NO329865B1 - Fremgangsmate for fremstilling av et forrad av biologiske prover som er kvalitetssikret - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte for fremstilling av et forråd av biologiske prøver som er kvalitetssikret.

Biologiske prøver, slik som plasmadonasjoner eller produksjonserier av cellekultur-supernatanter, kan bli kontaminert med uønskede mikroorganismer - spesielt virus og fremmed DNA. Disse kontaminasjonene kan føre til uønskede reaksjoner i preparater som blir fremstilt fra slike biologiske preparater og administrert til mennesker.

Humant plasma er fremfor alt av ekstraordinær klinisk betydning som et startmateriale for å fremstille plasmaderivater spesielt til substitusjonsterapi av en arvelig eller ervervet plasmakomponent-mangelsykdom. Som en regel blir ikke farmasøytiske preparater av dette slaget fremstilt fra enkeltdonorer, men heller fra en plasmasamling bestående av et veldig stort antall individuelle donasjoner.

Imidlertid må det utvises forsiktighet ved bruk av humant plasma, slik at det ikke inneholder noen smittefarlige agens som kunne bli overført ved den farmasøytiske prepareringen eller med plasmaderivatene. Blant smittefarlige agens som muligens kunne være i blodet, er fremfor alt alle virus som kan bli overført via blodet (hematogene virus) for eksempel HIV-virus og hepatitt-virus (A, B, C, D, E eller G) så vel som parvovirus.

På grunn av den store etterspørselen etter medikamenter som inneholder plasmaderivater, er en økonomisk fremstilling av disse medikamentene bare mulig i en industriell skala.

Plasma blir ervervet fra donorer og samlet i forråd for fremstillingen av farma-søytiske preparater. Et vanlig forråd består av omtrent 2000-6000 individuelle plasmadonasjoner. Her er det en risiko for at det totale plasmaforrådet vil bli kontaminert av en enkelt viruskontaminert plasmadonasjon. Selv om det allerede ved slutten av første halvdel av det 20. århundret var suksess innen bearbeidelsen av human albumin til et virussikkert preparat ved oppvarming, var dette innledningsvis ikke mulig for alle andre medikamenter som kunne anskaffes fra plasma på grunn av deres følsomhet ovenfor varme. Selv om det har vært millionvis av bruksmåter for tilstrekkelig preparerte albumin-preparater, har det til dags dato ikke vært virusinfeksjoner i blodet til mennesker.

Det har i motsetning til dette blitt rapportert om flere infeksjoner med mange andre medikamenter fremstilt fra plasma, spesielt med hepatitt-virus, og siden 1980-årene har det vært en økning i rapporterte infeksjoner med AIDS viruset.

Varmebehandlinger, med hensiktsmessig stabiliserte faktor Vlll-konsentrater, ble utført for første gang rundt 1980 i den hensikt å oppnå en inaktivering av virale kontaminanter. I begynnelsen måtte en likevel akseptere henholdsvis et stort tap av faktor VIII-aktivitet og at det faktiske inaktiveringspotensialet forble ukjent.

Gjennom forbedringer av varmeinaktiveringsmetodene, og bruk av andre, nye inaktiveringsmetoder, ble det til slutt mulig å fremstille medikamenter fra plasma som i de fleste tilfeller ikke ledet til virale infeksjoner hos mottakeren. Denne utviklingen gikk også hånd i hånd med forbedring innen utvelgelsen av donor og donasjoner med det mål å ekskludere enhver donor og donasjon hvor muligheten for viremia, og således et virusinneholdende plasma, eksisterte.

Det har i lang tid blitt forsøkt å ekskludere de donasjoner som har gitt et positivt resultat, enten gjennom deteksjon av antigen til, og antistoff mot, et spesielt virus i blodet, og ikke introdusere dem i et større plasmaforråd som var tiltenkt å fungere som startmateriale for fremstillingen av blodprodukter. Hos individuelle donorer kan bestemte virus være til stede i deres blod til og med i høye konsentrasjoner i lengre tidsperioder, selv om de i alle tester ikke hadde noen sykdomssymptomer eller patologiske test-resultater. Nå kan forekomsten av slike viremias ved et bestemt virus bli utvetydig påvist ved hjelp av en amplifikasjonsmetode.

En enkelt plasmadonasjon kontaminert med virus blir selvfølgelig fortynnet i forrådet av plasmaenheter, men påvisningen av virale genomsekvenser ved hjelp av amplifikasjonsreaksjoner er så sensitiv at til og med ved disse fortynningene er henholdsvis virusgenomer eller deres sekvenser utvetydig påvisbare, og hvis mengden av kontaminerende virus, som nevnt ovenfor, faller under en bestemt påvisningsgrense, har de ikke lenger noen klinisk relevans når det gjelder muligheten for en infeksjon.

EC-retningslinjen, i samsvar med "EEC Regulatory Document Note for Guidance, Guidelines for Medicinal Products Derived from Human Blood and Plasma" (Biologicals 1992, 20: 159-164), foreslår et kvalitetsikringssystem for kontroll av plasmadonorer eller plasmadonasjoner. I henhold til denne må enhver plasmadonasjon bli testet med en godkjent test for fraværet av virale markører, slik som hepatitt B antigen, HIV-1 og HIV-2 antistoff, siden disse er en indikasjon på en samsvarende, viral infeksjon hos plasma-donoren. Tester for å utelukke hepatitt C-infeksjon skal også bli utført.

I følge European Pharmacopoeia er det ment at spesielle tester skal bli utført for å fastslå hepatitt B-overflateantigen og HIV-antistoff i enhver donasjon (European Pharmacopoeia, andre utgave, del II, 1994, sidene 853-4).

FDA-retningslinjen fra 14. mars 1995 fremskaffer en PCR (Polymerase-kjede-reaksjon)-test av et sluttprodukt (immunoglobulinprodukt) som en ekstra sikkerhets-faktor.

Til tross for de foreslåtte testene blir det fremhevet i EC-retningslinjen at sikker-heten for individuelle plasmadonasjoner ved en kontroll av alle disse virusmarkørene ikke er god nok. Selv om fraværet av de omtalte markører i plasmaprøven blir bekreftet, kan ikke viremia utelukkes hos donoren. Virale antigener og samsvarende antistoff er ikke alltid påvisbare umiddelbart etter en infeksjon. For det meste dukker ikke de første markørene i en viral infeksjon opp før uker og måneder etter kontakt med et smittsomt materiale. Denne kritiske tidsperioden etter en infeksjon, og før fremkomsten av antistoff, blir vanligviskarakterisertsom en "vinduperiode". Tiden etter en infeksjon da de første virale markørene blir påvisbare, varierer imidlertid fra virus til virus.

Dessuten er det også kjent at for mange medikamenter fremstilt fra plasma skjer en forringelse eller inaktivering som del av fremstillingsprosessen, og at slike produkter i større grad er virussikre. Skjønt virusinaktivering av plasmaderivater har blitt utført ekstremt suksessfullt i en industriell skala. Ikke desto mindre har det i sjeldne tilfeller vært overføringer av hematogene virus som AIDS, hepatitt A, B og C. Derfor har det blitt antatt at viruskontaminerte produkter har blitt fremstilt av fabrikantene i noen få produksjonsserier til tross for en konstant fremstillingsmåte. (Lancet 340, 305-306

(1992); MMWR43 (28), 505-509 (1994); Thromb. Haemost. 68, 781 (1992)). Grunnen til dette bør antageligvis bli lett etter i en ekstrem høy kontaminasjon av bestemte startporsjoner. Siden bare indirekte metoder er tilgjengelige for å utelukke viruskontaminerte plasmadonasjoner i fremstillingen av plasma, er det en mulighet for at startmaterialet vil være så mye kontaminert at de ellers så suksessfulle virusinaktiverings-og forringelsesmetodene ikke lenger er nok for å fremstille virussikre sluttprodukter.

Siden den humane infeksjonsdosen er ukjent for de fleste humanpatogene virus, og de for øyeblikket ikke en gang er påvisbare i testing av plasmaforrådet, er det ønskelig å plukke ut hver enkelt kontaminasjon ved å identifisere de individuelle, kontaminerte prøvene. De nukleinsyreamplifikasjontester som blir brukt er riktignok ekstremt sensitive, men også veldig dyre. Så bruken av dem kan rettferdiggjøres med kjente, humanpatogene virus, mens disse utgiftene ikke vil være nødvendige for andre mikroorganismer hvor det enten ikke er kjent eller beskrevet noen humanpatogen effekt, eller hvor bare en veldig høy patogen dose er smittsom.

Spesielt beskriver WO 96/35437 og US 5591573-A testsystemer for plasma-samlinger hvor det blir brukt nukleinsyreampliifkasjonsmetoder og/eller antistoffunder-søkelser. US 5591573 fremlegger en fremgangsmåte for testing av plasmaforråd. Med denne fremgangsmåten blir et første forråd preparert og testet ved hjelp av PCR. Hvis denne PCR-testen er positiv, blir et andre mindre subforråd preparert og testet igjen ved hjelp av PCR. Denne prosessen gjentas inntil den individuelle, kontaminerte donasjonen er identifisert. Antistofftesting eller vedlikehold av forhåndssatte bestemte grenseverdier, lagt frem som del av screeningsmetoden, er også medregnet i samsvar med WO 96/35437.

Imidlertid har de beskrevne nukleinsyreamplifikasjonsmetodene det til felles at man alltid forsøker å bruke den amplifikasjonsmetoden som tillater den største sensitiviteten. Som notert er imidlertid disse høysensitive PCR-testene ekstremt kostbare, spesielt i serietester av forråd bestående av individuelle biologiske prøver. PCR-tester med lavere sensitivitet, som ville være langt mer kostnadsgunstige, blir imidlertid generelt unngått i slike undersøkelser siden risikoen for kontaminering som ligger under den (lave) påvisningsgrensen ville være medvirkende høy.

På en lignende måte fortsetter kontamineringer med mikroorganismer eller nukleinsyremateriale fra vertceller å forekomme selv med supernatanter fra rekombinante cellekulturer. Slike kontaminasjoner bør selvfølgelig ikke være tilstede, eller bør bare være tilstede opp til en bestemt maksimumsverdi (grenseverdi) i farmasøytiske preparater som skal fremstilles fra supernatantene.

MCOMISH F, et al., "Detection of Parvovirus B19 in Donated Blood:..."Journal of Clinical Microbiology, 1993, vol. 31, s. 323-329, beskriver en PCR screeningsmetode for å forebygge transfusjon av parvovirus B191 blod og blodprodukter.

ROTH W. K. et al., "Feasibility and efficacy of routine PCR screening of blood donations...", Journal of Clinical Microbiology, 1998, vol. 353, s. 359, omhandler en metode for å teste bloddonasjoner for viral kontaminasjonav HCV, HBV og HIV-1.

SCHOTTSTEDT V. et al., "PCR for HVC, HCV and HIV-1...", Biologicals, 1998, vol.26, s.101-104, beskriver resultater fra et rutinemessi PCR-screeningsprogram for påvisning av HVC, HCV og HIV-1 i et stort blodtransfusjonssystem.

Oppgaven til denne oppfinnelsen er således å gjøre tilgjengelig en fremgangsmåte for å fremstille et forråd av biologiske prøver, ved å bruke nukleinsyreamplifikasjons-metoder, som er kvalitetssikret med hensyn til mengde forurensende mikroorganismer, spesielt virus. En fremgangsmåte som på en side muliggjør en pålitelig identifikasjon av individuelle, kontaminerte prøver, spesielt individuelle, svært kontaminerte prøver så vel som fastholdelsen av en bestemt grenseverdi for slike kontaminanter i forrådet, men som på en annen side gir kostnadsreduksjoner og en fremgangsmåte som er enklere enn de testmetoder for forråd kjent fra tidligere innen faget.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en fremgangsmåte for fremstilling av et forråd av biologiske prøver som er kvalitetssikret, kjennetegnet ved at den omfatter: - å ta alikvoter fra de biologiske prøvene; - å kombinere de innsamlede alikvotene til et screeningsforråd; - å teste screeningsforrådet for nærvær av, eller innhold av, genomekvivalenter til mikroorganismer ved hjelp av en første nukleinsyreamplifikasjonprosess som har en påvisningsgrense, DL-1, for mikroorganismen det skal testes for; - å dele screeningsforrådet i screenings-subforråd, ved å rekombinere de innsamlede alikvoter til mindre forråd, hvis en forhåndsbestemt grenseverdi for genomekvivalenter er satt mellom DL-1 og IO<5>genomekvivalenter/ml overskrides i undersøkelsen av screeningsforrådet; - å teste screenings-subforrådet på ny for tilstedeværelse av eller innholdet av genomekvivalenter til mikroorganismer som det skal testes for ved hjelp av en ytterligere nukleinsyreampliifkasjonsprosess som har en utvalgt påvisningsgrense, DL-2, for mikroorganismene som skal testes, hvor DL-1 < DL-2;

- å finne og eliminere de prøver som overskrider DL-2 og

- å kombinere de gjenværende prøver for å fremstille forrådet av kvalitetssikrede biologiske prøver.

Ved å fremskaffe minst to nukleinsyreamplifikasjonsprosesser som er forskjellige med hensyn til deres sensitivitet kan, i følge oppfinnelsen, en effektiv (på grunn av den høye sensitiviteten i testingen av forrådet), og ikke desto mindre, kostnadsgunstig fremgangsmåte, gjøres tilgjengelig. Dette siden testingen av subforrådet blir utført for de individuelle prøvene ved en mindre sensitiv nukleinsyreamplifikasjonsmetode uten en ekstra foregående ekstraksjon av nukleinsyre (som derfor er avgjort mer kostnadsgunstig og ikke så dyrt).

I samsvar med oppfinnelsen er det første trinnet i fremgangsmåten å teste screeningsforrådet for nukleinsyre-kontaminasjon ved en veldig sensitiv og kvantitativ metode. Den veldig kostnadskrevende påvisningen av den individuelle, kontaminerte prøve eller donasjon, som involverer et mye større antall ekstra tester, blir bestemt med en mindre sensitiv nukleinsyreampliifkasjonsmetode. Ved å gjøre det på denne måten er det ingen risiko for at en relevant kontaminasjon vil bli oversett, siden screeningsforråd-testen skjer ved en metode som er så sensitiv som mulig. På en annen side blir kostnadene og tidsutleggene for eliminasjonsmetoden for de individuelle, kontaminerte prøver og produksjonsserier så avgjort redusert. I de tilfellene hvor påvisningen av slike individuelle donasjoner til nå ikke har blitt utført for disse grunnene, tilbyr fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen for første gang muligheten til å bruke det verdifulle råmaterialet som de individuelle donasjonene representerer til en lav kostnad og å hindre disse prøvene fra å bli kastet.

Sensitiviteten til nukleinsyreamplifikasjonsmetoden blir satt i samsvar med oppfinnelsen som den mengden av genomekvivalenter som fortsatt så vidt er påvisbar med den relevante nukleinsyreampliifkasjonsmetoden. Å tilveiebringe fremgangsmåter av dette slaget med en presist etablert grenseverdi er lett å gjøre for fagfolk innen området og som har dette som del av sine vanlige kunnskaper.

Fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen er fremfor alt passende for kvalitetssikring av forråd med hensyn til mengde forurensende mikroorganismer, som har lav patogenitet eller toksitivitet, eller hvor det kan antas at mengden forurensende mikroorganismer, som ligger under den etablerte grenseverdien, blir eliminert i hvert tilfelle i løpet av den påfølgende rensningsprosessen frem til prepareringen av det farmasøytiske preparat, eller at kontamineringsmengden som samsvarer med denne grenseverdien i et farmasøytisk preparat av dette slaget er harmløs og uten bieffekter. Et bestemt eksempel på dette består av kontamineringer med parvovirus - spesielt parvo B19.

Parvovirus Bl9 er et enkelttråd-DNA-virus med en diameter på 32 nm som ikke har en lipidmembran og således er relativt motstandsdyktig ovenfor virus-inaktiverings metoder. De fleste inaktiveringsmetoder, som for eksempel fysiske metoder som pasteurisering

(60 °C i over 12 timer) eller kjemiske behandlinger som organiske løsningsmidler (TNBP og/eller rensemidler), gir således ikke tilfredsstillende resultat. Bare tørr varme-behandling viser seg å ha blitt bevist å være effektivt.

Parvoviruset B19 er det forårsakende agens i den harmløse infeksjonen kalt erythema (erythema invectiosum), med artralgias og artritt observert en gang imellom. Infeksjoner i livmor er fryktet siden de ofte ender med fosterdød. Den begrensede kretsen av B19-behandlete pasienter omfatter de med kronisk, hemolytisk anemi, pasienter etter benmargstransplantasjoner, pasienter med medfødt/ervervet svekket immunsystem, så vel som gravide kvinner (Sibrowski et al., Beitr Infusionsther. Basel, Karger, 1990, 26,22-26).

Seroforekomsten i industrialiserte land er 2-10% hos barn under 5 år og 40-60% hos voksne over 20 år og 85% hos voksne over 70 år. Denne høye seroforekomsten resulterer således i et stort antall positive resultater i plasmaforrådtestingen, som i sin tur fører til behovet for et stort antall ekstra tester for å fastslå de individuelle, høyt kontaminerte prøvene.

EP-A-0922771 beskriver en fremgangsmåte for å påvise høye viruskonsen-trasjoner i blodplasma, hvor PCR-sensitiviteten er redusert gjennom bruk av suboptimale betingelser i ekstraksjonen, amplifikasjonen og deteksjonen slik at parvovirus-DNA fremdeles bare så vidt kan bli detektert i prøver hvis DNA-innhold er større enn IO<6->IO<7>genomekvivalenter/ml. Denne fremgangsmåten har imidlertid den ulempen at den ikke er egnet for testing av forråd.

Alle mikroorganismene som forekommer, som bakterier eller virus, kan ikke desto mindre bli analysert i samsvar med oppfinnelsen hvor fremfor alt kvalitetssikring med hensyn til virus er av spesiell prioritet under testingen av blod og plasmadonasjoner.

Hepattt virus, spesielt HAV, HB V, HCV, HD V, HEV og HGV, retrovirus, spesielt HIV-1 og HIV-2, og parvovirus, spesielt parvo Bl9, blir helst testet med fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen, eller så blir plasmaforråd kvalitetssikret med hensyn til disse virustypene.

Ved å teste forskjellige satser i en rekombinant proteinproduksjonserie, blir opprettholdelse av bestemte (på forhånd beskrevne) grenseverdier, for kontaminasjoner med vertcellenukleinsyrer (her blir eukaryotiske og prokarytotiske celler eller DNA/RNA påvist som mikroorganismer) eller kontamineringer med bestemte bakterielle eller virale kontaminasjoner, testet.

En spesielt foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten består i følge oppfinnelsen i å sette grenseverdien i testingen av screeningsforrådet mellom påvisningsgrensen til den første nukleinsyreampliifkasjonsmetoden DL-1 og IO<5>genomekvivalenter/ml, hvor for eksempel mer bestemt en verdi rundt IO<4>genomekvivalenter/ml har vist seg å være spesielt effektiv for parvo Bl9. Fortrinnsvis kan den relevante grensen også være i overensstemmelse med den relevante påvisningsgrensen.

Påvisningsgrensen for den første nukleinsyreamplifikasjonsmetoden DL-1 ligger helst i området IO<2->IO<4>genomekvivalenter/ml (imidlertid kan den være opp til 10-50 genomekvivalenter/ml eller i unntakstilfeller enda lavere), mens påvisningsgrensen DL-2 vanligvis blir valgt til å være IO<4->IO<7>genomekvivalenter/ml. DL-1 og DL-2 skiller seg fra hverandre med minst én tierpotens, men en forskjell på rundt to tierpotenser har vist seg spesielt effektiv siden individuelle, kontaminerte donasjoner på denne måten fremdeles kan bli pålitelig identifisert (dette er nødvendig i følge oppfinnelsen) og, på den annen side, siden kostnadene og utleggene for screeningsprosessen kan bli betydelig redusert sammenlignet med kjente metoder.

Amplifikasjonen av nukleinsyrer kan i følge oppfinnelsen finne sted ved en serie av amplifikasjonsprosesser som blir beskrevet i litteraturen. PCR-metoden har her vist seg spesielt effektiv og er foretrukket på grunn av dens vidstrakte bruk, industrielle tilgjenglighet så vel som dens kostnad. PCR amplifikasjonsmetoden ble først beskrevet i 1983 av Mullis et al. (US 4 683 195 og US 4 683 202). Virale genomsekvenser kan bli amplifisert ved hjelp av "nested PCR" (Methods Enzymol. 155 (1987), 335-350). For amplifikasjon og deteksjon av RNA, må først RNA transkriberes til DNA. Denne metoden blir utført ved å bruke revers transkriptase og blir kalt RT-PCR (Cell 50 (1987), 831-840).

Analysen av amplifikasjonsproduktene kan finne sted gjennom bruken av merkede nukleotider eller oligonukleotidprimere i en elongeringsprosess og påfølgende hybridisering eller gelelektroforeseseparasjon av produktene.

Påvisningen av amplifiserte DNA-fragmenter kan for eksempel finne sted ved hjelp av en probe som bærer to fluorescerende fargestoffer. Denne metoden blir for eksempel beskrevet av Livak et al. (PCR Method and Appl. 1995; 4:357-362). Den spesielle egenskapen til denne proben ligger i det faktum at fluorescensen til fargestoffet (FAM) bundet til 5'-enden til proben - "reporteren" - blir redusert ved nærvær av det andre fluorescerende fargestoffet (TAMRA)- "slukkeren"- som er plassert på 3'-enden til primeren.

Den nye DNA-tråden blir under amplifikasjonen syntetisert med en termostabil DNA-polymerase, helst Taq-polymerase. Ved å gjøre dette, forflytter DNA-polymerasen proben ikke bare fra den enkelte tråden, men snarere nedbryter den ved hjelp av sin endonukleaseaktivitet og frigjør således de to fluorescerende fargestoffene. Fluorescensen til "reporter"-fargestoffet er ikke lenger undertrykt av "slukker"-fargestoffet og øker. Denne fluorescensøkningen blir kontinuerlig registrert i ABI prism 7700 i løpet av PCR. Terskelverdien, fra hvilken en startende økning i fluorescens blir vurdert som et positivt signal, blir målt under sammenligning med flere negative kontroller.

Kvantifiseringen av mengde forurensende mikroorganismer, for eksempel parvo Bl9, i en ukjent prøve finner sted via en ekstern kalibreringskurve. Et klonet stykke av parvo B19-DNA i et bærerplasmid, som omfatter sekvensen som skal amplifiseres, blir i tillegg koamplifisert i lineær form i konsentrasjoner fra IO<6>kopier/reaksjon til 10 kopier/- reaksjon. Ved å etablere en terskelverdi (samsvarende med en PCR-syklus hvor fluorescenssignalet fra "reporter"-fargestoffet for første gang stiger over grunnlinjen) blir en kalibreringslinje etablert i programmet mot hvilken parvo B19 DNA-innholdet i en ukjent prøve som er over terskelverdien, blir kvantifisert.

Alternative metoder for PCR omfatter ligasekjedereaksjonen (LCR) i samsvar med EP 0320308A og EP 033673 IA og nukleinsyresekvensbasert amplifikasjon (NASBA), selvforsørget sekvensreplikasjon (SSR) i samsvar med EP 0310229, eller det transkripsjonsbaserte amplifikasjonssystemet (TAS) i samsvar med EP 0373960A.

Et antall enzymer, som kan bli brukt samtidig eller trinnvis i amplifikasjonen, slik som en DNA-polymerase eller en RNA-polymerase, blir brukt i disse metodene.

Fortrinnsvis kan internasjonale standarder i bli lagt til i nukleinsyreamplifikasjonen slik at den grunnleggende amplifikasjonfunksjonen kan bli garantert. I rutinetester kan tolkningen av resultatene oppnådd med fremgangsmåten i følge oppfinnelsen vanligvis bli sporet på følgende måte: a) ingen påvisning av den interne standarden (det vil si ingen synlige bånd): bestemmelsen fungerte for eksempel ikke som et resultat av amplifikasjonreaksjonen (for

eksempel PCR); på denne måten kan falske, negative resultater bli utelukket.

b) bare den interne standard er påviselig (for eksempel er bare standardbåndet synlig): bestemmelsen omfattende amplifikasjonsreaksjonen (for eksempel PCR) fungerte;

prøven er negativ.

c) standard- og prøvenukleinsyre er synlige (for eksempel er begge bånd synlige); prøven er positiv.

De biologiske prøvene som blir prioritert for testing i følge oppfinnelsen blir valgt ut fra gruppen av individuelle bloddonasjoner, plasma, serum og cellekultur-produksjonsserier. De forventede kontaminasjonene forkommer spesielt i disse biologiske prøvene, og disse er også prioritert brukt i den industrielle fremstillingen av medikamenter fra biogene kilder.

Fremgangsmåten i følge oppfinnelsen kan bli utført i en automatisert utførelses-form ved bruk av robotkontroll med konvensjonelle plattformer spesielt egnet for dette. Fagmannen er klar over de mange forskjellige mulighetene for fremstilling av slike screeningsforråd. Mortimer (Vox Sang. 1997, 73: 93-96) beskriver for eksempel todimensjonale (2D), tredimensjonale (3D) og til og med firedimensjonale (4D) forråd. For å løse opp for eksempel et 3D-forråd fremstilt fra 512 (8 x 8 x 8) individuelle prøver, må man for eksempel bruke 24 subforråd for å være i stand til å utvetydig identifisere den individuelle, kontaminerte prøven.

I følge oppfinnelsen blir den andre nukleinsyreamplifikasjonsprosessen utført direkte fra subforrådet etter den første nukleinsyreamplifikasjonen. Dette betyr at det ikke finner sted noen ekstra ekstrahering av nukleinsyre, men heller at den blir bestemt direkte i subforrådet.

Ifølge en annen utførelsesform omfatter oppfinnelsen også et kvalitetssikret forråd av biologiske prøver som kan oppnås ved hjelp av fremgangsmåten i følge oppfinnelsen, så vel som et farmasøytisk preparat som er fremstilt, eller som kan fremstilles, på basis av et kvalitetssikret preparat i følge oppfinnelsen. Disse farmasøytiske preparatene inneholder fortrinnsvis minst én komponent valgt fra gruppen av proteiner, spesielt plasmaproteiner, så vel som proteiner fremstilt ved rekombinasjon, og enzymer.

Oppfinnelsen er illustrert i mer detalj nedenfor ved hjelp av følgende eksempel.

Eksempel

Forrådinnsamling

Alikvoter fra 512 plasmadonasjoner blir samlet ved hjelp av et tredimensjonalt skjema til et screeningsforråd og 24 subforråd.

Ekstraksjon

Nukleinsyre-ekstraksjonen fra et screeningsforråd blir utført ved hjelp av en modifisert protokoll fra "QIAmp viral kit" fra QIAGEN. For dette formålet utsettes 1 ml av screeningsforrådet for ultrasentrifugering, og supernatanten blir redusert til 140 ul. Etter tilsettingen av 560 ul AVL lysisbuffer i følge QIAGEN-settet blir blandingen inkubert ved 56 °C på en termorister i ti minutter. Lysatet appliseres på en silikakolonne og tvinges gjennom kolonnen ved å sentrifugere den ved 8000 omdreininger/min. Etter vasking med 0,5 ml av hver av vaskebufferne AW1 og AW2, blir nukleinsyren absorbert til kolonnen eluert med 50 ul H20.

Amplifisering

Et lite fragment av parvo Bl9-DNA blir amplifisert ved å tilsette 20 ul ekstrakt til 30 pl hovedblanding.

(Perkin Eimer, TaqMan PCR Core Reagent Kit med 5 ul 10 x TaqMan buffer,

14 ul 25 mM MgCl2, 4 ul 2,5 mM dNTPs, 1,5 ul 10 uM PTl.f (5' GAC AGT TAT CTG ACC ACC CCC A 3') (Sek. ID nr. 1), 1,5 ul 10 ulM PTl.r (5' GCT AAC TTG CCC AGG CTT GT 3') (Sek. ID nr. 2), 1,5 ul 5 uM PTl.p (5'6-FAM-CCA GTA GCA GTC ATG CAG AAC CTA GAG GAG A-TAMRA3') (Sek. ID nr 3), 1 ul Tween 20 (1 %), 1,25 ul gelatin (2 %), 0,5 ul AmpErase UNG (1 U/pl), 0,25 ul AmpliTaq Gold (5 U/pl).

Amplifikasjonen finner sted under følgende betingelser i en ABI prism 7700:

1. AmpErase UNG-reaksjon 2 min ved 50 °C

2. Innledende denaturering 10 min ved 95 °C

3. Sykler på 15 sek ved 95 °C og 1 min ved 58 °C.

PCR blir evaluert ved en økning i fluorescens i løpet av PCR. Terskelverdien (det vil si den syklus hvor signalet stiger over bakgrunnsstøyen) tjener til kvantifiseringen. Terskelverdier i en standardserie av et linearisert plasmid med et klonet parvo Bl 9-genomfragment fungerer i dette tilfellet som grunnlinje for måling av parvo Bo-konsentrasjonen i screeningsforrådekstraktet.

Hvis antallet genomekvivalenter målt i prøven ligger under grenseverdien på

10<4>genomekvivalenter/ml i screeningsforrådet, blir prøvene inneholdt i dette forrådet frigjort for bruk. Hvis det, på en annen side, blir oppnådd en verdi over grenseverdien, løses screeningsforrådet opp.

Oppløsing av screeningsforådet

De 24 subforrådene til et screeningsforråd blir fortynnet 1:200 H20 (destillert) i flere trinn ved hjelp av en robot og brukt uten ekstraksjon i TaqMan PCR.

Amplifisering med det oppløste screeningsforrådet

Et lite fragment av parvo B19-DNA blir amplifisert ved å tilsette 20 pl subforrådfortynning (tilsvarende 0,1 ul av subforrådet) til 30 ul Mastermix.

(Perkin Eimer, TaqMan Gold Kit med 5 pl 10 x TaqMan-buffer, 14 pl 25 mM MgCl2, 4 pl 2,5 mM dNTPs, 1,5 pl 10 pM

PTl.f (5' GAC AGT TAT CTG ACC ACC CCC A 3') 1,5 pl 10 pM PTl.r (5' GCT AAC TTG CCC AGG CTT GT 3') 1 pl 5 pl M PT1 .p (5'6-FAM-CCA GTA GCA GTC ATG CAG AAC CTA GAG GAG A-TAMRA31) 1 pl Tween 20 (1 %), 1,25 pl gelatin (2 %), 0,5 pl AmpErase UNG (1 U/pl),

0. 25 pl AmpliTaq Gold (5 U/pl).

Amplifikasjonen finner sted under følgende betingelser i en ABI prism 7700:

1. AmpErase UNG-reaksjon 2 min ved 50 °C

2. Innledende denaturering 10 min ved 95 °C

3. Sykler på 15 sek ved 95 °C og 1 min ved 58 °C.

Evaluering

PCR blir evaluert ved en økning i fluorescens i løpet av PCR. Ved å bestemme terskelverdien (det vil si den syklusen hvor signalet stiger over bakgrunnsstøyen) under sammenligning med verdiene fra en kjent standardserie som ble amplifisert samtidig, blir antallet genomekvivalenter i ekstraktet fra screeningsprøven bestemt.

Siden bare prøver med et innhold på minst IO<4>genomekvivalenter/ml kan gi et signal, og hvis utgangspunktet er 0,1 pl materiale, blir alle individuelle donasjoner gjenkjent som positive kastet og de gjenværende frigjort for bruk.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et forråd av biologiske prøver som er kvalitetssikret, karakterisert vedat den omfatter: - å ta alikvoter fra de biologiske prøvene; - å kombinere de innsamlede alikvotene til et screeningsforråd; - å teste screeningsforrådet for nærvær av, eller innhold av, genomekvivalenter til mikroorganismer ved hjelp av en første nukleinsyreamplifikasjonprosess som har en påvisningsgrense, DL-1, for mikroorganismen det skal testes for; - å dele screeningsforrådet i screenings-subforråd, ved å rekombinere de innsamlede alikvoter til mindre forråd, hvis en forhåndsbestemt grenseverdi for genomekvivalenter er satt mellom DL-1 og IO<5>genomekvivalenter/ml overskrides i undersøkelsen av screeningsforrådet; - å teste screenings-subforrådet på ny for tilstedeværelse av eller innholdet av genomekvivalenter til mikroorganismer som det skal testes for ved hjelp av en ytterligere nukleinsyreamplifikasjonsprosess som har en utvalgt påvisningsgrense, DL-2, for mikroorganismene som skal testes, hvor DL-1 < DL-2; - å finne og eliminere de prøver som overskrider DL-2 og - å kombinere de gjenværende prøver for å fremstille forrådet av kvalitetssikrede biologiske prøver.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert vedat PCR anvendes som nukleinsyreamplifikasjonsmetode.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert vedat mikroorganismene som skal testes er virus.

4. Fremgangsmåte ifølge kravl - 3, karakterisert vedat mikroorganismen som skal testes er utvalgt fra gruppen bestående av et hepatittvirus, særlig HAV, HB V, HCV, HD V, HEV og HGV, retrovirus, særlig HIV-1 og HIV-2 og parvovirus, særlig parvo Bl9.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1 - 4, karakterisert vedat de biologiske prøvene utvelges fra gruppen som består av individuelle bloddonasjoner, plasma, serum og cellekultursatser.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1-5, karakterisert vedat screeningsforrådet lages av 512 biologiske prøver og inndeles i 24 subforråd.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1-6, karakterisert vedat den ytterligere nukleinsyreamplifikasjonsmetode utføres umiddelbart etter første nukleinsyreamplifikasjonsmetode.