JPH07502659A

JPH07502659A - トロンビンの製造方法

Info

Publication number: JPH07502659A
Application number: JP5511968A
Authority: JP
Inventors: ホリー，リチャード　ディー．; フォスター，ドナルド　シー．
Original assignee: ザイモジェネティクス，インコーポレイティド
Priority date: 1991-12-31
Filing date: 1992-12-30
Publication date: 1995-03-23
Anticipated expiration: 2018-05-06
Also published as: US5476777A; FI943122A0; CA2125783A1; AU3428793A; GR3030820T3; WO1993013208A1; NO942456D0; ES2134836T3; ATE179754T1; JP3404038B2; FI117831B; NO942456L; NO317018B1; DE69229126D1; DE69229126T2; FI943122L; EP0624199A1; EP0624199B1; AU683834B2; US5502034A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】トロンビンの製造方法発明の分野本発明は一般に組換えタンパク質を製造する方法に関し、さらに詳しくは、組み換えＤＮＡ技術を使用して宿主細胞からトロンビンを製造する方法に関する。

発明の背景凝固カスケードの終わりから２番目の段階は、プロトロンビンのトロンビンへの因子Ｘａ−複合体を触媒とする変換である。プロトロンビンは、肝臓の中で合成される一本鎖のビタミンに依存性糖タンパク質である。プロトロンビンはｐｒｏペプチド、ｇｌａ　ドメイン、２つのクリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）領域、Ａ鎖およびセリンプロテアーゼドメインを含有する。Ａ鎖はセリンプロテアーゼドメインにジサルファイド結合されている。トロンビンへの変換は、プロトロンビンが２つの部位で因子Ｘａ−複合体により切断されることを必要とする。

一方の因子Ｘａの切断は、ｇｌａ　ドメインおよび２つのクリングル領域からダるタンパク質断片を遊離する。他方の因子Ｘａの切断は、触媒的に活性な分子を生産する役割をし、セリンプロテアーゼドメインからＡｉｌを切断して、ジサルファイド結合した２つの鎖タンパク質を成形する。両者の因子Ｘａ切断部位における切断は、セリンプロテアーゼドメインにジサルファイド結合した４９アミノ酸のＡ鎖から構成された活性トロンビンを成形する。トロンビンは特定のアルギニル−グリシン結合を加水分解してフィブリノゲンにおいて自己集合してフィブリンのクロットとなるフィブリンのモノマーを生成し、そして因子Ｘ［Ｉ＋において因子Ｘ１ｌｌａを生成し、この因子Ｘ１ｌｌａは引き続いてフィブリンのモノマーを架橋してフィブリンのクロットを強化および安定化する。凝固のカスケードにおけるトロンビンの役割は、例えば１．ＪａｃｋｓｏｎおよびＮｅｍｅｒｓｏｎ　（Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ａｎｎ。

Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４９　：　７６５−８１１　（１９８０））により概観されている。トロンビンは臨床的に外科手術の間の出血を抑制するために、熱傷のためにおよびある種の外傷の場合において使用される（中村ら、ＴｈｅＡｍｅｒ、Ｓｕｒｇｅｏｎ　５７　：　２２６−２３０　（１９９１）　；　Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｏｐｈ　ｔｈａ　１ｍｏ　Ｉｏｇｙ９３　：　２７９−２８２　（＋９８６）　；　ｔｌａｒｒｉｓら、Ｊ、Ｂｏｎｅ　Ｊｏｉｎｔ　Ｓｕｒｇ、［Ａｍ］　６０：　４５４−４５６　（１９７８）　；　ＣｒａｉｇおよびＡｓｈｅｒ、　５ｐｉｎｅ　２　：　３１３−３１７　（１９７７；　Ｐｒａｓａｄら、Ｂｕｒｎｓ　１７　：　７０−７１　（＋９９１））　、ウシトロンビンは、また、いくつかの商用組織の接着剤である。

商用トロンビン治療剤はプールしたヒトおよび動物の血液生成物から精製され、そしてそれ自体として種々のウィルス、例えば、ＨＩＶおよび肝炎ウィルスの汚染の危険に遭遇する。３つの商用トロンビンを比較するとき、銘木および桜用（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　５３　：　２７１−２７８、１９８９）は、調製物か汚染タンパク質を含有し、そしてヒト調製物か免疫グロブリンＧ、Ｂ型肝炎の表面抗原およびヒト免疫不全抗体を含有することを発見した。ウシトロンビンを使用する異種間免疫化は、ヒトトロンビンおよびヒト因子Ｖ（因子Ｖはウシトロンビン調製物の中の汚染物質である）の両者に対する自己反応性抗体を２２４９ −２２５７　（１９９０）　；　５ｔｒｉｃｋｅｒ　ら、Ｂｌｏｏｄ　７２　：　１３７５−１３８０　（１９８８）；　Ｂｅｒｇｕｅｒら１．１．　Ｔｒａｕｍａ　３１　：　４０８−４１１　（１９９１））　、さらに、病原酸物の可能な汚染物質に関する関心が最近発生した。治療のためのヒト血液生成物は、また、ウィルス粒子、例えば、肝炎ウィルスおよびヒト免疫不全ウィルスにより汚染される。

プロトロンビンは組換え手段により製造されてきているが、タンパク質のほぼ１４％は異常にカルボキシル化された。

〉　−の要求を満足させそして他の関係する利点を提供する。

および転写ターミネータ−；ｂ）工程ａのＤＮＡ配列によりエンコー駆体を宿主細胞から選抜する。本発明の他の面において、トロンビにおいて、ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンはプロトロンビンのクリングル２、Ａ鎖、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインからなる。なお本発明の他の態様において、ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンはプロトロンビンのｉｌｌ、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインからなる。

図面の簡単な説明第１図は、プラスミドＺｅｍ２２９Ｒの構成を図解する。使用する記号は次の通りである：　ＳＶ４０ｔｅｒｍ、、　ＳＶ４０ターミネータ−；　ＤｌｔＦＲ、ジヒドロ葉酸リダクターゼｃＤＮＡ　；　ＳＶ４０ｐｒｏｍ、、　ＳＶ４０プロモーター、ＭＴ−１、マウスメタロチオネイン−１プロモーター。

第２図は、プラスミドＺｅｍ１６９の構成を図解する。使用する記号は次の通りである　ｐｒｅｐｒＯ，ｔＰＡｐｒｅｐｒｏ配列、　ｈＧＩｌ、　ｈＧＨターミネータ−：　ＭＣＦ、　ＭＣＦ−１３プロモーター。

特定の態様の説明本発明を記載する前に、以後使用すべきある種の用語の定義を記載することは本発明の理解に役立つであろう。

シグナル配列・　分泌ペプチドをエンコードするＤＮＡセグメント。

シグナル配列は、また、リーダー配列、ｐｒｅｐｒｏ配列および／またはｐｊｅ配列と呼ぶことかてきる。分泌ペプチドは、成熟ポリペプチドまたはタンパク質の細胞からの分泌を指令する作用をするアミノ酸配列である。分泌ペプチドは疎水性アミノ酸のコアにより特徴づけられそして、典型的には（しかし独立的ではない）新しく合成されたタンパク質のアミノ末端に見いだされる。分泌ペプチドは、シグナルペプチドドメインおよびＣ末端ドメインを包含するドメインに分割することかてきる。このようなドメインは、製造の成熟コープインク領域により中断されることができる。酵母バリア（Ｂａｒｒｉｅｒ）タンパク質の第３ドメインをエンコードするＤＮＡセグメントは、例えば、問題のＤＮＡ配列に対して直ぐに３°　または５′のＢＡＲＩシグナルペプチドおよびＤＮＡ配列に関して、適切なリーディングフレームの中に位置することができる。非常にしばしば、分泌ペプチドは分泌の間に成熟タンパク質から切断される。このような分泌ペプチドは、成熟タンパク質が分泌経路を通過するとき、成熟タンパク質からの分泌ペプチドの切断を可能とするプロセシング部位を含有する。

処理部位は分泌ペプチド内でエンコードされるか、あるいは、例えば、生体外突然変異誘発によりペプチドに付加することができる。

ｐｒｏ配列：　プロペプチドをエンコードしそしてタンパク質またはペプチドのプロセシングを指令またはシグナルする機能をするＤＮＡセグメント。ビタミンに依存性糖タンパク質のプロペプチドは高度に保存される。プロペプチドの中に最も高度に保存されるアミノ酸は、位置−１７および−１６におけるＶａｌ−Ｐｈｅ、−１２におけるＧｌｕまたはＧｌｎ、−１０においてＡｌａ、　−７および−６におけるＶａｌ−Ｌｅｕ、　−４におけるＡｒｇおよび−２および−１におけるＬｙｓ−Ａｒｇである（Ｆｏｓｔｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２６　：　７００３−７０１１　（１９８７））　、　ｌ１ｒｏ配列は一般にｐｒｅ配列の後に存在し、そしてプロセシングおよび分泌の間にタンパク質から除去される。

ビタミンに依存性糖タンパク質について、プロペプチドはタンパク質の翻訳後のプロセシング（例えば、Ｇｌａ　ドメインの中のグルタミン酸のガンマ−カルボキシル化）を保証すると信じられる。

Ｇｌａ　ドメイン・　一般に約２６〜約４５アミノ酸を含有し、タンパク質のアミノ末端領域に一般に位置するが、常には位置せず、γ−カルポギシグルタミル残基（Ｇｌａ）に翻訳後に変更される３〜１２グルタミル残基を含有するアミノ酸配列。ある場合において、Ｇｌａ　ドメインはゲノム配列のエクソン−イントロン境界により規定されることかできる。Ｇｌａ　ドメインの中のγ−カルボキシグルタミル残基は、膜リン脂質へのビタミンに依存性糖タンパク質のカルシウム仲介結合を促進する。しかしながら、ゲノム配列のエクソンＩＩ内にエンコ− １’されるｇ！ａ　ドメインを有するプロトロンビンは、生物学的活性のためにｇｌａ　ドメインを必要としない。機能的ｇｌａ　ドメインの不存在下で、ｇｌａ　トメイン不含プロトロンビンは、野生型プロトロンビンより顕著に高い因子Ｘａ複合体による活性化のｌ（、を有する。プロトロンビンの活性化を決定するアッセイは、例えば、Ｍａｌｈｏｒｔａら（，１，８ｉｏ１．　Ｃｈｅｍ、　２６０　：　２７９−２８７　（１９８３）　（これを引用によって加える）またはＢｌａｎｃｈａｒｄ　ら（，１，Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、ｌｏｔ　：　２１２−２５５（１９８３）　（これを引用によって加える）により記載された。

ｇｌａ　トメイン不含プロトロンビン・　活性化したとき、トロンビンの活性を有するポリペプチド。ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンは、機能的ｇｌａ　ドメインを欠如する単一のポリペプチドであり、そしてセリンプロテアーゼドメインに接合したＡｌｌの少なくとも一部分からなり、そしてＡｊｌとセリンプロテアーゼドメインとの間にジサルファイト結合を含有する。

トロンビン　フィブリノゲンの中の特定の結合を切断して、自己集合してフィブリンクロットを成形する、２つの鎖のジサルファイト結合したグリコリル化ポリペプチド。ここにおいてより詳細に開示するように、プロトロンビンは２つの因子Ｘａ−複合体の切断によりトロンビンに活性化される（ｇｌａおよびクリングルトメンを除去するための配列識別番号２および３のアルギニン、アミノ酸３０７およびスレオニン、アミノ酸３０８の間、およびセリンプロテアーゼドメインからへ鎮を切断するための配列識別番号２および３のアルギニン、アミノ酸３５６およびイソロイノン、アミノ酸３５６の間）。

Ａ鎖およびセリンプロテアーゼドメインは、一般に、これらの因子Ｘａ切断部位により結合されていると見なされる。しかしながら、当業者にとって明らかなように、トロンビンの活性を破壊しないへ鎖およびセリンプロテアーゼドメインの中のアレルの変動および他の欠失、付加または小さい変化は本発明の範囲内に包含される。用語「活性化部位ＪはＡＭ４とセリンプロテアーゼドメインとの間のタンパク質分解的切断部位を意味し、その切断はトロンビンを活性化するプレトロンビンの活性化を生ずる。自然のプロトロンビンおよびプレトロンビンの場合において、野生型トロンビンの活性化部位は因子Ｘａ切断部位である。

発現ベクター・　なかでも、タンパク質の発現を促進する、プロモーターおよび他の配列、例えば、転写ターミネータ−およびポリアデニル化シグナルと一緒に、問題のタンパク質をエンコードするＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ分子。発現ベクターは、さらに、自律的複製によるか、あるいは宿主ゲノムの中への組込みにより、宿主細胞の中でそれらの複製を提供する遺伝情報を含有する。当業者にとって明らかなように、宿主細胞の中の発現ベクターの自律的復製を提は酵母の複製起点および細菌の複製起点の両者を含有し、そして細菌および哺乳動物のベクターは一般に細菌の複製起点を含有する。

組換えＤＮＡのために普通に使用されている発現ベクターの例はプラスミドおよびある種のウィルスであるか、それらは両者の要素を含有する。それらは、また、■または２以上の選択可能なマーカーを含むことかできる。

トランスフェクションまたは形質転換：　精製したＤＮＡの導入により受容細胞または微生物の遺伝子型を安定にかつ遺伝的に変更する方法。これは典型的には受容生物の表現型の変化により検出される。用語「形質転換」は一般に微生物に適用されるが、「トランスフェクション」は多細胞生物から誘導される細胞の中のこのプロセスを記載するために使用される。

培養した細胞・　ある数の世代にわたって液体または固体の培地の中で増殖することができる細胞。多細胞生物から誘導される細胞の場合において、培養した細胞を生物から単細胞、組織、または組織の一部分として分離された細胞である。

ＤＮＡ構成体、　そうでなければ自然に存在しない方法で組み合わされかつ並置されたＤＮＡのセグメントを含有するようにヒトの関与を通して修飾された、− 重鎖または二本鎖のＤＮＡ分子またはこのような分子のクローン。ＤＮＡ構成体は、問題のポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列の転写および翻訳を指令する、作用可能に連鎖された要素を含有することができる。このような要素は、プロモーター、エンハンサ−および転写ターミネータ−を包含する。ＤＮＡ構成体内に含有される要素のおかげで、ある種の構成体はエンコードされたポリペプチドの発現および／または分泌を指令することができると理解される。問題のポリペプチドをエンコードするＤＮＡ配列が分泌シグナル配列を含有する場合、適当な要素を含有するＤＮＡ構成体はポリペプチドの分泌を指令することができると考えられる。

前述したように、プロトロンビンは、ｇｌａ　ドメイン、第１および第２のクリングルドメイン、１ｍおよびセリンプロテアーゼドメインを含有する、−重鎖の、グリフシル化された、ガンマーカルボキシル化タンパク質として通常生産される。Ａ鎖は、また、連鎖として知られており、Ｂ鎖および触媒ドメインの両者のとして知られている、セリンプロテアーゼドメインにジサルファイト結合されている。凝固カスケードの間に、プロトロンビンは因子Ｘａ切断部位により２つの部位で切断されて、トロンビンの遊離を生ずる。プロトロンビンのｌっの因子Ｘａ切断は、プロトロンビンのｇｌａ　ドメインおよびクリングルドメインを遊離する。第２の因子Ｘａ切断部位はプロトロンビンを活性化部位において切断し、Ａ鎖をセリンプロテアーゼドメインから分割してトロンビンを生産する。

本発明の目的は、組換え法および真核生物の宿主細胞を使用してトロンビンを生産する方法を提供することである。本発明の特徴は、ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンをエンコードするＤＮＡ配列からなる発現ベクターの使用である。本発明の追加の特徴は、宿主細胞内で発現ベクターを使用して、生体内または生体外でトロンビンに活性化されるトロンビン前駆体を生産することである。

プロトロンビンのｇｌａ　ドメインは、普通の方法によりｇｌａ　ドメインの一部分またはすべてを除去することによって、非機能的とすることができる。あるいは、ｇｌａ　ドメイン内のグルタミル残基をエンコードする配列を欠失するか、あるいはアミノ酸置換を生ずるように変更することができる。変更されたｇｌａ　ドメインを有するプロトロンビン変異型の活性化の反応速度論は、後述するように、Ｍａｌｈｏｒｔａら（前掲）により本質的に説明された方法を使用して評価することができる。機能的ｇｌａ　ドメインを含有しないタンパク質は、野生型プロトロンビンのそれより一般に約１５倍高い、好ましくは２０倍高い活性化のに、を有する。本発明の１つの態様内で、ここに開示するｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンは生体内で利用する前に活性化する。

変更されたドメインを有するプロトロンビン変異型の活性化の反応速度論は、次のようにして決定することができる。簡単に述べると、ＳｍＭ　ＣａＣＩｔ中に１６４μＭ〜６．５μＭのプロトロンビン変異型を含有する溶液を１０分より長い時間の間２２°Ｃにおいてインキュベーションする。インキュベーション後、因子Ｘａ、因子Ｖａ、　ＣａＣＩｔ　、ホスファチジルコリン−ホスファチジルセリン（３：１）（以後ｐｃｐｓと呼ぶ）、およびダンシル５−ジメチルアミノナフタレン−１−スルホニル（以後ＤＡＰＡと呼ぶ）を含有する溶液を、２．０ｍｌの反応混合物の最終濃度が次のようになるように、添加する：０．０３Ｍ　Ｔｒｉｓ　−１（ＣＩ　、　ｐＨ７，４：　Ｏ，ＩＯＭ　ＮａＣｌ　；　３．ＯｎＭ　因子Ｘａ　；　１０．　ＯｎＭ　因子■ａ：３０μＭ　ＰＣＰＳ　；　５．　ＯｍＭ　ＣａＣ１ｔおよびＩＯｕＭＤＡＰＡ、同時に、５ｍＭＣａＣｌ２中に１．４μＭ〜６．５μＭのプロトロンビンを含有する陽性の対照を２２°Ｃにおいて１０分より長い時間の間インキュベーションする。

インキュベーション後、因子ｘａ：因子Ｖａ　；　ＰＣＰＳ　；およびＤＡＰＡを含有する溶液の２５μｌを、２．０ｍｌの反応混合物の最終濃度が次のようになるように、添加する　０．０３Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　ｐＨ７，４；　０．１０ＭＮａＣ１；　０．５　ｎＭ　因子Ｘａ　；　１０．　ＯｎＭ　因子Ｖａ；３０μＭ　ＰＣＰＳ；５．０ｍＭＣａ”″および１０ＭＭ　ＤＡＰＡ０放射ビームの中で使用する４３０　ｎｍのカットオフフィルターで３４５　ｎｍの励起波長および５４５　ｎｍの放射を使用して、ＤＡＰＡ−トロンビン複合体の蛍光強度を測定することによって、反応の進行をモニターする。励起および放射のスリット幅は、それぞれ、ＩＯｎｍおよび１５Ｍｍである。結合されたミカエリス −メンテン−ヘンリ（Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ−Ｈｅｎｒｉ）法に従い反応のプロフィルを分析することによって、Ｋ、およびｋ　ｅａ＋を決定する（Ｎｅｓｈｅｉｍら１、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５４　＋　１０９５２−１０９６２　（１９７９）　；これをここに引用によって加える）。

本発明のある種の態様において、トロンビン前駆体を生体内で活性化することかできるか、あるいは自己触媒的に活性化することができるような方法て、野生型トロンビンの活性化部位を変更する。

例えば、野生型トロンビンの活性化部位をサツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＫＥＸ２遺伝子生産物により切断することができるような方法で、野生型トロンビンの活性化部位を変更することができる。四遺伝子は、２塩基性アミノ酸配列後を切断するエンドペプチダーゼをエンコードする（Ｆｕｌｌｅｒら、（Ｌｅ　ｉ　ｖｅ切断部位はアミノ酸配列ＫＲによりエンコードされる。より好ましくは、ＫＥＸ２切断部位はアミノ酸配列ＲＲＫＲ（配列識別番号３４）またはロンビン前駆体を切断してトロンビンを生成することができる。自然に四を発現しない宿主細胞を、例えば、Ｍｕｌｖｉｈｉｌｌら（同時係属米国特許出願第０７／４４５．３０２号、この全体をここに引用によって加える）およびＭｕｌｖｉｈｉｌｌ　ら、欧州特許（ＢＰ）第３１９．９４４号に記載されているようにして、サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）　ＫＥＸ２遺伝子で形質転換またはトランスフェクションすることができる。あるいは、野生型トロンビンの活性化部位は、生ずるタンパク質がトロンビンにより切断可能であるような方法で、変更することができる。好ましい態様において、トロンビンの切断部位はアミノ酸配列ＰＲによりエンコードされる。このような変化は、外因性トロンビンの少量の添加後、トロンビン前駆体を自己触媒的に活性化することを可能とする。本発明の１つの態様において、野生型トロンビンの活性化部位を、５ °末端上でトロンビン切断部位でそして３′末端上で四切断部位でフランキングされた成熟α−因子のコピーと置換する。活性化部位におけるこのような変更は、例えば、アダプター技術、生体外突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）突然変異誘発の技術を使用して得ることができる。

ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンをエンコードするＤＮＡセグメントは合成的に製造することができるが、あるいは、例えば、ヒト肝細胞から（Ｄｅｇｅｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２　：　２０８７−２０９７　（１９８３）およびはウシ肝臓からクローニングされたプロトロンビンをエンコードするＤＮＡセグメントから、本質的にＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙおよびＤａｖｉｅ。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２３　：　１６２６−１６３４　（１９７４）　（これらをここに引用によって加える）に記載されているように、クローニング法、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、：ｌ−ルド・スプリング・ハーバ−、ニューヨーク）　、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド”スプリング・ハーバ−、ニューヨーク（＋９８９）　）またはＭｕｌｌｉｓら（米国特許第４．６８３．１９５号）（それらの各々をここに引用によって加える）の方法を使用して製造することができる。プロトロンビンをエンコードするＤＮＡセグメントは、本発明のｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンをエンコードするＤＮＡセグメントを生成するように、制限消化および再結合、生体外突然変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応の増幅を使用する突然変異誘発により変更することかできる。

ヒトトロンビンをエンコードする代表的なヌクレオチド配列および推定されたアミノ酸配列を配列識別番号２および３に示す。当業者によく知られているように、ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンをエンコードするＤＮＡセグメントは、アレルの変異型および、保存的アミノ酸置換および／またはアミノ酸の小さい付加、置換または欠失を含有する合成的に操作されたまたは合成の変異型を包含する。

ＤＮＡ配列の変異型は、また、ＤＮＡコードのデジェネラシーを包含し、ここで宿主か好むコドンを包含する他のコドンは野生型配列の内の類似のコドンて置換されている。高いまたは低いストリンジエンシー下に本発明のＤＮＡ配列にハイブリダイゼーションすることができるＤＮＡ配列からなるＤＮＡセグメント（参照、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲）および本発明のアミノ酸配列のアミノ酸配列に対して遺伝暗号の結果としてデジェネラシーであるＤＮＡセグメントは、本発明の範囲内に包含される。遺伝子操作された変異型は、オリゴヌクレオチド定方向部位特異的突然変異、制限エンドヌクレアーゼ消化およびアダプターの結合、または文献においてよく確立された他の方法を使用することによって得ることがてきる（参照、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前る）。

ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンをエンコードするＤＮＡセグメン１−を適当な発現ベクターの中に挿入し、次いでこの発現ベクターを適当な宿主細胞の中に導入する。本発明の実施において使用する発現ベクターは、クローニングしたＤＮＡの転写を指令することができるプロモーター、ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンをエンコードするＤＮＡセグメント、および転写ターミネータ−からなる。

本発明のタンパク質を宿主細胞の分泌経路の中に向けるために、少なくとも１つのシグナル配列は問題のＤＮＡ配列に作用可能に連鎖される。好ましいシグナルは、次のものを包含する：アルファ因子のシグナル配列（ｐｒｅ−ｐｒｏ配列；　Ｋｕｒｊａｎおよびｌｌｅｒｓｋｏｗｉｔｚ、　Ｃｅ１１３０　：　９３３− ９４３　（１９８２）　；　Ｋｕｒｊａｎら、米国特許第４．５４６．０８２号；　Ｂｒａｋｅ。

６８２６−６８３０））　、α−２プラスミンインヒビタ−のシグナル配列組織のプラスミノゲンアクチベーターのリーダー配列（Ｐｅｎｎｉｃａら、Ｎａｔｕｒｅ　３０１　：　２１４−２２１　（１９８３））。あるいは、分泌シグナル配列は、例えば、ｖａｎ　ｔｌｅｉｎｉｅ　（Ｅｏｒ、　、１．　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＋３３　：　１７−２１　（１９８３）　；　Ｊ。

Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　１８４　：　９９−１０５　（＋９８５）　；　Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１４　：　４６８３−４６９０　（＋９８６））により確立されたルールに従い合成することかできる。

シグナル配列は単一に使用するか、あるいは組み合わせることができる。例えば、第１シグナル配列は単一で使用するか、あるいはバリア（Ｂａｒｒｉｅｒ）の第３ドメインをエンコードする配列と組み合わせて使用することかできる（米国特許第５．０３７．７４３号に記載されている、引用によって加える）。バリアの第３ドメインをエンコードするＤＮＡセグメントは、問題のＤＮＡ配列の３′ 　またはＤＮＡ配列に対して５′の適切なリーディングフレームの中に、およびシグナル配列および問題のＤＮＡ配列の両者をもつ適切なリーディングフレームの中に位置することかできる。

本発明の実施において使用する宿主細胞は、咄乳動物、鳥類、植物、昆虫、真菌および細菌の細胞を包含する。真菌の細胞は、酵母の種（例えば、サツカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）種、シゾサ・ソカロすることができる。酵母サツカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の株はとくに好ましし）。

本発明において使用するために適当な酵母のベクターは、次のものを包含する：　ＹＲｐ７　（Ｓｔｒｕｈｌら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６１０３５−１０３９　（＋９７８））　、ＹＥｐ１３　（Ｂｒｏａｃｈ　ら、Ｇｅｎｅ　８　：　１２１−１３３（１９７９））　、ＰＯＴヘクター（川崎ら、米国特許第４．９３１．３７３号、これをここに引用によって加える）　、ｐＪＤＢ２４９およびｐ、ＩＤＢ２＋９　（Ｂｅｇｇｓ。

Ｎａｔｕｒｅ　２７５　：　１０４−１０８　（＋９７８））およびそれらの誘導体。このようなベクターは選択可能なマーカーを包含し、これらは形質転換体の選択を可能とする表現型のアッセイが存在する優性の表現型を示す任意の数の１っであることができる。好ましい選択可能なマーカーは、宿主細胞の栄養要求性を相補し、抗生物質耐性を提供するか、あるいは細胞か特定の炭素源を利用できるようにするものであり、そし包含する。他の適当な選択可能なマーカーはＣＡＴ遺伝子であり、これは酵母細胞にクロランフェニコール耐性を付与する。

酵母における使用に好ましいプロモーターは、次のものを包含する。酵母グリコール分解遺伝子からのプロモーター（ｔ（ｉｔｚｅｎｍａｎら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５５　：　１２０７３−１２０８０　（１９８０）　；　Ａｌｂｅｒおよび川崎、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｐｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　Ｉ　：　４１９−４３４　（１９８２）　；川崎、米国特許第４、５９９．３１１号）またはアルコールデヒト′ロゲナーゼ遺伝子（Ｙｏｕｎｇら、Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ　ｆｏｒ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ。

Ｈｏ１ｌａｅｎｄｒら（編）　、ｐ、　３５５．　Ｐｌｅｎｕｍ、ニューヨーク（＋９８２）　；Ｎａｔｕｒｅ　３０７　：　６５２−６５４　（＋９８３）　；　１ｒａｎｉおよびＫｉ　Ｉｇｏｒｅ、米国特許出願第０７／６３１．７６３号、および欧州特許（ＥＰ）第２８４．０４４号、これらをここに引用によって加える）である。発現ユニットは、また、転写ターミネータ−を包含することかできる。好ましい転写ターミネータ−は」旦ターミネータ−（Ａｌｂｅｒおよび川崎、前掲）。

酵母に加えて、本発明のタンパク質はフィラメント状真菌、例えば、真菌アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）株の中に発現させることができる（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、米国特許第４．９３５．３４９号、これをここに引用によって加える）。有用なプロモーターの例は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｇｅｒ）グリコール分解遺伝子から誘導されたもの、例えば、ＡＤ１１３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯＪ、　４　：　２０９３ −２０９９　（１９８５））および匪プロモーターを包含する。適当なターミネータ−の例は、ＡＤ１３ターミネータ−（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、前掲）を包含する。このような成分を利用する発現ユニットを、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉ　ｆｌｕｓ）の染色体ＤＮＡの中に挿入することができるベクターの中にクローニングする。

真菌を形質転換する技術は文献においてよく知られており、そし−１６９（＋９８３））により記載された。宿主細胞の遺伝子型は、一般に、発現ベクター上に存在する選択可能なマーカーにより相補される遺伝的欠陥を含有するであろう。

特定の宿主および選択可能なマーカーの選択は、当業者のレベルの範囲内である。

糖タンパク質のアスパラギン連鎖グリコジル化について要求される少なくとも１つの遺伝子の中に遺伝的欠陥を含有する酵母宿主細胞を使用することか好ましいことがある。好ましくは、酵母の宿主細胞はＭＮＮ９遺伝子またはＭＮＮ　Ｉ遺伝子または両者の中に遺伝的欠陥を含有する（係属米国特許出願第１８９．５４７号および欧州特許（ＥＰ）第３１４、０９６号に記載されている、これらの全体をここに引用によって加える）。最も好ましくは、酵母の宿主細胞はＭＮＮ　＋遺伝子およびＭＮＮ９遺伝子の両者の崩壊を含有する。このような欠陥を有する酵母の宿主細胞は、突然変異および選択の標準の技術を使用して調製す（＋９８０））は、アスパラギン連鎖グリコジル化に影響を与える遺伝子の中の欠陥が存在するマンノタンパク質生合成突然変異体の単離を記載している。簡単に述べると、野生型酵母上に存在する外側マンノース鎖に対して向けられた蛍光化抗体を使用して、突然変異化酵母細胞をスクリーニングした。抗体に結合しなかった突然変異細胞をさらに特性決定し、そしてアスパラギン連鎖オリゴ糖部分の付加において欠陥が存在することが発見された。異種タンパク質の生産を最適化するために、宿主株がタンパク質分解活性を減少させる突然変異、例えば、酵母ＰＥＰ４突然変異（Ｊｏｎｅｓ、　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　８５　：　２３−３３（＋９７７））を有することが好ましい。異種タンパク質の分泌を最適化するために、宿主株は異種タンパク質の分泌を増加する突然変異をＰＭＲＩ遺伝子（Ｓｍｉｔｈ　、米国特許第５．０５７．４１６号）の中に育することが好ましい。ＰＭＲ１遺伝子を崩壊することが有利であることがある。

真菌の細胞に加えて、培養した哺乳動物細胞を本発明の範囲内で宿主細胞として使用することができる。本発明における使用のために好ましい培養しだ哺乳動物細胞は、ＣＯ３−１（ＡＴＣＣＣＲＬ　１６５０）、　ＢＨＫ。

および２９３　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５７３　；　Ｇｒａｈａｍら、Ｊ、Ｇｅｎ、Ｖｉｒｏｌ、　６　：　５９−７２　（１９７７））細胞系を包含する。好ましいＢｌ（Ｋ細胞系はＢＨＫ５７０細胞系（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に受け入れ番号ＣＲＬ　１０３１４で受託された）である。さらに、ある数の他の哺乳動物細胞系を本発明の範囲内で使用することがてき、これらの細胞系次のものを包含する：ラットＨｅｐ　Ｉ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　＋６００）　、ラッ　トｆ（ｅｐ　ＩＩ　（ＡＴＣＣＣＲＬ　１５４Ｂ）、ＴＣＭＫ（ＡＴＣＣＣＣＬ　１３９）、ヒト肺（ＡＴＣＣＣＣＬ　７５．１）、ヒトへパトーム（ＡＴＣＣＨＴＢ−５２）　、Ｈｅｐ　Ｇ２　（ＡＴＣＣＨＢ　８０６５）　、マウス肝臓（ＡＴＣＣＣＣＬ　２９．　Ｉ）、ＮＣＴＣ１４６９（ＡＴＣＣＣＣＬ、　９．１）およびＤＵＫＸ細胞（ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ。

Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７７　：　４２１６ −４２２０　（１９８０））。

本発明を実施するとき使用するための哺乳動物の発現ベクターは、クローニングされた遺伝子またはｃＤＮＡの転写を指令することができるプロモーターを包含するてあろう。好ましいプロモーターはウィルスのプロモーターおよび細胞のプロモーターを包含する。ウィルスのプロモーターは直ちの初期のサイトメガロウィルスのブロモ−含する。細胞のプロモーターは、マウスメタロチオネイン−１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、米国特許第４．５７９．８２１号）、マウスＶ、ブを包含する。とくに好ましいプロモーターはアデノウィルス２からまた、プロモーターから下流および問題のペプチドまたはタンノクク質をエンコードするＤＮＡ配列から上流に位置する１組のＲＮＡスプライス部位を含有することかできる。また、問題のコーディング配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルか発現ベクターの中に含有されている。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０からの初期または後期のポリアデニル化シグナル（ｔｃａｕｒｍａｎおよび５ｈａｒｐ　、前掲）、アデノウィルス５　ＥＩＢ領域からのポリアデニル化シグナルおよびヒーターとＲＮＡスプライス部位の間に位置する非コーディングウィルスリーダー配列、例えば、アデノウィルス２の３部分のリーダーを包含することかできる。好ましいベクターは、また、エンノ）ンサー配列、例えば、ＳＶ４０エンハンサ−およびマウスμエンハンサ−を包含することができる（Ｇｉｌｌｉｅｓ、　Ｃｅ１ｌ　３３　：　７１７−７２８　（１９８３））　、発現ベクターは、また、アデノウィルスＶＡのＲＮＡをエンコードする配列を含むことができる。

クローニングしたＤＮＡ配列は培養した哺乳動物細胞の中に、例えば、リン酸カルシウム仲介トランスフェクションにより導入することができる（Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅ１ｌ　１４　：　７２５　（１９７８）　；　ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、　Ｓｏｍａｔｉｃ　Ｃｅ１ｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　７　：　６０３　（１９８１）　；　ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　ＶｉｒｏｌｏｇＹ　５２　：　４５６　（＋９７３）　；これらの全体をここに引用によって加える）。クローニングしたＤＮＡ配列を哺乳動物細胞の中に導入する他の技術、例えば、エレクトロボレイション（Ｎｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯＪ、　Ｉ　：　８４１−８４５　（＋９８２））を使用することもできる。クローニングしたＤＮＡを組込んだ細胞を同定するために、選択可能なマーカーを一般に細胞の中に問題の遺伝子またはｃＤＮＡと一緒に導入する。培養した哺乳動物細胞において使用するために好ましい選択可能なマーカーは、薬物、例えば、ネオマイシン、ヒグロマイシン、およびメトトレキセートに対する耐性を付与する遺伝子を包含する。

選択可能なマーカーは増幅可能な選択可能なマーカーであることができる。好ましい増幅可能な選択可能なマーカーはＤＨＰＲ遺伝子である。選択可能なマーカーはＴｈ１ｌｌｙ　（Ｍａｍｍａｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ。

Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、マサチュセッツ州ストーンハム、これをここに引用によって加える）により概観されている。選択可能なマーカーの選択は当業者のレベルの範囲内である。

選択可能なマーカーは問題の遺伝子と同時に別のプラスミド上の細胞の中に導入することかできるか、あるいは同一プラスミド上に導入することかできる。同一プラスミド上で、選択可能なマーカーおよび問題の遺伝子が異なるプロモーターまたは同一プロモーターのコントロール下にあることができる場合、後者の配置はジストロンメツセージ（ｄｉｃｉｓｊｒｏｎｉｃ　ｍｅｓｓａｇｅ）を生成する。この型の構成体はこの分野において知られている（例えば、ＬｅｖｉｎｓｏｎおよびＳｉｍｏｎｓｅｎ。

米国特許第４．７１３．３３９号）。また、細胞の中に導入する混合物に、［キャリヤーＤＮＡ　ｊ　として知られている追加のＩ）ＮＡを添加することは有利であることがある。

トランスフェクションした哺乳動物細胞をある期間の間、典型的には１〜２日間増殖させて、問題の１または２以上のＤＮＡ配列を発現させる。次いて薬物の選択を適用して、選択可能なマーカーを安定に発現している細胞の増殖について選択する。増幅可能な選択可能なマーカーでトランスフェクションされた細胞について、薬物濃度を段階的方法で増加してクローニングした配列の増加したコピー数について選択し、これにより発現レベルを増加する。

大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の株であるが、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）および他の属も有用である。これらの宿主を形質転換しおよびそれらのの中でクローニングされた外来遺伝子を発現する技術はこの分野においてよく知られている（参照、例えば、ＭａｎｉａｔｉｓおよびＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲）。細菌の宿主の中で外来遺伝子を発現するために使用するベクターは、一般に、選択可能なマーカー、例えば、抗生物質耐性のための遺伝子、および宿主細胞の中で機能するプロモーターを含有する。適当なプロモーターは、ｔｒｐ　（ＮｉｃｈｏｌｓおよびＹａｎｏｆｓｋｙ、　Ｍｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１０１　：　１５５−１６４　（１９８３））、ｌａｃ　（Ｃａｓａｄａｂａｎら、Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、１４３　：　９７１−９８０　（１９８０））　、およびフ了−ジλプロモーター系（Ｑｕｅｅｎ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａｔ）ｐｌ、　Ｇｅｎｅｔ、　２　：　ｌ−１０（＋９８３））を包含する。細菌の形質転換に有用なプラスミドは、ｐＢＲ３２２（Ｂｏｌｉｖａｒａ■二月１０１　：　２０−７７　（１９８３）　、ＶｉｅｉｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅ　１９　：２５９−２６８　（１９８２））　、ｐＣＱＶ２　（Ｑｕｅｅｎ、前掲）、およびそれらの誘導体を包含する。プラスミドはウィルスおよび細菌の両者の要素を含有することができる。タンパク質を生物学的に活性な形態で回収する方法は、米国特許第４．９６６、９６３号および米国特許第４．９９９．４２２号（これらをここに引用によって加える）の中で論じられている。

本発明のｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンをエンコードする発現ベクターを植物、鳥類および昆虫の細胞の中に導入するために有用なプロモーター、ターミネータ−および方法はこの分野において記載されてきている。昆虫細胞の中で異種ＤＮＡ配列を発現するためのベクターとして、例えば、バキュロウィルスはＡｔｋｉｎｓｏｎら（Ｐｅｓｔｉｃ。

Ｓｃｉ、　２８　：　２１５−２２４　（１９９０））により概観された。植物細胞の中で遺（Ｂａｎｇｌａｏｒｅ）　ＩＩ　：　４７−５８　（１９８７））により！！観された。

次いて、本発明のＤＮＡ構成体を含有する宿主細胞を培養してｇｌａトメイン不含プロトロンビンを生産する。宿主細胞の増殖に要求される栄養を含有する培地の中で、細胞を標準の方法に従い培養する。

種々の適当な培地はこの分野において知られており、そして一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、ミレラルおよび成長因子を含む。成長培地は、一般に、ＤＮＡ構成体上の選択可能なマーカーにより相補されるか、あるいはＤＮＡ構成体と共トランスフェクションするＤＮＡ構成体を含有する細胞について必須栄養の中で、例えば、薬物の選択または欠乏により選択される。

例えば、酵母細胞は、好ましくは、非アミノ酸窒素源、無機塩類、ビタミンおよび必須アミノ酸の補助物質からなる、化学的に規定された培地の中で培養する。

培地のｐＨは好ましくは２より大きくかつ８より小さいｐ＋１、好ましくはｐｕｓ、ｓに維持される。安定なｐ＋＋を維持する方法は緩衝化および、好ましくは水酸化ナトリウムの添加による、一定ｐＨのコントロールを包含する。好ましい緩衝剤はコノ＼り酸およびビス−トリス（Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ）　（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ミゾリー州セントルイス）を包含する。アスパラギン連鎖グリコジノし化に要求される遺伝子の中に欠陥を有する酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定剤を含有する培地の中で増殖する。好ましい浸透圧安定剤は培地の中に０．１Ｍ〜１．５Ｍ、好ましくは０．５Ｍまたは１．０Ｍの濃度で補充されるフルピットである。哺乳動物細胞は、一般に、商業的（二人手回能な血清含有培地または血清不含培地の中で培養される。使用する特定の細胞系について適当な培地の選択は、当業者のレベルの範囲内である。

因子Ｘａ切断部位がトロンビン活性化部位で位置されている、ｇｌａトメイン不含プロトロンビンをエンコードする本発明の１）ＮＡ構成体を含有する宿主細胞は、好ましくは、化学的に規定された培地の中で培養される。血清不含培地は商業的源、例えば、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ（７１ノイラント州ガイサーバーグ）から入手することができるか、あるＩ、ｓは文献においてよく知られておりかつ、例えば、アメリカン・タイプ・カルチ−？−−コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）により発表されている処方を使用して調製することかできる。適当な培地の成分の選択は、当業者のレベルの範囲内である。ヘノくリンまたはトロンビンの添加により、これらのトランスフェクション体から生産されるある種のトロンビン前駆体の活性化を促進することは好ましいことかある。さらに詳しくは、野生型トロンビン活性化部位（Ａｒｇ−１ｉｅ）の代わりにトロンビン切断部位を含有するトロンビン前駆体の活性化を、培地へのヘパリンの添加により促進することかできる。好ましくは、０．５〜５．ＱＩＪ／ｍｌを血清不含培地に添加し、より好ましくは１〜５Ｕ／ｍｌ、最も好ましくはＩＵ／ｍｌのヘノくリンを血清不含培地に添加する。因子Ｘａ活性化部位がトロンビン活性化部位により置換されたｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンをエンコードする本発明のＤＮＡ構成体を含有する細胞から生産されたタンノくり質を活性化するために、０．５〜５μｇ／ｍｌのトロンビンを血清不含培地に添加し、より好ましくは１〜２μｇ／ｍｌのトロンビンを添加し、血清不含培地への１Ｍｇ／ｍｌ）ロンビンの添加はとくに好ましい。

本発明に従い製造されたトロンビン前駆体は、普通のクロマトグラフィーにより、好ましくは固体のマトリ・ソクス、例えば、ＡＦＦＩ−ＧＥＬ’ブルー親和ゲル（パイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州すッチモンド）に付着されたチバクロン・ブルーＦ３ＧＡ色素を使用しＣ精製することができる。トロンビン前駆体は、０．６〜Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１、好ましくはＩＭＮａＣｌの高い塩へのｉＷにより、カラムから溶離することかできる。２８０　ｎｍにおける吸収を測定することによって決定されたピーク画分をプールする。このプールを２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４中で希釈し、そして推定されたタンパク質濃度に基づいてｉ　：　＋、ｏｏ。

〜ｌ・２．０００（ｗ／ｗ）のヘビ毒液の活性化剤（より詳細に後述する）の添加により、トロンビン前駆体を活性化する。活性化された物質を、好ましくは、固体のマトリックス、例えば、ベンズアミジン・セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４Ｂ（ファーマソアＬＫＢ）くイオテクノロジー・インコーボレーテット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＫＢ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎｃ、）、ニュージャーシイ州ビスカタエイ）にカップリングされたノくラーアミノヘンズアミジンを使用して、クロマトグラフィーにより精製する。１５ｍＭ　ベンズアミジンへの暴露により、トロンビンをカラムから溶離することができる。両分の了りコートを希釈しそしてトロンビン発色性基質を添加することによって、流速を発色活性につし１てアッセイする。プールした両分をＧ−２５カラム（バイオ −ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ））に適用することによって、脱塩することができる。

ヘパリンに架橋したカラムのマトリックス、例えば、ＡＰＦＩ−ＧＥＬヘパリンゲル（バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、カリフォルニア州すッチモンド）などを横切って前辺て展開して、トロンビンおよびトロンビン様汚染物質を除去することは有利であろう。あるいは、トロンビン前駆体は抗トロンビン抗体を使用するアフィニティクロマトグラフィーにより精製することができる。トロンビンを精製する他の方法は米国特許第４．９６５．２０３号（これをここに引用によって加える）に記載されている。分泌経路において活性化されるか、あるいは培地の中で活性化されたｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンから生産された活性化トロンビンは、前述したように固体のマトリックスにカップリングしたパラ−アミノベンズアミジンを使用するクロマトグラフィーにより精製することかできる。

精製されたｌ・ロンビン前駆体をグサリヘビ、例えば、エキス・カルナラス（Ｅｃｈｉｓ　ｃａｒｎａｔｕｓ）またはビペラ・ルッセリイ（Ｖｉｐｅｒａス・カルナラス（Ｅｃｈｉｓ　ｃａｒｎａｔｕｓ）活性化剤は、好ましくは、セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ　−１５０およびＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ａ２５などを通す順次のクロマトグラフィー、および引き続くモノＱカラムを使用するＦＰＬＣにより精製する。あるいは、精製されたトロンビン前駆体は、因子Ｘａを使用して、例えば、Ｈｅ１ｄｅｂｒａｎｔら（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２４８　＋　７１４９−７１６３　（＋９７３））、Ｄｏｗｎｉｎｇら（、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　２５０　：　８８９７− ８９０６　（１９７５））、およびＫｒｉｓｈｎａｓｗａｍｙら（、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６２　：　３２９１−３２９９　（１９８７））により本質的に記載されているように活性化することができる。トロンビン活性化部位を含有するトロンビン前駆体は、トロンビンの添加により活性化することができる。

活性化された物質を、好ましくは、Ｓ−セファローズ（５ｅｐｈａｒｏｓｅ）ファスト・フロー・カラムおよび塩の勾配、好ましくは１００ｍＭ−ＩＭを使用して精製する。精製された活性化された物質をさらに逆相ＨＰＬＣにより精製することができる。追加の精製は、普通の化学的精製手段、例えば、なかでも液体クロマトグラフィー、勾配遠心、およびゲル電気泳動により達成することができる。タンパク質の精製法はこの分野において知られており（参照、一般に、５ｃｏｐｅｓ、　Ｒ，。

タンパク質の精製（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、　Ｓｐｒｉｎｇｃｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク（１９Ｂ２）　、これをここに引用によって加える）そしてここに記載するトロンビン前駆体の精製に適用することができる。少なくとも約５０％の実質的に純粋なトロンビンまたはトロンビン前駆体は好ましく、少なくとも約７０〜８０％はより好ましく、そして９５〜９９％またはそれ以上の均質性は、とくに製剤学的用途のために、最も好ましい。所望のように部分的にまたは均質性にいったん精製されると、組換えトロンビンまたはトロンビン前駆体を次いで薬剤組成物などの調製において使用することができる。

本発明に従い製造された組換えヒトトロンビンは種々の用途を見いだすか、哺乳動物、とくにヒトにおける凝固の疾患の処置のための薬剤組成物において使用される。本発明のトロンビン調製物は、治療的に凝固剤として、あるいは創傷の修復、大きいまたは小さい外傷または手術、熱傷、潰瘍化病変、皮膚の移植などに関連する出血の処理における凝血塊の成形を安定化するために使用することができる。組換えトロンビン組成物は、また、組織の付着剤または組織の接着剤の成分として、因子ｘ１１１または他のトランスグルタメニナーゼの調製物とともに使用することができる。

本発明の薬剤組成物は、治療的に有効量の組換えトロンビンおよび適当な薬理学的に許容されうる担体からなる。薬剤組成物は主として創傷または外科的部位などにおける局所的投与のために意図されるか、また、重大な肝臓不全、過度の出血および／または血液置換の養生法を伴う危険な外傷、クモ膜下出血なとの場合において静脈内に投与される。典型的には、本発明のトロンビン調製物は有効性を増加するために池の凝固配合物と同時に投与することができる。

組換えトロンビンの薬剤組成物、例えば、安定性を増強するためのタンパク質、例えば、アルブミン、リポタンパク質、フィブロネクチンおよび／またはグロブリンを含む、緩衝化水、生理的食塩水、０．３％グリシンなとを配合するとき、種々の水性担体を使用することができる。組成物はよく知られている滅菌技術により滅菌することかでき、そして溶液を使用のために包装するか、あるいは凍結乾燥することがてきる。本発明の薬剤組成物の他の成分は、生理学的状態をまねるために要求されるような、製剤学的に許容されうる補助物質、例えば、ｐ）（調節剤および緩衝化剤、張度調節剤など、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどを含むことができる。

他の成分、例えば、カルシウムイオン、プロテーゼインヒビター（例えば、アプロチニン）、フイブリノゲンなどを、また、組換えトロンビン組成物に、一般に患者への投与の時に添加して、組成物の有効性を増強することがてきる。プロスタグランジン、他の凝固因子、抗ヒスタミン、パップレシン、成長因子、ビタミン、抗生物質（例えば、アミノグリコシド、ペニシリン、カルボペネム、スルホン了ミド、テトラサイクリン）などの混合物を、また、準備することかできる。

種々の創傷接着剤の配合は米国特許第４．４２７．６５０号、米国特許第４．４４２．６５５号および米国特許第４．６５５．２１１号（これらの各々をここに引用によって加える）に詳細に論じられている。

製剤配合物中の組換えヒトトロンビンの治療的に有効な投与の濃度は広く変化することができ、すなわち、約１００〜約１０．０ＯＯＮＩＨ標！？ｍ位（ここで一般に１８ｇの実質的に純粋なトロンビンタンパク質は約３．０００単位に等しい）、通常少なくとも約５００〜５．０００単位、より好ましくは約１．０００〜２．０００単位であり、そして主として生ずる複合体の体積、粘度、強度などにより、意図する特定の用途、創傷または出血性障害のひどさ、選択した投与のモード、患者の一般的健康などに従い選択されるであろう。本発明の物質は一般に重大な疾患または損傷の状態、すなわち、生命に危険を及ぼすか、あるいは潜在的に生命に危険を及ぼす場合において使用できることを心に留めなくてはならない。このような場合において、余分な物質が最小となり、免疫原性が減少すること、そして本発明により生産可能な組換えヒトトロンビンの半減期の延長および安定性にかんがみて、処置の医師は実質的に過剰のこれらのトロンビン組成物を投与することが可能でありそして望ましいと感するであろう。

下記の実施例によって、本発明をさらに説明する。これらの実施例は本発明を限定しない。

実施例制限エンドヌクレアーゼおよび他のＤＮＡ修飾酵素（例えば、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ、仔ウシアルカリ性ホスファターゼ、ＤＮＡポリメラーゼ■　（クレノー断片）、Ｔ４ポリヌクレオチドリガーゼ）は、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＬａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）およびニュー・イングランド・バイオラプス（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から入手しそして、特記しない限り、製造業者の指示に従い使用した。

オリゴヌクレオチドをアプライド・バイオシステムス（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）　３８０　！！２ＤＮＡ合成装置で合成し、そして変性ゲルノボリアクリルアミドゲルの電気泳動により精製した。大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）細胞をＭａｎｉａｔｉｓら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：＾Ｌａｔ＋ｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ。

Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔ（ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　＋９８２　、引用によって加える）またはＳａｍｂｒｏｏｋら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、第２版、１９８８、引用によって加える）により記載されているように形質転換した。Ｍ１３およびｐＵＣクローニングヘクターおよび宿主株をＢＲＬがら入手した。

実施例１プロトロンビンｃＤＮＡのクローニングヒトプロトロンビンをエンコードするｃＤＮＡを、本質的にＤｅｇｅｎら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　２２　＋　２０８７−２０９７　（１９８３）　；この全体をここに引用によって加える）により記載されているように単離した。簡単に述べると、ヒト肝臓ＲＮＡから調製したｃＤＮＡライブラリーをプラスミドｐＢＲ３２２のＰｓｔ１部位の中にサブクローニングした。ｃＤＮＡライブラリーは形質転換された大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）であり、そして１８．０００の形質転換体を配列５’　ＣＣＮＧＣＲＣＡＲＡＡＣＡＴ３’　（配列識別番号ｌ）を有する縮重オリゴヌクレオチドのプールを使用してスクリーニングした。はぼ３０の陽性のクローンか同定された。ウシプロトロンビンｃＤＮＡがらの放射線標識化Ａｖａ　Ｉ−Ｂａｍｔ（ｌ制限断片で陽性のクローンを再スクリーニングすると、縮重オリゴヌクレオチドのプールおよびウシプロトロンビンｃＤＮＡの両者のハイブリダイゼーションする１４のクローンが同定された。陽性のクローンの２つをそれ以上の特性決定のために選択した。１つのクローンは完全なヒトプロトロンビンｃＤＮＡ配列を含有することが発見された。ヒトプロトロンビンｃＤＮＡ配列のＤＮＡ配列および推定されたアミノ酸配列を、配列識別番号２および３に示す。

プロトロンビンのリーダーをエンコードするようにデザインした合成オリゴヌクレオチドを使用して、プロトロンビンの発現ベクターを構成した。合成オリゴヌクレオチドは、アニーリングしたとき、５’　ＥｃｏＲ１付着末端および３°５ｓｔｌ末端を有するヒトプロトロンビンのリーダーをエンコードするアダプターを成形するようにデザインした。オリゴヌクレオチドＺＣ１３７８，ＺＣＩ３７９．　ＺＣ１３２３おヨヒＺｃ１３２４（それぞれ、配列識別番号８．　９．　６および７）を、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋら（前掲、その全体をここに引用によって加える）により記載されている方法を使用してキナーゼ処理しそしてアニーリングした。キナーゼ処理し、アニーリングしたアダプターを、ＥｃｏＲＩおよび５ｓｔｌで消化して線状化した帽３ｍｐ　Ｉ　９と結合した。この結合混合物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株、ＩＭＩ０１中に形質転換し、そして−重鎖ＤＮＡを配列の分析のために調製した。配列の分析により正しい配列を含有するクローンを同定した後、ＲＦ　ＤＮＡをこのクローンから調製し、そしてＥｃｏＲｌおよび５ｓｔｌて消化して１６０１）ｐの断片を単離した。このリーダー含有断片を部分的Ｓｓｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片（プラスミドｐ５９４およびＥｃｏＲＩ線状化、細菌アルカリ性ホスファターゼ処理されたｐＤＸから得られたタンパク質ＣのｃＤＮＡの一部分をエンコードする）に結合した（プラスミド５９４およびＩＩＤＸは普通に譲渡された米国特許第４、９５９．３１８号（これをここに引用によって加える）に記載されている）。この結合混合物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株Ｊ帽Ｏ１の中に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを選択した形質転換体から調製した。制限分析により、プロモーターに関して正しい向きて断片を有するクローンか同定された。プラスミドをＥｃｏＲＩおよびＡｐａＬ［で消化して７５６塩基対の断片を単離することによって、プロトロンビンのリーダーを得た。

ＡｐａＬＩおよびＢａｍｔｌｌて消化して１５５８塩基対の断片を単離しそしてＢａｍ１ｌｌおよびＰｓｔｌて消化して３８５塩基対の断片を単離した初期のｃＤＮＡクローンから、プロトロンビンのコーディング配列の残部を得た。合成オリゴヌクレオチドＺＣ２４９０およびＺＣ２４９２（配列識別番号ＩＯおよび１１）を、アニーリングしたとき、プロトロンビンｃＤＮＡの３゜末端を２ｅｍ２２９Ｒ発現ヘクターと接合するためのＰｓｔ　ｌ−ＥｃｏＲＩアダプターを成形するようにデザインした。

プラスミドＺｅｍ２２９はｐＵｃ！８に基づく発現ベクターであり、マウスメタロチオネイン−１プロモーターとＳＶ４０転写ターミネータ−との間にクローニングしたＤＮＡの挿入のための独特Ｂａｍ１１１部位を含有し、そしてＳＶ４０初期プロモーター、マウスジヒドロフオレートリダクターゼ遺伝子、およびＳＶ４０ターミネータ−を含有する発現単位を含有する。７ｃｍ２２９をＥｃｏＲｌて部分的に消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩ　（クレノー断片）およびｄＮＴＰて平滑末端とし、そして再結合することによって修飾して、２つのＥｃｏＲ１部位を欠失する。生ずるプラスミドをＢａｍＨｌで消化し、次いて線状化プラスミドをＢａｍ１（Ｉ−ＥｃｏＲＩアダプターと結合すると、独特ＥｃｏＲＩ　クローニング部位を生成した。生ずるプラスミドは消化されたＺｅｍ２２９Ｒてあった（第１図）。

ＥｃｏＲｌ−Ａｐａｌｌプロトｏンビンリーダー断片、１．５ｋｂのＡｐａＬＩ　−ＢａｍＨＩブロトロンヒンコーディング配列の断片、０．３８５　ｋｂのＢａｍＨ１−ＰＳｔｌプロトロンビンコーディング配列の断片およびＰｓｔｌ−ＥｃｏＲＩアダプターをＥｃｏＲｌ線状化７ｅｍ２２９と結合した。この結合混合物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）の中に形質転換し、そしてプラスミドＤＮＡを選択した形質転換体から調製した。制限分析により、プロモーターに関して反対の向きに挿入されたプロトロンヒンコーディング領域を有するクローンか同定され、そしてこれをプロトロンビン４／２２９Ｒバツクワードと表示する。

実施例２組織ブラスミノゲンアクチベーターｐｒｅｐｒｏ配列の構成次のようにして構成した２ｃｍ１６９がら、組織プラスミノゲンアクチベーター（ｊＰＡ）　ｐｒｅｐｒｏ配列から単離した。成熟ｔＰＡのためのコーディング配列からなるｃＤＮＡクローンを、ボウウェス（Ｂｏｗｅｓ）黒色腫細胞系からのｍＲＮＡがら構成した（ＲｉｊｋｅｎおよびＣｏ１１ｅｎ、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２５６　：　７０３５−７０４１．１９８１）。次イテコノｃＤＮＡを使用シテブラスミドＩ）ＤＲ１２９６を構成した。ｐＤＲ＋２９６で形質転換された大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）株、１Ｍ８３は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃ＋泪ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）に受け入れ番号５３３４７て受託された。

ＭＴ−１プロモーター、自然ｔＰＡｐｒｅｐｒｏ配列を含む、完全なｔＰＡ　：１−ディング配列、およびヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ターミネータ−からなるＤＮＡ構成体を次のようにして集合した。自然ｔＰＡｐｒｅｐｒｏ配列を合成オリゴヌクレオチドから構成し、そしてＢａｍｆｌｌ消化ｐＵｃ８の中に挿入した。ＭＴ−１プロモーターからなるＫｐｎｌ−ＢａｍＨＩ断片をＭＴｈＧｔ（＋１２　（Ｐａｌｍｉ　ｔｅｒら、５ｃｉｅｎｃｅ　２２　：　８０９−８１４．１９８３）から単離し、そしてｐｕｃ＋ｓの中に挿入して構成体Ｚｅｍ９３を構成した。ｐＢＲ３２２誘導ｐＢＸ３２２　（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、前掲）の中のＭＴ−１およびｈＧｌ（配列からなるプラスミ１−ＥＶ１４２をＥｃｏＲＩて消化し、そしてＭＴ−１プロモーターおよびｈＧＨターミネータ−からなる断片を単離した。この断片をＥｃｏＲ１消化ｐＵｃ１３の中にクローニングしてプラスミドＺｅｍ４を構成した。次いてＺｅｍ９３をＢａｍ旧および５ａｉｌで消化して線状化した。Ｚｅｍ４をＢｇ！Ｉ＋および５ａｌｌで消化し、そしてｈＧＨターミネータ−を精製した。

ｔＰ、Ａｐｒｅｐｒｏ配列をｐＵＣ８ベクターから５ａｕ３Ａ断片として除去した。３っのＤＮＡ断片を次いで接合し、そして正しい向きてｔＰＡｐｒｅｐｒｏ配列を有するプラスミドをＺｅｍ９７と表示する。Ｚｅｍ９７をＢｇｌＩＩで切断し、モしてｐＤＲＩ２９６からのＢｇｌｌｌ−ＢａｍｆｌｌのｔＰＡ配列を挿入した。生ずるベクターをＺｅｍ９９と表示した（第９図）。

第２図に示すように、Ｚｅｍ９９からのｔＰＡコーディング配列をＭＣＦ−１３プロモーターに作用可能に連鎖した（　Ｙｏｓｈ　ｉｍｕｒａら、Ｍｏ１．　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、　５　：　２８３２−２８３５　（１９８５））　、　Ｐｓｔｌ−３ｍａｌ線状化ｐｌｃ＋９）１と結合したＰＳｔｌおよびＳｍａ　Ｉ断片として、ＭＣＦ−１３プロモーターが得られた。生ずるプラスミドをＺｅｍ１６１と表示し、ＢｇｌＩＩで線状化した。ｔＰＡコーディング配列およびヒト成長ホルモンターミネータ−をＺｅｍ９９からＢａｎ）Ｉｔ断片としてｍ離した。Ｂｇｌｌ＋線状化Ｚｅｍ１６１およびＢａｍＨＩ　ｔＰＡ−ｈＧＩ＋断片を一緒に結合した。プロモーターに関して正しい向きにインサートを含有するプラスミドをＺｅｍ１６９と表示する（第２図）。

ＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化して＋２０　ｂｐの断片を単離することによって、ｔＰＡ　リーダー配列をＺｅｍ１６９から単離した。

次いてｔＰＡ　リーダーをタンパク質Ｃをエンコードする配列と接合した。合成オリゴヌクレオチドＺＣＩ２３７およびＺＣＩ２３８　（配列識別番号４および５）を、アニーリングしたとき、タンパク質Ｃの最初の８アミノ酸をエンコードしかっ５’　Ｂｇｌｌｌ付着末端および３’　５ｓｔｌ付着末端を有するアダプターを提供するよにデザインした。オリゴヌクレオチド２ＣＩ２３７およびＺＣＩ２３８　（配列識別番号４および５）を、本質的にＳａｍｂｒｏｏｋらく前掲）により記載されているようにキナーゼ処理した。３′　タンパク質Ｃコーディング配列はプラスミドｐＤＸ／ＰＣ９６２（これは同時係属普通に譲渡された米国特許出願第０７１５８２．１３１号およびＰＣＴ公開Ｗ０９１１０９９５３号、これら全体をここに引用によって加える）から得られ、このプラスミドは５Ｖ４０ｏｒｉおよびエンハンサ−、アデノウィルスの主要な後期プロモーターおよび５°および３′スプライス部位、タンパク質ＣのｃＤＮＡ配列およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含有する。プラスミドｐＤＸ／ＰＣ９６２をＥｃｏＲＩて完全に消化し、そしてＳｍａｌて部分的に消化して、３°タンパク質Ｃ配列を含有する１、５ｋｂの断片を単離した。１２０　ｂｐのＥｃｏＲＩ　−Ｂｇｌｒｌ　ｔＰＡリーダー断片、ＺＣ１２３７（配列識別番号４　）　、ＺＣ１２３Ｂ　（配列識別番号５）および１．５ｋｂのＳａｍ　［−ＥｃｏＲｒ断片を、ＥｃｏＲＩて消化して線状化されたｐＤＸ（米国特許第４．９５９．３１８号（これをここに引用によって加える）に記載されている）と接合した。この結合混合物を大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの中に形質転換し、そしてプラスミドＩＩＮＡを選択した形質転換体から調製した。選択したプラスミドを制限分析すると、ｔＰＡ／ｐＣ／ｐＤＸと名付けた１つのプラスミドは正しい順序でかつ正しい向きて断片を含有することが示された。

実施例３Ａ、　ＴｈｒｌＯＯの構成プラスミドＴｈｒｌＯＯを使用して、プロトロンビンのＡ鎖、活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを含有するｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンを発現させた。

ｔＰＡ　ＩＪ−ダー配列ノロ０塩基対の断片を、プラスミドｔＰＡ／ｐＣ／ｐＤＸ（実施例２）から、ＥｃｏＲｌおよびＮａｒｌを使用する消化により単離した。ヒトプロトロンビンのアルギニン４１５〜グリシン４３１をエンコードするＤＮＡセグメントに接合したｔＰＡリーダー配列の残りの６０塩基対（配列識別番号３）を提供する合成オリゴヌクレオチド（ＺＣ３８３０゜ＺＣ３８３１，ＺＣ３８３２，およびＺＣ３８３３（それぞれ、配列識別番号１２．１３゜１４および１５））を使用して、アダプターを構成した。このアダプター配列を５’Ｎａｒｌ付着末端および３’Ａｖａｌ付着末端を使用してデザインした。すへての４つのオリゴヌクレオチドを独立にキナーゼ処理し、そしてキナーゼの不活性化後、組み合わせそしてアニーリングした。１０３５塩基対のＡｖａｌ−ＥｃｏＲＩプロトロンビン断片を、プラスミドのプロトロンビン４／２２９Ｒバツクワード（実施例１）から単離した。

６０塩基対のＥｃｏＲＩ−ＮａｒｌのｔＰＡリーダー断片、Ｎａｒｌ−Ａｖａｌアダプター、Ａｖａ　ｌ−ＥｃｏＲＩプロトロンビン断片およびＥｃｏＲＩ線状化Ｚｅｍ２２９Ｒベクターを結合した。この結合混合物を使用して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩを形質転換した。プラスミドＤＮＡを８つの形質転換体から調製した。ＮａｒｌおよびＥｃｏＲｌを使用する制限分析により、１つの形質転換体は正しいサイズであるが、プロモーターに関して逆向きにインサートを含有することが示された。＃８と表示するクローンからプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩて消化して全体のインサートを遊離し、そして消化したＤＮＡを再結合して、インサートを適切な向きで有するクローンを得た。この結合から、単一のクローンがインサートを正しい向きて有することが示された。このクローンを＃１５と表示し、ＥｃｏＲｌ、　Ｐｓｔｌ、　Ａｖａｌ、　ＮａｒｌおよびＳａｃ　ｌ酵素を使用してさらに分析し、そしてこれはすへてのＤＮＡ断片を正しいサイズかつプロモーターに関して正しい向きで含有することが発見された。

ＢＩＩＫ５７０細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）米国マリイランド州ロックビレ、に受け入れ番号１０３＋４で受託された）のリン酸カルシウム仲介トランスフェクンヨン（Ｗｉｇｌｅｒら、前掲）において、クローン＃１５からのプラスミドＤＮＡを使用した。このトランスフェクション混合物は２〜１０μｇのプラスミドＤＮＡおよび１００μＭのクロロキンを含有した。この混合物を成長培地（表１）を含有する７０％のコンフルエントのｌｏｃｍのペトリ皿に添加し、そして３７℃および５％のＣＯｌにおいてインキュベーションした。４時間後、この培地を除去し、そして細胞を１５９６のグリセロールを含有するＤＭＥＭ　（ギプコーＢＲＬ　。

マリイランド州ガイサーバーグ）の添加により１分間グリセロールでショックさせた。インキュベーション後、グリセロール培地を成長培地（表１）と置換した。

表　１１、成長培地５００　ｍｌのダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）　（ギブコーＢＲＬ、　ｖリイランド州ガイサーバーグ）５％の胎児仔ウシ血清（ハイクロン（ｌｙｃｌｏｎｅ）、ユタ州ロウガン）１ｍＭのビリビン酸ナトリウム（アービン（Ｉｒｖｉｎｅ）　、カリフォルニア州すンタアナ）０．２９ｍｇ／ｍｌのし一グルタミン（ヘイゼルトン（Ｈａｚｅｌｔｏｎ）　、カンサス州レネクサ）２、選択培地５００　ｍｌのダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）５％の胎児仔ウシ血清ＩｍＭのビリビン酸ナトリウム０．２９ｍｇ／ｍｌのＬ−グルタミンｌμＭまたは１０８Ｍのメトトレキセート３　血清不含培地５００　ｍｌのダルベツコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）１ｍＭのビリビン酸ナトリウム０．２９ｍｇ／ｍｌのし一グルタミン１０ｍｇ／　Ｉのトランスフェリン（、ＪＲＩＩ　、カンサス州レネクサ）５ｍｇ／ｌのフェツイン（アルドリッヒ（Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウィスコンシン州ミルウす−キー）５ｍｇ／Ｉのインスリン（ギブコ、ニューヨーク州グランドアイランド）２μｇ／Ｉのセレニウム（アルドリッヒ、ライスコンシン州ミルウオーキー）トランスフェクション後２４時間において、細胞をトリプシン処理し、そして１０％または２．５％の細胞を選択培地（表１）の中で再プレートした。コロニーがよく確立されるまで、細胞を増殖させた。

独立のコロニーを２４ウエルのプレート（アメリカン・サイアンティフィック・プロダクツ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）　、イリノイ州ソカゴ）の中に取り上げ、そしてコンフルエントになるまで増殖させた。細胞かコンフルエントになったとき、各ウェルからの培地を０．５ｍｌの血清不含培地（表１）と置換した。

血清不含培地の中で２４時間後、培地を集め、そして発色アッセイ（実施例４）において反応性について試験した。反応性は実証されず、そして引き続くクローン＃１５からのＤＮＡの配列分析は２つの突然変異を明らかにした。オリゴヌクレオチドＺＣ３８３３（配列識別番号１５）をスパンする配列は塩基４２においてＴからＡへの置換を含有し、ＴｙｒのＰｈｅへの置換を生じた。この置換は保存的置換であり、そして配列は補正する必要がないことが決定された。さらに、オリゴヌクレオチドＺＣ３８３１（配列識別番号＋３）をスパンする配列は、フレームンフトを引き起こす欠失を塩基２９に有することが発見された。

欠失を補正するために、クローン＃１５からのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＢｓ５ｌｌｌて消化して、ｔＰＡ　リーダーおよびＺＣ３８３３：ＺＣ３８３０（それぞれ、配列識別番号１５および１２）アダプター配列をエンコードするほぼ１１９　ｂｐの断片を単離した。クローン＃１５からのプラスミドＤＮＡを、また、Ａｖａ　ｌおよびＥｃｏＲＩで消化して、プロトロンビンｃＤＮＡ配列を含有するほぼＩｋｂの断片を単離した。オリゴヌクレオチｌ’Ｚｃ３８３１およびＺＣ３８３２（配列識別番号１３および＋４）の中の突然変異は、オリゴヌクレオチド調製物の少量の汚染物質の結果であり、そしてそれ自体新しいオリゴヌクレオチドは合成されなかった。オリゴヌクレオチドＺＣ３８３１およびＺＣ３８３２（配列識別番号１３および＋４）をキナーゼ処理しそしてアニーリングした。１１９　ｂｐのＥｃｏＲＩ　−ＢｓｓｔｌＩ断片、キナーゼ処理しかつアニーリングしたＺＣ３８３１：　ＺＣ３８３２アダプター（配列識別番号１３および１４）、ＩｋｂのＡｖａ　Ｉ−ＩＥｃｏＲｌプロトロンビン断片、およびＥｃｏＲｌ線状化Ｚｅｍ２２９Ｒを結合した。この結合混合物を使用して、大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＸＬ−１細胞を形質転換した。選択した形質転換体からのプラスミドＤＮＡの制限分析および配列分析後、いくつかのクローンはＺＣ３８３１（配列識別番号１３）をスパンする正しい配列を含有することが発見された。正しい配列をＺＣ３８３１（配列識別番号１３）に含有しかつマウスメタロチオネインプロモーター、　ｔＰＡ　リーダー：ヒトプロトロンビンのＡ鎖およびセリンプロテアーゼドメイン：およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルからなるクローンをＴｈｒｌＯＯと表示した。

あるいは、前述したように構成体の部分のすべてを再結合しそして生ずるプラスミドを配列分析によりスクリーニングすることによって、両者の突然変異を修復することができる。オリゴヌクレオチドの再合成は修復しなかった。なぜなら、前述したように、誤差はオリゴヌクレオチド調製物の中の小さい汚染であったからである。

プラスミドＴｈｒｌＯＯを前述したように使用して、ＢＨＫ５７０細胞をトランスフェクションした。トランスフェクション体を増殖し、そしてトランスフェクションした細胞からの培地を前述したようにアッセイした。発色アッセイ（実施例４）において、ＴｈｒｌＯＯクローンｌはｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンを９．４μｇ／ｍｌで発現し、モしてＴｈｒｌＯＯクローン３はｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンを３．５μｇ／ｍｌで発現した。

Ｂ、　ＴｈｒｌＯ］の構成プラスミドＴｈｒｌＯＩを使用して、ヒトプロトロンビンのクリングル２、Ａ鎖、野生型トロンビン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを含有する、ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンを発現した。

全体の１２０塩基対のＩＰＡリーダーをｔＰＡ／ｐｃ／ｐＤＸから単離した。この断片はＥｃｏＲｌ−Ｂｇｌｌｌ断片として単離された。合成オリゴヌクレオチドＺＣ３８５８およびＺＣ３８５９（配列識別番号１６および１７）を、アニーリング後８０塩基対のアダプターを提供するようにデザインした。このアダプターはセリン１９２からアルギニン２１７まてのヒトプロトロンビン配列をエンコードし、そして５’　Ｂｇｌｌ＋付着末端および３゜ｔｌａｅｌｌ付着末端を含有する。Ｃ末端のプロトロンビン配列は、プラスミドプロトロンビン４／２２９Ｒバツクワード（実施例１）から、Ｈａｅｌｌ−ＥｃｏＲＩ断片として得た。

ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌｌｌのＩＰＡリーダー配列、Ｂｇｌｌｌ−Ｈａｅｌｌアダプター、１１ａｅｌｌ−ＥｃｏＲＩプロトロンビンｃＤＮＡ断片、およびＥｃｏＲＩ線状化Ｚｅｍ２２９Ｒを結合した。この結合混合物を使用して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩを形質転換し、そして選択した形質転換体からのプラスミドＤＮＡをＮａｒｌ、　ＥｃｏＲｌ、　Ｐｓｔｌ、　Ａｖａｌ、　５ｓｔｌ　、およびＸｈｏＩを使用して分析した。この分析は期待したサイズであるか、プロモーターに関して逆向きてインサートを有するクローンを明らかにした。＃ｌと表示するこのクローンからのプラスミドＤＮＡをＥｃｏＲＩて消化してベクターからインサートを遊離し、そして再結合した。選択した形質転換体からのプラスミドＤＮＡを制限分析により分析して、プロモーターに関して適切な向きてインサートを存するクローンを同定した。

インサートを正しい向きて有する単一のクローンを＃２１と表示しそして引き続いてＴｈｒｌｏｏと再び命名し、前述したようにＢ１１Ｋ５７０のリン酸カルシウム仲介トランスフェクンヨンにおいて使用した。トランスフェクションした細胞を増殖させ、そして前述したように独立のコロニーを取り上げそして２４ウエルのプレートの中にプレートした。細胞がいったんコンフルエントになったとき、培地を血清不含培地に変えた。２４時間後、発色アッセイ（実施例４）を使用して発色活性を決定した。クローン＃２９はｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンを２０μｇ／ｍｌで発現した。

Ｃ，Ｔｈｒ１０２の構成プラスミドＴｈｒ１０２を使用して、ヒトプロトロンビンのクリングル１、クリングル２、Ａ鎖、野生型トロンビン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインを含有する、ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンを発現した。

全体の１２０塩基対のｔＰＡリーダーをプラスミドｔＰＡ／ｐＣ／ｐＤＸ　（実施例２）からＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ断片として単離した。合成オリゴヌクレオチドＺＣ３８６０およびＺＣ３８６１（配列識別番号１８および１９）を、アニーリング後、ヒトプロトロンビンのセリン６８からプロリン８９まてをエンコードするＤＮＡセグメントからなりかつ５“Ｂｇｌｌ！付着末端および３゛χｈｏｌ付着末端を提供するアダプターを成形するようにデザインした。クリングル１、クリングル２、Ａ鎖、野生型トロンビン活性化部位およびセリンプロテアーゼドメインをエンコードするプロトロンビンｃＤＮＡを、プラスミドプロトロンビン４／２２９Ｒバツクワードから、Ｘｈｏ　ｌ−ＥｃｏＲＩ断片として単離した。

ＥｃｏＲｌ−ＢｇｌｌｌのｔＰＡリーダー配列、Ｂｇｌｌｌ　−Ｘｈｏｌアダプター、Ｘｈｏ　Ｉ−ＥｃｏＲＩプロトロンビンｃＤＮＡ断片、およびＥｃｏＲＩ線状化Ｚｅｍ２２９Ｒを結合した。この結合混合物を使用して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株１１８１０１を形質転換し、そして選択した形質転換体からのプラスミドＤＮＡを前述したようにＮａｒＩ、　ＥｃｏＲｌ、　Ｐｓｔｌ、　Ａｖａｌ、　５ｓｔ１．　Ｘｂａｌ、　Ｂｓｓ旧およびＸｈｏｌを使用して分析した。Ｔｈｒ１０２と表示する単一のクローンは、正しいサイズのインサートをプロモーターに関して正しい向きで有することか発見された。このクローンから調製したプラスミドＤＮＡを、前述したように、Ｂ１１Ｋ５７０のリン酸カルシウム仲介トランスフェクションにおいて使用した。独立のコロニーを２４ウエルのプレートの中に取り上げ、そして１０μＭのメトトレキセートを含有する選択培地の中で修飾した。いったん細胞がフンフルエンドとになったとき、発色アッセイ（実施例４）を使用してｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンを測定した。＃１５と表示するクローンはｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンを９．９μｇ／ｍｌで発現することか示された。

Ｄ、　ＫＥＸ２発現ベクターＫＥＸ２／　Ｚｅｍ２２８の構成形質転換したｋｅｘ２突然変異細胞を適当なテスター細胞の菌叢上のα−因子のかさの生成についてスクリーニングすることによって、された欠陥のすべてを相補する１つのクローンが得られた（交配、ａ−因子の生成、キラー毒素の成熟およびホモ接合体の二倍体株の中の胞子形成）。この遺伝子を酵母ＧＡＬＩプロモーターのコントロール下にｐＵＣベクターの中にサブクローニングした。生ずるプラスミド（ｐ１５１５と表示する）は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）米国マリイラント州ロックビレ、バークローン叶、　＋２３０１　、に受け入れ番号６７５６９て受託された。プラスミドｐ１５１５をｔｌｉｎｄｌｌｌて消化し、そして２．１ｋｂの断片を回収した。この断片をＨｉｎｄｌｌｌ切断ｐＵｃＩ８に結合してプラスミドｐＵＣＩ８／ＫＥＸ２を構成した。次いで、このプラスミドをＨｉｎｄｒｌｌて部分的に消化しそしてＲａｌＴｌ旧で完全に消化することによって、の残部をｐ１５１５のＢａｍ１ｌｌ　＋１Ｉｉｎｄｌｌｌ消化物から０．４３ｋｂの断片として単離した。

次いて、２つの肛次断片をベクターＺｅｍ２２８のＢａｍＨ１部位の中に結合した。Ｚｅｍ２２８は、マウスメタロチオネイン−１プロモーターとＳＶ４０転写ターミネータ−との間に外来ＤＮＡの挿入のための独特Ｂａｍ１ｌ［部位を含有するｐＵｃＩ８に基づく発現ベクターである。Ｚｅｍ２２８は、また、ＳＶ４０初期プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子、およびＳＶ４０プロモーターからなる発現ユニットを含有する。生ずるプラスミドはＫＥＸ２／　Ｚｅｍ２２８と表示する。

Ｅ、野生型トロンビン活性化部位の代わりに別の切断部位を含有するプラスミドの構成ＡｉｌとＴｈｒｌＯＯのプロトロンビンコーディング領域のセリンプロテアーゼドメインとの間に別の切断部位のアダプター挿入により、野生型トロンビン活性化部位（Ａｒｇ−１１ｅ）をアミノ酸配列ＲＲＫＲ（配列識別番号３４）からなる活性化部位と置換した。オリゴヌクレオチドＺＣ３９３２，ＺＣ３９３３，ＺＣ３９３４およびＺＣ３９３６（ソれぞれ、配列識別番号２２゜２３、２４および２５）を、アニーリングしたとき、ＲＲＫＲ（配列識別番号３４）をエンコードしかっＡ鎖およびセリンプロテアーゼドメインの配列をフランキングするＳａｃｌ−Ｍｒｏｌアダプターを提供するようにデザインした。オリゴヌクレオチドＺＣ３９３２およびＺＣ３９３４（それぞれ、配列識別番号２２および２４）の各々をキナーゼ処理した。プラスミドＴｈｒ１００をＢｃｏＲＩおよび５ａｃｌて消化してＡ鎖の５°　コーディング配列からなる０、２４３　ｋｇの断片を単離し、そしてＭｒｏ　ＩおよびＥｃｏＲ（て消化してセリンプロテアーゼドメインの３゛　コーディング配列からなる０、　８８ｋｂの断片を単離した。オリゴヌクレオチドの対を０．２４３　ｋｂのＥｃｏＲＩ−３ａｃｌ断片、０．８８ｋｂのＭｒｏｌ−ＥｃｏＲ１断片およびＺｅｍ２２９Ｒ（ＥｃｏＲＩて消化して線状化しそして仔ウシアルカリ性ホスファターゼで処理して再環化を防止した）と結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＸＬ−１細胞を形質転換した。選択した形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡを制限分析によりスクリーニングし、そしてプロモーターに関して正しい向きでｇｌａ　トメイン不含プロトロンビンのコーディング領域を含有するプラスミドをＴｈｒ１０３と表示しｔこ。

クリングル２、挿入されたＲＲＫＲ活性化部位（配列識別番号３４）およびセリンプロテアーゼドメインをエンコードするＤＮＡ構成体をプラスミドＴｈｒ１０３から構成した。ヒトプロトロンビンのクリングル２の５’Ａ鎖コーディング配列からなる０、５９１　ｋｂのＥｃｏＲＩ　−３ａｃｌ断片をプラスミドＴｈｒｌＯｌから得た。プラスミドＴｈｒ１０３をＳａｃ　ｌおよびＥｃｏＲ１て消化して、ヒトプロトロンビンのＡｊＪｌの３゛　コーディング配列、挿入されたＲＲＫＲ活性化部位（配列識別番号３４）、およびセリンプロテアーゼドメインのコーディング配列からなる０、　９７ｋｂの断片を単離した。０．５９１　ｋｂのＥｃｏＲｌ−Ｓａｃｌ断片を、０．９７０ｋｂのＳａｃ　Ｉ−ＥｃｏＲｌ断片およびＺｅｍ２２９Ｒ（ＥｃｏＲＩて消化して線状化しそして仔つシアルカリ性ボスファターゼで処理して再環化を防止した）と結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）株ＸＬ−１細胞を形質転換した。選択した形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡを制限分析によりスクリーニングし、そしてプロモーターに関して正しい向きてｇｌａ　トメイン不含プロトロンビンのコーディング領域を含有するプラスミドをＴｈｒ１２２と表示した。

クリングル２コーデイング配列およびＡ鎖の５°　コーディング配列：セリンプロテアーゼドメインの３°　コーディング配列：およびベクター配列からなる断片を得るための同一のデザインを使用して、ヒトプロトロンビンのクリングル２をエンコードするＤＮＡセグメント、ヒトプロトロンビンのＡ鎖、野生型トロンビン切断部位（配列識別番号３５）を置換するＬＤＫＲＫＥＸ２切断部位およびヒトブロトロンヒンセリンブロテアーゼドメインからなる類似のプラスミド構成体を作った。これらの断片を、Ａ鎖の３°　コーディング配列、ＬＤＫＲ切断部位のコーディング配列（配列識別番号３５）およびセリンプロテアーゼドメインの５′コーディング配列を提供するアダプターと接合して、プラスミドＴｈｒ１２７を成形した。

ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のトランスフェクション試薬Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル）− Ｎ、Ｎ、Ｎ−）リメチルアンモニウムサルフエート（ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）、インジアナ州インデアナポリス）を製造業者が供給する指示に従いを使用して、プラスミドＴｈｒ１２２およびＫＥＸ２／　Ｚｅｍ２２８を哺乳動物細胞系ＢＨＫ５７０　（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに受け入れ番号１０３１４で受託された）の中に共トランスフェクションした。トランスフェクション体を増殖させ、そしてトランスフェクションした細胞からの培地を発色アッセイ（実施例４）においてアッセイした。発色アッセイの結果は、クローンがほぼ３００　ｎｇ／　１のトロンビンを生産したことを示した。

野生型トロンビン活性化部位およびこの活性化部位から直ぐ上流の２つのアミノ酸のコドンをＲＲＫＲ（配列識別番号３４）と置換して、ヒトプロトロンビンのＡＭをエンコードするＤＮＡセグメント、ＲＲＫＲ（配列識別番号３４）切断部位およびヒトプロトロンビンのセリンプロテアーゼドメインを含有するプラスミドを構成した。オリゴヌクレオチドＺＣ４７Ｉ３．　ＺＣ４７２０，ＺＣ４７２ＬおよびＺＣ４７２２（ソれぞれ、配列識別番号２６．２７．２８および２９）を、アニーリングしたとき、３’Ａ鎖および５゛セリンプロテアーゼドメインのコーディング配列によりフランキングされたＲＲＫＲ切断部位（配列識別番号３４）のコーディング配列をエンコードするＳａｃ　ｌ−Ｍｒｏ　Ｉアダプターを提供するようにデザインした。オリゴヌクレオチドＺＣ４７２０（配列識別番号２７）およびＺＣ４７２１（配列識別番号２８）の各々をキナーゼ処理し、そして各オリゴヌクレオチドをそのコンパニオンのオリゴヌクレオチド（ＺＣ４７１３ＺＣ４７２０（それぞれ、配列識別番号２６および２７）およびＺＣ４７２１：　：ＺＣ４７２２（それぞれ、配列識別番号２８および２９））と了ニーリングした。プラスミドＴｈｒ１００をＥｃｏＲＩおよびＳａｃ　ｌで消化してＩｌｌの５′　コーディング配列をエンコードする０、２４３　ｋｂの断片を単離し、そしてＭｒｏ　ｌおよびＥｃｏＲＩて消化してセリンプロテアーゼドメインの３′　コーディング配列をエンコードする０、８８ｋｂの断片を単離した。オリゴヌクレオチドの対を０．２４３　ｋｂのＥｃｏＲＩ−３ａｃｌ断片、Ｍｒｏｌ　−ＥｃｏＲＩ断片およびＺｅｍ２２９Ｒ（ＥｃｏＲＩて消化して線状化しそして仔つシアルカリ性ボスファターゼで処理して再環化を防止した）に結合した。

生ずる結合混合物を使用して大腸菌（１’ｉ、　ｃｏｌｉ）株ＸＬ−１細胞を形質転換した。選択した形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡを制限分析によりスクリーニングし、そしてプロモーターに関して正しい向きＴｇｌａ　トメイン不含プロトロンビンのコーディング領域を含有するプラスミドをＴｈｒｌ１５と表示した。

ヒトプロトロンビンのクリングル２およびＡＭ４、野生型トロンビン活性化部位と置換するＲＲＫＲ活性化部位（配列識別番号３４）および直ぐ上流の２つのアミノ酸のコドンおよびヒトプロトロンビンのセリンプロテアーゼドメインをエンコードするＤＮＡ構成体をプラスミドＴｈｒｌ１５から構成した。ヒトプロトロンビンのクリングル２および５“　へ鎖のコーディング配列をエンコードする０、５９１　ｋｂのＥｃｏＲＩ　−５ａｃ　ｌ断片をプラスミドＴｈｒ１０１から得た。プラスミドＴｈｒｌ１５をＳａｃ　ｌおよびＥｃｏＲＩて消化して、３’ 　Ａｊ！コーディング配列、変更された活性化部位、およびセリンプロテアーゼドメインのコーディング配列からなる０、　９７ｋｂの断片を単離した。０．５９１　ｋｂのＥｃｏＲＩ　−５ａｃｌ断片を０．９７０　ｋｇ　５ａｃｌ−ＥｃｏＲＩ断片およびＺｅｍ２２９Ｒ（ＥｃｏＲＩて消化して線状化しそして仔ウシアルカリ性ホスファターゼで処理して再環化を防止した）と結合した。生ずる結合混合物を使用して大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＸＬ−１細胞を形質転換した。

選択した形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡを制限分析によりスクリーニングし、そしてプロモーターに関して正しい向きてｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンのコーディング領域を含有するプラスミドをＴｈｒ１２１と表示した。

クリングル２および５°　Ａ鎖コーディング配列；セリンプロテアーゼドメインの３゛　コーディング配列、およびベクター配列からなる断片を得るための同一の制限部位を使用して、ヒトプロトロンビンのクリングル２およびＡＭをエンコードするＤＮＡセグメント、野切断部位および野生型トロンビン活性化部位の直ぐ上流の２つのアミノ酸コドンおよびヒトプロトロンビンのセリンプロテアーゼドメインからなる類似のプラスミド構成体を作った。これらの断片を、３’　ＡｉＪｌコーディング配列、Ｌ［ｌＫＲ切断部位コーディング配列およびセリンプロテアーゼドメインコーディング配列からなるＤＮＡセグメントを提供するアダプターと接合して、Ｔｈｒ１２８を形成した。

ベーリンガー・マンヘイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ）のトランスフェクション試薬を使用して、プラスミドＴｈｒ１２１およびＫＥＸ２／　Ｚｅｍ２２８を哺乳動物細胞系Ｂ＋＋に５７０　（ＡＴＣＣに受け入れ番号１０３＋４で受託された）の中に共トランスフェクションした。トランスフェクション体を増殖させ、そしてトランスフェクションした細胞からの培地を発色アッセイ（実施例４）においてアッセイした。発色アッセイの結果は、クローンがほぼ３００　ｎｇ／　］のトトロピンを生産したことを示した。

Ｆ、　Ｔｈｒｌ１８の構成プラスミドＴｈｒ１００の中に存在する野生型トロンビン活性化部位（Ａｒｇ− １１ｅ）を、アダプターの挿入により、トロンビン切断部位と置換した。オリゴヌクレオチドＺＣ４７３８，ＺＣ４７８＋、　Ｚｃ４７旧、およびＺＣ４７４２（それぞれ、配列識別番号３０．３３．３１および３２）を、アニーリングしたとき、Ａ鎖のカルボキシル末端部分、トロンビン切断部位およびセリンプロテアーゼドメインのアミノ末端部分をエンコードするＤＮＡセグメントを含有するＳａｃｌ−Ｍｒｏｌアダプターを提供するようにデザインしプ９゜オリゴヌクレオチドＺＣ４７８１およびＺＣ４７４１Ｃそれぞれ、配列識別番号３３および３１）の各々をキナーゼ処理し、そして適当なパートナ−のオリゴヌクレオチド（ＺＣ４７８１：　：　ＺＣ４７３８）　（それぞれ、配列識別番号３３および３０）およびＺＣ４７４１：　：　ＺＣ４７４２）　（それぞれ、配列識別番号３１および３２））とアニーリングした。プラスミドＴｈｒｌＯＯをＥｃｏＲｌおよび５ａｃｌて消化してヒトプロトロンビンのＡ鎖の５゛　コーディング配列を含有する０、２４３　ｋｂの断片を慴離し、そしてＭｒｏｌおよびＥｃｏＲｌて消化してプロミーロンビンのセリンプロテアーゼドメインの３°　コーディング配列を含有する０、　８８ｋｂの断片を単離しｔこ。アニーリングしたオリゴヌクレオチド対７：Ｃ／１７８１・：ＺＣ４７３８）　（それぞれ、配列識別番号３３および３０）およびＺｃ４７４１　：　：　ＺＣ４７４２）　（それぞれ、配列識別番号３１および３２）を０．２４３　ｋｂのＥｃｏＲｌ　−３ａｃｌのＴｈｒ１００断片、Ｍｒｏ　Ｉ−ＥｃｏＲＩのＴｈｒｌＯＯ断片およびＺｅｍ２２９Ｒ（ＥｃｏＲｌで消化して線状化しそして仔ウソアルカリ性ホスファターゼで処理して再環化を防止した）と結合した。結合混合物の３μＩのアリコートを大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）株ＸＬ−１細胞の中に形質転換した。選択した形質転換体から調製したプラスミドＤＮＡを制限分析によりスクリーニングした。ヒトプロトロンビンのＡ鎖をエンコードするＤＮＡ配列、トロンビン切断部位およびヒトプロトロンビンのセリンプロテアーゼドメインをプロモーターに関して正しい向きで含有するプラスミドをＴｈｒｌ１８と表示した。

プラスミドＴｈｒｌ１８を、前述したようにベーリンガー・マンヘイムのトランスフェクション試薬を使用して、ＢＩＩＫ５７０細胞の中にトランスフェクションした。トランスフェクション体を増殖させ、モして）・ランスフエクションした細胞からの培地を発色アッセイ（実施例４）においてアッセイした。トランスフェクションした細胞のクローンを選択し、増殖させ、そして２つの６ウエルのプレートの各ウェルに接種した。各ウェルからの成長培地（表１）を、表２に示すように添加剤を含有する血清不合培地（表１）と置換した。

４　０、ＩＵ／ｍ！ヘパリン（ング７）　０．１８５　１Ｕ／ｍｌヘパリン　１．１６　１０Ｕ／ｍｌヘパリン　０．５６７　１０ｎｇ／ｍｌヘビ毒液アクチベータ−０，１５８５０ｎｇ／　ｍｌヘビ毒液アクチヘータ−０，４５９２００ｎｇ／ｍｌヘビ毒液アク毒液−クチベータ１．０１０　１０ｎｇ／ｍｌトロンビン（ワルト・キシエル博士、ニューメキンコ大学、ニューメキシコ州アブクエルク）　０．１８ＩＩ　１００　ｎｇ／ｍｌ　トロンビン　０．２３１２　１１０００ｎ／　ｍｌ　）ロンビン　１．１プレートを３７°Ｃにおいて２４時間インキュベーションし、次いて各ウェルからの培地を実施例４に記載する発色アッセイを使用してアッセイしたが、ただしヘビ毒液アクチベーターを使用する活性化の工程を省略した。このアッセイの結果を表３に示し、そしてＴｈｒｌ＋８から生産されたｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンは低いレベルのヘパリン、ヘビ毒液アクチベーターまたはトロンビンの存在下に自己活性化することができることが示される。

Ｔｈｒｌ　１８でトランスフェクションした細胞から生産されるｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンの自己活性化を試験するために、ランダムに選択したＴｈｒｌ　１８　）ランスフエクションしたクローンを６ウエルのプレートに分割し、そして血清不含培地の中でコンフルエントに増殖させた。各ウェルに、２μｇ／ｍｌのトロンビンを２ｍｌの血清不含培地の中に添加し、そしてプレートをインキュベーションした。２日後、培地の９０％を除去し、そしてトロンビンを含まない新しい血清不含培地と置換し、そしてプレートをインキュベーションした。

３日のインキュベーション後、培地の９０％を各ウェルから除去し、そしてトロンビンを含まない新しい血清不含培地と置換した。各ウェルからの使用済みの培地を発色アッセイにおいてアッセイした。

結果か示すように、細胞はほぼ２．５μｇ／ｍｌのトロンビンを作った。

プレートを３日間インキュベーションし、その後培地の９０％を前述のように置換し、そして使用済み培地のアリコートを前述したようにアッセイした。このアッセイの結果は、細胞がほぼ５μｇ／ｍｌトロンヒンを生産することを示した。

プレートを４日間インキュベーションし、そして前述したように培地を交換し、そしてアッセイした。アッセイの結果は、細胞かほぼＩｔ１ｇ／ｍｌのトロンビンを生産することを示した。

実施例４トロンビン前駆体の精製および活性のアッセイＡ、トランスフエクンヨンした宿主細胞がらのトロンビンの精製１５０　ｍｍの組織培養プレートの中で選択下に１５０　＋ｎｎ＋の組織培養プレートの中でコンフルエンシーに増殖した選択したトランスフェクション体から、トロンビン前駆体を精製した。いったんトランスフェクション体がコンフルエンシーに到達したとき、各プレートからの使用済み培地を除去し、廃棄し、そして２５ｍ１の血清不合培地（表２）と置換した。

２または３回／週、使用済み培地を集めそして一２０″Ｃにおいて貯蔵し、そして２５ｍ　ｌの新しい血清不含培地を各プレートに添加した。各トランスフェクション体について貯蔵した培地を融解し、プールし、そして０．４５μｍのフィルター（ナルゲ（Ｎａｌｇｅ）、ニューヨーク州ロチェスター）を通して濾過した。濾過した培地にアジ化ナトリウムを０．２％（Ｖ　／　Ｖ　）の最終濃度に添加した。

Ｔｈｒ１０２トランスフェクション体からの濾過した培地をＡＦＦＩ−ＧＥＫ” ＢＬＵＥカラム（パイオーラド、カリフォルニア州すッチモンド）に適用した。

トロンビン前駆体をカラムからＩＭ　ＮａＣ１，２５ｍＭＴｒｉｓ、　１））１７．４で溶離した。Ａ□。ピークを集めた。集めたピークの体積が大き過ぎる場合、試料をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）濃縮器（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）　、イリノイ州アーリントンハイツ）を使用して濃縮することかできる。プールした画分を２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７，４で２倍に希釈した。

精製したエキス・カルナラス（Ｅｃｈｉｓ　ｃａｒｎａｔｕｓ）毒液アクチベーターはワルト・キシエル博士（メキシコ大学、ニューメキシコ州アーリントンハイツ）から人手した。簡単に述べると、毒液アクチベーターは粗製の毒液からセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）　Ｇ−１５０，ＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５カラムの順次のゲル濾過および引き続く反復ＭＯＮＯＱ　ＦＰＬＣにより精製した。メルカプトエタノールの存在および不存在の両者において５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの電気泳動により、毒液アクチベーターは見掛けの分子量８０．０００をもつ単一のバンドとして移動した。精製したアクチヘーターを、はぼ０．２　Ｍ　ＮａＣ１を含有する０、５　Ｍ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ８，０中に溶解した。

プールしたＡ２．。ピークの中に存在するトロンビン前駆体を、推定したタンパク質濃度に基づいてＩ　：　１．０００およびｌ　：　２，０００（Ｗ／Ｗ）のヘビ毒液アクチベーターの希釈物の添加により活性化した。

この混合物を３７°Ｃにおいて４時間インキュベーションして、ピークのタンパク質の完全な活性化を可能とした。インキュベーション後、この物質をベンズアミジン・セファローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）　４８カラム（）了−マシアＬＫＢバイオテクノロジー・インコーホレーテッド、ニュージャーシイ州ピスカタエイ）に適用した。このカラムをＩＭＮａＣＩ、　２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ、　ｐＨ７、４で洗浄し、そしてＴＢＳ中の１５ｍＭ　ベンズアミノンで溶離した。両分を集め、そして各試料のアリコートをＴＢＳ。

Ｉｍｇ／ｍｌのＢＳＡ中で２００〜５００倍に希釈した。各希釈した試料の２０〜５０μｍのアリコートを発色アッセイによりアッセイして、トロンビン活性を含有する画分を同定した。

ヒト血漿プロトロンビン（ワルト・キンエル博士、ニューメキシコ大学、ヒトプロトロンビンはシグマ、ミゾリー州セントルイス、から購入することかできる）を発色アッセイにおいて標準として使用した。２０μｇのヒト血漿プロトロンビンをＴＢＳ、　ｐＨ７，４（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前掲）　＋　ｌ　ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン中で２０μｇ／ｍｌ、　１０μｇ／ｍ１．　５　ｕ　ｇ／ｍｌ、　２．５　ｕ　ｇ／ｍ１．１．２５μｇ／ｍｌ、　０．６２５　ｕ　ｇ／ｍｌ。

０．３＋２　ｕ　ｇ／ｍｌ、および０．１５６　ｕ　ｇ／ｍｌの濃度に系統的に希釈した。

二重反復実験の１０μｍの標準を９６ウエルのプレートのウェルに添加した。

２０〜５０μｍの各試料および１０μｌの各標準を９６ウエルのプレートのウェルに添加した。各試料および標準に４０μｌのトロンビン発色性基質（アメリカン・ダイアグノスチカ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）、ニューヨーク州ニューヨーク）を添加した。緩衝液（ＴＢＳ、　Ｉ　ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を各試料および標準に添加して、最終アッセイ体積を１００μｌにした。プレートを室温においてほぼ５分間インキュベーションして発色させた。４０５　ｎｍにおける吸収を各標準および試料について読んだ。ピークのトロンビン活性を示す両分をプールした。プールした両分は、Ｇ−２５カラム（パイオーラド）に適用することによって脱塩することができる。

Ｂ３発色アッセイ１０μｍの適当に希釈した試料（ＴＢＳ、　ｐＨ７，４中、Ｉｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）または標準（前述）を９６ウエルのプレートのウェルに添加することによって、トロンビン活性のレベルを決定する発色アッセイを実施した。各基に、ＴＢＳ、　ｐＨ７、４＋　１　ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン中で希釈した０、５ μｇ／ｍｌのヘビ毒液アクチベーターの８０μｌを添加した。

試料を３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。インキュベーション後、５０μｍのトロンビン発色性基質（アメリカン・ダイアグノスチ力、ニューヨーク州ニューヨーク）を添加した。緩衝液（ＴＢＳ。

Ｉｍｇ／ｍｌのＢＳＡ）を各試料および標準に添加し、そしてプレートを室温においてほぼ５分間インキュベーションして発色させた。４０５　ｎｍにおける吸収を各標準および試料について読んだ。試料の吸収値を平均し、そして標準の曲線と比較して存在する活性化可能なトロンビン前駆体の量を決定した。

ピークの試料を水で８倍に希釈し、そしてエキス・カルナラス（Ｅ、　ｃａｒｎａｔｕｓ）アクチベーターをＩ　：　１００〜１　：　１０００のアクナベ−ター。活性化可能なトロンビン前駆体の重量二重量比に添加した。

次いで、試料を３７°Ｃにおいて１〜４時間インキュベーションした。

活性化された試料の了りコートを還元性および非還元性アクリルアミドゲルの中で電気泳動させて、前駆体のトロンビンへの変換を確証した。

実施例５ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンの発現ユニットの構成および酵母細胞の中の発現ＡｐＺＨＩＯの構成ヒトプロトロンビンのクリングル２、Ａ鎖およびセリンプロテアーゼドメインをエンコードするＤＮＡ分子からなるＤＮＡ構成体を構成した。プラスミドｐＢＲ３２２の中のＰｓｔｌ断片としてサブクローニングされたプロトロンビンコーディング配列からなるプラスミドプロトロンビンをＮａｒｌおよびＢｅ１ｌて消化して、ヒトプロトロンビンのクリングル２コーデイング配列、Ａ鎖コーディング配列および５°　コーディング配列をエンコードする１、２ｋｂの断片を単離した。

アルファ因子ｐｒｅｐｒｏ配列のアミノ酸８１−８３に相当する、アミノ酸５ｅｒ−１，ｅｕ−Ａｓｐをエンコードする酵母コドン最適化配列、Ｌｙｓ−ＡｒｇＫＥＸ２切断部位およびプレトロンビンのアミノ末端のアミノ酸配列（配列識別番号１のアミノ酸３０８−３４５）からなる合成Ｈｉｎｄｌｌｌ　−３ｓｔｌアダプターをまず調製することによって構成したプレトロンビン発現ユニットから、ＴＰＩ＋プロモーター、ＭＦαｌシグナル配列およびＴＰ１１ターミネータ− 配列を得た。オリゴヌクレオチドＺＣ１５２６，ＺＣ１５６３゜ＺＣＩ５６４およびＺＣ１５６５（それぞれ、配列識別番号３９．４０．４Ｉおよび４２）をキナーゼ処理しそしてアニーリングして、前述のｔｌｉｎｄｌｌｌ　−５ｓｔｌアダプターを成形した。アニーリングしたとき、プロトロンビンのカルボキシル末端のアミノ酸（配列識別番号ｌのアミノ酸６１１−６１５）をエンコードする酵母コドン最適化配列および引き続く終止コドンからなるＢｃｌｌ−Ｘｂａｌアダプターを提供するように、第２オリゴヌクレオチドのアダプターを合成した。合成オリゴヌクレオチドＺＣ１６２９およびＺＣＩ６３０　（それぞれ、配列識別番号４３および４４）をキナーゼ処理しそしてアニーリングして、Ｂｅ１ｌ−Ｘｂａｌアダプターを形成した。

プラスミドプロトロンビンを５ｓｔｌおよびＢｅ１ｌで消化して、７８７塩基対のプロトロンビン断片をｔｌ−離した。ｔｌｉｎｄｌｌｌ　−３ｓｔｌアダプター、５ｓｔｌ−Ｂｅｌｌプロトロンビン断片およびＢｅ１ｌ−Ｘｂａｌアダプターを４方向結合において１ｌｉｎｄｌｌｌ−Ｘｂａｌ線状化ｐＵＣ１９と接合した。生ずるプラスミド（ｐＴＩＩＲＩ　と表示する）は、紅α【シグナルのアミノ末端のアミノ酸配列、団猛切断部位およびヒトプロトロンビンをエンコードするＤＮＡセグメントからなる。

」旦プロモーターおよびアルファ因子のシグナル配列をブラスミ）”ｐＴＧＦα ＣＢから得た。Ｌプロモーター、肝αｌシグナル配列、ＰＤＧＦ−ＢＢ配列、」旦ターミネータ−およびＩ）ＩＣＩ９Ｒベクター配列からなるプラスミドｐＢ１２から、プラスミドｐＴＧＦαＣＢを誘導した。ｐＢＩ２の構成は米国特許第４．７６６、０７３号（引用によってここに加える）に開示されている。肚αｌシグナル配列および１１Ｂ１２がらのＰＤＧＦ−ＢＢ配列を、ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片として、Ｍ＋３の中にサブクローニングした。

Ｋｕｎｋｅｌら（米国特許第４．８７３．１９２号、引用によってここに加える）により記載されている方法およびオリゴヌクレオチドＺＣ１１５９（配列ル配列の中に存在する５ｓｔｌ部位を旧ｎｄｌ１１部位に変化させた。５ｓｔｌｌシグナル配列を含有する断片をＥｃｏＲ［−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片として単離した。

肚α１シグナル配列を含有するＥｃｏＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌｌ断片および合成された形質転換性成長因子α（ＴＧＦα）コーディング配列を含有する旧ｎｄｌｌｌ −χｂａｌ断片を、ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ線状化ｐＵｃ１３と結合した。生ずるプラスミド（αｆＴＧＦα／ｐＵＣ１３と表示する）をＥｃｏＲＩおよびＸｂａｌて消化してＭＦαＩ−ＴＧＦαインサートを単離し、これをｐ１７０ｃＢ／ｐＢＲの中にクローニングした。プラスミドｐ１７０ｃＢ／ｐＢＲの構成はＭｕｒｒａｙ　（同時係属米国特許出願第０７１５５７．２１９号およびＷ０９２１０１７１６、これらをここに引用によって加える）により記載され、そしてそれを単離した。ＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａｌ　ｐ１７０ｃＢ／ｐＢＲ断片およびＥｃｏＲＩ　−Ｘｂａｌブレトロンビン発現ベクターを構成するために、プラスミドＴＧＦα断片を囃離した。プラスミドｐＴＨＲ１をＨｉｎｄｌｌｌおよびＸｂａ　Ｉで消化して、ＭＦα１−プレトロンビンコーディング配列を単離した。２つの断片を結合し、そして生ずるプラスミドをｐＴＨＲ２と表示した。

ｇｌａ　ドメイン不含プロトロンビンの分泌を指令することができる列からなる５、　９７ｋｂの断片を単離した。オリゴヌクレオチドＺＣ５３４４（配列識別番号４７）およびＺＣ５３５４（配列識別番号４８）のカイネイシて第２クリングルドメインに肝αＩ　ｐｒｅｐｒｏを接合するためのアダプターを形成した。

このアダプターは、アミノ酸セリン、プロトロンビンのアミノ酸１９２−２１６（配列識別番号２）の直ぐ前のＫＥＸ２切断部位をエンコードするＤＮＡ配列をフランキングするｌ１ｉｎｄｌｌｌおよびＮａｒｌ付着末端からなる。末端のプロトロンビンコーディング領域の１５塩基対、およびトロンビン前駆体コーディング配列の３′末端をＴＰ１１ターミネータ−に接合するための付着末端を含有する他のアダプターを、オリゴヌクレオチドＺＣＩ６３０　（配列識別番号側）およびＺＣ１６２９（配列識別番号４３）のカイネイションおよびアニーリングにより形成した。ｐＴＩＩＲ２からの５．９７ｋｂの断片、ＺＣ５３４４／ＺＣ５３４５アダプター、プロトロンビンからの！、２ｋｂの断片およびＺＣ１６３０／ＺＣ１６２９アダプターミネーターからなる。

２ミクロンを含有するｐｃｐｏＴの７５０　ｂｐのＳｐｈｌ−ＢａｍＨＩ断片を、ｐＢＲ３２２テトラサイクリン耐性遺伝子から誘導された＋８６　ｂｐのＳｐｈｌ−ＢａｍＨＩ断片と置換することによって、プラスミドｐＣＰＯＴからプラスミドｐＤＰＯＴを誘導した。（プラスミドｐＣＰＯＴはＡＴＣＣに大腸菌（Ｅ。

ｃｏｌｉ）株ＨＢＩＯＩの形質転換体として受託されそして受け入れ番号３９６８５を割り当てられた。それは全体の３ミクロンのプラスミドＤＮＡ　、１ｅｕ −ｄ遺伝子、１ｌＢＲ３２２配列およびシゾサッカロマイセス・ボンベ（Ｓｃｈｉｘｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｐｏｍｂｅ）　ＰＯＴＩ遺伝子からなる。

）Ｓｐｈ　ｌ−ＢａｍＨｌ断片をポリリンカーで置換することによって、プラスミドｐＤＰＯＴからプラスミドｐＲＰＯＴ誘導した。プラスミド１）ＤＰＯＴをｓｐｈ　！およびＢａｍ１ｉｌで消化して１０．８ｋｂの断片を単離した。オリゴヌクレオチドＺＣ１５５１およびＺＣ１５５２（配列識別番号３７および３８）を消化して、Ｓｍａｌ、　５ｓｔｌおよびＸｈｏ　Ｉ制限部位をフランキングするＢａｍ１ｌ［付着末端および５ｐｈｌ付着末端をもつアダプターを形成した。オリゴヌクレオチドＺＣ１５５１およびＺＣ１５５２（配列識別番号３７および３８）をキナーゼ処理しそしてアニーリングしてＢａｍｔｌｌ　−５ｐｈｌアダプターを形成した。１０．８ｋｂのｐＤＰＯＴ断片をＺε１５５１／ＺＣ１５５２アダプターとの結合により環化した。生ずるプラスミドをｐＲＰＯＴと命名した。

プラスミドｐｚｏ６の中に存在する発現ユニットをｐＲＰＯＴの中にサブクローニングした。プラスミドｐ２Ｈ６を、また、１（ｉｎｄｌｌｌおよび５ｐｈｌで消化して、トロンビン前駆体コーディング配列およびＴＰ１１ターミネータ−からなる２、２ｋｂの断片を単離した。２つの断片をＢａｍ１ｌｌ　−５ｐｈ　＋線状化ｐＲＰＯＴの中に結合した。生ずるプラスミドをＩＩＺＨＩＯと表示した。

Ｂ、　ｐ７１１８の構成ヒトプロトロンビンのクリングル１、クリングル２．１１およびセリンプロテアーゼドメインからなるトロンビン前駆体をエンコードするＤＮＡ分子からなるＤＮＡ構成体を調製した。プラスミドプロトロンビンをＸｈｏｌおよびＢｅ１ｌで消化して、クリングルｌおよび２コーディング配列、Ａ鎖コーディング配列およびセリンプロテアーゼドメインの５゛　コーディング配列からなる１、６ｋｂの断片を単離した。

ンビンコーディング配列の末端の１５塩基対からなる５、　９９ｋｂの断片を単離した。オリゴヌクレオチドＺＣ５３３９（配列識別番号４５）およびＺＣ５３４０（配列識別番号４６）のカイネイションおよびアニーリングにより、叶αＩ　ｐｒｅｐｒｏをクリングルｌに接合するためのアダプターをドｐＺＨ５を構成した。

結合した。生ずるプラスミドを！１ＺＨ８と表示した。

Ｃ８酵母細胞の中のｐＺＨｌＯおよびｐｚｏｓの発現２．５　リットルのフラスコの中の１．２リツトルのＹＥＰＤ＋　６％グルコースの中に各形質転換体の５ｍｌの一夜のＹＥＰＤ培養物を接種し、そして培養物を震盪器の中で３０°Ｃにおいて６０時間インキュベーションすることによって、選択したＺＭＩ＋４およびＺＭ１１８形質転換体を活性化可能なトロンビンを生産する能力についてアッセイした。インキュベーション１２４．３６．４８および６０時間に、各１００　ｍｌの試料を取った。

試料を遠心し、そして使用済み培地を発色アッセイにおいて活性化されたトロンビンの存在についてアッセイした。

ヒト血漿プロトロンビンの標準は、ワルト・キシエル博士にューメキシコ大学）から入手したヒト血漿プロトロンビンを使用して調製した。ヒトプロトロンビンを活性化緩衝液（後述する）の中で５．０　ｕ　ｇ／ｍｌ、　２．５　ｕ　ｇ／ｍｌ、　２．０　μｇ／ｍ１．１．５　μｇ／ｍｌ、　１．Ｏｕ　ｇ／ｍｌ、　０．５　ｕ　ｇ／ｍｌ、　０．４　ｕ　ｇ／ｍｌ、および０．３μｇ／ｍｌに希釈した。標準の二重反復実験の試料を９６ウエルのマイクロタイタープレートのウェルに添加した。

上澄み液の各２０μｍの試料に、活性化緩衝液（２０ｎＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐ）Ｉ７．４）、１５０　ｍＭ　ＮａＣ１，０，２％アジ化ナトリウム）中で希釈した８０μｍの１μｇ／ｍｌのヘビ毒液アクチベーターを添加した。試料を３７°Ｃにおいて１時間インキュベーションした。インキュベーション後、１００μｍの０．２５ｍＭのトロンビン発色性基質（アメリカン・ダイアグノスチ力）を添加し、そしてプレートを１〜３時間インキュベーションして発色させた。４０５　ｎｍにおける吸収を各標準および試料について読んだ。試料の吸収値を平均し、そして標準曲線と比較して活性化可能なトロンビン前駆体の存在量を決定した。

表３はアッセイの結果を示す。

表　３活性化可能なトロンビンのレベル（μｇ／ｍｌ）株〔プラスミド１２４時間　３６時間　４８時間　６０時間ＺＭ１１８［ＤＰＯＴ］　ＯＱ　ＯＯＺＭＩＩ８［ｐＺＨ８］　０．１１　０．０８　０．５　０．５ＺＭＩＩ８［ｐＺＨ１０］　０．０８　０．０５　０．２　−−−２Ｍ１１４［ｐＺｌ＋８］　 −−−−−−０，８４０，８８ＺＭ１１４［ｐＺＨ１０］　０．１０　−−−　０．１８　０．３以上の本発明は理解を明瞭にすることを目的として例示および実施例により多少詳細に記載されたが、明らかなように、ある種の変化および変更は添付する請求の範囲の範囲内で行うことができる。

配列の列挙（１）一般情報。

（ｉ）出願者：　ｔｌｏｌｌｙ、　Ｒｉｃｈａｒｄ　Ｄ。

Ｆｏｓｔｅｒ、　Ｄｏｎａｌｄ　Ｃ。

（ｉｉ）発明の名称ニトロンビンの製造方法（ｉｎ　）配列の数・４８（ｉｖ）通信住所（Ａ）受信人：　Ｔｏｗｎｓｅｎｄ　ａｎｄ　Ｔｏｗｎｓｅｎｄ（Ｂ）通　リ：　Ｏｎｅ　Ｍａｒｋｅｔ　Ｐｌａｚａ、　５ｔｅＷａｒｔ　５ｔｒｅｅｔ　Ｔｏｗｅｒ。

Ｔｗｅｎｔｉｅｔｈ　Ｆｌｏｏｒ（Ｃ）町　：　Ｓａｎ　Ｐｒａｎｃｉｓｃ。

（Ｄ）州　：ＣＡ（Ｅ）国　：　ＵＳＡ（Ｆ）郵便番号：　９４１０５（Ｖ）コンピューター読取りフオーム：（Ａ）媒体タイプ、フロッピーディスク（Ｂ）：］ンビューター：　ＩＢＭ　ＰＣｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ（Ｃ）操作システム　ＰＣ−ＤＯＳ／ＭＳ−Ｉ）Ｏ３（Ｄ）ソフトウェアー：　Ｐａｔｅｎｔｌｎ　Ｒｅ１ｅａｓｅ　＃１．Ｏ，Ｖｅｒｓｉｏｎ　ｔｌｌ、２５（ｖｉ　）出願データ（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日。

（Ｃ）分　類・（ｖｉ）従来の出願データ：（Ａ）出願番号：　ＵＳ　０７／８６０．７０１（Ｂ）出願８二３１−ＭＡＲ− １９９２（ｖｉ）従来の出願データ。

（Ａ）出願番号：　ＵＳ　０７／８１６．２８１（Ｂ）出願日　３ｌ−ＤＥＣ− １９９１（ｖｉ）アトニー／エージェント情報：（Ａ）名　称：　Ｐａｒｍｅｌｅｅ、　５ｔｅｖｅｎ　Ｗ（Ｂ）登録番号：３１．９９０（Ｃ）参照／ドケット番号二１３９５２−１２−２（ｉｘ）！信情報；（Ａ）　ｔ　話　；２０６〜４６７−９６００（Ｂ）テレファックス：　４１５ −５４３−５０４３（２）配列番号１についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：１４個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木組（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｘｌ）配　列：配列番号Ｉ；ＣＣＮＧＣＲＣＡＲＡ　ＡＣＡＴ　１４（２）配列番号２についての情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ：　１９４７個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｖｌ）起源：（Ａ）生物名：　Ｈｏｍｏ　５ａｐｉｅｎｓ（Ｆ）組織型：　Ｈｅｐａｔｉｃ（ｉｘ）配列の特徴：（Ａ）名称／キー：　ＣＤ５（Ｂ）位置３．．１８＝＋７（ｘｌ）配　列　配列番号２：ＡＡＣＣＡＡＴＣＣＣＧＴＧＡＡＡＧＡＡＴ　ＴＡＴＴＴＴＴＧＴＧ　ＴＴＴＣＴＡＡＡＡＣＴＡＴＧＧＴＴＣＣＣ１９２７ＡＡＴＡＡＡＡＧＴＧ　ＡＣＴＣＴＣＡＧＣＧ　１９４７（２）配列番号３についての情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長　さ・６１５個のアミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー二直鎖状（ｉｌ）配列の種類、タンパク質（ｘｌ）配　列：配列番号３・Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｖａｌｌ　５　１０　１５１１ｉｓ　Ｓｅｒ　Ｇｉｎ　１ｌｉｓ　Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｉｎ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ１、ｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　ＡｒｇＡｒｃ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　ＡｒｇＧｌｕ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｖａ１Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　ＡｒｇＡｓｐ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＧｌｙ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｈｉｓ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　ｌｉｅ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　ｒｌｅ＋１０　１１５　＋２０Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ＋２５　１３０　１３５Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｓｐ　ｔ、ｅｕ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　ＣｙｓＡｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ＋５５　１６０　１６５Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　Ａｒｇ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｓｅｒ　ｌｉｅ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　ＧｌｙＧｌｎ　Ａｓｐ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ＋８５　１９０　＋９５Ｓｅｒ　Ｖａｔ　Ａｓｎ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＡｒｇＧｌｙ　Ｇｌｎ　Ｇｌｎ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｌａ　Ｖａｔ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｇｌｙ　ＬｅｕＨｉｓ　Ｇｉｎ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｎ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　ＣｙｓＡｒｇ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｖａｔ　Ｔｒｐ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ　Ｖａｌ　ＡｌａＧｌｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｃｙｓ　ＧｌｕＧｌｕ　Ａｌａ　Ｖａｌ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　ＡｓｐＧｌｕ　Ａｓｐ　５ｅｒＡｓｐ　Ａｒｇ　Ａｌａ　ｌｉｅ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ｇｌｎ　ＴｈｒＰｈｅ　Ｐｈｅ　Ａｓｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ａｓｐ　Ｃｙｓ　ＧｌｙＬｅｕ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＧｌｕＡｒｇ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　［１ｅ　Ｖａｔ　Ｇｌｕ　ＧｌｙＳｅｒ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｔｒｐ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　ＰｈｅＡｒｇ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｎ　Ｇｌｕ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　ｌｉｅ　５ｅｒＡｓｐ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｖａｔ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｐｒ。

Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ｇｌｕ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｖａｌ　Ａｒｇ　ｌｉｅ　ＧｌｙＬｙｓ　Ｈｉｓ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ａｓｎ　Ｉｌｅ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　ｌｉｅ　５ｅｒＭｅｔ　Ｌｅｕ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　１ｌｉｓ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｔｒｐ　Ａｒｇ　ＧｌｕＡｓｎ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　ｌｉｅ　Ａｌａ　Ｌｅｕ　Ｍｅｔ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｖａ１Ａｌａ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　ｌｉｅ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｖａｔ　Ｃｙｓ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　ＧｌｕＴｈｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｇｌｎ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　Ｔｈｒ（２）配列番号４についての情ｔｉｌ：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長　さ＝２８個の塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数ニー木繊（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｖｉ）直接の起源。

（Ｂ）クローン　ＺＣＩ２３７（ｘｉ）配　列　配列番号４゜ＧＡＴＣＴＧＣＣＡＡ　ＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧ　ＧＡＧＧＡＧＣＴ　２８（２）配列番号５についての情報・（ｉ）配列の特徴（Ａ）長　さ：２０個の塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数、一本絹（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｙｉ）直接の起源。

（Ｂ）クローン：　ＺＣ１２３８（ｘｉ）配　列　配列番号５ＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡ　ＧＧＡＧＴＴＧＧＣＡ　２０（２）配列番号６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ　２７個の塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数ニー木繊（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｖｉ）直接の起源（Ｂ）クローン・ＺＣ１３２３（ｘｉ）配　列・配列番号６ＣＣＴＣＣＡＧＧＡＡ　ＧＧＡＧＴＴＧＧＣＴ　ＣＧＣＣＧＧＡ　２７（２）配列番号７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ・３５個の塩基対（Ｂ）型　・核酸（Ｃ）鎖の数ニー木繊（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｖｉ）直接の起源（Ｂ）クローン　ＺＣＩ３２４（ｘｉ）配　列、配列番号７：ＣＧＣＧＴＣＣＧＧＣＧＡＧＣＣＡＡＣＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧ　ＧＡＧＣＴ　３５（２）配列番号８についての情報・（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ、１２６個の塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数　一本絹（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｖｉ）直接の起源（Ｂ）クローン　ＺＣＩ３７８（Ｘｌ）配　列、配列番号８゜ＡＡＴＴＣ，ＣＡＣＣＡ　ＴＧＧＣＴＣＡＴＧＴ　ＧＡＧＡＧＧＡＣＴＧ　ＣＡＡＣＴＧＣＣＴＧ　ＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣ５０ＴＣＴＧＧＣＴＧＣＴ　ＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＣＡＣＡＧ　ＣＣＡＧＣＡＴＧＴＧ　ＴＴＣＣＴＧＧＣＴＣ１００ＣＴＣＡＧＣＡＧＧＣＣＡＧＧＡＧＣＣＴＧ　ＣＴＧＣＡＡ　１２６（２）配列番号９についての情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長　さ・１２６ｇの塩基対（、Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数　一本絹（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｖｉｉ）直接の起源（Ｂ）クローン　ＺＣ１３７９（ｘｉ）配　列、配列番号９・ＣＧＣＧＴＴＧＣＡＧ　ＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧ　ＧＣＣＴＧＣＴＧＡＧ　ＧＡＧＣＣＡＧＧＡＡ　ＣＡＣＡＴＧＣＴＧＧ　５０ＣＴＧＴＧＣＡＣＣＡ　ＧＧＣＴＧＣＡＣＡＧ　ＡＧＣＡＧＣＣＡＧＡ　ＧＣＣＡＧＧＣＡＧＣＣＡＧＧＣＡＧＴＴＧ　１００ＣＡＧＴＣＣＴＣＴＣＡＣＡＴＧＡＧＣＣＡ　ＴＧＧＴＧＧ　＋２６（２）配列番号１０についての情？［１（ｉ）配列の特徴（Ａ）長　さ　１９個の塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数　一本絹（Ｄ）トポロジー　直鎖状（〜ｉ）直接の起源（Ｂ）クローン　ＺＣ２４９０（ｘｉ）配　列：配列番号ｌＯ：ＡＡＴＴＣＴＡＣＡＣＡＡＴＧＣＴＧＣＡ　１９（２）配列番号１１についての情報。

（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長　さ・１１個の塩基対（Ｂ）盟　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー木繊（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｖｉ）直接の起源（Ｂ）クローン　ＺＣ２４９２（ｘｌ）配　列：配列番号１１：ＧＣＡＴＴＧＴＧＴＡ　Ｇ　１１（２）配列番号１２についての情報・（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：５６個の塩基対（Ｂ）型　・核酸（Ｃ）鎖の数　一本絹（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｖｉｉ）直接の起源（Ｂ）クローン・ＺＣ３８３０（ｘｌ）配　列・配列番号１２：ＧＣＧＣＧＣＴＣＣＴ　ＣＴＴＣＴＧＡＡＴＣＧＧＧＣＡＴＧＧＡＴ　ＴＴＣＣＴＧＧＣＴＧ　ＧＧＣＧＡＡＡＣＧＡ　５０、ＡＧＡＣＧＧ　５６（２）配列番号１３についての情報。

（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ　５４個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー８直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ３８３１（ｘｌ）配　列：配列番号１３ＧＣＧＣＧＣＡＣＣＧ　ＣＣＡＣＡＡＧＴＧＡ　ＧＴＡＣＣＡＧＡＣＴ　ＴＴＣＴＴＣＡＡＴＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＴ　５０ＴＧＧＣ５４（２）配列番号１４についての情Ｉｉ１　：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ、５２個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）　ｉｇの数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｖｉ）直接の起源（Ｂ）クローン・ＺＣ３８３２（ｘｉ）配　列・配列番号１４：ＣＣＧＡＧＣＣＡＡＡ　ＧＧＴＣＣＴＡＧＧＡ　ＴＴＧＡＡＧＡＡＡＧ　ＴＣＴＧＧＴＡＣＴＣＡＣＴＴＧＴＧＧＣＧ　５０にＴ５２（２）配列番号１５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Δ）長　さ：５２個の塩基対（Ｂ）型　・核酸（Ｃ）ｉｇの数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン　ＺＣ３８３３（ｘｌ）配　列：配列番号１５；ＣＧＣＣＧＴＣＴＴＣＧＴＴＴＣＧＣＣＣＡ　ＧＣＣＡＧＧＡＡＡＴ　ＣＣＡＴＧＣＣＣＧＡ　ＴＴＣＡＧＡＡＧＡＧ　５０ＧＡ　５２（２）配列番号１６についての情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ二８０個の塩基対（Ｂ）型　・核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン・ＺＣ３８５８（ｘｉ）配　列：配列番号１６゜ＧＡＴＣＴＧＡＡＧＧ　ＣＴＣＣＡＧＴＧＴＧ　ＡＡＴＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＴＣＧＡ　ＧＣＡＧＴＧＴＧＴＣ５０ＣＣＴＧＡＴＣＧＧＧ　ＧＧＣＡＧＣＡＧＴＡ　ＣＣＡＧＧＧＧＣＧＣ８０（２）配列番号１７についての情報（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ−７２個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ３８５９（ｃｉ）配　列：配列番号１７：ＣＣＣＴＧＧＴＡＣＴ　ＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧ　ＡＴＣＡＧＧＧＡＣＡ　ＣＡＣＴＧＣＴＣＧＡ　ＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡ　５０ＣＡＧＡＴＴＣＡＣＡ　ＣＴＧＧＡＧＣＣＴＴ　ＣＡ　７２（２）配列番号１８についての情報。

（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ、６４個の塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数、一本鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｖｉ　）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ３８６０（ｘｌ）配　列・配列番号１８゜ＧＡＴＣＴＴＣＣＡＣＧＧＣＴＡＣＧＧＡＴ　ＧＴＧＴＴＣＴＧＧＧ　ＣＣＡＡＧＴＡＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＧＡＧ　５０ＡＣＡＧＣＧＣＧＣＡ　ＣＧＣＣ６４（２）配列番号１９についての情報。

（ｉ）配列の特徴− （Ａ）長　さ　６４個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ’）　ｉｇの数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン　ＺＣ３８６１（ｘｉ）配　列　配列番号１９゜ＴＣＧＡＧＧＣＧＴＧ　ＣＧＣＧＣＴＧＴＣＴ　ＣＡＣＡＡＧＣＴＧＴ　ＧＴＡＣＴＴＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴ　５０ＣＣＧＴＡＧＣＣＧＴ　ＧＧＡＡ　６４（２）配列番号２０についての情報（ｉ）配列の特徴（Ａ）長　さ：２７個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）　ｊＪ！の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｖｉ　）直接の起源・（Ｂ）クローン：　ＺＣ４３９３（ｘｉ）配　列・配列番号２０：ＣＴＣＴＣＣＣＧＡＧ　ＣＣＡＡＡＧＧＴＣＴ　ＧＣＧＧＡＴＴ　２７（２）配列番号２１についての情報：（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長　さ　３０個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）Ｉの数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー−直鎖状（ｖｉ）直接の起源。

（Ｂ）クローン：　ＺＣ４４４３（ｘｌ）配　列　配列番号２１：ＧＴＣＡＣＣＧＧＧＡ　ＡＴＴＣＡＴＣＧＡＴ　ＡＴＣＴＡＧＡＴＣＣ３０（２）配列番号２２についての情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長　さ＝５６個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｖｉ　）直接の起源・（Ｂ）クローン・ＺＣ３９３２（ｘｉ）配　列：配列番号２２：ＡＴＣＣＧＡＧＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＧ　ＣＣＣＧＴＣＧＡＴＧ　ＴＡＧＧＡＴＴＣＣＡ　５０ＧＧＡＧＣＴ　５６（２）配列番号２３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：４６個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数・一本絹（Ｄ）トポロジー１直鎖状（ｖｉ　）直接の起源・（Ｂ）クローン：　ＺＣ３９３３（ｘｉ）配　列：配列番号２３：ＣＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＧ　ＧＧＣＧＣＣＧＡＡＡ　ＧＣＧＣＡＴＴＧＴＧ　ＧＡＧＧＧＣ４６（２）配列番号２４についての情報・（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ：４４個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）Ｈの数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ３９３４（ｘｌ）配　列：配列番号２４：ＴＣＧＧＡＴＧＣＡＧ　ＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴ　ＧＴＣＡＣＣＴＴＧＧ　ＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴ　４４（２）配列番号２５についての情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ：４２個の塩基対（Ｂ）型　、核酸（Ｃ）鎖の数　一本絹（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ３９３６（ｘｉ）配　列：配列番号２５・ＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＣＡＴ　ＧＣＣＧＡＴＣＴＣＴ　ＧＣ４２（２）配列番号２６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：３７個の塩基対（Ｂ）型　・核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クロー　ン：　ＺＣ４７１３（ｘｌ）配　列：配列番号２６：ＣＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＣＣＧＡＣＧＡＡ　ＡＧＣＧＣＡＴＴＧＴ　ＧＧＡＧＧＧＡ　３７（２）配列番号２７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：４７個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）Ｈ４の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（紬）直接の起源：（Ｂ）クロー　＞　：　ＺＣ４７２０（Ｘｌ）配　列：配列番号２７：ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＴＣＧＣＴＴＴＣＧＴＣＧ　ＧＴＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴ　４７（２）配列番号２８についての情ＩＬ（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長　さ、４４個の塩基対（Ｂ）梨　；核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー１直鎖状（ｖｊ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ４７２１（ｘｌ）配　列：配列番号２８・ＴＣＣＧＡＴＧＣＡＧ　ＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴ　ＧＴＣＡＣＣＴＴＧＧ　ＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴ　４４（２）配列番号２９についての情報：（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長　さ、４２個の塩基対（Ｂ）型　・核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｖＩＩ）直接の起源。

（Ｂ）クローン・ＺＣ４７２２（ｘｉ）配　列　配列番号２９：ＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＣＡＴ　ＧＣＣＧＡＴＣＴＣＴ　ＧＡ　４２（２）配列番号３０についての情報：（ｉ）配列の特徴（Ａ）長　さ、３７個の塩基対（Ｂ）型　核酸（Ｃ）鎖の数・一本絹（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｖｉ）直接の起源。

（Ｂ）クローン・ＺＣ４７３８（Ｘｌ）配　列・配列番号３０：ＣＣＴＧＧＡＡＴＣＣＴＡＣＡＴＣＧＡＣＣＣＧＣＧＣＡＴＴＧＴ　ＧＧＡＧＧＧＡ　３７（２）配列番号３１についての情報：（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長　さ＝４４個の塩基対（Ｂ）型　、核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源（Ｂ）クローン：　ＺＣ４７４１（ｘｌ）配　列：配列番号３１：ＴＣＣＧＡＴＧＣＡＧ　ＡＧＡＴＣＧＧＣＡＴ　ＧＴＣＡＣＣＴＴＧＧ　ＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＴＴＴ　４４（２）配列番号３２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ、４２個の塩基対（Ｂ）壓　：核酸（Ｃ）Ｈの数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー；直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ４７４２（Ｘり配　列：配列番号３２：ＣＣＧＧＡＡＡＡＧＣＡＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＡＧＧＴＧＡＣＡＴ　ＧＣＣＧＡＴＣＴＣＴ　ＧＣ４２（２）配列番号３３についての情報。

（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長　さ＝４７僧の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源。

（Ｂ）クローン：　ＺＣ４７８１（ｘｌ）配　列：配列番号３３：ＡＴＣＧＧＡＴＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＧＣＧＣＧＧＧＴＣＧＡＴ　ＧＴＡＧＧＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＣＴ　４７（２）配列番号３４についての情報；（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長　さ：４個のアミノ酸（Ｂ）堅　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー・直鎖状（ｖ）フラグメントタイプ　内　部（ｘｉ）配　列；配列番号３４：（２）配列番号３５についての情報− （ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ＝４個のアミノ酸（Ｂ）型　二アミノ酸（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖ）フラグメントタイプ　内　部（ｘｌ）配　列：配列番号３５：（２）配列番号３６についての情ｔｔｉ　：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ：２０個の塩基対（Ｂ）型　、核酸（Ｃ）ｗＡの数、−木組（Ｄ）トポロジー　直鎖状（ｉｉ）分子タイプ：　ｃＤＮＡ（ｖｉ　）直接の起源（Ｂ）クローン：　ＺＣ１１５９（ｘｉ）配　列：配列番号３６・ＴＴＧＴＣＣＡＡＧＣＴＴＡＣＡＣＣＴＴＣ（２）配列番号３７についての情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ：２７個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣＩ５５１（ｘｌ）配　列、配列番号３７：ＧＡＴＣＣＣＣＧＧＧ　ＧＡＧＣＴＣＣＴＣＧ　ＡＧＧＣＡＴＧ　２７（２）配列番号３８についての情報：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ、１９個の塩基対（Ｂ）型　、核酸（Ｃ）鎖の数、−木組（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン・ＺＣ１５５２（ｘｉ）配　列：配列番号３８：ＣＣＴＣＧＡＧＧＡＧ　ＣＴＣＣＣＣＧＧＧ　１９（２）配列番号３９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ＝７０個の塩基対（Ｂ）型　、核酸（Ｃ）鎖の数−一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖状２°　（軸）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣＩ５６２（ｘｉ）配　列、配列番号３９・ＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡ　ＡＧＡＧＡＡＣＣＧＣＴＡＣＣＴＣＴＧＡＡ　ＴＡＣＣＡＡＡＣＣＴ　ＴＣＴＴＣＡＡＣＣＣ５ＡＡＧＡＡＣＣＴＴＣＧＧＴＴＣＴＧＧＴＧ　７（２）配列番号４０についての情報・（ｉ）配列の特徴（Ａ）長　さ、６７個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トボロジーコ直鎖状（ｖｉｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣＩ５６３（ｘｉ）配　列：配列番号４０゜ＡＡＧＣＴＧＡＣＴＧτＧＧＴＴＴＧＡＧＡ　ＣＣＡＴＴＧＴＴＣＧ　ＡＡＡＡＧＡＡＧＴＣＴＴＴＧＧＡＡＧＡＣ！ＡＡＧＡＣＣＧＡＡＡ　ＧＡＧＡＧＣＴ　ｆ（２）配列番号４１についての情報・（ｉ）配列の特徴（Ａ）長　さ：６９個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニー重鎖（Ｄ）トポロジー、直鎖状（ｖｉ）直接の起源。

（Ｂ）クローン・ＺＣ１５６４（ｘｉ）配　列：配列番号旧：ＣＴＣＴＴＴＣＧＧＴ　ＣＴＴＧＴＣＴＴＣＣＡＡＡＧＡＣＴＴＣＴ　ＴＴＴＣＧＡＡＣＡＡ　ＴＧＧ丁ＣＴＣＡＡＡ　ＩＣＣ，ＡＣＡＧＴＣＡＧ　ＣＴＴＣＡＣＣＡＧ　１（２）配列番号４２についての情報（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ　６０個の塩基対０（Ｂ）型　・核酸０　（Ｃ）鎖の数、一本絹（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ１５６５（ｘｉ）配　列：配列番号４２：ＡＡＣＣＧＡＡＧＧＴ　ＴＣＴＴＧＧＧＴＴＧ　ＡＡＧＡＡＧＧＴＴＴ　ＧＧＴＡＴＴＣＡＧＡ　ＧＧＴＡＧＣＧＧＴＴ　５０ＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡ　６０（２）配列番号４３についての情報：（ｉ）配列の特徴・（Ａ）長　さ：１９個の塩基対；ｏ　（Ｂ）型　、核酸ｒ７　＜ｃ＞ｍの数　−木組（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源。

（Ｂ）クローン：　ＺＣＩ６２９（ｘｌ）配　列：配列番号４３：ＣＴＡＧＡＣＴＡＴＴ　ＣＡＣＣＧＡＡＴＴ　１９（２）配列番号４４についての情報：（ｉ）配列の特徴。

（Δ）長　さ＝１９個の塩基対（Ｂ）型　・核酸５０　（Ｃ）鎖の数ニー重鎖３９　（Ｄ））ボロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン＋　ＺＣ１６３０（ｘｌ）配　列：配列番号４４：ＧＡＴＣＡＡＴＴＣＧ　ＧＴＧＡＡＴＡＧＴ　＋９（２）配列番号４５についての情Ｉｉ１　：（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ二８０個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）ｌの数ニ一本絹（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ５３３９（ｘｉ）配　列：配列番号４５：ＡＧＣＴＧＣＴＴＧＧ　ＡＣＡＡＧＡＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＧＧＣＴ　ＡＣＧＧＡＴＧＴＧＴ　ＴＣＴＧＧＧＣＣＡＡ　５０ＧＴＡＣＡＣＡＧＣＴ　ＴＧＴＧＡＧＡＣＡＧ　ＣＧＡＧＧＡＣＧＣＣ８０（２）配列番号４６についての情１１：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長　さ二８０個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本絹（Ｄ）トポロジー１直鎖状（ｉ）直接の起＃ｉ：（Ｂ）クローン　ＺＣ５３４０（ｘｉ）配　列：配列番号４６：ＴＣＧＡＧＧＣＧＴＣＣＴＣＧＣＴＧＴＣＴ　ＣＡＣＡＡＧＣＴＧＴ　ＧＴＡＣＴＴＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＡＣＡＴ　５０ＣＣＧＴＡＧＣＣＧＴ　ＧＧＡＧＧＡＴＣＴＣＴＴＧＴＣＣＡＡＧＣ８０（２）配列番号４７についての情報。

（ｉ）配列の特徴。

（Ａ）長　さ：９０個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本絹（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ５３４４（ｘｉ）配　列：配列番号４７：ＡＧＣＴＴＧＧＡＣＡ　ＡＧＡＧＡＴＣＣＧＡ　ＡＧＧＣＴＣＣＡＧＴ　ＧＴＧＡＡＴＣＴＧＴ　ＣＡＣＣＴＣＣＡＴＴ　５０ＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴ　ＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＧＧＧＧＣＡＧＣＡ　ＧＴＡＣＣＡＧＧＧＧ　９０（２）配列番号４８についての情ｔｌｌ：（ｉ）配列の特＠：（Ａ）長　さ、８８個の塩基対（Ｂ）型　：核酸（Ｃ）鎖の数ニ一本絹（Ｄ）トポロジー：直鎖状（ｖｉ）直接の起源：（Ｂ）クローン：　ＺＣ５３４５（ｘｉ）配　列：配列番号４８：ＣＧＣＣＣＣＴＧＧＴ　ＡＣＴＧＣＴＧＣＣＣＣＣＧＡＴＣＡＧＧＧ　ＡＣＡＣＡＣＴＧＣＴ　ＣＣＡＡＴＧＧＡＧＧ　５０ＴＧＡＣＡＧＡＴＴＣＡＣＡＣＴＧＧＡＧＣＣＴＴＣＧＧＡＴＣＴ　ＣＴＴＧＴＣＣＡ　８８補正書の翻訳文提出書（特許法第１８４条の８）平成６年６月２８日

Claims

【特許請求の範囲】

１．トロンビン前駆体の発現を指図でき、そして次の操作的に連結された要素：転写プロモーター、ｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンをコードするＤＮＡセグメント及び転写ターミネーターを含んで成るＤＮＡ構造体。
２．前記プロモーターが、マウスメタロチオネイン−１プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、サッカロミセスセレビシアエＴＰＩＩプロモーター又はサッカロミセスセレビシアエＡＤＩＩ２−４ｃプロモーターである請求項Ｉ記載のＤＮＡ構造体。
３．前記ＤＮＡ構造体がシクナル配列をさらに含む請求項１記載のＤＮＡ構造体。
４．前記シグナル配列が、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子リーダー配列、ヒトα−２プラスミンインヒビターシグナル配列、サッカロミセスセレビシアエＢＡＰＩ分泌シグナル配列又はサッカロミセスセレビシアエＭＦａＩシグナル配列である請求項３記載のＤＮＡ構造体。
５．前記ＤＮＡセグメントがヒトｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンをコードする請求項Ｉ記載のＤＮＡ構造体。
６．前記ｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンがプロトロンビンのクリングル１、クリングル２、Ａ鎖、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメイン；プロトロンビンのＡ鎖、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメイン；又はプロトロンビンのクリングル２、Ａ領、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメインを含んで成る請求項１記載のＤＮＡ構造体。
７．前記活性化部位がヘビ毒活性化因子、トロンビン又はサッカロミセスセレビシアエＫＥＸ２遺伝子生成物により分解できる請求項６記載のＤＮＡ構造体。
８．トロンビン前駆体の発現を指図できるＤＮＡ構造体を導入されている宿主細胞であって、前記構造体が次の操作的に連結された要素：転写プロモーター、ｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンをコードするＤＮＡ配列及び転写ターミネーターを含んで成ることを特徴とする宿主細胞。
９．前記ＤＮＡ構造体がシグナル配列をさらに含んで成る請求項８記載の宿主細胞。
１０．前記ＤＮＡセグメントがヒトｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンをコードする請求項８記載の宿主細胞。
１１．前記ｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンがプロトロンビンのクリングル１、クリングル２、Ａ鎖、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメイン；プロトロンビンのクリングル２、Ａ鎮、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメイン；又はプロトロンビンのＡ鎖、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメインを含んで成る請求項８記載の縮主細胞。
１２．前記ｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンが、ヘビ毒活性化因子、トロンビン又はサッカロミセスセレビシアエＫＥＸ２遺伝子生成物により分解できる活性化部位を含む請求項８記載の宿主細胞。
１３．前記宿主細胞が哺乳類又は菌類細胞である請求項８記載の宿主細胞。
１４．前記宿主細胞が酵母細胞である請求項８記載の宿主細胞。
１５．前記酵母細胞がＨＨＮ９遺伝子、甘ＭＭＮＩ遺伝子、ＰＭＲＩ遺伝子又はＰＥＰ４遺伝子における変異を有する請求項１４記載の宿主細胞。
１６．トロンビンの生成方法であって、トロンビン前駆体の発現を指図できるＤＮＡ構造体を導入されている宿主細胞（ここで前記ＤＮＡ構造体は操作的に連結されている転写プロモーター、ｇＩａ−ドメイン不含プロトロンビンをコードするＤＮＡセグメント及び転写ターミネーターを含んで成る）を、ＤＮＡセグメントによりコードされるトロンビン前駆体の発現を可能にする適切な条件下で増殖し；そして前記宿主細胞からトロンビン前駆体を単離することを含んで成る方法。
１７．前記トロンビン前駆体をトロンビンに活性化する段階をさらに含んで成る請求項１６記載の方法。
１８．前記ＤＮＡ構造体がシグナル配列をさらに含んで成る請求項１６記載の方法。
１９．前記ＤＮＡ配列がヒトｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンをコードする請求項１６記載の方法。
２０．トロンビンの生成方法であって、トロンビン前駆体の発現を指図でき、そして操作的に連結されている転写プロモーター、ｇＩａ−ドメイン不含プロトロンビンをコードするＤＮＡセグメント及び転写ターミネーターを含んで成るＤＮＡ構造体を導入されている宿主細胞を、ＤＮＡセグメントによりコードされるトロンビン前駆体の発現及び宿主細胞におけるトロンビンヘのその活性化を可能にする適切な条件下で増殖し；そして前記宿主細胞からトロンビン前駆体を単離することを含んで成る方法。
２１．前記ＤＮＡ構造体がシグナル配列をさらに含んで成る請求項２２記載の方法。
２２．前記ＤＮＡ配列がヒトｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンをコードする請求項２１記載の方法。
２３．前記ｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンがプロトロンビンのクリングルＩクリングル２、Ａ鎖、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメイン；プロトロンビンのクリングル２、Ａ鎖、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメイン；又はプロトロンビンのＡ鎖、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメインを含んで成る請求項２１記載の方法。
２４．前記活性化部位がヘビ毒活性化因子、トロンビン又はサッカロミセスセレビシアエＫＥＸ２遺伝子生成物により分解できる請求項２３記載の方法。
２５．前記宿主細胞が哺乳類又は菌類細胞である請求項１６記載の方法。
２６．前記宿主細胞が酵母細胞である請求項２５記載の方法。
２７．前記酵母細胞がＭＮＮ９遺伝子、ＭＮＮＩ遺伝子、ＰＭＲＩ遺伝子又はＰＥＰ４遺伝子における変異を有する請求項２６記載の方法。
２８．トロンビンの生成方法であって、トロンビン前駆体の発現を指図でき、そして操作的に連結されている転写プロモーター、ｇＩａ−ドメイン不含プロトロンビンをコードする第２ＤＮＡセグメントに連結されるシグナル配列をコードする第ＩＤＮＡセグメント及び転写ターミネーターを含んで成るＤＮＡ構造体を導入されている宿主細胞を、前記第２ＤＮＡセクメントによりコードされるトロンビン前駆体の発現を可能にする適切な培地及び条件下で増殖し；前記トロンビン前駆体をトロンビンに活性化し；そして前記培地からトロンビン単離することを含んで成る方法。
２９．前記ＤＮＡ配列がヒトｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンをコードする請求項２８記載の方法。
３０．前記ｇｌａ−ドメイン不含プロトロンビンがプロトロンビンのクリングル１、クリングル２、Ａ鎖、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメイン；プロトロンビンのＡ鎖、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメイン；又はプロトロンビンのクリングル２、Ａ鎖、活性化部位及びセリンプロテアーゼドメインを含んで成る請求項２９記載の方法。
３１．前記活性化可能がトロンビンにより分解できる請求項３０記載の方法。
３２．組換えヒトトロンビン及び生理学的に許容できるキャリヤーを含んで成る医薬組成物。
３３．出血性疾患又は創傷のために患者を処理するための方法であって、治療的有効量の請求項３２記載の医薬組成物を患者に投与することを含んで成る方法。