NO317018B1 - DNA konstruksjon, vertcelle, fremgangsmater for fremstilling av Trombin, farmasoytisk sammensettning samt anvendelser derav - Google Patents

Description

Oppfinnelsens område

Foreliggende oppfinnelse er generelt rettet mot DNA-konstruksjon, vertscelle, fremgangsmåter for fremstilling av trombin, farmasøytisk sammensetning samt anvendelse derav.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Det nest siste trinn i koagulasjonskaskaden er den faktor-Xa-kompleks katalyserte omdannelse av protrombin til trombin. Protrombin er et enkeltkjedet, vitamin-K-avhengig glykoprotein som syntetiseres i leveren. Protrombin inneholder et propeptid, et gla-domene, to kringle-områder, en A-kjede og et serinprotease-domene. A-kjeden er disulfid-bundet til serinprotease-domenet. Omdannelse til trombin fordrer at protrombin spaltes på to steder av faktor-Xa-komplekset. En faktor-Xa-spaltning frigjør et proteinfragment som omfatter gla-domenet og to kringle-områder. Den andre faktor-Xa-spaltningen som er ansvarlig for dannelsen av et katalytisk aktivt molekyl, spalter A-kjeden fra serinprotease-domenet, hvorved det dannes et disulfid-bundet tokjedet protein. Spaltninger ved begge faktor-Xa-spaltningsseter resulterer i dannelsen av aktivt trombin som består av en 49 aminosyrers A-kjede, disulfid-bundet til serinprotease-domenet. Trombin hydrolyserer spesifikt arginyl-glycin-bindinger i fibrinogen for å danne fibrinmonomerer som automatisk samles til et fibrinkoagel, og i faktor XIII for å danne faktor Xllla, som så kryssbinder fibrinmonomerene for å styrke og stabilisere fibrinklumpen. Trombinets rolle i koagulasjonskaskaden er gjennomgått av for eksempel Jackson & Nemerson, ( Ann. Rev. Biochem. 49: 765-811 (1980)).

Trombin benyttes klinisk for å kontrollere blødning under kirurgiske operasjoner, ved forbrerininger og i visse traume-situasjoner (Nakamura et al. The Amer. Surgeon 57: 226-230 (1991); Thompson et al. Qphtalmology 93:279-282 (1986); Harris et al., J. Bone Joint Sure, f Am ] 60: 454-456 (1978); Craig & Asher, Spine 2: 313-317 (1977); Prasad et al. Burns 17: 70-71 (1991)). Bovint trombin utgjør også en komponent av enkelte kommersielle limtyper for vev.

Kommersielle trombin-terapeutika renses fra samlede humane og animalske blodprodukter og kan således være utsatt for forurensning med virus, så som HIV og hepatittvirus. Ved sammenligning av tre kommersielle trombinpreparater fant Suzuki & Sakuragawa ( Thromb. Res. 53:271-278, 1989) at preparatene inneholdt kontaminerende proteiner og at humanpreparatet inneholdt immunglobulin G, hepatitt-B-overflate antigent antistoff og humane immunsvikt antistoff. Xenogen immunisering med bovint trombin har vært rapportert i pasienter som har utviklet selv-reaktive antistoff både mot humant trombin og mot human faktor V (faktor V er en kontaminant i det bovine trombinpreparat)

(Stricker et al., Blood 72: 1375-1380 (1988); Flaherty & Weiner, Blood 73: 1388 (1989); Flaherty et al., Ann. Int. Med. 111: 631-634 (1989); Zehnder & Leung, Blood 76:2011-2016 (1990); Lawson et al., Blood 76:2249-2257 (1990); Stricker et al., Blood 72: 1375-1380 (1988); Berguer et al., J. Trauma 31:408-411 (1991)). Dessuten har det nylig oppstått bekymring for den mulige forurensning av bovint baserte produkter med patogener, som

f.eks. det bovine svampformede encefalitt-agens som ikke kan påvises eller inaktiveres ved konvensjonelle midler. Terapeutiske humane blodprodukter er også utsatt for forurensning med virale partikler, så som hepatittvirus og humant immunsviktvirus.

Selv om protrombin er blitt fremstillet ved rekombinant teknikk, har ca. 14% av proteinet vært unormalt karboksylert. Jørgensen et al., J. Biol. Chem., 262:6729-6734

(1987).

Det er derfor på dette felt et behov for fremstilling av trombin som er tilnærmet fritt for kontaminerende proteiner. Foreliggende oppfinnelse imøtekommer dette behov og byr dessuten på andre beslektede fordeler.

Sammenfatning av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse vedrører følgelig DNA-konstruksjon som kan styre ekspresjonen av en trombin-forløper, kjennetegnet ved at den omfatter følgende operabelt koblete elementer: en transkripsjonspromotor, et DNA segment kodende for protrombin som mangler en funksjonell gla domene og en transkripsjonen terminator.

Ovennevnte promoter er muse-metallotionein-l promoter, adenovirus major late-promoter, Saccaromyces cerevisiae TPI1 promoter eller Saccaromyces cerevisiae ADH2-4C promoteren.

Ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter DNA-konstruksjonen videre signalsekvens så som human vevs plasminogen aktivator leder sekvens, human a-2 plasmin inhibitor signalsekvens, Saccaromyces cerevisiae BARI sekretorisk signalsekvens eller Saccaromyces cerevisiae MFal signalsekvens.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre DNA-konstruksjon som angitt ovenfor, kjennetegnet ved at DNA segmentet kodende for protrombin som mangler en funksjonell gla-domene omfatter (i) kringle 1, kringle 2, A kjeden, et aktiveringssete og serin protease domene til protrombin; (ii) kringle 2, A kjeden, et aktiveringssete og serin protease domene til protrombin; eller (iii) A kjeden, et aktiverinssete og serin protease domene til protrombin.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre fremgangsmåte for fremstilling av en trombinforløper, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: dyrking av en vertscelle ifølge hvilket som helst av kravene 8 til 11 under egnede betingelser for å muliggjøre ekspresjon av trombinforløperen kodet av DNA segmentet; og isolering av trombinforløperen fra vertscellen.

Det er også beskrevet fremgangsmåte for fremstilling av trombin, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: dyrking av en vertscelle ifølge hvilket som helst av kravene 8-11 under egnede betingelser for å muliggjøre ekspresjon av trombinforløperen kodet av DNA segmentet og aktivering derav til trombin i vertscellen; og isolering av aktivert trombin fra vertscellen.

Det er også beskrevet fremgangsmåte for fremstilling av trombin, kjennetegnet ved at den omfatter følgende trinn: dyrking av en vertscelle, hvori det er blitt innført en DNA konstruksjon ifølge krav 3 eller krav 4, i et egnet medium og under betingelser som muliggjør ekspresjon av trombin-forløperen som blir kodet av DNA segmentet; aktivering av trombinforløper til trombin; og isolering av trombin fra mediet.

Oppfinnelsen vedrører også farmasøytisk sammensetning, kjennetegnet ved at

den omfatter et gla-domeneløst rekombinant human protrombin som kodes for en DNA sekvens ifølge kravene 1-7.

Det er også beskrevet anvendelse av et gla-domeneløst rekombinant human protrombin, kodet for av DNA sekvensen ifølge krav 1-7, for fremstilling av et medikament for behandling av en blødeforstyrrelse eller et sår.

Kort beskrivelse av tegningene

Fig. 1 illustrerer konstruksjonen av plasmid Zem229R. De anvendte symboler er: SV40 term.= SV40 terminator; DHFR = dihydrofolat-reduktase-cDNA; SV40 prom. = SV40 promoter; MT-1 = muse-metallothionien-1-promoter. Fig. 2 illustrerer konstruksjonen av plasmid Zeml69. De anvendte symboler er prepro = tPA-prepro-sekvensen; hGH = hGH-terminatoren; MCF = MCF-13-promoteren.

Beskrivelse av spesifikke utførelsesformer

Før fortsettelse av beskrivelsen, kan det være til hjelp for forståelsen av oppfinnelsen å angi enkelte av de betegnelser som heretter skal benyttes.

Signalsekvens: Et DNA-segment som koder for et sekretorisk peptid. Signalsekvenser kan også kalles ledersekvenser, prepro-sekvenser og/eller presekvenser. Et sekretorisk peptid er en aminosyresekvens som bevirker sekresjonen av et modent polypeptid eller protein fra en celle. Sekretoriske peptider karakteriseres ved en kjerne av hydrofobe aminosyrer og finnes typisk (men ikke utelukkende) ved aminoterminalene av nylig syntetiserte proteiner. Det sekretoriske peptid kan inndeles i domener, innbefattet et singalpeptid-domene og et C-terminalt domene. Slike domener kan være avbrutt av området som koder for full utvikling av et protein. Et DNA-segment som koder for det tredje domene av gjær-Barrier-proteinet, kan for eksempel befinne seg i riktig leseramme i forhold til BARI -sienalpeptidet og den aktuelle DNA-sekvens, enten umiddelbart 3' eller 5' til den aktuelle DNA-sekvens. Meget ofte spaltes det sekretoriske peptid fra det modne protein under sekresjonen. Slike sekretoriske peptider inneholder prosseseringsseter som muliggjør spaltning av det sekretoriske peptid fra det modne protein idet det passerer gjennom den sekretoriske bane. Prosesseringsseter kan kodes innen det sekretoriske peptid eller kan adderes til peptidet, for eksempel ved in vitro mutagenese.

Pro- sekvens: Et DNA-segment som koder for et propeptid og virker ved å styre eller signalisere prosesseringen av et protein eller peptid. Propeptidene av vitamin-K-avhengige glykoproteiner er sterkt konservert. De sterkest konserverte aminosyrer i propeptidene er Val-Phe i posisjonene -17 og -16, Glu eller Gin ved -12, Ala ved -10, Val-Leu ved -7 og -6, Arg ved -4 og Lys-Arg ved -2 og -1 (Foster et al., Biochemistr<y> 26: 7003-7011 (1987)). Prosekvenser følger i alminnelighet etter en presekvens og fjernes fra proteinet under prosessering og sekresjon.

For vitamin-K-avhengige glykoproteiner antas propeptidet å sikre riktig post-translasjonell prosessering (f.eks. gamma-karboksylering av glutaminsyrerester i Gla-domenet) av proteinet.

Gla- domene: En aminosyresekvens som i alminnelighet inneholder fra ca. 26 til ca. 45 aminosyrer, i alminnelighet, men ikke alltid, lokalisert i et proteins aminoterminale område, som inneholder mellom 3 og 12 glutamylrester som post-translasjonelt endres til gamma-karboksyglutamylrester (Gla). I enkelte tilfeller kan Gla-domenet defineres av exon-intron-overganger i den genomiske sekvens, y-karboksyglutamylrestene i Gla-domenene letter den kalsiummedierte binding av vitamin-K-avhengige proteiner til membranfosfolipider. Protrombin som har et gla-domene som kodes for innen exon II av den genomiske sekvens, fordrer imidlertid ikke gla-domenet for biologisk aktivitet. Når et funksjonelt gla-domene mangler, har et gla-domeneløst protrombin en Km for aktivering av faktor-Xa-komplekset som er markert høyere enn villtype-protrombinets. Malhotra et al., J. Biol. Chem. 260:279-287 (1985). Analyser for bestemmelse av protrombinaktivering er beskrevet for eksempel av Malhorta et al. ( J . Biol. Chem. 260: 279-287 (1983); som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse) eller Blanchard et al.

( J. Lab. Clin. Med. 101: 212-255 (1983); som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse).

Gla- domeneløst <p>rotrombin: Et polypeptid som etter aktivering har trombinets aktivitet. Et gla-domeneløst protrombin er et enkelt polypeptid som mangler et funksjonelt gla-domene og omfatter minst en del av A-kjeden forbundet med serinprotease-domenet og inneholder en disulfidbinding mellom A-kjeden og serinprotease-domenet.

Trombin: Et tokjedet, disulfid-bundet, glykosylert polypeptid som spalter spesifikke bindinger i fibrinogen for å danne fibrinmonomerer som samles automatisk for å danne en fibrinkoagel. Som her mer utførlig omtalt, aktiveres protrombin til trombin av to faktor-Xa-kompleksspaltninger (mellom Arginin, aminosyre 307 og Threonin, aminosyre 308 i Sekvens ID nr. 2 og 3 for å fjerne gla- og kringle-domenene og mellom Arginin, aminosyre 356 og Isoleucin, aminosyre 356 i Sekvens ID nr. 2 og 3 for å spalte A-kjeden fra serinprotease-domenet). A-kjeden og serinprotease-domenet ansees i alminnelighet som å være bundet av disse faktor-Xa-spaltningssetene. For fagmannen vil det imidlertid være klart at alleliske variasjoner og andre delesjoner, addisjoner eller mindre aminosyreendringer i A-kjeden og serinprotease-domener som ikke ødelegger trombinaktiviteten, faller inn under foreliggende oppfinnelse. Betegnelsen "aktiveringssete" refererer til det proteolytiske spaltningssetet mellom A-kjeden og serinprotease-domenet, som ved spaltningen resulterer i aktivering av pretrombin til aktivt trombin. Når det gjelder nativt protrombin og pretrombin, er villtype-trombin-aktiveringssetet et faktor-Xa spaltningssete.

Ekspresjonsvektor: Et DNA-moIekyl som bl.a. inneholder en DNA-sekvens som koder for et aktuelt protein sammen med en promoter og andre sekvenser, så som en transkripsjonsterminator og et polyadenyleringssignal som letter ekspresjonen av proteinet. Ekspresjonsvektorer inneholder dessuten genetisk informasjon som sørger for deres replikasjon i en vertscelle, enten ved autonom replikasjon eller ved integrasjon i verts-genomet. For fagmannen vil det være klart at slik informasjon som sørger for den autonome replikasjon av en ekspresjonsvektor i en vertscelle, omfatter kjente gjær- og bakterielle repliksjonsori. Som mer detaljert beskrevet her, inneholder egnede gjærvektorer både et gjærbasert replikasjonsorigo og et bakterielt replikasjonsorigo, og bakterie- og pattedyr-vektorer inneholder i alminnelighet et bakterielt replikasjonsorigo. Eksempler på ekspresjonsvektorer som er vanlig benyttet for rekombinant DNA, er plasmider og visse virus, men de kan også inneholde elementer av begge. De kan også innbefatte én eller flere selekterbare markører.

Transfeksjon eller transformasjon: Prosessen som varig og arvemessig endrer genotypen av en resipientcelle eller mikroorganisme ved innføringen av renset DNA. Dette påvises i alminnelighet ved forandring av resipientorganismens fenotype. Betegnelsen "transformasjon" anvendes generelt for mikroorganismer, mens "transfeksjon" benyttes for å beskrive denne prosess i celler som skriver seg fra multicellulære organismer.

Dyrket celle: En celle som er i stand til å dyrkes i flytende eller faste medier over flere generasjoner. Når det gjelder celler fra multicellulære organismer, er en dyrket celle en celle isolert fra organismen som en enkeltcelle, et vev eller en del av et vev.

DNA- konstruksjon: Et DNA-molekyl, eller en klon av et slikt molekyl, enten enkeltkjedet eller dobbeltkjedet, som gjennom menneskeinngrep er modifisert til å inneholde segmenter av DNA kombinert og sammenstillet på en måte som ellers ikke ville forekomme i naturen. DNA-konstruksjoner kan inneholde operativt koblede elementer som styrer transkripsjonen og translasjonen av DNA-sekvenser som koder for aktuelle poly-peptider. Slike elementer innbefatter promotere, enhancere og transkripsjonsterminatorer. Som følge av de elementer som DNA-konstruksjonen inneholder, oppfattes visse konstruksjoner som å være i stand til å styre ekspresjonen og/eller sekresjonen av de kodede polypeptidene. Dersom en DNA-sekvens som koder for et aktuelt polypeptid inneholder en sekretorisk signalsekvens, vil DNA-konstruksjonen som inneholder passende elementer, ansees å være i stand til å styre sekresjonen av polypeptidet.

Som angitt ovenfor fremstilles protrombin normalt som et enkeltkjedet, glykosylert, gamma-karboksylert protein som inneholder et gla-domene, et første og andre kringle-domene, en A-kjede og et serinprotease-domene. A-kjeden, også kjent som den lette kjeden, er disulfid-bundet til serinprotease-domenet, som er kjent både som B-kjeden og som det katalytiske domene. Under koagulasjonskaskaden spaltes protrombin på to steder av faktor-Xa-komplekset, hvilket resulterer i frigjøringen av trombin. En faktor-Xa-kompleksspaltning av protrombin frigjør gla- og kringle-domenene i protrombin. Faktor-Xa-kompleksspaltningen spalter protrombinet ved aktiveringssetet, idet A-kjeden splittes fra serinprotease-domenet for å danne trombin.

Et formål med foreliggende oppfinnelse er følgelig å tilveiebringe fremgangsmåter for fremstilling av trombin ved bruk av rekombinant teknikk og eukaryote vertsceller.

Protrombinets gla-domene kan gjøres ikke-funksjonelt ved å fjerne en del av, eller hele, gla-domenet ved konvensjonelle metoder. Alternativt kan sekvensen som koder for glutamylrestene i gla-domenet utelates eller endres slik at de fører til aminosyre-substitusjon. Kinetikken for aktivering av protrombinvarianter som har endrede gla-domener, kan bestemmes ved å benytte metoden som i det vesentlige er beskrevet av Malhorta et al. (ibid.), som beskrevet nedenfor. Proteiner som ikke inneholder funksjonelle gla-domener har Km-aktiveringsverdier som i alminnelighet er ca. 15 ganger høyere enn for villtype-protrombin, fortrinnsvis ca. 20 ganger høyere. Ifølge en utførelsesform av oppfinnelsen, aktiveres de her beskrevne gla-domeneløse protrombiner før utnyttelsen in vivo.

Aktiveringskinetikken for protrombinvarianter som har endrede domener, kan bestemmes som følger. I korte trekk inkuberes en oppløsning inneholdende 1,4 uM til 6,5 uM av protrombinvarianten i 5 mM CaCb ved 22°C i mer enn 10 minutter. Etter inkubering tilsettes en oppløsning inneholdende faktor-Xa, faktor-Va, CaCb, fosfatidylkolin-fosfatidylserin (3:1) (heretter betegnet PCPS) og dansyl-5-dimetyl-aminonaftalen-l-sulfonyl (heretter betegnet DAP A) slik at sluttkonsentrasjonen av reaksjonsblandingene på 2,0 mL er 0,03M Tris-HCl, pH 7,4; 0,1 OM NaCl; 3,0 nM faktor-Xa; 10,0 nM faktor-Va; 30 uM PCPS; 5,0 mM CaCl2 og 10 uM DAPA. Samtidig inkuberes en positiv kontroll inneholdende 1,4 uM til 6,5 uM protrombin i 5 mM CaCb ved 22°C i mer enn 10 minutter. Etter inkubering tilsettes 25 uL av en oppløsning inneholdende faktor-Xa; faktor-Va; CaCb; PCPS; og DAPA slik at sluttkonsentrasjonene for reaksjonsblandingene på 2,0 mL er 0,,03M Tris-HCl, pH 7,4; 0,10M NaCl; 0,5 nM faktor-Xa; 10,0 nM faktor-Va; 30 uM PCPS; 5,0 mM Ca<2+> og 10 uM DAPA. Reaksjons-utviklingen følges ved å måle fluorescensintensiteten av DAPA-trombinkomplekset under bruk av en eksitasjonsbølgelengde på 345 nm og en emisjonsbølgelengde på 545 nm under bruk av et 430 nm "cutoff1 filter i emisjonsstrålen. Eksitasjons- og emisjonsspalte-åpningene er henholdsvis 10 nm og 15 nm. Km og kcat bestemmes ved å analysere reaksjonsprofilen i henhold til den integrerte Michaelis-Menten-Henri-prosedyre (Nesheim et al., J. Biol. Chem. 254: 10952-10962 (1979); som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse.

I enkelte utførelsesformer av oppfinnelsen endres aktiveringssetet for villtype-trombin på en slik måte at trombin-forløperne kan aktiveres in vivo eller aktiveres autokatalytisk. For eksempel kan aktiveringssetet for villtype-trombin endres slik at det kan spaltes av Saccharomvces cerevisiae KEX2 genproduktet. KEX2-genet koder for en endo-peptidase som spaltes etter en dibasisk aminosyresekvens (Fuller et al, i Leive, red., Microbiology: 1986.273-278 (1986)). Fortrinnsvis kodes KEX2-spaltningssetet av aminosyresekvensen KR. Helst kodes KEX2-spaltningssetet av aminosyresekvensen RRKR (Sekvens ID nr. 34) eller LDKR (Sekvens ID nr. 35). En vertscellelinje som uttrykker KEX2-genet er således i stand til å spalte trombin-forløpere som inneholder et KEX2-sete ved aktiveringssetet for å danne trombin. Vertsceller som ikke naturlig uttrykker KEX2. kan transformeres eller transfekteres med Saccharomvces cerevisiae KEX2-genet som beskrevet av for eksempel Mulvihill et al. (samtidig verserende U.S. Patentapplication Serial No. 07/445,302 som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse) og Mulvihill et al., EP 319,944. Alternativt kan villtype-trombin-aktiveringssetet endres på en slik måte at de resulterende proteiner blir i stand til å spaltes av trombin. En slik forandring gjør det mulig for trombin-forløperne og aktiveres autokatalytisk etter en minimal tilsetning av eksogent trombin. Villtype-trombin-aktiveringssetet kan erstattes med en kopi av moden a-faktor flankert på 5-enden med et trombin-spaltningssete og på 3'-enden med et K£X2-spaltningssete. Slike endringer ved aktiveringssetet kan oppnås ved å benytte teknikk som for eksempel adapterteknologi, in vitro mutagenese og PCR- (polymerase chain reaction) mutagenese.

DNA-segmenter som koder for gla-domeneløse protrombiner kan fremstilles syntetisk eller fremstilles fra DNA-segmenter som koder for protrombin klonet fra for eksempel humane leverceller (Degen et al. Biochemistrv 22: 2087-2097 (1983) og Degen & Davie, Biochemistrv 26: 6165-6177 (1987)) eller fra storfelever, i det vesentlige som beskrevet av MacGillivray & Davie, Biochemistrv 23: 1626-1634 (1984), som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse, ved å benytte den type kloningsmetoder som er beskrevet av Maniatis et al. ( Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor, NY (1982)), Sambrook et al. ( Molecular Clonin<g>: A Laboratory Manual. 2.utg., Cold Spring Harbor, NY (1989)) eller Mullis et al. (US-patent 4,683,195), som samtlige herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse. DNA-segmenter som koder for protrombin kan endres til å produsere DNA-segmenter som koder for gla-domeneløst protrombin ifølge foreliggende oppfinnelse, ved restriksjons-kutting og religering, ved in vitro mutagenese eller ved mutagenese ved bruk av PCR-amplifikasjon.

En representativ nukleotid sekvens som koder for humant protrombin og den avledede aminosyresekvens, er vist i Sekvens ID nr. 2 og nr. 3. Som fagmannen vil innse omfatter DNA-segmenter som koder for gla-domeneløse protrombiner, alleliske varianter og genmodifiserte eller syntetiske varianter som inneholder konservative aminosyre-substitusjoner og/eller mindre addisjoner, substitusjoner eller delesjoner av aminosyrer. DNA-sekvensvarianter omfatter også degenereringer i DNA-koden hvor andre kodoner, innbefattet vertsforetrukne kodoner, benyttes i stedet for de analoge kodoner i villtype-sekvensen. DNA-segmenter som omfatter DNA-sekvenser som er i stand til hybridisering til DNA-sekvensene ifølge foreliggende oppfinnelse under høy eller lav stringens (se Sambrook et al., ibid.) og DNA-segmenter som koder for sekvenser som er degenerert som følge av den genetiske kode til aminosyresekvensene, omfattes av foreliggende oppfinnelse. Genetisk modifiserte varianter kan oppnås ved å benytte oligonukleotidrettet sete-spesifikk mutagenese, ved bruk av restriksjons-endonuklease-kutting og adapterligering eller andre veletablerte litteraturmetoder (se f.eks. Sambrook et al., ibid. og Smith et al., Genetic Engineering: Principles and Methods. Plenum Press, 1981; som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse).

DNA-segmenter som koder for gla-domeneløst protrombin skytes inn i passende ekspresjonsvektorer som på sin side føres inn i passende vertsceller. Ekspresjonsvektorer som kan benyttes ved gjennomføring av foreliggende oppfinnelse omfatter en promoter som er i stand til å styre transkriberingen av et klonet DNA, et DNA-segment som koder for et gla-domeneløst protrombin og en transkripsjonsterminator.

For å styre proteiner inn i vertscellens sekretoriske bane, kobles minst en signalsekvens operativt til den aktuelle DNA-sekvens. Foretrukne signaler innbefatter alfafaktor-signalsekvensen (pre-pro-sekvens; Kurjan & Herskowitz, Cell 30: 933-943 (1982); Kurjan et al., US-patent 4,546,082; Brake, US-patent 4,870,008) PH05-signalsekvensen (Beck et al., WO 86/00637), den BARI-sekretoriske singalsekvens (MacKay et al., US-patent 4,613,572; MacKay, WO 87/002670), SUC2-sienalsekvensen (Carlson et al., Mol. Cell. Biol. 3: 439-447 (1983)), a-l-antitrypsin-signalsekvensen (Kurachi et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 78: 6826-6830 (1981)), a-2-plasmin-inhibitor-signalsekvensen (Tone et al., J. Biochem. (Tokyo) 102: 1033-1042 (1987)) og vevs-plasminogenaktivator-ledersekvensen (Pennica et al., Nature 301:214-221 (1983)). Alternativt kan en sekretorisk signalsekvens syntetiseres i henhold til etablerte retnings-linjer, for eksempel av von Heinie ( Eur. J. Biochem. 133: 17-21 (1983): J. Mol. Biol. 184: 99-105, (1985); Nuc.Acids Res. 14: 4683-4690 (1986)).

Signalsekvenser kan benyttes hver for seg eller kombineres. For eksempel kan en første signalsekvens benyttes for seg eller i kombinasjon med en sekvens som koder for det tredje Barrier-domenet (beskrevet i US-patent 5,037,743, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse). Et DNA-segment som koder for det tredje Barrier-domenet kan befinne seg i riktig leseramme 3' av den aktuelle DNA-sekvens eller 5' til DNA-sekvensen og i riktig leseramme med både signalsekvensen og den aktuelle DNA-sekvens.

Vertsceller for bruk ved utførelse av foreliggende oppfinnelse innbefatter pattedyr-, fugle-, plante-, insekt-, sopp- og bakterieceller. Soppceller, innbefattet slekter av gjær (f.eks. Saccharomvces spp., Schizosaccharomvces spp.) eller filamentøse sopper (f.eks. Aspereillus spp., Neurospora spp.) kan i henhold til foreliggende oppfinnelse benyttes som vertsceller. Stammer av gjæren Saccharomvces cerevisiae er særlig foretrukne.

Passende gjærvektorer for bruk i henhold til foreliggende oppfinnelse innbefatter YRp7 (Struhl et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76: 1035-1039 (1978)), YEpI3 (Broach et al., Gene 8: 121-133 (1979)), POT-vektorer (Kawasaki et al., US-patent 4,931,373, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse), pJDB249 og pJDB219 (Beggs, Nature 275 :104-108 (1978)) og derivater derav. Slike vektorer vil i alminnelighet innbefatte en selekterbar markør som kan være ett av et hvilket som helst antall gener som oppviser en dominant fenotype som det eksisterer en fenotype-bestemmelse for, slik at det er mulig å selektere transformanter. Foretrukne selekterbare markører er slike som kompletterer vertscellens auxotrofi, gir antibiotisk resistens eller setter en celle i stand til å utnytte bestemte karbonkilder, og innbefatter LEU2 (Broach et al., ibid.), URA3 (Botstein et al., Gene 8: 17 (1979)), HIS3 (Struhl et al., ibid.) eller POT1 (Kawasaki et al., ibid.). En annen egnet selekterbar markør er CAT-genet som gir kloramfenikolresistens på gjærceller.

Foretrukne promotere for bruk i gjær innbefatter promotere fra gjær-glykolytiske gener (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255: 12073-12080) (1980); Alber & Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1: 419-434 (1982); Kawasaki, US-patent 4,599,311) eller alkohol-dehydrogenase-gener (Young et al., i Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals. Hollaender et al., (red.), s. 355, Plenum, New York (1982); Ammerer, Meth. Enzvmol. 101: 192-201 (1983)). I denne sammenheng er særlig foretrukne promotere IPIl-promoteren (Kawasaki, US-patent 4,599,311,1986) og ADH2- 4c-promoteren (Russell et al., Nature 304: 652-654 (1983); Irani & Kilgore, U.S. Patent Application Serial No. 07/631,763 og EP 284,044, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse). Ekspresjonsenhetene kan også innbefatte en transkripsjonsterminator. En foretrukket transkripsjonsterminator er TPI1 -terminatoren (Alber & Kawasaki, ibid.).

Foruten i gjær, kan proteinene uttrykkes i filamentøse sopper, f.eks. i stammer av soppen Asper<g>illus (McKnight et al., US-patent 4,935,349, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse). Eksempler på anvendelige promotere innbefatter de som er avledet fra Aspergillus nidulans glykolytiske gener, så som ADH3-promoteren (McKnight et al., EMBQ J. 4:2093-2099 (1985)) og tpiA-promoteren. Et eksempel på en egnet terminator er ADH3-terminatoren (McKnight et al., ibid.). Ekspresjonsenheter som utnytter slike komponenter klones inn i vektorer som er i stand til å skytes inn i det kromosomale DNA til Aspergillus.

Teknikker for omdannelse av sopp er velkjent innen faglitteraturen, og er for eksempel beskrevet av Beggs (ibid.), Hinnen et al., ( Proe. Nati. Acad. Sei. USA 75: 1929-1933 (1978)), Yelton et al., ( Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:1740-1747 (1984)) og Russell ( Nature 301: 167-169 (1983)). Genotypen av vertscellen vil i alminnelighet inneholde en genetisk defekt som kompletteres av den selekterbare markør som forekommer på ekspresjonsvektoren. Valget av en bestemt vert og selekterbar markør vil være velkjent for fagmannen.

Som vert kan det være fordelaktig å benytte en gjærcelle som inneholder en genetisk mangel i minst ett gen som fordres for asparagin-koblet glykosylering av glykoproteiner. Fortrinnsvis inneholder gjær-vertscellen genetiske mangler enten i MNN9-genet eller MNN1-genet eller i begge (beskrevet i verserende U.S. Patent Application Serial No. 189,547 og EP 314,096, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse). Helst inneholder gjær-vertscellen et brudd i både MNN1- og MNN9-genene. Gjær-vertsceller som har slike defekter kan fremstilles ved å benytte standard mutasjons-og seleksjonsteknikk. Ballou et al. ( J. Biol. Chem. 255: 5986-5991 (1980)) har beskrevet isoleringen av mannoprotein-biosyntesemutanter som mangler gener som påvirker asparagin-koblet glykosylering. I korte trekk ble det foretatt en screening av mutageniserte gjærceller ved bruk av fluorescinerte antistoff rettet mot den ytre mannosekjede som forekommer på gjær av villtype. Mutantceller som ikke binder antistoff, ble ytterligere karakterisert og viste seg å mangle evnen til addisjon av asparagin-lenkede oligosakkarid-deler. For å optimalisere produksjonen av de heterologe proteinene, er det å foretrekke at vertsstammen er bærer av en mutasjon, så som gjær- PEP4-mutasjonen (Jones, Genetics 85: 23-33 (1977)), som resulterer i redusert proteolytisk aktivitet. For å optimalisere sekresjon av de heterologe proteinene, er det å foretrekke at vertsstammen er bærer av en mutasjon i PMR1 -genet (Smith, US-patent 5,057,416) som resulterer i en økning av sekresjonen av heterologe proteiner. Det kan være fordelaktig å bryte opp PMR1-genet.

I tillegg til soppceller kan dyrkede pattedyrceller benyttes som vertsceller heri. Foretrukne dyrkede pattedyrceller for bruk i henhold til foreliggende oppfinnelse, innbefatter COS-1-, (ATCC CRL 1650), BHK- og 293- (ATCC CRL-1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 6: 59-72 (1977)) cellelinjene. En foretrukket BHK-cellelinje er BHK570-cellelinjen (deponert ved American Type Culture Collection under aksesjonsnummer CRL 10314). I tillegg kan en rekke andre pattedyr-cellelinjer benyttes, herunder Rat Hep I (ATCC CRL 1600), Rat Hep II (ATCC CRL 1548), TCMK (ATCC CCL 139), humane lunge- (ATCC CCL 75.1), humane hepatom- (ATCC HTB-52), Hep G2 (ATCC HB 8065), muselever- (ATCC CCL 29.1), NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1) og DUKX-celler (Urlaub & Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei USA 77: 4216-4220 (1980)).

Pattedyr-ekspresjonsvektorer for bruk heri inkluderer en promoter som er i stand til å styre transkripsjonen av et klonet gen eller cDNA. Foretrukne promotere innbefatter virale promotere og cellulære promotere. Virale promotere innbefatter immediate early cytomegalovirus-promoteren (Boshart et al., Cell 41: 521-530 (1985)) og SV40-promoteren (Subramani et al., Mol. Cell. Biol. 1: 854-864 (1981)). Cellulære promotere innbefatter muse-metallothionein-l-promoteren (Palmiter et al., US-patent 4,579,821), en muse-VK-promoter (Bergman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81: 7041-7045 (1983); Grant et al., Nuc. Acids Res. 15: 5496 (1987)) og en muse-Vn-promoter (Loh et al., Cell 33: 85-93 (1983)). En særlig foretrukket promoter er major late-promoteren fra Adenovirus 2 (Kaufman & Sharp, Mol. Cell. Biol. 2: 1304-13199 (1982)). Slike ekspresjonsvektorer kan også inneholde et sett av RNA-spleiseseter (splice sites) lokalisert nedstrøms fra promoteren og oppstrøms fra DNA-sekvensen som koder for det aktuelle peptid eller protein. Foretrukne RNA-spleiseseter kan oppnås fra adenovirus og/eller immunglobulin-gener. I ekspresjonsvektoren inngår også et polyadenyleringssignal lokalisert nedstrøms for den aktuelle kodende sekvens. Polyadenyleringssignaler inkluderer de tidlige eller sene polyadenyleringssignaler fra SV40 (Kaufman & Sharp, ibid.), polyadenyleringssignalet fra Adenovirus 5 El B-området og genterminatoren for det humane veksthormon (DeNoto et al., Nuc. Acids. Res. 9: 3719-3730 (1981)). Ekspresjonsvektorene kan innbefatte en ikke-kodende viral ledersekvens, så som den Adenovirus 2 tredelte leder, lokalisert mellom promoter- og RNA-spleisesetene. Foretrukne vektorer kan også inkludere enhancer-sekvenser, så som SV40 enhanceren og muse-ji-enhanceren (Gillies, Cell 33: 717-728

(1983)). Ekspresjonsvektorer kan også innbefatte sekvenser som koder for adenovirus

VA RNA.

Klonede DNA-sekvenser kan innføres i dyrkede pattedyrceller, for eksempel ved kalsiumfosfatmediert transfeksjon (Wigler et al., Cell 14: 725 (1978); Corsaro & Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603 (1981); Graham & Van der Eb, Virology 52:456 (1973); som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse). Andre teknikker for innføring av klonede DNA-sekvenser i pattedyrceller, så som elektroporering (Neumann et al., EMBO J. 1: 841-845 (1982)) kan også benyttes. For å identifisere celler hvor det klonede DNA er integrert, innføres i alminnelighet en selekterbar markør i cellene sammen med det aktuelle gen eller cDNA. Foretrukne selekterbare markører for anvendelse i dyrkede pattedyrceller innbefatter gener som bevirker resistens overfor medikamenter som neomycin, hygromycin og metotrexat. Den selekterbare markøren kan være en amplifiserbar, selekterbar markør. En foretrukket amplifiserbar, selekterbar markør er DHFR-genet. Selekterbare markører omtales i en oversikt av Thilly (Mammalian Cell Technology. Butterworth Publishers, Stoneham, MA, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse). Utvalget av selekterbare markører vil være velkjent for fagmannen.

Selekterbare markører kan innføres i cellen på et eget plasmid samtidig med det aktuelle gen, eller de kan innføres på det samme plasmid. Skjer det på det samme plasmid, kan den selekterbare markør og det aktuelle gen styres av forskjellige promotere eller av den samme promoter, hvorav sistnevnte arrangement fører til et dicistronisk budskap. Konstruksjoner av denne type er kjent på området (for eksempel, Levinson & Simonsen, US-patent 4,713,339). Det kan også være fordelaktig å tilsette ytterligere DNA, kjent som "carrier DNA" til blandingen som føres inn i cellene.

Transfekterte pattedyrceller gis anledning til vekst i en tid, typisk 1-2 dager, for å begynne ekspresjonen av aktuell(e) DNA-sekvens(er). Medikamentseleksjon benyttes deretter for å selektere for vekst av celler som uttrykker den selekterbare markør på en stabil måte. For celler som er blitt transfektert med en amplifiserbar, selekterbar markør, kan medikamentkonsentrasjonen økes trinnvis for å selektere for øket kopiantall av de klonede sekvenser, hvorved ekspresjonsnivåene økes.

Foretrukne prokaryote vertsceller for gjennomføring av foreliggende oppfinnelse er stammer av bakterien Escherichia coli. men Bacillus og andre slekter er også anvendelige. Teknikker for å omdanne disse vertene og uttrykke fremmede gener som er klonet inn i disse, er velkjent på området (se f.eks. Maniatis et al. og Sambrook et al., ibid.). Vektorer som benyttes for å uttrykke fremmede gener i bakterielle verter vil i alminnelighet inneholde en selekterbar markør, så som et gen for antibiotisk resistens, samt en promoter som virker i vertscellen. Passende promotere inkluderer trp (Nichols & Yanofsky, Meth. Enzvmol. 101: 155-164 (1983)), lac (Casadaban et al., J. Bacteriol. 143: 971-980 (1980)) og fag-A,-promoter-systemene (Queen, J. Mol. Appl. Genet. 2: 1-10 (1983)). Egnede plasmider for transformering av bakterier innbefatter pBR322 (Bolivar et al., Gene 2: 95-113 (1977)), pUC-plasmider (Messing, Meth. Enzvmol. 101: 20-77 (1983), Vieira & Messing, Gene 19: 259-268 (1982)), pCQV2 (Queen, ibid.) og derivater derav. Plasmider kan inneholde både virale og bakterielle elementer. Fremgangsmåter for å oppnå proteinene i biologisk aktiv form er omtalt i US-patent 4,966,963 og 4,999,422, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse.

Promotere, terminatorer og egnede metoder for å innføre ekspresjonsvektorer som koder for gla-domeneløst protrombin i henhold til foreliggende oppfinnelse, i plante-, fugl-og insektceller, er tidligere beskrevet på dette fagområdet. Anvendelsen av for eksempel baculovirus som vektorer for å uttrykke heterologe DNA-sekvenser i insektceller er omtalt i en oversikt av Atkinson et al. fPestic. Sei. 28: 215-224 (1990)). Anvendelsen av Agrobacterium rhizo<g>enes som vektorer for å uttrykke gener i planteceller er omtalt i en oversikt av Sinkar et al., ( J . Biosci. ( Bandaore) 11:47-58 (1987)).

Vertsceller som inneholder DNA-konstruksjoner i henhold til foreliggende oppfinnelse, dyrkes deretter for produksjon av gla-domeneløst protrombin. Cellene dyrkes i henhold til standardmetodikk i et dyrkningsmedium som inneholder nødvendige nærings-stoffer for vekst av vertscellene. Det er på dette området kjent en rekke egnede medier som i alminnelighet innbefatter en karbonkilde, en nitrogenkilde, essensielle aminosyrer, vitaminer, mineraler og vekstfaktorer. Vekstmediet vil i alminnelighet selektere for celler som inneholder DNA-konstruksjonen, for eksempel ved medikamentselektering eller mangel av et essensielt næringsstoff som supppleres av den selekterbare markør på DNA-konstruksjonen eller ko-transfekteres med DNA-konstruksjonen.

Gjærceller dyrkes for eksempel fortrinnsvis i et kjemisk definert medium som omfatter en annen nitrogenkilde enn aminosyrer, samt uorganiske salter, vitaminer og supplerende essensielle aminosyrer. Mediets pH holdes fortrinnsvis høyere enn 2 og lavere enn 8, fortrinnsvis ved pH 6,5. Fremgangsmåter for å opprettholde en stabil pH innbefatter buffertilsetning og konstant pH-kontroll, fortrinnsvis ved tilsetning av natriumhydroksyd. Foretrukne buffere innbefatter ravsyre og Bis-Tris (Sigma, St. Louis, MO.). Gjærceller som har en defekt i et nødvendig gen for asparagin-koblet glykosylering, dyrkes fortrinnsvis i et medium som inneholder en osmotisk stabilisator. En foretrukket osmotisk stabilisator er sorbitol supplert til mediet i en konsentrasjon på mellom 0,1M og 1,5M, fortrinnsvis ved 0,5M eller 1,0M. Pattedyrceller dyrkes i alminnelighet i kommersielt tilgjengelige serum-holdige eller serumfrie medier. Valg av passende medium for den benyttede cellelinje vil være kjent for fagmannen.

Vertsceller inneholdende DNA-konstruksjoner som i henhold til foreliggende oppfinnelse koder for et gla-domeneløst protrombin, hvor faktor-Xa-spaltningssetet er erstattet med et trombinaktiveringssete, dyrkes fortrinnsvis i et kjemisk definert serumfritt medium. Serumfrie medier kan skaffes fra kommersielle kilder, for eksempel GIBCO-BRL (Gaithersburg, MD) eller fremstilles ved å benytte velkjente oppskrifter, for eksempel publisert av the American Type Culture Collection. Valg av passende mediekomponenter vil kunne foretas av fagmannen. Det kan være fordelaktig å lette aktiveringen av visse trombinforløpere dannet av disse transfektanter, ved tilsetning av heparin eller trombin. Nærmere bestemt kan aktiveringen av trombinforløpere inneholdende et trombin-spaltningssete, i stedet for villtypens trombinaktiveringssete (Arg-Ile), lettes ved tilsetning av heparin til mediet. Fortrinnsvis tilsettes mellom 0,5 og 5,0 U/mL heparin, gjerne mellom 1 og 5 U/mL og helst 1 U/mL heparin til det serumfrie mediet. For å aktivere proteinet fremstillet av celler inneholdende DNA-konstruksjoner som i henhold til foreliggende oppfinnelse koder for et gla-domeneløst protrombin, hvor faktor-Xa-aktiveringssetet er erstattet med et trombin-aktiveringssete, tilsettes mellom 0,5 og 5 ug/mL trombin, fortrinnsvis mellom 1 og 2 (j,g/mL trombin og helst 1 ug/mL trombin til det serumfrie medium.

Trombin-forløpere fremstillet i henhold til foreliggende oppfinnelse, kan renses ved konvensjonell kromatografi, fortrinnsvis ved å benytte farvestoffet cibacron blue F3GA som er blitt adherert til en fast matriks, så som AFFI-GEL® blue affinity gel (Bio-Rad, Richmond, CA). Trombin-forløpere kan elueres fra kolonnen med en saltkonsentrasjon på mellom 0,6 og IM NaCl, fortrinnsvis IM NaCl. Hovedfraksjonene, fastslått ved å måle absorbansen ved 280 nm, slås sammen. Blandingen fortynnes med 25 mM Tris, pH 7,4, og trombin-forløperne aktiveres ved tilsetning av mellom 1:1000 og 1:2000 (vektdeler) slangegitfaktivator (beskrevet mer utførlig nedenfor) beregnet på basis av en antatt proteinkonsentrasjon. Det aktiverte materialet renses ved kromatografi, fortrinnsvis ved å benytte para-aminobenzamidin koblet til en fast matriks, som f.eks. Benzamidine Sepharose 4B (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ). Trombin kan elueres fra kolonnen ved å utsettes for 15 mM benzamidin. Fraksjonene undersøkes med henblikk på kromogen aktivitet ved fortynning av alikvoter av fraksjonene og tilsetning av et trombin-kromogent substrat. De samlede fraksjonene kan avsaltes ved å overføre materialet til en G-25 kolonne (Bio-Rad).

Det kan være fordelaktig på forhånd å sende trombin-forløperne over en kolonne-matriks som er kryssbundet til heparin, så som AFFI-GEL heparin-gel (Bio-Rad, Richmond, CA) eller lignende, for å fjerne trombin og trombinlignende forurensninger. Alternativt kan trombin-forløperne renses ved affinitetskromatografi under bruk av anti-trombin-antistoff. Andre rensemetoder for trombin er beskrevet i US-patent 4,965,203, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse. Aktivert trombin fremstillet fra gla-domeneløse protrombiner som er aktivert i den sekretoriske bane eller er aktivert i dyrkningsmediet, kan renses ved kromatografi under bruk av para-aminobenzamidin koblet til en fast matriks som beskrevet ovenfor.

Rensede trombin-forløpere kan aktiveres ved å benytte en slange-aktivator fra en orm, som f.eks. Echis carnatus eller Vipera russellii. fortrinnsvis fra Echis carnatus som for eksempel beskrevet av Teng et al. ( Taxicon. 27:161-167 (1989)). Echis carnatus-aktivatoren renses fortrinnsvis ved suksessiv kromatografi gjennom Sephadex G-I 50 og DEAE-Sephadex A25 eller lignende, etterfulgt av gjentatt FPLC under bruk av en Mono-Q-kolonne. Alternativt kan rensede trombin-forløpere aktiveres ved å benytte faktor-Xa slik som i det vesentlige beskrevet av for eksempel Heldebrant et al. ( J . Biol. Chem. 248: 7149-7163 (1973)), Downing et al., f J. Biol. Chem. 250: 8897-8906 (1975)), og Krishnaswamy et al. ( J. Biol. Chem. 262: 3291-3299 (1987)). Trombin-forløpere som inneholder et trombin-aktiveringssete, kan aktiveres ved tilsetning av trombin.

Aktivert materiale renses fortrinnsvis ved å benytte en kolonne med S-Sepharose fast flow og en saltgradient, fortrinnsvis fra 100 mM til IM. Det rensede aktiverte materialet kan ytterligere renses ved omvendt-fase HPLC. Rensing ut over dette kan oppnås ved konvensjonelle kjemiske rensemetoder, som for eksempel væskekromatografi, gradientsentrifugering og gel-elektroforese. Metoder for rensing av protein er kjent på området (se i sin alminnelighet Scopes, R., Protein Purification, Springer-Verlag, NY

(1982) som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse) og kan anvendes for rensing av de her beskrevne trombin-forløpere. Tilnærmet rent trombin eller trombin-forløpere med minst 50% homogenitet, særlig 70-80% og, særlig for farma-søytiske anvendelser, helst 95-99% homogenitet, foretrekkes. Rekombinant trombin eller trombin-precursor kan etter ønsket partiell rensning eller rensning til oppmalt homogenitet, deretter benyttes ved fremstillingen av farmasøytiske preparater, etc.

Det rekombinante humane trombin fremstillet i henhold til foreliggende oppfinnelse finner en rekke anvendelser, men inngår særlig i farmasøytiske preparater for

behandling av koagulasjonsforstyrrelser i pattedyr, særlig mennesket. Trombinpreparatene ifølge oppfinnelsen kan benyttes terapeutisk som koaguleringsmiddel eller for å stabilisere koageldannelsen ved tilheling av sår, behandling av blødning i forbindelse med større eller mindre traumer eller kirurgi, forbrenninger, ulcerøse lesjoner, hudtransplantasjon, etc. De rekombinante trombinpreparatene kan også benyttes som komponenter i vevs-klebermdler, eller vevs-lim, for eksempel med preparater av faktor-VIII eller andre transglutaminaser.

Farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen er primært beregnet for lokal administrasjon på det aktuelle sår eller operasjonssted, etc, men kan også administreres intravenøst ved alvorlig leversvikt, svære traumer ledsaget av kraftig blødning og/eller blodoverføring, subarachnoid blødning og lignende. I alminnelighet kan trombinpreparatene ifølge oppfinnelsen administreres samtidig med andre koagulasjons-formuleringer for å oppnå forbedret effekt.

En rekke vandige bærere kan benyttes ved formulering av de farmasøytiske preparatene inneholdende rekombinant trombin, f.eks. bufferholdig vann, saltoppløsning, 0,3% glycin og lignende, innbefattet glykoproteiner for stabilitetsforbedring, så som albumin, lipoprotein, fibronektin og/eller globulin. Preparatene kan steriliseres ved hjelp av velkjent steriliseringsteknikk og oppløsningene bruksforpakkes eller lyofiliseres. Andre komponenter som inngår i farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen, kan innbefatte farmasøytisk akseptable hjelpestoffer i den utstrekning de fordres for å oppnå tilnærmet fysiologiske betingelser, så som pH-regulerende midler og buffere, midler til regulering av det osmotiske trykk og lignende, for eksempel natriumacetat, natriumlaktat, natriumklorid, kaliumklorid, kalsiumklorid, etc.

Til de rekombinante trombinpreparatene kan det dessuten også tilsettes andre komponenter, i alminnelighet samtidig med administrasjon til pasienten, for å øke deres effektivitet, så som kalsiumioner, proteaseinhibitorer (f.eks. aprotinin), fibrinogen, etc. Blandinger av prostaglandiner, andre koagulasjonsfaktorer, antihistaminer, vasopressiner, vekstfaktorer, vitaminer, antibiotika (f.eks. aminoglykosider, penicilliner, karbapenemer, sulfonamider, tetracykliner) og lignende kan også inngå. Formuleringer av ulike vevs-klebemidler for sår er utførlig behandlet i US-patent 4,427,650,4,442,655 og 4,655,211 som herved samtlige inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse.

Konsentrasjonen av terapeutisk effektive doser av det rekombinante humane trombin i farmasøytiske formuleringer, kan variere betydelig, dvs. fra ca. 100 til ca. 10.000

NIH standardenheter (hvor i alminnelighet 1 ug tilnærmet fullstendig renset trombinprotein tilsvarer ca. 3000 enheter) vanligvis fra minst ca. 500 til 5000 enheter og helst fra ca. 1000 til 2000 enheter, og vil primært bli valgt på basis av volumer, viskositeter, styrken av det resulterende kompleks, etc, i henhold til den tiltenkte anvendelse, alvorlighetsgraden av skaden eller blødningen, den valgte administrasjonsmåte, pasientens generelle helse-tilstand, etc. Man skal være oppmerksom på at materialene i alminnelighet vil bli benyttet ved alvorlige sykdoms- eller skadetilstander, det vil si i livstruende eller potensielt livstruende situasjoner. I slike tilfeller vil det som følge av minimaliseringen av fremmed-stoffer, nedsatt immunogenisitet og forlenget halveringstid og stabilitet av det rekombinante humantrombin som er muliggjort gjennom foreliggende oppfinnelse, være mulig og føles ønskelig av behandlende lege å administrere betydelige overskudd av disse trombinpreparatene.

De etterfølgende eksempler er tenkt som illustrasjoner.

EKSEMPLER

Restriksjons-endonukleaser og andre DNA-modifiserende enzymer (f.eks. T4-polynukleotidkinase, alkalisk fosfatase fra kalv, DNA-polymerase I (Klenow-fragment), T4-polynukleotidligase) ble anskaffet fra Boehringer Mannheim Biochemicals, Bethesda Research Laboratories (BRL) og New England Biolabs og benyttet i henhold til produsentens anvisning om intet annet er angitt.

Oligonukleotider ble syntetisert på en Applied Biosystems Model 380A DNA-syntesemaskin og renset ved polyakrylamidgel-elektroforese på denaturerende gel. E. coli-celler ble transformert som beskrevet av Maniatis et al. ( Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982 som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse) eller som beskrevet av Sambrook et al., ( Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, annen utgave, 1988, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse). Ml3- og pUC-kloningsvektorer og vertsstammer ble anskaffet fra BRL.

Eksempel 1

Kloning av et protrombin cDNA

Et cDNA som koder for humant protrombin ble isolert i det vesentlige som beskrevet av Degen et al. ( Biochemistry 22: 2087-2097 (1983); som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse). I korte trekk, ble et cDNA-bibliotek fremstillet fra human lever-RNA subklonet inn i Pst I-setet av plasmidet pBR322. cDNA-biblioteket var transformert E. coli og ca. 18.000 transformanter ble underkastet screening ved bruk av en samling av degenererte oligonukleotider med sekvensen 5' CCNGCRCAR AACAT 3' (Sekvens ID nr. 1). Ca. 30 positive kloner ble identifisert. Gjentatt screening av de positive klonene med et radioaktivt merket Ava I-Bam HI-retriksjonsfragment fra bovint protrombin cDNA, identifiserte 14 kloner som hybridiserte både til den degenererte oligonukleotid-samlingen og det bovine protrombin-cDNA. To av de positive klonene ble selektert for ytterligere karakterisering. En klon viste seg å inneholde den komplette humane protrombin-cDNA-sekvens. DNA-sekvensen og den derav deduserte aminosyresekvens av en human protrombin-cDNA-sekvens er vist i Sekvens ID nr. 2 og 3.

En protrombin-ekspresjonsvektor ble konstruert ved å benytte syntetiske oligonukleotider beregnet på koding av protrombin-lederen. Syntetiske oligonukleotider ble utviklet for ved annealing å danne en adapter som koder for den humane protrombin-leder som har en 5' Eco RI klebrig ende og en 3' Sst I ende. Oligonukleotidene ZC1378, ZC1379, ZC1323 og ZC1324 (Sekvens ID nr. henholdsvis 8,9,6 og 7) ble fosforylert (kinased) og renaturert (annealing) ved å benytte den metode som i det vesentlige er beskrevet av Sambrook et al. (ibid.) som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse). Den fosforylerte, renaturerte adapter ble ligert med M13mpl9 som var blitt linearisert ved kutting med Eco RI og Sst I. Ligeringsblandingen ble transformert til IL coli-stamme JM101, og enkelt-kjedet DNA preparert for sekvensanalyse. Etter at sekvensanalyse hadde identifisert en klon inneholdende den korrekte sekvens, ble RF DNA fremstillet fra klonen og kuttet med Eco RI og Sst I for å isolere det 160 bp lange fragment. Det leder-holdige fragment ble ligert til et partielt Sst I-Eco RI-fragment som koder for en del av et protein C cDNA oppnådd fra plasmid p594 og Eco Rl-linearisert, bakterielt alkalisk fosfatasert pDX (plasmidene p594 og pDX er beskrevet i samtidig overdratt US-patent 4,959,318 som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse). Ligeringsblandingen ble transformert til E. coli-stamme JM101 og plasmid-DNA fremstillet fra selekterte transformanter. Restriksjonsanalyse identifiserte en klon som hadde fragmentene i den korrekte orientering i forhold til promoteren. Protrombin-lederen ble oppnådd ved å kutte plasmidet med Eco RI og Apa LI for å isolere fragmentet på 756 basepar.

Resten av den protrombin-kodende sekvens ble oppnådd fra den opprinnelige cDNA-klon som ble kuttet med Apa LI og Barn HI for å isolere fragmentet på 1558 basepar og med Barn I og Pst I for å isolere fragmentet på 385 basepar. Syntetiske oligonukleotider ZC2490 og ZC2492 (Sekvens ID nr. 10 og 11) ble utviklet for etter annealing å danne en Pst I-Eco RI-adapter for å koble 3'-enden av protrombin-cDNA med Zem229R ekspresj ons vektoren.

Plasmidet Zem229 er en pUC18-basert ekspresjonsvektor som inneholder et unikt Bam HI-sete for innskudd av klonet DNA mellom muse-metallothionein-1-promoteren og SV40-transkripsjonsterminatoren og en ekspresj onsenhet inneholdende SV40 early promoter, muse-dihydrofolat-reduktase-genet og SV40-terminatoren. Zem229 ble modifisert for å utelate de to Eco RI-setene ved partiell kutting med Eco RI, "blunting" med DNA-polymerase I (Klenow-fragment) og dNTP, med påfølgende re-Iigering. Åpning av det resulterende plasmid med Bam HI og påfølgende ligering av det lineariserte plasmid med Bam HI-Eco RI-adaptere resulterte i et unikt Eco RI-kloningssete. Det resulterende plasmid ble betegnet Zem229R (Fig. 1).

Eco RI-Apa Ll-protrombin-lederfragmentet, det 1,5 kb lange Apa LI-Bam I II-protrombin-kodende sekvensfragment, det 0,385 kb lange Bam HI-Pst I-protrombin-kodende sekvensfragment og Pst-I-Eco-RI-adapteren ble ligert med Eco-RI-linearisert Zem229. Ligeringsblandingen ble transformert til E. coli og plasmid-DNA fremstillet fra selekterte transformanter. Restriksjonsanalyse identifiserte en klon som hadde det protrombin-kodende området innskutt i motsatt orientering i forhold til promoteren, og ble betegnet protrombin 4/229R bakover.

Eksempel 2

Konstruksjon av vevs-plasminogenaktivator-prepro-sekvensen

Vevs-plasminogenaktivator (tPA) prepro-sekvensen ble isolert fra Zeml69 som ble konstruert på følgende måte. En cDNA-klon som omfatter den kodende sekvens for modent tPA ble konstruert fra mRNA fra Bowes melanom-cellelinjen (Rijken & Coilen, J. Biol. Chem. 256: 7035-7041,1981). Dette cDNA ble deretter benyttet for å konstruere plasmidet pDR1296. E. coli-stammen JM83 transformert med pDR1296 er deponert ved American Type Culture Collection under aksesjonsnummer 53347.

En DNA-konstruksjon som omfatter MT-1-promoteren, den fullstendige tPA-kodende sekvens, innbefattet den naturlige tPA-prepro-sekvens, og terminatoren for humant veksthormon (hGH) ble satt sammen på følgende måte. Den naturlige tPA-prepro-sekvensen ble konstruert fra syntetiserte oligonukleotider og satt inn i pUC8 kuttet med Bam HI. Et Kpn I-Bam HI-fragment omfattende MT-1-promoteren ble isolert fra MThGHl 12 (Palmiter et al., Science 22: 809-814,1983) og innskutt i pUC18 for å konstruere Zem93. Plasmid EV 142, omfattende MT-1 og hGH-sekvenser i pBR322-derivatet pBX322 (Palmiter et al., ibid.) ble kuttet med Eco RI og fragmentet omfattende MT-1-promoter- og hGH-terminator-sekvensene isolert. Dette fragment ble klonet i Eco RI-kuttet pUC13 for å konstruere plasmidet Zem4. Zem93 ble deretter linearisert ved kutting med Bam HI og Sal I. Zem4 ble kuttet med Bgl II og Sal I og hGH-terminatoren renset. tPA-prepro-sekvensen ble fjernet fra pUC8-vektoren som et Sau 3A-fragment. De tre DNA-fragmentene ble deretter koblet sammen og et plasmid med tPA-prepro-sekvensen i korrekt orientering ble betegnet ZEM97. Zem97 ble kuttet med Bgl II og Bgl II-Bam HI-tPA-fragmentet fra pDR1296 skutt inn. Den resulterende vektor ble betegnet Zem99 (Fig. 2).

Som vist i Fig. 2 ble den tPA-kodende sekvens fra Zem99 deretter operativt koblet til NCF-13-promoteren (Yoshimura et al., Mol. Cell. Biol. 5:2832-2835, (1985)). MCF-13-promoteren ble oppnådd som et Pst I- og Sma I-fragment som ble ligert med Pst I-Sma I-linearisert pIC19H. Det resulterende plasmid, betegnet Zeml61 ble linearisert med Bgl II. Den tPA-kodende sekvens og den humane veksthormon-terminator ble isolert fra Zem99 som et Bam HI-fragment. Det Bgl II-lineariserte Zeml61 og Bam HI tPA-hGH-fragment ble ligert sammen. Et plasmid inneholdende innskuddet i korrekt orientering i forhold til promoteren ble betegnet Zeml69 (Fig. 2). tPA-ledersekvensen ble isolert fra Zeml69 ved kutting med Eco RI og Bgl U for å isolere det 120 bp lange fragment.

tPA-lederen ble deretter koblet til en sekvens som koder for protein C. Syntetiske oligonukleotider ZC1237 og ZC1238 (Sekvens ID nr. 4 og 5) ble konstruert for etter annealing å gi en adapter som koder for de første åtte aminosyrene i protein C og har en 5' Bgl II klebrig ende og en 3' Sst I klebrig ende. Oligonukleotidene ZC1237 og ZC1238 (Sekvens ID nr. 4 og 5) ble fosforylert i det vesentlige som beskrevet av Sambrook et al.

(ibid.). Den 3' protein-C-kodende sekvens ble oppnådd fra plasmid pDX/PC962 (som er beskrevet i samtidig verserende, samtidig overdratt U.S. Patent Application Serial No. 07/582,131 og PCT Publication WO 91/09953, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse), som inneholder SV40 ori-punktet og enhancer, adenovirus "major late" promoteren og 5'- og 3-spleisesetene, en protein C cDNA-sekvens og SV40 polyadenyleringssignalet. Plasmidet pDX/PC962 ble kuttet fullstendig med Eco RI og partielt med Sst I for å isolere det 1,5 kb lange fragment som inneholdt 3' protein-C-sekvensen. 120 bp Eco RI-Bgl II tPA-lederfragmentet, ZC1237 (Sekvens ID

nr. 4), ZC1238 (Sekvens ID nr. 5) og det 1,5 kb lange Sst I-Eco Rl-fragment ble koblet sammen med pDX (beskrevet i US-patent 4,959,318 som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse), som var linearisert ved åpning med Eco RI. Ligeringsblandingen ble transformert til E. coli-stammen HB 101, og plasmidet DNA fremstillet fra selekterte transformanter. Restriksjonsanalyse av de selekterte plasmidene viste at ett plasmid, betegnet tPA/pC/pDX, inneholdt fragmentene i korrekt rekkefølge og med korrekt orientering.

Eksempel 3

Konstruksjon av gla-domeneløse protrombin ekspresjonsenheter og ekspresjon i pattedyrceller

A. Konstruksjon av ThrlOO

Plasmid ThrlOO ble benyttet for å uttrykke et gla-domeneløst protrombin som inneholdt A-kjeden, aktiveringssetet og serinprotease-domenet av protrombin.

Et 60 basepar-fragment av tPA-ledersekvensen ble isolert fra plasmidet tPA/PC/pDX (Eksempel 2) ved kutting med Eco RI og Nar I. Adaptere ble konstruert ved å benytte syntetiske oligonukleotider (ZC3830, ZC3831, ZC3832 og ZC3833 (Sekvens ID nr. henholdsvis 12,13,14 og 15)), som førte til at de øvrige 60 basepar av tPA-ledersekvensen ble koblet til et DNA-segment som kodet for Arginin 415 til og med Glycin 431 i humant protrombin (Sekvens ID nr. 3). Denne adaptersekvens ble konstruert med en 5' Nar I klebrig ende og en 3' Ava I klebrig ende. Alle fire oligonukleotidene ble fosforylert uavhengig, og ble etter inaktivering av kinasen, kombinert og renaturert (annealing). Et 1035 basepar, Ava I- til Eco RI-protrombinfragment ble isolert fra plasmid protrombin 4/229R bakover (Eksempel 1).

Det 60 basepars Eco RI til Nar I tPA-lederfragment, Nar I til Ava I-adapteren, Ava I til Eco RI protrombinfragmentet og Eco RI-linearisert Zem229R-vektoren ble ligert. Ligeringsblandingen ble benyttet til transformering av E. coli-stamme HB 101. Plasmid DNA ble fremstillet fra åtte transformanter. Restriksjonsanalyse ved bruk av Nar I og Eco RI viste at én transformant inneholdt et innskudd med korrekt størrelse, men i omvendt orientering i forhold til promoteren. Plasmid DNA fra denne klon, betegnet #8, ble kuttet med Eco RI for å frigjøre hele innskuddet og det kuttede DNA ble religert for å oppnå en klon som hadde innskuddet i riktig orientering. En enkelt klon fra denne ligering ble vist å ha innskuddet i korrekt orientering. Denne klon, betegnet #1S, ble analysert videre ved bruk av Eco RI-, Pst I-, Ava I-, Nar I og Sac I-enzymer og ble funnet å inneholde alle DNA-fragmentene i korrekt størrelse og orientering i forhold til promoteren.

Plasmid DNA fra klon #15 ble benyttet ved en kalsiumfosfat-mediert transfeksjon (Wigler et al. ibid.) av BHK570-celler (deponert ved Americal Type Culture Collection, Rockville, MD, under aksesjonsnummer 10314). Transfeksjonsblandingen inneholdt 2-10 ug av plasmid DNA og 100 uM klorokin. Blandingen ble tilsatt til en 70% konfluent 10 cm petriskål inneholdende vekstmedium (Tabell 1) og inkubert ved 37°C og 5% CO2. Etter fire timer ble mediet fjernet og cellene gitt et glycerolsjokk i 1 minutt ved tilsetning av DMEM (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) inneholdende 15% glycerol. Etter inkubering ble glycerolmediet erstattet med vekstmedium (Tabell 1). 24 timer etter transfeksjon ble cellene trypsinisert og enten 10% eller 2,5% av cellene utplatet på nytt i seleksjonsmedium (Tabell 1). Cellene ble dyrket inntil veletablerte kolonier. Uavhengige kolonier ble overført til 24-brønns plater (American Scientific Products, Chicago, IL) og dyrket inntil konfluens. Ved konfluent cellelag ble mediet fra hver brønn erstattet med 0,5 mL serumfritt medium (Tabell 1).

Etter 24 timer i det serumfrie medium, ble mediene tatt ut og undersøkt med henblikk på reaktivitet ved en kromogen-basert bestemmelse (Eksempel 4). Det ble ikke påvist reaktivitet, og påfølgende sekvensanalyse av DNA fra klon #15 tilkjennega to mutasjoner. Sekvensen som omfattet oligonukleotid ZC3833 (Sekvens ID nr. 15) inneholdt en substitusjon ved base 42 fra T til A, hvilket resulterte i en Tyr- til Phe-substitusjon. Denne substitusjon er en konservativ substitusjon, og det ble fastslått at det ikke var nødvendig å korrigere sekvensen. I tillegg ble det funnet at sekvensen som omfattet oligonukleotid ZC3831 (Sekvens ID nr. 13) hadde en delesjon ved base 29 som forårsaket en rammeforskyvning.

For å korrigere delesjonen, ble plasmid DNA fra klon #15 kuttet med ECo RI og BssH I for å isolere det ca. 119 bp lange fragment som koder for tPA-leder- og ZC3833:ZC3830- (Sekvens ID nr. henholdsvis 15 og 12)adaptersekvensene. Plasmid DNA fra klon #15 ble også kuttet med Ava I og Eco RI for å isolere det ca. 1 kb lange fragment som inneholdt protrombinets cDNA-sekvens. Mutasjonene i oligonukleotidene ZC3831 og ZC3832 (Sekvens ID nr. 13 og 14) var resultatet av mindre konta-mineringer av oligonukleotidpreparatene, og som sådanne ble oligonukleotidene ikke syntetisert. Oligonukleotidene ZC383I og ZC3832 (Sekvens ID nr. 13 og 14) ble fosforylert og renaturert (annealing). Det 119 bp lange Eco RI-BssH I-fragment, den fosforylerte og . renaturerte ZC3831:ZC3832-adapter (Sekvens ID nr. 13 og 14), det 1 kb lange Ava I-Eco Rl-protrombinfragment og Eco Rl-lineariserte Zem229R ble ligert sammen. Ligeringsblandingen ble benyttet for transformering av XL-1-celler fra E. coli-stammen. Etter restriksjon og sekvensanalyse av plasmid DNA fra selekterte transformanter, ble flere kloner funnet å inneholde den korrekte sekvens omfattende ZC3831 (Sekvens ID nr. 13). En klon inneholdende den korrekte sekvens av ZC3831 (Sekvens ID nr. 13) og som omfattet muse-metallothionen-promoteren; tPA-lederen; A-kjeden og serinprotease-domenet i humant protrombin; og SV40-polyadenyleringssignalet, ble betegnet ThrlOO.

Alternativt kan begge mutasjonene repareres ved å religere alle deler av konstruksjonen som innledningsvis beskrevet og foreta en screening av de resulterende plasmider ved sekvensanalyse. Det var ikke behov for resyntetisering av oligonukleotidene, idet feilene som tidligere angitt, var ubetydelige kontaminanter i oligonukleotidpreparatene.

Plasmid ThrlOO ble benyttet til å transfektere BHK570-celler som beskrevet ovenfor. Transfektantene ble dyrket og mediene fra transfekterte celler undersøkt som beskrevet ovenfor. Den kromogen-baserte bestemmelse (Eksempel 4) viste at ThrlOO klon 1 uttrykte gla-domoneløst protrombin i 9,4 ug/mL og ThrlOO klon 3 uttrykte gla-domeneløst protrombin i 3,4 ug/mL.

B. Konstruksjon av ThrlOl

Plasmidet ThrlOl ble benyttet for å uttrykke et gla-domeneløst protrombin som inneholdet kringle 2, A-kjeden, villtype-trombin-aktiveringssetet og serinprotease-domenet i humant protrombin.

Den fulle 120 basepar tPA-leder ble isolert fra tPA/PC/pDX. Dette fragmentet ble isolert som et Eco RI-Bgl II-fragment. Syntetiske oligonukleotider ZC3858 og ZC3859 (Sekvens ID nr. 16 og 17) ble utviklet for å gi en 80 basepars adapter etter annealing. Adapteren koder for en human protrombinsekvens fra Serin 192 til og med Arginin 217 og inneholder en 5' Bgl II klebrig ende og en 3' Hae II klebrig ende. Den C-terminale protrombinsekvens ble oppnådd fra plasmid-protrombin 4/229R bakover (Eksempel 1) som et Hae II til Eco Rl-fragment.

Eco RI til Bgl II tPA-ledersekvensen, Bgl II til Hae II-adapteren, Hae II til Eco RI-protrombin-cDNA-fragmentet og Eco Rl-linearisert Zem229R ble ligert sammen. Ligeringsblandingen ble benyttet til å transformere E. coli-stamme HB 101, og plasmid DNA fra selekterte transformanter ble analysert ved å benytte Nar I, Eco RI, Pst I, Ava I, Sst I og Xho I. Denne analysen viste en klon som hadde et innskudd av forventet størrelse, men med omvendt orientering i forhold til promoteren. Det plasmide DNA fra denne klon, betegnet #1, ble kuttet med Eco RI for å frigjøre innskuddet fra vektoren og ble deretter religert. Plasmid DNA fra selekterte transformanter ble analysert ved restriksjonsanalyse for å finne en klon som hadde et innskudd i riktig orientering i forhold til promoteren.

En enkelt klon som hadde innskuddet i korrekt orientering, betegnet #21 og senere omdøpt ThrlOO, ble benyttet ved en kalsiumfosfat-mediert transfeksjon av BHK570-celler som tidligere beskrevet. De transfekterte cellene ble dyrket og uavhengige kolonier plukket og utplatet på 24- brønns plater som ovenfor beskrevet. Mediene ble skiftet til serumfrie medier straks cellene var konfluente. Etter 24 timer ble den kromogene aktiviteten bestemt ved bruk av en kromogenbasert bestemmelse (Eksempel 4). Klon #29 viste seg å uttrykke gla-domeneløst protrombin i 20 ug/mL.

C. Konstruksjon av Thrl02

Plasmid Thrl 02 ble benyttet for å uttrykke et gla-domeneløst protrombin som inneholdt kringle 1, kringle 2, A-kjeden, aktiveringssetet for villtype-trombin og serinprotease-domenet i humant protrombin.

Hele den 120 basepars tPA-leder ble isolert som et Eco RI-Bgl II-fragment fra plasmid tPA/PC/pDX (Eksempel 2). Syntetiske oligonukleotider ZC3860 og ZC3861 (Sekvens ID nr. 18 og 19) ble utviklet for ved annealing å danne en adapter som omfattet et DNA-segment som koder fra Serin 68 til Prolin 89 i humant protrombin og gir en 5' Bgl II klebrig ende og en 3' Xho I klebrig ende. En protrombin-cDNA-kodende kringle 1, kringle 2, A-kjeden, villtype-trombin-aktiveirngssetet og serinprotease-domenet ble isolert fra plasmid-protrombin 4/229R bakover som et Xho I-Eco Rl-fragment.

Eco RI til Bgl II tPA-ledersekvensen, Bgl II til Xho I-adapteren, Xho I til Eco RI-protrombin-cDNA-fragmentet, og Eco Rl-linearisert vektor Zem229R ble ligert. Ligeringsblandingen ble benyttet for å transformere E. coli-stamme HB101, og plasmid DNA fra selekterte transformanter ble analysert ved å benytte Nar I, Eco RI, Pst I, Ava I, Sst I, Xba I, BssH I og Xho I som tidligere beskrevet. En enkelt klon, betegnet Thrl 02, ble funnet å ha et innskudd av korrekt størrelse og i korrekt orientering i forhold til promoteren. Plasmid DNA fremstillet fra denne klon ble benyttet ved en kalsiumfosfat-mediert transfeksjon av BHK570-celler som ovenfor beskrevet. Uavhengige kolonier ble overført til 24-brønns plater og amplifisert i seleksjonsmedium inneholdende 10 uM metotrexat. Etter at cellene var konfluente ble gla-domeneløst protrombin målt ved å benytte en kromogen-basert bestemmelse (Eksempel 4). En klon, betegnet #15, ble vist å uttrykke gla-domeneløst protrombin i 9,9 p,g/mL.

D. Konstruksjon av KEX2 ekspresjonsvektor KEX2/Zem228

Saccharomyces cerevisiae KEX2-genet ble isolert fra et genbibliotek fra gjær ved å foreta en screening av transformerte kex2-mutantceller for fremstilling av en a-faktor halo på en plen av passende testerceller. Det ble oppnådd en klon som kompletterte alle rapporterte defekter av kex2-mutanter (parring, a-faktorproduksjon, modning av killer-toksin og sporulering i en homozygot diploidstamme). Genet ble subklonet inn i en pUC-vektor under kontroll av gjær GALI -promoteren. Det resulterende plasmid, betegnet pl515, er deponert ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD 20221 under aksesjonsnummer 67569. Plasmid pl 515 ble kuttet med Hind III og et 2,1 kb langt fragment tatt ut. Dette fragmentet ble ligert til Hind III-kuttet pUCl 8 for å konstruere plasmid pUCl 8/KEX2. KEX2-fraementet (2,1 kb) ble deretter isolert fra pUCl 8/KEX2 ved å kutte plasmidet partielt med Hind III og fullstendig med Bam HI. Resten av KEX2-sekvensen ble deretter isolert som et 0,43 kb langt fragment fra en

Bam HI + Hind III oppkutting av pl 515.

De to KEX2-fragmentene ble deretter ligert til Bam HI-setet av vektoren Zem228. Zem228 er en pUC18-basert ekspresjonsvektor som inneholder et unikt Bam HI-sete for innskudd av fremmed DNA mellom muse-metallothionein-I-promoteren og SV40-transkripsjonsterminatoren. Zem228 inneholder også en ekspresjonsenhet som omfatter SV40 early promoteren, et neomycin resistensgen og SV40-terminatoren. Det resulterende plasmid ble betegnet KEX2/Zem228.

£. Konstruksjon av plasmider inneholder alternative spaltningsseter i stedet for villtype-trombin-aktiveringssetet

Villtype-trombin-aktiveringssetet (Arg-Ile) ble erstattet med et aktiveringssete omfattende aminosyresekvensen RRKR (Sekvens ID nr. 34) ved adapterinnskudd av det alternative spaltningssete mellom A-kjeden og serinprotease-domenet av det protrombin-kodende område av ThrlOO. Oligonukleotidene ZC3932, ZC3933, ZC3934 og ZC3936 (Sekvens ID nr. henholdsvis 22,23,24 og 25) ble utviklet for ved annealing å gi en Sac I-Mro I-adapter som koder for et RRKR- (Sekvens ID nr. 34) aktiveringssete og flankerende A-kjede- og serinprotease-domene-sekvenser. Oligonukleotidene ZC3932 og ZC3934

(Sekvens ID nr. henholdsvis 22 og 24) ble begge fosforylert. Oligonukleotidparene ZC3933 og ZC3932 (Sekvens ID nr. henholdsvis 23 og 22) og ZC3936 og ZC3934 (Sekvens ID nr. henholdsvis 25 og 24) ble renaturert (annealing). Plasmid ThrlOO ble kuttet med Eco RI og Sac I for å isolere det 0,243 kb lange fragment som omfattet den 5' kodende sekvens av A-kjeden, og med Mro I og Eco RI for å isolere det 0,88 kb lange fragment som omfattet den 3' kodende sekvens av serinprotease-domenet. Oligonukleotidparene ble ligert med det 0,243 kb lange Eco RI-Sac I-fragmentet, det 0,88 kblange Mro I-Eco RI-fragmentet og Zem229R som var blitt linearisert ved åpning med Eco RI og behandlet med alkalisk fosfatase fra kalv for å hindre recyklisering. Den resulterende ligeringsblanding ble benyttet til å transformere E. coli-stamme XL-1-celler. Plasmid DNA fremstillet fra selekterte transformanter ble underkastet screening ved restriksjonsanalyse og et plasmid inne-holdende det gla-domeneløse protrombin-kodende område i korrekt orientering med hensyn til promoteren, ble betegnet Thrl 03.

En DNA-konstruksjon som kodet for Kringle 2, A-kjeden, et innskutt RRKR-aktiveringssete (Sekvens ID nr. 34) og serinprotease-domenet, ble konstruert fra plasmid Thrl03. Et 0,591 kb langt Eco RI-Sac I-fragment omfattende de Kringle 2 5' A-kjede-kodende sekvenser av humant protrombin ble oppnådd fra plasmid ThrlOl. Plasmid Thrl 03 ble kuttet med Sac I og Eco RI for å isolere det 0,97 kb lange fragment som omfatter den 3' kodende sekvens av A-kjeden i humant protrombin, det innskutte RRKR-aktiveringssete (Sekvens ID nr. 34) og den serinprotease-domene-kodende sekvens. Det 0,591 kb lange Eco RI-Sac I-fragment ble ligert med det 0,970 kb lange Sac I-Eco Rl-fragment og Zem229R som var blitt linearisert med Eco RI og behandlet med alkalisk fosfatase fra kalv for å forhindre recyklisering. Den resulterende ligeringsblanding ble benyttet til å transformere E. coli-stamme XL-1-celler. Plasmid DNA fremstillet fra selekterte transformanter ble underkastet screening ved restriksjonsanalyse, og et plasmid inneholdende det gla-domeneløse protrombin-kodende området i korrekt orientering med hensyn til promoteren, ble betegnet Thrl22.

En analog plasmidkonstruksjon omfattende et DNA-segement som koder for Kringle 2 i humant protrombin, A-kjeden i humant protrombin, et LDKR KEX2-spaltningssete som erstatter villtype-trombin-spaltningssetet (Sekvens ID nr. 35) og serinprotease-domenet i humant protrombin, ble fremstillet ved å benytte de samme restriksjonsoppkuttinger for å oppnå fragmenter omfattende den Kringle 2 kodende sekvens og den 5' kodende sekvens av A-kjeden; den 3' kodende sekvens av serinprotease-domenet; og vektorsekvensene. Disse fragmentene ble sammenføyd med en adapter som ga den 31 kodende sekvens av A-kjeden, den LDKR-spaltningssete-kodende sekvens (Sekvens ID nr. 35) og den 5' kodende sekvens av serinprotease-domenet for å danne plasmid Thrl 27.

Plasmid Thrl 22 og KEX2/Zem228 ble ko-transfektert til pattedyr-cellelinjen BHK570 (deponert ved American Type Culture Collection under aksesjonsnummer 10314) ved å benytte Boehringer Mannheim transfeksjonsreagenset N-[l-(2,3-dioleoyloksy)-propyl]-N,N,N-trimetyl-ammoniummetylsulfat (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) under bruk av anvisninger fra produsenten. Transfektantene ble dyrket og medier fra transfekterte celler undersøkt ved hjelp av den kromogenbaserte bestemmelse (Eksempel 4). Resultatene av den kromogenbaserte bestemmelse viste at klonene produserte ca. 300 ng/L trombin.

Villtype-trombin-aktiveirngssetet og to aminosyre-kodoner umiddelbart oppstrøms fra aktiveringssetet, ble erstattet med et DNA-segment som koder for RRKR (Sekvens ID nr. 34) for å konstruere et plasmid inneholdende et DNA-segment som koder for A-kjeden i det humane protrombin, et RRKR- (Sekvens ID nr. 34) spaltningssete og serinprotease-domenet i humant protrombin. Oligonukleotidene ZC4713, ZC4720, ZC4721 og ZC4722 (Sekvens ID nr. henholdsvis 26,27,28 og 29) ble utviklet for ved annealing å gi en Sac I-Mro I-adapter som koder for RRKR-spaltningssetet (Sekvens ID nr. 34), hvor den kodende sekvens er flankert av de 3' A-kjede- og 5' serinprotease-domene-kodende sekvenser. Oligonukleotidene ZC4720 (Sekvens ID nr. 27) og ZC4721 (Sekvens ID nr. 28) ble begge fosforylert og hver oligonukleotid renaturert (annealing) med dens tilhørende oligonukleotid (ZC4713:ZC4720 (Sekvens ID nr. henholdsvis 26 og 27) og ZC4721::ZC4722 (Sekvens ID nr. henholdsvis 28 og 29)). Plasmid ThrlOO ble kuttet med Eco RI og Sac I for å isolere det 0,243 kb lange fragment som koder for den 5' kodende sekvens av A-kjeden, og med Mro I og Eco RI for å isolere det 0,88 kb lange fragment som koder for den 3' kodende sekvens av serinprotease-domenet. Oligonukleotidparene ble ligert med det 0,243 kb lange Eco RI-Sac I-fragment, det 0,88 kb lange Mro I-Eco-RI-fragmentet og Zem229R, som var blitt linearisert ved åpning med Eco RI og behandling med alkalisk fosfatase fra kalv for å forhindre recyklisering. Den resulterende ligeringsblanding ble benyttet for å transformere E. coli-stamme XL-1-celler. Plasmid DNA fremstillet fra selekterte transformanter ble underkastet screening ved restriksjonsanalyse, og et plasmid inneholdende det gla-domeneløse protrombin-kodende område i korrekt orientering med hensyn til promoteren, ble betegnet Thrl 15.

En DNA-konstruksjon som koder for Kringle 2 og A-kjeden i humant protrombin, et RRKR-aktiveringssete (Sekvens ID nr. 34) som erstatter villtype-trombinaktiverings-setet, og to aminosyre-kodoner umiddelbart oppstrøms samt serinprotease-domenet i humant protrombin, ble konstruert fra plasmid Thrl 15. Et 0,51 kb langt Eco RI-Sac I-fragment som koder for Kringle 2 og den 5' A-kjede-kodende sekvens av humant protrombin ble oppnådd fra plasmid ThrlOl. Plasmid Thrl 15 ble kuttet med Sac I og Eco RI for å isolere det 0,97 kb lange fragment som omfattet den 3' A-kjede-kodende sekvens, det endrede aktiveringssetet og den serinprotease-domene-kodende sekvens. Det 0,591 kb lange Eco RI Sac I-fragmentet ble ligert med det 0,970 kb lange Sac I-Eco Rl-fragment og Zem229R som var blitt linearisert med Eco RI og behandlet med alkalisk fosfatase fra kalv for å hindre recyklisering. Den resulterende ligeringsblandingen ble benyttet til å transformere E. coli-stamme XL-1-celler. Plasmid DNA fremstillet av selekterte transformanter ble underkastet screening ved restriksjonanalyse, og et plasmid inne-holdende det gla-domeneløse protrombin-kodende område i korrekt orientering med hensyn til promoteren ble betegnet Thrl 21.

En analog plasmid-konstruksjon omfattende et DNA-segment som koder for Kringle 2 og A-kjeden i humant protrombin, et LDKR- (Sekvens ID nr. 35) KEX2-spaltningssete som erstattet villtype-trombin-aktiveringssetet, og de to aminosyre-kodonene umiddelbart oppstrøms for villtype-trombin-aktiveringssetet samt serinprotease-domenet av humant protrombin, ble fremstillet ved å benytte de samme restriksjonsseter for å oppnå fragmenter omfattende de Kringle 2- og 5' A-kjede-kodende sekvenser; den 3' kodende sekvens av serinprotease-domenet; og vektorsekvenser. Disse fragmentene ble koblet sammen med en adapter som førte til et DNA-segment som omfattet den 3' A-kjede-kodende sekvens, det LDKR-spaltningssete-kodende område og den serinprotease-domene-kodende sekvens for å danne Thrl28.

Plasmid Thrl21 og KEX2/Zem228 ble ko-transfektert til pattedyr-cellelinjen BHK570 (deponert ved ATCC under aksesjonsnummer 10314) ved å benytte Boehringer Mannheim Transfection-Reagent. Transfektantene ble dyrket og medier fra transfekterte celler undersøkt i henhold til den kromogenbaserte bestemmelse (Eksempel 4). Resultatet av den kromogenbaserte bestemmelse viste at klonene produserte tilnærmet 300 ng/mL.

F. Konstruksjon av plasmid Thrl 18

Villtype-trombin-aktiveringssetet (Arg-Ile) forekommende i plasmid ThrlOO, ble erstattet med et trombin-spaltningssete ved innskudd med adapter. Oligonukleotider ZC4738, ZC4781, ZC4741 og ZC4742 (Sekvens ID nr. henholdsvis 30, 33, 31 og 32) ble utviklet for etter annealing å gi en Sac I-Mro I-adapter inneholdende et DNA-segment som koder for den karboksylterminale del av A-kjeden, et trombin-spaltningssete og den aminoterminale del av serinprotease-domenet. Oligonukleotidene ZC4781 og ZC4741 (Sekvens ID nr. henholdsvis 33 og 31) ble hver fosforylert og renaturert (annealing) med den passende partner oligonukleotid (ZC4781::ZC4738 (Sekvens ID nr. henholdvis 33 og 30) og ZC4741 ::ZC4742 (Sekvens ID nr. henholdsvis 31 og 32)). Plasmid ThrlOO ble kuttet med Eco RI og Sac I for å isolere det 0,243 kb lange fragment som inneholdt den 5' kodende sekvens av A-kjeden i humant protrombin, med en Mro I og Eco RI for å isolere det 0,88 kb lange fragment inneholdende den 3' kodende sekvens av serinprotease-domenet i protrombin. De renaturerte (annealing) oligonukleotidparene ZC4781::ZC4738 (Sekvens ID nr. henholdsvis 33 og 30) og ZC4741::ZC4742 (Sekvens ID nr. henholdsvis 31 og 32) ble ligert med det 0,243 kb lange Eco RI-Sac I ThrlOO-fragmentet, Mro I-Eco RI Thrl 00-fragmentet og Zem229R som var blitt linearisert med Eco RI og behandlet med alkalisk fosfatase fra kalv for å forhindre recyklisering. En 3 uL alikvot av ligeringsblandingen ble transformert i E. coli-stamme XL-1-celler. Plasmid DNA fremstillet fra selekterte transformanter ble underkastet screening ved restriksjonsanalyse. Et plasmid inneholdende en DNA-sekvens som koder for A-kjeden i humant protrombin, et trombin-spaltningssete og serinprotease-domenet i humant protrombin i korrekt orientering i forhold til promoteren, ble betegnet Thrl 18.

Plasmid Thrl 18 ble transfektert til BHK570-celler ved å benytte Boehringer Mannheim Transfection Reagent som beskrevet ovenfor. Transfektantene ble dyrket og medier fra transfekterte celler undersøkt i henhold til den kromogenbaserte bestemmelse (Eksempel 4). En klon av transfekterte celler ble selektert, dyrket og utsådd i hver brønn av de to 6-brønns platene. Vekstmediet (Tabell 1) fra hver brønn ble erstattet med serumfritt medium (Tabell 1) inneholdende tilsetninger som vist i Tabell 2.

Platene ble inkubert i 24 timer ved 37°C, hvoretter mediet fra hver brønn ble undersøkt ved hjelp av den kromogenbaserte bestemmelse beskrevet i Eksempel 4 bortsett fra at aktiveringstrinnet med slangegiftaktivator ble utelatt. Resultatene av bestemmelsen er vist i Tabell 3 og tyder på at det gla-domeneløse protrombin fremstillet fra Thrl 18 er i stand til selvaktivering i nærvær av lave nivåer av heparin, slangegiftaktivator eller trombin.

For å undersøke autoaktiveringen av det gla-domeneløse protrombin fremstillet fra Thrl 18-transfekterte celler, ble en vilkårlig utvalgt Thrl 18-transfektert klon oppdelt på en 6-brønns plate og dyrket til konfluens i serumfritt medium. Til hver brønn ble det tilsatt 2 ug/mL trombin i 2 mL serumfritt medium, hvoretter platene ble inkubert. Etter 2 dager ble 90% av mediet fjernet og erstattet med friskt serumfritt medium uten trombin og platene igjen inkubert. Etter inkubering i 3 dager ble 90% av mediet fra hver brønn tatt ut og erstattet med friskt serumfritt medium uten trombin. En prøve av det brukte mediet fra hver brønn ble undersøkt i henhold til den kromogenbaserte bestemmelse. Resultatene viste at cellene produserte ca. 2,5 ug/mL trombin. Platene ble inkubert i 3 dager, hvoretter 90% av mediet ble erstattet som tidligere, og en alikvot av det brukte mediet undersøkt som ovenfor. Resultatet av undersøkelsen viste at cellene produserte ca. 2 ug/mL trombin. Platene ble inkubert i 4 dager og mediet byttet ut og undersøkt som beskrevet ovenfor. Resultatet av undersøkelsen viste at cellene produserte ca. 1 ug/mL trombin.

Eksempel 4

Rensing av trombin-forløpere og aktivitetsbestemmelser

A. Rensing av trombin fra transfekterte vertsceller

Trombin-forløpere ble renset fra selekterte transfektanter som var dyrket under seleksjon til konfluens i 150 mm vevskultur-skåler. Etter at transfektantene hadde nådd konfluens, ble det brukte mediet fra hver skål tatt ut, kassert og erstattet med 25 mL serumfritt medium (Tabell 2). To eller tre ganger per uke ble brukt medium oppsamlet og oppbevart ved -20°C og hver skål tilsatt 25 mL friskt serumfritt medium. Oppbevarte medier for hver transfektant ble opptint, slått sammen og filtrert gjennom et 0,45 um filter (Nalge, Rochester, NY). Det filtrerte mediet ble tilsatt natriumazid til en sluttkonsentrasjon på 0,2 volumprosent.

Filtrerte medier fra Thrl02-transfektanter ble anbragt på en AFFI-GEL® BLUE kolonne (Bio-Rad, Richmond, CA). Trombin-forløperne ble eluert fra kolonnen med IM NaCl, 25 mM Tris pH 7,4. A2go-toppen ble oppsamlet. Dersom volumet av den oppsamlede topp er for stort, kan prøven konsentreres ved å benytte en Centricon concentrator (Amicon, Arlington Heights, IL). De samlede fraksjonene ble fortynnet to ganger med 25 mM Tris, pH 7,4.

Renset Echis carinatus-giftaktivator ble anskaffet fra Dr. Walt Kisiel (University of Mexico, Albuquerque, NM). I korte trekk ble slangegiftaktivatoren renset fra rågiften ved suksessiv gelfiltrering på Sephadex G-I50, DEAE-Sephadex A25 kolonner med påfølgende gjentatt MONO Q FPLC. Ved SDS-polyakrylamid-gelelektroforese med og uten nærvær av merkaptoetanol, vandret giftaktivatoren som et enkelt bånd med en tilsynelatende Mr på 80.000. Den rensede aktivator ble oppløst i 0,5 Tris HC1, pH 8,0, inneholdende ca. 0,2M NaCl.

Trombin-forløperne i de samlede A28t>-topper ble aktivert ved tilsetning av slangegiftaktivator i en fortynning på mellom 1:1000 og 1:2000 (vektdeler) på basis av en anslått proteinkonsentrasjon. Blandingen ble inkubert i 4 timer ved 37°C for å muliggjøre fullstendig aktivering av hovedproteinet. Etter inkuberingen ble materialet anbragt på en Benzamidine Sepharose 4B kolonne (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ). Kolonnen ble vasket med IM NaCl, 25 mM Tris, pH 7,4, og eluert med 15 mM benzamidin i TBS. Fraksjoner ble oppsamlet og alivoter av hver prøve fortynnet 200 til 500 ganger i TBS, 1 mg/mL BSA. En alikvot på 20 til 50 uL av hver fortynnet prøve ble undersøkt ved kromogenbasert bestemmelse for å identifisere de fraksjoner som inneholdt trombinakti vitet.

Humant plasma-protrombin (fra Dr. Walt Kisiel, University of New Mexico; humant protrombin kan anskaffes fra Sigma, St. Louis, MO) ble benyttet som standard ved den kromogenbaserte bestemmelse. 20 ug humant plasmaprotrombin ble seriefortynnet i TBS, pH 7,4 (Sambrook et al., ibid.) + 1 mg/mL bovint serumalbumin til konsentrasjoner på 20 ug/mL, 10 ug/mL, 5 ug/mL, 2,5 ug/mL, 1,25 ug/mL, 0,625 ug/mL, 0,312 ug/mL og 0,156 ug/mL. To parallelle 10 uL standarder ble tilsatt til brønner i en 96-brønns mikrotiterplate. 20 til 50 mikroliter av hver prøve og 10 uL av hver standard ble tilsatt til brønnene i en 96-brønns mikrotiterplate. Hver prøve og standard ble tilsatt 40 uL 1 mM trombin-kromogent substrat (American Diagnostica, New York, NY). Buffer (TBS, 1 mg/mL BSA) ble tilsatt til hver prøve og standard for å bringe det endelige prøvevolum opp til 100 uL. Platene ble inkubert i ca. 5 minutter ved romtemperatur for å gi mulighet for farveutvikling. Absorbansen ved 405 nm ble avlest for hver standard og prøve. Fraksjoner som viste høy trombinaktivitet ble slått sammen. De samlede fraksjonene kan avsaltes ved å anbringe materialet på en G-25 kolonne (Bio-Rad).

B. Kromogenbasert bestemmelse

Kromogenbaserte bestemmelser for å fastslå trombinaktivitetsnivåene ble foretatt ved å tilsette 10 uL passende fortynnet prøve (i TBS, pH 7,4,1 mg/mL BSA) eller standard (beskrevet ovenfor) til brønner i en 96-brønns mikrotiterplate. Hver prøve ble tilsatt 80 uL av 0,5 ug/mL slangegiftaktivator, fortynnet i TBS, pH 7,4 + 1 mg/mL bovint serumalbumin. Prøvene ble inkubert ved 37°C i 1 time. Etter inkubering ble 50 uL 0,5 mM trombin-kromogent substrat (American Diagnostica, New York, NY) tilsatt, hvoretter platene fikk inkuberes ca. 5 min. ved romtemperatur for å gi mulighet for farveutvikling. Absorbansen ved 405 nm ble avlest for hver standard og prøve. Gjennomsnittet av prøvenes absorbansverdier ble sammenlignet med standardkurven for å bestemme den foreliggende mengde av aktiverbar trombin-precursor.

Hovedprøven ble fortynnet 8 ganger med vann og tilsatt E. carinatus-aktivator til et vekt:vekt forhold mellom aktivatonaktiverbar trombin-precursor fra 1:100 til 1:1000. Prøven ble deretter inkubert fra 1 til 4 timer ved 37°C. Alikvoter av den aktiverte prøve ble underkastet elektroforese i reduserende og ikke-reduserende akrylamidgel for å bekrefte omdannelsen av precursoren til trombin.

Eksempel 5

Konstruksjon av Gla-domeneløse protrombin-ekspresjonsenheter og ekspresjon i gjærceller

A. Konstruksjon av pZHIO

En DNA-konstruksjon omfattende et DNA-molekyl som koder for en trombin-precursor omfattende Kringle 2, A-kjeden og serinprotease-domenet i humant protrombin ble satt sammen. Plasmid-protrombin, omfattende den protrombin-kodende sekvens subklonet som et Pst I-fragment i plasmid pBR322, ble kuttet med Nar I og Bel I for å isolere det 1,2 kb lange fragment som koder for den Kringle 2 kodende sekvens, den A-kjede-kodende sekvens og den 5' kodende sekvens av serinprotease-domenet i humant protrombin.

TPI1 -promoteren. MFal -signalsekvensen og TPI1 -terminatorsekvensene ble oppnådd fra en pretrombin-ekspresjonsenhet konstruert ved først å fremstille en syntetisk Hind III-Sst I-adapter som omfattet en gjær-kodon-optimalisert sekvens som koder for aminosyrene Ser-Leu-Asp, svarende til aminosyrene 81-83 i alfafaktor-preprosekvensen, et Lys-Arg KEX2-spaltningssete og den aminoterminale aminosyresekvens av pretrombin (aminosyrene 308 til og med 345 av Sekvens ID nr. 1). Oligonukleotidene ZC1562, ZC1563, ZC1564 og ZC1565 (Sekvens ID nr. henholdsvis 39,40,41 og 42) ble fosforylert og renaturert (annealing) for å danne Hind III-Sst I-adapteren beskrevet ovenfor. En annen oligonukleotid-adapter ble syntetisert for etter annealing å gi en Bel I-Xba I-adapter som omfatter en gjær-kodon-optimalisert sekvens som koder for de karboksylterrninale aminosyrene i pretrombin (aminosyrene 611 til 615 av Sekvens ID nr. 1) etterfulgt av en stoppkodon. Syntetiske oligonukleotider ZC1629 og ZC1630 (Sekvens ID nr. henholdsvis 43 og 44) ble fosforylert og renaturert (annealing) for å danne Bel I-Xba I-adapteren. Plasmid-protrombin ble kuttet med Sst I og Bel I for å isolere det 787 basepar lange protrombinfragmentet. Hind III-Sst I-adapteren, Sst I-Bcl I-protrombinfragmentet og Bel I-Xba I-adapteren ble sammenføyet med Hind III-Xba I-linearisert pUC19 ved en fireveis ligering. Det resulterende plasmid, betegnet pTHRl, omfatter et DNA-segment som koder for den aminoterminale aminosyresekvens av MFal-signalet, et KEX2-spaltningssete og et humant pretrombin.

TPI 1-promoteren og alfafaktor-signalsekvensen ble oppnådd fra plasmid-pTGFaCB. Plasmidet pTGFaCB ble oppnådd fra plasmid pB12, som omfatter TPI1-promoteren, MFal-signalsekvensen. PDGF-BB-sekvensen, TPI 1 -terminatoren og pIC19R-vektorsekvensen. Konstruksjonen av pB12 er omtalt i US-patent 4,766,073, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse. MFq 1 -signalsekvensen og PDGF-BB-sekvensen fra pB12 ble subklonet som et Eco Rl-Xba I-fragment i Ml3. Sst I-setet i MFal -signalsekvensen ble endret til et Hind III-sete ved in vitro mutagenese ved å benytte fremgangsmåten beskrevet av Kunkel et al. (US-patent 4,873,192, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse) og oligonukleotid ZC1159 (Sekvens ID nr. 36). En klon med Hind III-sete i stedet for Sst I-sete ble identifisert. Et fragment inneholdende MFal -signalsekvensen ble isolert som et Eco RI-Hind in-fragment. Eco RI-Hind UJ-fragmentet inneholdende MFal -signalsekvensen og et Hind III-Xba I-fragment inneholdende en syntetisert transformerende vekstfaktor a- (TGFa) kodende sekvens ble ligert med Eco Rl-Xba I linearisert pUC13. Det resulterende plasmid, betegnet afTGFa/pUC13, ble kuttet med Eco RI og Xba I for å isolere MFal -TGFa-innskuddet som ble klonet i pl70CB/pBR. Konstruksjonen av plasmid pl70CB/pBR er beskrevet av Murray (samtidig verserende U.S. Patent Application Serial No. 07/557,219 og

WO 92/01716, som herved inkorporeres med hele sitt innhold i foreliggende beskrivelse).

Den inneholder TPI 1-promoteren. MFal-signalsekvensen, den PDGF-BB-kodende sekvens, TPI 1 -terminatoren og pBR322 vektorsekvensene. Plasmid pB170CB/pBR ble kuttet med Eco Rl-Xba I for å isolere fragmentet inneholdende TPI 1 -promoteren. pBR322-vektorsekvensen og TPI 1-terminatoren. Eco Rl-Xba I pB170CB/pBR-fragmentet og Eco Rl-Xba I MFal -TGFa-fragmentet ble ligert. Det resulterende plasmid, betegnet TGFaCB, omfatter TPI 1 -promoteren. MFal-signalsekvensen, en TGFa-kodende sekvens og TPI 1 -terminatoren.

For å konstruere en pretrombin-ekspresjonsvektor, ble plasmid TGFaCB kuttet med Hind III og Xba I for å isolere fragmentet inneholdende MFal-signalet. TPI 1 -promoteren. pBR322 vektorsekvensene og TPI 1 -terminatoren. Plasmid pTHRl ble kuttet med Hind III og Xba I for å isolere den MFal-pretrombin-kodende sekvens. De to fragmentene ble ligert, og det resulterende plasmid ble betegnet pTHR2.

Ved konstruksjonen av en gjær-ekspresjonsenhet som kunne styre sekresjonen av et gla-domeneløst protrombin, tjente plasmid pTHR2 som kilde for TPI 1-promoteren. MFal-signalsekvensen og TPI 1 -terminatoren. Plasmid pTHR2 ble kuttet med Hind III og Bel I for å isolere det 5,97 kb lange fragmentet som omfattet TPH-terminatoren, vektorsekvensene, TPI 1-promoteren og MFal -signalsekvensen. En adapter for å tilføye MFal-prepro til det andre Kringledomenet via et KEX2-spaltningssete, ble dannet ved fosforylering og renaturering (annealing) av oligonukleotidene ZC5344 (Sekvens ID nr. 47) og ZC5345 (Sekvens ID nr. 48). Adapteren omfatter Hind HI- og Nar I-klebrige ender som flankerer en DNA-sekvens som koder for et KEX2-spaItningssete umiddelbart forut for aminosyrene Serin, aminosyre 192 til 216 av protrombin (Sekvens ID nr. 2). En annen adapter som inneholdt 15 basepar av det terminale protrombin-kodende område og klebrige ender for tilføyelse av 3-enden avtrombin-precursorens kodende sekvens medTPJl-terminatoren, ble dannet ved fosforylering og renaturering (annealing) av oligonukleotidene ZC1630 (Sekvens ID nr. 44) og ZC1629 (Sekvens ID nr. 43). Det 5,97 kb lange fragment fra pTHR2, ZC5344/ZC5345-adapteren, det 1,2 kb lange fragment fra protrombin og ZC1630/ZC1629-adapteren ble ligert for å danne plasmid pZH6. Plasmid pZH6 omfatter TPI 1-promoteren: MFal-signalsekvensen; Kringle 2, A-kjeden og serinprotease-domenet i humant protrombin; og TPI 1-terminatoren.

Plasmid pDPOT ble oppnådd fra plasmid pCPOT ved å erstatte det 750 bp lange Sph I-Bam HI-fragment av pCPOT inneholdende 2 mikron og pBR322-sekvenser med et 186 bp langt Sph I-Bam HI-fragment oppnådd fra pBR322 tetracyklin-resistens-genet.

(Plasmid pCPOT er deponert ved ATCC som en E. coli-stamme HBlOl-transformant og er tildelt aksesjonsnummer 39685. Det omfatter det hele 2 mikron plasmid-DNA, leu2- d-genet, pBR322-sekvenser og Schizosaccharomvces pombe POT1 -genet).

Plasmid pRPOT ble oppnådd fra plasmid pDPOT ved å erstatte Sph I-Bam HI-fragmentet med en polylinker. Plasmid pDPOT ble kuttet med Sph I og Bam HI for å isolere det 10,8 kb lange fragmentet. Oligonukleotider ZC1551 og ZC1552 (Sekvens ID nr. 37 og 38) ble utviklet for å danne en adapter med en Bam HI klebrig ende og en Sph I klebrig ende som flankerer Sma I, Sst I og Xho I restriksjonsseter. Oligonukleotider ZC1551 og ZC1552 (Sekvens ID nr. 37 og 38) ble fosforylert og renaturert (annealing) for å danne Bam HI-Sph I-adapteren. Det 10,8 kb lange pDPOT-fragmentet ble sirkularisert ved ligering med ZC1551/ZC1552-adapteren. Det resulterende plasmid ble betegnet pRPOT.

Ekspresjonsenheten som foreligger i plasmid pZH6 ble subklonet i pRPOT ved først å kutte pZH6 med Bgl II og Hind III for å isolere det 1,2 kb lange fragment som omfatter TPI 1-promoteren og MFal-prepro. Plasmid pZH6 ble også kuttet med Hind III og Sph I for å isolere det 2,2 kb lange fragment som omfatter den trombin-precursor-kodende sekvens og TPI 1 -terminatoren. De to fragmentene ble ligert sammen ul Bam HI-Sph I-linearisert pRPOT. Det resulterende plasmid ble betegnet pZHIO.

B. Konstruksjon av pZH8

En DNA-konstruksjon omfattende et DNA-molekyl som koder for en trombin-precursor omfattende Kringle 1, Kringle 2, A-kjeden og serinprotease-domenet i humant protrombin ble fremstillet. Plasmid-protrombin ble kuttet med Xho I og Bel I for å isolere det 1,6 kb lange fragment som omfatter et DNA-segment som koder for de Kringle 1 og 2 kodende sekvenser, den A-kjede-kodende sekvens og den 5' kodende sekvens av serinprotease-domenet. Plasmid pZH6 ble kuttet med Hind III og Bel I for å isolere det 5,99 kb lange fragment som omfattet MFal -signalsekvensen. TPI 1 -promoteren. vektorsekvenser, TPI 1 -terminatoren og de terminale 15 basepar av den protrombin-kodende sekvens. En adapter for å tilføye MFal-prepro til Kringle 1 ble dannet ved fosforylering og renaturering (annealing) av oligonukleotidene ZC5339 (Sekvens ID nr. 45) og ZC5340 (Sekvens ID nr. 46). Adapteren omfatter en 5' Hind III klebrig ende som ødelegger Hind III-setet, et DNA-segment som koder for et KEX2-spaltningssete umiddelbart forut for aminosyrene Serin, aminosyre 68 til 89 av protrombin (Sekvens ID nr. 2) og en 3' Xho I klebrig ende. Det 1,5 kb lange Xho I-Bcl I-fragment fra plasmid-protrombin, det 5,99 kb lange Bel I-Hind ni-fragment fra pZH6 og Hind ni-Xho I-adapteren ble ligert sammen for å konstruere plasmid pZH5.

Ekspresjonsenheten forekommende i plasmid pZH5 ble subklonet til pRPOT ved først å kutte pZH5 med Bgl II og Xho I for å isolere det 1,31 kb lange fragment som omfatter TPI 1-promoteren og MFal-prepro. Plasmid pZH5 ble også kuttet med Xho I og Sph I for å isolere det 2,45 kb lange fragment som omfatter den trombin-precursor-kodende sekvens og TPI 1 -terminatoren. De to fragmentene ble ligert inn i Bam HI-Sph I-linearisert pRPOT, Det resulterende plasmid ble betegnet pZH8.

C. Ekspresjon av pZHIO og pZH8 i gjærceller

Plasmider pZHIO, som omfatter et DNA-segment som koder for det andre kringle-, A-kjede- og serinprotease-domenet av trombin og pZH8, som omfatter et DNA-segment som koder for Kringle 1 og 2, A-kjeden og serinprotease-domenet av trombin, ble transformert til Saccharomvces cerevisiae-stammer ZM114 (MATa leu2- 3. 112 ade2- 101 ura3- 52 pep4::TPIlprom- CAT ea! 2 suc2- 9 tpil::URA3 vpt31 ogZM118 fMATa/ MATa ura3/ ura3 tpil::URA3/ tpil::URA3 bari/bari pep4::URA3/ pep4::URA3 [cir°]) ved å benytte fremgangsmåten som i det vesentlige er beskrevet av Hinnen et al.

(ibid.). Transformanter ble selektert med henblikk på deres evne til å vokse i nærvær av glukose som eneste karbonkilde.

Selekterte ZM114 og ZM118 transformanter ble bestemt med henblikk på deres evne til å produsere aktiverbart trombin ved inokulering av 5 mL overnatt-YEPD-kultur av hver transformant i 1,2 L YEPD + 6% glukose i en 2,5 L flaske under inkubering av kulturen i 60 timer ved 30°C i et risteapparat. Prøver å 100 mL tatt ut etter 24, 36, 48 og 60 timer etter inokuleringen. Prøvene ble sentrifugert og det brukte mediet undersøkt med henblikk på nærvær av aktivert trombin ved hjelp av en kromogenbasert bestemmelse.

Humane plasma-protrombin-standarder ble fremstillet ved å benytte humant plasmaprotein fra Dr. Walt Kisiel (University of New Mexico). Det humane protrombin ble fortynnet i aktiveringsbuffer (beskrevet nedenfor) til 5,0 ug/mL, 2,5 ug/mL, 2,0 ug/mL,

1,5 ug/mL, 1,0 ug/mL, 0,5 ug/mL, 0,4 ug/mL og 0,3 ug/ml. Parallellprøver av standard ble tilsatt til brønnene i en 96-brønns mikrotiterplate.

Til hver 20 uL prøve supernatant ble det tilsatt 80 uL av 1 ug/mL slangegiftaktivator fortynnet i aktiveringsbuffer (20 nM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 0,2% Na-azid). Prøvene ble inkubert ved 37°C i 1 time. Etter inkubering ble 100 uL 0,25 mM trombin-kromogent substrat (American Diagnostica) tilsatt, hvoretter platene fikk inkuberes i 1 til 3 timer for å gi mulighet for farveutvikling. Absorbansen ble målt ved 405 nm for hver standard og prøve. Gjennomsnittsverdiene av prøvenes absorbans ble sammenlignet med standardkurven for å bestemme mengden av foreliggende aktivert trombin-precursor. Tabell 3 viser forsøksresultatene.

Claims (20)

1. DNA konstruksjon som kan styre ekspresjonen av en trombinforløper, karakterisert ved at den omfatter følgende operabelt koblete elementer: en transkripsjonspromotor, et DNA segment kodende for protrombin som mangler en funksjonell gla domene og en transkripsjonen terminator.

2. DNA konstruksjon ifølge krav 1, karakterisert ved at promoteren er muse-metallotionein-1 promoter, adenovirus major late-promoter, Saccaromyces cerevisiae TPI1 promoter eller Saccaromyces cerevisiae ADH2-4C promoteren.

3. DNA konstruksjon ifølge krav 1 eller krav 2, karakterisert ved at den videre omfatter en signalsekvens.

4. DNA konstruksjon ifølge krav 3, karakterisert ved at signalsekvensen er human vevs plasminogen aktivator leder sekvens, human a-2 plasmin inhibitor signalsekvens, Saccaromyces cerevisiae BARI sekretorisk signalsekvens eller Saccaromyces cerevisiae MFal signalsekvens.

5. DNA konstruksjon ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at DNA segmentet koder for human protrombin som mangler en funksjonell gla domene.

6. DNA konstruksjon ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene, karakterisert ved at DNA segmentet kodende for protrombin som mangler en funksjonell gladomene omfatter (i) kringle 1, kringle 2, A kjeden, et aktiveringssete og serin protease domene til protrombin; (ii) kringle 2, A kjeden, et aktiveringssete og serin protease domene til protrombin; eller (lii) A kjeden, et aktiverinssete og serin protease domene til protrombin.

7. DNA konstruksjon ifølge krav 6, karakterisert ved at aktiveringssete kan spaltes av en slangevenomaktivator, trombin eller Saccaromyces cerevisiae KEX2 gen produkt.

8. Vertscelle, karakterisert ved at det er innført en DNA konstruksjon ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene.

9. Vertscelle ifølge krav 8, karakterisert ved at vertscellen er en pattedyr-celle eller soppcelle.

10. Vertscelle ifølge krav 8, karakterisert ved at vertscellen er en gjærcelle.

11. Vertscelle ifølge krav 10, karakterisert ved at gjærcellen har en mutasjon i MNN9 genet, MNN1 genet, PMR1 genet eller PEP4 genet.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av en trombinforløper, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: dyrking av en vertscelle ifølge hvilket som helst av kravene 8 til 11 under egnede betingelser for å muliggjøre ekspresjon av trombinforløperen kodet av DNA segmentet; og isolering av trombinforløperen fra vertscellen.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av trombin, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: dyrking av en vertscelle ifølge et hvilket som helst av kravene 8-11 under egnede betingelser for å muliggjøre ekspresjon av trombinforløperen kodet av DNA segmentet og aktivering derav til trombin i vertscellen; og isolering av aktivert trombin fra vertscellen.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av trombin, karakterisert ved at den omfatter følgende trinn: dyrking av en vertscelle, hvori det er blitt innført en DNA konstruksjon ifølge krav 3 eller krav 4, i et egnet medium og under betingelser som muliggjør ekspresjon av trombinforløperen som blir kodet av DNA segmentet; aktivering av trombinforløper til trombin; og isolering av trombin fra mediet.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at DNA sekvensen koder for human protrombin som mangler en funksjonell gla domene.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14 eller krav 15, karakterisert ved at protrombin som mangler en funksjonell gladomene omfatter (i) kringle 1, kringle 2, A kjeden, aktiveringssete og serinprotease domene til protrombin; (ii) kringle 2, A kjeden, aktiverinssete og serinprotease domene til protrombin; (iii) A kjeden, et aktiveringssete og serinprotease domene til protrombin.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at aktiveringssetet kan spaltes av trombin.

18. Farmasøytisk sammensetning, karakterisert ved at den omfatter et gla-domeneløst rekombinant human protrombin som kodes for en DNA sekvens ifølge kravene 1-7.

19. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 18, karakterisert ved at den er for anvendelse i terapi.

20. Anvendelse av et gla domeneløst rekombinant human protrombin, kodet for av DNA sekvensen ifølge krav 1-7, for fremstilling av et medikament for behandling av en blødeforstyrrelse eller et sår.