NO324880B1 - Tuberkulose-antigener og fusjonsproteiner omfattende disse, DNA som koder for antigenene og ekspresjonsvektorer og vertsceller omfattende dette DNA, samt farmasoytiske sammensetninger og vaksiner for immunoterapi og diagnose av tuberkulose. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører generelt diagnostikk og preparater for behandling av Mycobacterium tuberculosis- mféksjon. Oppfinnelsen vedrører spesielt polypeptider som omfatter et Mycobacterium tuberculosis- antigen, eller en del eller andre varianter derav, samt DNA som koder for dette, og ekspresjonsvektorer og vertsceller omfattende dette DNA. Oppfinnelsen vedrører videre farmasøytiske sammensetninger og vaksiner og anvendelsen av slike polypeptider for diagnostisere og vaksinere mot Mycobacterium tuberculosis- infeksion. Oppfinnelsen vedrører også et diagnostisk kit.

Tuberkulose er en kronisk infeksiøs sykdom, som generelt er forårsaket av infeksjon med Mycobacterium tuberculosis. Det er en utbredt sykdom i utviklingsland, så vel som et økende problem i utviklede områder av verden, med omtrent 8 millioner nye tilfeller og 3 millioner dødsfall hvert år. Skjønt infeksjonen kan være asymptomatisk i en relativt lang tid, blir sykdommen vanligvis manifestert som en akutt inflammasjon av lunger, som resulterer i feber og en ikke produktiv hoste. Hvis den forblir ubehandlet, er resultatet alvorlige komplikasjoner og død.

Skjønt tuberkulose generelt kan bli kontrollert ved å bruke utvidet antibiotikaterapi, så er slik behandling ikke tilstrekkelig for å forhindre spredning av sykdommen. Infiserte individer kan være asymptomatiske, men smittebærere i noen tid. Selv om det er viktig å opprettholde behandlingsregime, er det vanskelig å følge opp pasienten. Noen pasienter fullfører ikke behandlingen, noe som kan føre til ineffektiv behandling og utvikling av medikamentresistens.

Inhibering av spredning av tuberkulose krever effektiv vaksinering og nøyaktig, tidlig diagnose av sykdommen. For tiden, er vaksinering med levende bakterier den mest effektive metoden for å indusere en beskyttende immunitet. Den mest vanlig mycobakterien som anvendes for dette formålet er Bacillus Calmette-Guerin (BCG), en avirulent stamme av Mycobacterium bovis. Imidlertid, er det ikke enighet om sikkerheten og effektiviteten av BCG, og i noen land, slik som USA, vaksineres ikke befolkningen. Diagnose stilles vanligvis ved å bruke en hudtest, som involverer intradermal eksponering for tuberkulin PPD (proteinrenset derivat). Antigen-spesifikke T-celle responser resulterer i målbar hevelse på injeksjonsstedet 48-72 timer etter injeksjon, noe som indikerer eksponering for mycobakterie-antigenet. Sensitivitet og spesifisitet har imidlertid vært et problem med denne testen, og individer vaksinert med BCG kan ikke skjelnes fra infiserte individer.

Mens makrofager har blitt vist å virke som prinsipielle effektorer for M. tuberculosis-immunitet, er T-celler fortrinnsvis indusere av slik immunitet. Den essensielle rollen til T-celler i beskyttelse mot M. tuberculosis- mféksjon blir illustrert ved hyppig forekomst av M. tuberculosis hos AIDS pasienter, som skyldes nedgang i CD4 T-celler assosiert med human immunsviktvirus (HlV)-infeksjon. Mykobakterium-reaktive CD4 T-celler har blitt vist å være potente produsenter av gamma-interferon (IFN-y) som igjen har vist seg å trigge antimykobakterielle effekter i makrofager hos mus. Mens rollen til IFN-y i mennesker ér mindre klar, har studier vist at 1,25-hydroksy-vitamin D3, enten alene eller i kombinasjon med IFN-y eller tumornekrosefaktor-alfa aktiverer humane makrofager for å inhibere M. tuberculosis- inféksjon. Videre er det kjent at IFN-y stimulerer humane makrofager til å fremstille 1,25-dihydroksy-vitamin D3. På samme måte har IL-12 blitt vist å spille en rolle ved å stimulere resistens mot M. tuberculosis-infeksjon. For en oversikt over immunologien til M. tuberculosis- inféksjon se Chan og Kaufmann i Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (ed.), ASM Press Washington, DC, 1994.

WO9709428 beskriver polypeptider som omfatter immunogene deler av M. tuberculosis og spesielle beslektede nukleotider er angitt i databasen EMBL Empro med aksesjonsnummer Z95557. Denne kjente teknikk beskriver ikke polypeptidene og DNA ifølge foreliggende oppfinnelse.

Følgelig, er det behov innen fagfeltet for forbedrede vaksiner og metoder for å forhindre, behandle og detektere tuberkulose. Den foreliggende oppfinnelsen oppfyller disse behovene og tilveiebringer ytterligere andre relaterte fordeler.

Foreliggende oppfinnelse angår således et isolert polypeptid kjennetegnet ved at det omfatter: (i) en immunogen del av M. tuberculosis- antigeaet som beskrevet i SEQ DD NO: 109, eller (ii) en variant av M. tuberculosis- antigen som beskrevet i SEQ ID NO: 109 med samme biologiske virkning.

I en foretrukken utførelsesform i følge oppfinnelsen omfatter det isolerte polypeptid et M. tuberculosis- antigen beskrevet i SEQ ID NO: 109, eller en variant av Af. tuberculosis- zntigent beskrevet i SEQ ID NO: 109 med samme biologiske virkning.

I en annen foretrukken utførelsesform i følge oppfinnelsen omfatter det isolerte polypeptid en aminosyresekvens som beskrevet i SEQ ID NO. l 19 eller SEQ ID

NO: 120. Det isolerte polypeptid ifølge oppfinnelsen kan også bestå av en aminosyresekvens som beskrevet i SEQ ID NO:l 19 eller SEQ ID NO:120.

Foreliggende oppfinnelse angår videre et fusjonsprotein kjennetegnet ved at det omfatter minst to polypeptider ifølge oppfinnelsen, eller et polypeptid ifølge oppfinnelsen og et kjent M. tuberculosis- mtigen.

Foreliggende oppfinnelse angår videre et DNA-molekyl, kjennetegnet ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid eller et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen. I en foretrukken utførelsesform omfatter DNA en nukleotidsekvensen beskrevet i SEQ ID NO: 108.

Foreliggende oppfinnelse angår videre en ekspresjonsvektor, kjennetegnet ved at den omfatter et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen. Videre angår oppfinnelsen en isolert vertcelle transformert med nevnte ekspresjonsvektor.

Innenfor et annet aspekt, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse farmasøytiske sammensetninger som omfatter minst ett polypeptid eller fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen og en fysiologisk akseptabel bærer, eller minst ett DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen og en fysiologisk akseptabel bærer.

Oppfinnelsen tilveiebringer også vaksiner som omfatter minst ett polypeptid eller et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen og en ikke-spesifikk immunresponsforsterker. Vaksinen kan også omfatte minst ett DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen og en ikke-spesifikk immunresponsforsterker.

Et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen angår anvendelse av et polypeptid, et fusjonsprotein eller et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen for fremstilling av et preparat for induksjon av beskyttende immunitet i en pasient. Oppfinnelsen angår også anvendelse av en farmasøytisk sammensetning ifølge oppfinnelsen, for fremstilling av en vaksine for induksjon av beskyttende immunitet i en pasient

Et ytterligere aspekt ifølge oppfinnelsen angår et diagnostisk kit for deteksjon av tuberkulose, kjennetegnet ved at det omfatter: (a) et polypeptid eller fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen; og (b) apparat som er tilstrekkelig for å bringe nevnte polypeptid i kontakt med dermale celler fra en pasient.

Disse og andre aspekter ifølge foreliggende oppfinnelse vil være tydelig ved referanse til følgende detaljerte beskrivelse og medfølgende tegninger. Alle referansene beskrevet heri er herved inkorporert ved referanse i deres helhet som om hver var inkorporert individuelt.

Kort beskrivelse av tegningene

Figurene IA og IB illustrerer stimulering av hhv proliferering og interferon-y produksjon i T-celler avledet fra en første PPD-positiv donor (referert til som D7) ved rekombinant ORF-2 og syntetiske peptider til ORF-2. Figurene 2A og 2B illustrerer stimulering av hhv proliferering og interferon-y produksjon, i T-celler avledet fra en annen PPD-positiv donor (referert til som Dl60) ved rekombinant ORF-2 og syntetiske peptider til ORF-2.

Som beskrevet over, er foreliggende oppfinnelse generelt rettet mot sammensetninger og metoder for å forebygge, behandle og diagnostisere tuberkulose. Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse inkluderer polypeptider som innbefatter minst en immunogen del av et M. tuberculosis- antigen, eller en variant av et slikt antigen som er forskjellig bare i konservative substitusjoner og/eller modifikasjoner. Som brukt heri, omfatter termen "polypeptid" aminosyrekjeder av en hver lengde, inklusiv fullengdeproteiner (dvs. antigener) hvor i aminosyreresidiene er koblet ved kovalente peptidbindinger. Derfor, kan et polypeptid som omfatter en immunogen del av en de ovenfor nevnte antigener består fullstendig av den immunogene delen, eller kan inneholde ytterligere sekvenser. Ytterligere sekvenser kan bli avledet fra det native M. tuberculosis- antigenet eller kan være heterolog, og slike sekvenser kan, (men behøver ikke) å være immunogene.

"Immunogen" som referert heri, refererer seg til evnen til å indusere en immunrespons (f.eks. cellulær) i en pasient, slik som et menneske og/eller en biologisk prøve. Spesielt er antigener som er immunogene (og immunogene deler eller andre varianter av slike antigener) i stand til å stimulere celleproliferering, interleukin-12- produksjon og/eller interferon-y- produksjon i biologiske prøver som omfatter en eller flere celler selektert fra gruppen av T-celler, NK-celler, B-celler og makrofager, hvor cellene er avledet fra et M. tuberculosis- immxmt individ. Polypeptidene omfatter minst en immunogen del av en eller flere M. tuberculosis- antigener og kan generelt bli brukt for å detektere tuberkulose eller å indusere beskyttende immunitet mot tuberkulose i en pasient.

Sammensetningen ifølge oppfinnelsen omfatter også varianter av de ovenfor nevnte polypeptidet. En polypeptid "variant" som brukt heri, er et polypeptid som er forskjellig fra det viste polypeptidet bare i konservative substitusjoner og/eller modifikasjoner, slik som den terapeutiske, antigene og/eller immunogene egenskapen til polypeptidet blir bibehold. Polypeptidvariantene utviser fortrinnsvis minst omtrent 70%, mer fortrinnsvis minst omtrent 90% og mest å foretrekke minst omtrent 95% identitet til de identifiserte polypeptidene. For polypeptider med immunoreaktive egenskaper, kan varianter, alternativt, bli identifisert ved å modifisere aminosyresekvensen til en av de ovenfor nevnte polypeptider, og evaluere immunoreaktiviteten til det modifiserte polypeptidet. For polypeptider som er nyttige for dannelse av diagnostiske bindingsmidler, kan en variant bli identifisert ved å evaluere et modifisert polypeptid for deres evne til å danne antistoff som detekterer tilstedeværelsen eller fravær av tuberkulose. Alternativt, antigenene ifølge oppfinnelsen kan være nyttige for anvendelse i diagnostiske metoder ifølge oppfinnelsen og kan bli identifisert ved evaluering av modifiserte polypeptider for deres evne til å detektere antistoff tilstede i sera fra tuberkuloseinfiserte pasienter. Slike modifiserte sekvenser kan bli fremstilt og testet ved å bruke f.eks., representative prosedyrer beskrevet heri.

En "konservativ" substitusjon, er en substitusjon der en aminosyre er substituert for en aminosyre som har lignende egenskaper, slik at en som kjenner fagfeltet peptidkjemi ville forvente at sekundærstrukturen og den hydropatiske egenskapen til polypeptidet i det vesentlige er uforandret. Generelt, representerer følgende grupper av aminosyrer konservative endringer: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr;

(3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; og (5) phe, tyr, trp, his.

Varianter kan også (eller alternativt) bli modifisert ved, f.eks., delesjon eller addisjon av aminosyrer som har minimal influens på de immunogene egenskapene, sekundærstruktur og hydropatisk egenskap hos polypeptidet. F.eks., et polypeptid kan være konjugert til en signal (eller leder)-sekvens i den N-terminale enden av proteinet som co-translasjonelt eller post-translasjonelt dirigerer overføring av proteinet. Polypeptidet kan også være konjugert til en linker eller annen sekvens for å lette syntese, rensing eller identifisering av polypeptidet (f.eks. poly-His), eller for å øke binding av polypeptidet til et fast støttemateriale. F.eks., kan et polypeptid bli konjugert til en immunoglobulin Fc-region.

Generelt kan M. tuberculosis- mtigene og DNA-sekvensene som koder for slike antigener, bli fremstilt ved å bruke en hvilken som helst av forskjellige prosedyrer. F.eks., kan genomiske eller cDNA ibliotek avledet fraM. tuberculosis- b\ i screenet direkte ved å bruke perifere blodmononukleære celler (PBMC) eller T-cellerlinjer eller kloner avledet fra en eller flere M. tuberculosis- imname individer. Direkte bibliotekscreeninger kan generelt bli utformet ved å analysere puljer av uttrykte rekombinante proteiner for déres evne til å indusere proliferering og/eller interferon-y produksjon i T-celler avledet fra et M. tuberculosis- immxmt individ. Potensielle T-celleantigener kan første bli selektert basert på antistoffreaktivitet, som beskrevet over.

Alternativt kan DNA-sekvenser som koder for antigener bli identifisert ved å screene en egnet M. tuberculosis- genomisk eller cDNA ekspresjonsbibliotek med sera ervervet fra pasienter infisert med M. tuberculosis. Slike screeninger kan generelt bli utført ved å bruke teknikker som er velkjent innen fagfeltet, slik som de som er beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989.

Rensede antigener ble deretter evaluert for deres evne til å indusere en egnet immunrespons (f.eks. cellulær) ved å bruke, f.eks., representative metoder beskrevet heri. Immunogene antigener kan deretter partielt sekvenseres ved å bruke teknikker slik som tradisjonell Edman kjemi. Se Edman og Berg, Eur. J. Biochem, 80:116-132,1967. Immunogene antigener kan også bli produsert rekombinant ved å bruke en DNA-sekvens som koder for antigenet, som har blitt satt inn i en ekspresjonsvektor og uttrykkes i en egnet vert.

DNA-sekvensene som koder for antigenene ifølge oppfinnelsen kan også erverves ved å screene et egnet M. tuberculosis cDNA eller genomisk DNA-bibliotek for DNA-sekvenser som hybridiserer til degenererte oligonukleotider avledet fra partielle aminosyresekvenser fra isolerte antigener. Degenererte oligunkleotidsekvenser for anvendelse i en slik screening kan bli designet og syntetisert, og screeninger kan bli utført, som beskrevet (f.eks.) i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (og referanse som er sitert deri). Polymerasekjedereaksjon (PCR) kan også anvendes, ved å bruke ovenfor nevnte oligonukleotider i metoder velkjent innen fagfeltet, for å isolere en nukleinsyreprobe fra et cDNA eller genomisk bibliotek. Bibliotekscreeningen kan deretter utføres ved å bruke den isolerte proben.

Uansett metoden for fremstilling, har antigenene (og immunogene deler derav) som beskrevet heri evne til å indusere immunogen respons. Mer spesifikt, har antigenene evne til å indusere proliferering og/eller cytokinproduksjon (dvs. interferon-y- og/eller interleukin-12-produksjon) i T-celler, NK-celler, B-celler og/eller makrofager avledet fra en M. tuberculosisAmmunt individ. Seleksjonen av celletype for anvendelse ved evaluering av immunogen respons mot et antigen vil selvfølgelig avhenge av den ønskede responsen. F.eks, er interleukin-12-produksjon lettest å evaluere ved å bruke preparater som inneholder B-celler og/eller makrofager. Et M. tuberculosis- immwnt individ er å betraktes som en som er resistent mot utviklingen av tuberkulose i kraft av å ha fått en effektiv T-celle respons mot M. tuberculosis (dvs, vesentlig fri for sykdomssymptomer). Slike individer kan bli identifisert basert på en sterk positiv (dvs. større enn 10 mm diameter hevelse) intradermal hudtestrespons mot tuberkuloseproteiner (PPD) og et fravær av et hvert tegn eller symptomer på tuberkulosesykdom. T-celler, NK-celler, B-celler og makrofager avledet fra M. tuberculosis- immane individer kan bli fremstilt ved å bruke metoder kjent innen fagfeltet. F.eks. kan et preparat av PBMC (dvs. perifere blodmononukleære celler) anvendes uten ytterligere separasjon av komponentceller. PBMC kan generelt bli fremstilt ved f.eks. å bruke tetthetssentrifugering gjennom Ficoll (Winthrop Laboratories, NY).

T cellene for anvendelse i analysene beskrevet heri kan også bli renset direkte fra PBMC. Alternativt, kan en anriket T cellelinje reaktive mot mykobakterielle proteiner, eller T cellekloner reaktive mot individuelle mykobakterielle proteiner anvendes. Slike T cellekloner kan bli dannet ved, f.eks., å dyrke PBMC fraM tuberculosis- iromxme individer med mykobakterielle proteiner i en tidsperiode på 2-4 uker. Dette tillater ekspansjon av bare mykobakterieproteinspesifikke T-celler, som resulterer i en linje bestående bare av slike celler. Disse cellene kan deretter bli klonet og testet med individuelle proteiner, ved å bruke metoder kjent for de som kjenner fagfeltet, til mer nøyaktig å bestemme individuell T cellespesifisitet. Generelt betraktes antigener som testet positive i analyser for proliferering og/eller cytokinproduksjon (dvs. interferon-y og/eller interleukin-12 produksjon) ved å bruke T-celler, NK-celler, B-celler og/eller makrofager avledet fra en M. tuberculosis- individ å være immunogene. Slike analyser kan bli utført, f.eks., ved å bruke representative prosedyrer beskrevet under. Immunogene deler av slike antigener kan bli identifisert ved å bruke lignende analyser, og kan være tilstede i polypeptidene beskrevet heri.

Evnen et polypeptid (f.eks. et immunogent antigen, eller en del eller andre varianter derav) har til å indusere celleproliferering er evaluert ved å bringe cellene i kontakt

(f.eks. T-celler og/eller NK-celler) med polypeptidet og måle prolifereringen av cellene. Generelt, er mengden av polypeptidet tilstrekkelig for å evaluere omtrent IO<5> celler varierende fra omtrent 10 ng/ml til omtrent 100 ug/ml og fortrinnsvis omtrent 10 ug/ml. Inkuberingen av polypeptidet med celler blir utført ved 37°C i omtrent 6 dager. Etter inkubering med polypeptid, blir cellene analysert for en proliferativ respons, som kan evalueres ved metoder kjent innen fagfeltet, slik som å eksponere celler for en puls av radiomerket tymidin og måling av inkorporeringen av merking i cellulært DNA. Generelt, er et polypeptid som resulterer i minst en tre gangers økning i proliferering i forhold til bakgrunnen (dvs. proliferering observert for celler dyrket uten polypeptid) betraktet å være i stand til å indusere proliferering.

Evnen et polypeptid har til å stimulere produksjon av interferon-y og/eller interleukin-12 i celler kan bli evaluert ved å bringe cellene i kontakt med polypeptidet og å måle nivået av interferon-y eller interleukin-12 produsert av cellene. Generelt er mengden av polypeptid tilstrekkelig for evaluering av omtrent IO<3> celler varierende fra omtrent 10 ng/ml til omtrent 100 ug/ml og er fortrinnsvis 10 ug/ml. Polypeptidet kan, men behøver ikke, å være immobilisert på et fast støttemateriale, slik som en kule, eller en biodegraderbar mikrosfære, slik som de som er beskrevet i US patent nr. 4,897,268 og 5,075,109. Inkuberingen av polypeptidet med cellene blir utført ved 37°C i omtrent seks dager. Etter inkubering med polypeptid, blir cellene analysert for interferon-y og/eller interleukin-12 (eller en eller flere subenheter derav), som kan bli evaluert ved metoder kjent innen fagfeltet, slik som en enzymkoblet immunosorbentanalyse (ELISA), eller i tilfellet av IL-12-P70-heterodimeren, en bioanalyse slik som en analyse som måler proliferering av T -eller. Generelt, er et polypeptid som resulterer i produksjon av minst 50 pg av interferon-y per ml av dyrket supernatant (som inneholder IO<4->IO<5> T-celler per ml) betraktet å være i stand til å stimulere produksjonen av interferon-y. Et polypeptid som stimulerer produksjonen av minst 10 pg/mg av IL-12-P70-subenheten, og/eller minst 100 pg/ml av IL-12-P40-subenheten per IO<5> makrofager eller B-celler (eller per 3 x IO<5> PBMC) betraktet å være i stand til å stimulere produksjonen av IL-12.

Generelt, er immunogene antigener som stimulerer proliferering og/eller cykokinproduksjon (dvs. interferon-y og/eller interleukin-12 produksjon) i T-celler, NK-celler, B-celler og/eller makrofager avledet fra minst omtrent 25% av M. tuberculosis-immune individer. Blant disse immunogene antigener, har polypeptidene overlegne terapeutiske egenskaper som kan skilles fra hverandre basert på økningen av responsene i de ovenfor nevnte analysene, og basert på prosentandelen av individer hvor det observeres en respons. I tillegg, vil antigener som har overlegne egenskaper ikke stimulere proliferering og/eller cytokinproduksjon in vitro i celler avledet fra mer enn omtrent 25% av individene som ikke er M. tuberculosis- immuae, for derved å eliminere responsene som ikke er spesifikke med hensyn på M. tuberculosis- responsive celler. De antigenene som induserer en respons i en stor prosentandel av T cellen, NK cellen og B cellen og/eller makrofagfremstillingene fra M. tuberculosis- imncnme individer (med en lav insidens av responser i cellefremstillingene fra andre individer) har overlegne terapeutiske egenskaper.

Antigener med overlegne terapeutiske egenskaper kan også bli identifisert basert på deres evne til å redusere alvorlighetsgraden av M. tuberculosis- mféks\ on hos forsøksdyr, når disse blir administrert som en vaksine. Egnede vaksinefremstillinger for anvendelser på forsøksdyr er beskrevet i detalj under. Effektiviteten kan bli bestemt basert på evnen antigenet har til å tilveiebringe minst omkring 50% reduksjon i bakterieantallet og/eller minst omtrent 40% nedgang i mortalitet som følge av eksperimentell infeksjon. Egnede forsøksdyr inkluderer mus, marsvin og primater.

Antigener som har overlegne diagnostiske egenskaper kan generelt bli identifisert basert på evnen til å indusere en respons i en intradermal hudtest utført på et individ med aktiv tuberkulose, men ikke en test utført på et individ som ikke er infisert med M. tuberculosis. Hudtestene kan generelt bli utført som beskrevet under, der en respons på minst 5 mm hevelse betraktes som positiv.

Immunogene egenskaper til antigenene beskrevet heri kan bli fremstilt og identifisert ved å bruke velkjente teknikker, slik som de som er sammenfattet i Paul, Fundamental Immunology, 3d. ed., Raven Press, 1993, sidene 243-247 og referanser sitert deri. Slike teknikker inkluderer screening av polypeptiddeler av det native antigenet for immunogene egenskaper. Representativ proliferering og cytokinproduksjonsanalyser beskrevet heri kan generelt anvendes i disse screeningene. En immunogen del av polypeptid er en del som ved slike representative analyser, danner en immunrespons (f.eks. proliferering, interferon-y produksjon og/eller interleukin-12 produksjon) som i det vesentlige er lik den som dannes ved fullengde antigenet. Med andre ord kan en immunogen del av et antigen frembringe minst omtrent 20%, fortrinnsvis omtrent 100% av prolifereringen indusert ved fullengdeantigenet i modellprolifereringsanalysen beskrevet heri. En immunogen del kan også, eller alternativt, stimulere produksjonen av minst omtrent 20%, og fortrinnsvis omtrent 100% av interferon-y og/eller interleukin-12 indusert ved fullengde antigenet i modellanalysen beskrevet heri.

Deler og andre varianter av M. tuberculosis- antigener kan bli dannet ved syntetiske eller rekombinante metoder. Syntetiske polypeptider som har færre enn omtrent 100 aminosyrer, og generelt færre enn omtrent 50 aminosyrer, kan bli dannet ved å bruke teknikker som er velkjent innen fagfeltet. F.eks., kan slike polypeptider bli syntetisert ved å bruke en hver av de kommersielt tilgjengelig fastfaseteknikker, slik som Merrifield fastfasesyntesemetoden, hvor aminosyrene sekvensielt blir tilsatt en voksende aminosyrekjede. Se Merrifield, J. Am. Chem. Soc. «55:2149-2146,1963. Utstyr for automatisert syntese av polypeptider er kommersielt tilgjengelig fra slike som Perkin Eimer/Applied BioSystems Division, Foster, City, CA, og kan det betjenes ifølge forhandlerens instruksjoner. Varianter av et nativt antigen kan generelt bli fremstilt ved å bruke standard mutageneseteknikker slik som oligonukleotidrettet setespesifikk mutagenese. Seksjoner av DNA-sekvensen kan også fjernes ved å bruke standardteknikker som gir en fremstilling av forkortede polypeptider.

Rekombinante polypeptider som inneholder deler og/eller varianter av et nativt antigen kan lett bli fremstilt fra en DNA-sekvens som koder for polypeptidet ved å bruke forskjellige teknikker velkjent innen fagfeltet. F.eks., kan supernatanter fra egnede vert/vektorsystemer som utskiller rekombinant protein i kulturmediet først bli konsentrert ved å bruke kommersielt tilgjengelig filter. Etter konsentrasjonen, kan konsentratet anvendes på en egnet rensningsmatriks slik som en affinitetsmatriks eller en ionebytteresin. Til slutt, kan en eller flere reversfase HPLC trinn anvendes for ytterligere å rense et rekombinant protein.

Enhver av de forskjellige ekspresjonsvektorene som er kjent innen fagfeltet kan anvendes for å uttrykke rekombinante polypeptider ifølge oppfinnelsen. Ekspresjon kan oppnås ved en hver egnet vertscelle som har blitt transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor som inneholder DNA-molekylet som koder for et rekombinant polypeptid. Egnede vertsceller inkluderer prokaryoter, gjær og høyere eukaryotiske celler. Fortrinnsvis, er vertcellene som anvendes E. coli, gjær eller mammalske cellelinjer slik som COS eller CHO. DNA-sekvensene som uttrykkes på denne måten kan kode for naturlig forekommene antigener, deler av naturlig forekommene antigener eller andre varianter derav.

Generelt, uten hensyn til metode for fremstilling, er popylpeptidene som beskrevet heri i vesentlig ren form. Fortrinnsvis, er polypeptidene minst omtrent 80% rene, mer å foretrekke omtrent 90% rene og mest foretrekkbart minst omtrent 99% rene. I visse foretrukne utførelsesformer som er beskrevet i detalj under, er vesentlig rene polypeptider inkorporert i farmasøytiske sammensetninger eller vaksiner for anvendelse i en eller flere av metodene som er beskrevet heri.

I en utførelsesform, beskriver foreliggende oppfinnelse polypeptider som en immunogen del av M. tuberculosis- antigenet som beskrevet i SEQ ID NO: 109, eller en variant av M. tuberculosis- zntigen som beskrevet i SEQ ID NO: 109 med samme biologiske virkning og DNA-molekyler som koder for slike polypeptider.

M. tuberculosis- sntigener tilveiebrakt heri inkluderer varianter som er kodet for av

DNA-sekvenser som er vesentlig homologe med en eller flere av DNA-sekvensene som er spesifikt beskrevet heri. "Vesentlig homolog", som brukt heri, refererer seg til DNA-sekvenser som er i stand til å hybridisere under moderate stringente betingelser. Egnede moderate stringente betingelser inkluderer en forvask i en løsning av 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hybridisering ved 50°C-65°C, 5X SSC, over natt, eller i tilfeller av kryssartshomologi ved 45°C, 0,5X SSC; etterfulgt av to vaskinger ved 65°C i 20 minutter med hver av 2X, 0,5X og 0,2X SSC som inneholder 0,1 % SDS). Slike hybridiserende DNA-sekvenser er også innenfor området av denne forbindelsen, det er også nukleotidsekvenser som, på grunn av kodedegenerering, koder for et immunogent polypeptid som blir kodet for av en hybridiserende DNA-sekvens.

I et beslektet aspekt tilveiebringer den foreliggende oppfinnelsen fusjonsproteiner som omfatter minst to polypeptider ifølge oppfinnelsen. I en foretrukken utførelsesform omfatter fusjonsproteinet et polypeptid ifølge oppfinnelsen og et kjent M. tuberculosis-antigen, slik som 38 kD antigen beskrevet i Andersen og Hansen, Infect. Immun. 57:2481-2488,1989. (GenBank Accession nr. M30046), eller ESAT-6 tidligere identifisert i M. bovis (Accession nr. U34848) og i M. tuberculosis (Sorensen et al., Infec. Immun. 63:1710-1717, 1995). Varianter av slike fusjonsproteiner er også tilveiebrakt. Fusjonsproteinene ifølge foreliggende oppfinnelse kan inkludere linkerpeptid mellom første og andre polypeptid.

En DNA-sekvens som koder for et fusjonsprotein ifølge foreliggende oppfinnelse er konstruert ved å bruke kjente rekombinante DNA-teknikker for å samle separate DNA-sekvenser som koder for første og andre polypeptid i en egnet ekspresjonsvektor. 3' enden av en DNA-sekvens som koder for første polypeptid blir ligert, med eller uten en peptidlinke, til den 5' enden av en DNA-sekvens som koder for det andre polypeptidet slik at leserammene til sekvensene er i fase for å tillate mRNA translasjon av de to DNA-sekvensene til et enkelt fusjonsprotein som bibeholder biologisk aktivitet av både

det første og det andre polypeptidet.

En peptidlinkersekvens kan anvendes for å separere første og andre polypeptid med en distanse som er tilstrekkelig for å forsikre at hvert polypeptid holdes til dets sekundære og tertiære strukturer. En slik peptidlinkersekvens er inkorporert i fusjonsproteinet ved å bruke standardteknikker som er velkjent innenfor fagfeltet. Egnede peptidlinkersekvenser kan bli valgt basert på følgende faktorer: (1) deres evne til å adoptere en fleksibel utvidet konformasjon; (2) deres evne til ikke å adoptere en sekundær struktur som kan interagere med funksjonelle eptioper på det første og andre polypeptidet; og (3) mangel på hydrofobiske eller ladede residier som kan reagere med polypeptidets funksjonelle epitope. Foretrukne peptidlinkersekvenser inneholder Gly, Asn og Ser residier. Andre nesten nøytrale aminosyrer, slik som Thr og Ala kan også bli brukt i linkersekvensen. Aminosyresekvensene som kan være nyttige å anvende som linkere inkluderer de som er beskrevet i Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 55:8258-8262,1986; U.S. patent nr. 4,935,233 og US patent nr. 4,751,180. Linkersekvensen kan være fra 1 til omtrent 50 aminosyre i lengde, peptidsekvensene er ikke påkrevet når første og andre polypeptid har ikke essensielle N-terminale aminosyreregioner som kan bli brukt for å separerer funksjonelle domener og hindre sterisk interferens.

Ligerte DNA-sekvenser er operativt koblet til egnede transkripsjons- eller translasjonsregulatoriske elementer. Regulatoriske elementer som er ansvarlig for ekspresjon av DNA er lokalisert bare 5' i forhold til DNA-sekvensen som koder for det første polypeptidet. På samme måte er stoppkodon nødvendig for å avslutte translasjonen og translasjonstermineringssignalene bare tilstede 3' i forhold til DNA-sekvensen som koder for det andre polypeptidet.

Polypeptider eller fusjonsproteiner (eller DNA-molekyler som koder for slike polypeptider) kan anvendes for å indusere beskyttende immunitet mot tuberkulose i en

pasient. Som brukt heri, en "pasient" referer seg til et hvert varmblodsdyr, fortrinnsvis et menneske. En pasient kan rammes av en sykdom, eller kan være helt fri for detekterbar sykdom og/eller infeksjon. Med andre ord, beskyttende immunitet kan bli indusert for å hindre eller behandle tuberkulose.

I dette aspektet er polypeptidet, fusjonsproteinet eller DNA-molekylet generelt, til stede i en farmasøytisk sammensetning og/eller en vaksine. Farmasøytiske sammensetninger kan omfatte en eller flere polypeptider, som hver og en kan inneholde en eller flere av de ovenfor nevnte sekvensene (eller varianter derav), og en fysiologisk akseptabel bærer. Vaksinene kan omfatte en eller flere av de ovenfor nevnte polypeptider og en ikke-spesifikk immunresponsforsterker, slik som en adjuvans eller et liposom (hvor i polypeptidet er inkorporert). Slike farmasøytiske sammensetninger og vaksiner kan også inneholde andre M. tuberculosis- mXxg& ast, enten inkorporert i et kombinasjonspolypeptid eller tilstede i et separat polypeptid.

Alternativt, kan en vaksine inneholde DNA som koder for en eller flere polypeptider som beskrevet over, slik at polypeptidet blir dannet in situ. I slike vaksiner kan DNA være tilstede innen en hver av forskjellige avleveringssystemer som er kjent innen fagfeltet, inklusive nukleinsyreekspresjonssystemer, bakterielle og virale ekspresjonssystemer. Egnede nukleinsyreekspresjonssystemer inneholder nødvendige DNA-sekvenser for ekspresjon i pasienten (slik som egnet promotor og termineringssignal). Bakterielle avleveringssystemer involverer administrering av en bakterie (slik som Bacillus- Calmette- Guerrin) som uttrykker en immunogen del av polypeptidet på dets celleoverflate. I en foretrukket utførelsesform, kan DNA bli introdusert ved å bruke et viralt ekspresjonssystem (f.eks. vaksinia eller andre koppevirus, retrovirus, eller adenovirus), som kan involvere anvendelse av ikke patogene (defekte), replikasjonskompetente virus. Teknikker for å inkorporerer DNA i slike ekspresjonssystemer er velkjent innen fagfeltet. DNA kan også være "nakent", som beskrevet, f.eks. i Ulmer et al., Science 259:1745-1749,1993 og gjennomgått av Cohen, Science 259:1691-1692,1993. Opptak av nakent DNA kan økes ved å belegge DNA på biodegraderbare kuler, som blir effektivt transportert inn i cellene.

I et relatert aspekt, kan en DNA-vaksine som beskrevet over bli administrert samtidig med eller sekvensielt i forhold til enten et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelsen eller et kjent M. tuberculosis- antigen, slik som 38 kD antigen beskrevet over. F.eks., kan administrering av DNA som koder for et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, enten "nakent" eller i et avleveringssystem som beskrevet over, bli etterfulgt av administrering av et antigen for å øke den beskyttende immuneffekten til vaksinen.

Måter og frekvens for å administrere, så vel som dosering, vil variere fra individ til individ og kan være like de som for tiden anvendes ved immunisering ved bruk av BCG. Generelt, kan de farmasøytiske sammensetninger og vaksiner bli administrert ved injeksjon (f.eks. intrakutant, intramuskulært, intravenøst eller subkutant), intranasalt (f.eks. ved aspirering), eller oralt. Mellom 1 og 3 doser kan bli administrert i 1-36 ukers periode. Fortrinnsvis, blir 3 doser administrert, med intervaller på 3-6 måneder, og booster vaksinasjoner kan bli gitt periodisk deretter. Alternative protokoller kan anvendes for individuelle pasienter. En egnet dose er en mengde av polypeptid eller DNA som, når den bli administrert som beskrevet over, er i stand til å indusere en immunrespons i en immunisert pasient tilstrekkelig til å beskytte pasienten fra M. tuberculosis- mfeksjon i minst 1-2 år. Generelt varierer mengden av polypeptid tilstede i en dose (eller produsert in situ ved DNA i en dose) fra 1 pg til omtrent 100 mg per kilo vert, typisk fra omtrent 10 pg til omtrent 1 mg, og fortrinnsvis fra omkring 100 pg til omtrent 1 ug. Egnet dosestørrelse ville variere med størrelsen på pasienten, men vil typisk være i området fra 0,1 ml til omtrent 5 ml.

Mens en hver egnet bærer kjent innen fagfeltet kan anvendes i de farmasøytiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen, vil type av bærer variere avhengig av administrasjonsmåten. For parenteral administrering, slik som subkutan injeksjon, omfatter bæreren fortrinnsvis vann, saltvann, alkohol, lipider, en voks eller en buffer. For oral administrering, kan det benyttes en hver av de ovenfor nevnte bærere eller en fast bærer, slik som mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talkum, cellulose, glukose, sukrose og magnesiumkarbonat. Biodegraderbare mikrosfærer (f.eks. polylaktisk galaktid) kan også anvendes som bærere for farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen. Egnede biodegraderbare mikrosfærer er beskrevet, f.eks. i US patent nr. 4,897,268 og 5,075,109.

En hver av forskjellige adjuvanser kan anvendes i vaksinene ifølge oppfinnelsen for uspesifikt å forsterke immunresponsen. De fleste adjuvanser inneholder en substans som er laget for å beskytte antigene fra rask katabolisme, slik som alumimumhydroksid eller mineralolje, og en uspesifikk stimulator for immunresponser, slik som lipid A, Bortadella pertussis eller Mycobacterium tuberculosis. Egnede adjuvanser er kommersielt tilgjengelig som, f.eks., Freund's ufullstendige adjuvans og Freund's fullstendige adjuvans (Difco Laboratories) og Merck adjuvans 65 (Merck and Company, Inc., Rahway, NJ). Andre egnede adjuvanser inkluderer alum, biodegraderbar mikrosfære, monofosforyl lipid A og quil A.

I et annet aspekt av denne oppfinnelsen tilveiebringes metoder for anvendelse av en eller flere av polypeptidene beskrevet over for å diagnostisere tuberkulose ved å bruke en nudtest. Som brukt heri, er en "hudtest" en hver analyse utført direkte på en pasient hvor i en forsinket type hypersensitivitet (DTH) reaksjon (slik som hevelse, rødfarging eller dermatitt) ble målt etter intradermal injeksjon av en eller flere polypeptider som beskrevet over. Slik injeksjon kan oppnås ved å bruke en hver egnet tilretning som er tilstrekkelig til å bringe polypeptidet eller polypeptidene i kontakt med dermale celler hos pasienten, slik som en tuberkulinsprøyte eller en 1 ml sprøyte. Fortrinnsvis blir reaksjonen målt minst 48 timer etter injeksjonen, mer fortrinnsvis 48-72 timer.

DTH reaksjonen er en cellemediert immunrespons, som er større i pasienter som tidligere har blitt eksponert for testantigenet (dvs. den immunogene delen av polypeptidet, eller en variant derav). Responsen kan bli målt visuelt, ved å bruke en linjal. Generelt, er en respons som er større enn omtrent 0,5 cm i diameter, fortrinnsvis større enn omkring 1,0 cm i diameter, en positiv respons, indikativ for tuberkuloseinfeksjon, som er eller ikke er manifestert som en aktiv sykdom.

Polypeptidene ifølge oppfinnelsen er fortrinnsvis formulert for anvendelse i hudtest som farmasøytiske sammensetninger som inneholder et polypeptid og en fysiologisk akseptabel bærer, som beskrevet over. Slike sammensetninger inneholder typisk en eller flere av de ovenfor nevnte peptider i en mengde som varierer fra omtrent 1 ug til omtrent 100 ug, fortrinnsvis fra omtrent 10 ug til omtrent 50 ug i et volum på 0,1 ml. Fortrinnsvis er bæreren som anvendes i slike farmasøytiske sammensetninger en saltvannsoppløsning med passende konserveringsmidler, slik som fenol og/eller Tween 80™.

I en foretrukket utførelsesform, er et polypeptid som anvendes i hudtesten av tilstrekkelig størrelse slik at det forblir på injeksjonsstedet under hele testperioden. Generelt, er et polypeptid minst 9 aminosyrer i lengde tilstrekkelig. Polypeptidet nedbrytes også fortrinnsvis av makrofager innen timer etter injeksjonen for å tillate presentasjon av T-celler. Slike polypeptider kan inneholde repetisjoner av en eller flere av de ovenfor nevnte sekvenser og/eller andre immunogene eller ikke immunogene sekvenser.

Følgende eksempler er tilveiebrakt for å illustrere og ikke for å begrense.

EKSEMPEL 1

RENSING OG KARAKTERISERING AV M . TUBERCULOSIS - POLYPEPT1DER VED Å ANVENDE CD4+ T- CELLELTNJER DANNET FRA HUMANT PBMC

M. tuberculosis- antigeaer ifølge foreliggende oppfinnelse ble isolert ved å ekspresjonskloning av cDNA-biblioteker fra M. tuberculosis- stsæameae H37Rv og Erdman vesentlig som beskrevet av Sanderson et al. ( J. Exp. Med., 1995,182:1751-1757) og ble vist ved å indusere PBMC proliferering og IFN-y i en immunoreaktiv T cellelinje.

To DC4+ T cellelinjer, referert til som DC-4 og DC-5 ble dannet mot dendrittceller infisert med M. tuberculosis. Spesifikt, ble dendrittceller fremstilt fra adherent PBMC fra en enkelt donor og deretter infisert med tuberkulose. Lymfocytter fra den samme donoren ble dyrket under begrensende fortynnende betingelser med infiserte dendrittceller for å danne CD4+ T-cellelinjene DC-4 og DC-5. Disse cellelinjene ble vist å reagere med urenset løselige proteiner fra M. tuberculosis men ikke med Tb38-1. Begrensende fortynnende betingelser ble anvendt for å erverve den tredje CD4+ T cellelinje, referert til som DC-6, som ble vist å reagere med både urensede løselige proteiner og Tb3 8-1.

Genomisk DNA ble isolert fra M. tuberculosis- stammene H37Rv og Erdman og brukt for å konstruere ekspresjonsbiblotekene i vektoren pBSK(-) ved å bruke Lambda ZAP ekspresjonssystem (Stratagene, La Jolla, CA). Disse bibliotekene ble transformert i E. coli, puljer av indusert E. coli kulturer ble inkubert med dendrittceller, og evnen til de resulterende inkuberte dendrittcellene til å stimulere celleproliferirering og IFN-y produksjon i CD4+ T cellelinje DC-6 ble undersøkt som beskrevet under i eksempel 2. Positive puljer ble fraksjonert og retestet inntil rene M. tuberculosis- kloner ble ervervet. Nitten kloner ble isolert, hvor ved ni ble funnet å inneholde det tidligere identifiserte M. tuberculosis- antigenet TbH-9 og Tb38-1, beskrevet i US patent søknad nr. 08/533,634. De bestemte cDNA sekvensene for de gjenværende ti klonene (heretter referert til som Tb224, Tb636, Tb424, Tb436, Tb398, Tb508, Tb441, Tb475, Tb448 og Tb465) er tilveiebrakt i SEQ ID nr. 1-10 respektivt. Korresponderende predikerte aminosyresekvenser for Tb224 og Tb636 er tilveiebrakt i SEQ ID nr. 13 og 14 respektivt. De åpne leserammene for disse to antigenene viste seg å ha noe homologi med TbH-9, beskrevet over. Tb224 og Tb636 ble også funnet å være overlappende kloner.

Tb424, Tb436, Tb398, Tb508, Tb441, Tb475, Tb488 og Tb465 ble funnet å inneholde to små åpne leserammer (referert til som ORF-1 og ORF-2) eller avkortede former derav, med små variasjoner i ORF-1 og ORF-2 det som ble funnet i hver klon. De predikerte aminosyresekvensene av ORF-1 og ORF-2 for Tb424, Tb436, Tb398, Tb508, Tb441, Tb475, Tb448 og Tb465 er tilveiebrakt i SEQ ID nr. 16 og 17,18 og 19,20 og 21,22 og 23,24 og 25,26 og 27,28 og 29 og 30 og 31 respektivt. I tillegg, ble klonene Tb424 og Tb436 funnet å inneholde en tredje tydelig åpen leseramme, referert til ORF-U. De predikerte aminosyresekvensene fra ORF-U for Tb424 og Tb436 er tilveiebrakt i SEQ ID NO: 32 og 33, respektivt. Tb424 og Tb436 ble funnet å være enten overlappende kloner eller nylig dupliserte/transposerte kopier. På samme måte, ble Tb398, Tb508 og Tb465 funnet å være enten overlappende kloner eller nylig dupliserte/transposerte kopier, dette gjaldt også Tb475 og Tb488.

Disse sekvensene ble sammenlignet med kjente sekvenser i genbanken ved å bruke BLASTN systemet. Ingen homologi med antigenene TB224 og Tb431 ble funnet. Tb636 ble funnet å være 100% identisk til kosmid tidligere identifisert i M. tuberculosis. På samme måte, ble Tb508, Tb488, Tb398, Tb424, Tb436, Tb441, Tb465 og Tb475 funnet å være homologe med kjente M. tuberculosis- kosmider. I tillegg ble Tb488 funnet å ha 100% homologi medM ft*6ercM/oji.s-topoisomerase 1.

Sytten overlappende peptider til den åpne leserammen ORF-1 (referert til som 1-1 -1-17; SEQ ID NO: 34-50, respektivt) og tretti overlappende peptider til den åpne leserammen ORF-2 (referert til som 2-1 - 2-30, SEQ ID NO: 51-80) ble syntetisert ved å bruke prosedyrene beskrevet under i eksempel 3.

Evnen syntetiske peptider og rekombinant ORF-1 og ORF-2 har til å indusere T-celleproliferering og JJFN-y-produksjon i PBMC fra PPD-positive donorer ble analysert som beskrevet under i eksempel 2. Figurene 1 A-B og 2A-B illustrerer stimulering av T celle proliferering og IFN-y ved rekombinant ORF-2 og syntetiske peptider 2-1-2-16 for to donorer, referert til som hhv D7 og Dl60. Rekombinant ORF-2 (referert til som MTI) stimulerte T-celleproliferering og IFN-y-produksjon i PBMC fra begge donorer. Mengden av PBMC stimulering som sees ved individuelle syntetiske peptider varierer innen hver donor, noe som indikerer at hver donor gjenkjenner forskjellige epitoper på ORF-2. Proteinene som kodes av ORF-1, ORF-2 og ORF-U ble deretter betegnet hhv MTS.MT1 ogMSF.

Atten overlappende peptider til sekvensen til MSF (referert til som MSF-1 - MSF-18; SEQ ID NO: 84-101, respektivt) ble syntetisert og deres evne til å stimulere T celle proliferering og IFN-y produksjon i en CD4+ T cellelinje dannet mot M. tuberculosis-dyrkningsfiltrat ble undersøkt som beskrevet under. Peptidene referert til som MSF-12 og MSF-13 (SEQ ED NO: 95 og 96, respektivt) ble funnet å ha høyeste nivåer av reaktivitet. To overlappende peptider (SEQ ID NO: 81 og 82) til den åpne leserammen til Tb224 ble syntetisert og vist å indusere T celle proliferering og IFN-y produksjon i PBMC fra PPD-positive donorer.

To CD4+ T cellelinjer fra forskjellige donorer ble dannet mot M. tuberculosis- m& s& rte dendrittceller ved å bruke ovenfor nevnte metodologi. Screening av M. tuberculosis-cDNA ekspresjonsbibliotek beskrevet over ved å bruke denne cellelinjen, resulterte i isolering av to kloner referert til som Tb867 og Tb391. Den bestemte cDNA-sekvensen for Tb867 (SEQ ID NO: 102) ble funnet å være identisk med tidligere isolert M. tuberculosis- kosnåd SCY22G10 med den kandidatreaktive åpne leserammen som koder for et 750 aminosyre M. tuberculosis- prottinkinase. Sammenligning av den bestemte cDNA-sekvensen for Tb391 (SEQ ID NO: 103) med de i genbanken ga ingen signifikant homologi med kjente sekvenser.

I ytterligere studier, ble CD4+ T cellelinjer dannet mot M tø&ercw/osw-kulturfiltratet vesentlig som beskrevet over, og brukt for å screene M. tuberculosis Erdman cDNA-ekspresjonsbibliotek som beskrevet over. Fem reaktive kloner, referert til som Tb431, Tb472, Tb470, Tb838 og Tb962 ble isolert. De bestemte cDNA-sekvensene for Tb431, Tb472. Tb470 og Tb838 er tilveiebrakt som hhv SEQ TD NO: 11,12,104 og 105 med de bestemte cDNA-sekvensene for Tb962 tilveiebrakt i SEQ ID NO: 106 og 107. Korresponderende bestemte aminosyresekvenser for Tb431 er tilveiebrakt i SEQ ID NO: 15.

Etterfølgende studier førte til isolering av en fullengde cDNA-sekvens for Tb472 (SEQ DD NO: 108). Overlappende peptider ble syntetisert og brukt for å identifisere reaktiv åpen leseramme. Den predikerte aminosyresekvensen for proteinet kodet for av Tb472 (referert til som MSL) er tilveiebrakt i SEQ DD NO: 109. Sammenligning av sekvensene Tb472 og MSL med de som er i genbanken, som beskrevet over, ga ingen homologi med kjente sekvenser. Femten overlappende peptider til sekvensene til MSL (referert til som MSL-1 - MSL-15; SEQ DD NO: 110-124, respektivt) ble syntetisert og deres evne til å stimulere T celle proliferering og DTN-y produksjon i en CD4+ T cellelinje dannet mot M. fø&ercw/osw-kulturfiltratet ble undersøkt som beskrevet under. Peptidene referert til som MSL-10 (SEQ DD NO: 119) og MSL-11 (SEQ DD NO: 120) ble funnet å vise høyeste nivå av reaktivitet.

Sammenligning av den bestemte cDNA-sekvensen for Tb838 med de som er genbanken ga identitet til det tidligere M. tuberculosis- kosmidet SCY07H7. Sammenligning av de bestemte cDNA-sekvensene for klon Tb962 med de som er i genbanken ga noe homologi med to tidligere identifiserte M. tuberculosis- kosmider, hvor ett koder for en del av baktoferritin. Imidlertid, ble rekombinant baktoferritin ikke funnet å være reaktiv med T cellelinjen brukt for å isolere Tb962.

Klonen Tb470, som beskrevet over, ble brukt for å gjenvinne en fullengde åpen leseramme (SEQ JD NO: 125) som viste homologi med TbH9 og ble funnet å kode for et 540 kDa antigen, referert til som Mtb40. Den bestemte aminosyresekvensen for Mtb40 er tilveiebrakt i SEQ ID NO: 126. På samme måte FØRTE ETTERFØLGENDE

STUDIER TIL ISOLERING AV FULLENGDE cDNA SEKVENSEN FOR Tb431,

TILVIEBRAKTI SEQ JD NO: 83, som har blitt bestemt å inneholde en åpen leseramme som koder for Mtb40. Tb470 og Tb431 ble også funnet å inneholde en potensiell åpen leseramme som koder for U-ORF-lignende antigen.

Screening av en M. tuberculosis Erdman cDNA-ekspresjonsbibliotek med flere CD4+ T cellelinjer dannet mot et M. fw&ercu/osis-kulturfiltrat, resulterte i isolering av tre kloner, referert til som Tb366, Tb433 og Tb439. De bestemte cDNA-sekvensene for Tb366, Tb433 og Tb439 er tilveiebrakt som hhv SEQ JD NO: 127,128 og 129. Sammenligning av disse sekvensene med de som finnes i genbanken ga ingen signifikants homologi med Tb366. Tb433 ble funnet å vise noe homologi med det tidligere identifiserte M. tuberculosis- mtigenet MPT83. TB439 ble funnet å vise 100% identitet til det tidligere isolerte M. tuberculosis- kosmidet SCY02B10.

En CD4+ T cellelinje ble dannet mot M. tuberculosis- P?D, vesentlig som beskrevet over, og brukt for å screene ovenfor nevnte M. tuberculosis- Erdman cDNA-ekspresjonsbibliotek. En reaktiv klon (referert til som Tb372) ble isolert, med de bestemte cDNA-sekvensene som er tilveiebrakt i SEQ JD NO: 130 og 131. Sammenligning av disse sekvensene med de som finnes i genbanken ga ingen signifikant homologi.

I ytterligere studier, førte screening av en M. føéercu/osis-cDNA-ekspresjonsbibliotek med en CD4+ T cellelinje dannet mot dendrittceller som hadde blitt infisert med tuberkulose i 8 dager, som beskrevet over, til isolering av to kloner referert til som Tb390R5C6 og Tb390R2Cl 1. Den bestemte cDNA-sekvensen for Tb390R5C6 er tilveiebrakt i SEQ JD NO: 132 med de bestemte cDNA-sekvensene for Tb390R2Cl 1 tilveiebrakt i SEQ JD NO: 133 og 134. Tb390R5C6 ble funnet å være 100% identisk med en tidligere identifisert M. tuberculosis- kosmid.

De etterfølgende studier, ble metodologien beskrevet over brukt til å screene M. tuberculosis genomisk DNA-bibliotek fremstilt som følger. Genomisk DNA fra M. tuberculosis Erdman stamme ble tilfeldig fordelt til en gjennomsnittsstørrelse på 2 kb, og gjort "blun ended" med Klenowpolymerase, etterfulgt av tilsetning av EcoRl adaptorere. Innføyelsen ble deretter ligert inn i en screenfagvektor (Novagen. Madiosn, Wl) og pakket in vitro ved å bruke PhageMaker ekstrakt (Novagen). Fagbiblioteket (referert til som Erd Xscreenbibliotek) ble amplifisert og en del ble konvertert til et plasmidekspresjonsbibliotek ved en autosubkloningsmekanisme ved å bruke E. coli stammen BM25.8 (Novagen). Plasmid DNA ble renset fra BM25.8 kulturer som inneholdt pSCREEN rekombinanter og brukt til å transformere kompetente celler fra den uttrykkende vertsstammen BL21(DE3)PLysS. Transformerte celler ble alikvotert ved 96 brønners mikrotiterplater med hvor hver brønn inneholdt en samling av omtrent 50 kolonier. Replikaplater av de 96 brønners plasmidbibliotekformatene ble indusert med IPTG for å gi rekombinant proteinekspresjon. Etter induksjonen, ble platene sentrifugert for å pelletere E. coli som ble brukt direkte i T celle ekspresjonskloning av en CD4+ T cellelinje fremstilt fra en PPD positiv donor (donor 160) som beskrevet over. Puljene som inneholdt E. coli som uttrykte M. tuberculosis T celleantigener ble deretter brutt ned til individuelle kolonier og reanalysert på samme måte for å identifisere positive treff.

Screening av T cellelinjen fra donor 160 med en 96 brønners plate av Erd Xscreenbiblioteket tilviebrakte totalt ni positive treff. Tidligere eksperimenter på screening av pBSK bibliotek beskrevet over med T-celler fra donor 160 indikerte at de fleste av de positive klonene ville være TbH-9, Tb38-1 eller MTI (beskrevet i US patentsøknad nr. 08/553,634) eller varianter derav. Imidlertid, viste Southern analyse at bare tre brønner hybridiserte med en blandet probe av TbH-9, Tb38-1 og MTI. Av de gjenværende seks positive brønnene ble to funnet å være identiske. De bestemte 5' cDNA-sekvensene for to av de isolerte klonene (referert til som Y1-26C1 og Yl-86C11) er tilveiebrakt i SEQ ID NO: 135 og 136 respektiv. Fullengde cDNA-sekvensen for den isolerte klonen referert til som hTcc#l er tilveiebrakt i SEQ ID NO: 137, med den korresponderende predikerte aminosyresekvensen tilveiebrakt i SEQ JD NO: 138. Sammenligning av sekvensene til hTcc#l med de genbanken som beskrevet over ga noe homologi med tidligere isolert M. tuberculosis- kosmid MTCY07H7B.06.

EKSEMPEL 2

INDUKSJON AV T CELLE PROLIFERERING OG INTERFERON- y PRODUKSJON AVM TUBERCULOSIS - AmiGENER

Evnen rekombinant M. tuberculosis- antiigener har til å indusere T celleproliferering og interferon-y produksjon kan bli bestemt som følger.

Proteiner kan bli indusert ved JPTG og renset ved gelelusjon, som beskrevet i Skeiky et al., J. Exp. Med., 1995,181:1527-1537. De rensede polypeptidene ble deretter screenet for evnen til å indusere T celleproliferering i PBMC-preparater. PBMS fra donorene kjent å være PPD hudtestpositive og hvis T-celler er kjent til å proliferere som respons på PPD, ble dyrket i medium som inneholder RPMI1640 tilsatt 10% samlet humant serum og 50 ng/ml gentamisin. Rensede polypeptider ble tilsatt i duplikat ved konsentrasjoner på 0,5 til 10 ng/ml. Etter seks dager med dyrkning i 96 brønners rundbundede plater i et volum på 200 ni, blir 50 ni av mediumet fjernet fra hver brønn for bestemmelse av IFN-y nivåer, som beskrevet under. Platene ble deretter pulset med 1 nCi/brønn og tritiert tymidin i ytterligere 18 timer, høstet og tritiumopptaket bestemt ved å bruke gasscintillasjonsteller. Fraksjonene som resulterer i en proliferering i begge replikaene som er tre ganger større enn prolifereringen observert i cellene dyrket i medium alene er å betrakte som positive.

IFN-y er målt ved å bruke en enzymkoblet immunosorbent analyse (ELISA). ELISA platene blir belagt med en musemonoklonal antistoff rettet mot humant IFN-y (PharMingen, San Diego, CA) i PBS i fire timer ved romtemperatur. Brønnene ble deretter blokkert med PBS som inneholder 5% (V/V) fettfri tørrmelk i 1 time ved romtemperatur. Platene ble vasket seks ganger i PBS/0,2% TWEEN-20 og prøvene fortynnet 1:2 i kulturmedium i ELISA platene blir inkubert over natten i romtemperatur. Platene ble igjen vasket og et polyklonalt kanin anti-humant JPN-y serum fortynnet 1:3000 i PBS/10% normal geiteserum blir tilsatt til hver brønn. Platene blir deretter inkubert i to timer ved romtemperatur, vasket og pepperots peroksidase-koblet anti-kanin IgG (Sigma Chemical So., St. Louis, MO) blir tilsatt i en 1:2000 fortynning i PBS/5% fettfri tørrmelk. Etter ytterligere to timers inkubering ved romtemperatur, blir platene vasket og TMB substrat tilsatt. Reaksjonen blir stoppet etter 20 minutter med 1 N svovelsyre. Optisk tetthet blir bestemt ved 450 nm ved å bruke 570 nm som referansebølgelengde. Fraksjoner som resulterer i at begge replikane gir en OD to ganger høyere enn gjennomsnitts OD fra cellene dyrket i mediet alene, pluss 3

standardavvik, bli betraktet som positive.

EKSEMPEL 3

RENSING OG KARAKTERISERING AV M . TUBERCULOSIS - POLYPEPTJDBR VED Å ANVENDE CD4+ T CELLELINJER DANNET FRA EN MUSE M.

TUBERKULSOEMODELL

Infeksjon av C57BL/6 mus med M. tuberculosis resulterte i utvikling av en progressiv sykdom i omtrent 2-3 uker. Sykdomsprogressjon ble deretter stoppet som en konsekvens av en sterk beskyttende T celle mediert immunrespons. Denne infeksjonsmodellen ble brukt for å danne T cellelinjer som er i stand til å gjenkjenne beskyttende M. tuberculosis- antigener.

Spesielt, ble miltceller ervervet fra C57BL/6 mus infisert med M. tuberculosis i 28 dager og brukt for å indusere spesifikk anti-M tuberculosis T cellelinjer som beskrevet over. De resulterende CD4+ T-cellelinjene sammen med normale antigenpresenterende (milt) celler fra C57BL/6 mus ble brukt for å screene M. tuberculosis Erd A,screenbibliotek beskrevet over. En av de reaktive bibliotekssamlingene, som ble funnet å være svært stimulatoriske på T-celler, ble selektert og en korresponderende aktive klon (referert til som Y288C10) ble isolert.

Sekvensering av klonen Y288C10 viste at den inneholdt to potensielle gener, i tandem. De. bestemte cDNA-sekvensene for disse to genene (referert til som mTCC#l og mTCC#2) er tilveiebrakt som hhv SEQ ID NO: 139 og 140, med de korresponderende predikerte aminosyresekvensene tilveiebrakt i SEQ JD NO: 141 og 142, respektivt. Sammenligning av disse sekvensene med de i genbanken ga identitet til ukjente sekvenser som tidligere var funnet i M. tuberculosis- kosmidet MTY21C12. De predikerte aminosyresekvensene fra mTCC#l og mTCC#2 ble funnet å ha noe homologi med tidligere identifiserte medlemmer av TbH9 proteinfamilien, som diskutert over.

EKSEMPEL 4

SYNTESE AV SYNTETISKE POLYPEPTIDER

Polypeptider kan bli syntetisert på en Millipore 9050 peptidsyntetiseringsmaskin ved å bruke FMOC kjemi med HPTU (0-benzotirazol-N,N,N,,N,-tetrametyluronium heksafluorfosfat) aktivering. En Gly-Cys-Gly sekvens kan festes til aminoterminal ende i peptidet for å tilveiebringe en metode for konjugasjon eller merking av peptidet. Kutting av peptidene fra det faste støttematerialet kan bli utført ved å bruke følgende kuttingsblanding: trifluoreddiksyre: etanditiol: tioanisol: vann: fenol (40:1:2:2:3). Etter kutting i 2 timer, kan peptidene bli presipitert i kald metyl-t-butyl-eter. Peptidpelletene kan deretter bli løst i vann som inneholder 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) og lyofilisert forut for rensning ved Cl8 revers fase HPLC. En gradient på 0%-60% acetonitril (som inneholdt 0,1% TFA) i vann (som inneholdt 0,1% TFA) kan bli brukt for å eluere peptidene. Etter lyofiliseringen av det rene fraksjonet, kan peptidene bli karakterisert ved å bruke elektrospraymassespektrometri og ved aminosyreanalyser.

Claims (25)

1. Isolert polypeptid, karakterisert ved at det omfatter: (i) en immunogen del av M. tuberculosis- antigenet som beskrevet i SEQ TD NO: 109, eller (ii) en variant av M. tuberculosis- antigen som beskrevet i SEQ ID NO: 109 med samme biologiske virkning.

2. Isolert polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter et M. tuberculosis- antigen beskrevet i SEQ ID NO: 109, eller en variant av M. tuberculosis- antigent beskrevet i SEQ ID NO: 109 med samme biologiske virkning.

3. Isolert polypeptid ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en immunogen del av M tuberculosis- antigenet som beskrevet i SEQ ID NO: 109.

4. Isolert polypeptid ifølge krav 3, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som beskrevet i SEQ ID NO:l 19.

5. Isolert polypeptid ifølge krav 4, karakterisert ved at det består av aminosyresekvens som beskrevet i SEQ ID NO: 119.

6. Isolert polypeptid ifølge krav 3, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens som beskrevet i SEQ ID NO: 120.

7. Isolert polypeptid ifølge krav 6, karakterisert ved at det består en aminosyresekvens som beskrevet i SEQ ID NO: 120.

8. Isolert polypeptid ifølge krav 3, karakterisert ved at det omfatter en M. tuberculosis- antigenet som beskrevet i SEQ TD NO: 109.

9. Isolert polypeptid ifølge krav 8, karakterisert ved at det består av M. tuberculosis- antigenet som beskrevet i SEQ ID NO: 109.

10. Fusjonsprotein, karakterisert ved at det omfatter minst to polypeptider ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 9.

11. Fusjonsprotein, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 9 og et kjent M. tuberculosis-antigen,

12. DNA-molekyl, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid ifølge krav 1 til 10 eller et fusjonsprotein ifølge krav 10 og 11.

13. DNA-molekyl ifølge krav 12, karakterisert ved at det omfatter nukleotidsekvensen beskrevet i SEQ DD NO: 108.

14. DNA-molekyl ifølge krav 13, karakterisert ved at det består av nukleotidsekvensen beskrevet i SEQ DD NO: 108.

15. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter DNA-molekylet ifølge hvilket som helst av kravene 12-14.

16. Isolert vertcelle, karakterisert ved at den er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 15.

17. Isolert vertcelle ifølge krav 16, karakterisert ved at den er valgt fra gruppen bestående av E. coli, gjær og pattedyrceller.

18. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter minst ett polypeptid ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 9 eller et fusjonsprotein ifølge krav 10 og 11 og en fysiologisk akseptabel bærer.

19. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter minst ett DNA-molekyl ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 14 og en fysiologisk akseptabel bærer.

20. Vaksine, karakterisert ved at den omfatter minst ett polypeptid ifølge hvilket som helst av kravene 1 til 9 eller et fusjonsprotein ifølge krav 11 og 12 og en ikke-spesifikk immunrespons forsterker.

21. Vaksine, karakterisert ved at den omfatter minst ett DNA-molekyl ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 14 og en ikke-spesifikk immunresponsforsterker.

22. Vaksine sammensetning ifølge krav 20 eller krav 21, karakterisert ved at den ikke-spesifikke immunresponsforsterkeren er en adjuvans.

23. Anvendelse av et polypeptid ifølge hvilket som hels av kravene 1 til 9, et fusjonsprotein ifølge krav 10 og 11 eller et DNA-molekyl ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 14, for fremstilling av et preparat for induksjon av beskyttende immunitet i en pasient.

24. Anvendelse av et polypeptid ifølge hvilket som hels av kravene 1 til 9, et fusjonsprotein ifølge krav 10 og 11, et DNA-molekyl ifølge hvilket som helst av kravene 12 til 14 eller en farmasøytisk sammensetning ifølge krav 18 eller 19, for fremstilling av en vaksine for induksjon av beskyttende immunitet i en pasient.

25. Diagnostisk kitt for deteksjon av tuberkulose, karakterisert ved at det omfatter: (c) et polypeptid ifølge hvilket som helst av kravene 1-9 eller et fusjonsprotein ifølge krav 10 og 11; og (d) apparat som er tilstrekkelig for å bringe nevnte polypeptid i kontakt med dermale celler fra en pasient.