NO324991B1 - GnRH antagonistpeptid samt farmasoytisk preparat inneholdende det samme. - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører et GnRH antagonistpeptid samt et farmasøytisk preparat inneholdende det samme.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører mere generelt peptider som er antagonister av humant gonadotropinfrigjørende, hormon (GnRH) og som har fordelaktige fysiske, kjemisk og biologiske egenskaper. Mere spesielt vedrører den foreliggende oppfinnelse dekapeptider som inhiberer gonadal funksjon og frigjør-ingen av steroidhormonene progesteron og testosteron i perioder av lengre varighet, og vedrører også farmasøytiske preparater som inneholder slike dekapeptider for slike formål og særlig for å mestre tilstander resulterende fra hypersekre-sjonen av gonadale sterodier.

Follikkelstimulerende hormon (FSH) og luteiniserende hormon (LH), noen ganger omtalt som gonadotropiner eller gonado-tropiske hormoner, frigjøres ved hjelp av hypofysen som er festet ved en stengel til hypotalamus.

Hormonfrigjøring ved hjelp av hypofysens fremre lapp krever vanligvis først frigjøring av hormoner dannet ved hjelp av hypotalamus, slik som GnRH dekapeptidet.

Administreringen av GnRH analoger som er antagonistiske overfor den normale funksjon til GnRH er blitt anvendt for generelt å undertrykke sekresjon av gonadotropiner i pattedyr og for å undertrykke eller forsinke ovulasjon.

Søken etter forbedrede GnRH antagonister har resultert i dannelsen av Antid, dvs. [Ac-D-2Nal<1>, D-4ClPhe2, D-3Pal3, Lys(Nie)<5>, D-Lys(Nie)<6>, ILys<8,> D-Ala1<0>]-GnRH og Cetrorelix, dvs. [Ac-D-2Nal<1>, D-4ClPhe<2>, D-3Pal3, D-Cit<6>, D-Ala<10>]-GnRH.

US patent nr. 5.516.887 beskriver GnRH antagonister som sies å være mere effektive enn Antid med hensyn til å undertrykke plasmatestosteron, f.eks. [Ac'-D-2Nal<1>, D-4ClPhe<2>, D-3Pal<3>, D-Ne-karbamoyl Lys6, ILys8, D-Ala1<0>]-GnRH som omtales som Antarelix.

US patent nr. 5.296.468, utstedt 22. mars 1994, omhandler utformingen og syntese av en rekke GnRH antagonister hvor sidekjedene av valgte rester reageres for å danne cyanoguanidinoenheter, som noen deretter spontant omdannes til en ønsket heterosyklus, f.eks. et 3-amino-l,2,4,-tiazol (atz). Slike cyanoguanidinoenheter er bygget på omega-aminogruppen i en aminosyresidekjede, som lysin, ornitin, 4-aminofenylalanin (4Aph) eller en forlenget kjedeversjon derav, som 4-amino-homofenylalanin (4Ahp). GnRH antagonister med signifikant

modifiserte eller unaturlige aminosyrer i 5- og.6-stillingen utviser god biologisk potens, og dem bygget på Aph betraktes generelt til å være foretrukne. En som er særlig foretrukket er Azalin B, dvs. [Ac-D-2Nal<1>, D-4ClPhe<2>, D-3Pal<3>, 4Aph(atz)<5>, D-4Aph(atz) s, ILys<8>, D-Ala<10>]-GnRH. US patent nr. 5.506.207 omhandler biopotente GnRH antagonister hvor aminosubstituerte fenylalaninsidekjeder av rester i 5- og 6-stillingene er acylert, idet et særlig potent dekapeptid er Acylin, dvs.

[Ac-D-2Nal<1>, D-4ClPhe<2>, D-3Pal<3>, 4Aph(Ac)<5>, D-4Aph(Ac)<6>, ILys<8>, D-Ala<10>]-GnRH.

J.E. Rivier et al., Journal of Medicinal Chemistry, vol. 38, no. 14, 1995, s. 2649-62 vedrører Azalin B familien av forbindelser som allerede er omtalt generelt i forbindelse med US patent nr. 5.2 96.468.

J. Rivier et al., Journal of Medicinal Chemistry, vol. 35, 1992, s. 4270-78 omhandler spesifikt den første generasjonen av disse forbindelsene som er beskrevet i det foregående.

WO 96/4 0 757 omhandler GnRH antagonistpeptider med fortrinns-vis 10 aminosyrer.

Til tross for de attraktive egenskaper for denne gruppe av GnRH antagonister, har man fortsatt å søke etter ytterligere forbedrede GnRH antagonister, særlig dem som utviser lang varighet med hensyn til biologisk virkning. Det kan ofte være viktig at en peptidanalog bør utvise en lang varighet av aktivitet med hensyn til LH sekresjon, en egenskap som kan økes ved hjelp av peptidets resistens overfor protolytisk enzymnedbrytning i kroppen for både korttids og langtids behandlingsindikasjoner. I tillegg, for å forenkle administrering av disse forbindelser til pattedyr, særlig mennesker, uten signifikant geldannelse, ansees det å være ekstremt fordelaktig at slike GnRH antagonistiske dekapeptider har en høy oppløselighet i vann ved normal fysiologisk pH, dvs. omtrent pH .5 til omtrent pH 7,4. •Man har nå funnet at visse andre modifikasjoner av resten i 5-stilling, eller av resten i 5- og 6-stillingen, i denne subklassen av GnRH antagonister, som inkluderer Cetrorelix, Antarelix, Acylin, Antid og andre, uventet resulterer i forbindelser som, når de administreres subkutant, utviser den spesielt fordelaktige egenskap med lang varighet med hensyn til bioaktivitet. Disse modifikasjoner gjennomføres for en 4aminoPhe rest eller dens ekvivalent 4Ahp eller for 4-amino-metylfenylalanin (4Amf) hvor den primære aminogruppe er bundet til en metylgruppe festet til 4- eller para-stillingen. I slike modifikasjoner, reageres aminogruppen i sidekjeden med et isocyanat for å danne en ureagruppe eller reageres med en heterocyklisk karboksylsyre som inneholder minst 2 nitrogenatomer som er ordnet til å utgjøre en ureaenhet. De foretrukne heterocykliske reaktanter er D- eller L-hydroorotinsyre (Hor) (C4N2H5 (0) 2COOH) og D- eller L-2-imida-zolidon-4-karboksylsyre (Imz) (C3N2H5 (0)C00H) .

Generelt er GnRH antagonist-dekapeptider med den etterfølg-ende formel, og nær beslektede analoger og de farmasøytisk aksepterbare salter derav, funnet til å ha forbedrede farma-kologiske egenskaper, særlig en lang varighet med hensyn til bioaktivitet.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således et GnRH antagonistpeptid som har formelen: X-D-Nal-(A)D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10 og de farmasøytisk aksepterbare salter derav hvori:

X er en acylgruppe med opp til 7 karbonatomer eller Q,

hvori Q er

og hvori R er H eller lavere alkyl; A er 4C1, 4F, 4Br, 4N02, 4CH3, 40CH3, 3,4Cl2 eller C<a>Me4Cl; Xaa5 er. Ap<h>(Q1) eller Amf ( Qx) hvor Qx er

Xaa6 er D-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Lys(Nie), D-Cit, D-Hci eller D-Pal, hvori Q2 er For, Ac, 3-amino-1, 2,4-triazol, Q eller Q1; Xaa8 er Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et2) eller Har(Et2); og

Xaa10 er D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3, Gly-NH2, AzaGly-NH2, Ala-NH2, Agl-NH2, D-Agl-NH2/ Agl(Me)-NH2 eller D-Agl(Me)-NH2, med imidlertid den betingelse at a-aminogruppen i Xaa5 eventuelt kan være metylert, og med videre den betingelse at når Xaa6 inneholder D- eller L-Hor eller D-eller L-Imz, da kan Xaa5 ha Ac, For eller 3-amino-l, 2,4-triazol som Qx, og at når Xaa6 inneholder Q, da kan Xaa5 også inneholde Q.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et farmasøytisk preparat for å inhibere sekresjonen av gonadotropiner i pattedyr som inneholder, som en aktiv bestanddel, en effektiv mengde av en GnRH antagonist ifølge oppfinnelsen sammen med et ikke-giftig fortynningsmiddel.

En metode for in vivo eller in vitro diagnose av en tilstand hvori GnRH bevirker usedvanlig stor hormonsekresjon eller tumorvekst omfatter administrering av et GnRH antagonistpeptid av den type som er beskrevet over og måling med hensyn til hormonell sekresjon eller tumorcelleproliferasjon.

Et mellomprodukt for fremstilling av et GnRH antagonistpeptid har formelen: Xx-D-Nal- (A) D-Phe-D-Pal-Ser (X2) -Xaa5-Xaa6-Leu-Lys (ipr) (X4) - Pro-X<5> hvori: X<1> er en cc-aminobeskyttende gruppe; A er 4C1 eller 4F; X<2> er H eller en hydroksyl-beskyttende gruppe; Xaa5 er Aph { Q^ eller Amf (C^) hvori Qx er en D-isomer, en L-isomer eller en D/L-isomer blanding av enten Xaa6 er D-Aph(Q2), D-Amf(Q2) eller D-Pal, hvori Q2 er Ac, Qlt eller karbamoyl eller metylkarbamoyl; X<4> er en syrelabil • aminobeskyttende gruppe; og X<5> er D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- eller D-Agl(Me)-resinbærer; N(Et)-resinbærer; et amid av D-Ala, Gly eller Ala; etylamid; AzaGly-NH2 eller OH, med den betingelse at a-aminogruppen i Xaa5 eventuelt kan være metylert.

Disse antagonister er særlig anvendbare for å undertrykke sekresjonen av gonadotropiner og som fertilitetsregulatorer i mennesker på grunn av at de utviser en lang varighet med hensyn til aktivitet, dvs. de fortsetter å vesentlig undertrykke LH sekresjon i minst omtrent 4 døgn. De har forbedret" solubilitét i vandige buffere ved fysiologiske pH verdier og aksepterbare bivirkninger med hensyn til stimulering av histaminfrigjøring, dvs. de er bedre enn GnRH superagonistene som nå anvendes klinisk, og de utviser også minimal geldannelse ved subkutan injeksjon i effektive konsentrasjoner. Disse GnRH antagonister virker bra i en anafylaktoid analyse og fører til en relativt liten blemme. Som et resultat kan disse peptider særlig anvendes for administrering til pattedyr, særlig mennesker, som fertilitetsregulatorer og for behandlingen av patologiske tilstander som tidlig utviklet pubertet, hormonavhengige neoplasier, dysmenoré, endo-metriose, steroidavhengige tumorer og andre korttids og langtids indikasjoner nevnt i det foregående. De kan også anvendes diagnostisk.

Fordi disse GnRH antagonister er lett oppløselige i det fysiologiske pH området fra omtrent 5 til omtrent 7,4, kan de utformes og administreres i konsentrert form, særlig ved en pH mellom omtrent 5 og omtrent 7. På grunn av deres polare karakter, er de særlig egnet for anvendelse i preparater med sakte frigjøring basert på kjente kopolymerer. På grunn av at disse GnRH antagonister utviser effektiv suppresjon av LH og FSH av lang varighet, er de også særlig effektive for den preventive behandling av hannpattedyr (med den eventuelle administrering av testosteron) og for behandlingen av steroidavhengige tumorer.

I løpet av de siste 10 til 12 årene har de spesielle egen-skapene til hver av de 10 restene i sekvensen i GnRH, ut fra formålet om å danne en effektiv antagonist, blitt studert nærmere, og som et resultat fra disse studier har man funnet at der er forskjellige ekvivalente rester som kan velges og at substitusjoner av en av disse ekvivalenter med en annen ikke signifikant nedsetter den biologiske potens til dekapeptid GnRH antagonister. Slike ekvivalente substitusjoner kan gjennomføres i GnRH antagonistene i henhold til oppfinnelsen.

Det er for eksempel blitt generelt akseptert at innlemmelsen av en parasubstituert D-Phe eller 2,4-diklorsubstituert D-Phe eller D-C<a>Me4ClPhe eller D-pentametyl(Me5) Phe rest i 2-stillingen signifikant øker GnRH antagonistaktiviteten, men den spesifikke identitet av ringsubstituenten er imidlertid kun av relativt mindre viktighet når den er valgt blant de følgende: klor, fluor, brom, nitro, metyl og alkoksy. Slike rester i 2 -st-i.llingen betraktes derfor til å være ekviva-lenten av D-4ClPhe som er vanlig anvendt deri. Phe<7 >betraktes til å være ekvivalent med Leu<7>'. N-terminusen er foretrukket N-acylert, foretrukket med acetyl (Ac) men også med andre acylgrupper med opp til 7 karbonatomer, f.eks. formyl (For), akrylyl (Acr), n-propionyl (Pn), butyryl (By), valeryl (VI), vinylacetyl (Vac) og benzoyl (Bz), idet den alternativt kan være modifisert med et substituert eller usubstituert karbamoyl. Andre lengre acylgrupper betraktes til å være ekvivalenter men er mindre foretrukne. a-aminogruppen på resten i 5-stillingen kan eventuelt være metylert, som omtalt i US patent nr. 5.110.904, for å øke oppløselighet i vann, men en slik modifikasjon kan resultere i en forkortet varighet av LH suppresjon og i et større potensiale for histaminfrigjøring. C-terminusen er foretrukket D-Ala-NH2, D-Ala-ol eller Ala-ol, men Gly-NH2, NHCH2CH3, AzaGly-NH2, Ala-NH2, Agl-NH2, D-Agl-NH2 , Agl(Me)-NH2 og D-Agl(Me)-NH2 anvendes også da de betraktes til å være kjente ekvivalenter.

Som angitt i det foregående, ansees den foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en familie av GnRH antagonister som er representert ved følgende formel: X-D-Nal-(A) D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10 og de farmasøytisk aksepterbare salter derav hvori:

X er For, Ac, Acr, Pn, By, VI, Vac, Bz eller Q,

hvori Q er

og hvori R er H eller lavere alkyl,

A er 4C1, 4F, 4Br, 4N02, 4CH3, 40CH3, 3,4C12 eller C<a>Me4Cl, Xaa5 er Apli^) eller Amf { Q^ hvori Q1 er

<:>Xaa6 er D-Aph(Q2), D-Amf(Q2) , D-Lys(Nie), D-Cit, D-Hci eller D-Pal, hvori Q2 er For, Ac, 3-amino-l,2,4-triazol, Q eller Q1# Xaa8 er Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et2) eller Har(Et2), og

Xaa10 er D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3, Gly-NH2, AzaGly-NH2, Ala-NH2, Agl-NH2, D-Agl-NH2, Agl(Me)-NH2 eller D-Agl(Me)-NH2, med den betingelse at a-aminogruppen i Xaa5 eventuelt kan være metylert.

I en nær beslektet familie av GnRH antagonister kan Xaa5 ha enten Ac, For eller 3-amind-1,2,4-triazol som Q1# i hvilket tilfelle Xaa6 inkluderer Q2 i formen av D- eller L-Hor eller D- eller L-Imz.

I en annen nær beslektet familie av GnRH antagonister hvor Xaa6 inkluderer Q, inkluderer Xaa5 også Q. ■

Med D-Nal menes D-isomeren av alanin som er substituert med naftyl på p-karbonatomet, dvs.•også omtalt som p-D-Nal eller 3- D-Nal. D-2Nal anvendes foretrukket hvor bindingen til naftalen er i 2-stillingen på ringstrukturen, idet D-lNal imidlertid også kan anvendes. D-Cpa representerer klor-D-Phe og D-4ClPhe, dvs. D-4Cpa er foretrukket. D-Pal representerer D-isomeren av alanin som er blitt substituert med pyridyl på P-karbonatomet, idet bindingen foretrukket er til 3-stillingen på pyridinringen, dvs. D-3Pal(P-3-pyridyl-D-Ala), skjønt D-2Pal(p-2-pyridyl-D-Ala) i stedet vil kunne anvendes. Med 4Aph menes 4NH2Phe hvori aminosubstituenten på fenylring-en er i 4-stillingen, idet 3NH2Phe (3Aph) betraktes til å være dens ekvivalent i disse analoger. Dessuten menes det at 2NH2Phe også er ekvivalent sett ut fra biopotenssynspunktet. Med 4Amf menes 4NH2CH2Phe hvor der er en metylenkobling til sidekjede-aminogruppen, idet 3NH2CH2Phe (3Amf) betraktes som ekvivalent. Med Hor eller L-Hor eller L-Hor menes L-hydroorotyl, og med Imz eller L-Imz menes L-2-imidazolidon-4-karbonyl som begge også kan anvendes som D-isomeren eller D/L blandingen. Med atz menes 3-amino-l,2,4,-tiazol. Aph(atz) er også kjent til å være det mere presise kjemiske navn 4- (31-amino-lH-l1,2',4'-triazoyl-51-yl)aminofenylalanin. Med Lys(Nie) menes Ne<->nikotinoyllysin, dvs. e-aminogruppen i Lys er acylert med 3-karboksypyridin. Med D-Cit menes D-isomerene av citrullin, og med D-Hci menes D-isomerene av homo-citrullin som også er D-Ne<->karbamoyllysin. Med ILys eller Lys(ipr) menes Ne<->isopropyllysin hvor e-aminogruppen av Lys er alkylert. Med Ala-ol menes alaninol, dvs. CH3CH(NH2)CH2OH, og med AzaGly-NH2 menes NHNHCONH2. Med Har menes homoarginin. Med Agl menes a-aminoglycin. Med Cbm menes karbamoyl og med MeCbm menes metylkarbamoyl eller -CONHCH3-. Med lavere alkyl menes C-^ til C5, foretrukket C-,^ til C3, og mere foretrukket Cx eller C2, dvs. metyl(Me) eller etyl(Et).

Skjønt de foretrukne D-isomerer for innlemmelse i 6-stillingen til disse GnRH antagonister er angitt spesifikt, skal det forstås at som et resultat av de omfattende undersøkelser som er gjort innen fagområdet .i løpet av de to siste tiår, er der en rekke kjente ekvivalente D-isomerer. Slike tidligere kjent D-isomersubstitusjoner kan være kompatible og svekker ikke biopotensen som gitt ved de spesifikke 5-stilling-substitusjoner angitt heri, og kan eventuelt anvendes.

En foretrukket subgenus av GnRH antagonister har formelen: . X-D-Nal- (A) D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys (ipr) -Pro-Xaa10 og de farmasøytisk aksepterbare salter derav hvori:

X er For, Ac, Acr, Pn, By, VI, Vac, Bz eller Q,

hvori Q er

og hvori R er H eller lavere alkyl; A er 4C1 eller 4F, Xaa5 er Aph [ Q-^) eller Amf (Q-^ hvori Q1 er

Xaåg er D-Aph(Q2), D-Amf(Q2) , D-Cit, D-Lys(Nie), eller D-Pål, hvori Q2 er For, Ac, Q eller Qlf og

Xa<a>10 er D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3 eller Gly-NH2.

En ytterligere foretrukket subgenus av GnRH antagonister har

. formelen: X-D-Nal-D-4Cpa-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Lys (ipr) -Pro-Xaa10 og de farmasøytisk aksepterbare salter derav hvori:

X er Ac eller Q,

hvori Q er

og hvori R er H eller metyl, Xaa-5 er Apti^) eller Amf (Qx) hvori Q-l er

Xaa6 er D-Aph(Q2), D-Amf(Q2) eller D-Pal hvori Q2 er Ac, Q eller Qx, og

Xaa10 er D-Ala-NH2, D-Ala-ol eller Ala-ol.

En annen foretrukket subgenus av GnRH antagonister har formelen: MeCbm-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-Xaa6-Leu-ILys-Pro-Xaa10 og de farmasøytisk aksepterbare salter derav hvori D-Xaa6 er D-Amf(Q^ , D-Aph(Q1) eller D-3Pal, hvori Q er D-Hor eller

og hvori R er H eller lavere alkyl, og foretrukket H eller metyl, og hvori Xaa10 er D-Ala-NH2, D-Ala-ol eller Ala-ol.

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen kan syntetiseres ved en vanlig peptidoppløsningssyntese, og en slik syntese er foretrukket for større produktmengder. For å oppnå be-grensede mengder, f.eks. mindre enn 1 kg, kan det være foretrukket å syntetisere dem ved anvendelse av en fast-fase teknikk. Sidekjedebeskyttende grupper, som er vel kjent innen teknikken, inkluderes foretrukket som en del av en hvilken som helst aminosyre som har en spesielt reaktiv eller labil sidekjede når den kobles til kjeden som bygges på resinet. Slike synteser tilveiebringer et fullstendig beskyttet mellomliggende peptidoresin, som X<1->D-Nal-A(D) -Phe-D-Pal-Ser (X2) -Xaa5-Xaa6-Leu-Lys (ipr) (X4) -Pro-X5.

Ett eksempel på et kjemisk mellomprodukt som kan anvendes til å syntetisere en GnRH antagonist med en ønsket rest i 5- og 6-stillingene inneholdende hydroorotyl eller lignende er representert ved formelen: X1-D-Nal-4Cpa-D-Pal-Ser (X2)-Aph(X3) -D-Aph(X3) -Leu-ILys (X4) -Pro-X5. Ved syntese av peptid-mellomprodukter med denne formel og andre analoger, kan grupper X<1> og X<5> som angitt i det etterfølgende anvendes.

X<1> er en a-aminobeskyttende gruppe av den type som er kjent til å være anvendbar innen teknikken med trinnvis syntese av polypeptider og når X i den ønskede peptidsammenstilling er

en særlig acylgruppe kan denne gruppe anvendes som beskyttelsesgruppen. Blånt klassene av a-aminobeskyttende grupper som dekkes ved hjelp av X1 er (1) acetyl-type beskyttende grupper som formyl (For), trifluoracetyl, ftalaoyl, p-toluensulfonyl

(Tos), benzoyl (Bz), benzensulfonyl, ditiasuccinoyl (Dts), o-nitrofenylsulfenyl (Nps), tritylsulfenyl, o-nitrofenoksy-acetyl, akrylyl (Acr) , kloracetyl, acetyl (Ac) og yklor-butyryl; (2) aromatiske uretan-type beskyttende grupper, f. eks., benzyloksykarbonyl (Z) , f luorenylmetyloksykarbonyl (Fmoc) og substituert benzyloksykarbonyl som p-klorbenzyl-oksykarbonyl (C1Z), p-nitrobenzyloksykarbonyl, p-brombenzyl-oksykarbonyl og p-metoksybenzyloksykarbonyl; (3) alifatiske uretan-beskyttende grupper som tertbutyloksykarbonyl (Boe), diisopropylmetoksykarbonyl, isopropyloksykarbonyl, etoksy-karbonyl og allyloksykarbonyl; (4) cykloalkyluretan-type beskyttende grupper som cyklopentyloksykarbonyl, adamantyl-oksykarbonyl og cykloheksyloksykarbonyl; (5) tiouretan-type beskyttende grupper som fenyltiokarbonyl,- (6) alkyl-type beskyttende grupper som allyl (Aly), trifenylmetyl(trityl) og benzyl (Bzl); (7) trialkylsilangrupper som trimetylsilan. Den foretrukne a-aminobeskyttende gruppe er Boe.

X<2> er en beskyttende gruppe for hydroksylsidekjeden i Ser, f.eks. Ac, Bz, trityl, 2,6-diklorbenzyl (DCB) eller benzyleter (Bzl) og er foretrukket Bzl.

X<3> er en beskyttende gruppe for en sidekjede-aminogruppe som ikke fjernes når den a-aminobeskyttende gruppe eller en annen aminobeskyttende gruppe fjernes. Illustrerende eksempler inkluderer (1) baselabile grupper som Fmoc eller enkelte andre svak-syrestabile aromatiske uretan-type beskyttende grupper; (2) tiollabile grupper som ditiasuccinoyl (Dts) som kan fjernes eller spaltes ved tiolyse; (3) hydrazinlabile grupper som ftaloyl (Pht) som spaltes ved hydrazinolyse; (4) nukleofil-labile grupper som o-nitrofenylsulfenyl (Npsj og lignende som spaltes ved tioacetamid eller ved hjelp av svake syrer eller deres salter; (5) fotolabile grupper som spaltes ved fotolyse; og (6) grupper som er selektivt fjern-bare ved reduksjon, som Dts. Fmoc er foretrukket for en Boe SPPS strategi.

X<4> er en syrelabil beskyttende gruppe for en primær eller sekundær aminosidekjedegruppe, som Z eller 2C1Z.

X<5> kan være D-Ala-, Gly-, Ala-, Agl-, D-Agl-, Agl(Me)- eller D-Agl(Me)-NH-[resinbærer], eller N(Et)-[resinbærer], X<5> kan også være et amid av enten Gly eller Ala eller D-Ala, et lavere alkylsubstituert amid festet direkte til Pro, AzaGly-NH2 eller -0H (fri syre). Når X<5> er en fri syre er mellomproduktet et nonapeptidfragment som er utformet til å kobles til D- eller L-alaninol for å tilveiebringe et dekapeptid med en alkohol i C-terminusen.

Kriteriet for å velge sidekjedebeskyttende grupper X<2> til X<4>

er at den beskyttende gruppe generelt bør være stabil overfor reagenset under reaksjonbetingelser som er valgt for å fjerne den a-aminobeskyttende gruppe (foretrukket Boe) i hvert trinn av syntesen. Disse beskyttende grupper bør generelt ikke

spaltes av under koblingsbetingelser men bør kunne fjernes ved komplettering av syntesen av den ønskede aminosyresekvens under reaksjonsbetingelser som ikke vil endre peptidkjeden. De aminobeskyttende grupper som anvendes initialt for rester i 5- og 6-stillingene fjernes foretrukket og selektive reak-sjoner gjennomføres før spalting av det endelige peptid fra resinet, som forklart i det etterfølgende. Dersom et dekapeptid-mellomprodukt syntetiseres som angitt i det foregående, kan de X<3> beskyttende grupper ønskelig fjernes individuelt.

Når X<5> er D-Ala-NH-[resinbærer], vil en amidbinding forbinde D-Ala til et BHA resin eller til et MBHA resin, idet dette likeledes er tilfellet når Agl eller D-Agl anvendes i C-terminusen. Når X<5> er N (Et)-[resinbærer] , vil en etylamid-binding forbinde Pro til et N-alkylaminometylresin (NAAM).

Når N-terminusen skal acetyleres er det for eksempel mulig å anvende acetyl som X<1> beskyttelsesgruppen for a-aminogruppen i p-D-Nal i 1-stillingen ved å addere den til aminosyren før den kobles til peptidkjeden, men en reaksjon gjennomføres imidlertid foretrukket med peptid-mellomproduktet på resinet. Etter avbeskyttelse av a-aminogruppen og mens ønskede side-kjedegrupper forblir beskyttet, gjennomføres acetylering foretrukket ved reaksjon med eddiksyreanhydrid, idet reaksjonen alternativt kan gjennomføres med eddiksyre, i nærvær av diisopropyl- eller dicykloheksylkarbodiimid (DIC eller DCC), eller ved noen annen passende acyleringsreaksjon som er kjent innen teknikken. En lignende prosedyre gjennomføres når en karbamoyl- eller substituert karbamoylgruppe er ønskelig i N-terminusen. Når de avbeskyttede sidekjede-aminogrupper modifiseres mens resten er en del av peptid-kj eden, kan reaksjonen gjennomføres ved anvendelse av et passende isocyanat i nærvær av en passende base, for eksempel N,N-diisopropyletylamin (DIEA), skjønt bruk av en slik base er valgfri. Når en usubstituert karbamoylgruppe er ønsket i sluttproduktet, kan den avbeskyttede aminosidekjede reageres med benzylisocyanat, p-tosylisocyanat, trimetylsilylisocyanat eller tert-butylisocyanat, hvor den sistnevnte er foretrukket. Ved anvendelse av en slik strategi fjernes t-butyl-enheten under spalting fra resinet, noe som etterlater karba-moylgruppen.

En slik GnRH antagonist med for eksempel formelen: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2, fremstilles ved (a) dannelse av et mellomprodukt-peptid med formel: Boc-D-4Aph(X<3>)-Leu-ILys(X<4>)-Pro-X<5> hvor X<3 >er en baselabil, hydrazinlabil eller annen passende labil beskyttende gruppe for en aminogruppe, X<4> er en syrelabil beskyttende gruppe for en aminosidekjede og X<5> er D-Ala-NH-[resinbærer] ; (b) fjerning av X<3> fra D-4Aph for å avbeskytte den primære amino-sidekjedegruppen i denne aminosyrerest i mellomproduktpeptidet; (c) reaksjon av denne avbeskyttede primære amino-sidekjedegruppen med eddiksyreanhydrid; (d) komplettering av kjedeforlengelsen for å danne mellomproduktet X1-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser(X2)-4Aph(X3) -D-4Aph (Ac)-Leu-ILys (X4)-Pro-X5, hvori X<1> er hydrogen eller en a-aminobeskyttende gruppe og X<2> er hydrogen eller en beskyttende gruppe for en hydroksylgruppe i Ser; (e) avbeskyttelse av a-aminogruppen i N-terminusen og ace tyler ing.; (f) fjerning av X<3> fra 4Aph og reaksjon av den avbeskyttede primære aminogruppe med hydroorotinsyre; og (g) avsplitting av eventuelle gjenværende beskyttende grupper og/eller spalting fra resin-bæreren inkludert i X<5>.

Endelig rensing av peptidet gjennomføres ved kromatografi og foretrukket ved anvendelse av RP-HPLC, som kjent innen teknikken, se J. Rivier, et al. J. Chromatography, 288, 3 03-328 (1984) og C. Miller og J. Rivier, Biopolymers (Peptide Science), 40, 265-317 (1996).

GnRH antagonistene i henhold til oppfinnelsen betraktes til å være effektive ved mengdeandeler som er mindre enn 10 0 fig pr. kg kroppsvekt, ved subkutan administrering omtrent midt på dagen med pro-østrum, for å forhindre ovulasjon i hunnrotter. For forlenget suppresjon av ovulasjon, kan det være nødvendig å anvende dosenivåer i området fra omtrent 0,1 til omtrent 2,5 mg pr. kg kroppsvekt. Antagonistene er også effektive for å stanse spermatogenese ved administrering til hannpattedyr på en regulær basis og kan således anvendes som preven-sjonsmidler. Fordi disse forbindelser vil redusere testo-steronnivåer og såldes libido (en uønsket konsekvens for den normale, seksuelt aktive hann), kan det være ønskelig å administrere erstatningsdoser av testosteron sammen med GnRH antagonisten for å oppnå azoospermi mens man opprettholder libido. Disse antagonister kan også anvendes for å regulere produksjonen av gonadotropiner og kjønnssteroider og for andre av de langtids- og kortidsindikasjonene som er indikert i det foregående, og de kan anvendes innen veterinærmedisin som kontraseptiver for kjæledyr.

Peptidene tilveiebragt ved oppfinnelsen er særlig oppløselige ved fysiologiske pH verdier og kan fremstilles som relativt konsentrerte oppløsninger for administrering, særlig for subkutan injeksjon,. Disse peptider er godt tolerert av kroppen og har ikke tendens til å danne gel ved subkutan administrering i effektive konsentrasjoner. Generelt kan farmasøytiske preparater som omfatter slike peptider og en passende farmasøytisk aksepterbar eksipiens administreres iv, ip, subkutant eller lignende i mengder på mellom omtrent 0,001 mg til omtrent 2,5 mg pr. kg kroppsvekt pr. døgn, og hvor 0,5 mg/kg/døgn vanligvis er tilstrekkelig.

De passende beskyttede D- eller L-hydroorotylholdige, karba-moylholdige og/eller D- eller L-imidazolidonkarbonyl-holdige aminosyrer kan syntetiseres og deretter anvendes i en kjede-forlengelses-peptidsyntese. En like valid syntese gjennom-føres imidlertid ved først å innlemme passende beskyttet Aph, D-Aph, Amf eller D-Amf rest i den ønskede stilling i peptid-mellomproduktet, og dette kan være den valgte laboratorie-metode hvor kun små mengder ønskes initialt. Denne sistnevnte strategi gjennomføres ved påfølgende avbeskyttelse av den spesielle rest (enten umiddelbart eller påfølgende under syntesen) og hvorpå den avbeskyttede sidekjede-aminogruppen reageres med det ønskede reagens.

Den foreliggende oppfinnelse er videre beskrevet ved hjelp av de etterfølgende eksempler.

Eksempel 1

Peptidet-med formelen: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3.Pal-Ser-Lys (Nie) - D-Lys(Nie)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 (Antid) er blitt funnet til å utvise svært gode biologiske egenskaper som en GnRH antagonist, noe som også gjelder for peptidet som etterhvert omtales som Acylin og som avviker fra Antid i kun 5- og 6-stillingene. Man har nå funnet at ved anvendelse av disse molekyler som et utgangspunkt og ved å gjøre andre substitusjoner i 5- og 6-stillingene eller i 5-stillingen i dekapeptidet Acylin,. oppnås GnRH antagonister med forbedret varighet med hensyn til bioaktivitet in vivo. Med hensyn til stillinger 1-4 og 7-10, skal det bemerkes at Antid, Acylin og Azalin alle er nøyaktig de samme.

Det etterfølgende dekapeptid [4Aph(Hor)<5>, D:4Aph(Cbm)6] -Antid eller [Ac-D-2Nal<1>, D-4Cpa<2>, D-3Pal<3>, 4Aph(Hor)5, D-4Aph(Cbm)<6>, ILys<8>, D-Ala<10>]-GnRH syntetiseres ved fast-fase syntese. Dette peptid har følgende formel: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys(isopropyl)-•Pro-D-Ala-NH2.

Omtrent 0,5 0 g (0,54 mmol/g) MBHA resin (Bachem) anvendes initialt, og Boc-beskyttet D-Ala kobles til resinet over en periode på omtrent 2' timer i dimetylformamid (DMF)/CH2C12 ved anvendelse av omtrent 0,65 mmol Boe derivat og diisopropyl-karbodiimid (DIC) og vannfritt 1-hydroksybenzotriazol (HOBt) som aktiverings- eller koblingsreagenser. D-Ala resten fester til MBHA resten ved en amidbinding.

Etter kobling av hver aminosyrerest, er vasking, avbeskyttelse og deretter kobling av den neste aminosyrerest gjennomført i overensstemmelse med den følgende manuelle synteseplan for omtrent 0,5 til 1 g utgangsresin:

Ovennevnte plan anvendes for å koble hver av aminosyrene i peptidet i henhold til oppfinnelsen etter at den første aminosyre er blitt festet. N<a>Boc beskyttelse anvendes for hver av aminosyrene som kobles gjennom syntesen. N<a>Boc-p-D-2Nal fremstilles ved en metode som er kjent innen teknikken, f.eks. som beskrevet detaljert i US patent nr. 4.234.571, og den er også kommersielt tilgjengelig fra SyntheTech, Oregon, USA. De primære aminogrupper i sidekjeden av 4Aph i 5-stillingen og av D-4Aph i 6-stillingen beskyttes med Fmoc. Benzyleter (Bzl) anvendes foretrukket som en sidekjedebeskyttende gruppe for hydroksylgruppen i Ser, idet Ser imidlertid kan kobles uten sidekjedebeskyttelse. N<a>Boc-Lys(ipr,Z) anvendes for resten i 8-stillingen.

Etter tilsetning av D-4Aph for resten i 6-stillingen som N<a>Boc-D-4Aph(Fmoc), er det følgende mellomprodukt til stede: Boc-D-4Aph(Fmoc)-Leu-Lys(ipr,Z)-Pro-D-Ala-NH-[MBA resinbærer] . Sidekjedeaminogruppen på resten i 6-stillingen modifiseres deretter etter at man først har fjernet side-kjedebeskyttelsen. Fmoc beskyttelsesgruppen fjernes ved påfølgende behandlinger med 25% piperidin i DMF (10 ml) i omtrent 15 minutter hver gang. Etter vasking av peptidoresinet med DMF, blir den nylig frigjorte aminogruppe behandlet med 2 0-ganger overskudd av tert-butylisocyanat i DMF ved romtemperatur i omtrent 12 timer eller inntil komplettering som undersøkt ved anvendelse av en ninhydrid-test. Peptidoresinet underkastes deretter en standard vasking og Boe fjernes for å tilføye den neste rest.

Resten i 5-stillingen tilføyes deretter som en N<a>Boc-4Aph(Fmoc). Dens sidekjede avbeskyttes deretter som før, og en reaksjon gjennomføres med 0,01 g (0,66 mmol) L-hydroorotinsyre, 90 mg (0,66 mmol) HOBt og 0,66 mmol DIC i 3 ml DMF ved romtemperatur i omtrent 8 timer eller inntil komplettering som undersøkt ved anvendelse av en standard ninhydrin-test. Etter vasking og fjerning av N°Boc, kompletteres syntesen av dekapeptidet ved fortløpende reaksjon med N<a>Boc-Ser(Bzl), N<a>Boc-D-3Pal, N<a>Boc-4Cpa og N<a>Boc-D-2Nal. Etter avbeskyttelse av a-aminogruppen i N-terminusen ved anvendelse av trifluoreddiksyre (TFA), oppnås acetylering ved anvendelse av et større overskudd av eddiksyreanhydrid i diklormetan (DCM) i omtrent 3 0 minutter. Alternativt fjernes ikke Fmoc. beskyttelsen av 4Aph inntil etter acetyleringen av N-terminusen, og reaksjonen med L-hydroorotinsyre gjennom-føres deretter.

Peptidoresinet tørkes og etter tilsetning av anisol (0,5 ml) som et rengjøringsmiddel, gjennomføres spalting av peptidet fra resinet og avbeskyttelse av Ser og Lys sidekjedene ved omtrent 0°C med 15 ml HF i omtrent 1,5 timer, med fjerning av hvilken- som helst gjenværende t-butylenhet. Etter fjerning av HF under vakuum vaskes resinet to ganger med 100 ml etyl-eter. Det spaltede peptid ekstraheres med 0,2% TFA i 25% CH3CN/H20, prosessen gjentas ved anvendelse av 100 ml hver gang. Ekstraktene samles og frysetørkes, og de tilveiebringer omtrent 600 mg av urent peptidpulver.

Rensing av peptidet gjennomføres deretter ved preparativ revers-fase høyytelsesvæskekromatografi (RP-HPLC) som kjent innen teknikken og som spesifikt angitt i J. Rivier, et al. J. Chromatography, 288, 3 03-328 (1984). Den første prepara-tive RP-HPLC separasjon anvender et TEAP (trietylammonium-fosfat) buffersystem, og en endelig separasjon gjennomføres ved anvendelse av en 0,1% TFA (trifluoreddiksyre) gradient, alle som beskrevet detaljert i J. Chromatography artikkelen.

Peptidet (omtrent 3 0 mg) (heretter omtalt som peptid nr. 1) bedømmes til å være i alt vesentlig homogent ved anvendelse av kapillærsoneelektroforese (CZE) , og renheten estimeres til å være omtrent 98%. Aminosyreanalyser.av det rensede peptid er overensstemmende med formelen for den fremstilte struktur. Molekylvekt som bestemt ved LSIMS ("liquid secondary ion mass spectrometry") måles til 1631,9 Da, som er overensstemmende med den forventede masse på 1631,8 Da for dette peptid.

Hydrofilisitet testes ved å måle retensjonstiden ved anvendelse av RP-HPLC med en gradient av 40% buffer B til 70% buffer B over 30 minutter, og med buffer A lik TEAP pH 7,0 og buffer B lik 70% CH3CN og 30% buffer A. Peptid nr. 1 er mere hydrofilt enn acylin, og eluerer tidligere enn acylin. Dets oppløselighet i vandige buffere ved en pH fra omtrent 5 til omtrent 7 og dets resistens overfor in vivo geldannelse, sammen med en lengevirkende biopotens med hensyn til å undertrykke sirkulerende LH nivåer som beskrevet i det etterfølg-ende, gjør det særlig egnet for administrering ved subkutan injeksjon sammenlignet med andre forbindelser med generelt sammenlignbar biologisk effektivitet.

Peptidet prøves in vivo for å bestemme dets effektivitet med hensyn til å undertrykke sekresjonen av LH i rotter. Måling av sirkulerende LH nivåer i kastrerte Sprague-Dawlay hann-rotter behandlet subkutant med peptidet gjennomføres som rapportert i C. Rivier et al. Biol. Reproduc., 1983, 29, 374-378. Peptidene oppløses først i en konsentrasjon på 1,0 eller 10 mg/ml i bakteriostatisk vann og fortynnes deretter videre i en 0,04 M fosfatbuffer inneholdende 0,1% BSA. På-følgende fortynninger gjennomføres i fosfatbuffer. Peptidene injiseres subkutant i 5 rotter, og blodprøver (300 ^1) samles under metotananestesi. Serum (50 /il) testes for LH nivåer in duplo ved anvendelse av reagenser tilveiebragt av the National Pituitary and Hormone Distribution Program of the NIDDK. Testing viser at en dose på 50 pg peptid pr. rotte undertrykker LH sekresjon til nivåer som er langt lavere enn 50% av kontrollnivåer gjennom en 96 timers periode etter injeksjon. Dessuten er nivåene målt etter 96 timer kun omtrent 30% av LH nivåene utvist i rotter som på lignende måte er injisert med en dose på 50 fig acylin. Peptid nr. 1 betraktes til å være svært lengevirkende. Undersøkelse av rottene viser at peptidet ble svært godt tolerert uten at noen signifikant geldannelse i injeksjonspunktet kunne påvises.

Erfaring som oppnådd fra testingen av en rekke GnRH antagonister viser at et peptid som utviser en slik lengevirkende suppresjon av LH ville, dersom testet in vivo i modne Sprague-Dawley hunnrotter, fullstendig blokkere ovulasjon i en dose på 2,5 /xg.

Eksempel IA

Syntesen som angitt i eksempel 1 gjentas, idet N<a>Boc-D-4Amf(Fmoc) erstatter N<a>Boc-D-4Aph(Fmoc). Etter avbeskyttelse av D-4Amf sidekjeden gjennomføres reaksjon med t-butylisocyanat som før. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-.r D-4Amf(karbamoyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås ved RP-HPLC rensing og bedømmes til å være i alt vesentlig homogen og renheten derav estimeres til å være større enn 99%.

MS analyse viser en masse på 1645,9 Da som er gunstig sammenlignet med den forventede masse på 1645,8 Da. Fra HPLC resultatene kan man se at dette peptid er mere hydrofilt enn Acylin.

Analyse av dette peptid i standard in vivo rotte LH suppre-sjonstesten viser at, i en dose på 50 fig, er det like effektivt som Acylin med hensyn til å undertrykke LH nivåer etter l, 2 og 3 døgn. Etter 96 timer er LH nivåene kun rundt 25% av dem i rotter injisert med Acylin. Peptid nr. IA betraktes til å være svært lengevirkende.

Eksempel IB

For å danne analogen [4Aph(Hor)<5>]-Acylin gjentas syntesen som angitt i eksempel 1 men hvor eddiksyreanhydrid erstatter t-butylisocyanat for reaksjonen med den avbeskyttede stilling-6 sidekjeden. Spalting av dekapeptidet fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renheten estimeres til å være større enn 99%. MS analyse viser en masse på 163 0,6 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1630,8 Da.

Analyse av dette peptid i en standard in vivo rottetest som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 [ ig, er peptidet bioaktivt og omtrent like effektivt som Acylin på dag 1 til og med dag 4. Det betraktes til å være svært lengevirkende med hensyn til suppresjonen av LH.

Eksempel 1C

Syntesen som angitt i eksempel IB gjentas hvor D/L hydroorotinsyre erstatter L-hydroorotinsyre for å danne isomere dekapeptider. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D/L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være en homogen blanding av to forbindelser uten andre forurensninger. MS analyse viser en masse på 1630,6 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 163 0,8 Da.

Analyse av dette peptid i standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 ( ig, er peptidet bioaktivt og omtrent like effektivt som Acylin på dag 1 til og med dag 4. Det betraktes til å utvise lengevirkende varighet med hensyn til suppresjonen av LH.

Eksempel ID

Syntesen som angitt i eksempel IB gjentas idet D-hydroorotinsyre erstatter L-hydroorotinsyre for å danne det isomere dekapeptid. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være større enn 98%. MS analyse viser en masse på 1630,8 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1630,8 Da.

Analyse av dette peptid i standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 pg, utviser peptidet lengevirkende bioaktivitet med hensyn til suppresjonen av LH, og det er omtrent like effektivt som Acylin på dag 1 til og med dag 4.

Eksempel 1E

Syntesen som angitt i eksempel IB gjentas idet N<a>Boc-D-4FPhe erstatter N<a>Boc-D-4ClPhe for å danne dekapeptidet [D-4FPhe<2>, 4Aph(Hor)<5>]-Acylin. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Fpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være større enn 99%. MS analyse viser en masse på 1615,1 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1614,8 Da.

Analyse av dette peptid i standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 fig, er peptidet bioaktivt og omtrent like effektivt som Acylin på dag 1 til og med dag 4. Det betraktes til å være lengevirkende med hensyn til suppresjonen av LH.

Eksempel 1F

Syntesen som angitt i eksempel IB gjentas idet N<a>Boc-4Amf(Fmoc) erstatter N<a>Boc-4Aph(Fmoc) for å danne dekapeptidet [4Amf(Hor)<5>]-Acylin. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være større enn 98%. MS analyse viser en masse på 1644,7 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1644,8 Da.

Analyse av dette peptid i standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 fig, er peptidet bioaktivt og omtrent like effektivt som Acylin på dag 1 til og med dag 4. Det betraktes til å være lengevirkende med hensyn til suppresjonen av LH.

Eksempel IG

Syntesen som angitt i eksempel 1 gjentas men i stedet for å reagere sidekjedeaminoet i D-4Aph med t-butylisocyanat, blir dette og 4Aph resten samtidig reagert med hydroorotinsyre for å danne dekapeptidet [4Aph(Hor)5) , D-4Aph(Hor)<6>]-Antid. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(L-hydroorotyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vésentlig homogent og dets renhet estimeres til å være større enn 99%. MS analyse viser en masse på 1728,4 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1728,8 Da. Resultatene fra RP-HPLC viser at dette peptid er mere hydrofilt enn Azalin B som sin tur er mere hydrofilt enn Acylin.

Analyse av dette peptid i standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 y. g, er peptidet bioaktivt og omtrent like effektivt som Acylin på dag 1 til og med dag 4. Det*betraktes til å være lengevirkende med hensyn til suppresjonen av LH.

Denne syntese gjentas idet N<a>Boc-D-4Amf(Fmoc) erstatter N<a>Boc-D-4Aph(Fmoc) for å danne dekapeptidet [4Aph(Hor)<5>, D-Amf(Hor)<6>]-Antid som generelt er like biopotent med hensyn til suppresjon av sekresjon av LH.

Eksempel 1H

Syntesen som angitt i eksempel 1 gjentas men i stedet for å reagere sidekjedeaminoet i D-4Aph med t-butylisocyanat, reageres det med D-hydroorotinsyre for å danne dekapeptidet [4Aph(Hor)<5>), D-4Aph(D-Hor)<6>]-Antid. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(D-hydroorotyl)-Leu-Lys(isopropyl) -Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være større enn 98%. MS analyse viser en masse på 1728,7 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1728,8 Da. Resultatene fra RP-HPLC viser at dette peptid er mere hydrofilt enn Azalin B som i sin tur er mere hydrofilt enn Acylin.

Analyse av dette peptid i standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 /tg, er peptidet bioaktivt og omtrent like effektivt som Acylin på dag 1 til og med dag 3. Det er i alt vesentlig mere effektivt enn Acylin etter 4 dager og det betraktes til å være svært lengevirkende med hensyn til suppresjonen av LH.

Eksempel 1J

Syntesen av dekapeptidet [MeCbm-D-2Nal<1>, 4Aph(Hor)<5>]-Acylin gjennomføres ved den generelle prosedyre som er angitt i eksempel IB, men i stedet for umiddelbart å fjerne Fmoc beskyttelsesgruppen etter tilsetning av N<a>Boc-4Aph(Fmoc) kompletteres syntesen av dekapeptidet på resinet. Deretter, etter avbeskyttelse av N-terminusen i stedet for reaksjon med eddiksyreanhydrid, gjennomføres en reaksjon med metylisocyanat for. å danne metylkarbamoyl i N-terminusen. Deretter fjernes Fmoc og sidekjedeaminoet i 4Aph reageres med L-hydroorotinsyre som i eksempel IB. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet metylkarbamoyl-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Aph(acetyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det. bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være omtrent 99%. MS analyse viser en masse på 1645,7 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1645,8 Da. Resultatene fra RP-HPLC viser at dette peptid er mere hydrofilt enn Azalin B som i sin tur er mere hydrofilt enn Acylin.

Analyse av dette peptid i standard in vivo rottetesten som i .eksempel 1 viser at, i en dose på 50 /tg, er peptidet bioaktivt og omtrent like effektivt som Acylin på dag 1 til og med dag 3 og er nærmest 50% mere effektivt etter 96 timer. Det betraktes til å være svært lengevirkende med hensyn til suppresjonen av LH.

Eksempel IK

Syntesen som angitt i eksempel 1 gjentas idet N<a>Boc-D-3Pal erstatter N<a>Boc-D-4Aph(Fmoc) og med utelatelse av den påfølgende reaksjon med t-BuNCO for å danne dekapeptidet [4Aph(Hor)<5>), D-3Pal<6>]-Antid. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet acetyl-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-3Pal-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent, og .dets renhet estimeres til å være større enn 99%. MS analyse viser en masse på 1574,7 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1574,7 Da.

Analyse av dette peptid i standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 fig, er peptidet bioaktivt og omtrent like effektivt som Acylin i løpet av 3 dager, men etter 96 timer utviser det imidlertid suppresjon av LH nivå til verdier på omtrent 35% av dem for Acylin. Det betraktes til å være svært lengevirkende med hensyn til suppresjonen av LH.

Eksempel IL

Syntesen som angitt i eksempel IG gjentas idet t-butylisocyanat erstatter hydroorotinsyre for å danne dekapeptidet [4Aph(Cbm)<5>), D-4Aph(Cbm)<6>]-Antid. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(karbamoyl)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent, og dets renhet estimeres til å være større enn 99%. MS analyse viser en masse på 1534,9 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1534,7

Da.

Analyse av dette peptid i standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 jig, er peptidet bioaktivt og omtrent like effektivt som Acylin i løpet av 4 dager. Det betraktes til å være lengevirkende med hensyn til suppresjon av LH.

Eksempel IM

Syntesen som angitt i eksempel IG gjentas idet metylisocyanat erstatter hydroorotinsyre for å danne dekapeptidet [4Aph(MeCbm)<5>), D-4Aph(MeCbm)6] -Antid. Spalting fra resinet og avbeskyttelse, etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(metylkarbamoyl)-D-4Aph(metylkarbamoyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent, og dets renhet estimeres til å være større enn 99%. MS analyse viser en masse på 1562,8 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1562,8 Da.

Analyse av dette peptid i. standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 /ig, er peptidet bioaktivt og omtrent like effektivt som Acylin i 2 dager og deretter begynner aktiviteten å falle noe med hensyn til suppresjon av LH.

Eksempel 2

Peptidet [4Aph(Hor)5) , D-Cit<6>]-Antid, en analog av peptidet Cetrorelix med formelen: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-Cit-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 syntetiseres ved anvendelse av syntesen som generelt angitt i eksempel 1. I stedet for N<a>Boc-D-4Aph kobles N<a>Boc-D-Cit i 6-stillingen. Alternativt kobles N<a>Boc-D-0rn(Fmoc) i 6-stillingen, og kjedeforlengelsen stanses temporært etter at man har oppnådd følgende peptid-mellomprodukt: Boc-D-Orn(Fmoc)-Leu-Lys (ipr, Z) -Pro-D-Ala-NH- [MBHA resinbærer]. Aminosidekjeden på Orn resten avbeskyttes deretter ved å fjerne Fmoc beskyttelsen som i eksempel 1, og mellomproduktet behandles med overskudd av t-butylisocyanat i DMF i omtrent 6 timer ved romtemperatur for reaksjon med sidekjeden av Orn resten. Kompletteringen av syntesen av dekapeptid-mellomproduktet gjennomføres som i eksempel 1.

Peptidoresinet vaskes deretter, spaltes og avbeskyttes og renses deretter som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-Cit-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent, og dets renhet estimeres til å være større enn 99%. LSIMS analyse viser en målt masse på 1583,7 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1583,8 Da for dette peptid.

Peptidet er mere hydrofilt enn Cetrorelix og utviser like lang varighet med hensyn til bioaktivitet som Cetrorelix ved testing in vivo for suppresjon av LH sekresjon som i eksempel 1. Det har marginalt bedre suppresjbn etter 3 dager og i alt vesentlig bedre etter 96 timer.

Eksempel 2A

En analog av peptidet Antid, dvs. [4Aph(Hor)5] -Antid syntetiseres ved anvendelse av syntesen som generelt angitt i eksempel 1 i US patent nr. 5.169.935. Etter kobling av N<a>Boc-D-Lys(Fmoc) i 6-stillingen, gjennomføres reaksjon med et overskudd av nikotinsyre i DMF etterfulgt av avbeskyttelse. Deretter kobles N<a>Boc-Aph(Fmoc) i 5-stillingen og aminosidekjeden på Aph resten avbeskyttes deretter som i. eksempel l. Mellomproduktet reageres med L-hydroorotinsyre i DMF og syntesen av dekapeptid-mellomproduktet kompletteres som i eksempel 1.

Etter standard vasking gjennomføres spalting fra resinet, avbeskyttelse og rensing som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-Lys(Nie)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 oppnås ved RP-HPLC rensingen. Det betraktes til å være mere hydrofilt enn Cetrorelix og til å utvise like lang varighet med hensyn til bioaktivitet som cetrorelix vedrørende suppresjon av LH sekresjon.

Eksempel 3

Analogen [4Aph(D/L-Imz)<5>]-Acylin syntetiseres i henhold til metoden som generelt angitt i eksempel IB, unntatt at D/L-Imz erstatter L-Hor. Etter avbeskyttelse av 4Aph 5-stillingen behandles således mellomproduktet med et overskudd av D/L-2-imidazolidon-4-karboksylsyre, omtrent 90 mg HOBt og omtrent 0,66 mmol DIC i DMF oppløsning i omtrent 6 timer ved romtemperatur. Komplettering av dekapeptid-mellomproduktet gjennomføres som i eksempel 1.

Peptidoresinet vaskes, spaltes og avbeskyttes og renses som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D/L-2-imidazolidon-4-karbonyl)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være en homogen blanding av to forbindelser, uten andre forurensninger. LSIMS analyse viser en målt masse på 1602,7 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1602,8 Da- for dette peptid.

Analyse av peptidet ved anvendelse av standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 [ ig, utviser peptidet lang varighet med hensyn til suppresjonen av LH sekresjon. Det har marginalt bedre suppresjon etter 3 dager og etter 96 timer enn Acylin.

Eksempel 3A

Syntesen i eksempel 3 gjentas ved anvendelse av et overskudd av L-2-imidazolidon-4-karboksylsyre i stedet for D/L-Imz. Det oppnådde peptid bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være omtrent 99%. LSIMS analyse- viser en målt masse på 16 02,5 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1602,8 Da for dette peptid. Peptidet er mere vannoppløselig enn Acylin.

Analyse gjennomføres som i eksempel 1 og ved en dose på

5 0 iig, idet peptidet utviser lang varighet med hensyn til suppresjonen av LH sekresjon som er omtrent den samme som Acylin over en periode på 96 timer.

Eksempel 3B

Syntesen i eksempel 3 gjentas ved anvendelse av et overskudd av D-2-imidazolidon-4-karboksylsyre i stedet for D/L-Imz. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-Imz)-D-4Aph(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 oppnås. LSIMS analyse viser en målt masse på 1602,6 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1602,8 Da for dette peptid. Peptidet er mere vannoppløselig enn Acylin.

Analyse gjennomføres som i eksempel 1. Peptidet er-bioaktivt og ved en dose på 50 iig utviser peptidet suppresj on av LH sekresjon.

Eksempel 3C

Peptidet [4Aph(Imz)<5>, D-4Amf(Cbm)<6>]-Acylin syntetiseres ved anvendelse av en kombinasjon av metoden som angitt i eksempler IA (for å innføre D-4Amf(Cbm)<e>) og 3A (for å inn-føre 4Aph(Imz)<5>). Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Imz)-D-4Amf(karbamoyl)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent, og dets renhet estimeres til å være større enn 98%. LSIMS analyse viser en målt masse på 1617,6 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1617,8 Da for dette peptid. Peptidet analyseres som i eksempel 1 og ved en dose på 50 /ig utviser det en lang varighet med hensyn til suppresjon av LH sekresjon. Den er i alt vesentlig den samme som for Acylin i løpet av 3 døgn og det har en noe bedre suppresjon etter 96 timer.

Eksempel 4

Peptidet [4Aph(Hor)<5>, D-4Amf(MeCbm) 6]-Antid med formelen Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Amf (MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 syntetiseres ved anvendelse av den syntese som generelt er angitt i eksempel IA. I stedet for å reagere D-4Amf i 6-stillingen med overskudd av t-butylisocyanat i DMF, reagerer man med metylisocyanat. Komplettering av syntesen av dekapeptid-mellomproduktet gjennomføres deretter som i eksempel IA.

Peptidoresinet vaskes, spaltes og avbeskyttes og renses som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Amf(MeCbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være større enn 99%. LSIMS analyse viser en målt-masse på 1659,8 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1659,8 Da for dette peptid.

Analyse av peptidet ved anvendelse av standard in vivo rottetesten viser at, i en dose på 50 /ig, utviser peptid nr. 4 bedre suppresjonen av LH sekresjon enn Acylin og betraktes til å ha en svært lengevirkende bioaktivitet.

Eksempel 4A

Syntesen i eksempel 4 gjentas hvor eddiksyreanhydrid erstatter metylisocyanat for å danne peptidet [4Aph(Hor)<5>, D-4Amf(Ac)<6>]-Antid. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-hydroorotyl)-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være større enn 99%. LSIMS analyse viser en målt masse på 1644,5 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1644,8 Da for dette peptid.

Peptidet testes som i eksempel 1 i en dose på 50 /zg, og utviser lengevirkende bioaktivitet. Det viser suppresjon av LH sekresjon som er lik. den for Acylin etter 3 dager og etter 96 timer er suppresjonen noe bedre enn for Acylin.

Eksempel 4B

En modifikasjon av dekapeptidet syntetisert og testet i eksempel IA gjennomføres med D-alaninol i C-terminusen i stedet for D-alanylamid. Et nonapeptidfragment syntetiseres først med prolin som en fri syre i C-terminusen ved anvendelse av en syntese som generelt er som beskrevet med hensyn til eksempel IA, men med anvendelse av et Merrifield resin (klormetylert tverrbundet polystyren) som den tilgjengelig fra Bachem, Inc. Etter spalting, avbeskyttelse og rensing, oppnås følgende nonapeptid: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-OH. 0,15 mmol av det fullstendig avbeskyttede og HPLC rensede nonapeptid oppløses i 3 ml tørr DMF sammen med 3,0 mmol D-alaninol (Lancaster Chemical) . Deretter ble 0,60 mmol PyBOP (Novabiochem) , en fast substans, tilsatt som et koblingsmiddel og reaksjons-blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter. Reaksjonen ble avkjølt ved tilsetning av 200 ml vann, med dannelse av en emulsjon som ble omdannet til en klar opp-løsning ved å justere pH til 2,5 ved anvendelse av iseddik. Det oppnådde dekapeptid, Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol ble renset ved anvendelse av prepårativ RP-HPLC ved anvendelse av TEAP

(pH 2,3) som en buffer etterfulgt av ytterligere rensing ved anvendelse av 0,1% TFA som en buffer. Det oppnådde peptid bedømmes til å være i alt vesentlig homogent, og dets renhet estimeres til å være større enn omtrent 99%. MS analyse viser en masse på 1632,9 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1632,8 Da.

Analyse av peptidet i standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 fig, er peptidet bioaktivt og slik bioaktivitet fortsetter i minst 96 timer. Peptidet betraktes til å ha svært god langtidsvirkning.

Eksempel 4C

Syntesen i eksempel 4B gjentas idet 3,0 mmol L-alaninol (Aldridge Chemical) erstatter D-alaninol i reaksjonsbland-ingen. Det oppnådde dekapeptid renses som i eksempel 4B og bedømmes til å være i alt vesentlig homogent, med en renhet estimert til å være større enn omtrent 98%. MS analyse viser en masse på 1632,9 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1632,8 Da.

Testing av dette peptid i standard in vivo rottetesten som i eksempel 1 viser at, i en dose på 50 / xg, er peptidet bioaktivt og slik bioaktivitet fortsetter i minst 96 timer. Peptidet betraktes til å ha svært god langtidsvirkning.

Eksempel 4D

En modifikasjon av dekapeptidet syntetisert og testet i eksempel 1 gjennomføres med D-alaninol i C-terminusen i stedet for D-alanylamid. Et nonapeptidfragment syntetiseres med prolin som en fri syre i C-terminusen ved anvendelse av SPPS på et Merrifield resin, men ellers generelt som beskrevet med hensyn til eksempel 1. Etter spalting, avbeskyttelse og rensing, oppnås følgende nonapeptid: Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-OH. Det rensede nonapeptid reageres deretter med D-alaninol som i eksempel 4B, og det oppnådde dekapeptid, Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-ol renses ved anvendelse av preparativ.RP-HPLC som beskrevet i eksempel 4B, med unntak av at det anvendes TEAP ved pH 6,5 i stedet for TEAP ved pH 2,3. Det oppnådde peptid bedømmes til å være i alt vesentlig homogent, med en renhet som estimeres til å være større enn omtrent 99%. MS analyse viser en masse på 1618,9 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1618,8 Da. Analyse av peptidet in vivo viser at det er bioaktivt.

Eksempel 4E

Syntesen beskrevet i eksempel 4D gjentas., idet L-alaninol erstatter D-alaninol. Det oppnådde dekapeptid: Ac-D-2Nal-b-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(Hor)-D-4Aph(Cbm)-Leu-ILys-Pro-Ala-ol renses ved anvendelse av preparativ RP-HPLC som beskrevet i eksempel 4D, og det oppnådde peptid bedømmes til å være i alt vesentlig homogent, med en renhet som estimeres til å være større enn omtrent 99%. MS analyse viser en masse på 1618,9 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1618,8 Da. Analyse av peptidet in vivo viser at det er bioaktivt.

Eksempel 5

Peptidet [4Aph (D-Hor) 5, D-4Amf (Cbm) 6]-Antid, ett som har formelen Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 syntetiseres ved anvendelse av syntesen som generelt er angitt i eksempel IA. I stedet for å reagere 4Aph .i 5-stillingen med L-hydroorotinsyre, reageres sidekjeden med D-hydroorotinsyre. Komplettering av syntesen av dekapeptid-mellomproduktet gjennomføres deretter som i eksempel IA.

Peptidoresinet underkastes deretter standard vasking, og spalting fra resinet og avbeskyttelse etterfulgt av rensing gjennomføres som beskrevet i eksempel 1. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Amf(Cbm)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være større enn 98%. LSIMS analyse viser en målt masse på 1645,8 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1645,8 Da for dette peptid.

Testing av peptidet ved anvendelse av standard in vivo rottetesten viser at, i en dose på 50 /zg, utviser peptidet en varighet av bioaktivitet for suppresjonen av LH sekresjon i løpet av 2 dager som er omtrent like lang som Acylin og som fortsetter å gi en noen mindre grad av suppresjon etter 72 og 96 timer.

Eksempel 5A

Syntesen i eksempel 5 gjentas med unntak av at man i stedet for å reagere den avbeskyttede sidekjede av 4Amf med T-butylisocyanat, reageres denne med eddiksyreanhydrid. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(D-hydroorotyl)-D-4Amf(Ac)-Leu-ILys-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det . bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være større enn 99%. LSIMS analyse viser en målt masse på 1644,7 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1644,8 Da for dette peptid.

Peptidet testes som i eksempel 1 og, i en dose på 50 iig, utviser det en suppresjon av LH sekresjon som er i alt vesentlig den samme som Acylin i løpet av 3 dager, og etter 96 timer utviser det en suppresjonen av LH som er noe større enn for Acylin.

Eksempel 6

Syntesen som generelt angitt i eksempel 1F gjentas med unntak av at N<a>Boc-D-4Amf(Fmoc) anvendes for resten i 6-stillingen i stedet for N<a>Boc-D-4Aph(Fmoc) for å danne dekapeptidet [4Amf(Hor)<5>, D-4Amf (Ac)6]-Antid. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Amf(acetyl)-Leu-Lys(isopropyl) -Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være større enn 99%. MS analyse viser en masse på 1658,7 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1658,8 Da.

Peptidet testes som i eksempel 1 og, i en dose på 50 /ig, er peptidet funnet til å være lengevirkende med hensyn til suppresjon av LH sekresjon. Virkningen er omtrent den samme som for Acylin i løpet av de første 4 dager og det utviser en biopotens som er nærmest lik den for Acylin i løpet av dagene 3 og 4 .

Eksempel 6A

Syntesen i eksempel 6 gjentas unntatt at man i stedet for å reagere den avbeskyttede sidekjede av D-4Amf med eddiksyreanhydrid reageres denne med t-butylisocyanat som i eksempel 1 for å danne peptidet [4Amf(Hor)<5>, D-4Amf (Cbm) 6]-Antid. Dekapeptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås i RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være omtrent 99%. MS analyse viser en masse på 1659,6 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1659,8 Da.

Pepetidet testes som i eksempel l og, i en dose på 50 iig, er det like aktivt som Acylin med hensyn til suppresjon av LH sekresjon etter 1 dag og nærmest like aktivt etter 2 dager. Det er noe mindre aktivt etter 3 dager og utviser omtrent den samme aktivitet som Acylin etter 4 dager.

Eksempel 6B

Syntesen i eksempel 6A gjentas méd unntak av at reaksjonen gjennomføres med metylisocyanat i stedet for t-butylisocyanat for å danne peptidet [4Amf(Hor)<5>, D-4Amf(MeCbm)<6>]-Antid. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(L-hydroorotyl)-D-4Aph(metylkarbamoyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås ved RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å være omtrent 99%. MS analyse viser en masse på 1673,6 Da, som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1673,8 Da.

Pepetidet testes i analysen som angitt i eksempel 1 og, i en dose på 50 ug, er peptidet like aktivt som Acylin i suppresjonen av LH sekresjon etter 1 dag og omtrent like aktivt etter 2 dager. Etter 3 og 4 dager fortsetter det å gi en betydelig mindre grad av suppresjon av LH sekresjon enn Acylin.

Eksempel 6C

Syntesen i eksempel 6 gjentas med idet D-hydroorotinsyre erstatter L-hydroorotinsyre for å danne peptidet [4Amf(D-Hor)<5>, D-4Amf(Ac)<6>]-Antid. Peptidet Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Amf(D-hydroorotyl)-D-4Amf(acetyl)-Leu-Lys(isopropyl)-Pro-D-Ala-NH2 oppnås ved RP-HPLC rensingen. Det bedømmes til å være i alt vesentlig homogent og dets renhet estimeres til å. være større enn 99%. MS analyse viser en masse på 1658,7 Da som er i overensstemmelse med den beregnede masse på 1658,8 Da.

Pepetidet testes som i eksempel 1 og, i en dose på 50 ztg-, er det i alt vesentlig like effektivt som Acylin etter dag 1 og 2. På dag 3 er det vesentlig mindre effektivt enn Acylin og dets biopotens fortsettes å avta signifikant deretter.

Eksempel 7

Ved anvendelse av prosedyrene som generelt er angitt i eksempler 1 til 5, fremstilles også følgende GnRH antagonistpeptider: [4Aph(Hor) 5,D-4Amf (Cbm) 6, Pro9NHCH2CH3] -Antid

[4Aph(Hor)<5>,D-4Aph(Cbm)<s>, Pro9NHCH2CH3] -Antid

[Acr-D-2Nal1,4FD-Phe2,4Aph(Hor)5] -Acylin

[Bz-D-2Nal1/ 4N02D-Phe2 , 4Aph (Hor) 5,D-4Aph (Hor) 6] -Antid [For-D-2Nal1, 40CH3D-Phe2, 4Amf (Hor) 5, D-4Aph (D-Hor) 6] -Antid [Acr-D-2Nal1,4BrD-Phe2,4Aph(Imz) 5] -Antid

[Pn-D-2Nal1,4CH3D-Phe2, 3Aph (D-Imz) 5, D-4Aph (Hor) 6] -Antid [By-D-2Nal1,3,4Cl2D-Phe2, 4Aph(Hor)5,D-4Aph(Hor)6] -Antid [Vl-D-2Nal1, 4N02D-Phe2, 4Aph (Hor) 5, D-3Aph (Cbm) 6] -Antid

[Vac-D-2Nal1, CaMe4ClD-Phe2 , 4Aph (Hor) 5, Gly10] -Acylin [Pn-D-2Nal1, 3Aph (Imz) 5,D-3Amf (D-Hor) 6-Agl10] -Antid [Acr-D-2Nalx, 4Aph (Hor) 5, Arg (Et2) 8 , D-Agl (Me)10] -Acylin [MeCbm-D-2Nal1, 4Aph(Hor) 5, Arg8-Agl (Me)10] -Acylin [Cbm-D-2Nal1, 3Amf (Imz) 5, Ala10] -Acylin

[EtCbm-D-2Nal1, 4Amf (Hor) 5, Pro9NHCH2CH3] -Acylin [Acr-D-2Nal1, 4Aph(Imz) 5,D-4Amf (Cbm) 6,Arg8] -Antid [Cbm-D-2Nal1, 4Aph (MeCbm) 5,D-4Amf (MeCbm) 6, Arg (Et2) 8] -Antid [4Ahp (Hor) 5,D-4Ahp (Imz) 6, D-Agl10] -Antid

[ Ac - D - INal1, 4 Amf (Hor)5, D - 4 Amf (D - Hor) 6, Arg8 ] -Ant id [PrCbm-D-2Nal1, 4Amf (Imz) 5, D-4Ahp (EtCbm) 6, Pro9NHCH2CH3] -Antid [4Amf (Hor) 5,D-Lys (Nie) 6, AzaGly10] -Antid

[4Amf (Hor) 5,D-Cit6,Har (Et2) 8] -<A>ntid

[4Aph(Hor) 5,D-Lys (Nie) 6, D-Agl10] -Antid

[4Aph (Hor) 5, D-Hci6, Agl (Me)10] -Antid

[4Aph(Hor) 5,D-3Pal6,Har8,Agl10] -Antid

[4Aph (Hor) 5, D-4Aph (For) 6, D-Agl (Me)10] -Antid

[4Aph(Hor) 5,D-4Aph(atz) 6,Har (Et2) 8] -Antid

[4Aph (Hor) 5, D-4Aph (iprCbm) 6, D-Agl10] -Antid

[For-D-lNal^Amf (Hor) 5, D-4Amf (atz) 6, Gly10] -Antid [4Aph(D-Hor) 5,D-4Aph(Cbm) 6, Ala10-ol] -Antid

Disse peptider er biopotente med hensyn til å inhibere sekresjon av LH.

Eksempel 8

Ved anvendelse av prosedyrér som generelt er angitt i eksempler 1 til 5 og i US patent nr. 5.491.217, fremstilles også følgende GnRH antagonistpeptider: [NaMe4Aph(Hor)5,D-4Aph(Cbm)6] -Antid

[NaMe4Aph (Hor) 5, D-4Amf (Cbm) 6] -Antid

[NaMe4Aph (Hor) 5] -Acylin

[N°Me4Aph(D-Hor)<5>]-Acylin

[D-4FPhe<2>,NaMe4Aph(Hor)<5>]-Acylin

[NaMe4Amf (Hor) 5] -Acylin

[N<a>Me4Aph(Hor<5>) , D-4Aph (Hor) 6] -Antid

[N<a>Me4Aph(Hor<5>) , D-4Aph (D-Hor) 6] -Antid

[MeCbm-D-2Nal1,NaMe4Aph(Hor) 5] -Acylin

[NaMe4Aph (Hor) 5,D-3Pal6]-Antid

[NaMe4Aph (Cbm) 5, D-4Aph (Cbm) 6] -Antid

[NaMe4Aph (MeCbm) 5, D-4Aph (MeCbm) 6] -Antid

[N<a>Me4Aph(Hor),D-4Amf(Cbm)<6>, Ala10-ol] -Antid

[NaMe4Aph(Hor) ,D-4Aph(Cbm) 6, D-Ala<10->ol]-Antid [NaMe4Aph(Hor) ,D-4Aph(Cbm) 6, Ala<10->ol]-Antid

[N<a>Me4Aph(Hor)<5>,D-Cit<6>] -Antid

[NaMe4Aph (Hor) 5,D-Lys (Nie) 6] -Antid

[NaMe4Aph (D/L-Imz) 5] -Acylin

[NaMe4Aph (L-Imz) 5] -Acylin

[NaMe4Aph(D-Imz) 5] -Acylin

[NaMe4Aph (L-Imz) 5,D-4Amf (Cbm) 6] -Acylin

[NaMe4Aph (Hor) 5, D-4Amf (MeCbm) 6] -Antid

[NaMe4Aph (Hor) 5, D-4Amf (Ac)6] -Antid

[N<a>Me4Aph(Hor)<s>, D-4Amf (Cbm) 6,D-Ala10-ol] -Antid [NaMe4Aph (D-Hor) 5, D-4Amf (Cbm) 6] -Antid

[NaMe4Aph (D-Hor) 5, D-4Amf (Ac) 6] -Antid

[NaMe4Amf (Hor) 5, D-4Amf (Ac) 6] -Antid

[NaMe4Amf (Hor) 5, D-4Amf (Cbm) 6] -Antid

[NaMe4Amf (Hor) 5, D-4Amf (MeCbm) 6] -Antid

[NaMe4Amf (D-Hor) 5, D-4Amf (Ac) 6]-Antidv

Disse peptider er biopotente med hensyn til å inhibere sekresjonen av LH og har god oppløselighet i vann ved fysiologisk pH.

De ovennevnte forbindelser som ble testet ble vist til å utvise biologisk potens med hensyn til suppresjon av LH i et omfang som i det minste generelt er sammenlignbart med det tilsvarende GnRH antagonistpeptidet kjent som Antid, som de betraktes til å være analoger av. Som et resultat av omfattende testing innen dette området i mere enn ett tiår, har bipotens bestemt ved denne alminnelig aksepterte test som måler suppresjonen av LH blitt akseptert som et bevis når det gjelder slike forbindelsers evne til å undertrykke gonado-tropinsekresjon <p>g således utvise anvendbare antigonadale anti-ovulatoriske effekter. Basert på overlegen oppløse-lighet, resistens overfor in vivo geldannelse, lang varighet av bioaktivitet og andre egenskaper, betraktes disse forbindelser til å være generelt anvendbare som antigonadal-midler for å undertrykke sekresjon av gonadotropiner og for å. inhibere frigivelse av steroider ved gonadene, f.eks. som anti-ovulasjonsmidler.

Forbindelsene i henhold til oppfinnelsen administreres ofte i form av farmasøytisk aksepterbare ikke-giftige salter slik som syreaddisjonssalter eller i form av metallkomplekser, idet acetat og pamoat, saltet av pamoinsyre, kan være foretrukket. Dersom den aktive bestanddel skal administreres i tablettform, kan tablettene inneholde et farmasøytisk aksepterbart ikke-giftig fortynningsmiddel som inkluderer et bindemiddel, slik som tragakant, maisstivelse eller gelatin, et desintegrasjonsmiddel slik som alginsyre og et smøremiddel slik som magnesiumstearat. Intravenøs administrering i iso-tonisk saltoppløsning, fosfatbufferoppløsninger og lignende kan gjennomføres.

De farmasøytiske preparater vil vanligvis inneholde en effektiv mengde av peptidet sammen med en konvensjonell farmasøy-tisk aksepterbar bærer eller fortynningsmiddel. Dosen vil vanligvis være fra omtrent 10 fig til omtrent 2,5 mg peptid pr. kg av vertens kroppsvekt ved intravenøs tilførsel. Naturen til disse forbindelser kan tillate effektiv oral administrering, men orale doser vil eventuelt være høyere. Behandling av individer med disse peptider gjennomføres generelt på samme måte som den kliniske behandling hvor det anvendes andre GnRH antagonister, ved anvendelse av en passende bærer hvori forbindelsen er oppløselig og med administrering av en dose som er tilstrekkelig til å undertrykke LH og FSH nivåer i pasienten.

Det vil også være ønskelig å avlevere GnRH analogen over forlengede tidsperioder, for eksempel over perioder på en uke til ett år fra en enkel administrering, og depot- eller implantasjonsdoseformer med sakte frigivelse kan anvendes.

Disse forbindelser kan administreres til pattedyr intra-venøst, subkutant, intramuskulært, oralt, perkutant, intra-nasalt, intrapulmonalt, intrarektalt eller intravaginalt for å oppnå fertilitetsinhibering og/eller kontroll og også ved anvendelser som krever reversibel suppresjon av gonadal aktivitet, slik som for styringen av tidlig utviklet pubertet eller under strålingsterapi eller kjemoterapi. De er også anvendbare for behandling av steroidavhengige tumorer. Effektive doser vil variere med administreringsformen og den spesielle pattedyrart som behandles. Noen av disse forbindelser har oppløseligheter helt opp til 50 mg/ml, og de kan vanligvis anvendes som 5-10 mg/ml oppløsninger ved pH 5,4. Et eksempel på en typisk doseform er en oppløsning av bakteriostatisk vann ved en pH på omtrent 6 som inneholder peptidet, denne oppløsning administreres parenteralt for å gi en dose i området fra omtrent 0,1 til 2,5 mg/kg kroppsvekt pr. døgn. Disse forbindelser betraktes til å være godt tolererbare in vivo og motstå geldannelse, følgelig betraktes de til å være særlig velegnet for administrering ved subkutan injeksjon i en oppløsning av bakteriostatisk vann av omtrent 5% mannitol ved en pH på omtrent 4,9, og ved passende konsentrasjoner over omtrent 0,75 mg/ml og til og med over omtrent 1,0 mg/ml, uten fare for geldannelse i injeksjonspunktet.

Disse GnRH antagonistpeptider kan også anvendes diagnostisk, både in vivo og in vitro. Disse peptider kan injiseres in vivo etterfulgt av testing av blodstrømmen til en pasient for å bestemme omfanget av nedgang i hormonsekresjon, f.eks. LH sekresjon. In vitro analyser kan gjennomføres for å bestemme om visse tumorceller ér følsomme overfor GnRH. I slike analyser blir tumorcellekulturer behandlet med GnRH antagonistpeptider og deretter målt med hensyn til hormonelle sekre-sjoner og celleproliferasjon.

Claims (11)

1. •1. GnRH antagonistpeptid,

   karakterisert ved at det har formelen: X-D-Nal-(A) D-Phe-D-Pal-Ser-Xaa5-Xaa6-Leu-Xaa8-Pro-Xaa10 og de farmasøytisk aksepterbare salter derav hvori:

   X er en acylgruppe med høyst 7 karbonatomer eller Q,

   hvori Q er og hvori R er H eller lavere alkyl;

   A er 4C1, 4F, 4Br, 4N02, 4CH3, 40CH3, 3,4C12 eller C<a>Me4Cl; Xaa5 er Aph(Q1) eller Amf (0^) hvori Qj er

   Xaa6 er b-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Lys(Nie), D-Cit, D-Hci eller D-Pal hvori Q2 er For, Ac, 3-amino-l,2,4-triazol, Q eller Qlf-Xaa8 er Lys(ipr), Arg, Har, Arg(Et2) eller Har(Et2); og Xa<a>10 er D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3, Gly-NH2, Ala-NH2, <Az>aGly-NH2, Agl-NH2, D-Agl-NH2, Agl(Me)-NH2 eller D-Agl(Me)-NH2, med den betingelse imidlertid at a-aminogruppen i Xaa5 eventuelt kan være metylert, og med videre den betingelse at når Xaa6 inneholder D- eller L-Hor eller D- eller L-Imz kan Xaa5 ha Ac, For eller 3-amino-l,2,4-triazol som Qlf og at når Xaa6 inneholder Q kan Xaa5 også inneholde Q.
2. 2. GnRH antagonistpeptid som angitt i krav 1, hvori X, A og Xaa8 er som definert i krav 1,

   Q er karbamoyl eller metylkarbamoyl; D-Pal er D-3Pal;

   Xaa5 er 4Aph(Q1) eller 4Amf (Qx) hvori Q ± er

   Xaa6 er D-4Aph(Q2), D-4Amf(Q2) hvori Q2 er Q eller D- eller L-Hor eller D- eller L-Imz, med den betingelse når Q2 er Q da kan Q-l også være Q, og

   Xaa10 er D-Ala-NH2, D-Ala-ol eller Ala-ol.
3. 3. GnRH antagonistpeptid som angitt i krav 1 eller 2, hvori Q-l er L-Hor eller D-Hor.
4. 4 . GnRH antagonistpeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 3, hvori X er Ac, Xaa5 er 4Aph(L- eller D-Hor), Xaa6 er D-4Aph(Ac), D-4Aph(atz) eller D-3Pal, Xaa8 er Lys(ipr) og Xa<a>10 er D-Ala-NH2.
5. 5 . GnRH antagonistpeptid som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 4, hvori Xaa5 er 4Aph(L- eller D-Hor), Q2 er Q og R er H eller metyl.
6. 6. GnRH antagonistpeptid som angitt i krav 1, hvori Xaa5 er 4Aph(L- eller D-Hor) og Xaa6 er D-Cit eller D-Hci.
7. 7. GnRH antagonistpeptid som angitt i krav 1, hvori X er For, Ac, Acr, Pn, By, VI, Vac, Bz eller Q, hvori Q er som definert i krav 1,

   A er 4C1 eller 4F; D-Pal er D-3Pal;

   Xaa5 er Aph(Qx) eller Amf (Q-J hvori Qx er en D-isomer, en L-isomer eller en D/L-isomer blanding av enten Hor eller Imz; Xaa6 er D-Aph(Q2), D-Amf(Q2), D-Cit, D-Lys(Nie) eller D-Pal, hvori Q2 er For, Ac, Q eller Q1#-

   Xaa8 er Lys(ipr), og

   Xa<a>10 er D-Ala-NH2, D-Ala-ol, Ala-ol, NHCH2CH3 eller Gly-NH2.
8. 8. GnRH antagonistpeptid som angitt i krav 7, hvori X er Ac eller Q, R er H eller metyl, Q± er L- eller D-Hor, Xaa6 er - D-4Aph(Q2), D-4Amf(Q2) eller D-3Pal hvor Q2 er Ac, Q eller Qlt og Xa<a>10 er D-Ala-NH2.
9. 9. GnRH antagonistpeptid som angitt i krav 1, som har formelen:

   Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-Xaa6-Leu-Lys(ipr)-Pro-Xaa10, hvor Xaa6 er D-4Aph(Ac), D-3Pal, D-4Aph(karbamoyl), D-4Amf(karbamoyl), D-4Amf(metylkarbamoyl) eller D-4Aph(D-Hor) og Xaa10 er D-Ala-NH2, D-Ala-ol eller Ala-ol.
10. 10. GnRH antagonistpeptid som angitt i krav 9, som har formelen:

    Ac-D-2Nal-D-4Cpa-D-3Pal-Ser-4Aph(L-Hor)-D-4Aph(karbamoyl)-Leu-Lys (ipr)-Pro-D-Ala-NH2.
11. 11. Farmasøytisk preparat for å inhibere sekresjonen av gonadotropiner i pattedyr,

    karakterisert ved at det omfatter, som en aktiv bestanddel, en effektiv mengde av en GnRH antagonist som angitt i ett eller flere av kravene 1 til 10 sammen med et ikke-giftig fortynningsmiddel.