av de foregående fysiokjemiske data og isolering av mycinose og desosamin fra hydrolysen av de respektive antibiotiske forbindelser, kan det konkluderes med at antibiotikum AR5-1, antibiotikum AR5-2 og de tilsvarende 12,13-dehydroderivater (definert ovenfor) har den plane strukturformel I. Gruppen av formel II har konfigurasjonen av Dpmycinose. De samme plane formler gjelder for derivatene av disse forbindelser som beskrevet her.

Antibiotikaene ifølge oppfinnelsen ble underkastet anerkjente tester for å bestemme deres antibakterielle profil. Testmetodikk og et sammendrag av resultatene er angitt i det etterfølgende.

Antibiotikum AR5-1, antibiotikum AR5-2, deres 12,13-desepdxy-12,13-dehydroanaloger, erythromicin og rosaramicin ble underkastet samme tester: In vitro næringsvæske fortynningstester (MIC-verdier) ble foretatt på konvensjonell måte ved anvendelse av enten Mueller-Hinton-næringsvæske (gram-positive og gram-negative bakterier), Sabouraud Dextrose-næringsvæske (fungi) eller flytende thioglycollat-næringsvæske (anaerobe bakerie) ved den passende pH, i volumer på 3 - 5 ml/rør. Inocula ble erholdt ved fortynning av enten over natten gamle kulturer (gram-positive og gram-negative bakterier og gjær), 48 timers gamle kulturer (anaerobe bakterier), eller 4-5 dager gamle kulturer (dermatofyter). Rørene ble inkubert ved 28° C (dermatofyter), eller 37° C (gram-positive og gram-negative bakterier og gjær), og endepunktene ble avlest etter 24, 48

og 7 2 timer.

In vitro agar fortynningstester ble utført under anvendelse av Mueller-Hinton. agar som ble smeltet før bruk og avkjølt til ca. 55° C før tilsetningen av egnede volumer av forbindelsesløsning, under dannelse av doble seriefor-tynninger. 30 ml ble overført til 100 x 15 mm ? Integrid R petriskåler og fikk tørke over natten. Plater ble inokulert med en Steers-Foltz-anordning. Inoculum-konsentrasjoner ble justert slik at hver inokulerende stav i Steers-anordningen avga ca. 10^ levedyktige enheter av hver organisme til agar-overflaten. De inokulerte plater fikk tørke og ble deretter

inkubert ved 37° C. MIC-verdier ble bestemt etter 24 og 48

timers inkubasjon. MIC er den laveste konsentrasjon ved hvilken mindre enn seks isolerte, adskilte kolonier var synlig.

I de etterfølgende tabeller 11 - 13 er de testede antibiotika angitte i følgende rekkefølge: antibiotikum AR5-1

er A, 12,13-desepoxy-12,13-dehydro-antibiotikum AR5-1 er B, antibiotikum AR5-2 er C, 12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2 er D, Erythromycin er E og Rosaramicin er

F:

Staphylococcus-isolatene ble oppdelt i tre grupper:

SS R S

E R , erythromycin og rosaramicn-følsomme stammer, ES, erythromycin-resistens og rosaramacin-følsomme stammer,

E R R R, stammer resistente overfor både erythromycin og rosaramicin. Bare overfor den sluttelige gruppe av macrolid-resistente stammer mistet antibiotikaene ifølge oppfinnelsen aktivitet. De var aktive overfor enkelte anaerobe stammer slik som B. fragilis og Clostrida, men viste ikke den gram-negative styrke som utvises av rosaramicin.

In vivo musebeskyttelsestester ble utført på hann-

mus (Carworth CF-1) som hver veide 18 - 20 gram. Infeksjon ble fremkalt med ca. 10 7 organismer pr. mus eller tilstrek-

kelig inocula for å fremkalle død av kontrollgrupper 24 -

28 timer etter infeksjon. De infiserende organismer innbefattet stammer av Staphylococcus Enterococcus, &-hemolytisk Streptococcus og E. coli.

Serumnivåer av de respektive antibiotika ble målt

i mus, rotter og hunder. Resultatene var overraskende idet at de nye antibiotikaer utviste terapeutiske serumnivåer betydelig lenger enn erythromycin eller rosaramicin. Det ble også observert at antibiotikum AR5-2 fremkalte topp-serumnivåer tidligere enn noen av de andre testede antibiotikaer, imidlertid fremkalte antibiotikum AR5-1 terapeu-

tiske serumnivåer med lenger varighet. Dette fenomen gir betydelig støtte for farmasøytisk doseringsformer innehol-

dende begge forbindelser. Dette vil kunne gi færre doser pr. dag uten å ødelegge den terapeutiske effekt.

Sammenlignende in vivo PD^^-verdier med erythromycin og rosaramicin viste en meget stor fordel som forbindelsene ifølge oppfinnelsen utviser. Ulik erythromicin og rosaramicin, med ett unntak, synes forbindelsene ifølge oppfinnelsen å være like kraftige oralt og subcutant. Generelt er antibiotikum AR5-1 og 12 ,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1 30 - 40 ganger mer kraftig oralt enn erythromicin og rosaramicin.

De akutte toksisitetsbestemmelser ble utført med grupper av hannmus (Carworth CF-1) som veide 18 - 20 g. LDj-Q-verdier (den dose som var lethal for 50 % av musene)

ble beregnet ved analyser basert på antall overlevende 24 og 48 timer etter dosering.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen utviser en anti-bakteriell effekt overfor et vidt spekter av bakteriearter, spesielt overfor stammer av gram-positive bakterier. Eksempler på bakterier overfor hvilke forbindelsene ifølge oppfinnelsen er aktive, er forskjellige stammer av Streptococcus pyogenes, Staphylococcus aureus og Bacillus subtilis. Forbindelsene kan således anvendes ved behandling av varm-blodige dyr som lider av sykdommer fremkalt av slike organismer. Absorpsjonen er bedre enn for lignende macrolide antibiotikaer. Forbindelsene kan også anvendes for in vitro formål som desinfeksjonsmidler for laboratorieglass, dental og medisinsk utstyr.

Antibiotikaene ifølge oppfinnelsen kan administreres topisk, parenteral og oralt, fortrinnsvis i blanding med egnede farmasøytiske bærer og eksipienter.

Doseringsformene, unntatt topisk administrering, skal være formulert til å gi en administrering av fra 5 til 50 mg pr. kg pr. dag. Topiske formuleringer skal påføres de påvirkede områder to til fire ganger pr. dag og skal inneholde fra 5 til 15, fortrinnsvis ca. 10, gram pr. liter for lotions og den samme mengde pr. kg for salver.

Imidlertid skal det taes i betraktning at mange faktorer slik som for eksempel alder og generell fysisk tilstand på pasienten, arten av infiserende organisme influe-rer på den nøyaktige dosering av det medikament som skal administreres.

De antibakterielle forbindelser ifølge oppfinnelsen kan utleveres i form av for eksempel kapsler, tabletter, eliksirer og som injiserbare løsninger og suspensjoner.

Formuleringer kan inneholde én eller flere av antibiotikaene ifølge oppfinnelsen.

I tester utført med pattedyr er det blitt fastslått at antibiotikum AR5-2 når et topp serumnivå tidligere enn antibiotikum AR5-1 ved subcutan eller oral administrering, mens antibiotikum AR5-1 gir topp serumnivåer som varer betydelig lenger enn for antibiotikum AR5-2. En kombina-sjonsdose har således den fordel at den gir et tidlig og forlenget topp-serumnivå.

En foretrukket kombinasjon er en farmasøytisk doseringsform inneholdende 30 - 60 %, fortrinnsvis 40 - 50 %, av én av antibiotikumene AR5-1 og antibiotikum AR5-2 i doseringsform i blanding med egnede . farmasøytiske eksipienter, hvor det gjenværende av det antibakterielle aktive materiale er den andre av antibiotikum AR5-1 og antibiotikum AR5-2. En annen foretrukket formulering inneholder angitte antibiotikaer i like deler.

Fra de angitte testresultater kan det konkluderes med at forbindelsene ifølge oppfinnelsen er nyttige antibakterielle midler. Visse grupper og individuelle forbindelser er av særlig interesse: Fra estrene av forbindelsene av formel I er de foretrukne hvor hydroxygruppen i 9- og/eller 21 og/eller 2'-og/ellér 4" er forestret med mono-carboxylsyrer eller dicarboxylsyrer hver med fra 2 til 18 carbonatomer, spieselt de hvori hydroxygruppene er forestret med en monocarboxylsyre inneholdende 2 eller 3 carbonatomer.

Fra forbindelsene av formel I inneholdende substi-tuenter R og/eller R<3>og/ellerR<4>og/eller R^ og/eller R<6>og/ellerR^og/ellerR<8>og/eller R 0 og/eller R11, er de foretrukne hvori R<2>, R<3>, R<4>, R<6>, R<7>, R<10>og R<11>er en alkylgruppe inneholdende rettkjedede eller forgrenede alkyl-radikaler med 1-8 carbonatomer, fortrinnsvis methyl eller ethyl, R 5 er hydrogen og R 8 er fenyl.

Uttrykket "heterocyklisk gruppe" som anvendt i

2 3 9 11 definisjonen av substituentene R , R , R og R kan eksemplifiseres ved pyridyl, furanyl, pyrrolidinyl, piperazinyl, pyrazinyl, azetidinyl, tetrazol, triazol, oxazol og isoxazol.

Uttrykket amino "syrerest" som anvendt i definisjonen for forbindelsene av formel I kan eksemplifiseres ved alanyl, glycyl, arginyl, sarcosyl, tyrosyl, fenylalanyl, methionyl, seryl, lysyl, asparaginyl, isoleucyl, leucyl, threonyl, histidyl, aspartyl, valyl, prolyl, glutaminyl, triptofanyl og glutamyl.

Forbindelser av generell formel XIV

i fri form eller i form av deres ester eller salt, hvori R

er hydrogen eller hydroxy, M er oxo eller (H,OH), A betegner sammen med carbontomene i 12- og 13-stilling en oxiranring,

eller en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling, er antibiotikum AR5-1, antibiotikum AR5-2, deres 9(a,3)-(H,0H)-analoger og 12 ,13-desepoxy-12,13-dehydro-derivatene av disse forbindelser. Som angitt tidligere er en blanding av antibiotikum AR5-1 og antibiotikum AR5-2

særlig foretrukket, hvori antibiotikum AR5-1 utgjør 30 -

60 % (fortrinnsvis 50 %) av blandingen, og hvor antibiotikum AR5-2 utgjør resten av blandingen.

Forbindelser av formel I i fri form eller i form

av deres estere og salter, hvori R er hydrogen eller hydroxy,

M er oxo eller (H,0H), A og B betegner dobbeltbindinger og

Z er -CH2OH, -CHO, -CH2NH2, -CH2NHR<2>, -CH2NR<2>R<3>, -Cr^OCOR<2>,

, CH20-glycosyl unntatt -CH-jO-mycinosyl

og -CH90-(3"-desmethyl-mycinosyl), -CH^-ureido eller CH~-

2 3 5 thioureido, og R , R og R er som ovenfor definert. Av disse forbindelser er særlig de av interesse hvori M er (H,OH) og de hvori Z er CH2NH2, -CH2N(CH3)2,

og i særdeleshet -CH20H. Desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1 er av stor interesse. Forbindelser av generell formel I, i fri form eller i form av deres estere eller salter, hvori A sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling betegner en oxiranring, X er OH og Y er H, B er sammen med carbonatomene i 10- og 11-stilling gruppen -CH2-CH(Q<1>)-, hvori -Q1 er -NH2, -NHC(0)R<6>, -NHR<6>, -NR<6>R<7>,

en amino-

syrerest, en forestret aminosyrerest eller et heterocyklisk

radikal med seks ledd inneholdende enten nitrogen som eneste heteroatom eller nitrogen og et annet heteroatom som er nitrogen, oxygen eller svovel; spesielt de hvori Q<1>er

-NH-, -HC(0)R g, thiomorfolino, 4-methylpiperazinyl,

6 7

morfolino eller piperidinyl; R, M, R og R er som ovenfor definert. 11-thiomorfolino-10,11-dihydro antibitokum AR5-2, ll-amino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-1, 11-amino-l0,11-dihydro antibiotikum AR5-2, 11-acetamido-l0,11-dihydro antibiotikum AR5-2, 11-(piperidinyl)-10,11-dihydro antibiotikum AT5-2, 11-morfolino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2 eller 11-(4-methylpiperazinyl)-10,11-dihydrq antibiotikum AR5-2 er av særlig interesse.

10,11-dihydro antibiotikum AR5-1

Forbindelser av generell formel I i fri form eller

i form av deres estere eller salter hvori A sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling betegner en oxiranring, X er ON og Y er H, B er sammen med carbonatomene i 10- og 11-2 2 6

stilling gruppen -CH2-CH(Q )-, hvori -Q er -S-R , thioxanthyl, en svovelholdig aminosyrerest, eller en svovelholdig forestret aminosyrerest; og R, M og R ger som ovenfor definert, spesielt 11-ethylthio-10,11-dihydro antibiotikum AR5-1, ll-ethylthio-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, 11-(p-methoxybenzylthio)-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, eller ll-L-cysteinyl-ethylester-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2.

Forbindelser av generell formel I, i fri form

eller i form av deres estere eller salter, hvori X er hydrogen, OH, mesyloxy, halo, azido, amino, guanidino, -NHR<6>, -NR<6>R<7>, -NHR<8>, -NHC(0)OR<6>, -NHC(0)OR<8>når Y er hydrogen; eller hvor Y i kombinasjon med X er oxo og R, M,

6 7 8

R , R og R er som ovenfor definert, og A betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling, eller er sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring; B betegner en dobbeltbinding medllom carbonatomene i 10- og 11-stilling, spesielt de hvori X er mesyloxy og Y er hydrogen eller hvor Y i kombinasjon med X er oxo. 2<1->acetyl-4"-dehydro antibiotikum AR5-2, 2'-acetyl-4"-dehydro antibiotikum AR5-1, 2<1->acetyl-4"-methan-

sulfonyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2,

og 4"-methansulfonyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum A5-2 er av særlig interesse.

Eksempel 1 Fremstilling av antibiotikum AR- 5- kompleks

Fremstilling av inoculum

Fremstill 3,0 liter av annen trinns inoculum

ifølge den prosedyre som er angitt i beskrivelsen under anvendelse av M.polytrota NRRL 12066.

Fermentering

Seks 14 liters fermenteringskar inneholdende 10

liter medium C ble sterilisert, avkjølt til 30° C og inocu-

lert med 500 ml av trinn to inoculum. Inkuber hver fermen-teringsblanding ved 30° C med rotasjonsomrøring ved 350 omdr..

pr. minutt og gjennomluftning ved 0,35 vvm. Juster fermen-teringsblåndingen til pH 7 ved starten av fermenteringen og opprettholdt pH på 7,0 + 0,5 ved tilsetning av fortynnet alkali om nødvendig. Fortsett fermenteringen i ca. 72 timer og start deretter overvåkning med henblikk på antibiotisk produksjon.

Isolering og rensing av antibiotikaene

Når topp antibiotisk konsentrasjon nåes, kombiner

de seks satser til en 60 liters sats. Ekstraher de kombi-

nerte satser to ganger med 120 liter ethylacetat. Konsen-

trer ekstraktene til en olje i vakuum. Absorber det olje-

aktige residuum på en kolonne inneholdende 2,1 liter Sephadex LH-20 og eluer med ethylalkohol. Eluater inneholdende antibakterielt aktive fraksjoner som bestemt ved skivetesting mot Staphylococcus aureus 209P ble kombinert, konsentrert og absort på en kolonne inneholdende 400 g silicagel. Eluer med den nedre fase av et kloroform:methanol:petrolether:vannsystem (3:3:1:1). Overvåk eluatet under anvendelse av HPTLC og kombiner fraksjoner inneholdende like materialer.

Utbytte - 913 mg antibiotikum AR5-1 og 12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1.

950 mg antibiotikum AR5-2 + 12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2.

Rensing av antibiotikaene

Absorber 1,1 g urent antibiotika AR5-2 (forurenset med 12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibitoikum AR5-2 på en kolonne inneholdende 130 g silicagel og eluer som tidligere beskrevet under dannelse av 297 mg av antibiotikum AR5-2

(HPLC analyse viser at produktet er renere enn 95 %). Kom-

biner og konsentrer de gjenværende eluater under dannelse av 12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2.

Gjenta den ovenfor beskrevne rensing under anven-

delse av 1,2 g urent antibiotikum AR5-1 (forurenset med 12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1) under dan-

nelse av 400 mg av en oljeaktig, uoppløst blanding. Under-

kast 8,9 mg av denne blanding preparativ HPOLC under anven-

delse av Partial M9 PAC som den stasjonære fase og under anvendelse av den nedre fase av et methylenklorid:heptan: vann (3:2:1) system under dannelse av 7,5 mg 95 % rent ved HPLC. Kombiner de gjenværende eluater under dannelse av 12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1.

Eksempel 2

10, 11- dihydro- ll-( amino)- antibiotikum AR5- 1

Oppløs 3,5 g antibiotikum AR5-1 i 35 ml methanol

mettet med ammoniakk. Omrør løsningen ved romtemperatur

(20° C) i 2 dager og konsentrer løsningen til et residuum.

Oppløs residuet i et løsningsmiddelsystem bestående av

toluen, methylenklorid, methanol og konsentrert ammoniumhydroxyd i et forhold på 16:4:1:1 og kromatografer på en silicagelkolonne inneholdende 400 g silicagel under anven-

delse av det ovenfor beskrevne løsningsmiddelsystem som elueringsmiddel. Kombiner.og konsentrer fraksjonene inneholdende det ønskede antibiotikum til et residuum. Ved å underkaste en ekvivalent mengde antibiotikum AR5-2 prose-

dyren ifølge dette eksempel ble 10,11-dihydro-ll-amino antibiotikum AR5-2 fremstilt.

Eksempel 3

10, 11- dihydro- ll-( p- methoxybenzylthio) antibiotikum AR5- 2

Oppløs 100 mg antibiotikum AR5-2 i tilstrekkelig tetrahydrofuran for å oppløse dette. Tilsett 3 dråper p-methoxybenzylthiol og la løsningen stå ved romtemperatur

(20° C) i ca. 72 timer. Fortynn reaksjonsblandingen med ethylacetat. Kromatografer på silicagel GF. Ereparative plater med en tykkelse på 1000 mikrometer

under anvendelse av en blanding av kloroform, methanol, petroleumether og vann i forholdet 3:3:1:1 som fremkallende løsning. Fjern silicagel inneholdende antibiotika som bestemt ved observasjon under ultrafiolett lys, og oppløs produktet i ethylacetat. Konsentrer ethylacetatekstraktet til et residuum under dannelse av 34 mg antibiotikum AR5-2. Ekstraher silicagelet med aceton og konsentrer til et

residuum på 44 mg av produktet ifølge dette eksempel.

Ved å anvende en ekvivalent mengde av antibiotikum . AR5-1 og følge fremgangsmåten ifølge dette eksempel ble 10,11-dihydro-ll-(p-methoxybenzylthio) antibiotikum AR5-1 fremstilt.

Formulering. 1

Prosedyre

1. Bland antibiotika og lactose.

2. Tilsett magnesiumstearat og bland.

3. Fyll kapsel.

Formulering 2

Prosedyre 1. Oppvarm 200 ml vann til kokning og oppløs i denne halvpart av parabenet. Avkjøl til ca. 70° C, bland i Polysorbat 80. Strø i silikatet, omrør til en jevn glatt suspensjon. 2. Oppvarm ytterligere 200 ml til kokning og oppløs det gjenværende av parabenet. Disperger CMC i denne til en glatt gel. Bland i Sorbitol-løsningen. Oppløs natrium-citrat deri. 3. Tilsett produktet fra Trinn 2 til det fra Trinn 1 langsomt under konstant omrøring. Avkjøl blandingen til 25° C. Tilsett antibiotikum AR-5 komponent 2, tartrat-smaksstoff og farvestoff og bland grundig. Tilsett tilstrekkelig mengde vann til et totalt volum på 1000 ml.

Formulering 3

P rosedyre

1. Smelt petrolatum. 2. Oppslem antibiotikum med ca. 10 % av petrolatum og før gjennom en colloidalmølle. 3. Bland den malte oppslemming med den gjenværende, del av smeltet petrolatum. Avkjøl.

Formulering 4

Prosedyre

1. Oppvarm stearinsyren, sorbitan-monostearat, sorbitan-monooleat og polyoxyethylen sorbitan-monolaurat til 65° C.

2. Oppvarm ca. 90 % av vannet til 70° C.

3. Tilsett vannet til trinn 1 og bland under dannel-

se av en krembase. 4. Oppslem antibiotikumet med ca. 10 % av vannet og før gjennom en colloidalmølle. 5. Tilsett den malte oppslemming til den smeltede base og bland. Avkjøl.

Formulering 5

Prosedyre

1. Bland antibiotikaene og lactosen.

2. Tilsett magnesiumstearat og bland.

3. Fyll kapsel.

I de foregående formuleringer kan antibiotikaene ifølge oppfinnelsen, de ikke-toksiske, farmasøytisk akseptable estere og ikke-toksiske, farmasøytiske akseptable syreaddisjonssalter derav anvendes i ekvivalent mengde,

uten vesentlig modifisering av den terapeutiske effekt som oppnås ved bruk av disse.

Eksempel 4

2 '- acetyl- 4"- dehydro antibiotikum AR5- 2

Oppløs 3 g R-2 i 70 ml aceton ved 20 - 25° C, tilsett 0,4 ml eddiksyreanhydrid under omrøring og fortsett omrøringen i 6 timer. Tilsett 30 ml benzen og fordamp under høyvakuum til et hvitt residuum inneholdende 2'-acetyl AR5-2.

Oppløs 3,6 g 2'-acetyl-AR5-2 i 13,7 ml tørr di-methylsulfoxyd, 27 ml tørr benzen og 0,33 ml pyridin, 0,17 ml friskt destillert trifluoreddiksyre og 2,54 g dicyclo-hexylcarbodiimid. Omrør blandingen ved 20 - 25° C i 7 timer. Filtrer, vask det faste materiale med benzen, kombiner filtratet og vaskevannene og vask med 3 x 100 ml destillert vann og deretter igjen med en mettet natriumkloridløsning. Tørk det organiske lag over magnesiumsulfat og fordamp løs-ningsmidlet under dannelse av 2'-acetyl-4"-dehydro AR5-2.

Eksempel 5

Desmycinosyl- 12, 13- desepoxy- 12, 13- dehydro antibiotikum AR5- 1

Oppløs 3,5 g 2'-acetyl-4"-dehydro-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1 (erholdt ved å.underkaste 12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-1 den prosedyre som er beskrevet i eksempel 4) i 100 ml methanol, tilsett 25 g silicagel (J.T. Baker, 60 - 200 mesh) og omrør ved 20 - 25° C i 4 dager, filtrer og vask det faste materiale med 100 ml 10 % methanol i kloroform. Kombiner filtratet og vaskevannet og fordamp til et residuum under høy-vakuum. Kromatografer residuet over 300 g aluminiumoxyd (type IV, Woelm), eluer med 500 ml hver av 0,5 % methanol i kloroform, 1 % methanol i kloroform og 5,0 % methanol i kloroform under dannelse av titelforbindelsen.

1. 2',4"-diacetyl antibiotikum AR5-2

2. 2',4 "-diacetyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2

3. 11-(p-methoxybenzylthio)-10,11-dihydro .

antibiotikum AR5-2

4. ll-ethylthio-10,11-dihydro antibiotokum AR5-2 5. 9-dihydro-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2 6. 9,2<1>,4"-triacetyl-9-dihydro-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2 7. ll-ethylthio-10,11-dihydro antibiotika AR5-1 8. 4"-methansulfonyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2 9. 2'-acetyl-9-dihydro-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2 10. 2'-acetyl-4"-dehydro antibiotikum AR5-2 11. ll-acetamido-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2 12. 11-(1-piperidinyl)-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2 13. 11-(2-amino-2-ethoxycarbonylethanthio) 10,11-dihydro antibiotikum AR5-2 14. 11-morfolino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2

15. 11-(4-methylpiperazinyl)-10,11-dihydro

antibiotikum AR5-2

16. 11-thiomorfolino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2 17. 10,11-dihydro antibiotikum AR5-1 18. 4"-acetyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2 19. 4"-acetyl antibiotikum AR5-2 20. 9-dihydro-12,13-desepoxy-12/13-dehydro antibiotikum AR5-1 21. 9-dihydro antibiotikum AR5-2 22. 2'-acetyl antibiotikum AR5-2 23. 9-dihydro antibiotikum AR5-1

f

24.Desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2

Claims (13)

1. Macrolid antibiotikum av generell formel I:

hvori R er H eller OH, M er 0 eller (H,OH); Z er gruppen av formel II

hvori X er hydrogen, OH, mesyloxy, tosyloxy, trifluor-methensulfonyloxy, halo, azido,'amino, isocyanato, isothiocyanato, guanidino, -NHR 6, -NR<6>R<7> , -NH R <8> , -NHC(0)OR <6> , -NHC(0)0R <8> , -NHC(NH)R <6> , -NH(CH2 )pOH eller -NH(CH2 )pOR <10> , hvor p er et helt tall fra ? til 18, eller -NIIC0R <6> når Y er hydrogen; eller hvor Y i kombinasjon med X er oxo,=N-NH2 , =N-NHR <1:L> eller =NR <1:L> ; A betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling, eller er sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring; B betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 10- og 11-stilling, eller forutsatt at R er H, M er 0, X er OH, Y er H og A sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling betegner en oxiranring, kan B også være en enkelbinding mellom carbonatomene i 10- og 11-stilling, eller forutsatt at A sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling betegner en oxiranring og X er OH og Y er H, kan B sammen med carbonatomene i 10- og 11-stilling også betegne, gruppen -CH2 -CH(Q <1> )- eller -CH2 -CH(Q <2> )-, hvori Q <1> er en nitrogenholdig gruppe og Q <2> er en svovelholdig gruppe (nitrogenet eller svovelet er bundet til carbonatomet i 11-stilling), hvori -Q <1> er -NH2 , -NH C(0)R<6> , -NHR <6> , -NR<6>R<7> , -NHR <10> OH, -N=CHR <6> , -NHC(S)NHR <6> , -NHC(NH)R <6> , -NHC(0)0R <6> , -NHC(0)NHR <6> , -NHC(NH)NH2 ,

-NHC(NH)NHR , en aminosyrerest, en forestret aminosyrerest eller et heterocyklisk radikal med 3-7 ledd inneholdende enten nitrogen som eneste heteroatom eller nitrogen og et annet heteroatom som er nitrogen, oxygen eller svovel; -Q <2> er -S-R <6> , thioxanthyl, -S-R <l0-> NHR <6> , -S-R <8> , S-R <9> , -S -R<10->R<9> , _s_r <10_> r <8_> r <9>^ _s_ <r8>_<r9>> _s_R<10_> c(o)OR <6>f -S-R<10> -COOH, en svovelholdig aminosyrerest,æller en svovelholdig forestret aminosyrerest; og hvori, forutsatt at A og B betegner dobbeltbindinger, Z også kan være -CH2 OH, -CHO, -CH2 NH2 , -CH2 NHR <2> , -CH2 NR <2> R <3> , -CH2 OCOR <2> , -CH^HCOR2,

-CH2 0-glycosyl unntatt -CH2 0-mycinosyl og -CH2 0-(3"-desmethyl-mycinosyl), -CH^ -ureido eller CH9 -thioureido, hvor' R 2 og R 3' uavhengig av hverandre betegner en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer, en alkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer eller en heterocyklisk gruppe inneholdende 3-7 carbonatomer og ett heteroatom som er svovel, nitrogen eller oxygen, eller at én av substituentene R 2 og R 3 i aminogruppene er hydrogen og den andre er gruppen -(CH2)mOR 4eller

hvori m er et helt tall fra 2 til 10, n er et helt tall fra 2 til 6 og R 4 er en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer, en aralkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer eller en heterocyklisk gruppe inneholdende 3-7 carbonatomer og et heteroatom som er svovel, nitrogen eller oxygen; og R"* er 2 ' ^ 6 7 hydrogen, R eller -CI^CJ^-N j R og R er uavhengig av hverandre en alkylgrupe inneholdende 1-18 carbonatomer, en aralkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer; R Qer. en arylgruppe; R 9 er en heterocyklisk gruppe som inneholder 3 til 7 ledd, hvori heteroatomene er valgt fra svovel, nitrogen og oxygen; og R <1> ^ er en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer; R <11> betegner en alkylgruppe inneholdende 1-18 carbonatomer, en aralkylgruppe inneholdende 7-18 carbonatomer eller en heterocyklisk gruppe inneholdende 3 til 7 ledd hvori heteroatomene er valgt fra svovel, nitrogen og oxygen; og ikke-toksiske farmasøytisk akseptable estere derav og ikke-toksiske syreaddisjonssalter av forbindelsene av formel I og deres estere, i særdeleshet forbindelser av formel I i deres fri form eller i form av en ester, hvori hydroxygruppen i 9 • og/eller 21 og/eller 2' • og/eller 4" er forestret med mono-carboxylsyrer eller dicarboxylsyrer hver med 2-18 carbonatomer, fortrinnsvis hvori hydroxygruppene er forestret med en monocarboxylsyre inneholdende 2 eller 3 carbonatomer .

2. Forbindelse ifølge krav 1 med formel XIV i fri form eller i form av en ester eller salt, hvori R er hydrogen eller hydroxy, M er oxo og A er en dobbeltbinding eller betegner sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring, idet fri forbindelser hvori A sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling betegner en oxiranring betegnet som antibiotikum AR5-1 og antibiotikum AR5-2.

3. En blanding av fri antibiotika ifølge krav 2, karakterisert ved at antibiotikum AR5-1 utgjør 30 - 60 vekt% av- blandingen, idet antibiotikum AR5-2 utgjør resten av blandingen.

4. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at i formel I er R hydrogen eller hydroxy, M er oxo eller (H,0H), A og B betegner dobbeltbindinger og Z er -CH2 OH , -CHO, - <CH>2 N- <H>2 , -CH2N HR <2> , -CH2 NR<2>R<3> , -CH2 OCOR <2> ,-CH2NHCOR2, -CH2NR3COR2,

-CH2 0-glycosyl, unntatt -CH2 0- mycinosyl .og -CH- O-(3"-de smeth <y>l -m <y> cinos <y>l ) , -CH9 -2 3 5 ureido eller -Cr^ -thioureido; og R , R og R er som definert i krav 1, fortrinnsvis en forbindelse hvori M er (H,OH) og/eller Z er -CH2<O> H, -CH2 NH2 , -CH2 N(CH3 )2 eller NH -CH2 NHC-NH2 , i særdeleshet desmycinosyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro-antibiotikum AR5-1.

5. Forbindelse ifølge krav 1 med formel XIV ifølge krav 2, karakterisert ved at R er H eller OH, M er (H,OH) og A er en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling eller er sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring.

6. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at i formel I er A sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring; Z er gruppen av formel II, hvori X er OH og Y er H, B er sammen med carbonatomene i 10- og 11-stilling gruppen -CH2~ CH(Q <1> )-, hvori -Q <1> er -NH2 ,-NHC(0)R <6> , -NHR <6> , -NR <6> R <7> ,

en amino syrerest, en forestret aminosyrerest eller et heterocyklisk radikal på 6 ledd inneholdende enten nitrogen som eneste heteroatom eller nitrogen og et annet heteroatom som er nitrogen, oxygen eller svovel; og R, M, R 6 og R 7 er som definert i krav 1, i fri form eller i form av dets ester, fortrinnsvis en forbindelse hvori Q l er -NH2 , -NHC(0)R f, thiomorfolino, 4-methylpiperazinyl, morfolino eller 1-piperidinyl, i særdeleshet 11-thiomorfolino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, ll-amino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-1, 11- •amino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, 11-(piperidinyl)-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, 11-morfolino-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2 eller 11-(4-methylpiperazinyl)-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2.

7. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at i formel I er A sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring, Z er gruppen av generell formel II hvori X er OH og Y er H, B er sammen med carbon atomene i 10- og 11-stilling gruppen -CH~-CH(Q 2)-, hvori -Q 2 er -S-R 6, thioxanthyl, en svovelholdig aminosyrerest, eller en svovelholdig forestret aminosyrerest; og R, M og R er som definert i krav 1, i fri form eller i form av dets ester, fortrinnsvis ll-ethyltyio-10,11-dihydro antibiotikum AR5-1, ll-ethylthio-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2, 11-(p-methoxybenzylthio)-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2 eller 11-L-cysteinylethylester-10,11-dihydro antibiotikum AR5-2.

8. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at i formel I og II er X hydrogen, OH, mesyloxy, tosyloxy, trifluormethansulfonyloxy, halo, azido, amino, isocyanato, isothiocyanato, guanidino, -NHR <6> , -NR 6R <7> , -NHR <8> , -NHC(0)OR 6, -NHC(0)0R <8> , -NHC(NH)R <6> , -NH(CH2 )pOH eller -NH(CH2)pOR10, hvori p er et helt tall fra 2 til 18, eller -NHCOR <6> når Y er hydrogen; eller hvor Y i kombinasjon med X er oxo, =N-NH2 , =N-NHR <11> eller =NR <11> ; A betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling, eller er sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring; B betegnet en dobbeltbinding mellom fi 7 8 10 carbonatomene i 10- og 11-stilling; R, M, R , R , R , R og R <11> er som definert i krav 1, fortrinnsvis en forbindelse hvori X er hydrogen, OH, mesyloxy, halo, azido, amino, guanidino, -NHR <6> , -NR <6> R <7> , -NHR <8> , -NHC(0)OR <6> , -NHC(0)OR <8> når Y er hydrogen; eller hvor Y i kombinasjon med X er oxo.

9. Forbindelse ifølge krav 8, karakterisert ved at X er mesyloxy og Y er hydrogen, eller hvor Y i kombinasjon med X er oxo, i særdeleshet 2'-acetyl-4"-dehydro antibiotikum AR5-2, 2'-acetyl-4"-dehydro antibiotikum AR5-1, 2'-acetyl-4"-methansulfonyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2, eller 4"-methansulfonyl-12,13-desepoxy-12,13-dehydro antibiotikum AR5-2.

10. Forbindelse ifølge krav 1, karakterisert ved at den er 10,11-dihydro antibiotikum AR5-1.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av macrolide antibiotika av generell formel I ifølge krav 1, farmasøytisk akseptable estere derav og syreaddisjonssalter av forbindelsene av formel I og av deres estere som definert ifølge hvilken som helst av krav 1-10, karakterisert ved at forbindelsene fremstilles ved en egnet prosess eller kombinasjon av prosesser valgt fra følgende:-) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIV

hvori R er H eller OH, M er oxo, og A betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling, eller sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling er en oxiranring: at en mikroorganisme av arten Micromonospora polytrota inkuberes i et vandig næringsmedium under aerobe betingelser, og at minst én av forbindelsene av formel XIV isoleres derfra i fri form eller i form av en farmasøytisk akseptabel ester eller et salt; -) for fremstilling av forbindelser av formel I eller deres estere hvori A betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling: at en tilsvarende forbindelse av formel I eller dens ester hvori A sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling betegner en oxiranring, reduseres; -) for fremstilling av 10,11-dihydro antibiotikum AR5-1: at antibiotikum AR5-1 reduseres enzymatisk; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel I hvori R er hydrogen eller hydroxy, M er oxo, A og B betegner dobbeltbindinger mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling, og 10- og 11-stilling, og Z er -CI^OH: at forbindelser av formel I eller deres estere hvori R, M, A og B er som ovenfor definert og Z er -CH2 G—glycosyl, hydrolyseres; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel I eller deres estere, hvori M er oxo eller (H,OH), R er hydrogen eller hydroxy, A og B betegner dobbeltbindinger mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling og 10- og 11-stilling, og Z er -CHO, -CH2 NH2 , -CH2 NHR <2> , -CH2<N> R <2>R<3> ,~ CH2O R <2> , -CH2 OCOR<2> , -CH2 NHCQR<2> f -CH^r^qr2 ,

-CH2 0-glycosyl unntatt -CH2 0-mycinosyl og -CH„0-(3"-desmethyl-mycinosyl), -CH^ -ureido eller -CH--2 3 5 thioureido, hvori R , R og R er som ovenfor definert: at den tilsvarende forbindelse av formel I eller dets ester hvori Z er -CH2 OH omdannes; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel I eller deres estere hvori R er hydrogen eller hydroxy, M er oxo, A og B betegner dobbeltbindinger mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling og 10- og 11-stilling, og hvor Z er -CHO: at den tilsvarende forbindelse av formel I eller dens ester oxyderes; -) ved fremstilling av forbindelser av generell formel I eller deres estere hvori R er hydrogen eller hydroxy, M er oxo eller (H,OH), A og B betegner dobbeltbindinger mellom carbonatomene i 12-og 13-stilling og 10- og 11-stilling, og hvor Z er -CH2 0-glycosyl unntatt -CH2 0-mycinosyl og -CH2 0-(3"-desmethyl-mycinosyl): at den tilsvarende forbindelse av formel I hvori Z er -CH2 OH eller et reaktivt derivat derav, omsettes med det egnede sukker i nærvær av en katalysator og i fravær av vann; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel I eller deres estere hvori R er hydrogen eller hydroxy, M er oxo eller (H,OH), A og B betegner dobbeltbindinger mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling og 10- og 11-stilling, 2 2 og hvor Z er -CH20R , R er som ovenfor definert: at den tilsvarende forbindelse av formel I hvori Z er -Cr^OH forethres, og hvori - om ønsket - aminogruppene og hydroxygruppene er blitt beskyttet; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel I eller deres estere hvori R er hydrogen eller hydroxy, M er oxo eller (H,OH), A og B betegner dobbeltbindinger mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling og 10- og 11-stilling, og Z er -CH2 NH2 , CH2NHR2 eller -CH2 NR <2> R <3> (R <2> og R <3> er som ovenfor definert): at den tilsvarende forbindelse av formel I ell-er dens ester hvori Z er -CHO amineres reduktivt, etterfulgt av oxydasjon hvis M i det ønskede produkt er oxo; -) for fremstilling av forbindelse av generell formel I eller deres estere hvori R er hydrogen eller hydroxy, M er oxo eller (H,OH), A og B betegner dobbeltbindinger mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling og 10- og 11-stilling, og Z er

2 3 5 -CH2~ ureido eller -CH2 -thioureido, hvori R , R og R er som ovenfor definert: at den tilsvarende forbindelse av formel I eller dens 2'-ester hvori Z er -CH2 NH2 , omsettes med en forbindelse av formel (V) L-Q, hvori Q- er den gruppe som skal innføres i den primære aminogruppe i 21-stilling i utgangsmaterialet og L er en forlatende gruppe; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel I eller deres estere hvori R er hydrogen eller hydroxy, M er oxo eller (H,0H), A og B betegner dobbeltbindinger mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling og 10- og 11-stilling, og hvor Z er -CH2 NHCOR <2> eller -CH2 NR <3> COR <2> : at den tilsvarende forbindelse av formel I hvori Z er -CH-NH- eller 2 -CH2 NHR acyleres; -) for fremstilling av forbindelser av formel I hvori M er oxo og A, B, R og Z er som ovenfor definert unntatt forbindelser hvori Z er -CH2 OH eller X er OH: at den tilsvarende forbindelse av formel I hvori M er (H,OH) oxyderes; -) for fremstilling av forbindelser av formel I hvori M er (H,OH) og A, B, R og Z er som ovenfor definert, forutsatt at Z er forskjellig fra -CHO og forutsatt at - hvis Z er gruppen av formel II at Y er hydrogen: reduksjon av den tilsvarende forbindelse av formel I hvori M er 0, eller hvis Z i det ønskede produkt er -CH2 0H eller gruppen av formel II, hvori X er hydroxy, at utgangsforbindelsen også kan være en forbindelse av formel I hvori Z er -CHO eller Y i kombinasjon med X er oxo; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel VIII eller IX eller deres estere:

hvori R er H eller OH, M er 0, Q1 er -NH2 , -NHR <6> , -NR <6> R <7> , -NHC(NH)NH2 , -NHC(NH)NHR <6> , en aminosyrerest, en forestret aminosyrerest eller et heterocyklisk radikal med 3-7 ledd inneholdende enten nitrogen som eneste heteroatom eller nitrogen og et annet heteroatom som er nitrogen, oxygen eller svovel; og Q <2> er -S-R <6> , thioxanthyl, -S -R<10->NHR<6> , _S_R <8> , S-R <9> , -S-R <10-> R <9> , S-R <10-> R <8> ,R <9> , -S-R <8> ,R <9> , -S-R <1> °-C(0)OR <6> , -S-R^-COOH, en svovelholdig aminosyrerest, elleren svovel- 6 7 8 9 10 holdig forestret aminosyrerest; og R , R , R , R og R er som definert for formel I: at antibiotikum AR5-1, antibiotikum AR5-2 eller estrene av disse forbindelser omsettes med en egnet forbindelse av 1 2 formel HQ (VI) eller HQ (VII) eller med et reaktivt derivat av forbindelsen av formel VI eller VII; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel VIII hvori Q <1> er -NH-C(0)NHR <6> eller -NHC(S)NHR <6> , R er H eller OH og M er 0 eller (H,0H) og R er som definert for formel I: at den tilsvareride forbindelse av formel VIII hvori Q <1> er amino, omsettes med et isocyanat eller isothiocyanat av generell formel R <6> NC0 (XI) eller R <6> NCS (X II); -) for fremstilling av forbindelser av generell formel VIII 1 6 6 7 hvor Q er -NHR , -NR R eller en forestret aminosyrerest R<6> I 7 r -NHC-C00R , R er H eller OH og M er 0 eller (H,0H), og R og R 7 er som definert for formel I: at den tilsvarende forbindelse av formel VIII hvori Q <1> er 6 6 7 -NH9 omsettes med det egnede aldehyd (R CHO), keton (R COR ) eller 2-oxo-carboxylsyre (R 6 C(0)C00R 7) i nærvær av et reduksjonsmiddel slik som natriumcyanoborhydrid, natriumborhydrid eller lithiumtri-tertiær butoxyaluminiumhydrid, etterfulgt om ønsket av oxydasjon av den således erholdte 9-hydroxyfor-bindelse under dannelse av den tilsvarende 9-oxoforbindelse; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel VITI hvori Q <1> er -NHC(0)R <6> , -NHC(0)OR <6> ,

eller -N=CHR <6> , R er H eller OH og M er 0 eller (H,0H), og R er definert som for formel I: at den tilsvarende forbindelse av formel VIII hvor Q <1> er -NH2/ omsettes med en forbindelse inneholdende, ved siden av en forlatende gruppe, gruppen -C(0)R <6> , -C(0)OR<6> ,

eller =CHR <6> , -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere:

hvori R er H eller OH; M er oxo eller (H,0H); A betegner en dobbeltbinding mellom carbonatomene i 12- og 13-stilling, eller er sammen med carbonatomene i 12- og 13-stilling en oxiranring, og X er mesyloxy: at den tilsvarende forbindelse av formel XIII eller dennes ester hvori X er hydroxy og Y er hydrogen, omsettes med mesylklorid; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere, hvori R, M og A er som ovenfor definert og X er tosyloxy eller trifluormethansulfonyloxy og Y er hydrogen: at den tilsvarende forbindelse av formel XIII eller dennes ester hvori X er hydroxy og Y er hydrogen, omsettes med tosylklorid eller trifluormethansulfonylklorid; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor definert og X sammen med Y betegner oxo: at den tilsvarende forbindelse av formel XIII eller dennes ester hvori X er hydroxy og Y er hydrogen, oxyderes; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor definert og X er azido og Y er hydrogen; at den tilsvarende forbindelse av formel XIII eller dennes ester hvori X er trifluormethansulfonyloxy, omsettes med natriumazid; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor definert og X betegner halogen og Y er hydrogen,: at den tilsvarende forbindelse av formel XIII eller dennes ester hvori X er trifluormethansulfonyloxy, omsettes med et alkalimetallhalogenid; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor definert og X er hydroxy som har den motsatte konfigurasjon enn hydroxygruppen i utgangsmaterialet og Y er hydrogen: at det tilsvarende triflat omsettes med natriumacetat i eddiksyre etterfulgt av hydrolyse av det således erholdte 4"-acetat; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor definert og X er 0=C=N- eller S=C=N- og Y er hydrogen: at den tilsvarende forbindelse av formel XIII eller dennes ester hvori X er azido, omsettes med trifenylfosfin og carbondioxyd eller difenylfosfin og carbondisulfid; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor definert og X er amino og Y er hydrogen: at den tilsvarende forbindelse av formel XIII eller dennes ester hvori X er azido, omsettes med trifenylfosfin; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori .R, M og A er som ovenfor definert og X er amino og Y er hydrogen: at esteren av den tilsvarende 4"-halogenforbindelse omsettes med hexamethylentetramin; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor definert og X og Y er hydrogen: at den tilsvarende 4"-halogenforbindelse dehalogeneres; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor definert og X er -NHR <6> , -NR6R7 eller -NHR <8> : at den tilsvarende 4"-aminoforbindelse eller dens ester omsettes med et aldehyd (R 6 CHO eller R <8> CHO) eller keton 6 7 (R COR ) i. nærvær av et reduksjonsmiddel slik som natriumcyanoborhydrid, natriumborhydrid eller lithiumtri-tertiært butoxyaluminiumhydrid, i et ikke-reaktivt løsningsmiddel (R 6 , R 7 og R 8 er som definert for formel I), etterfulgt om ønsket av oxydasjon av den således erholdte 9-hydroxyfor-bindelse til den tilsvarende 9-oxoforbindelse; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor definert og X er -NHC(0)OR <6> eller -NHC(0)OR <8> og Y er hydrogen: at den tilsvarende 4"-aminoforbindelse eller dens ester, omsettes med et klorformiat (C1C00R eller CICOOR ) i nærvær r q av natriumcarbonat og vann (R og R er som definert for formel I); -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor 6 6 definert og X er -NIICOR (R er som ovenfor definert) og Y er hydrogen: at den tilsvarende 4"-aminoforbindelse eller dennes ester, omsettes med anhydridet eller halogenidet av syren R COOH i et ikke-reaktivt løsningsmiddel; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere hvori R, M og A er som ovenfor definert og X er guanidino eller -NHC(NH)R 6 (RD 6 er som ovenfor definert): at den tilsvarende 4"-aminoforbindelse eller dens ester, omsettes med S-methyl-isothiourea eller en iminoether; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere, hvori R, M og A er som ovenfor definert og X er -NH(CH2 )pOH eller -NH(CH2 )pOR <10> hvori p er et helt tall fra 2 til 18, R^ ® er som ovenfor definert: at den tilsvarende 4"-aminoforbindelse eller dens ester, omsettes med hal-(CH2 )pOH eller hal-(CH2 )pOR <10> (R<10>t og p er som ovenfor definert, hal betegner halogen),i nærvær av en base; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere, hvori R, M og A er som ovenfor definert og X er hydroxy og Y er hydrogen: at den tilsvarende forbindelse av formel XIII eller dennes ester hvori X i kombinasjon med Y er oxo, reduseres, etterfulgt om ønsket av oxydasjon av den således erholdte 9-hydroxyforbindelse under dannelse av den tilsvarende 9-oxoforbindelse; -) for fremstilling av forbindelser av generell formel XIII eller deres estere, hvori R, M og A er som ovenfor definert og X i kombinasjon med Y er =N-NH?, =N-NHR11 eller 1111 =NR (R er som ovenfor definert): at den tilsvarende forbindelse av formel XIII eller dennes ester hvori X i kombinasjon med Y er oxo, omsettes med hydrazin, substituert hydrazin R11-NH-NH9 eller et primært 11 amin R NH2 ; hvoretter de ovenfor beskrevne fremgangsmåter om ønsket etterfølges av isolering av isomerene av de således erholdte forbindelser av formel I og/eller omforming av de således erholdte forbindelser av formel I til deres estere og/eller hydrolyse av de således erholdte estere av forbindelser av formel I til den fri form og/eller omforming av de således erholdte forbindelser til deres syreaddisjonssalter.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at inkuberingen utføres under submerse betingelser i et næringsmedium inneholdende assimilerbare kilder av minst nitrogen og carbon, fortrinnsvis under anvendelse av Micromonospora polytrota NRRL 12066.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av gentamicin C-kompleks, karakterisert ved at en mikroorga nismen av arten Micromonospora polytrota, i særdeleshet Micromonospora polytrota NNRL 12066 incuberes et vandig næringsmedium under- aerobe betingelser og at produktet isoleres fra næringsvæsken.