NO319143B1

NO319143B1 - Fremgangsmate for fremstilling av nukleinsyrer fra et lysat ved anvendelse av svak basisk polymer og amplifisering, og forsokssett for amplifisering av malnukleinsyrer.

Info

Publication number: NO319143B1
Application number: NO19953631A
Authority: NO
Inventors: John Wesley Backus; Tobias E Ekeze; Jerome Charles Swartz; Richard Calvin Sutton; Ignazio Salvatore Ponticello
Original assignee: Johnson & Johnson Clin Diag
Priority date: 1994-09-15
Filing date: 1995-09-14
Publication date: 2005-06-27
Also published as: CA2158485C; PT707077E; KR100451267B1; NO953631L; CA2158485A1; JPH08173194A; EP0707077B1; KR960010876A; AU3030295A; EP0707077A2; EP0707077A3; AU706641B2; JP4354537B2; ATE282715T1; US5582988A; FI115843B; SI0707077T1; FI954331L; DK0707077T3; DE69533771D1

Abstract

Nukleinsyrer kan bli gjort tilgjengelig for amplifikasjon eller annen behandling etter ly sering ved kontakting av lysatet med spesifikke, svakt basiske polymerer for å danne et presipitat med nukleinsyrene ved sur pH. Etter fjerning av ikke-presipiterte materialer, blir PH gjort basisk for derved å frigjøre nukleinsyrer fra polymeren. Denne fremgangsmåten for å danne prøver er enkel og meget hurtig, og frigjorte nukleinsyrer kan bli ytterligere behandlet i hybridi-seringsanalyser eller amplifikasjonsprosedyrer. Svake, basiske polymerer er vann-oppløselige og kationiske ved sur pH, men nøytrale i ladning ved basisk pH.

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av en nukleinsyre fra et lysat ved anvendelse av svakt basiske polymerer og amplifisering. Oppfinnelsen vedrører også et forsøkssett for anvendelse ifølge fremgangsmåten.

Teknologi for å detektere små mengder nukleinsyrer har øket hurtig i løpet av de siste

20 årene, inkludert utvikling av meget sofistikerte amplifiseringsteknikker så som polymerasekjedereaksjon (PCR). Forskere har oppdaget verdien av slik teknologi for å detektere nukleinsyrer som indikerer sykdommer og genetiske trekk i menneske- eller dyretestprøver. Anvendelse av prober og primere i slik teknologisk er basert på

konseptet med komplementaritet, dvs. binding av to tråder av en nukleinsyre ved hydrogenbindinger mellom komplementære nukleotider (også kjent som nukleotidpar).

PCR er et betydelig fremskritt innenfor å muliggjøre deteksjon av meget små konsentrasjoner av en målsøkt nukleinsyre. Detaljer ved PCR er f.eks. beskrevet i US—A--4.965.188 (Mullis et al.), til tross for at det er et hurtig ekspanderende volum med litteratur innenfor dette området.

For effektivt å amplifisere og detektere en målnukleinsyre, er det vanligvis nødvendig å isolere nukleinsyren fra cellulært eller annet prøvedebris. Forskjellige lyseringsprosedyrer er kjente, inkludert frysing, behandlet med spaltende enzym så som protease, f.eks. Proteinase K, koking og anvendelse av forskjellige detergenter (se f.eks. U.S.S.N 178.202, inngitt 6. april 1988 til Huguchi, og EP-A-0.428.197, publisert 22. mai 1991), oppløsningsmiddelpresipiteringer og varmeprotokoller.

Når nukleinsyrer er ekstrahert fra celler eller viruspartikler, eksisterer det fortsatt et behov for å separere disse fra andre materialer i lysatet på en enkel og billig måte. Et materiale kjent for å bli kompleksbundet med nukleinsyrer er polyetylenimin og forskjellige kjemiske derivater. Det er blitt anvendt for å presipitere nukleinsyrer som kontaminanter i prosesser for isolering av enzymer og i affinitetskolonner for oppfanging av nukleinsyrer.

Nylig har kolleger anvendt polyetylenimin i kombinasjon med et anionisk fosfatester-overflateaktivt middel for å oppfange og selektivt isolere nukleinsyrer. Selv om denne teknikken er blitt anvendt med noe hell, kreves anvendelse av to separate reagenser i forskjellige trinn i forsiktig kontrollerte mengder. Mengden av fosfatester-

overflateaktivt middel anvendt er avhengig av mengden av polyetylenimin som er til stede i presipitatet med nukleinsyrene. En forbedring er blitt forsøkt for å redusere antall

trinn og reagenser nødvendig for oppfanging og isolering av nukleinsyrene.

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av en nukleinsyre fra et lysat, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: A) ved en pH på mindre enn 7, bringes et lysat som antas å inneholde en nukleinsyre i kontakt med en vannoppløselig, svakt basisk polymer i en mengde tilstrekkelig for å danne et vannuoppløselige presipitat av nevnte svake, basiske polymer med alle nukleinsyrene til stede i lysatet,

B) nevnte vannuoppløselige presipitat separeres fra nevnte lysat og

C) nevnte presipitat bringes i kontakt med en base for å øke oppløsningens pH til

høyere enn 7 og derved frigi nevnte nukleinsyrer fra nevnte svake basiske polymer,

idet nevnte svake basiske polymer omfatter tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av en eller flere etylenisk, innettede polymeriserbare monomerer med en amingruppe som kan bli protonert ved sur pH.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for amplifisering og deteksjon av en målnukleinsyre, kjennetegnet ved

I) å tilveiebringe en målnukleinsyre ved anvendelse av følgende trinn:

A) ved en pH på mindre enn 7 bringes et lysat antatt å inneholde en målnukleinsyre i kontakt med en vannoppløselig, svakt basisk polymer i en mengde som er tilstrekkelig for å danne et vannuoppløselig presipitat av nevnte svake basiske polymer med alle nukleinsyrene til stede i nevnte lysat, inkludert nevnte målnukleinsyre,

B) separere nevnte vannuoppløselige presipitat fra nevnte lysat og

C) bringe nevnte presipitat i kontakt med en base for å øke oppløsningens pH til høyere enn 7, og derved frigi nevnte nukleinsyrer, inkludert nevnte målnukleinsyre, fra nevnte svakt basiske polymer,

idet nevnte svakt basiske polymer omfatter tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av en eller flere etyleniske, umettede polymeriserbare monomerer som har en amingruppe som kan bli protonert ved

sur pH,

II) amplifisere nevnte målnukleinsyre til stede blant nevnte frigitte nukleinsyrer og III) detektere nevnte amplifiserte målnukleinsyre.

Videre omfatter opprinnelsen forsøkssett for amplifisering av en målnukleinsyre, kjennetegnet at det omfatter, separat pakket: a) en amplifiseringsreaksjonsblanding omfattende en eller flere amplifiseringsreagenser og b) en svak basisk polymer omfattende tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av en eller flere etylenisk umettede polymeriserbare

monomerer med en amingruppe som kan bli protonert ved sur pH.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en hurtig, enkel og effektiv fremgangsmåte for selektiv isolering og tilveiebringing av nukleinsyrer for ytterligere behandling, så som hybridiseringsanalyser eller amplifiseringsprosedyrer. Foreliggende oppfinnelse løser problemene angitt ovenfor vedrørende konvensjonelle isoleringsmidler, inkludert anvendelse av polyetylenimin. I tillegg blir problemene presentert ved anvendelse av polyetylenimin kombinert med et fluorinert fosfat-overlfateaktivt middel også unngått på grunn av at det overflateaktive midlet ikke er nødvendig. Prøveprepareringsmetoden ifølge denne oppfinnelsen er ikke omstendelig og krever et minimalt antall trinn og gjør den dermed enklere å automatisere. Den kan vanligvis bli utført i løpet av omtrent 15 minutter (fortrinnsvis i løpet av 10 minutter).

Disse fordelene blir tilveiebrakt ved anvendelse istedenfor polyetylenimin en "svak basisk" polymer som er kationisk og vannoppløselig ved sur pH, men deprotoneres ved en basisk pH som er betraktelig over pKa til polymeren. Med "svak basisk" menes at polymer pKa er mindre enn 7, og sannsynligvis mindre enn 6,5. Polymeren kan følgelig bli anvendt ved lav pH for å presipitere nukleinsyrer på grunn av den ioniske interaksjon til kationiske polymeren og det anioniske fosfat slettet til nukleinsyrene.

Etter fjerning av ikke-kompleksbundede materialer, og ved en pH-justering til basiske betingelser, blir nukleinsyrene frigitt (eller dekompleksbundet) fra den svakt, basiske polymeren til presipitatet og tilgjengelig for ytterligere behandling, så som amplifisering. Amplifiseringsprosedyrene kan bli utført under basiske betingelser.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 illustrerer data oppnådd i eksempel 3 nedenfor i bar grafisk form.

Fig. 2 illustrerer data oppnådd i eksempel 4 nedenfor i bar grafisk form.

Foreliggende oppfinnelse er spesielt egnet for ekstrahering og deteksjon av en eller flere målnukleinsyrer til stede i en prøve fra en hvilken som helst type samlet fra dyr, menneske, miljø eller mikrobiologiske prøver. Nukleinsyrene oppnådd på denne måten kan bli ytterligere behandlet ved å utsette disse for konvensjonelle hybridiseringsanalyser og prosedyrene er velkjente innenfor fagområdet (f.eks. US-A-4.994.373, inkorporert heri som referanse med hensyn på hybridiseringsteknologi).

Den gjenværende diskusjonen vil bli rettet mot foretrukne utførelsesformer hvorved nukleinsyrene blir utsatt for amplifiseringsprosedyrer, spesielt PCR. Rammen av denne oppfinnelsen er ikke ment å være så begrenset på grunn av at andre amplifiseringsteknikker (så som LCR) kan også bli anvendt.

De generelle prinsippene og betingelsene for amplifisering og deteksjon av nukleinsyrer ved anvendelse av polymerasekjedereaksjon er velkjente, idet detaljer derav er gitt i mange referanser inkludert US-A-4.683.195 (Mullis et al.), US-A-4.683.202 (Mullis), US-A-4.965.188 (Mullis et al.) og WO-A-^91/12342. De angitte US-patentene er inkorporert heri som referanse. I lys av det som blir beskrevet innenfor fagområdet og det som blir angitt heri, vil en fagmann innenfor et område lett kunne utføre foreliggende oppfinnelse ved å kombinere den preparative fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelsen med polymerasekjedereaksjonsprosedyrer, eller med en hvilken som helst annen amplifiseringsprosedyre kjent innenfor fagområdet.

Andre amplifiseringsprosedyrer som kan bli anvendt ved utførelse av denne oppfinnelsen innbefatter, men er ikke begrenset til, ligasekjedereaksjon som beskrevet, f.eks. i EP-A-0.320,308 (publisert desember 1987) og EP-A-0.439.182 (publisert januar 1990).

Forsøksprøver kan innbefatte cellulært eller viralt materiale, hår, kroppsvæsker eller andre materialer inneholdende genetisk DNA eller RNA, eller DNA eller RNA fra infeksiøse midler som kan bli detektert. Målnukleinsyren kan bli ekstrahert fra en hvilken som helst egnet human, dyre-, mikrobiell, viral eller plantekilde. I tillegg kan målnukleinsyrene bli isolert fra onkogene celler.

Bakterier som kan bli detektert innbefatter, men er ikke begrenset til, bakterier som kan finnes i blod, Salmonella spp., Streptococcus spp., Chlamydia spp., Neisseria spp., Mycobacterium spp. (så som Mycobacterium tuberculosis og Mycobacterium avium complex), Mycoplasma spp. (så som Mycoplasma Haemophilus influenzae og Mycoplasma pneumoniae), Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferei, Pneumocystis carinii, Clostridium difficile, Campylobacter spp., Yersinia spp., Shigella spp. og Listeria spp. Vimser som er detekterbare innbefatter, men er ikke begrenset til, herpes simpleks-vimser, Epstein Barr-virus, cytomegalovirus, humane papillomaviruser, influensaviruser, respiratoriske syncytialviruser, hepatittviruser og retroviruser (så som HTLV-I, HTLV-II, HIVI og HIV2). Protozoparasitter og sopp (inkludert gjær og mugg) er også detekterbart. Andre detekterbare prøver vil være innlysende for fagfolk innenfor dette området. Oppfinnelsen er spesielt nyttig for deteksjon av tilstedeværelse av nukleinsyre assosiert med forskjellige bakterier eller viruser.

I en foretrukken utførelsesform er oppfinnelsen nyttig for isolering, amplifisering og deteksjon av nukleinsyrer assosiert med HIVI, HIV2, proviral HIVI, proviral HIV2, cytomegalovirus, human papillomavirus, mycobakterielle prøver, hepatittvirus eller genetiske sykdommer.

Før kontakt med svak basisk polymer definert heri, kan nukleinsyrene bli ekstrahert fra prøven på en hvilken som helst egnet måte. Forskjellige lyseringsprosedyrer er kjent innenfor fagområdet, inkludert de som er beskrevet av Laure et al. i The Lancet, s. 538-540 (3. september 1988), Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, s. 280-281 (1982), Gross-Belland et al. i Eur. J. Biochem., 36,32 (1973) og US—A-^4.965.188 (angitt ovenfor). Ekstrahering av DNA fra fullblod eller komponenter derav er f.eks. beskrevet i EP—A—0.393.744 (publisert 24. oktober 1990), US-A-5.231.015 (Cummins et al.) og US-A-5.334.499 (Burdick et al.), idet angitte patenter er inkorporert heri som referanse. Lyseringsprosedyren kan være avhengig av prøvetype som blir anvendt som kilde for nukleinsyrer.

Idet den bestemte lyseringsprosedyren ikke er kritisk for utførelse av denne oppfinnelsen, innbefatter en foretrukket lyseringsprosedyre oppvarming av prøven i nærvær av et egnet ikke-ionisk, overflateaktivt middel, et antall som er velkjent innenfor fagområdet. En annen nyttig lyseringsprosedyre er beskrevet i U.S.S.N. 08/063.169 (inngitt 18. mai 1993 av Ekeze og Kerschner) hvorved en total blodprøve blir blandet med en bufret oppløsning av ammoniumklorid, etterfulgt av ytterligere trinn som innbefatter en annen blanding med ammoniumklorid.

Lysatet blir deretter blandet, ved en pH på mindre enn 7 (fortrinnsvis mindre enn 5), som er en svak basisk polymer (definert nedenfor) i en mengde tilstrekkelig for å kompleksbindes med alle nukleinsyrene til stede i lysatet, dannelse av et vannuoppløselig presipitat. Denne polymeren er vannoppløselig ved sur pH. Generelt er mengden av polymer til stede minst omtrent 0,01 vekt-%, idet fra omtrent 0,05 til omtrent 0,5 vekt-% er foretrukket. Fagfolk innenfor dette området vet hvordan man justerer mengden av polymer for å akkommodere en hvilken som helst mengde nukleinsyrer. Blanding kan bli utført på en hvilken som helst egnet måte i opptil 30 minutter (generelt mindre enn 5 minutter) og ved en hvilken som helst egnet temperatur (generelt fra 15 til 35°C).

Svak, basisk polymer kan bli anvendt i dets vannoppløselige frie form, eller koblet til et vannuoppløselige substrat, så som i en affinitetskolonne, eller koblet til polymeriske, glass eller andre uorganiske partikler. Polymerene kan følgelig bli koblet ved anvendelse av konvensjonelle metoder (f.eks. absorpsjon, kovalente bindinger eller spesifikke bindingsreaksjoner) til et egnet substrat, inkludert glass, polymeriske eller magnetiske partikler, filtre eller filmer. Hvor den svakt basiske polymeren er vannuoppløselig selv ved basisk pH, kan den bli fjernet ved filtrering, sentrifugering eller andre konvensjonelle metoder etter at nukleinsyrene er frigitt.

Mens bundet til den svakt basiske polymeren, er nukleinsyrene ikke nyttige. Det er deretter nødvendig å separere det vannuoppløselige presipitatet fra gjenværende prøve som kan inneholde betraktelig cellulært debris og polymer i overskudd. Denne separasjon kan bli oppnådd ved anvendelse av hvilke som helst av de forskjellige, konvensjonelle prosedyrene, inkludert sentrifugering eller filtrering hvoretter væsken bli fjernet. Sentrifugering er foretrukket ved utførelse av denne oppfinnelsen.

Etter separeringstrinnet, kan nukleinsyrene bli dekompleksbundet eller frigitt fra den svakt basiske polymeren ved kontakt av presipitatet med en base, med eller uten oppvarming. Sterke baser kan bli anvendt uten oppvarming og de innbefatter, men er ikke begrenset til, natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, ammoniumhydroksyd, litiumhydroksyd, natriumkarbonat, natriumbikarbonat, et tertiært amin (så som trietylamin, diisopropyletylamin og lutidin), tricin, bicin eller en hvilken som helst annen organisk eller uorganisk base som er innlysende for fagfolk innenfor dette området. Nyttige svakere baser kan innbefatte basiske buffere så som tris(hydroksymetyl)aminometan (eller sure addisjonssalter derav), N,N-bis(2-hydroksyetyl)glycin, N-tris(hydroksymetyl)metyl-glycin og andre som er velkjente innenfor fagområdet. Oppvarming kan være nødvendig når svakere baser blir anvendt.

En slik oppvarming kan bli utført i opptil 15 minutter (generelt mindre enn 5 minutter) ved en temperatur som er minst omtrent 50°C, og foretrukket er fra omtrent 95 til

omtrent 125°C, under egnet trykk. Som anvendt heri angir "omtrent" ±5°C.

I foretrukne utførelsesformer kan svakere baser bli anvendt med oppvarming for å frigi nukleinsyrene fra presipitatet. Dette tilveiebringer en oppløsning inneholdende nukleinsyrer som er klar for amplifisering uten ytterligere behandling. En rekke svakere baser kan være buffere, så som Ms(hydtoksymetyl)aminometanhydroklorid.

I noen utførelsesformer er polymerene anvendt i slike utførelsesformer (definert nedenfor) som er vannuoppløselige selv ved basisk pH. Slike polymerer kan bli fjernet fra systemet etter frigivelse av nukleinsyrene og før amplifisering, om ønskelig.

Den resulterende oppløsningen inneholdende frigitte nukleinsyrer har en basisk pH. I noen tilfeller kan nukleinsyrene bli ytterligere behandlet uten noen ytterligere justering i pH. I andre utførelsesformer hvor en sterk base blir anvendt, kan pH til oppløsningen bli justert (generelt nedenfor) til fra omtrent 6 til omtrent 9 (fortrinnsvis fra omtrent 7,5 til omtrent 9), ved anvendelse av en hvilken som helst egnet syre eller buffer, så som tris(hydroksymetyl)aminometanhydroklorid, N,N-bis(2-hydroksyetyl)glycin, N-tris-(hydroksymetyl)metylglycin og andre som er kjent for fagfolk innenfor dette området. Mengdene av slike materialer nødvendig for å oppnå ønsket pH vil være innlysende for fagfolk innenfor dette området.

Ved basisk pH kan polymer anvendt for å oppfange nukleinsyrene være enten vannoppløselig eller vannuoppløselig og monomerene nødvendig for å tilveiebringe slike egenskaper er beskrevet nedenfor.

Den beskrevne fremgangsmåten for oppfanging og frigivelse av nukleinsyrene ifølge denne oppfinnelsen blir vanligvis utført i løpet av omtrent 20 minutter, og fortrinnsvis i løpet av omtrent 10 minutter.

Som anvendt heri, dersom ikke annet er angitt, refererer "omtrent" til en variasjon på ±10% av angitte verdier. Når anvendt med pH-verdier, refererer "omtrent" til ± 0,5 pH-enhet.

I en foretrukken utførelsesform ifølge denne oppfinnelsen omfatter en fremgangsmåte for amplifisering og deteksjon av en målnukleinsyre:

I) lysering av celler eller viruspartikler for å frigi en målnukleinsyre,

n) utsette målnukleinsyren for følgende trinn:

A) ved en pH som er mindre enn 7, kontakting av målnukleinsyren med en vannoppløselig, svakt basisk polymer i en mengde tilstrekkelig for å danne et vannuoppløselig presipitat av den svakt, basiske polymeren med alle nukleinsyrer til stede i lysatet, inkludert målnukleinsyren,

B) separere det vannuoppløselige presipitatet fra lysatet og

C) bringe presipitatet i kontakt med en base for å øke oppløsningens pH til høyere enn 7, og derved frigi nukleinsyrer, inkludert målnukleinsyren, fra den svakt, basiske polymeren,

den svakt basiske polymeren omfattende tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av en eller flere etyleniske, umettede polymeriserbare monomerer med en amingruppe som kan bli beskyttet ved sur pH,

III) uten ytterligere justering av pH, amplifisering av frigitt målnukleinsyre og

IV) detektere den amplifiserte målnukleinsyren.

I foregående fremgangsmåte er det ytterligere mer foretrukket at den svakt basiske polymeren er vannuoppløselig ved basisk pH, og fremgangsmåten omfatter videre trinnet av å fjerne den vannuoppløselige polymeren etter frigivelse av målnukleinsyren, men før amplifisering derav.

Svakt, basisk polymer anvendt ved utførelse av denne oppfinnelsen blir fremstilt fra en eller flere etyleniske, umettede, polymeriserbare monomerer, hvor minst en har en amingruppe som kan bli protonert ved sur pH. Ved sur pH blir polymeren protonert for å danne det sure addisjonssaltet av aminet. Ved basisk pH, eksisterer polymeren som fri base.

"Svakt basiske grupper" som kan være en del av polymeriserbare monomerer nyttig i denne oppfinnelsen innbefatter, men er ikke begrenset til, cykliske amingrupper, eller primære, sekundære eller tertiære aminoalkylgrupper som kan bli protonert ved sur pH. Nyttige cykliske amingrupper innbefatter, men er ikke begrenset til, imidazolyl—, isoksazolyl—, pyridyl—, piperidyl—, piperazinyl—, pyrazolyl—, triazolyl—, tetrazolyl—, oksadiazolyl—, pyridazinyl—, pyrimidyl—, pyrazinyl—, kinolinyl— og kinazolinylgrupper. Foretrukne grupper er cykliske grupper som er aromatiske og imidazolylgrupper er mest foretrukket. Nyttige aminoalkyl— eller cykliske amingrupper

er koblet til vinylgrupper av monomerer ved anvendelse av hensiktsmessig koblede grupper inkludert alkylen-, amido- eller estergrupper, og multiple alkylengrupper kan bli koblet sammen med imino-, oksy-, amid-, karbonyl- eller estergrupper.

Generelt nyttige polymerer for oppfanging av nukleinsyrer omfatter tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av: a) fra omtrent 15 til 100 vekt-% av en vannoppløselig, svakt basisk etylenisk umettet polymeriserbar monomer som har minst en gruppe som kan bli protonert ved sur pH og som blir valgt fra gruppen bestående av aminoalkyl, imidazolyl, isoksazolyl, pyridyl, piperidyl, piperazinyl, pyrazolyl, triazolyl, tetrazolyl, oksadiazolyl, pyridazinyl, pyrimidyl, pyrazinyl, kinolinyl og kinazolinyl, b) fra 0 til omtrent 35 vekt-% av en ikke-ionisk, hydrofll etylenisk umettet, polymeriserbar monomer og c) fra 0 til omtrent 85 vekt-% av en ikke-ionisk, hydrofob etylenisk umettet, polymeriserbar monomer.

Den svakt basiske polymeren omfatter fortrinnsvis tilbakevendende enheter på fra omtrent 20 til omtrent 100 vekt-% av a), fra 0 til omtrent 25 vekt-% av b) og fra 0 til omtrent 80 vekt-% av c).

En mer spesifikk klasse av monomerer nyttige i a) ovenfor er de som er representert ved struktur (I):

hvor R<3> er hydrogen eller metyl, og X er oksy eller imino. I tillegg er R^ en divalent hydrokarbonkoblingsgruppe med fra 1 til 8 karbon- og heteroatomer i kjeden og som omfatter en eller flere alkylengrupper (så som metylen, etylen, n-propylen, isopropylen og n-pentylen), forutsatt at når det ikke er mer enn en alkylengruppe, er de koblet sammen i R^ med en eller flere karbonyl—, oksy—, imino—, ester- eller amidogrupper i en hvilken som helst operabel kombinasjon. Med "operabel kombinasjon" menes at gruppene kan bli kombinert med alkylengruppene i en hvilken som helst kjemisk mulig konfigurasjon, og kan bli anvendt i kombinasjon (koblet til hverandre) i kjemisk mulige

måter (så som oksykarbonyl, karbonamido og andre som er innlysende for fagfolk innenfor dette området). Det er også å bemerke at R^ kan bli avsluttet (eller koblet til R<5>) med en karbonyl-, oksy-, imino-, ester— eller amidogruppe.

r<5> er et cyklisk amin eller en primær, sekundær eller tertiær aminoalkylgruppe, som definert ovenfor, som kan bli protonert ved sur pH.

Eksempler på nyttige type a)-monomerer innbefatter, men er ikke begrenset til, 1-vinylimidazol, 2-metyl-l-vinylimidazol, 2-vinylpyridin, l-hydroksy-6-vinyl-lH-benzotriazol, 2—aminoetylmetakrylathydroklorid, 2-aminoetylakrylathydroklorid, N—(3-aminopropyl)metakrylamid, 2-vinylkinolin, N-(3-imida-zolylpropyljmetakrylamid, N-(2-imidazolyletyl)metakrylamid, N—(3-imidazolylpropyl)akrylamid, N-(l, 1 -dimetyl-3-N-imidazolylpropyl)akrylamid, N-(imidazolylmetyl)akrylamid, 1—vinylpyrrolidinon, 3-(N,N-dimetylamino)propylmetakrylat og syreaddisjonssalter av angitte frie baser.

En klasse med nye monomerer av type a) ifølge oppfinnelsen kan bli anvendt for å fremstille enten homopolymerer eller kopolymerer. Disse monomerene er definert i struktur (II):

hvor R er hydrogen eller metyl. Fortrinnsvis er R metyl. I tillegg er Ri forgrenet eller lineær alkylen med 1 til 3 karbonatomer (så som metylen, etylen, trimetylen eller propylen). Ri er fortrinnsvis alkylen med 2 eller 3 karbonatomer. Mer foretrukket er Ri trimetylen.

Spesielt nyttige monomerer med struktur (II) innbefatter, men er ikke begrenset til, N-(3-imidazolylpropyl)metakrylat, N—(2—imidazolyletyl)metakrylamid, N-(3-imidazolylpropyl)akrylamid, N-( 1,1 -dimetyl-3-N-imidazolylpropyI)akrylamid, N—(imidazolylmetyl)akrylamid og deres syreaddisjonssalter. Av nye monomerer beskrevet heri, er den første forbindelsen mest foretrukket.

Foretrukket type a)-monomerer innbefatter 1-vinylimidazol og N-2-metyl-l-vinylimidazol.

Dersom monomerene av type a) har lav eller ingen vannoppløselighet, kan de også bli polymerisert i form av deres syreaddisjonssalter (så som hydroklorid eller hydrobromid).

Monomerer identifisert som type b)-monomerer er de som er definert heri som "hydrofile", som betyr slike, når homopolymerisert, tilveiebringer homopolymerer som er vannoppløselige ved pH 7 eller over. Slike monomerer har hydrofile grupper så som hydroksy-, amin- (primær, sekundær, tertiær og cyklisk), amid-, sulfonamid- og polyetylenoksygrupper, men det er ikke nødvendig at de omfatter slike grupper dersom den angitte homopolymer vannoppløselighetsparameteren er oppfylt.

Representative monomerer av type b) innbefatter, men er ikke begrenset til, akrylamid, 2-hydroksyetylakrylat, 2,3-dihydroksypropylmetakrylat, poly(etylenoksy)etylmetakrylat (med 2 til 10 etylenoksygrupper) og N,N-dimetylakrylamid. En foretrukket monomer er akrylamid.

Monomerer identifisert som type c)-monomerer er de som er definert heri som "hydrofobe", som betyr de som, når homopolymerisert, tilveiebringer homopolymerer som er vannuoppløselige ved pH 7 eller over, uansett hvilken type utragende gruppene de kan ha.

Representative monomerer av type c) innbefatter, men er ikke begrenset til, metakrylamid, 2-hydroksyetylmetakrylat, N-t-butylmetakrylamid, etylakrylat, metylakrylat, butylakrylat, metylmetakrylat, styren, vinyltoluen og andre vinylaromatiske forbindelser og andre som er innlysende for fagfolk innenfor dette området. En foretrukken monomer er 2-hydroksyetylmetakrylat.

Monomerer av typen a), b) og c) som er nye er generelt lett tilgjengelige fra kommersielle kilder eller kan bli fremstilt ved anvendelse av konvensjonelle prosedyrer og utgangsmaterialer.

De nye monomerene med struktur (II) kan bli dannet generelt ved kondensering av en l-(aminoalkyl)imidazol med en (met)akryloylklorid ved anvendelse av hensiktsmessige betingelser som innlysende for fagfolk innenfor dette området. En representativ fremstilling av en foretrukket monomer er gitt nedenfor for eksemplene. Ytterligere detaljer angående slike monomerer kan bli oppnådd fra dokumentet inngitt av Ponticello et al. med tittel "Weakly Basic Polymerizable Monomers and Polymers Prepared

Therefrom".

Homopolymerene og kopolymerene beskrevet heri kan bli fremstilt ved anvendelse av konvensjonelle oppløsningspolymeriseringsteknikker som er velkjente innenfor fagområdet til tross for at det er visse foretrukne betingelser som er illustrert i fremstillingsmetodene angitt nedenfor for eksemplene. Forholdet til forskjellige monomerer kan bli justert, som kjent for fagfolk, for å tilveiebringe polymerer som er enten vannoppløselige eller vannuoppløselige ved basisk pH, dersom slike polymerer forblir vannoppløselige ved sur pH.

Oppløsningspolymerisasjon innbefatter generelt oppløsning av monomerene i et egnet oppløsningsmiddel (inkludert vann eller forskjellige vannblandbare, organiske oppløsningsmidler) og polymerisering i nærvær av en egnet fri radikalinitiator. Den resulterende polymeren er vannoppløselig ved sur pH og blir følgelig presipitert ved anvendelse av et oppløsningsmiddel så som aceton, renset og på ny oppløst i vann for senere bruk.

Spesielt nyttige polymerer beskrevet heri innbefatter, men er ikke begrenset til poly-[N-(3-imidazolylpropyl)metalcrylamidhydroklorid-ko-alo^lamid],poly-[N-(3-imidazolylpropyl)metakrylamidhydroklorid-ko-2-hydroksyetylmetakrylat], poly-(l-vinylimidazol), poly-(2-aminoetylmetakrylathydroklorid-ko-2-hydroksyetylmetakrylat), poly-( 1 -vinylimidazolhydroklorid-ko-2-hydroksyetylmetakrylat), poly-[N-( 1,1 -dimetyl-3-imidazolylpropyl)akrylamid], poly-(N-2-metyl-l-vinylimidazol) og syreaddisjonssalter av de frie basepolymerene.

I foretrukne utførelsesformer er polymerene som blir anvendt vannuoppløselige ved basisk pH. Slike polymerer blir fremstilt ved anvendelse av type a)-monomerer samt type c)-monomerer, men med begrensende mengder (mindre enn 15 vekt-%) av type b)-monomerer for å forhindre oppløsning av polymeren ved basisk pH. Representative polymerer av denne typen innbefatter, men er ikke begrenset til, poly-[N-(3-imida-zolylpropyl)metakrylamidhydrokloird-co-2-hydroksyetylmetakrylat], poly-(l-vinylimidazol), poly-(2-aminoetylmetaloylathydroklorid-ko-2-hydroksyetylmeta]crylat) og poly-(l -vinylimidazol)hydrokloird-ko-2-hydroksyetylmetakrylat).

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot amplifisering eller deteksjon av en eller flere spesifikke nukleinsyresekvenser til stede i en eller flere målnukleinsyrer frigitt som angitt ovenfor. En mengde målnukleinsyrer kan bli amplifisert og detektert samtidig ved anvendelse av et tilsvarende sett av primere og deteksjonsmetoder for hver spesifikke nukleinsyre. Multiple sekvenser i samme nukleinsyre kan også bli amplifisert og detektert.

Et "PCR-reagens" refererer til hvilke som helst av reagensene generelt betraktet å være nyttig i PCR, dvs. et sett av primere for hver målnukleinsyre, en DNA-polymerase, en DNA-polymerase-kofaktor og to eller flere deoksyribonukleosid-5'-trifosfater (dNTP).

Som angitt heri refererer opptegnelsen "oligonukleotid" når det refereres til primere eller prober, et molekyl omfattende fire eller flere deoksyribonukleotider eller ribonukleotider, og fortrinnsvis mer enn ti. Dets nøyaktige størrelse er ikke kritisk, men avhenger av mange faktorer inkludert anvendelsen eller funksjonen av oligonukleotidet. Oligonukleotidet kan bli avledet ved hjelp av hvilke som helst kjente metoder.

Betegnelsen "primer" refererer til et oligonukleotid, enten naturlig forekommende eller produsert syntetisk som har evne til å virke som et initieringsprodukt for syntesen når plassert under de betingelsene hvor syntese av et primerekstensjonsprodukt komplementært med en nukleinsyretråd (dvs. templat) blir indusert. Slike betingelser innbefatter tilstedeværelse av nukleotider (så som de fire standard deoksyribonukleosid-5'-trifosfater), en DNA-polymerase og en DNA-polymerase-kofaktor og egnet temperatur og.pH. Normalt utgjør slike betingelser det som er kjent som "høy strin-gente" betingelser slik at uspesifikk amplifisering blir minimalisert. Primeren må være lang nok for å initiere syntese av ekstensjonsproduktene i nærvær av DNA-polymerase. Den nøyaktige størrelsen på hver primer vil variere avhengig av den antatte anvendelsen, kompleksisiteten til den målsøkte sekvensen, reaksjonstemperaturen og primerkilden. Generelt vil primerne anvendt i denne oppfinnelsen ha fra 10 til 60 nukleotider.

Primere nyttige heri kan bli oppnådd fra et antall kilder eller fremstilt ved anvendelse av kjente teknikker og utstyr, inkludert f.eks., en ABI DNA Synthesizer (tilgjengelig fra Applied Biosystems) eller en Biosearch 8600 Series eller 8800 Series Synthesizer (tilgjengelig fra Milligen-Biosearch, Inc.) og kjente fremgangsmåter for anvendelse derav (f.eks. som beskrevet i US-A-4.965.188). Naturlig forekommende primere isolert fra biologiske kilder er også nyttige (så som restriksjonsendonukleasespaltninger). Som anvendt heri refererer betegnelsen "primer" også til en blanding av primere. Hvert sett av primere for en gitt målnukleinsyre kan innbefatte to eller flere primere for hver motstående måltråd.

En eller begge primere kan bli merket med samme eller forskjellig markør for deteksjon eller oppfanging av amplifisert produkt. Prosedyrer for kobling av markører og preparering av primere er velkjente innenfor fagområdet, f.eks. som beskrevet av Agrawal et al., Nucleic Acid Res., 14, s. 6227-45 (1986), US-A-^.914.210 (Levenson et al.) vedrørende biotinmarkører, US—A—4.962.029 (Levenson et al.) vedrørende enzymmarkører og referansene angitt deri. Nyttige markører innbefatter også radioisotoper, elektron-tette reagenser, kromogener, fluorogener, fosforescensdeler, ferritin og andre magnetiske partikler (se US—A—4.795.698 til Owen et al. og US—A-^4.920.061 til Poyton et al.), kjemiluminescensdeler (så som luminol) og andre spesifikt bindende arter (avidin, streptavidin, biotin, sukkere eller lectiner). Foretrukne markører er enzymer, radioisotoper og spesifikke bindingsarter (så som biotin). Nyttige enzymer innbefatter, glukoseoksydase, peroksydaser, urikase, alkalisk fosfatase og andre som er kjent innenfor fagområdet og som kan bli koblet til oligonukleotider ved anvendelse av kjente prosedyrer. Reagenser for å tilveiebringe et kolorimetrisk eller kjemiluminescerende signal med slike enzymer er velkjent.

Når markøren er et enzym så som en peroksydase, blir det ved et visst punkt i analysen tilsatt hydrogenperoksyd og egnede farge-dannende sammensetninger for å tilveiebringe et detekterbart fargestoff. Nyttige farge-tilveiebringende reagenser innbefatter tetrametylbenzidin og derivater derav, og leuco-fargestoffer, så som vannuoppløselige triarylimidazol-leuco-fargestoffer (som beskrevet i US—A—4.089.747 til Bruschi) eller andre forbindelser som reagerer for å tilveiebringe et fargestoff i nærvær av peroksydase og hydrogenperoksyd. Spesielt nyttige farge-tilveiebringende sammensetninger er beskrevet i EP-A-0.308.236 (publisert 22. mars 1989). Kjemiluminescenssignaler gir respons til en peroksydasemarkør kan også bli dannet ved anvendelse av hensiktsmessige reagenser.

Hvis en eller begge primere blir biotinylert, kan den amplifiserte nukleinsyren bli detektert ved anvendelse av detekterbart, merket avidin eller en ekvivalent derav (så som streptavidin). F.eks. kan avidin bli konjugert med et enzym, eller ha en radioisotop ved anvendelse av kjent teknologi. Biotin på det amplifiserte produktet kompleksdannes med avidin og hensiktsmessig deteksjonsteknikker for å detektere et radioaktivt, kolorimetrisk eller kjemiluminescerende signal blir anvendt.

Som anvendt heri, er en oppfangings-"probe" et oligonukleotid som er vesentlig komplementært med en nukleinsyresekvens til en eller flere tråder av målnukleinsyren som blir anvendt for å desolubilisere den amplifiserte nukleinsyren. Probe-oligonukleotidet blir generelt koblet til et egnet vannuoppløselig substrat så som polymeriske eller glasskuler, mikrotiter-platebrønn, tynn polymerisert eller cellulosefilm eller andre materialer som er innlysende for fagfolk innenfor dette området. Oligonukleotidet er generelt fra omtrent 12 til omtrent 40 nukleotider i lengde til tross for at lengden ikke er kritisk.

En DNA-polymerase er et enzym som vil tilsettes deoksynukleosidmonofosfat-molekyler til 3-hydroksyenden av primeren i et kompleks av primer og templat, men denne tilsetningen er på en templatavhengig måte (dvs. avhengig av spesifikke nukleotider i templatet). Mange nyttige DNA-polymeraser er kjent innenfor fagområdet. Polymerasen er fortrinnsvis "termostabil" som betyr at den er stabil overfor varme, spesielt høye temperaturer anvendt for denaturering av DNA-tråder. Den termostabile DNA-polymerasen er videre ikke vesentlig inaktivert ved de høye temperaturene anvendt i PCR som beskrevet heri.

Et antall termostabile DNA-polymeraser er blitt rapportert innenfor dette området, inkludert de som er nevnt i detalj i US—A—4.965.188 (angitt ovenfor) og US—A—4.889.818 (Gelfand al.), inkorporert heri som referanse. Spesielt nyttige polymeraser er de som blir oppnådd fra forskjellige Thermus bakterielle arter, så som Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus filiformis eller Thermus flavus. Andre nyttige termostabile polymeraser blir oppnådd fra forskjellige andre mikrobielle kilder inkludert Thermococcus literalis, Pyrococcus furiosus, Thermotoga sp. og de som er beskrevet i WO-A-89/06691 (publisert 27. juli 1989). Noen nyttige polymeraser er kommersielt tilgjengelig. Et antall teknikker er kjent for isolering av naturlig-forekommende polymeraser fra organismer og for produsering av genetiske omkonstruerte enzymer ved anvendelse av rekombinante teknikker som angitt i fagområdet sitert i dette avsnittet.

En DNA-polymerase-kofaktor refererer til en ikke-proteinforbindelse som enzymet er avhengig av for aktivitet. Et antall slike materialer er kjente kofaktorer innbefattende mangan og magnesiumsalter. Nyttige kofaktorer innbefatter, men er ikke begrenset til, mangan og mangesiumklorider, sulfater, acetater og fettsyresalter (f.eks. smørsyre—, kapronsyre—, kaprylsyre—, kaprinsyre— og laurinsyresalter). Mindre salter, dvs. klorider, sulfater og acetater er foretrukket.

Også nødvendig for PCR er to eller flere deoksyribonukleotid-5'-trifosfater, så som dATP, dCTP, dGTP, dUTP eller dTTP. dATP, dCTP, dGTP og dTTP blir alle anvendt i PCR. Analoger så som dITP og 77-deaza-dGTP er også nyttige.

Også nyttig for utøvelse av oppfinnelsen er et antistoff spesifikt for DNA-polymerase og antistoffet inhiberer den enzymatiske aktiviteten ved temperaturer under omtrent 50°C, men antistoffet blir deaktivert ved høyere temperaturer. Representative monoklonale antistoffer med disse egenskapene er beskrevet i US—A~5.338.671 (inngitt 7. oktober 1992 av Scalice et al.), inkorporert heri som referanse. Antistoff-rfagmentet kan bli anvendt istedenfor det hele molekylet dersom de har tilsvarende egenskaper.

PCR-reagenser beskrevet heri er tilveiebrakt og anvendt i PCR i egnede konsentrasjoner for å tilveiebringe amplifisering av målnukleinsyren. De minimale mengdene av DNA-polymerase er generelt minst omtrent 1 enhet/100 ul oppløsning, med fra omtrent 4 til 25 enheter/100 ul er foretrukket. En "enhet" er definert heri som mengden av enzymaktivitet nødvendig for å inkorporere 10 nmol av totale nukleotider (dNTP) inn i en utragende nukleinsyrekjede i 30 minutter ved 74°C. Konsentrasjon av hver primer er minst omtrent 0,075 umolar, idet fra omtrent 0,2 til omtrent 1 umolar er foretrukket. Alle primerene er til stede i omtrent samme mengde (innenfor en variasjon med 10% av hver). Kofaktoren er generelt til stede i en mengde på fra omtrent 1 til omtrent 15 mmolar, og hver dNTP er generelt til stede i fra omtrent 0,1 til omtrent 3,5 mmolar i reaksjonsblandingen. Som anvendt i denne paragrafen refererer "omtrent" til en variasjon på ±10% av angitt verdi.

PCR-reagensene kan bli tilført individuelt, eller i en bufret oppløsning med en pH i området på fra omtrent 7 til omtrent 9 ved anvendelse av en hvilken som helst egnet buffer.

På grunn av at målnukleinsyren som skal bli amplifisert og detektert vanligvis er i dobbelttrådet form, må de to trådene bli separert (dvs. denaturert) før primingen kan foregå. Dette kan foregå i løpet av ekstraheringsprosessen, men foregår fortrinnsvis i et separat trinn deretter. Oppvarming til en egnet temperatur (identifisert som "første temperatur" eller T\ heri) er en foretrukket metode for denaturering. Denne første temperaturen er generelt i området på fra omtrent 85 til omtrent 100°C i egnet tid, f.eks. fra 1 til omtrent 240 sekunder (fortrinnsvis 1 til omtrent 40 sekunder). Dette innledende denatureringstrinnet kan også bli innbefattet i den første amplifiseringscyklusen. I slike tilfeller kan denatureringen være lenger i den første cyklusen (f.eks. opptil 240 sekunder) mens de senere cyklusene kan ha mye kortere denatureirngstrinn (f.eks. opptil

30 sekunder).

Denaturerte trader blir deretter primet med hensiktsmessig sett av primere ved avkjøling av reaksjonsblandingen til en andre temperatur, T2, som generelt er innenfor området på fra omtrent 55 til omtrent 70°C. Det er ønskelig at avkjølingen blir utført så hurtig som mulig, men med det for tiden kjente utstyret, foregår det vanligvis over en tidsperiode på fra omtrent 5 til omtrent 40 sekunder, og mer foretrukket fra omtrent 5 til omtrent 20 sekunder.

Når de denaturerte trådene er avkjølt, blir reaksjonsblandingen inneholdende PCR-reagensene inkubert ved en tredje temperatur, T3, generelt fra 1 til omtrent 120 sekunder og fortrinnsvis fra 1 til omtrent 80 sekunder for å tilveiebringe dannelse av primerekstensjonsprodukter. Generelt er den tredje temperatur innenfor området på fra omtrent 55 til omtrent 74°C. Den er fortrinnsvis innenfor området på fra omtrent 62 til omtrent 70°C.

I en mest foretrukket utførelsesform er andre og tredje temperaturer de samme og hører inn under området på fra omtrent 62 til omtrent 70°C. Priming og primerekstensjon blir generelt utført i samme trinn.

En amplifiseringscyklus omfatter følgelig denaturering, priming (eller sammensmelting) og primerekstensjonstrinn beskrevet ovenfor. Generelt blir minst 15 av slike amplifiseringscykluser utført ved utførelse av denne oppfinnelsen, idet det maksimale antallet cykluser bestemmes av den bestemte anvenderen. I de fleste tilfellene blir 15 til 50 amplifiseringscykluser anvendt i fremgangsmåten, idet 15 til 40 cykluser er foretrukket. Hver amplifiseirngscyklus er generelt fra omtrent 20 til omtrent 360 sekunder, med en cyklustid på fra omtrent 30 til omtrent 120 sekunder er foretrukket og fra omtrent 30 til omtrent 90 sekunder er mer foretrukket. Lengre eller kortere cyklustider kan bli anvendt, om ønskelig.

Når anvendt i forhold til tid for et gitt trinn i amplifiseringsprosedyren, refererer betegnelsen "omtrent" til ±10% av den tidsgrensen. Når anvendt med referanse til temperatur, angir "omtrent" ±5°C.

Amplifiseringsmetoden ifølge denne oppfinnelsen blir fortrinnsvis utført på en kontinuerlig, automatisert måte slik at reaksjonsblandingen blir temperaturcyklisert på en kontrollert måte i et ønsket antall ganger. Et antall instrumenter er blitt utviklet for dette formålet, som kjent for fagfolk. Instrumentet som blir anvendt, vil altså fortrinnsvis bli programmert for både primære og sekundære amplifiseringscykluser.

Et slikt instrument for dette formålet er beskrevet i detalj i US—A—4.965.188 og EP-A-0.236.069. Dette instrumentet inneholder generelt en varmeledende beholder for å holde et antall reaksjonsrør inneholdende reaksjonsblandingen, et middel for oppvarming, avkjøling og temperaturopprettholdelse, og en computerinnretning for å danne signaler for å kontrollere amplifiseringssekvensen, forandringer i temperatur og tidsbestemmelse.

EP-A-0.402.994 tilveiebringer detaljer for nyttige kjemiske testpakker som kan bli bearbeidet ved anvendelse av instrumentet beskrevet i US-A-5.089.233 (Devaney, jr. et al.), inkorporert heri som referanse. Også beskrevet deri er midler for oppvarming og avkjøling av testpakken ved gjentatte intervaller (dvs. gjennom cykluser) hensiktsmessige for fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse. Ytterligere detaljer med hensyn på nyttig PCR-prosesseringsutstyr kan bli oppnådd ut fra litteraturen i fagområdet, og er generelt kjent av fagfolk innenfor dette området.

Bortsett fra kjemiske testpakker beskrevet ovenfor, kan fremgangsmåten bli utført i andre beholdere så som de som er beskrevet i detalj i US-A-4.902.624 (Columbus et al.), US-A-5.173.260 (Zander et al) og US-A-5.229.297 (Schnipelsky et al.) og alle er inkorporert heri som referanse, og hvilke som helst andre egnede beholdere som er kjent for fagfolk kan også bli anvendt.

Slike testpakker er også kjent som selv-innbefattende testinnretninger som har separate rom for forskjellige reagenser anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Rommene er hensiktsmessig satt sammen slik at reagenser og analyseoppløsninger kan bli brakt i kontakt med oppfangingsreagenset ved hensiktsmessige tidspunkter uten å åpne innretningen.

Deteksjon av amplifiserte produkter kan bli oppnådd ved anvendelse av hvilke som helst andre kjente prosedyrer, inkludert Southern-blott-teknikker, som beskrevet i US—A—4.965.188 (angitt ovenfor) eller ved anvendelse merkede prober eller primere, som kjent innenfor fagområdet.

Alternativt til utførelsesforrnene beskrevet ovenfor kan de amplifiserte produktene bli detektert ved anvendelse av et merket oligonukleotid som er komplementært ved en av primerekstensjonsproduktene.

I de heterogene deteksjonssystemene ifølge oppfinnelsen blir de amplifiserte produktene oppfanget på et vannuoppløselig substrat og de andre materialene i reaksjonsblandingen blir fjernet på en egnet måte, så som ved filtrering, sentrifugering, vasking eller en annen separeringsteknikk.

Oppfangingsprober kan bli koblet til vannuoppløselige bærere ved anvendelse av kjente koblingsteknikker (inkludert absorpsjon og kovalente reaksjoner). En slik teknikk er beskrevet i EP—A—0.439.222 (publisert 18. september 1991). Andre teknikker er f.eks. beskrevet i US-A—4.713.326 (Dattagupta et al.), US-A-4.914.210 (Levenson et al.) og EP—B—0.070.687 (publisert 26. januar 1983). Nyttige separeringsmidler innbefatter filtrering gjennom membraner så som polyamidmikroporøse membraner som er kommersielt tilgjengelige fra Pall Corporation.

En hvilken som helst nyttig fast bærer kan derimot bli anvendt for å forankre oppfangingsproben og eventuell hybridiseringsprodukt, inkludert mikrotiterskåler, reagensrør, beholdere, magnetiske eller polymere partikler, metaller, keramiske forbindelser og glassull for å nevne noen. Spesielt viktige materialer er magnetiske eller polymeriske partikler med reaktive grupper nyttige for kovalent kobling av oppfangingsproben. Slike partikler er generelt fra omtrent 0,001 til omtrent 10 umeter. Ytterligere detaljer eller eksempler på slike materialer er angitt i US—A—4.997.772 (Sutton et al.), US-A—5.147.777 (Sutton et al), US-A-5.155.166 (Danielson et al) og US—A—4,795.698 (Owen et al), som alle er inkorporert heri som referanse.

Oppfangingsproben kan bli koblet til en flat bærer så som en polymerisk film, membraner, filterpapirer eller harpiks-belagt eller ubelagt papir. Oppfangingsproben koblet til polymere partikler kan også bli immobilisert på slike flate bærere på en egnet måte, f.eks. som tørkede deponeringer, eller adherert ved varmefusjon eller med adhesiver. Oppfangingsproben kan f.eks. bli koblet til en flat bærer i den selv-inneholdende testretningen ifølge oppfinnelsen. Andre detaljer angående slike materialer er gitt i EP-A-0.408.738 (publisert 23. januar 1991), WO 92/16659 (publisert 1. oktober 1992) og US-A-5.173.260 (Sutton et al.).

Oppfangingsprobene kan bli arrangert på en egnet bærer i en hvilken som helst konfigurasjon på f.eks. rader med runde deponeringer eller striper.

Foreliggende oppfinnelse kan også bli anvendt i det som er kjent som "homogene"

amplifiseringsprosedyrer hvor målnukleinsyrene blir detektert uten at det er behov for oppfangingsreagenser. Detaljer angående slike analyser er kjent innenfor fagområdet, så som i EP-A-0.487.218 (publisert 27. mai 1992) og EP-A-0.512.334 (publisert 11. november 1992).

AmpUfiseirngsreaksjonssammensetningen kan bli innbefattet som en individuell pakkekomponent i et forsøkssett nyttig for forskjellige amplifiseringsanalyser. Settet kan innbefatte andre reagenser, oppløsninger, utstyr og instruksjoner nyttige i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, inkludert oppfangingsreagenser immobilisert på et vannuoppløselig substrat, vaskeoppløsninger, lyseringsoppløsninger, detek-sjonsreagenser og andre materialer som er innlysende for fagfolk innenfor dette området. I tillegg kan forsøkssettet innbefatte en separat pakket svakt basisk polymer som beskrevet ovenfor, buffere, svake eller sterke baser og andre reagenser nødvendig for enten eller både amplifisering og prøvepreparering. Forsøkssettet kan også innbefatte en forsøksinnretning inneholdende en eller flere andre sett komponenter. Denne forsøksinnretningen er fortrinnsvis "selv-innbefattende" i den betydningen som er kjent innenfor dette området. Andre sett kan innbefatte svakt basisk polymer beskrevet heri og en eller flere reagenser (så som deteksjons- eller oppfangingsprober) anvendt i hybridiseringsanalyser.

Alle prosentandelene er i vekt dersom ikke annet er angitt.

Materialer og fremgangsmåter som eksempler:

Fremstillin<g> av N-( 3- imidazolylpropyl)- metakrvlamid:

Denne fremgangsmåten viser fremstilling av en ny monomer med struktur (I), identifisert ovenfor, men preparatet er representativt for hvordan andre monomerer innenfor rammen av denne oppfinnelsen lett kan bli fremstilt.

En oppløsningsmiddelblanding ble fremstilt ved blanding av vann (100 ml) inneholdende natriumhydroksyd (12,8 g, 0,32 mol) og diklormetan (200 ml) inneholdende l-(3-aminopropyl)imidazol (37,5 g, 0,3 mol) og avkjølt i et isbad. Til denne avkjølte blandingen ble det tilsatt alt i ett, metakryloylklorid (34,8 g, 0,3 mol) i diklormetan (100 ml) med omfattende omrøring under en nitrogenatmosfære. Varme ble utviklet idet temperaturen på blandingen ble økt til omtrent 60°C, og blandingen ble omfattende omrørt i ytterligere 10 minutter, og deretter ble det organiske laget separert. Vannlaget ble ekstrahert to ganger med diklormetan (100 ml hver gang). Den kombinerte, organiske oppløsningen (organisk oppløsningsmiddellag og ekstrakter) ble vasket med mettet natriumklorid (100 ml), tørket over vannfri natriumsulfat, filtrert og oppløsningsmidlet ble fjernet. Resten ble løst opp i kloroform (50 ml), etterfulgt av tilsetning av etyleter (50 ml) til sløringspunktet.

Det resulterende reaksjonsproduktet krystalliserte til omtrent 0°C og ble filtrert for å tilveiebringe et hvitt, fast stoff som har et smeltepunkt på 45-46°C. Utbyttet var 70%.

Analytiske data innbefatter: m/e (M-l93),

<1>H-NMR (DMSO-d6): 1,8 (m, 2H, C-CH2-C, CH3), 3,02 (m, 2H, N-CH2), 3,95 (t,

2H, im-CH2), 5,25 og 5,6 (AB, 2H, vinyl-CH2), 6,82 og 7,15 (AB, 2H, 4,5-H av im), 7,6 (s, 1H, 2-H av im), 7,95 (m, 1H, NH).

Fremstilling av homopolymer:

En foretrukket homopolymer fremstilt fra en ny monomer beskrevet heri ble fremstilt ved tilsetning av 2,2'-azobis-(2-metylpropionitril) (300 mg) til en oppløsning av N-(3-imidazolylpropyl)metakrylamid (12,5 g, 0,065 mol) i vann (90 ml) og isopropanol (10 ml), opprettholdt under en nitrogenatmosfære. Den resulterende oppløsningen ble oppvarmet, mens den ble omrørt, til 65-70°C i et vannbad i 3 timer. Etter omtrent 1,5 timer ble konsentrert HC1 (3 ml) tilsatt og omrøringen ble fortsatt under nitrogen i den gjenværende tiden. Oppløsningen ble deretter konsentrert på en roterende avdamper til omtrent 25 ml, og det resulterende polymerproduktet ble presipitert i aceton (over 4 liter), filtrert og oppløst i deionisert vann (80 ml). Oppløsningen inneholdt 12% faste stoffer.

Fremstilling av første kopolvmer: Poly-[N-(3-imidazolylpropyl)metala-ylamidhydroklorid-ko-akrylamid] (90:10 vektforhold) ble fremstilt ved tilsetning av 2,2'-azobis-(2-metylpropionitril) (400 mg) til en oppløsning av N-(3-imidazolylpropyl)metakrylamid (18 g, 0,09 mol) og akrylamid (2 g, 0,028 mol) i deionisert vann (120 ml) og isopropanol (15 ml), opprettholdt under en nitrogenatmosfære. Oppløsningen ble oppvarmet til 65-70°C med omrøring i 4 timer, etterfulgt av tilsetning av fortynnet HCI for å redusere pH til omtrent 2. Omrøring og oppvarming ble fortsatt i ytterligere en time, og oppløsningen ble deretter latt nå romtemperatur over natt.

Oppløsningen ble konsentrert til omtrent 75 ml ved anvendelse av en roterende avdamper, og den resulterende polymeren ble presipitert i aceton (omtrent 4 liter), filtrert og oppløst i deionisert vann (150 ml). Ytterligere konsentrering til omtrent 125 ml ble utført for å fjerne gjenværende aceton. Polymeren var til stede som 15,5% faste stoffer.

Fremstilling av andre ko<p>olvmer: Poly-[2-aminoetylmetakiylathydroklorid-ko-2-hydroksyetymietakrylat] (20:80 vektforhold) ble fremstilt ved tilsetning av 2,2l<->azobis-(2-metylpropionitril) (400 mg) til en oppløsning av 2-aminoetylmetakrylathydroklorid (4 g, 0,02 mol) og 2-hydroksyetylmetakrylat (16 g, 0,12 mol) i deionisert vann (180 ml) og etanol (20 ml), opprettholdt under en nitrogenatmosfære. Oppløsningen ble oppvarmet til 65-70°C med omrøring i 4 timer. Omrøring og oppvarming ble fortsatt i ytterligere en time, og oppløsningen ble deretter latt nå romtemperatur over natt.

Den resulterende polymeren ble presipitert i aceton (omtrent 4 liter), filtrert og oppløst i deionisert vann (150 ml). Ytterligere konsentrering til omtrent 125 ml ble utført for å fjerne gjenværende aceton. Polymeren var til stede i 5,6% faste stoffer.

Fremstilling av tredje ko<p>olvmer: PoIy-[l-vinylimidazol-ko-2-hydroksyetyImetakryIat] (50:50 vektforhold) ble fremstilt ved tilsetning av 2,2l<->azobis-(2-metylpropionitril) (350 mg) til en oppløsning av 1-vinylimidazol (10 g, 0,1 mol) og 2-hydroksyetylmetakrylat (10 g, 0,077 mol) i N,N-dimetylformamid (160 ml), opprettholdt under en nitrogenatmosfære. Oppløsningen ble oppvarmet til 65-70°C med omrøring i 7 timer.

Etter at dette stod ved romtemperatur over natt, ble polymeren presipitert i aceton (omtrent 4 liter), filtrert og oppløst i deionisert vann (200 ml) inneholdende konsentrert HC1 (8,5 ml). Ytterligere konsentrering ble utført for å fjerne gjenværende aceton. Polymeren var til stede som 12,4% faste stoffer.

Fremstillin<g> av fjerde kopolvmer: Poly-(l-vinylimidazol-ko-2-hydroksyetylmetakrylat) (25:75 vektforhold) ble fremstilt på en lignende måte som "tredje kopolymer". Den resulterende oppløsningen inneholdt 13,7% faste stoffer.

Rekombinant DNA-polymerase fra Thermus aquaticus ble fremstilt ved anvendelse av konvensjonelle metoder og hadde en aktivitet på omtrent 250.000 enheter/mg protein. Følgende primere og prober ble dannet ved anvendelse av kjente utgangsmaterialer og prosedyrer ved anvendelse Applied Biosystems modell 380B DNA-syntetisator og standard fosforamidittkjemi og ABI1 umolar skala, fast cyklusprotokoll. Nukleosid-3'-fosforamiditter og nukleosidderivatiserte, kontrollerte poreglassbærere ble oppnådd fra Applied Biosystems.

Primere og prober komplementære med hovedkapsidproteinregionen til humant cytomegaloviralt DNA var som følger:

Primer og prober komplementære med 65 kD antigenregionen til Mycobacterium tuberculosis DNA var som følger:

Primere og prober komplementære med gag-regionen til HIVl-proviralt DNA var som følger:

I primersekvensene representerer X en biotinfosforamidittdel (fra DuPont) koblet til sekvensen gjennom to tetraetylenglykol-spacerenheter ved anvendelse det som blir beskrevet i US—A—■4.914.210 (Levenson et al.), inkorporert heri som referanse. Alle rensningene ble utført ved anvendelse av en nukleinsyrerensningskolonne, etterfulgt av revers fase HPLC-teknikker.

Oppfangingsprobesekvenser Y inneholder to tetraetylenglykolspacere koblet av en fosfatbinding, og en 3-amino-l,2-propandioldel fremstilt ved anvendelse av prosedyrene til Levenson et al.-patentet angitt ovenfor.

Lav kopi HIVI målproviralt DNA ble ekstrahert fra 8E5/LAV-cellelinjen (inneholder en enkelt integrert kopi av HTV-I-genomet) ved anvendelse av konvensjonelle prosedyrer. Etter cellelysering og proteinspaltning ble nukleinsyre renset ved fenol/kloroform-ekstrahering: tris-mettet fenol (750 ul) ble tilsatt til cellesuspensjonen, og fenol/lysatoppløsningene ble dannet og separert ved sentrifugering. Den vandige fasen ble deretter overført til et nytt 2 ml-rør. Denne prosedyren ble gjentatt ved anvendelse av kloroformisoamylalkohol. Det vandige laget ble brakt til 0,3 molar med natriumacetat. Nukleinsyre ble presipitert ved tilsetning av 95% kald etanol og lagret ved —70°C i 1 time. Konsentrasjonen av HIVl-proviralt DNA ble deretter bestemt A260°g seriefortynninger med varierende kopiantall ble dannet i "TE"-buffer [tris-(hydroksymetyl)aminometan (1 mmolar) og (etylendinitrilo)tetraeddiksyre (0,1 mmolar)] for anvendelse i eksperimentene. Prøve (5-10 ul) ble tilsatt til DNA-oppløsningen for fange inn.

KontroU-hCMV-stamme AD169 (ATCC VR538) ble propagert i MRC-5 (ATCC

CCL171) celler helt til karakteristisk cytopatisk effekt fremkom i >90% av monolaget. Cellekulturvæsken ble høstet, 20% sluttvolum føtalt bovimserum ble tilsatt og cellene ble pelletert. Supematanten inneholdende fri virus ble frosset ved —80°C. For kontroll-DNA-amplifiseringer ble 1:10 seriefortynninger av dette stampreparatet dannet i bufferoppløsning [tris(hydroksymetyl)aminometan (10 mmolar, pH 8) og TWEEN^<M >20 ikke-ionisk, overflateaktivt middel (0,5%)]. Seriefortynninger ble deretter kokt i 5 minutter for å lysere viralpartiklene og alikvoter av disse prøvene ble tilsatt til PCR-reaksjonsblandingen.

Mycobacterium tuberculosis DNA ble oppnådd ved fortynning av dyrket M. tuberculosis, en avirulent stamme H37Ra (ATCC 25177), til samme turbiditet som en MacFarland #1 standard. Dette tilsvarer omtrent 3x10* kolonidannende enheter/ml ;(cfu). Den DNA-ampliifseringer ble 1:10 seriefortynninger av dette stampreparatet dannet i bufferoppløsning identifisert ovenfor. Seriefortynninger ble deretter kokt i 30 minutter for å lysere bakterien. Et nivå av målnukleinsyre tilsvarende 1,8 x IO-* cfu ble anvendt i hver 300 ul reaksjonsblanding.

Kliniske prøver for eksempel 3 ble oppnådd fra dr. Gregory J. Buffone ved Baylor College of Medicine, Texas Children's Hospital (Houston, Texas). Disse prøvene var tidligere blitt bestemt å være enten hCMV-DNA "kultur-positive" eller "kultur-negative". Kultur-positive prøver ble ytterligere registrert ifølge tidslengden nødvendig for kultur-positive resultater å bli observert visuelt (prøver som er visuelt positive ved tidligere tidspunkter blir generelt antatt å inneholde flere dyrkbare virus).

Deoksyribonukleotider (dNTP), tris(hydroksymetyl)aminometan-buffer og lyofilisert kalvethymus-DNA ble oppnådd fra Sigma Chemical Co.

ZONYL<TM> FSP anionisk ftuorinert fosfatester-overflateaktivt middel ble oppnådd fra DuPont.

TWEEN™ 20 ikke-ionisk, overflateaktivt middel ble oppnådd fra ICI Americas, Inc.

Det monoklonale antistoffet spesifikt for den angitte DNA-polymerasen ble fremstilt som beskrevet i US-A-5.338.671 (angitt ovenfor).

En streptavidin-peroksydase konjugert oppløsning omfattende et kommersielt tilgjengelig (Zymed Laboratories, Inc.) konjugat av streptavidin og pepperrot-peroksydase (131 ng/ml), kasein (0,5%), 4'-hydroksyacetanilid (10 mmolar) og mertiolat (0,5%) i fosfatbufret saltvannsoppløsning (25 mmolar natriumfosfat og 75 mmol natriumklorid). Den endelige konjugatkonsentrasjonen var 312 ng/ml.

En vaskeoppløsning (pH 7,4) inneholdt natriumfosfat, monobasisk 1-hydrat (25 mmolar), natriumklorid (373 mmolar), (etylendinitrilo)tetraeddiksyre-dinatriumsalt (2,5 mmolar), etylmerkuirtiosalicylsyre-natriumsalt (25 umolar) og decylnatirumsulfat (38 mmolar).

Farge-tilveiebringende sammensetning (pH 6,8) inneholdt 4,5-bis-(4-dimetylaminofenyl)-2-(4-hydroksy-3-metoksyfenyl)imidazol-leuko-fargestoff (250 smolar), polyfvinylpyrrolidon) (112 mmolar), hydrogenperoksyd (0,03%), dietylentriaminpentaeddiksyre (100 umolar), 3,-klor-4,-hydroksyacetamlid (5 mmolar)

og natriumfosfat, monobasisk, 1-hydrat (10 mmolar).

Det vandige farge-stoffsignal-stopp-oppløsningen inneholdt natriumazid (0,1%).

Oppfangingsreagenser ble preparert ved kobling av SEK ID NR. 3, SEK ID NR. 6 eller SEK ID NR. 9 oligonukleotid identifisert ovenfor til partikler av poly[styren-ko-3-(p-vinylbenzyltio)propionsyre] (95:5 vektforhold,, 1 um gjennomsnittlig diameter) på følgende måte. En suspensjon av partiklene i vann ble vasket to ganger med 2-(N-morfolino)etansulfonsyrebuffer (0,1 molar, pH 6) og suspendert til omtrent 10% faste stoffer. En prøve (3,3 ml) av de vaskede partiklene, fortynnet til 3,33% faste stoffer i bufferen (0,1 molar), ble blandet med l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etyIkarbodiimid-hydroklorid (2,1 ml av 84 mg/ml vann) og hensiktsmessig probe (22 ul av 44,44 OD/ml nanorent vann). Den resulterende suspensjonen ble oppvarmet ved 50°C i et vannbad i omtrent 2 timer med røring av og til og sentrifugert. Partiklene ble vasket tre ganger med tris(hydroksymetyl)aminometanbuffer (0,01 molar, pH 8) inneholdende (etylendinitrilo)tetraeddiksyre-dinatriumsalt (0,001 molar) og resuspendert deri til 4% faste stoffer.

En PCR-reaksjonsblanding (100 ml) innbefattet tris(hydroksy-metyl)aminometanhydrokloirdbuffer (10 mmolar, pH 8), kaliumklorid (50 mmolar), magnesiumklorid (10 mmolar), gelatin (0,01%), dATP, dCTP, dGTP og dTTP (1,5 mmolar av hver i eksemplene 2 og 3 og 1,0 mmolar av hver i eksempel 4), glycerol (9,5%), primere (0,4 umolar av hver dersom ikke annet er angitt), DNA-polymerase identifisert ovenfor (16 enheter/100 ul), et monoklonalt antistoff spesifikt for DNA-polymerase identifisert ovenfor (50:1 molart forhold til DNA-polymerase, i eksemplene 2 og 4).

Amplifisering ved PCR ble utført i eksempel 2 nedenfor ved anvendelse av engangskjemiske testpakker eller innretninger som inneholdt rom for individuelle reagenser og oppløsning. Disse rommene og innretningene ble dannet fra et polyesterlag (0,01 cm tykkelse) belagt med polyetylen (SCOTCH PAK™ fra 3M Co.), foldet over for å tilveiebringe et sirkulært rom omtrent 1,3 cm i diameter. En åpning ble tilveiebrakt for å muliggjøre tilsetning av PCR-reagensblandingen som ble trukket inn i kammer ved hjelp av vakuum. Åpningen ble deretter varmeforseglet. Etter amplifisering ble et hjørne av rommet kuttet, og reaksjonsblandingen inneholdende produktene ble overført til et

mikrofugerør (0,5 ml) for lagring ved 4°C helt til deteksjon av produktene ble utført. PCR-protokollen ble utført ved anvendelse en konvensjonell automatisert

PCR-prosessor som er beskrevet i detalj i US-A-5.089.233, inkorporert heri som referanse.

Amplifisering i eksemplene 3 og 4 ble utført i 0,2 ml MICROAM<pTM_>era]csjonsrør ve(j anvendelse en konvensjonell Perkin Eimer GENEAMP™ PCR System 9600-termocykler.

PCR-amplifiseringsprotokollene er beskrevet nedenfor i de respektive eksemplene.

SURECELL^<M->testinnretningene ble anvendt for å detektere amplifiseringsprodukter. Disse innretningene er tilgjengelige fra Eastman Kodak Company (Clinical Diagnostics Division) og inneholder tre forsøksbrønner, hver med en plassert LOPRODYNE<TM >mikroporøs membran (Pall Corp., 5 umeter gjennomsnittlig porestørrelse). Ved fortynning til 0,25% ble hvert oppfangingsreagens (1,2 pl) fjernet og tørket i definerte regioner av membranene i forsøksbrønnene til forsøksinnretningene. Disse forsøksinnretningene er beskrevet i US-A-4.948.561 (Hinckley et al.), inkorporert heri som referanse.

Deteksjon ble utført på følgende måte. En porsjon (5 ul) av den endelige amplifiseringsreaksjonsblandingen ble blandet med en bufferoppløsning [tris(hydroksymetyl)aminometan (10 mmolar, pH 8), kaliumklorid (50 mmolar), magnesiumklorid (10 mmolar) og gelatin (0,01%)] (95 ul) og inkubert ved 95°C i 5 minutter for å denaturere nukleinsyrene. Den resulterende oppløsningen ble deretter overført til SURECELLTM.forsøicsinnretninger slik at amplifiserte målnukleinsyrer kunne bli hybridisert til oppfangingsprobene ved 50°C.

Forsøksbrønnene til forsøksinnretningene ble deretter vasket ved 55°C med en bufferoppløsning [natriumdihydrogenfosfat (10 mmolar), natriumklorid (150 mmolar), natriumdecylsulfat (1%) og etylendiamintetraeddiksyre (1 mmolar)] (250 ul, pH 7,4). Streptavidin-peroksydase-konjugatoppløsningen (50 ul) ble tilsatt til hver forsøksbrønn og latt strømme gjennom membraner ved romtemperatur. Etter 2 minutter ble forsøks-brønnene vasket for andre gang.

Farge-tilveiebringende sammensetning (100 ul) ble deretter applisert på hver forsøksbrønn, etterfulgt av inkubasjon ved romtemperatur i 2 minutter. Fargestopp-oppløsningen (100 ul) ble deretter tilsatt til hver forsøksbrønn for å stoppe fargeutviklingen, og det resulterende fargesignalet ble visuelt gradert på en tetthetsskala på 0 til 10 (høyest tetthet). Bakgrunnsavlesningene ble oppnådd fra regionene på membraner hvor det ikke var deponert oppfangingsreagens.

Gelelektroforese ble utført ved tilsetning av amplifiseringsproduktblanding (6,75 ul) til agarosegeler (2,5%) som var blitt på forhånd farget med etidiumbromid (0,4 mg/ml sluttkonsentrasjon). Gelene ble elektroforert ved omtrent 8 volt/cm i omtrent 1 time ved anvendelse av elektroforesebuffer (600 ml) inneholdende etidiumbromid (0,4 mg/ml sluttkonsentrasjon). Bufferen var en blanding av tris(hydroksymetyl)aminometan, borat og etylendiamintetraeddiksyre. De resulterende båndene ble sammenlignet med konvensjonelle molekylvektsmarkører og produktbåndintensitet ble registrert (115-mer for HIVI og 383-mer for M. tuberculosis) på en 0 til 5 skala hvor 0 representerer ikke noe detekterbart signal og 5 representerer høyest signal.

Andre reagenser og materialer ble oppnådd enten fra kommersielle kilder eller dannet ved anvendelse av lett tilgjengelige utgangsmaterialer og konvensjonelle prosedyrer.

Eksempel 1 Oppfaneing og frigivelse av DNA ved anvendelse av svakt basisk

homopolymer

Dette eksempel illustrerer utførelse av foreliggende oppfinnelse for oppfanging og frigivelse av en nukleinsyre ved anvendelse av poly-(l-vinylimidazol).

Forskjellige volum av poly-(l-vinylimidazol) [en 1:10 fortynning av 2,4% stamoppløsning (pH 2,3)] ble blandet med kalvethymus-DNA (100 (il, 0,5 ug/ul) og vorteksbehandlet for å danne et presipitat av en nukleinsyre og polymer. Sentrifugering i 1 minutt ble deretter utført. En ytterligere mengde polymer (10 ul av 2,4% stamoppløsning) ble tilsatt til hver supernatant og de resulterende blandingene ble vorteksbehandlet og sentrifugert for å bestemme om den første presipiteringen var kvantitativ. Tabell I nedenfor viser mengden av polymer anvendt og type presipitering observert for hver prøve.

Det ble observert at presipitering oppstod under sure betingelser (pH 2,3) og at 50 ul av 1:10-fortynningen av polymerstamoppløsningen kunne bli anvendt for å presipitere 100 ul kalvethymus-DNA-oppløsning (0,5 ug/ul) på en nærmest kvantitativ måte. Denne observasjon ble også bekreftet ved anvendelse av konvensjonelle gelelektroforesemetoder.

Eksperimenter ble utført for å bestemme hvordan man skulle oppløse presipitatet for derved å frigi nukleinsyren for senere bruk. Tabell II nedenfor viser forskjellige pellett-oppløsningsbetingelser som er forsøkt og den resulterende pellettstørrelsen. Den mest nyttige teknikken var anvendelse av varme i kombinasjon med basisk pH (ingen pellett). Konvensjonell gelelektroforese viser klart at ved basisk pH, var polymeren og nukleinsyrene til stede som frie materialer. Nukleinsyrene var følgelig tilgjengelige for senere bruk, som i PCR. Tabell HI nedenfor viser virkning av pH på dannelsen av et presipitat mellom polymeren (50 ul l:10-fortynning av stamoppløsning) og kalvethymus-DNA (100 ul av 0,5 ug/ul oppløsning). Sur pH var klart nødvendig for effektiv oppfanging av nukleinsyren ved dannelsen av et presipitat (pellett).

Eksempel 2 Oppfanging og frigivelse av HIVl- proviralt DNA og amplifisering av

HIVI- DNA og ffennmisk Mycobacterium tuberculosis DNA

Dette eksempelet illustrerer praktisering av denne oppfinnelsen når det gjelder å oppfange og frigi en målnukleinsyre i nærvær av ikke-målnukleinsyrer, etterfulgt av amplifisering av de isolerte målnukleinsyrene.

Prøver for eksperimenter ble dannet ved blanding av kalvethymus-DNA (ikke-mål DNA, 250 ul, 0,5 ug/ul) med eller uten 100 kopier HIVl-proviralt DNA, med poly-(l-vinylimidazol) (125 ul l:10-fortynning av 2,4% oppløsning), vorteksbehandlet for å danne presipitater og sentrifugering i l minutt for isolere presipitatene.

Presipitatene ble resuspendert i enten en oppløsning av natriumhydroksyd (187,5 (il, 50 mmolar) i vann (25 ul) eller vandig natriumhydroksyd og ZONYL™ FSP anionisk, fluorinert fosfatester-overflateaktivt middel (25 (il), etterfulgt av oppløsning ved 100°C

i 10 minutter. Tris(hydroksymetyl)aminometanhydrokloridbuffer (37,5 (il, 0,5 molar) ble deretter tilsatt til hver oppløsning ved å bringe den endelige DNA-konsentrasjon til 0,5 ug/ml. Anionisk, overflateaktivt middel ble tilsatt til noen presipitater for å bestemme dets virkning på frigivelse og amplifisering av DNA.

Til hver resulterende blanding (60 eller 150 ul) ble det tilsatt PCR-amplifiseringsreaksjonsblanding (240 eller 150 ul) identifisert ovenfor for å oppnå en endelig reaksjonsblanding på 300 ul og amplifiseringen ble utført i 40 cykluser ved anvendelse av følgende protokoll:

1) denaturering ved 95°C i 15 sekunder (80 sekunder i første cyklus) og

2) primersammensmeltning og primerekstensjon i 30 sekunder ved 62°C for mål-HIV-1-proviralt DNA. M. tuberculosis DNA (100 kopier) ble likeledes amplifisert (primerekstensjon ved 64°C i trinn 2), med unntagelse av at det ble tilsatt direkte til PCR-reaksjonsblandingen. Det ble ikke utsatt for svak basisk polymer. Dette var for å demonstrere at polymeren ikke negativt ville påvirke amplifiseringen av en ikke-oppfanget målnukleinsyre.

Etter amplifisering ble to metoder anvendt for å detektere tilstedeværelse av amplifisert mål-DNA: (a) Gelelektroforese: An alikvot (12 ul) av hver amplifiserte produktoppløsning ble tilsatt til et 4 ul konvensjonelt prøvefargestoff. Den resulterende blandingen ble amplifisert på en 2,5% agarosegel som var forfarget med etidiumbromid (0,4 mg/ml sluttkonsentrasjon). Elektroforese ble utført i 1,5 timer ved 120 volt. Gelbånd ble visualisert under ultrafiolettlys og registrert som beskrevet ovenfor. (b) Fargesignal i SURECELL'',M-forsøksinnretninger ble oppnådd som beskrevet

ovenfor.

Tabell IV nedenfor viser gelelektroforese og fargeregistreringsresultater for flere prøver under forskjellige betingelser. Resultatene viser at HIVl-proviralt DNA-målnukleinsyre ble vellykket amplifisert etter oppfanging og frigivelse ved anvendelse av svak basisk polymer. I tillegg ble M. tuberculosis-DNA også amplifisert for dette å indikere at polymeren i reaksjonsblandingen ikke inhiberte amplifiseringen av en eksogent tilsatt nukleinsyre.

Fargestoffsignaler og gelelektroforeseresultater ved 30 ug og 75 ug målnivåer var i samsvar med de som ble oppnådd med samme mengder av kokt eller ukokt kalvethymus-DNA (prøvene 17-20) eller ukokt humant placentalt DNA (prøvene 21-23). Ved alle nivåer av ZONYL™ FSP anionisk overflateaktivt middel, ble amplifiseringen alvorlig inhibert, og ikke noe signal ble observert med noen deteksjonsteknikker. Prøvene 1 og 2 demonstrerte den mest effektive amplifiseringen for HIVl-proviralt DNA (24 og 60 kopier pr. 300 pl reaksjonsblanding).

Eksempel 3 Prevepreparering og amplifisering av humant cvtomegaloviralt

DNA

Dette eksempelet illustrerer utførelse av foreliggende oppfinnelse ved anvendelse av en 9 hCMV "kultur-positiv" og 3 "kultur-negative" urinprøver oppnådd fra et medisinsk senter. Det sammenligner også foreliggende oppfinnelse med en vanlig anvendt prøvepreparatorisk metode, dvs. oppvarming av prøven til 100°C i 10 minutter i nærvær av et ikke-ionisk, overflateaktivt middel.

To alikvoter (150 ul hver) av hver urinprøve ble blandet med en bufferoppløsning (150 ul) inneholdende TWEEN™ 20 ikke-ioniske, overflateaktivt middel (0,5%) og kalvethymus-DNA (10 ug) i tris(hydroksymetyl)aminometanhydrokloridbuffer (10 mmolar, pH 8).

Blandingene ble hver oppvarmet ved 100°C i 10 minutter. Til et sett av prøver ble en svak basisk polymer, poly-(l-vinylimidazol) (125 ul, 1:10 fortynning av 2,4%) tilsatt, som dannet et presipitat av polymer og nukleinsyrer. De resulterende suspensjonene ble sentrifugert ved 14.000 rpm i 5 minutter. Supernatantene ble fjernet og pellettene ble resuspendert i natriumhydroksyd (83 pl, 50 mmolar) og oppvarmet ved 100°C i 10 minutter for å frigi nukleinsyrene. Tris(hydroksvmetyl)aminometanhydroklorid (17 ul, 0,5 molar, pH 7) ble deretter tilsatt for å nøytralisere oppløsningen.

Det andre sett av prøver mottok ikke ytterligere behandling.

En alikvot (20 pl) av hver oppløsning (for begge sett av behandlede prøver) ble tilsatt til PCR-reagensblandingen (80 pl) beskrevet ovenfor inneholdende de angitte hCMV-primeme og 40 cykluser PCR ble utført ved anvendelse av følgende protokoll:

1) denaturering ved 94°C i 30 sekunder, og

2) primersammensmeltning og primerekstensjon i 30 sekunder ved 64°C.

Deteksjon av amplifiserte produkter ble oppnådd ved anvendelse av fargestoffsignaldannelse med oppfangingsprober som beskrevet ovenfor i eksempel 2 og sammenlignet med resultatene bestemt ved dyrkning (bare kliniske prøver).

Fig. 1 og tabell V nedenfor viser resultater av begge metodene sammenlignet med dyrkningsresultatene. Det fremgår at i dette eksempelet demonstrerer oppfinnelsen en sensitivitet på 89% (8 av 9 kultur-positive prøver) og en spesifisitet på 100% (3 av 3 kultur-negative prøver) sammenlignet med dyrkningsresultatene. Kontrollprøvepreparatorisk metode (oppvarming i nærvær av et ikke-ioniske overflateaktivt middel) utviser en sensitivitet på 33% (3 av 9 dyrknings-positive prøver) og en spesifisitet på 100% (3 av 3 dyrknings-negative prøver) når sammenlignes med dyrkningsresultatene.

Dette eksempelet demonstrerer fordelen ved å fjerne målnukleinsyrer fra inhibitorer som kan være til stede i kliniske prøver. Andre metoder anvendt innenfor fagområdet kan oppnå samme resultat, men ved hjelp av en mer omstendelig, tidkrevende og miljømessig utrygg måte.

Eksempel 4 Oppfanging og frigivelse av mål- hCMV- DNA og

amplifisering ved anvendelse av flere polymerer

Dette eksempelet ble utført som eksempel 3 ovenfor ved anvendelse av flere svakt basiske polymerer innenfor rammen av denne oppfinnelsen.

Forskjellige hCMV-DNA-fortynninger (10 pl) ble blandet, ved risting, med en bufferoppløsning (70 pl) inneholdende

tris(hydroksymetyl)aminometanhydrokloridbuffer (10 mmolar, pH 8) og TWEEN<TM >20 ikke-ionisk, overflateaktivt middel (0,5%) og med kalvethymus-DNA (20 pl, 0,5

ug/ul) i 1,5 ml mikrosentirfugerør. Fortynnet polymer (100 pl, omtrent 0,24% faste stoffer) ble tilsatt til hvert rør og den resulterende blandingen ble ristet.

Polymer 1 varpoly-[N-(3-imida2olylpropyl)-metakrylamidhydroklorid} (12% faste stoffer), Polymer 2 var poIy-|^-vinylimidazol-ko-2-hydroksyetylmetakryIat] (50:50 vektforhold, 5,3% faste stoffer) og Polymer var poly-[N-(3-imidazolylpropyl)metakrylamidhydroklorid-ko-akrylamid] (90:10 vekt-%, 15,5% faste stoffer). Negative kontroller ble likeledes dannet og bearbeidet uten å inneholde målnukleinsyre. Andre kontroller inneholdt målnukleinsyrer, men destillert vann (100 pl) ble blandet med prøvene istedenfor polymer.

De resulterende blandingene ble sentrifugert ved 14.000 rpm i 30 sekunder for å separere eventuelt presipitat fra supernatanten som var kastet. Til de resulterende pellettene ble det tilsatt buffer (100 pl, identifisert ovenfor inneholdende TWEEN™ 20 ikke-ionisk, overflateaktivt middel, pH 10), fulgt av vorteksing og oppvarming ved 100°C i 5 minutter.

Fortynningsnivåene av mål-hCMV-DNA-stamoppløsningene var som følger:

Nivål: 1:500

Nivå 2: 1:5.000

Nivå 3: 1:50.000

Nivå 4: 1:500.000

Amplifisering og deteksjon av oppfanget og frigitt mål-hCMV-DNA ble utført som beskrevet i eksempel 3 ved anvendelse av 40 cykluser av protokollen:

1) denaturering ved 95°C i 30 sekunder (180 sekunder for første cyklus) og

2) primersammensmeltning og primerekstensjon i 30 sekunder ved 68°C.

Resultatene er vist i fig. 2 og i tabell VI nedenfor. I fig. 2 viser de første tre sett av kolonnene fargestoffskåringer oppnådd ifølge oppfinnelsen fra hCMV-DNA-nivåene oppfanget og deretter amplifisert for hver av tre ukentlige basiske polymerer. Det siste kolonnesettet viser resultatene når det ikke ble anvendt polymer for å isolere nukleinsyrer. Registrering av fargestoff i tabell VI ble bestemt som beskrevet i eksempel 3 ovenfor.

Resultatene indikerer at de tre ukentlige, basiske polymerene effektivt oppfanget og frigitt målnukleinsyren for amplifisering med unntagelse i det laveste målnukleinsyrenivået.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en nukleinsyre fra et lysat, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: A) ved en pH på mindre enn 7, bringes et lysat som antas å inneholde en nukleinsyre i kontakt med en vannoppløselig, svakt basisk polymer i en mengde tilstrekkelig for å danne et vannuoppløselige presipitat av nevnte svake, basiske polymer med alle nukleinsyrene til stede i lysatet, B) nevnte vannuoppløselige presipitat separeres fra nevnte lysat og C) nevnte presipitat bringes i kontakt med en base for å øke oppløsningens pH til høyere enn 7 og derved frigi nevnte nukleinsyrer fra nevnte svake basiske polymer, idet nevnte svake basiske polymer omfatter tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av en eller flere etylenisk, umettede polymeriserbare monomerer med en amingruppe som kan bli protonert ved sur pH.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at den videre omfatter følgende trinn: D) pH av nevnte oppløsning inneholdende nevnte frigitte nukleinsyrer justeres til fra omtrent 6 til omtrent 9.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte base er natriumhydroksyd, kaliumhydroksyd, ammoniumhydroksyd, litiumhydroksyd, natriumkarbonat, natriumbikarbonat, et tertiært amin eller trisfhydroksy-metyI)aminometan.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte svake basiske polymer blir anvendt i trinn A) i en mengde fra omtrent 0,01 til omtrent 0,5 vekt-%.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at nevnte svake basiske polymer består av tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av: a) fra omtrent 15 til 100 vekt-% av en vannoppløselig, svakt basisk etylenisk umettet polymeriserbar monomer som har minst en gruppe som kan bli protonert ved sur pH og som blir valgt fra gruppen bestående av aminoalkyl, imidazolyl, isoksazolyl, pyridyl, piperidyl, piperazinyl, pyrazolyl, triazolyl, tetrazolyl, oksadiazolyl, pyridazinyl, pyrimidyl, pyrazinyl, kinolinyl og kinazolinyl, b) fra 0 til omtrent 35 vekt-% av en ikke-ionisk, hydrofil etylenisk umettet, polymeriserbar monomer og c) fra 0 til omtrent 85 vekt-% av en ikke-ionisk, hydrofob etylenisk umettet, polymeriserbar monomer.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en svak base blir anvendt i trinn C), ledsaget av oppvarming av nevnte vannuoppløselige presipitat ved fra omtrent 50 til omtrent 125°C.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at en sterk base blir anvendt i trinn C) uten oppvarming av nevnte vannuoppløselige presipitat.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for amplifisering og deteksjon av en målnukleinsyre, kar akterisert ved å I) å tilveiebringe en målnukleinsyre ved anvendelse av følgende trinn: A) ved en pH på mindre enn 7 bringes et lysat antatt å inneholde en målnukleinsyre med en vannoppløselig, svakt basisk polymer i en mengde som er tilstrekkelig for å danne et vannuoppløselig presipitat av nevnte svake basiske polymer med alle nukleinsyrene til stede i nevnte lysat, inkludert nevnte målnukleinsyre, B) separere nevnte vannuoppløselige presipitat fra nevnte lysat og C) bringe nevnte presipitat i kontakt med en base for å øke oppløsningens pH til høyere enn 7, og derved frigi nevnte nukleinsyrer, inkludert nevnte målnukleinsyre, fra nevnte svakt basiske polymer, idet nevnte svakt basiske polymer omfatter tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av en eller flere etyleniske, umettede polymeriserbare monomerer som har en amingruppe som kan bli protonert ved sur pH, II) amplifisere nevnte målnukleinsyre til stede blant nevnte frigitte nukleinsyrer og HI) detektere nevnte amplifiserte målnukleinsyre.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at den videre omfatter, etter trinn C), trinnet: D) justering av pH til oppløsningen inneholdende nevnte frigitte nukleinsyrer til fra omtrent 6 til omtrent 9.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte amplifisering blir oppnådd ved polymerasekjedereaksjon ved anvendelse av en termostabil DNA-polymerase og minst en merket primer.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at den er for amplifisering og deteksjon av en målnukleinsyre assosiert med HIVI, HIV2, proviral HIVI, proviral HIV2, cytomegalovirus, Mycobacterium spp., human papillomavirus, hepatittviruser eller en genetisk sykdom ved anvendelse av primere spesifikke for og hybridiserbare med trådene til nevnte målnukleinsyre.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at nevnte svakt basiske polymer består av tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av: a) fra omtrent 15 til 100 vekt-% av en vannoppløselig, svakt basisk etylenisk umettet polymeriserbar monomer med minst en gruppe som kan bli protonert ved sur pH og som blir valgt fra gruppen bestående av aminoalkyl, imidazolyl, isoksazolyl, pyridyl, piperidyl, piperazihyl, pyrazolyl, triazolyl, tetrazolyl, oksadiazolyl, pyridazinyl, pyrimidyl, pyrazinyl, kinolinyl og kinazolinyl, b) fra 0 til omtrent 35 vekt-% av en ikke-ionisk, hydrofil etylenisk umettet, polymeriserbar monomer og c) fra 0 til omtrent 85 vekt-% av en ikke-ionisk, hydrofob etylenisk umettet, polymeriserbar monomer.

13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte svakt, basiske polymer består av tilbakevendende enheter av fra omtrent 20 til omtrent 100 vekt-% av (a), fra 0 til omtrent 25 vekt-% av (b) og fra 0 til omtrent 80 vekt-% av (c).

14. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at monomeren (a) har formelen (I): hvor

R.<3> er hydrogen eller metyl, X er oksy eller imino, R<4> er en divalent hydrokarbonbindingsgruppe med fra 1 til 8 karboner eller heteroatomer i kjeden og omfatter en eller flere alkylengrupper, forutsatt at når det er mer enn en alkylengruppe, er de koblet sammen i R-* med en eller flere karbonyl—, oksy—, imino—, ester- eller amidogrupper i en hvilken som helst operabel kombinasjon og R<4> kan bli terminert med karbonyl-, oksy-, imino-, ester- eller amidogruppe og R<5> er et cyklisk amin eller en primære, sekundær eller tertiært aminoalkylgruppe som kan bli protonert ved sur pH.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at nevnte monomer (a) har strukturen (II): hvor R er hydrogen eller metyl og Ri er alkylen med 1 til 3 karbonatomer.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at monomeren (a) blir valgt fra gruppen bestående av N-(3-imidazolylpropyl)metakrylamid, 1-vinylimidazol, 2-metyl-l-vinylimidazol, 2-vinylpyridin, l-hydroksy-6-vinyl-lH-benzotriazol, 2-aminoetylmetakrylathydroklorid, 2-aminoetylakrylathydroklorid, 1-vinylpyrrolidinon, 3-(N,N-dimetylamino)propylmetakrylat, 2-aminoetylmetakrylat, N-(3-aminopropyl)metakrylamidhydroklorid, 2-vinylkinolin, N-(2-imidazolyletyl)metakrylamid, N-(3-imidazolylpropyl)akrylamid, N-(imidazolylmetyl)akrylamid, N-(l, 1 -dimetyl-3-imidazoIylpropyl)akrylamid og syreaddisjonssalter derav, monomeren (b) blir valgt fra gruppen bestående av akrylamid, 2—hydroksyetylakrylat, 2,3-dihydroksypropylakrylat, 2,3-dihydroksypropylmetakrylat, poly(etylenoksy)etylmetakrylat (med 2 til 10 etylenoksygrupper), og N,N-dimetylakrylamid, og monomeren (c) blir valgt fra gruppen bestående av metakrylamid, 2-hydroksyetylmetakrylat, N-t-butylmetakrylamid, etylakrylat, metylmetakrylat, styren, vinyltoluen, metylakrylat og butylakrylat.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at nevnte svakt, basiske polymer er poly-[N-(3-imidazolylpropyl)metakrylamidhydroklorid-ko-akrylamid], poly-[N-(3-imidazolylpropyl)metalcrylamidhydroklorid-ko-2-hydroksyetylmetakrylat], poly-( 1 - vinylimidazol), poly-(2-aminoetylmetakrylathydroklorid-ko-2-hydroksyetylmetakrylat), poly-(l -vinylimidazolhydroklorid-ko-2-hydroksyetylmetakrylat), poly-[N-(l,l-dimetyl-3-imidazolylpropyl)akrylamid] og poly-(N-2-metyl-1 -vinylimidazol).

18. Forsøkssett for amplifisering av en målnukleinsyre, karakterisert ved at det omfatter, separat pakket: a) en amplifiseringsreaksjonsblanding omfattende en eller flere amplifiseringsreagenser og b) en svak basisk polymer omfattende tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av en eller flere etylenisk umettede polymeriserbare monomerer med en amingruppe som kan bli protonert ved sur pH.

19. Forsøkssett ifølge krav 18, karakterisert ved at nevnte svakt, basiske polymer omfatter tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av: a) fra omtrent 15 til 100 vekt-% av en vannoppløselig, svakt basisk etylenisk umettet polymeriserbar monomer som har minst en gruppe som kan bli protonert ved sur pH og som blir valgt fra gruppen bestående av aminoalkyl, imidazolyl, isoksazolyl, pyridyl, piperidyl, piperazinyl, pyrazolyl, triazolyl, tetrazolyl, oksadiazolyl, pyridazinyl, pyrimidyl, pyrazinyl, kinolinyl og kinazolinyl, b) fra 0 til omtrent 35 vekt-% av en ikke-ionisk, hydrofil etylenisk umettet polymeriserbar monomer og c) fra 0 til omtrent 85 vekt-% av en ikke-ionisk, hydrofob etylenisk umettet polymeriserbar monomer.

20. Forsøkssett ifølge krav 18, karakterisert ved at nevnte amplifiseringsreaksjonsblanding omfatter et sett av primere, hvor minst en er merket, en mengde dNTP og en termostabil DNA-polymerase.

21. Forsøkssett ifølge krav 18, karakterisert ved at det omfatter en forsøksinnretning inneholdende en eller flere settkomponenter.

22. Forsøkssett ifølge krav 18, karakterisert ved at nevnte svakt, basiske polymer er koblet til et fast substrat.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 1 for amplifisering og deteksjon av en målnukleinsyre, karakterisert ved at den omfatter: I) lyserende celler eller viruspartikler for å frigi en målnukleinsyre, II) utsette nevnte målnukleinsyre for følgende trinn: A) ved en pH som er mindre enn 7, kontakting av nevnte målnukleinsyre med en vannoppløselig, svakt basisk polymer i en mengde som er tilstrekkelig for å danne et vannuoppløselig presipitat av nevnte svakt, basiske polymer med alle nukleinsyrer til stede i nevnte lysat, inkludert nevnte målnukleinsyre, B) separere nevnte vannuoppløselige presipitat fra nevnte lysat og C) bringe nevnte presipitat i kontakt med en base for å øke oppløsningens pH til høyere enn 7, og derved frigi nevnte nukleinsyrer, inkludert nevnte målnukleinsyre, fra nevnte svakt basiske polymer, idet nevnte svakt basiske polymer omfatter tilbakevendende enheter oppnådd ved addisjonspolymerisasjon av en eller flere etyleniske, umettede polymeriserbare monomerer som har en amingruppe som kan bli protonert ved sur pH, III) uten ytterligere justering av pH, amplifisere nevnte frigitte målnukleinsyre og IV) detektere nevnte amplifiserte målnukleinsyre.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at nevnte svakt basiske polymer er vannuoppløselig ved basisk pH og nevnte fremgangsmåte omfatter videre trinnet av å fjerne nevnte vannuoppløselige polymer etter frigivelse av nevnte målnukleinsyre derifra og før amplifisering derav.