NO311982B1

NO311982B1 - DNA-sekvens som koder for et peptid inneholdende repeterende oligopeptidenhet, polypeptid som omfatter ekspresjonsprodukt avrekombinant DNA av en DNA-sekvens som koder et peptid medrepeterende oligopeptidenheter, prokaryot vert som omfatter DN

Info

Publication number: NO311982B1
Application number: NO19882946A
Authority: NO
Inventors: Franco A Ferrari; Charles Richardson; James Chambers; Stuart C Causey; Thomas J Pollock; Joseph Cappello; John W Crissman
Original assignee: Protein Polymer Tech Inc
Priority date: 1986-11-04
Filing date: 1988-07-01
Publication date: 2002-02-25
Also published as: FI883082A0; FI101720B1; WO1988003533A1; DE3752363D1; NO882946D0; EP0293443B1; NO882946L; JPH01501755A; AU1052888A; FI101720B; JPH1014586A; NZ222450A; ATE233273T1; AU612340B2; JP3250968B2; DK369788D0; EP0293443A1; EP0293443A4; JP2000135092A; DK369788A

Description

Området gjelder fremstilling av polymerer med høy molekylvekt, enten nukleinsyrer eller peptider som er ekspresjonsprodukter av nukleinsyrene, og gjelder spesielt fremstilling av peptider med høy molekylvekt som inneholder repeterende sekvenser ved biokjemiske prosesser, idet peptidet finner anvendelse som strukturerte materialer.

Rekombinant-DNA-teknologi er blitt anvendt ved isolering av naturlige gener og ekspresjon av disse gener i forskjellige vertsceller. Denne teknologi har typisk hatt anvendelse ved fremstilling av biologisk aktive polypeptider, så som interferoner eller peptidhormoner, som var upraktisk å fremstille i egnede mengder på andre måter. Det var også mulig å fremstille modifiserte proteiner ved isolering av naturlige gener og utnyttelse av teknikkene med setespesifikk in vitro-mutagenese for å forandre disse gener og derved forandre de fremstilte polypeptider. Andre polypeptider har vært dannet ved kombinering av seksjoner av forskjellige naturlige gener for fremstilling av nye polypeptider som er kimære molekyler av de forskjellige naturlig forekommende molekyler.

Ved fremkomsten av effektive og automatiserte fremgangsmåter for kjemisk syntese av DNA er det blitt mulig å syntetisere hele gener og å modifisere slike syntetiske gener etter ønske under synteseforløpet. Disse forskjellige teknologier har imidlertid vært anvendt ved fremstilling av naturlige eller modifiserte versjoner av naturlige polypeptider. Det har vært meget få forsøk på å anvende disse teknologier for dannelse av hovedsakelig nye polypeptider. I naturen har polypeptider et vidt område av kjemiske, fysiske og fysiologiske karakter-egenskaper. Ikke desto mindre er det kommersielle anvendelser for hvilke kjente, naturlig forekommende polypeptider ikke er formålstjenlige.

Skjønt bioteknologien er mangesidig, har den vanligvis vært begrenset i sine anvendelser til naturlig forekommende produkter eller modifiseringer av naturlig forekommende molekyler. Én stor styrke ved organisk kjemisk syntese har i motsetning til dette vært evnen til omdannelse av billige karbonmaterialer til mange forskjellige polymere molekyler, innbefattende naturlig forekommende molekyler, men mest betydningsfullt fullstendig nye kjemiske strukturer så som polypropylen og polyakrylater, som har definerte og forutsette kjemiske egenskaper som ikke er forbundet med naturlig forekommende molekyler.

Slike materialer, spesielt polymerer med høy molekylvekt som inneholder repeterende sekvenser av aminosyrer, har vist seg vanskelig å fremstille på biokjemiske måter. De gener som var nødvendige for fremstilling av store peptider inneholdende repeterende enheter av aminosyrer, var ustabile og undergikk ofte intermolekylær rekombinering som forårsaket utslettelse av repeterende enheter i genet. Utvikling av en bioteknologi som ville gi polymere molekyler ved biologiske prosesser lik dem som er tilgjengelige ved organisk syntese, ville i betydelig grad utvide anvendelsesområdet for bioteknologien.

Kort beskrivelse av aktuell litteratur

Kloning av multiple laktoseoperatorer opp til fire etter hverandre er beskrevet av Sadler et al., Gene, (1980) 8:279-300. Bakterielle hybridplasmider som inneholder satellitt-DNA repetert i stor grad, er beskrevet av Brutlag et al., Cell, (1977) 10:509-519. Syntesen av et poly(aspartyl-fenylalanin) i bakterier er beskrevet av Doel et al., Nucleic Acids Research, (1980) 8:4575-4592. En fremgangsmåte for anrikning når det gjelder prolininnhold ved kloning av et plasmid som koder for dannelsen av en prolin-polymer, ble beskrevet av Kangas et al., Applied and Environmental Microbiology, (1982) 43:629-635. De biologiske begrensninger når det gjelder lengden av DNA-sekvenser som i stor grad er repeterbare og som kan holdes fast inne i plasmidreplika, er omtalt av Gupta et al.

i Bio/Techno-logy, s. 602-609, september 1983.

Fremgangsmåter og blandinger er tilveiebrakt for fremstilling av polypeptider med repetitive oligomere enheter ved ekspresjon av et syntetisk strukturelt gen. De individuelle enheter som koder for en oligomer peptidsekvens, varieres når det gjelder nukleotidsekvens hvor det anvendes aminosyrekodon-overskudd. Lange nukleinsyresekvenser bygges opp ved syntetisering av nukleinsyreoligomerer som uttrykker en rekke individuelle repetitive peptidenheter, og oligomerene sammenføyes under tilveiebringelse av et polynukleotid med den ønskede lengde. Ekspresjonssystemer anvendes som tilveiebringer veksten av den aktuelle vert til høy densitet før betydelig ekspresjon av polypeptidproduktet, fulgt av indusering av eks-presjon under tilveiebringelse av høye utbytter av polypeptidproduktet, som kan isoleres fra vertscellene. Ved én utførelsesform, anvendes det et system hvor transkripsjonsinitierings-systemet hos det syntetiske gen ikke gjenkjennes av verts-RNA-polymerasen, og et gen som uttrykker en funksjonell RNA-polymerase under induserbar regulering, er innbefattet i verten. Figurene viser som følger;

Fig. 1: Plasmid-pSY701-struktur.

Fig. 2: lmmuno-"blots" av polypeptid-produkter ved anvendelse av antistoff mot (A) beta-laktamase eller mot (B) gly-ala-peptid.

Fig. 3: Konstruksjons-prosesskjema for plasmid pG10/Slpl.

Fig. 4: lmmuno-"blots" av polypeptid-produkter (A)

T7gp10/Slpl med anti-Slp-antistoff, (B) T7gp9/Slpl med anti-Slp-antistoff eller (C) farging med Coomassie-blått.

Fig. 5: Konstruksjons-prosesskjema for plasmid pSY856.

Fig. 6: Tidsforløp for opphopning av kanamycin-resistensgenproduktet med T7-systemet.

Fig. 7: Konstruksjons-prosesskjema for plasmid pSY857.

Fig. 8: Konstruksjons-prosesskjema for plasmid pSY980.

Fig. 9: (A) Amidosvart-farging av gel som inneholder

produktet av beta-galaktosidase/Slplll-genfusjon; (B) immuno-"blot" av det samme produkt med anti-Slp-antistoff.

Fig. 10: Konstruksjons-prosesskjema for plasmid pSY1280.

Det er tilveiebrakt nye polypeptider som er polyoligomerer av repeterende, forholdsvis korte, aminosyresekvensenheter. Oligomerene kan bindes sammen ved hjelp av mellomstykker med annerledes aminosyresekvens. De nye polypeptider inneholder derfor repetitive aminosyresekvenser og er spesielt egnet som fibrøse proteiner, innbefattende elastomere. Det gen som koder for de repeterende-enhet-holdige peptider, dannes spesielt for å unngå problemer som tidligere var forbundet med gener inne-holdende multiple repeterende enheter.

DNA-sekvensene ifølge den foreliggende oppfinnelse omfatter en DNA-sekvens som koder for et peptid inneholdende en repeterende oligopeptidenhet hvor den repeterende enheten kjennetegnes ved at den inneholder minst tre ulike aminosyrer og totalt fra 4 til 30 aminosyrer, at peptidet inneholder minst to repeterende enheter og minst to identiske aminosyrer i hver repeterende enhet og i hvilken enhetene eventuelt er forbundet med en aminosyrebro med fra ca. 1 til 15 aminosyrer, hvor DNA-sekvensen har følgende formel:

i hvilken:

K og L begge utgjøres av DNA-sekvenser som koder en aminosyresekvens inneholdende 1 til 100 aminosyrer, hvor K og L utgjør mindre enn ca. 20% av aminosyrenes totale antall;

k og I utgjøres av 0 eller 1;

W utgjøres av følgende formel:

A utgjøres av en DNA-sekvens som koder den repeterende oligopeptidenheten i hvilken A inneholder ca. 12-90 nukleotider hvor minst to kodoner koder den identiske aminosyren i de repeterende enhetene som er forskjellige hvorved det finnes minst to ulike A'er som skiller seg fra hverandre med hensyn til minst ett nukleotid;

B utgjøres av en DNA-sekvens som er forskjellig fra A og som koder en annen oligopeptidenhet enn den som kodes av A og som inneholder ca. 3-45 nukleotider hvor B's enheter kan være like eller forskjellige;

n utgjøres av et helt tall i intervallet 1-100;

hver p er selvstendig 0 eller 1; og

q utgøres av minst 1 og velges slik at en DNA-sekvens med minst 90 nukleotider oppstår;

M og N er like eller forskjellige og utgjøres av kodonenes DNA-sekvens og utgjøres av 0-18 nukleotider i leseramme med respektive W og X;

X er lik eller forskjellig fra W og er av følgende formel:

Y er lik eller forskjellig fra W og er av følgende formel:

i hvilken:

alle symboler utledes av definisjonen for deres bokstavpar;

x og y utgjøres av 0 eller 1;

i utgjøres av 1-100; og

totalsummen for q, q<1> og q2 utgjøres av minst 1 og ikke mer enn ca. 50;

og at massen av polypeptidet som kodes av sekvensen er minst ca. 10 kDal.

I en foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse kjennetegnes DNA-sekvensen som koder for et peptid inneholdende repeterende oligopeptidenhet av at den repeterende enheten omfatter aminosyresekvensen GAGAGS eller GVGVP hvor DNA-sekvensen utgjøres av følgende formel:

i hvilken:

A utgjøres av en DNA-sekvens som koder den repeterende oligonukleotidenheten hvor kodonene for minst to G'er i samme eller ulike A'er er forskjellige, hvorved det eksisterer minst to ulike A'er som skiller seg fra hverandre med hensyn til minst ett nukleotid;

B utgjøres av en DNA-sekvens som skiller seg fra A og som koder en annen oligopeptidenhet enn den som kodes av A-enheten og som innbefatter ca. 3-45 nukleotider hvorved B-enhetene kan være like eller forskjellige;

n utgjøres av et helt tall i intervallet 5-25;

hver p utgjøres selvstendig av 0 eller 1; og

q er minst 1 og velges slik at en DNA-sekvens innbefattende minst 90 nukleotider oppstår;

og massen av polypeptid som kodes av sekvensen er minst ca. 10 kDal.

Mer foretrukket kjennetegnes DNA-sekvensen ved at den koder for et peptid hvor oligopeptidenheten utgjøres av GAGAGS og B omfatter et kodon for tyrosin.

I andre foretrukne utførelser koder DNA-sekvensen for et peptid hvor A utgjøres av formelen GGTGCGGGCGCAGGAAGT, eventuelt hvor A inneholder følgende sekvens:

Ytterligere foretrukne utførelser av DNA-sekvensen i henhold til foreliggende oppfinnelse kjennetegnes ved at oligopeptidet utgjøres av GVGVP, eller hvor A har følgende formel GGTGTAGGCGTTCCG.

Foreliggende oppfinnelse omhandler også et poiypeptid som omfatter ekspresjonsproduktet av rekombinasjons-DNA'et av en DNA-sekvens som koder et peptid med repeterende oligopeptidenheter hvor oligopeptidet karakteriseres ved at det omfatter minst tre ulike aminosyrer og totalt 4-30 aminosyrer hvor peptidet innbefatter minst to repeterende enheter og minst to identiske aminosyrer i hver repeterende enhet, hvorved enhetene eventuelt er forenet med en aminosyrebro med ca. 1-15 aminosyrer hvor DNA-sekvensen utgjøres av følgende formel:

i hvilken:

K og L begge utgjøres av DNA-sekvenser som koder en aminosyresekvens med ca. 1 til 100 aminosyrer, hvorved K og L utgjør mindre enn ca. 20% av aminosyrenes totale antall;

k og I utgjøres av 0 eller 1;

W utgjøres av følgende formel:

A utgjøres av en DNA-sekvens som koder den repeterende oligopeptidenheten i hvilken A innbefatter ca. 12-90 nukleotider, hvorved minst to kodoner koder de identiske aminosyrene i de repeterende enhetene som er forskjellige, hvorved minst to forskjellige A'er eksisterer som skiller seg fra hverandre med hensyn til minst ett nukleotid;

B utgjøres av en DNA-sekvens som skiller seg fra A og som koder en annen oligopeptidenhet enn den oligopeptidenheten som kodes av A-enheten og som innbefatter ca. 3-45 nukleotider, hvorved B-enhetene kan være like eller forskjellige;

n utgjøres av et helt tall i intervallet 1-100;

hver p er selvstendig 0 eller 1; og

q er minst 1 og velges slik at en DNA-sekvens med minst 90 nukleotider oppstår;

og massen av polypeptidet er minst ca. 10 kDal.

I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen omfatter polypeptidet som repeterende enhet minst den ene av GAGAGS og GVGVP.

I et annet aspekt angår oppfinnelsen et peptid som omfatter et ekspresjonsprodukt av rekombinasjons-DNA'et fra en DNA-sekvens som koder et peptid som inneholder et oligopeptid som repeterende enhet, kjennetegnet ved at den omfatter minst tre ulike aminosyrer og totalt 4-30 aminosyrer hvorved peptidet omfatter minst to repeterende enheter og minst to identiske aminosyrer i hver repeterende enhet, hvorved enhetene eventuelt er forenet med en aminosyrebro, hvorved inngår ca. 1-15 aminosyrer, hvorved DNA-sekvensen har følgende formel:

i hvilken:

K og L er begge DNA-sekvenser som koder en aminosyresekvens med ca. 1 til 100 aminosyrer, hvorved K og L utgjør mindre enn ca. 20% av aminosyrenes totale antall;

k og I utgjøres av 0 eller 1;

A utgjøres av en DNA-sekvens som koder den repeterende oligopeptidenheten i hvilken A innbefatter ca. 12-90 nukleotider, hvorved minst to kodoner koder identiske aminosyrer i den repeterende enheten som er forskjellig, hvorved det eksisterer minst to ulike A'er som skiller seg fra hverandre med hensyn til minst ett nukleotid;

B utgjøres av en DNA-sekvens som skiller seg fra A og som koder en annen enn den oligopeptidenheten som kodes av A-enheten og som innbefatter ca. 3-45 nukleotider, hvorved B-enhetene kan være like eller forskjellige;

n utgjøres av et helt tall i intervallet 1-100;

hver p er selvstendig 0 eller 1; og

og massen av polypeptidet er minst ca. 10 kDal.

I en foretrukken utførelsesform av dette aspektet, koder A for GAGAGS eller GVGVP.

Foreliggende oppfinnelse omfatter også en prokaryot vert som inneholder DNA-sekvensen som er definert i patentkravene.

Foreliggende oppfinnelse angår videre en fremgangsmåte for fremstilling av et peptid som omfatter rekombinant-DNA-ekspresjonsprodukt av en DNA-sekvens som koder et peptid med repeterende oligonukleotidenheter, hvilket oligopeptid karakteriseres ved at det omfatter minst tre ulike aminosyrer og totalt 4-30 aminosyrer og at nevnte peptid omfatter minst to repeterende enheter og minst to identiske aminosyrer i hver repeterende enhet og i hvilken enhetene eventuelt er forenet med en aminosyrebro med ca. 1-15 aminosyrer, hvorved nevnte DNA-sekvens har følgende formel:

i hvilken:

K og L begge utgjøres av DNA-sekvenser som koder en aminosyresekvens omfattende 1 til 100 aminosyrer, hvorved K og L innbefatter mindre enn ca. 20% av det totale antallet aminosyrenes;

k og I er 0 eller 1;

W utgjøres av følgende formel:

A utgjøres av en DNA-sekvens som koder de repeterende oligopeptid-enhetene i hvilke A omfatter ca. 12-90 nukleotider, hvorved minst to kodoner koder de identiske aminosyrene i den repeterende enheten som er forskjellig, hvorved det eksisterer minst to ulike A'er som skiller seg fra hverandre med hensyn til minst ett nukleotid;

B utgjøres av en DNA-sekvens som skiller seg fra A og som koder en annen enn den oligopeptidenhet som kodes av A-enheten og som omfatter ca. 3-45 nukleotider hvorved B-enhetene kan være like eller forskjellige;

n utgjøres av et helt tall i intervallet 1-100;

hver p er selvstendig 0 eller 1; og

M og N er like eller forskjellige og utgjøres av en DNA-sekvens av kodoner og utgjøres av 0-18 nukleotider i leseramme med respektive W og X hvorved de koder en aminosyresekvens;

X er lik eller forskjellig fra W og har følgende formel:

Y er lik eller forskjellig fra W og har følgende formel:

i hvilken:

alle symboler følger definisjonene for bokstavparene;

x og y er 0 eller 1;

i utgjøres av 1-100; og

totalsummen av q, q<1> og q<2> er minst 1 og ikke større enn ca. 50;

og massen av polypeptidet som kodes av sekvensen er minst ca. 10 kDal; hvorved fremgangsmåten omfatter;

dyrking av en prokaryot vert i henhold til patentkrav 12, i hvilket DNA-sekvensen befinner seg under transkripsjonen og translasjonen regulering av initierings- og termineringsreguleringsregionene funksjonelle i verten; og isolering av ekspresjonsproduktet.

Foretrukket kjennetegnes fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen av at peptidet omfatter minst en av de repeterende enhetene GAGAGS og GVGVP.

De nukleotidsekvenser som anvendes, vil bli syntetisert slik at de repetitive enheter vil ha forskjellige kodoner for den samme aminosyre som beskrevet ovenfor. Vanligvis vil minst ca. 25%, mer vanlig minst ca. 40% og generelt minst ca. 60%, men ikke mer enn ca. 95%, fortrinnsvis ikke mer enn ca. 90% av nukleotidsekvensene som koder for de repeterende enheter, være de samme. Større uensartethet innenfor disse områder vil anvendes hvor begynnelses-konstruksjonene eksperimentelt er vist å undergå spontane rekombinasjons-fenomener.

Av spesiell interesse er polypeptider som, som repeterende enhet har SGAGAG (G = glycin, A = alanin; S = serin). Denne repeterende enhet finnes i et naturlig forekommende silkefibroin-protein, som kan representeres som GAGAG(SGAGAG)8SGAAGY (Y= tyrosin). Ved den foreliggende oppfinnelse utformes den repeterende enhet hvor den N-terminale ende kan være MGAGAG eller hvilken som helst annen sekvens med generelt minst ca. 3 aminosyrer, vanligvis minst ca. 5 aminosyrer, mer vanlig 12 aminosyrer og ikke mer enn 200, vanligvis ikke mer enn 100 aminosyrer, som kan være forskjellige fra den repetitive enhet. Generelt vil en annen N-terminal ende være resultatet av innføring av genet i en vektor på en måte som resulterer i ekspresjon av et fusjonsprotein. Hvilket som helst protein som ikke forstyrrer de ønskede egenskaper hos produktet, kan tilveiebringe den N-terminale ende. Spesielt kan endogene vertsproteiner, f.eks. bakterielle proteiner, anvendes. Valget av protein kan avhenge av beskaffenheten av det transkripsjonene begynnelsesområde. På liknende måte kan den C-terminale ende ha en aminosyresekvens som er forskjellig fra den repeterende sekvens. Det kan passende være 1-100, vanligvis 1-25 aminosyrer, som kan være den C-terminale ende hos et naturlig forekommende strukturelt gen, som igjen typisk er et resultat av dannelsen av et fusjonsprodukt.

Et silkeliknende-protein-(Slp)-gen kan dannes ved at det tilveiebringes oligomerer med fra ca. 5 til 25 repeterende enheter som beskrevet ovenfor, mer vanlig med ca. 10-20 repeterende enheter. Ved at oligomerene har forskjellige kohesive ender, kan de konkatameriseres under tilveiebringelse av polymeren med 2 eller flere av de oligomere enheter, vanligvis ikke mer enn ca. 50 oligomere enheter, mer vanlig ikke mer enn ca. 30 oligomere enheter og ofte ikke mer enn ca. 25 oligomere enheter.

De silkeliknende proteiner kan varieres ved at de har vekslende multimerer med den samme eller forskjellig "handed-ness". For eksempel kan (B)p i formelen tilveiebringe et like eller ulike antall aminosyrer. I silke kan hydrogenatomene i glycin være rettet inn på én side og metyl- og hydroksylgruppene i alanin og serin på den annen. Hvis (B)p er et liketall, vil det være kontinuerlig innretning, hvis det er et uliketall, vil det være vekslende innretning av (A)n. Således kan forskjellige egenskaper oppnås ved at antallet aminosyrer som kodes for ved (B)p, forandres.

Av spesiell interesse er polypeptider som etterlikner sammensetningen og de fysiske egenskaper hos silke av Bombyx mori.

Polypeptider som, som basis-repetisjons-enhet har GVGVP (G = glycin, V = valin, P = prolin), og som kan finnes i naturlig forekommende elastin, er også av interesse. Ved den foreliggende oppfinnelse kan den N-terminale ende være hvilken som helst passende sekvens og kan hvis ønskelig helt eller delvis fjernes ved en protease. Vanligvis vil den N-terminale sekvens som ikke har det aktuelle motiv, være mindre enn ca. 100 aminosyrer, mer vanlig mindre enn ca. 60 aminosyrer.

Av spesiell interesse er en basissekvens med ca. 6-10, fortrinnsvis 8, enheter atskilt ved en sekvens på ca. 6-20 aminosyrer, vanligvis 8-16 aminosyrer, som kan innbefatte en indre repetisjon forskjellig fra basis-repetisjons-enheten på 4-8 aminosyrer. For eksempel kan den annen repetisjonssekvens være GAGAGS, gjentatt to ganger. Det totale antall basis-repetisjonsenheter vil vanligvis være i området ca. 150-300, vanligvis 175-250. Den C-terminale ende kan slutte med en repetitiv enhet eller en del derav eller en annen sekvens på 1-100, vanligvis 1-30 aminosyrer. Den C-terminale ende er ikke avgjørende for oppfinnelsen og vil bli valgt hovedsakelig av bekvemmelighetshensyn. Som for den N-terminale ende kan den konstrueres for proteolytisk spaltning. Som for silkeproteinet, kan det aktuelle elastin-liknende protein være oppbygd på samme måte. Av spesiell interesse er proteiner som etterlikner elastins egenskaper og tilveiebringer elastomere egenskaper.

Kopolymeren som innbefatter repeterende enheter, er en kraftig virkende fremgangsmåte for å variere egenskaper, ved passende valg av forskjellige enheter, antallet enheter i hver multimer, mellomrommet mellom dem og antallet repeterende enheter i den multimere kombinasjons-sammensetning. Ved således å variere antallet og anordningen av primære monomerer kan det oppnås et stort antall forskjellige fysiske og kjemiske egenskaper.

Eksempler på anvendelse av blokk-kopolymerene er kombinasjoner av silke-enheter og elastin-enheter under tilveiebringelse av produkter med egenskaper som er forskjellige fra polymerer som bare har den samme monomere enhet.

For fremstilling av de strukturelle gener kan det anvendes forskjellige fremgangsmåter. For fremstilling av oligomerene kan det syntetiseres komplementære kjeder av DNA, slik at dobbeltkjedet DNA oppnås ved hybridisering med de passende terminale ender. Hvis ønskelig kan hver av de oligomere enheter være de samme slik at det i et enkelt trinn kan oppnås en konkatamer avhengig av hybridiserings-betingelsene. Normalt vil det anvendes konvensjonelle koplings- og ligeringsbetingelser, såsom beskrevet i de eksempler som følger.

Hvis ønskelig kan to forskjellige oligomere enheter fremstilles hvor de terminale ender hos de to enheter er komplementære, én med den annen, men de terminale ender hos den samme enhet kan ikke bindes sammen. På denne måte kan man bygge individuelle oligomere enheter og deretter knytte dem sammen under dannelse av konkatameren, hvor de mellomliggende sammenbindende sekvenser er definert i det minste delvis ved de ter-minale ender. Avhengig av konstruksjonen kan den 5'-terminale ende tilveiebringe begynnelseskodonet metionin, eller det strukturelle gen kan knyttes til en adapter som kan tilveiebringe en unik sekvens (som eventuelt kan spaltes ved hjelp av et spe-sifikt enzym) ved den 5'-terminale ende eller innføres i en gendel, vanligvis endogen for verten, i en passende avlesnings-ramme for tilveiebringelse av et fusjonsprodukt. Ved at det tilveiebringes passende komplementære terminale ender mellom adapteren eller det avkortede gen og 5'-enden hos det aktuelle strukturelle gen, kan sekvensene sammenknyttes i en passende avlesningsramme under tilveiebringelse av det ønskede protein. Fordeler som kan oppnås ved anvendelse av adaptere eller fus-jonsproteiner, innbefatter at man får spesifikke sekvenser for spesielle formål, såsom sammenknytting, utskillelse, kompleks-dannelse med andre proteiner, affinitetsrensning eller liknende.

Straks det strukturelle gen er blitt sammensatt, kan det klones; kloner med det ønskede gen, spesielt når det gjelder sekvenslengde, kan isoleres; og genet kan fjernes og anvendes for sammenknytting med en sekvens for ekspresjon.

Ekspresjons-konstruksjonen vil innbefatte transkripsjonene og translasjonene regulerende begynnelses- og avslutningsområder, henholdsvis 5' og 3', hos det strukturelle gen. Som allerede angitt, kan disse områder dannes ved at det anvendes et fusjonsprotein hvor det aktuelle strukturelle gen innføres i et annerledes strukturelt gen nedstrøms for dets begynnelseskodon og i avlesningsramme med begynnelses-kodonet. Alternativt er forskjellige transkripsjonene og translasjonene begynnelses-områder tilgjengelige fra mange forskjellige gener for anvendelse i ekspresjonsverter, slik at disse transkripsjonene og translasjonene begynnelsesområder kan knyttes sammen med det aktuelle strukturelle gen under tilveiebringelse av transkripsjons- og translasjons-begynnelse for de aktuelle strukturelle gener. Det er tilgjengelig mange forskjellige avslutningsområder som kan være fra det samme gen som det transkripsjonene begynnelsesområde eller fra et annet gen. Tallrike konstruksjoner er blitt beskrevet i litteraturen, og de samme fremgangsmåter kan anvendes når det gjelder det aktuelle gen som dem som er blitt anvendt når det gjelder andre strukturelle gener.

Av spesiell interesse er anvendelsen av et induserbart transkripsjons-begynnelsesområde. På denne måte kan verts-stammen dyrkes til høy densitet før betydelig ekspresjon av det ønskede produkt. Tilveiebringelse av induserbar transkripsjon er spesielt egnet hvor peptidet holdes i celleverten i stedet for at det utskilles av verten.

En rekke induserbare transkripsjonsbegynnelsesområder finnes eller kan anvendes i spesielle situasjoner. De induserbare områder kan reguleres ved et spesielt kjemikalie, så som isopropyl-tiogalaktosid (IPTG) for indusering av beta-galaktosidase-genet. Andre induserbare områder innbefatter venstre- og høyre-lambda-aktivatorer; forskjellige aminosyre-polycistroner, f.eks. histidin og tryptofan; temperaturfølsomme aktivatorer; og regulerende gener, f.eks. clte 857.

Et alternativt system som kan anvendes med fordel, er anvendelse av en kombinasjon av transkripsjons-begynnelsesområder. Et første transkripsjons-begynnelsesområde som regulerer ekspresjonen av det ønskede gen men som ikke er funksjonelt i ekspresjonsverten ved at det ikke er funksjonelt med den endogene RNA-polymerase, anvendes. Et andre transkripsjonsbegynnelses-område, såsom et induserbart område, kan deretter anvendes for regulering av ekspresjonen av en RNA-polymerase med hvilken det første transkripsjons-begynnelsesområde er funksjonelt. På denne måte skjer ekspresjon bare ved aktivering av det regulerende område som regulerer ekspresjonen av den eksogene RNA-polymerase. Ved den foreliggende patentsøknad er dette system illustrert med T7-fag-transkripsjonsbegynnelsesom-rådet, spesifikt begynnelses-områdene for gener 9 og 10 hos T7-fag.

Et alternativt system er avhengig av anvendelse av mutanter som undergår en utviklingsforandring basert på en forandring i miljøet, såsom mangel på et næringsstoff, temperatur, osmotisk trykk, saltholdighet eller liknende. Illustrerende for dette system kan stammer av B. subtilis oppnås som ikke kan danne spo->rer men som kan danne slike komponenter som starter ekspresjon av produkter forbundet med sporedannelse. Ved en forandring i mediumsbetingelse-ne vil derfor et transkripsjonsbegynnelses-område forbundet med sporedannelse bli aktivert. I denne situasjon tilveiebringer verten det nødvendige induserende middel eller aktivator til å starte ekspresjonen.

Det finnes forskjellige andre teknikker for tilveiebringelse av induserbar regulering av transkripsjon og translasjon av et gen i en spesiell vert.

Hovedsakelig vil verten være en unicellulær organisme, enten en prokaryot eller en eukaryot, valgt blant bakterier, alger, sopp, trådsopp o.s.v. Illustrative verter innbefatter E. coli, B. subtilis, B. stearothermophilus, S. cerevisiae og liknende.

Ekspresjonskonstruksjonen for ekspresjon av det ønskede gen, i seg selv eller i forbindelse med eventuelle hjelpegener innbefattet i transkripsjonen, vil vanligvis være knyttet til en passende vektor for innføring i ekspresjonsverten. Et stort antall vektorer er kommersielt tilgjengelige, mens andre som er beskrevet i litteraturen. Vektorene er normalt karakterisert ved at de har ett eller flere unike restriksjonsseter, et replikasjonssystem for ekstrakromosomal bevaring i verten, og én eller flere markører som muliggjør selektivt trykk på verten. Markørene kan tilveiebringe komplementering, prototrofi til en auxotrofisk vert, resistens overfor et biocid, f.eks. et antibiotikum såsom penicillin eller kanamycin, eller liknende.

I noen tilfeller anvendes i stedet for selektivt trykk et markørgen som muliggjør påvisning av spesielle kolonier som inneholder genet. Denne situasjon er illustrert ved genet for beta-galaktosidase, hvor det anvendes et substrat som tilveiebringer et farget produkt.

Ekspresjons-konstruksjonen, innbefattende eventuelle hjelpegener, kan innføres i ekspresjonsvektoren i henhold til kjente teknikker, med spesiell anvendelse av restriksjon, innskyting og ligering.

Ekspresjons-konstruksjonen kan så anvendes for transformasjon av den passende vert. Avhengig av verten kan det anvendes enten intakte celler eller protoplast, hvor det anvendes transformasjon eller konjugasjon. Passende kan kalsiumfosfat-utfelt DNA eller ikke-ioniske detergenter anvendes for innføring av plasmidet i verten. Det bør være klart at det er ikke nødvendig å anvende vektorer for vertstransformasjon, siden rent DNA kan innføres for integrering i genomet. Selv der hvor integrering er ønskelig, oppnås imidlertid en mye større integreringseffektivitet ved anvendelse av vektorene, idet således anvendelsen av vektorer foretrekkes.

Avhengig av vektorens beskaffenhet kan ekspresjonskonstruksjonen holdes på et ekstrakromosomalt element eller bli integrert i verten. Når integrering ønskes, vil det vanligvis være ønskelig med prokaryote celler og en del eukaryote celler for å få en sekvens som er homolog til en sekvens i vertens kromosom. Vanligvis vil sekvensen være minst ca. 200 bp og ikke mer enn ca. 5000 bp, vanligvis ikke mer enn ca. 2000 bp. Valget av den homologe sekvens er noe vilkårlig, men kan anvendes for komplementering, hvor verten er en auxotrofisk mutant og homologien tilveiebringer prototrofi.

Transformantene eller integrantene kan så dyrkes i et passende næringsmedium til høy densitet, fulgt av induksjon av transkripsjon i henhold til beskaffenheten av det transkripsjonene system hos ekspresjonskonstruksjonen. Hvor det ønskede protein bibeholdes i cytoplasmaet, høstes disse celler og lyseres, og avhengig av anvendelsen av proteinet, kan proteinet renses ytterligere i henhold til konvensjonelle teknikker, såsom kromatografi, løsningsmiddel-løsningsmiddelekstraksjon, affinitetskromatografi og liknende.

De repetitive proteiner kan finne mange forskjellige anvendelser. Slp-proteinene kan anvendes ved dannelse av fibrer med unike egenskaper, som erstatning for silke og liknende. Kollagenproteiner kan dannes hvor kollagenet er fritt for telopeptidet eller inneholder telopeptidet, avhengig av sin funksjon. Atelopeptidkollagen bør ha liten, hvis noen, immunogenitet, for å være et egnet strukturelt element for mange forskjellige profetiske anordninger eller for anvendelse som kollagenerstatning ved andre anvendelser. På liknende måte kan andre proteiner med repetitive sekvenser, såsom keratin, også fremstilles i henhold til den foreliggende oppfinnelse. Andre egnede repetitive proteiner kan fremstilles basert på sekvenser av edderkopp-silke og andre repetitive animalske fibrer. Kunstige peptider som er egnet for immunisering, kan også fremstilles basert på repeterende sekvenser som er tilstede i forskjellige overflateantigener hos sykdomsfremkallende mikroorganismer, såsom parasitter, bakterier og virus.

De følgende eksempler er gitt som illustrering.

Eksempel 1

DNA-fremstillingsfremgangsmåter

1. Fremstilling av plasmid-DNA fra E. coli:

A. Liten målestokk: Plasmid-DNA ble fremstilt ut fra 1,5 ml kulturer enten ved kokefremgangsmåten eller den alkaliske lyse-fremgangsmåte (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. (1982)).

B. Stor målestokk: En plasmidbærende stamme ble dyrketover natten i 1 liter Luria-buljong med det passende antibiotikum. Cellene ble oppsamlet ved sentrifugering ved 10.000 xg i 5 minutter og suspendert på nytt i 10 ml iskald TE (10 mM Tris-HCI pH 8,1 mM EDTA). Cellene ble sentrifugert igjen, suspendert på nytt i 4 ml TES (TE og 25 vekt/volum% sakkarose) og homogenisert ved Vortex-behandling. Prøvene ble holdt på is for de etterfølgende trinn. Lysozym (1 ml med 10 mg/ml) ble tilsatt til cellesuspensjonen og inkubert i 5 minutter før tilsetning av 2 ml 0,5 M EDTA pH 8. Etter 10 minutters inkubering ble det tilsatt 50 ml proteinase K (40 mg/ml), 10 minutter senere fulgt av 15 ml lyserende buffer (0,1% Triton X-100,1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCI pH 8). Etter 15-20 minutter ble cellelysatet sentrifugert ved 35.000 xg i 90-120 minutter. Supernatanten (19,8 ml) ble overført til et plastrør med 20 g CsCI og 400 ^l etidiumbromid (10 mg/ml). Etter oppløsing ble blandingen delt i to polyallomer-ultrasentrifugerør, forseglet med varme og sentrifugert i en Beckmann Ti-65-rotor ved 60.000 rpm i 24 timer. Det nederste plasmid-DNA-bånd ble fjernet fra røret med en sprøyte. Etidiumbromidet ble ekstrahert tre ganger med et likt volum NaCI-mettet isopropanol. To volumdeler H20 ble tilsatt til DNA-oppløsningen og deretter ble DNA utfelt med etanol.

2. Fremstilling av dobbeltkjedet DNA:

En kultur av JM103 ble dyrket til en OD6oo på ca. 0,2 og deretter delt i porsjoner på 2 ml. Hver porsjon ble infisert med et friskt plakk av M13 og inkubert ved 37°C i ca. 6 timer med kraftig risting. Deretter ble cellene sammenklumpet og supernatanten ble oppbevart for etterfølgende infeksjoner. Den dobbeltkjedede fag-DNA ble ekstrahert ved kokemetoden (Maniatis et al.).

3. Avproteinisering:

Fenolekstraksjon ble utført på et passende volum av DNA-prøve, typisk mellom 100 |J og 10 ml. DNA-prøven ble fortynnet i 0,01 M Tris-HCI pH 7,5, 1 mM EDTA og et likt volum vann-mettet fenol ble tilsatt. Prøven ble "vortex"-behandlet i korttid og anbrakt på is i 3 minutter. Etter sentrifugering i 3 minutter i en mikro-sentrifuge ble det vandige sjikt overført til et nytt rør og ekstrahert én gang med et likt volum kloroform:isoamylalkohol (24:1).

4. Etanolutfelling:

DNA i en vandig buffer ble konsentrert ved etanolutfelling. Til DNA-prøven ble det tilsatt 1/10 volum 3 M natriumacetat pH 7,5 og 2-3 volumdeler kald etanol. DNA ble utfelt i 30 minutter ved -70°C eller over natten ved -20°C og deretter sammenklumpet ved sentrifugering i mikrosentrifugen i 15 minutter ved 4°C. Klumpen ble vasket én gang med 200 |il kald 80% etanol og sammenklumpet igjen i 10 minutter ved 4°C. Etter lufttørking eller frysetørking ble klumpene suspendert på nytt i den passende buffer.

5. Fosfatasebehandling av DNA:

Fosfatasebehandling av DNA ble utført ved at 1 fil (25 enheter) kalve-intestinal-fosfatase (Boehringer Mannheim) ble tilsatt direkte til restriksjonsenzym-nedbrytningsreaksjonen og inkuberingen fortsatt i 30 minutter ved 37°C. Fosfatasen ble inaktivert i 60 minutter ved 65°C før avproteinisering ved fenolekstraksjon.

6. Innfyllings-reaksjon med DNA-polymerase I:

DNA ble suspendert på nytt i buffer som inneholdt 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 50 mM KCI, 5 mM MgCI2 og 400 jiM av hver av de fire deoksynukleotid-trifosfater. Ti enheter Klenow DNA-polymerase ble tilsatt og reaksjonen fikk gå i 15 minutter ved romtemperatur. DNA ble deretter fenolekstrahert og etanolutfelt.

7. T4-polynukleotidkinase-reaksjon:

Reaksjonen (10 jliI) inneholdt: T4-polynukleotid-kinase (BRL), 150 ng DNA,

1 Hl 10 x kinasebuffer (0,7 M Tris-HCI pH7,6, 0,1 M MgCI2, 50 mM DTT) og [<32>P]-

ATP (200-300 nCi). Dette ble inkubert ved 37°C i 30 minutter, og deretter ble DNA renset under anvendelse av en NACS-kolonne (Bethesda Research Labs) (BRL).

8. Nedbrytning med restriksjons-endonukleaser:

DNA ble brutt ned med restriksjons-endonukleaser (REN) i 1 x "AA"-buffer [10 x AA-buffer er 330 mM Tris-acetat, pH 7,9, 660 mM kaliumacetat, 100 mM magnesiumacetat, 50 mM ditiotreitol (DTT) og 1 mg/ml bovint serumalbumin (nukleasefritt)]. Når det var mulig ble konsentrasjonen av DNA holdt på under 1 jkj/25 Inkuberingen var ved 37°C i 1-4 timer for de fleste restriksjons-endonukleaser bortsett fra Ball-, Banl- og Nael-nedbrytningene som ble inkubert over natten.

9. Analytisk agarosegel-elektroforese av DNA:

Til DNA-prøver for gel-analyse ble det tilsatt 0,2 volumdeler påsettingsbuffer (5 x elektroforesebuffer, 0,01% bromfenylblått-fargestoff, 50 mM EDTA og 50% glycerol). Deretter ble prøvene påsatt i felt i en horisontal neddykket elektro-foreseenhet som inneholdt en 1,0 vekt/volum% agarosegel. Elektroforesebufferen var enten 1 x TAC eller 1/2 x TBE. 1 x TAC er 40 mM Tris-base, 10 mM EDTA, justert til pH 7,8 med eddiksyre. 1/2 x TBE er 0,045 M Tris-base, 0,045 M borsyre, 1 mM EDTA, pH 8. Gelen ble kjørt ved 40-50 V i 18 timer, deretter fjernet og farget med 0,5 ug/ml etidiumbromid i 30 minutter. DNA-båndene ble synliggjort på en lang-bølgelengde-UV-transilluminator.

10. Preparativ agarosegel-elektroforese:

Fremgangsmåtene og materialene er de samme som for den analytiske agarosegel-elektroforese. Den eneste forskjell er anvendelsen av agarose med lavt smeltepunkt, i et konsentrasjons-område på 0,5-2,5 vekt/volum% avhengig av størrelsen av det DNA-fragment som skal renses. DNA-restriksjonsfragmentene ble skåret bort fra LMP-agarosegelene etter synliggjøring med etidiumbromid.

11. NACS-rensning:

Gelfragmenter som inneholdt DNA, ble smeltet ved 70°C i 5 minutter og fortynnet omtrent 5 ganger med TE1 (10 mM Tris-HCI pH 7,5, 0,2 M NaCI). Geloppløsningen ble påført på en NACS-kolonne (BRL). Kolonnen ble vasket med 5 ml av den samme buffer. Den bundne DNA ble eluert med 300 fil av enten TE2 (10 mM Tris-HCI pH 7,5, 1,0 M NaCI) for DNA-fragmenter mindre enn

1000 bp eller TE3 (10 mM Tris-HCI pH 7,5, 2 M NaCI) for større fragmenter. Den eluerte DNA ble konsentrert ved etanolutfelling.

12. DNA-ligering:

Reaksjoner for ligering av kohesive ender inneholdt: 1 ^g DNA, 1 x AA-buffer (se trinn 8 ovenfor) 1 mM ATP og 20 enheter T4-DNA-ligase i et 20 ^l sluttreaksjonsvolum. Ligeringen fikk foregå i 16-18 timer ved 15°C eller 1-2 timer ved romtemperatur. For stumpendede ligeringer inneholdt reaksjonene 1 ^g DNA, 25 mM Tri-HCI pH 7,5, 5 mM MgCI2, 5 mM DTT, 0,25 mM spermidin, 200 mg BSA, 1 mM heksamin-koboltklorid (HCC), 0,5 mM ATP og 400 enheter T4-DNA-ligase (NEB) i et 20 ^l reaksjonsvolum. Ligeringen fikk foregå i 30 minutter -1 time ved romtemperatur.

Bakterietransformasjons-fremgangsmåter

1. Fremstilling av transformasjons-kompetente E. co//-celler:

En kultur av 200 ml steril L-buljong ble inokulert med en full, liten bakterie-"sløyfe" med E. coli- ce\\ er. Dette ble inkubert med risting ved 37°C inntil OD6oo var ca. 0,5. Kulturen ble anbrakt på is i 10 minutter og sentrifugert ved 6 000 xg i 10 minutter. Celleklumpen ble suspendert på nytt i 100 ml iskaldt 0,1 M MgCI2, holdt på is i 30-40 minutter og sentrifugert igjen. Klumpen ble suspendert på nytt i 2 ml iskaldt 100 mM CaCI2, overført til et sterilt forsøksrør og inkubert på is i 24 timer. De kompetente celler ble deretter fordelt i porsjoner

og lagret ved -70°C.

2. Transformasjon av E. coli:

En porsjon av frosne kompetente celler ble tint på is. Til 50 i^l celler ble det tilsatt 0,1-1 p,g DNA, og blandingen ble inkubert på is i 30 minutter. Røret ble fjernet fra isen og anbrakt i et 42°C bad i 2 minutter. L-buljong (1 ml) ble tilsatt og transformasjonsblandingen inkubert med risting ved den ønskede temperatur (vanligvis 30°C eller 37°C) i 2 timer. Deretter ble en tiendedel av transformasjonen utplatet på L-buljongplater som inneholdt det passende antibiotikum, og hvor nødvendig ble XGAL og IPTG tilsatt.

3. DNA-transformasjon av B. subtilis:

B. subtilis- ceWer ble dyrket til tidlig stasjonær-fase (forandring i Klett-enheter på <5% på 15 minutter). Transformasjonen fulgte etablerte fremgangsmåter (Anagnostopoulos et al., 1981) (ref. 8). Cellene (0,45 ml) ble inkubert med 1-10 ug DNA ved 37°C i 80 minutter med risting og deretter utplatet på TBAB-agarplater med et passende antibiotikum.

4. Isolering av plasmid-DNA fra B. subtilis:

Plasmid-DNA fra B. subtilis ble oppnådd ved en fremgangsmåte lik alkalisk-lyse-fremgangsmåten, bortsett fra at sammenklumpede celler ble suspendert på nytt i 8 ml oppløsning 1 (50 mM glukose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCI (pH 8,0), 10 mg/ml lysozym) og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter. Deretter ble 16 ml av oppløsning 2 (0,2 N NaOH, 1 vekt/volum% SDS) tilsatt og inkubert på is i 10 minutter. Til slutt ble 12 ml 3 M kalium-acetat (pH 4,8) tilsatt og inkubert i ytterligere 20 minutter på is. De lyserte celler ble sentrifugert i 15 minutter ved 15 000 rpm i en rotor av typen Sorval SS-34. DNA ble utfelt ved tilsetting av et likt volum isopropylalkohol og sentrifugert ved 7 000 rpm. Klumpen ble suspendert på nytt i 5 ml 10 mM Tris-HCI (pH 7,5), 1 mM EDTA (TE). Oppløsningen ble fenolekstrahert én gang og kloroformekstrahert. DNA ble utfelt med etanol og suspendert på nytt i 3 ml TE. Volumet ble justert til 5,2 ml ved tilsetning av 4,2 g CsCI, 400 (al etidiumbromid med 10 mg/ml og TE. Oppløsningen ble overført til et hurtigforseglings-polyallomer-sentrifugerør av typen Beckman og sentrifugert ved 45 000 rpm i en rotor av typen Beckman vti65 i18 timer.

Antistoff-fremstilling, proteinkjemi og elektroforese av proteiner

1. Fremstilling av antistoff mot kunstig syntetiserte peptider:

Syntetisk peptid med sekvens (GAGAGS)8GAAGY ble koplet til BSA under anvendelse av gluteraldehyd-fremgangsmåten ifølge Kagen og Glick (1979). Koplingsgraden ble kontrollert under anvendelse av spormengder av radioaktivt jodert syntetisk peptid. Peptid-konjugater i en konsentrasjon på 1 mg/ml i komplett Freund's adjuvans ble anvendt for immunisering av kaniner på dag 0. Dyrene ble injisert på nytt med antigen i Freund's ikke-komplette adjuvans på dag 30 og titrert på dag 60. Positive sera ble påvist under anvendelse av en mikrotiter-RIA under anvendelse av det syntetiske peptid som antigen; Kagen og Glick (1979) i Methods of Radioimmunoassay, Jaffe og Berman (red.), Academic Press, s. 328.

Et peptid på 53 aminosyrer svarende til Slplll-sekvensen ble fremstilt på en peptid-syntetiseringsanordning av typen Applied Biosystems. Utbyttet av dette materiale, som har en molekylvekt på 3640, var ca. 0,5 gram. Peptidet ble koplet til bovint serumalbumin. Materialet ble sendt til Antibodies, Inc. for fremstilling av antistoffer i kaniner. Man fikk antisera som reagerte med syntetiske peptider både med Sipl- og Slplll-sekvensene. Disse antisera har vært egnet for påvisning av fusjonspeptider inneholdende gly-ala-sekvenser.

Idet man fulgte den fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor, ble det syntetisert et antigen med formelen (V-P-G-V-G)s, som ble koplet til "nøklehull-limpef-hemocyanin. Polyklonale antisera ble deretter fremstilt som beskrevet ovenfor som ble bundet til ELP-peptidet.

2. Polyakrylamidgel-elektroforese av proteiner:

Ca. 10<9> E. co//-celler fra voksende kulturer ble sammenklumpet ved sentrifugering ved 10 000 xg i 5 minutter. Celleklumpene ble suspendert på nytt i 100-500 jil 2X prøvebuffer (100 mM Tris-HCI pH 6,8, 4% SDS, 10% p-merkaptoetanol, 60% glycerol eller sakkarose) og sonikert i 30 sekunder under anvendelse av et sonisk sprengningsapparat av typen Tekmar. Prøvene ble kokt i ca. 5 minutter, og 20-100 \ i\ av cellelysatene ble påsatt på en SDS-polyakrylamidgel (7,5-16 vekt/volum%). Gelene ble fremstilt idet man fulgte fremgangsmåten ifølge Laemmli (Nature, 227:680-685 (1970)). Proteinene i gelene ble farget med 2% Coomassie-brilliantblått i 10% metanol, 7,5% eddiksyre i 1 time og avfarget i 10% metanol, 7,5% eddiksyre over natten.

3. lmmuno-"blotting" av proteiner i geler:

Etter proteinelektroforese ble én av de omgivende glassplater fjernet fra polyakrylamidgelen. Geloverflaten ble fuktet med transportbuffer (25 mM Tris-HCI, 192 mM glycin, 20% metanol). Et stykke nitrocellulosepapir (Sartorius, SM11307) ble mettet med transportbuffer og lagt på gelen. Luftbobler mellom filteret og gelen ble fjernet. Gelen og nitrocellulose-filteret ble anbrakt i overføringsenheten som beskrevet av produsenten (Bio-Rad). Transporten fikk foregå ved 200 mA i 3-4 timer. Deretter ble nitrocellulosefilteret fjernet og farget med Amido-Schwartz i 3 minutter (0,05% Amidosvart, 45% avionisert H20,45% metanol, 10% eddiksyre) og avfarget i H20. Filteret ble inkubert i minst 10 minutter ved romtemperatur i "BLOTTO" (5 vekt/volum% fettfri tørrmelk, 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 0,9 vekt/- volum% NaCI, 0,2 vekt/volum% natriumazid). Filteret ble anbrakt i serum passende fortynnet (1:50 - 1:500) i 0,5 X "BLOTTO" (2,5% fettfri tørrmelk, 50 mM Tris-HCI pH 7,4, 0,9% NaCI, 0,2% natriumazid) og ble agitert forsiktig i ca. 16 timer ved romtemperatur. Filteret ble vasket i 1 time med 5 skift av TSA (50 mM Tris-HCI pH 7,4, 0,9% NaCI, 0,2% natriumazid). "Blottet" ble anbrakt i 15 ml 0,5 X "BLOTTO"-oppløsning som inneholdt 1 x 10<7> cpm av <125>l-protein A og agitert forsiktig i 2 timer ved romtemperatur. Filteret ble vasket i 2 timer med minimum 7 skift TSA, skylt én gang med avionisert H20 og lufttørket. "Blottet" ble dekket med Saran-innpakning og autoradiografert.

4. Aminosyreanalyse:

Aminosyre-sammensetningene bestemmes ved PTC-derivitisasjons-fremgangsmåten ifølge Henrickson og Meredith (1984). Proteinprøver ble hydrolysert med 5,7 N konstant kokende HCI ved 108°C i 24 timer i vakuum. Etter omsetning med PITC ble aminosyrederivatene påvist ved 254 nm ved HPLC-reversert-fase-kromatografi under anvendelse av et system av typen Hewlett Packard 1090 og en kolonne av typen Supelco C18 (4,6 mm x 25 cm) med en lineær gradient på 0-50% acetonitril i 0,1 M NH4OAc pH 6,78 som mobil fase. R.L. Henrickson og S.C. Meredith (1984) Amino Analysis by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography. Anal. Biochem. 137:65-74.

5. Aminosyresekvens-analyse:

Den N-terminale aminosyresekvens ble bestemt ved automatisert Edman-nedbrytning under anvendelse av et gassfase-protein-sekvensbestemmelses-apparat av typen Applied Biosystems Modell 470A. PTH-aminosyrederivatene ble analysert ved reversert-fase-HPLC under anvendelse av et Hewlett Packard 1090-system og en Altex C18-kolonne (2 mm x 25 cm) med et komplekst gradient-buffersystem.

6. Peptidsyntese:

Syntetiske peptider ble fremstilt ved fastfase-syntese på et peptid-syntetiseringsapparat av typen Applied Biosystems Model 430 A under anvendelse av standard-symmetrisk-anhydridkjemien som tilveiebrakt av produsenten. Koplingsutbyttet ved hvert trinn ble bestemt ved den kvantitative ninhydrinfremgangsmåte ifølge Sarin et al., (1981). Det syntetiske peptid ble spaltet fra den faste bærer og aminosyre-blokkerende grupper ble fjernet under anvendelse av vannfritt HF (Stewart og Young, 1984). Ubearbeidede peptider ble avsaltet ved kromatografi over Sephadex G-50. V.K. Sarin, S.B.H. Kent, J.P. Tam og R.B. Merrifield (1981). Anal. Biochem. 237:927-936. J.M. Stewart og J.D. Young (1984). Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL. s. 85-89.

Syntetiske DNA-fremgangsmåter

1. In vitro-DNA-syntese:

N,N-diisopropylfosforamidittene, kontrollert-poreglasskolonnene og alle syntesereagenser var fra Applied Biosystems, Foster City, California.

Syntetiske oligonukleotider ble fremstilt ved fosfitt-triesterfremgangsmåten med et DNA-synteseapparat av typen Applied Biosystems Model 380A under anvendelse av et 10-dobbelt overskudd av beskyttede fosforamiditter og 1 (irnol nukleotid bundet til synteseunderstøttelses-kolonnen. Kjemiene som ble anvendt ved syntesen, er standardprotokollene anbefalt for anvendelse ved synteseapparatet og er blitt beskrevet (Matteucci et al., Journal Amer. Chem. Soc, 103:3185-3319 (1981)). Fjerning av beskyttende grupper og spaltning av oligomerene fra den faste bærer ble utført i henhold til standard-fremgangsmåter som beskrevet av McBride et al., Tetrahedron Letters, 24:245-248 (1983). Det repetitive utbytte av syntesen målt ved den optiske densitet for den fjernede beskyttende gruppe som anbefalt av Applied Biosystems (1984), var større enn 97,5%.

Den ubearbeidede oligonukleotid-blanding ble renset ved preparativ gel-elektroforese som beskrevet ved Applied Biosystems protokollene fra 9. november 1984 (User Bulletin nr. 13). Akrylamidgel-konsentrasjonen varierte fra 10 til 20% avhengig av oligomerens lengde. Den rensede oligomer ble identifisert ved UV-skyggelegging, skåret løs fra gelen og ekstrahert ved knusnings- og gjennom-bløtningsfremgangsmåten (Smith, Methods in Enzymology, 65:371-379 (1980)).

2. Sekvensbestemmelse hos DNA:

DNA-sekvenser ble bestemt ved følgende fremgangsmåter. Fragmenter som inneholdt det område som var av interesse, ble klonet i det multiple kloningssted M13mp18 eller M13mp19 (Mani-atis et al., 1982, og Norrander et al., 1983). Enkelt-kjedet DNA ble fremstilt og sekvensbestemt ved "primer-ekstensjons"-metoden (Sanger et al., 1977 og Biggin et al., 1983) under anvendelse av 35S-deoksyadenosin-5'-(alfa-tio)-trifosfat (New England Nuclear) som merking. I noen tilfeller ble revers transkriptase (Molecular Genetics) anvendt til forlengelse av primeren under anvendelse av dideoksy:deoksynukleosidtrifosfat-forholdene anvendt av Zagursky et al. (Gene Anal. Techn. (1985) 2:89-94). Deoksyadenosin-trifosfat merket med enten <32>P eller 35S ble anvendt ved disse reaksjoner. Kompresjonsartefakter som viste seg i noen G-C-rike sekvenser, ble overvunnet ved utelukkelse av deoksyguanosin-trifosfat fra G-reaksjonen og anvendelse av deoksyinosin-trifosfat (P-L Biochemicals) ved en sluttkonsentrasjon på 37,5 jxM i stedet. I de andre blandinger var konsentrasjonen av dideoksy-GTP i G-reaksjonen 0,5 mM. Alle sekvenser ble kjørt på 6 eller 8% polyakrylamidgeler som inneholdt 8 M urea (Sanger et al. 1978). Primere anvendt for sekvensbestemmelse ble kjøpt fra P-L Biochemicals. Ved lagring og analyse av data ble det anvendt programvare både fra DNAstar og International Biotechnologies, Inc.

3. Mutagenese in vitro av klonet DNA:

Plasmid-DNA (1 jag) som inneholdt den sekvens som skullemuteres, ble nedbrutt i to atskilte reaksjoner. Én reaksjon inneholdt enten én eller to restriksjons-endonukleaser som spalter på seter som umiddelbart omgir det område som er av interesse. Ved den annen reaksjon ble DNA nedbrutt med en restriksjons-endonuklease som spalter bare én gang på et sted som er fjernt fra den sekvens som skal muteres. DNA-fragmentene dannet i den første reaksjon ble skilt ved agarosegel-elektroforese, og det store fragment som mangler den sekvens som skal muteres, ble skåret ut og renset. DNA fra den annen reaksjon, det store fragment av DNA fra den første reaksjon og et syntetisk oligodeoksynukleotid med en lengde på 20-30 baser inneholdende mutant-sekvensen, ble blandet i et molart forhold på 1:1:250. Blandingen ble denaturert ved oppvarming ved 100°C i 3 minutter i 25-100 ^ 100 mM NaCI, 6,5 mM Tris-HCI pH 7,5, 8

mM MgCI2 og 1 mM B-merkaptoetanol. Den denaturerte blanding le koplet på nytt ved at temperaturen gradvis ble senket som ølger: 37°C i 30 minutter, 4°C i 30 minutter og 0°C i lOminutter. Reaksjonen ble supplert med 0,5 mM deoksyribo-nukleotidtrifosfater, 1 mM ATP, 400 enheter T4-DNA-ligase og 5 enheter E. coli-DNA-polymerase-stort-fragment og inkubert ved 15°C i 12-16 timer. Reaksjons-blandingen ble så transformert til E. coli og antibiotikum-resistente kolonier ble utvalgt.

Fermenteringsbetingelser

Fermentoren er en 15 I Chemap, 10 I arbeidsvolum. Dyrkningsbetingelsene er: temperatur = 30°C, pH = 6,8; NaOH 2,5 M anvendes for pH-regulering. Topprom-trykket ("headspace press-ure") er under 0,1 bar. Det oppløste oksygen reguleres til 50%. Luftstrømningen varierer fra 0,5 l/min. til 20 l/min. Agiterings-hastigheten varierer mellom 200 og 1500 rpm. Fermentoren inokuleres med et 10 volum% inokulum dyrket i medium A i 15 timer ved 30°C under agitering.

Medium B var fermentormediet. Startvolumet var 5 I.

Nårglukosekonsentrasjonen nådde 1%, ble en konsentrert oppløsning (5x) av medium B tilsatt til fermentoren for å holde glukosekonsentrasjonen på ca. 1%. Når kulturen nådde en ODeoo på 60,0, ble temperaturen øket til 42°C i 10 minutter og deretter senket til 39°C i 2,5 timer. Cellene ble deretter høstet ved

sentrifugering og frosset ved -70°C inntil de ble bearbeidet.

Eksempel 2

Sammensetting og ekspresjon av Slpl-genet

1. "Oppsummering av skjemaet for sammensetting av Slpl-genet:

En 18 bp DNA-sekvens som koder for det oftest repeterende oligopeptid i silkefibroinproteinet dannet av Bombyx mori [F. Lucas og K.M. Rudall (1986) Extracellular Fibrous Proteins: The Silks. s. 475-558, i Comprehensive Biochemistry, vol. 26, del B., M. Florkin og F.H. Stotz (red.) Elsevier, Amsterdam] ble syntetisert in vitro. To enkelttråder ble syntetisert, koplet sammen og deretter ble de resulterende dobbeltkjedede segmenter multimerisert hode-til-hale under dannelse av konkatamerer på opp til og ut over 13 repeteringer. Det strukturelle gen for silke I som vi fortsatte å arbeide med, hadde 13 repeteringer som kodet for oligopeptid-gagags, hvor g = glycin, a = alanin og s = serin. Vi omtaler dette strukturelle gen som "monomeren". Vi konstruerte "dimere, trimere, tetramere, pentamere og heksamere" Slpl-gener inneholdende 26 (Slpl-2)-, 39 (Slpl-3)-, 52 (Slpl-4)-, 65 (Slpl-5)- og 78 (Slpl-6)-repeteringer. Det er en kort mellomliggende sekvens mellom hver monomerenhet. Sammensetningen er skissert som følger:

Repeterende DNA-sekvens

2. Sammensetting av det "monomere" strukturelle Slpl-gen:

De to enkelt-kjeder vist ovenfor ble syntetisert som tidligere beskrevet. Kjedene ble renset atskilt ved gel-elektroforese, fosforylert under anvendelse av T4-polynukleo-tidkinase og deretter blandet sammen og fikk koples. Dette resulterte i at de dobbeltkjedede segmenter ble spontant innrettet hode-til-hale i lange konkatamerer. Fosfodiester-bindingene mellom segmentene ble dannet med T4-DNA-ligase. Reaksjonen ble stoppet ved utfylling av de terminale kohesive ender under anvendelse av Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I. Det stump-endede repeterende DNA ble deretter ligert til Hincll-REN-setet på plasmidvektor pUC12 (Veiera et al., Gene 19:259-268 (1982)). Den ligerte DNA ble transformert til E. co//-HB101 og transformanter ble utvalgt med hensyn til sin evne til å vokse i nærvær av ampicillin. DNA hos potensielle kloner ble analysert når det gjaldt størrelse og orientering ved REN-nedbrytning og gelelektroforese. DNA-sekvensene ble bestemt med hensyn til isolerte deler med store innskudd som var passende orientert. "Monomer"-klonen utvalgt for etterfølgende multimerisering hadde 13 repeteringer som kodet for oligopeptid-agagsg, og ble kalt pSY708. DNA-sekvensen, den utledede aminosyresekvens og REN-seter på Slpl-innskuddet og omgivende områder på pSY708 er vist i Tabell 2.

3. Konstruksjon av ekspresjonsvektoren, pSY701:

Plasmid pSP65 (10 (j.g, Boehringer Mannheim) ble nedbrutt med Aatll-REN, fenolekstrahert og etanolutfelt. DNA ble suspendert på nytt i 10 ul H20. Halvparten av denne DNA ble nedbrutt med eksonuklease III i følgende blanding: 5 ug DNA, 10 ul 10 X eksonuklease lll-buffer (600 mM Tris-HCI pH 8,0, 6,6 mM MgCl2,10 mM p-merkaptoetanol) og 9 enheter eksonuklease III i et totalt volum på 200 ul. Prøver på 20 fil ble uttatt etter 0,1, 2,5, 5 og 7,5 minutter og fortynnet straks i 100 ul av den følgende buffer (30 mM natriumacetat, pH 4,5, 0,25 M NaCI, 1 mM ZnS04) som inneholdt 5 ug tRNA og 36 enheter S1-nuklease. Det ble inkubert ved 30°C i 45 minutter, og deretter ble reaksjonen avsluttet ved tilsetning av 15 ul stopp-buffer (0,5 M Tris pH 9,0,125 mM EDTA, 1 vekt/volum% SDS, 200 ug/ml tRNA). Prøveneble fenolekstrahert og etanol-utfelt. Den resuspenderte DNA ble nedbrutt med Smal-REN og kjørt i elektroforese gjennom en 1% gel av agarose med lavt smeltepunkt. Gelbåndet som svarte til det DNA-fragment som bar p-laktamasegenet, plasmid-opphavet og p-galaktosidase-aktivatoren ble skåret ut fra gelen og smeltet ved 65°C. Én volumdel H20 ble tilsatt. DNA i hver prøve (tidspunkt) ble resirkularisert ved ligering i nærvær av agarose. Reaksjonen innbefattet 8 ul smeltet gel, 2 ul ligeringsbuffer (100 mM Tris-HCI pH 7,5, 50 mM MgCI2, 50 mM DTT, 1 mM ATP), 10 enheter T4-DNA-ligase og ble inkubert ved 15°C i 3 timer. Kompetente celler av JM101 ble transformert med den ligerte DNA og transformanter ble utvalgt ved dyrkning på L-buljongplater som inneholdt ampicillin (40 ug/ml). Plasmid-DNA ble fremstilt ut fra fire transformanter. DNA ble nedbrutt med BamHI-REN, merket med <32>P-dGTP under anvendelse av Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I, nedbrutt med Pvu I og deretter ble det minste fragment renset på gel. Fragmentet fra én transformant ble sekvensbestemt under anvendelse av teknikken ifølge Maxam og Gilbert. Fragmentene av de andre tre plasmider ble ytterligere nedbrutt med Taql og kjørt i elektroforese på den samme gel. Det sekvensbestemte plasmid hadde en fusjon mellom det multiple kloningssted og en posisjon oppstrøms for det N-terminale ATG hos p-laktamase. Størrelsen av BamHI-Taql-fragmentet hos to av de andre plasmider anga en fusjon mellom det multiple kloningssete og den 4. aminosyre hos p-laktamasegenet. DNA og tilsvarende aminosyresekvenser i det N-terminale område hos den forandrede p-laktamase er oppgitt nedenfor, sammen med et ringformet "kart" over REN-seter for pSY701 (se Fig. 1). Aminosyresekvensen på Fig. 1 er met-thr-met-ile-thr-pro-ser-leu-gly-cys-arg-ser-thr-leu-glu-asp-pro-his-phe-arg-val-ala-leu-ile-pro-phe-phe-ala-ala-phe-cys-leu-pro-val-phe-ala-his.

4. Innskyting av "monomer" Sipl fra pSY708 i pSY701:

Plasmid-pSY708 ble nedbrutt med Hindlll, de kohesive ender ble utfylt ved anvendelse av Klenow-fragmentet hos DNA-polymerase I og deretter nedbrutt med BamHI. Plasmid pSY701 ble nedbrutt med Xbal, utfylt som ovenfor og deretter nedbrutt med BamHI. DNA-fragmentet fra pSY708 og skjelettet hos pSY701 ble deretter renset ved elektroforese gjennom en agarosegel med lav smelte-temperatur og renset med NACS- (BRL)-kolonner. De passende fragmenter ble blandet, ligert og deretter transformert inn i E. coli JM109. Transformanter ble utvalgt ved dyrkning på L-plater som inneholdt ampicillin (40 mg/ml), IPTG (5 x 10"<4> M) og XGAL (20 mg/ml). Transformanter ble analysert med hensyn til plasmidinnhold, og én (pSY756) ble utvalgt for ytterligere undersøkelse siden den bar innskuddet i monomer-Slpl-1 -sekvensene i den riktige orientering, som bestemt ved kartlegging av REN-seter. Skjønt hele DNA-sekvensen ikke ble bestemt når det gjaldt pSY756, ble forbindelsespunktet mellom innskuddet og vektoren bekreftet som korrekte restriksjons-sekvenser for Xbal oppstrøms og BamHI nedstrøms.

5. Multimerisering av Slpl-genet hos pSY756:

Plasmid pSY708 ble nedbrutt med REN-Smal, og det DNA-fragment som bar kodings-sekvensen for polypeptidet arg(ala-gly-ala-gly-ser-gly)i3thr-leu-glu-asp-pro (R(AGAGSG)i3TLEDP), ble renset som under punkt 4 ovenfor. Plasmid pSY756 ble nedbrutt med Smal, avproteinisert og deretter ligert med det rensede DNA-fragment fra pSY708. Transformanter av E. coli JM109 ble utvalgt på medium som inneholdt ampicillin. Klonene ble funnet å inneholde 2 enheter (dimer pSY882), 3 enheter (trimer pSY883) og 4 enheter (tetramer pSY915) av den opprinnelige monomersekvens av pSY708-klonen. På liknende måte er pentamerer og heksamerer også blitt konstruert. Alle disse plasmider er genetisk stabile og gir gly-ala-peptidet som en fusjon med p-laktamase.

6. Ekspresjon av Slpl-genfusjonen til p-laktamaseproteinet:

Syntese i E. co//-celler av Slpl-peptidet som et fusjonsprotein med p-laktamase ble påvist ved immuno-"blotting"-(Western)-analyse. Anti-"Slp"-antistoffer ble dannet mot et syntetisk silkepeptid. Fusjoner mellom p-laktamase og Sipl ble også påvist med antistoffer dannet mot E. co//-p-laktamasen.

Som vist på Fig. 2 reagerer dette antistoff med dimerer og trimerer av Sipl koplet sammen med E. co//'-p-laktamasen. Slpl-innskuddet fortsetter med den femte aminosyre hos signalsekvensen for dette enzym. p-Laktamase-antistoffet (Fig. 2A) påviser både de ikke-bearbeidede fusjonsproteiner så vel som det bearbeidede modne enzym som viser seg som hoved-antigenbåndet på denne figur, omtrent ved 28 kD-stillingen. Bevegeligheten hos alle Slp-holdige polypeptider er anomalt langsom, og proteinene er ikke så store som de ser ut på gelene.

Anti-Slp-antistoffet er også egnet til påvisning av disse fusjonsprodukter. Feltene 2-5 på Fig. 2B representerer 4 atskilte kloner som inneholder dimere fusjoner av Sipl med p-laktamase, mens felt 6 og 7 er fra to kloner som inneholder trimer-fusjoner. Som det vil kunne sees, er trimerens antigenitet betydelig større enn for dimeren. Det er kjent fra tidligere forsøk at fusjonsproteiner som bare inneholder en monomer av Sipl, ikke påvises i det hele tatt med dette anti-Slp-antistoff. Den økede antigenitet hos trimer-peptidet gjør det mulig å påvise det som en bearbeidet fusjon med p-laktamase-signalpeptidet. Den bearbeidede form sees omtrent ved 33 kD-stillingen i feltene 6 og 7 på Fig. 2B. Tilsynekomsten av normalt bearbeidet modent p-laktamase-enzym (påvist med p-laktamase-antistoff) så vel som et peptid svarende til fusjonenmellom Slpl-3-trimeren og signalpeptidet hos p-laktamase (påvist med gly-ala-antistoff) antyder at til tross for innføringen av Slpl-sekvenser i signalsekvensen, finner normal proteolytisk bearbeidelse av

enzymet sted i E. coli.

7. a. Ekspresjon av Slpl-genet ved fusjon til T7-gener:

Slpl-sekvensen er også blitt uttrykt som et fusjonsprotein med både gen-9-og gen-10-proteiner fra bakteriofag T7 i E. coli. Konstruksjonen er oppført i diagramform på Fig. 3. Plasmid pSY915 (inneholdende Slpl-4-tetrameren) ble nedbrutt fullstendig med REN Sali og delvis med BamHI. DNA-fragmentet som inneholdt Slpl-4-tetrameren, ble renset og deretter klonet i plasmid pSY114 (pG2 fra Promega Biotech), som var blitt nedbrutt med REN Sali og BamHI. Fra dette mellom-plasmid ble tetramer-innskuddet ved Sipl fjernet med REN Accl og EcoRI. Dette fragment ble så klonet i pSY633 (pBR322 inneholdende den fullstendige T7-gen-9-sekvens; pAR441 ifølge Studier et al., (1986)) som ble nedbrutt med EcoRI og Asull. I det resulterende plasmid er Slpl-tetrameren sammenkoplet med gen-9-translasjons-avlesningsrammen nær den C-terminale ende av gen 9. Dette plasmid ble deretter anvendt til transformering av E. coli stamme 0-48 (stamme HMS174 ( DE3) ifølge Studier et al., 1986) som inneholder T7-RNA-polymerasegenet innskutt i kromosomet under transkripsjonen regulering av den IPTG-induserbare p-galaktosidase-aktivator. Ved denne form avhenger ekspresjon av Slpl-4-sekvensen av dannelse av T7-RNA-polymerasen som selv reguleres ved den IPTG-induserbare p-galaktosidase-aktivator. Når disse cellene er indusert med IPTG, syntetiseres et protein-produkt av gen 9/Slpl-4-fusjons-genet og påvises med antistoff mot det syntetiske Slp-peptid, som vist på Fig. 4B og 4C. Fusjonsproduktet vandrer i gelen som om det hadde en størrelse på 82 kD. Den ventede størrelse er bare 65 kD. Den anomale bevegelighet er karakteristisk for den uvanlige aminosyresammenset-ning (rikt på glycin og alanin) og sees ved alle Slp-holdige produkter.

På liknende måte ble plasmid pSY638 (pAR2113 ifølge Studier) inneholdende aktivatorområdet og de første 13 aminosyrer i T7-gen-10-proteinet, nedbrutt med REN BamHI, utfylt med Klenow-fragmentet hos DNA-polymerase og deretter nedbrutt med REN EcoRI. I dette lineariserte plasmid ble Asull-EcoRI-fragmentet hos pSY633 klonet, inneholdende Slpl-4-tetrameren. Denne ligering skaper en fusjon i ramme av silke-tetrameren etter den trettende aminosyre hos T7-gen 10. Sistnevnte fusjonsprodukt kan anvendes for spinning uten ytterligere bearbeidelse siden de N-terminale 13 aminosyrer bare er en del av det store Slpl-protein. Skjønt fusjonsproduktet har en størrelse på ca. 30 kD, har det anomal bevegelighet og vandrer som om det var større, 50 kD. Dette er vist på Fig. 4A.

Plasmidene pG9/Slpl-4 og pG10/Slpl-4 ble ytterligere forbedret ved innskyting av et kanamycin-resistensgen i p-laktamasegenet i orienteringen motsatt T7-ekspresjonssystemet. En eventuell lavnivå-ekspresjon fra T7-systemet fører således ikke til forhøyet p-laktamase-aktivitet. Slik aktivitet utelukket ampicillinet i mediet som ble tilsatt for utvelging med hensyn til opprettholdelse av plasmidet. Når ampicillinet var oppbrukt, ble plasmidene tapt fra kulturen. Kanamycin-resistensgenet omgår dette problem og representerer en betydelig forbedring i T7-ekspresjonssystemet, særlig for kulturer i stor målestokk. Kanamycin-resistens-genet (opprinnelig fra Tn903) ble isolert fra plasmid pUC4K (J. Veira og J. Messing, 1982. Gene. 19:259-268) var et Hincll-fragment.

7.b. Fermentering og rensning av Slpl-4:

E. coli stamme 0-48 med pSY997 ble dyrket ved 37°C under anvendelse av en fermentor av typen Chemap eller Braun, i 10 I LB til en OD (Klett-enheter) på 300 (3 x 10<9> celler pr. ml). T7-systemet ble deretter indusert med tilsetting av 3,5 mM IPTG. Etter 150 minutter ble cellene konsentrert 10 x under anvendelse av en Millipore-filterenhet (Pellicon kassettsystem, filter med utelukkelse ved molekylvekt 100 000). Cellesuspen-sjonen ble deretter frosset ved -70°C inntil bearbeidelse.

Cellesuspensjonen ble smeltet i et vannbad ved 42°C og lysert i en fransk presse, og lysatet ble rotert ved 125 000 xg i 1 time ved 25°C. Den klarede supernatant ble behandlet med DNAase (250 um/ml) i 15 minutter ved romtemperatur og deretter filtrert gjennom et 0,45 um sterilfilter. Filtratvolumet ble målt og inkubert i is med langsom omrøring. Deretter ble det tilsatt 231 mg ammoniumsulfat for hver ml filtrat i løpet av et tidsrom på 45 minutter. Én ml NaOH for hvert 10 g ammoniumsulfat ble tilsatt for nøytralisering av pH. Etter 2 timers kontinuerlig omrøring ble blandingen rotert ved 9 000 xg i 10 minutter. Klumpen ble suspendert på nytt i 1/10 av det opprinnelige filtratvolum under anvendelse av destillert vann. Sentrifugeringen og re-suspensjonen ble gjentatt tre ganger. Klumpen ble suspendert på nytt i 1/10 av det opprinnelige filtratvolum i destillert vann. Prøver ble analysert med hensyn til proteinkonsentrasjon, aminosyresammensetning og proteinsekvens ved standardfremgangsmåter. Dette er én av flere frem-gangsmåter for oppnåelse av produktet. Denne fremgangsmåte resulterer i et Slpl-4-produkt som har en renhetsgrad større enn 90%. Aminosyresammensetningen er nesten utelukkende gly, ala og ser, som ventet, og den N-terminale aminosyresekvens er sekvensen hos gen-10-lederen.

8. Regulert ekspresjon av TG7-RNA-polymerasegenet i Bacillus subtilis: Kodingssekvensen for T7-RNA-polymerasegenet (T7-gen 1, T7-nukleotider 3128-5845) fra plasmid pSY558 (pAR1151 ifølge Studier et al., 1986) ble modifisert ved mutagenese in vitro av klonet DNA. Vi innførte gjenkjennelses-sekvensen for restriksjonsendonukleasen Ndel i stilling 3171. Under anvendelse av et oligodeoksynukleotid som ble syntetisert som tidligere beskrevet, ble T7-gen-1-sekvensen forandret fra sin naturlige sekvens, TAAATG, til den modifiserte sekvens, CATATG.

På liknende måte ble oppstrøms-reguleringssekvensen hos Bacillus subtilis- genet spoVG, oppnådd fra plasmid pCB1291 (Rosenblum et al., J. Bacteriology, 148:341-351 (1981)), modifi-sert ved in wfro-mutagenese i stilling 85 (Johnson et al., Nature, 302:800-804 (1983)) slik at den også innbefatter et Ndel-spaltningssete. Oppstrømsreguleringssekvensene hos spoVG-genet ble deretter ligert med kodingssekvensen hos T7-RNA-polymerasegenet via disse nye Ndel-spaltningsseter. Etter transformering av E. coli HB101, ble plasmidinnholdet hos individuelle ampicillinresistente isolater kontrollert ved restriksjonskartlegging. Den riktige konstruksjon ble kalt pSY649.

Plasmid-DNA som inneholdt spoVG:T7-RNA-polymerasefusjonsgenet (pSY649) ble ytterligere modifisert slik at det innbefattet et kloramfenikol-resistensgen som virker i B. subtilis. Først ble Ndel-Sall-fragmentet på ca. 1200 baseparfra plasmid pGR71-P43 (Goldfarb et al., Nature, 293:309-311 (1981)) isolert. Dette fragment bærer P43-aktivatoren hos B. subtilis og et til-støtende kloramfenikolacetyl-transferasegen fra Tn9. Etter utfylling av alle de kohesive ender under anvendelse av Klenow-DNA-polymerasereaksjonen, ble dette fragment innført i Xbal-setet i multippel-kloningssetet pUC13 (Veiera et al., Gene, 19:259-268 (1982)). Ampicillin- og kloramfenikol-resistente transformanter ble utvalgt for ytterligere anvendelse. Den riktige plasmidkonstruksjon ble kalt pSY630. Smal-Hincll-endonukleasespaltningsfragmentetfra plasmid pSY630 som inneholdt kloramfenikol-acetyltransferasegenet koplet til P43-aktivator-sekvensen, ble gel-renset og "stump"-ende-ligert til Pvul-setet hos plasmid pSY649 som først var blitt behandlet med T4-DNA-polymerase. Det resulterende plasmid, pSY856, ble deretter transformert til B. subtilis 1168. På grunn av at plasmid pSY856 ikke autonomt kan replikeres i B. subtilis, må stabile transformanter som er resistente overfor kloramfenikol, være resultatet av integreringen av plasmidet i 8. SuM//s-kromosomet (Ferrari et al., J. Bacteriology, 154:1513-1515 (1983)). Integreringsfenomenet, gjort lettere ved homolog rekombinasjon, skjedde mest sannsynlig enten ved spoVG- eller P43-locuset i det bakterielle kromosom (pSY856 inneholder DNA-sekvenser homologe til B. subtilis-kromosomet ved bare disse to seter). Den resulterende stamme, "BIPoL", ble dyrket både i nærvær og fravær av kloramfenikol for bestemmelse av stabiliteten hos den utvelgbare markør. Ekspresjon av T7-polymerasen ble oppnådd, og dette har ingen synlig virkning på veksten eller levedyktigheten hos denne stamme. 9.a. Ekspresjon av et plasmidbåret mål-gen (kanamycin-resistens) i B. subtilis-stamme BIPoL: Staphylococcus aureus-plasmidet pUB110 (Lacey et al., J. Med. Microbiology, 7:285-297, 1974) som inneholder det gen som koder for resistens overfor antibiotikumet kanamycin, ble anvendt for utprøvning av ekspresjonen hos det vekstregulerte spoVG:T7-RNA-polymerasegen hos stammen BIPoL. Et EcoRI-BamHI-fragment av fag-T7-DNA (stilling 21 402 - 22 858 inneholdende T7-gen-9-aktivatorsekvensen ble renset fra plasmid pAR441 (Studier et al., 1986). Dette DNA-fragment ble ligert i pUB110 mellom EcoRI- og BamHI-restriksjons-endonuklease-setene. Det resulterende plasmid, pSY952, inneholder den T7-spesifikke aktivator i den samme orientering som kanamycin-resistensgenet. Plasmid pSY952 ble transformert til B. subtilis 1168 og BIPoL, og disse stammer ble analysert med hensyn til nivået av ekspresjon av polypeptidet kodet for ved det plasmid-avledede kanamycin-resistensgen. Omtrent 10<9> celler fra voksende kulturer av 1168,1168 som inneholdt pUB110,1168 som inneholdt pSY952, BIPoL, BiPoL som inneholdt pUB110 og BIPoL som inneholdt pSY952, ble oppnådd ved flere tidspunkter under vekst- og sporedannelses-syklusen. Proteinene i disse celleprøver ble bear-beidet og analysert ved polyakrylamidgel-elektroforese.

På grunn av at transkripsjonshastigheten fra spoVG-aktivatoren øker som en funksjon av celledensiteten og når et maksimum under tidlig sporedannelse, er det ventet en akselerert opphopning av mål-proteinet i BiPoL-stammen som inneholder pSY952 under veksten etter hvert som kulturen kommer inn i spore-dannelsen. Resultatene viser at et protein med molekylvekt 34 kilodalton øker i tallrikhet etter hvert som kulturen nærmer seg og kommer inn i stasjonær fase.

Størrelsen av proteinet er i overensstemmelse med den forutsette størrelse av kanamycin-resistensgenproduktet (Sadaie et al., J. Bacteriology, 141:1178-1182

(1980)) kodet for i pSY952. Dette protein er ikke til-stede i B1 PoL eller 1168 inneholdende pSY952 som mangler det spoVG-regulerte T7-RNA-polymerasegen eller i B1 PoL inneholdende pUB110, som mangler T7-aktivatorsekvensen. Det maksimalt opphopede nivå av målprotein etter 24 timers vekst i BIPoL som inneholdt pSY952, var 20% av det totale cellulære protein, som bestemt ved densitometri.

9.b. Ekspresjon av Slpl-4- i B. subtilis:

Plasmid pGIOSIpl ble nedbrutt med EcoRI-REN. Etter utfylling av de kohesive ender under anvendelse av Klenow-DNA-polymerasereaksjonen, ble DNA nedbrutt med Bg1 ll-REN. Plasmid pSY662 ble nedbrutt med Smal- og BamHI-REN. De to plasmidene ble deretter renset ved elektroforese gjennom en agarosegel med lav smeltetemperatur og renset med NACS-(BRL)-kolonner. DNA-fragmentet pGIOSIpl ble ligert til pSY662-skjelettet og trans-formert til E. coli som inneholdt ampicillin (40 ug/ml). Transformanter ble analysert med hensyn til plasmidinnhold, og én (pSY662/G10/Slpl-4) ble utvalgt for ytterligere undersøkelse.

Kompetente celler av B. subtilis BIPol ble transformert med pSY662/G10/- Slpl-4 og inkubert ved 37°C med risting i 90 minutter. Transformasjonsblandingen ble deretter fortynnet 1:100 i friskt LB som inneholdt 10 ug tetracyklin pr. ml, og inkubert ved 37°C med risting. Prøver ble uttatt og like antall celler ble lysert og påsatt på geler for separasjon ved hjelp av SDS-PAGE. Immunoblot-analyse ble utført under anvendelse av anti-Slp-antistoffer for påvisning av syntesen av gen-10/Slpl-4-fusjonsproteinet.

Ekspresjonen av Slpl-4-polypeptidet i B. subtilis ble påvist ved sin serore-aktivitet med anti-Slp-antistoff, etter overføring av de cellulære proteiner fra polyakrylamidgelen til et nitrocellulosefilter. Vi beviste at det seroreaktive protein var produktet av Slpl-4-genet ved inngående behandling av de cellulære proteiner med CNBr. Dette skulle spalte etter metionin-rester, men siden Slpl-4 mangler metionin, vil det forbli uberørt. CNBr-behandlingen utelukket mer enn 98% av proteinene som kunne farges med fargestoffet Coomassie-blått. Og som ventet for et protein uten metionin, forble Slpl-4 uberørt og reagerte likevel med anti-Slp-serum.

Eksempel 3

Sammensetting og ekspresjon av Slplll-genet

1. Oppsummering av skjemaet for sammensetting av Slplll-genet:

Det syntetiske Slplll-gen koder for et protein likt Slpl-genet og det krystallinske område hos silkefibroinproteinet dannet av silkeormen, Bombyx Mori. Sipl 11 likner mer silke-fibroinmolekylet fordi det innbefatter aminosyren tyrosin ved regelmessige mellomrom (ca. 50 rester), mens multimerer av Sipl ikke gjør det. Slplll-genet ble sammensatt av mindre deler. For det første ble tre dobbeltkjedede seksjoner av DNA med en lengde på ca. 60 bp kjemisk syntetisert. Hver seksjon ble klonet ved innskyting i bakteriofag M13, og DNA-sekvensen ble påvist. Disse seksjoner ble deretter fjernet fra vektoren og knyttet sammen i en spesifikk rekkefølge. Denne sammenknytning på ca. 180 bp kalles Slplll-"monomeren". "Monomerer" ble der-etter knyttet sammen i en spesifikk rekkefølge under oppnåelse av dimerer, trimerer, tetramerer o.s.v. av SiplII. Multimerene ble så klonet enten direkte i plasmid-ekspresjonsvektorer for påvisning av Slplll-proteinet eller i begynnelsen i et adapter-plasmid. Innføring av Slplll-DNA i adapteren muliggjør ytterligere genmanipulering og er beskrevet ytterligere senere. Sammensetningsskjemaet er skissert som følger:

Syntese av dobbeltkjedede DNA-seksjoner -

DNA og tilsvarende aminosyresekvenser hos de tre seksjoner av Slplll-genet er vist i Tabell 3.

Den dobbeltkjedede DNA-sekvens er vist i 5'- og 3-retningen. Aminosyrene (g = glycin, a = alanin, s = serin, y = tyrosin) kodet for ved sekvensen, er vist like nedenfor hver seksjon. Gjenkjennelsessekvenser for spaltning ved restriksjons-endonukleaser er vist over hver seksjon.

De ovenstående seks enkeltkjeder ble syntetisert. Etter syntesen ble DNA-kjedene renset og de homologe kjeder ble koplet. Ca. 1 ul (0,5 ug) av hvert kjede ble blandet med 2 ul 10X AA-(deskripsjons)-buffer og 16 ul sterilisert avionisert H20 i et 1,5 ml Eppendorf-polypropylenrør. Røret ble anbrakt i et kokende vannbad (500 ml i et 1-liters beger) i 10 minutter, og deretter ble begeret fjernet fra den varme plate og fikk avkjøles på benken til romtemperatur. Dette tok ca. 1-2 timer.

Hver av de tre dobbeltkjedede seksjoner ble klonet atskilt i M13mp18. Seksjon 1 ble ligert mellom Smal- og BamHi-restrik-sjonssetene hos multippel-kloningssetet. Seksjon 2 ble ligert mellom BamHI- og Pstl-setene. Og seksjon 3 ble innskutt mellom Pstl- og Hindlll-setet. De respektive kloner er: M13mp18.1, M13mp18.2, M13mp18.3. DNA-sekvensen ble bestemt for hver klonet seksjon. Én representant for hver seksjon som hadde den riktige DNA-sekvens, ble gjenvunnet og ble materialet for det neste trinn: sammensetting av "monomeren".

3. Sammensetting av "monomeren" av Sipl 11:

DNA-seksjonene 2 og 3 ble isolert ved nedbrytning av M13-klonene med restriksjonsenzymer: når det gjaldt seksjon 2, ble M13mp18.2 nedbrutt med BamHI og Pst1; når det gjaldt seksjon 3, bleM13mp18.3 nedbrutt med Pst1 og Hindlll. De to seksjoner ble renset og blandet sammen i like molare mengder med M13mp18.1 som først var blitt nedbrutt med BamHI og Hindlll. T4-DNA-ligase ble tilsatt for å knytte sammen de homologe overlappende ender i rekkefølgen 1-2-3. På grunn av hybridiserings-spesifisiteten hos de kohesive ender, sammenknyttes de tre seksjoner effektivt bare i denne rekkefølge. DNA-sekvensen hos den klonede "monomer" i sammensetningen kalt M13mp18.1.2.3 ble bestemt å

være riktig og som vist under 2 ovenfor.

4. Multimerisering av "monomeren" av Slplll:

For fremstilling av store mengder av det strukturelle "monomer"-gen, subklonet vi først "monomeren" i plasmidvektoren pUC12. M13mp18.1.2.3 ble nedbrutt med EcoRI- og Hindlll-rest-riksjonsenzymer. Slplll-"monomeren" ble gelrenset og ligert i pUC12 nedbrutt med EcoRI og Hindlll. Den resulterende plasmid-DNA ble fremstilt, "monomeren" ble frigjort fra vektoren ved nedbrytning med Banl-REN og fragmentet ble gel-renset.

For dannelse av multimerer ble "monomer"-DNA med Banl-ender sammenknyttet ved ligering. Den ikke-palindromiske terminale Banl-gjenkjennelsessekvens muliggjør sammenknytning bare i en hode-til-hale-rekkefølge. Omfanget av multimeriseringen kontrolleres ved gel-elektroforese og farging av DNA med etidiumbromid. Multimerer med mer enn 20 enheter er oppnådd ved denne fremgangsmåte.

5. Kloning av multimerene av Slplll:

Plasmid pCQV2 (Queen et al., J. Appl. Mol. Gen., 2:1-10 (1983)) ble nedbrutt med EcoRI- og BamHI-restriksjonsendonukleaser, og et fragment på ca. 900 bp ble renset. Dette DNA-fragment inneholder bakteriofag-lambda-cl-857-repressorgenet, den nært sammenknyttede høyre-aktivator, PR, og begynnelsen av cro-genet. Plasmid pSY335 (beskrevet som pJF751 i Ferrari et al., J. Bacteriology, 161:556-562 (1985)) ble nedbrutt med EcoRI- og BamHI-restriksjonsenzymer og deretter ligert til DNA-fragmentet på ca. 900 bp hos pCQV2. Det plasmid man fikk fra denne konstruksjon, pSY751, uttrykker p-galaktosidasegenet ved 37°C og 42°C, men ikke ved 30°C (Fig. 8).

Ved denne fremgangsmåte klones først Slplll-genet i en "adapter"-sekvens i et mellom-plasmid og subklones deretter til ekspresjonssystemene. Adapter-sekvensen har de følgende nyttige karaktertrekk: et unikt sentralt Banl-REN-sete, tre unike REN-seter til hver side av Banl, informasjonskoding for proteinspaltning ved enten metionin-, aspartat-prolin- eller arginin-aminosyrene og liten størrelse. Banl-setet er innføringspunktet for Slplll-multimerene med Banl-ender.

Adapteren ble syntetisert med synteseapparatet av typen Applied Biosystems 380A, klonet i M13mp18 og DNA-sekvensen påvist. Adapteren ble deretter subklonet i en spesielt konsruert plasmidvektor som manglet Banl-REN-seter. Mottaker-plasmidet ble fremstilt som følger. Plasmid pJH101 (Ferrari et al., 1983) ble delvis nedbrutt med Ahalll-restriksjonsenzym og ligert på nytt. Transformanter av E. coli HB101 ble utvalgt på medium som inneholdt kloramfenikol (12,5 mg/ml). Etter restriksjonsanalyse av flere isolater ble ett plasmid utvalgt, pSY325 (Fig. 7). Dette plasmid inneholder bare kloramfenikol-resistens-genet og replikasjonsopprinnelsen (fra pBR322) pJH101. Etter fullstendig nedbrytning med Xholl, ble pSY325 ligert med den gel-rensede adapter. Resultatet var adapter-plasmidet, pSY937, og dets nye REN-seter ble påvist.

Slplll-multimerene ble klonet i Banl-setet hos pSY937 (Fig. 7). Positive kloner ble identifisert ved kolonihybridisering og med det nedre kjede av seksjon 1 hos Slplll som DNA-proben for hybridisering (probesekvens vist i Tabell 2). Positive kloner ble karakterisert ved gel-elektroforese når det gjaldt størrelsen av den innskutte multimer. Til slutt ble Slplll-sekvensene subklonet under anvendelse av REN-setet i de omgivende adapter-områder til spesifikke punkter på ekspresjonsplasmider.

Slplll-proteinet hadde følgende aminosyresammensetning:

(fm) angir begynnelses-kodonet

Slplll-ekspresjonsvektor

Plasmid-DNA pSY1086 er et pSY937-derivat som inneholder 19 repeterende enheter av Slplll (3,5 kb). Dette plasmid-DNA ble nedbrutt med Nrul og Pvull og fragmentene separert ved agarose-gelelektroforese. Den rensede SiplII-multimer ble deretter klonet i plasmid pSY751 nedbrutt med Pvulll-REN. Flere kloner ble analysert og én (pSY1008) ble utvalgt for anvendelse ved ekspresjonsforsøk og Slplll-rensning.

Ampicillinmedikament-resistensgenet hos pSY1008 ble erstattet med Kanamycin-markøren fra pSY1010 (dannet ved nedbrytning av pSY633 med Dral og Sspl og innskyting av Kan<R> oppnådd ved Hincll-nedbrytning av pUC4K), og det påfølgende plasmid ble kalt pSY1186. Ved fjerning av Slplll-delen av plasmid pSY1186 med Banl ble det dannet et nytt plasmid, pSY1262. Dette plasmid inneholder et unikt Banl-sete som muliggjør direkte ligering av fragmenter som inneholder Banl-ender oppnådd ved polymerisering av monomerer. Dette plasmid er blitt anvendt til dannelse av plasmider som inneholder innskudd for de følgende proteiner: SELP1, 2, 3 og Slp4.

Fremstilling og rensning av Slplll

Cellekultur

E. coli dyrkes i følgende medium:

En over-natten-kultur (500 ml -1 I) som var blitt dyrket ved 30°C, ble anvendt til inokulering av 375 I media som befant seg i en 500 I fermentor. Fermentor-betingelsene innbefatter en takometer-avlesning på 100 rpm, et beholder-mottrykk på 0,35 kg/cm<2> og en luftstrøm på 170 l/min. for opprettholdelse av oppløst 02 med mer enn 50%.

Glukose (1 g/l) og ampicillin (0,05 g/l) ble tilsatt til fermenteringen når kulturen nådde en OD65o på 1,0 og igjen ved 2,0. Når kulturen nådde en OD6so på 2,0, ble temperaturen øket til 42°C i 10 minutter og deretter senket til 38°C i 2 timer.

Kulturen ble deretter nedkjølt til 10°C og cellene ble høstet ved sentrifugering i en kontinuerlig sentrifuge og frosset ved -70°C inntil bearbeidning. Utbytter fra to atskilte fermente-ringer var 7,3 kg og 5,2 kg våtvekt av celler.

Det skal bemerkes at andre medier kan anvendes, og med andre plasmider kan man benytte seg av forskjellige utvelgelsesbetingelser (dvs. erstatning av ampicillin med kanamycin-utvelgelse). Disse betingelser er blitt anvendt ved fermente-ringer i laboratorie-målestokk (10 I volumer).

Cellelysering

Fremgangsmåte 1. Cellene tines og suspenderes til en konsentrasjon på 1 kg våtvekt/6 I i 50 mM Tris-HCI pH 7,0, 1 mM EDTA og knuses ved 2 passeringer gjennom et cellesprengnings-apparat av typen APR Gaulin ved 563 kg/cm<2>. Under denne lyseringsfremgangsmåte holdes cellene kalde med et isbad. Cellelysatet sentrifugeres så ved 26 000 xg med en kontinuerlig sentrifuge, såsom T2-28-rotoren i en kjølesentrifuge av typen Sorvall RC5B drevet ved 4°C. Under disse betingelser kan mer enn 90% av det dannet Slplll finnes i klumpen. Supernatanten inneholder en del produkt som kan gjenvinnes ved NH4S04-utfelling som beskrevet nedenfor. Klumpen ekstraheres med LiBr som beskrevet nedenfor.

Fremgangsmåte 2. Frosne celler tines og suspenderes på nytt til en konsentrasjon på 1 kg våtvekt/6 I i 50 mM Tris-HCI pH 7,0, 10 mM EDTA og 5 mM PMSF for inhibering av proteaseaktiviteten. Cellene omrøres i denne buffer ved romtemperatur i 0,5-2 timer, og deretter tilsettes lysozym til en konsentrasjon på 1 g/l og inkuberingen fortsettes i 20 minutter. (3-Merkaptoetanol tilsettes deretter til 70 mM og detergenten NP40 tilsettes deretter til en endelig konsentrasjon på 1 % i 20 minutter mens cellesuspensjonen omrøres kontinuerlig. Deretter tilsettes MgCI2 til 50 mM fulgt av DNAase i en konsentrasjon på 1 mg/l, og inkuberingen fortsettes ved romtemperatur i 20 minutter. Cellelysatet sentrifugeres så som ved fremgangsmåte 1 ved 26 000 xg i en kontinuerlig sentrifuge, og supernatanten oppsamles og ledes gjennom den kontinuerlige sentrifuge en andre gang ved 26 000 xg. Supernatanten fra denne annen sentrifugering inneholder

<5% av det totale Slplll, men det som er der, kan gjenvinnes med NH4S04 som beskrevet nedenfor. Klumpene som fås ved den første og annen sentrifugering ved 26 000 xg, blandes og ekstraheres med LiBr som beskrevet nedenfor.

Fremgangsmåte 3. Ved denne fremgangsmåte anvendes en stamme av E. coli som inneholder et andre plasmid som koder for T7-fag-lysozymet. Dette plasmid er forenlig med det plasmid som koder for Slplll-genet og medikament-resistensdeterminanten. Stammen dyrkes i det samme medium og under de samme betingelser som ved de første to fremgangsmåter. På grunn av dannelsen av T7-lysozymet inne i cellene, svekkes imidlertid deres cellevegg og de kan lett lyseres ved fullførelsen av fermenteringen ved tilsetning av EDTA til >100 mM og NP40 til en konsentrasjon på 0,5-1,0 volum%. Lysering kan også oppnås ved tilsetning av kloroform (20 ml pr. liter) i fermenteringsbuljongen i stedet for NP40. Alternativt kan cellene oppsamles ved sentrifugering før lysering, suspenderes på nytt til 1 kg våtvekt/6 I i Tris-EDTA som beskrevet under de første to fremgangsmåter og deretter lyseres ved tilsetning av NP40 eller kloroform. Etter cellelysering ved én av fremgangsmåtene, sentrifugeres lysatet i en kontinuerlig rotor ved 26 000 xg som beskrevet under de første to fremgangsmåter. Som ved disse fremgangsmåter anvendes LiBr-ekstraksjon av klumpen og NFUSCvutfelling av supernatanten for gjenvinning av produktet.

Rensning av Slplll

Klumpen som oppnås ved sentrifugering av cellelysatet ved 26 000 xg som beskrevet ovenfor, ekstraheres med et likt volum 9 M LiBr. Saltoppløsningen tilsettes og klumpen suspenderes jevnt ved omrøring ved romtemperatur (RT). Blandingen omrøres i 1 time ved RT etter at en jevn suspensjon er oppnådd. Blandingen sentrifugeres så ved 26 000 xg i en kontinuerlig rotor ved 4°C eller ved RT for dannelse av en klump og en supernatantfraksjon. Supernatanten opp-bevares, og klumpen ekstraheres på nytt med et nytt likt volum av 9 M LiBr som ovenfor. Etter blanding i 1 time, sentrifugeres blandingen ved 26 000 xg, og supernatanten fra denne sentrifugering blandes med supernatanten fra den første LiBr-ekstraksjon og får stå ved 4°C over natten. Ca. 90% av Slplll som finnes i cellelysat-26 OOOxg-klumpen, ekstraheres med LiBr under anvendelse av denne fremgangsmåte.

Etter at LiBr-ekstraktet har stått over natten ved 4°C, dannes det en utfelning som fjernes ved sentrifugering ved 26 000 xg og kastes. Supernatanten anbringes deretter i dialyseposer og dialyseres mot flere skift av dH20 i 2 dager. Etter hvert som LiBr fjernes ved dialyse, utfelles Slplll-produktet i dialyseposene. Utfelningen oppsamles ved sentrifugering og vaskes 2-3 ganger med dH20. Det vaskede sluttprodukt sentrifugeres og tørkes ved frysetørking.

For gjenvinning av Slplll fra 26 000 g-supernatantfraksjonene anvendes NH4S04-utfelling. Fast NH4S04 tilsettes langsomt til prøven som holdes ved 4°C inntil det oppnås 38% metning (231 g/l). Blandingen omrøres så ved 4°C i 2-3 timer. Utfelningen gjenvinnes ved sentrifugering i en kontinuerlig-strømnings-sentrifuge og vaskes 4-5 ganger med et likt volum destillert H20 eller med 0,5% SDS i H20. Etter hver vasking gjenvinnes utfelningen ved kontinuerlig sentrifugering. Klumpen blir stadig hvitere med suksessive vaskinger etter hvert som forurensende protein fjernes. Slplll gjenvinnes som en vasket klump og kan tørkes ved frysetørking.

Trypsinbehandlingstrinn for Slplll

Slplll ble suspendert i 50 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,1 M NaCI-buffer, og ble anbrakt i et vannbad på 37°C, og TPCK-behandlet trypsinoppløsnsing ble blandet i suspensjonen. Den endelige trypsinkonsentrasjon var 0,1 %. Etter 3 timer ble oppløsningen sentrifugert ved 16 000 xg i 15 minutter, klumpen ble vasket først med halvdelen av likt volum av 0,5% SDS i H20, og deretter med destillert vann. Etter hver vasking ble klumpen gjenvunnet ved sentrifugering. Sluttproduktet ble suspendert på nytt i vann og holdt ved 4°C for videre analyse.

Ved trypsinbehandlingen ble Slplll renset til en renhet på 99,4%.

Fysiske målinger av Slplll

Fysiske målinger av de rensede silkeliknende proteiner er blitt sammen-liknet med fysiske målinger av Bombyx mor/-silke for å påvise at de repetitive aminosyrepolymerer fremstilt mikrobiologisk har nøyaktig likhet med egenskapene hos naturlig forekommende polymerer. Fysiske målinger ble utført for å bekrefte modellen av antiparallellkjedefoldet arkoppbygning når det gjaldt de krystallinske områder hos Sombyx-morZ-silkefibroin Marsh, Corey og Pauling, Biochem. Biophys. Acta (1955) 16; Pauling og Corey, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1953) 39:247. Foreløpig analyse av røntgendiffraksjonsmønstre oppnådd ved Slp-filmer svarer til det som er beskrevet av Fraser, MacRai og Steward (1966) (Tabell 4). Sirkulær Dikroisk (CD) og Fourier-transform-infrarød-(FTIR)-spektroskopisk analyse av Slplll er i overensstemmelse med en høy grad av utvidede p- og p-dreiningsoppbygninger. Sammenlikninger av de spektra man fikk fra Slplll med spektraene hos naturlig forekommende silkefibroin i forskjellige løsningsmidler (Isuka og Young, Proe. Nati. Acad. Sei. USA (1966) 55:1175) angir at Slplll i oppløsning består av en blanding av de tilfeldige og høyst ordnede strukturer som sees i silkefibroiner.

Omtalt i Fraser et al., J. Mol. Biol. (1966) 19:580.

Eksempel 4

EBSI-genkonstruksjon:

Seks oligonukleotid-kjeder ble syntetisert og renset som beskrevet tidligere.

Oligonukleotidkjeder (iii), (iv), (v) og (vi) ble koplet og ligert med DNA hos plasmid pBSm13(+) (Stratagene) som var blitt nedbrutt med Hindlll og EcoRI. Produktene av denne ligeringsreaksjon ble transformert til E. co//-stamme JM109. Kolonier av transformanter ble utvalgt med hensyn til resistens overfor ampicillin. Koloniene ble undersøkt med hensyn til sin hybridisering med <32>P-merkede oligonukleotider (iii), (v). Plasmid-DNA fra flere positivt hybridiserende kloner ble renset og sekvensbestemt. To av plasmidene, pSY1292 og pSY1293,

inneholdt sekvensen som er vist for oligonukleotider (iii), (v) og (iv), (vi). Disse sekvenser inneholdt alle nukleotidene som var tilstede i disse syntetiske oligonukleotider, bortsett fra én. Et G:C-basepar manglet ved stilling 7 (iii). Mangelen av dette basepar sperret ett av Banl-setene. For innføring av et andre Banll-sete ved 5'-enden av genfragmentet, ble oligonukleotider (i) og (ii) koplet og ligert med plasmid pBSm13(+) som var blitt nedbrutt med Hindlll og EcoRI. Plasmid-DNA fra koloniene av transformanter som var resistente overfor ampicllin, ble renset. To plasmider, pSY1295 og pSY1296, som kunne nedbrytes med Stul, et unikt sete som fantes i oligonukleotidsekvensen, ble sekvensbestemt. De ble begge vist å inneholde sekvensen vist for oligonukleotider (i) og (ii). Plasmid-DNA fra pSY1292 ble nedbrutt sekvensielt med Hindlll, Sl-nuklease

og EcoRI. Nedbrytningsproduktene ble separert ved elektroforese i en agarosegel, og DNA-fragmentet på ca. 150 basepar ble skåret ut fra gelen. Dette DNA-fragment ble nedbrutt medplasmid-DNA pSY1296 som var blitt nedbrutt med Stul og EcoRI. Produktene av denne ligeringsreaksjon ble transformert til E. coli stamme JM109 og ble utvalgt med hensyn til resistens overfor ampicillin.

Koloniene ble undersøkt med hensyn til hybridisering til <32>P-merket oligonukleotid (v). Plasmid-DNA fra to positivt hybridiserende kloner ble renset og sekvensbestemt. Disse plasmider ble kalt pSY1297 og pSY1298. De inneholdt følgende sekvens:

EBSI-multimer-gen-sammensetning:

Banl-akseptorplasmidet pSY937 ble modifisert for å motta Banll-terminale kohesive DNA-fragmenter. To oligonukleotider ble syntetisert for dette formål.

Oligonukleotidene (vii) og (viii) ble koplet og ligert med plasmid-DNA pSY937, som ble nedbrutt med BamHI. Produktene av denne ligering ble transformert til £. coli stamme JM109, og kolonier ble utvalgt med hensyn til resistens overfor kloramfenikol. Kolonier med transformanter ble undersøkt ved hybri-disering til <32>P-merket oligonukleotid (vii). Plasmid-DNA fra to positivt hybridiserende kloner, pSY1299 og pSY1300, inneholdt sekvensen vist for oligonukleotider (vii) og (viii), bestemt ved DNA-sekvensbestemmelse.

Plasmid-DNA pSY1298 ble nedbrutt med Banll og nedbrytningsfragmentene separert ved agarosegelelektroforese. EBSI-genfrag-mentet, ca. 150 basepar, ble skåret ut og renset ved elektroeluering og etanolutfelling. Ca. 1 ug renset fragment ble selv-ligert for dannelse av multimerer i størrelsesområdet 450-6 000 bp. Produktene av selvligeringen ble deretter ligert med plasmid-DNA pSY1299 som var blitt nedbrutt med Banll. Produktene fra denne ligeringsreaksjon ble transformert til E. coli stamme HB101. Transformanter ble utvalgt med hensyn til resistens overfor kloramfenikol. Plasmid-DNA fra individuelle transformanter ble renset og analysert med hensyn til øket størrelse på grunn av EBSI-multimer-DNA-innskudd. Ti kloner (pSY1240-1249) med innskudd i størrelsesområdet 1,5-4,4 Kbp ble oppnådd.

Ekspresjon av EBSI-multimer-gen:

Én av disse kloner, pSY1248, som inneholdt et 4 Kb EBSI-multimergen, ble klonet på nytt i A.PR-ekspresjonsvektoren, pSY751. Plasmid-DNA fra pSY1248 ble nedbrutt med Nrul og Pvull, separert ved agarosegelelektroforese, og DNA-båndet som svarte til EBSI-multimer-genet, ble skåret ut og renset ved NACS-rensning.

DNA fra plasmid pSY751 ble nedbrutt med Pvull og ligert med Nrul-Pvull-fragmentet fra pSY1248. Produktene fra denne ligering ble transformert til E. coli HB101, og de transformerte celler utvalgt med hensyn til resistens overfor ampicillin. To kloner ble isolert som inneholdt det nye plasmid pSY1280. E. coli-celler som inneholdt pSY1280, ble dyrket ved 30°C til en OD6oo på 0,7 og deretter ble temperaturen øket til 42°C i 1,5 timer. Proteinene fremstilt ved disse celler ble analysert ved SDS-PAGE. De separerte proteiner ble overført til nitrocellulosepapir og påvist ved immunreakttvitet med anti-ELP-kaninserum. Et sterkt reaktivt proteinbånd ble observert med en tilsynelatende molekylvekt på 120 kD.

Ampicillinmedikament-resistensgenet hos pSY1280 ble substituert med Kanamycin-markøren, og det etterfølgende plasmid ble kalt pSY1332. Dette plasmid ble anvendt ved fermentering for rensning av EBSI. (Se Fremgangsmåter).

Rensning av EBSI-protein:

£. co//'-stamme HB101 som inneholdt plasmid pSY1280, ble fermentert i 10

I volum. Cellene ble konsentrert ved filtrering og ytterligere høstet ved sentrifugering. Sammenklumpede celler ble lagret frosset ved -70°C inntil de ble bearbeidet. Frosne celler ble tint på is og suspendert i 4 ml 50 mM Tris-HCI pH 7,0,10 mM EDTA, 5 mM PMSF pr. gram våtvekt av celler. Cellene ble knust ved French-pressing to ganger ved 1 055 kg/cm<2> og deretter avkjølt til 0°C. Det ubearbeidede lysat ble klaret ved sentrifugering ved 26 Kxg i 20 minutter. Supernatantproteinene ble utfelt ved tilsetning av fast ammoniumsulfat til 20% metning (114 g/l). Utfelningen ble oppsamlet ved sentrifugering ved 10Kxg i 10 minutter. Klumpen ble suspendert på nytt i 10 ml H2O og dialysert mot 10 mM Tris pH 8,0, 0,15 M NaCI ved 4°C. Den dialyserte oppløsning ble nedbrutt med 0,1% Trypsin (Sigma) i 1,5 timer ved romtemperatur, og utfelt på nytt med 20% ammoniumsulfat. Det utfelte protein ble suspendert på nytt i H20 og dialysert mot 10 mM Tris pH 7,0, 1 mM EDTA ved 4°C. Proteinrenheten hos denne prøve ble analysert med hensyn til aminosyresammensetning og bestemt til 83%.

Elastiske egenskaper hos EBSI-protein

Det løselige preparat av delvis renset EBSI-protein beskrevet ovenfor ble inkubert ved 37°C i 30 minutter og sentrifugert ved 10 Kxg i 10 minutter ved romtemperatur. Denne behandling bevirket aggregering av EBSI-proteinet, at det ble uløselig og ble sammenklumpet til et gjennomskinnelig faststoff. Faststoffet var motstandsdyktig overfor mekanisk sprengning enten ved Vortex-behandling eller ved bløtgjøring under anvendelse av en glasstav. Faststoffet kunne kuttes med et barberblad til strimler som oppviste høy elastisitetsgrad. De beholdt fullstendig sin form etter gjentatte utvidelser og avspenninger. De motsto komprimering uten noen synlig irreversibel deformasjon av strukturen.

EBSI-rensning

EBSI-prøve (-70% ren) ble dialysert i 50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, pH 8,0, ved 4°oC over natten med ett bufferskift. Hvis utfelling ble observert, ble prøven sentrifugert ved 27 000 xg i 15 minutter ved 4°C. Alle de gjenværende trinn ble utført ved 4°C. Supernatanten ble påført på en DEAE-Sephacel-kolonne som var blitt ekvilibrert med 50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, pH 8,0. Gjennomstrømnings-fraksjonene som inneholdt EBSI, ble oppsamlet og blandet. NaCI ble tilsatt til de blandede fraksjoner fra DEAE-Sephacel-kolonne under frembringelse av en sluttkonsentrasjon på 2 M NaCI i prøven. Uoppløselig materiale ble fjernet ved sentrifugering ved 27 000 xg i 20 minutter. Supernatanten ble deretter påsatt på Fenyl-Sepharosekolonne som var ekvilibrert med 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0, med 2 M NaCI. Kolonnen ble grundig vasket med buffer inntil intet eluerende protein ble påvist ved A2so- Kolonnen ble deretter eluert trinnvis med 50 mM natriumfosfatbuffer, pH 7,0, og til slutt med vann. De EBSI-aktive fraksjoner ble blandet og lagret ved 4°C for ytterligere analyse.

Ved tilføyelse av disse trinn til de tidligere fremgangsmåter ble det oppnådd 100% rent EBSI.

Eksempel 5

ELPI-konstruksjon og -ekspresjon

To oligonukleotidkjeder ble syntetisert og renset som beskrevet under Fremgangsmåteavsnittet.

De to oligonukleotid-kjeder ble koplet og ligert med DNA fra plasmid pBS m13(+) (Stratagene) som var blitt nedbrutt med REN'ene Hindlll og EcoRI.

Produktene fra denne ligeringsreaksjon ble transformert til E. coli stamme JM109. Kolonier av transformanter ble undersøkt med hensyn til hybridisering med <32>P-merket oligonukleotid (i). Plasmid-DNA fra positivt hybridiserende kloner ble renset og sekvensbestemt. Ett plasmid, pSY1287, inneholdt sekvensen vist for oligonukleotider (i) og (ii).

Plasmid-DNA fra pSY1287 ble nedbrutt med Banl-REN og nedbrytningsfragmentene ble separert ved agarosegelelektroforese. ELPI-genfragmentet, ca. 60 bp, ble skåret ut og renset ved NACS-kolonne. Ca. 1 ug renset fragment ble selv-ligert for dannelse av multimerer i størrelsesområdet 300-5000 bp.

Produktene fra selvligeringen ble deretter ligert med plasmid-DNA pSY937 som var blitt nedbrutt med REN Banl. Produktet fra denne ligeringsreaksjon ble transformert til E. coli stamme HB101. Transformanter ble utvalgt med hensyn til resistens overfor kloramfenikol. Plasmid-DNA fra individuelle transformanter ble renset og analysert med hensyn til øket størrelse på grunn av ELPI-multippel-DNA-innskudd. Fire kloner (pSY1388-1391) med innskudd i størrelsesordenen 1-2,5 kbp ble oppnådd. Disse kloner ble klonet på nytt i XPR-ekspresjonsvektoren pSY751. De oppnådde kloner (pSY1392-1395) ble anvendt or ekspresjon av

ELPI.

ELPI-proteinet hadde følgende aminosyresammensetning:

SELP1-genkonstruksjon og -ekspresjon

To oligonukleotid-kjeder ble syntetisert og renset som beskrevet i Fremgangsmåteavsnittet.

Disse oligonukleotidkjeder ble koplet og ligert med plasmid pSY1304 som var blitt nedbrutt med Pstl-REN (pSY1304 er forskjellig fra pSY857 ved at det har en monomer enhet i stedet for den trimere enhet hos pSY857). Plasmid-DNA fra kolonier av transformanter som var resistente overfor kloramfenikol ble renset. Ett plasmid, pSY1365, som var nedbrytbart med REN SnaBI, ble sekvensbestemt og påvist å være riktig.

ELPI-genfragment renset som beskrevet (ELPI-konstruksjon og -ekspresjon) ble behandlet med "Mung"-bønne-nuklease som beskrevet av leverandøren (Stratagene). DNA-fragmentblandingen ble deretter ligert med plasmid-DNA pSY1365, som var blitt nedbrutt sekvensielt med REN Fspl, SnaBI og kalve-intestinalfosfatase. Produktene fra denne ligeringsreaksjon ble transformert til E. coli stamme HB101 og ble utvalgt med hensyn til resistens overfor kloramfenikol. Plasmid-DNA fra individuelle transformanter ble renset og analysert med hensyn til ELPI-monomer-DNA-innskyting. To plasmider, pSY1366 A og B, ble sekvensbestemt. De ble begge vist å inneholde ELPI-DNA-sekvensen i den riktige orientering.

Plasmid-DNA pSY1366 ble nedbrutt med REN Banl, og DNA-fragmentet som inneholdt SELP1-monomeren, ble gel-renset. For dannelse av multimerer ble 1 ug av SELP1-DNA-fragmentet selv-ligert. Det ble oppnådd multimerer i størrelsesområdet 500 bp-10 kbp. SELP1-multimerene ble klonet i Banl-setet hos pSY1262. Positive kloner ble karakterisert ved gel-elektroforese når det gjaldt størrelsen av den innskutte multimer og anvendt for ekspresjon og proteinanalyse.

SELP2-monomerkonstruksjon

Plasmid-DNA pSY1298 ble nedbrutt med Banll-REN, og EBSI-genfragmentet ble renset som tidligere beskrevet. EBSI-monomerfragmentet ble ligert i pSY1304 (pSY937 som inneholdt en monomerav Slplll, konstruert som pSY857) som var blitt nedbrutt med Banll-REN og behandlet med kalveintestinalfosfatase.

Produktene fra ligeringsblandingen ble transformert til E. coli stamme HB101. Transformanter ble valgt med hensyn til resistens overfor kloramfenikol. Etter restriksjonsanalyse av flere isolater ble det valgt ett plasmid, pSY1301, som inneholdt et DNA-fragment svarende til EBSI-monomer-genet.

SELP2-multippelgen-sammensetning og -ekspresjon

Plasmid-DNA pSY1301 ble nedbrutt med REN Banl, og det DNA-fragment som inneholdt SELP2-"monomeren", ble gel-renset. For dannelse av multimerer ble 1 ug av SELP2-DNA-fragmentet selv-ligert. Det ble oppnådd multimerer større enn 12 kb.

SELP2-multimerene ble klonet i Banl-setet hos pSY1262. Positive kloner ble karakterisert ved gel-elektroforese med hensyn til størrelsen av den innskutte multimer. Klonene med innskudd i størrelsesområdet 1,5-11 kg ble utvalgt. Plasmid-DNA pSY1372 som inneholdt et innskudd på 6 kb (18 repeteringer),

ble anvendt for videre analyse og proteinrensning.

SELP2-proteinrensning

£. co//-stamme HB101 som inneholdt plasmid pSY1372, ble fermentert i henhold til fremgangsmåten som er beskrevet under Fremgangsmåter for fermentering. Cellene ble høstet ved sentrifugering. Sammenklumpede celler ble lagret frosset ved -70°C inntil de ble bearbeidet. Frosne celler ble tint på is og suspendert i 4 ml 50 mM Tris-HCI, pH 7,0, 10 mM EDTA, 5 mM PMSF pr. gram våtvekt av cellene, Cellene ble knust ved passering gjennom et cellesprengnings-

apparat av typen Gaulin ved 563 kg/cm<2>. Det ubearbeidede lysat ble klaret ved sentrifugering ved 26 000 xg i 20 minutter. Supernatanten, som inneholdt >75% av SELP2-proteinet, ble utfelt ved tilsetning av 20% ammonium-sulfat (114 g/l). Utfelningen ble oppsamlet ved sentrifugering ved 10 000 xg i 10 minutter. Klumpen ble suspendert på nytt i 10 ml H20 og dialysert mot 10 mM Tris pH 8,0, 0,15 M NaCI ved 4°C. Det dialyserte materiale ble sentrifugert ved 26 000 xg i 15 minutter for oppsamling av den uoppløselige fraksjon av protein som inneholdt ca. 10% av SELP2-proteinet. Denne uoppløselige proteinklump ble vasket to ganger i 0,2% SDS ved 50°C i 30 minutter med risting en gang imellom. Det uoppløselige protein ble oppsamlet hver gang ved sentrifugering ved 26 000 xg i 15 minutter fulgt av en vasking med 50% etanol. Den endelige pro-teinklump ble suspendert på nytt i vann og analysert ved "Western blot"-analyse og aminosyresammensetning. Ved Western blot viser SELP2-proteinet seg å være homogent i størrelse svarende til dets store molekylvekt (>150 kd). Ved aminosyresammensetningen er SELP2-preparatet omtrent 80% rent og det observerte molare forhold mellom aminosyrene (Ser:Gly:Ala:Pro:Val:Tyr) samsvarer meget godt med den forventede sammensetning som forutsett ved SELP2-sekvensen i pSY1372.

SELP3-konstruksjon og -ekspresjon

Plasmid-DNA pSY1301 ble delvis nedbrutt med REN Haell og nedbrytningsfragmentene separert ved agarosegel-elektroforese. De større DNA-fragmenter ble skåret ut og renset ved hjelp av NACS-kolonne. De rensede fragmenter ble selv-ligert, ligeringsreaksjonen ble oppvarmet ved 70°C i 15 minutter for inaktivering av T4-DNA-ligasen og til slutt nedbrutt med REN Pstl. Nedbrytningsblandingen ble deretter transformert til E. co//-stamme JM109. Transformanter ble utvalgt med hensyn til resistens overfor kloramfenikol. Plasmid-DNA fra individuelle transformanter ble renset og analysert med hensyn til: (1) resistens overfor REN Pstl, og (2) utslettelse av 60 pb Heall-fragment som fantes i SELP2-genfragmentet. Én klon (pSY1377) tilfredsstilte begge fordringer. Plasmid-DNA pSY1377 ble nedbrutt med REN Banl, og DNA-fragmentet som inneholdt SELP3-monomeren, ble gel-renset. For dannelse av multimerer ble 1 ug av SELP3-DNA-fragmentet selv-ligert. Det ble oppnådd multimerer i størrelses-ordenen 500 bp-10 kbp. SELP3-multimerene ble klonet inn i Banl-setet hos pSY1262. Positive kloner ble bestemt ved gel-elektroforese med hensyn til størrelsen av den innskutte multimer og anvendt for ekspresjon og proteinanalyse.

SLP4-konstruksjon og -ekspresjon

Plasmid-DNA pSY1304 (pSY857 med en enkelt monomer enhet i motsetning til den trimere enhet hos pSY857) ble delvis nedbrutt med REN Haell og nedbrytningsfragmentene separert ved agarosegel-elektroforese. De større DNA-fragmenter ble skåret ut og renset ved hjelp av NACS-kolonne. De rensede fragmenter ble selv-ligert, ligeringsreaksjonen ble oppvarmet ved 70°C i 15 minutter under inaktivering av T4-DNA-ligasen og til slutt nedbrutt med REN Pstl. Nedbrytningsblandingen ble deretter transformert til E.co//-stamme JM109. Transformanter ble utvalgt med hensyn til resistens overfor kloramfenikol. Plasmid-DNA fra individuelle transformanter ble renset og analysert med hensyn til: (1) resistens overfor REN Pstl og (2) utslettelse av 60 bp Haell-fragment som fantes i SELP2-genfragmentet. Én klon (pSY1378) tilfredsstilte begge fordringer. Plasmid-DNA pSY1378 ble nedbrutt med REN Banl, og DNA-fragmentet som inneholdt SLP4-monomeren, ble gel-renset. For dannelse av multimerer ble 1 ug SLP4-DNA selv-ligert. Det ble oppnådd multimerer i størrelsesordenen 300 bp - 6 kbp. SLP4-multimerene ble klonet inn i Banl-setet hos pSY1262. Positive kloner ble bestemt ved gel-elektroforese med hensyn til størrelsen av den innførte multimer og anvendt for ekspresjon og proteinanalyse.

Som det fremgår av ovennevnte resultater, kan høyst repetitive sekvenser fremstilles, klones og anvendes for ekspresjon under dannelse av mange

forskjellige produkter som kan etterlikne naturlige produkter, såsom silke og andre proteiner og antigener. Dessuten er det tilveiebrakt nye systemer for regulering av ekspresjonen av peptidet under induserbare betingelser hos forskjellige verter. På denne måte kan nye proteinholdige produkter tilveiebringes som tilveiebringer nye egenskaper eller kan ha stor likhet med egenskapene hos naturlig forekommende produkter.

Bibliografi

1. Maniatis, T., Fritsch, E.F. and Sambrook, J. 1982. -Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

NY.

2. Laemmli, U.K. 1970. Nature (London), 227;680-685. 3. Applied Biosystems User Bulletin. 1984. No. 13* 4. Matteucci, M.D. and Caruthers, M.H. 1981. ;Journal Amer. Chem. Soc, 103i31&5-3319. 5. -McBride, L.J. and Caruthers, M.H. 1933* Tetrahedron Letters, 24:245-248. 6. Smith, 1980. Methods in Enzymology, 65:371-379. 7. Vieira, J. and Messing, J. 1982. Gene, 19t259-268. 8. Anagnostopouls, C. and Spizizen, J. 1981. J.

Bacteriol., 81741-746.

9. Davanloo, P., Rosenberg, A.H. Dunn, J.J. and Studier, F.W. 1984. Proe. Nati. Acad. Soi. USA, 8J_: 2035-2039. 10. Rosenbluh, A., Banner, C.D.B., Losiek, R. and Fitz-James, P.C. 1981. J. Bacteriol., 148;34l-351 . 11. Sadaie, Y., Burtia, K.C. and Doi.R. 1980. J. Bacteriol., 1JH_:1178-1182. 12. Queen, C. 1983. J. Applied Molecular Genettes, 2_:1-10. 13. Ferrari-, F.A., Trach, K. and Hoch, J.A. 1985. J. Bacteriol.. 161 :556-562." 14. Johnson, W.C., Moran, CP. and Loaick, T.R. 1983. Nature (London), 302:800-804. 15. Studier, W.F. and Moffat, B.A. 1986. J. Mol. • Biol., 189:113-130. 16. Goldfarb, D.S., Doi, R.H. and Rodriguez, R.L. 1981. Nature (London), 293:309-311. 17. Ferrari, F.A., Nguyen, A., Lang, D. and Hoch, J.A. 1983. J. Bacteriol., 154:1513-1515. 18. Lacey, R.W. and Chopra, I. 1974. J. Med. Microbiology. £-.285-297. 19. Norrander, J., Kempe, T. and Messing, J. 1983. Gene, 26:101-106 20. Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. 1977. Proe. Nati. Acad. Sci. PSA. 74:5463-5467. 21. Biggin, M.D., Gibson, T.J. and Hong, G.F. 1983.

Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 80:3963-3965.

22. Zagursky, R.J., Bauoeister, K., Lotnax, N. and Berman, M.L. 1985. Gene Anal. Techn.. j2:89-94. 23. Sanger, F. and Coulson, A.R. 1978. FEBS Letters, 87:107-110.

24. Sadler, J.R., Techlenburg, M. and J. L. Betz.

1980. Plasmids containing many tandem copies of a synthetic lactose operator. Gene 8.:279-300.

Alle publikasjoner og patentsøknader nevnt i denne beskrivelse viser kunnskapsnivået hos fagfolk på det område som denne oppfinnelse gjelder. Alle publikasjoner og patentsøknader er i det foreliggende medtatt som referanse i det samme omfang som om hver individuell publikasjon eller patentsøknad var spesifikt og individuelt angitt å være medtatt som referanse.

Idet oppfinnelsen nå er beskrevet fullstendig, vil det være klart for en vanlig fagmann på området at det kan gjøres mange forandringer og modifikasjoner ved den uten at man avviker fra de tilknyttede kravs idé eller ramme.

Claims

1. DNA-sekvens som koder et peptid inneholdende en repeterende oligopeptid-enhet hvor den repeterende enheten karakteriseres ved at den inneholder minst tre ulike aminosyrer og totalt fra 4 til 30 aminosyrer, at peptidet inneholder minst to repeterende enheter og minst to identiske aminosyrer i hver repeterende enhet og i hvilken enhetene eventuelt er forbundet med en aminosyrebro med fra ca. 1 til 15 aminosyrer, hvor DNA-sekvensen har følgende formel: i hvilken: K og L begge utgjøres av DNA-sekvenser som koder en aminosyresekvens inneholdende 1 til 100 aminosyrer, hvor K og L utgjør mindre enn ca. 20% av aminosyrenes totale antall; k og I utgjøres av 0 eller 1; W utgjøres av følgende formel: A utgjøres av en DNA-sekvens som koder den repeterende oligopeptidenheten i hvilken A inneholder ca. 12-90 nukleotider hvor minst to kodoner koder den identiske aminosyren i de repeterende enhetene som er forskjellige hvorved det finnes minst to ulike A'er som skiller seg fra hverandre med hensyn til minst ett nukleotid; B utgjøres av en DNA-sekvens som er forskjellig fra A og som koder en annen oligopeptidenhet enn den som kodes av A og som inneholder ca. 3-45 nukleotider hvor B's enheter kan være like eller forskjellige; n utgjøres av et helt tall i intervallet 1-100; hver p er selvstendig 0 eller 1; og q utgøres av minst 1 og velges slik at en DNA-sekvens med minst 90 nukleotider oppstår; M og N er like eller forskjellige og utgjøres av kodonenes DNA-sekvens og utgjøres av 0-18 nukleotider i leseramme med respektive W og X; X er lik eller forskjellig fra W og er av følgende formel: Y er lik eller forskjellig fra W og er av følgende formel: i hvilken: alle symboler utledes av definisjonen for deres bokstavpar; x og y utgjøres av 0 eller 1; i utgjøres av 1-100; og totalsummen for q, q<1> og q2 utgjøres av minst 1 og ikke mer enn ca. 50; og at massen av polypeptidet som kodes av sekvensen er minst ca. 10 kDal.

2. DNA-sekvens som koder et peptid inneholdende en repeterende oligopeptidenhet hvor den repeterende enheten karakteriseres ved at den omfatter aminosyresekvensen GAGAGS eller GVGVP hvor DNA-sekvensen utgjøres av følgende formel: i hvilken: A utgjøres av en DNA-sekvens som koder den repeterende oligonukleotidenheten hvor kodonene for minst to G'er i samme eller ulike A'er er forskjellige, hvorved det eksisterer minst to ulike A'er som skiller seg fra hverandre med hensyn til minst ett nukleotid; B utgjøres av en DNA-sekvens som skiller seg fra A og som koder en annen oligopeptidenhet enn den som kodes av A-enheten og som innbefatter ca. 3-45 nukleotider hvorved B-enhetene kan være like eller forskjellige; n utgjøres av et helt tall i intervallet 5-25; hver p utgjøres selvstendig av 0 eller 1; og q er minst 1 og velges slik at en DNA-sekvens innbefattende minst 90 nukleotider oppstår; og massen av polypeptid som kodes av sekvensen er minst ca. 10 kDal.

3. DNA-sekvens i henhold til patentkrav 2, karakterisert ved at oligonukleotidenheten utgjøres av GAGAGS og B innebefatter et kodon for tyrosin.

4. DNA-sekvens i henhold til patentkrav 2, karakterisert ved at A utgjøres av følgende formel:

5. DNA-sekvens i henhold til patentkrav 3, karakterisert ved at A inneholder følgende sekvens:

6. DNA-sekvens i henhold til patentkrav 2, karakterisert ved at oligopeptidet ugjøres av GVGVP.

7. DNA-sekvens i enhold til patentkrav 6, karakterisert ved at en A ugjøres av følgende formel:

8. Polypeptid som omfatter ekspresjonsprodukt av rekombinasjons-DNA'et av en DNA-sekvens som koder et peptid med repeterende oligopeptidenheter hvor oligopeptidet karakteriseres ved at det omfatter minst tre ulike aminosyrer og totalt 4-30 aminosyrer hvor peptidet innbefatter minst to repeterende enheter og minst to identiske aminosyrer i hver repeterende enhet, hvorved enhetene eventuelt er forenet med en aminosyrebro med ca. 1-15 aminosyrer hvor DNA-sekvensen utgjøres av følgende formel: i hvilken: K og L begge utgjøres av DNA-sekvenser som koder en aminosyresekvens med ca. 1 til 100 aminosyrer, hvorved K og L utgjør mindre enn ca. 20% av aminosyrenes totale antall; k og I utgjøres av 0 eller 1; W utgjøres av følgende formel: A utgjøres av en DNA-sekvens som koder den repeterende oligopeptidenheten i hvilken A innbefatter ca. 12-90 nukleotider, hvorved minst to kodoner koder de identiske aminosyrene i de repeterende enhetene som er forskjellige, hvorved minst to forskjellige A'er eksisterer som skiller seg fra hverandre med hensyn til minst ett nukleotid; B utgjøres av en DNA-sekvens som skiller seg fra A og som koder en annen oligopeptidenhet enn den oligopeptidenheten som kodes av A-enheten og som innbefatter ca. 3-45 nukleotider, hvorved B-enhetene kan være like eller forskjellige; n utgjøres av et helt tall i intervallet 1-100; hver p er selvstendig 0 eller 1; og q er minst 1 og velges slik at en DNA-sekvens med minst 90 nukleotider oppstår; og massen av polypeptidet er minst ca. 10 kDal.

9. Polypeptid i henhold til patentkrav 8, karakterisert ved at polypeptidet innbefatter som repeterende enhet minst den ene av GAGAGS og GVGVP.

10. Peptid som omfatter et ekspresjonsprodukt av rekombinasjons-DNA'et fra en DNA-sekvens som koder et peptid som inneholder et oligopeptid som repeterende enhet, karakterisert ved at den omfatter minst tre ulike aminosyrer og totalt 4-30 aminosyrer hvorved peptidet omfatter minst to repeterende enheter og minst to identiske aminosyrer i hver repeterende enhet, hvorved enhetene eventuelt er forenet med en aminosyrebro, hvorved inngår ca. 1-15 aminosyrer, hvorved DNA-sekvensen har følgende formel: i hvilken: K og L er begge DNA-sekvenser som koder en aminosyresekvens med ca.

1 til 100 aminosyrer, hvorved K og L utgjør mindre enn ca. 20% av aminosyrenes totale antall; k og I utgjøres av 0 eller 1; A utgjøres av en DNA-sekvens som koder den repeterende oligopeptidenheten i hvilken A innbefatter ca. 12-90 nukleotider, hvorved minst to kodoner koder identiske aminosyrer i den repeterende enheten som er forskjellig, hvorved det eksisterer minst to ulike A'er som skiller seg fra hverandre med hensyn til minst ett nukleotid; B utgjøres av en DNA-sekvens som skiller seg fra A og som koder en annen enn den oligopeptidenheten som kodes av A-enheten og som innbefatter ca. 3-45 nukleotider, hvorved B-enhetene kan være like eller forskjellige; n utgjøres av et helt tall i intervallet 1-100; hver p er selvstendig 0 eller 1; og q er minst 1 og velges slik at en DNA-sekvens med minst 90 nukleotider oppstår; og massen av polypeptidet er minst ca. 10 kDal.

11. Polypeptid i henhold til patentkrav 10, karakterisert ved at A koder GAGAGS eller GVGVP.

12. Prokaryot vert, karakterisert ved at den omfatter en DNA-sekvens i henhold til patentkrav 1.

13. Fremgangsmåte for fremstilling av et peptid som omfatter rekombinant-DNA-ekspresjonsprodukt av en DNA-sekvens som koder et peptid med repeterende oligonukleotidenheter, hvilket oligopeptid karakteriseres ved at det omfatter minst tre ulike aminosyrer og totalt 4-30 aminosyrer og at nevnte peptid omfatter minst to repeterende enheter og minst to identiske aminosyrer i hver repeterende enhet og i hvilken enhetene eventuelt er forenet med en aminosyrebro med ca. 1-15 aminosyrer, hvorved nevnte DNA-sekvens har følgende formel: i hvilken: K og L begge utgjøres av DNA-sekvenser som koder en aminosyresekvens omfattende 1 til 100 aminosyrer, hvorved K og L innbefatter mindre enn ca. 20% av det totale antallet aminosyrenes; k og I er 0 eller 1; W utgjøres av følgende formel: A utgjøres av en DNA-sekvens som koder de repeterende oligopeptid-enhetene i hvilke A omfatter ca. 12-90 nukleotider, hvorved minst to kodoner koder de identiske aminosyrene i den repeterende enheten som er forskjellig, hvorved det eksisterer minst to ulike A'er som skiller seg fra hverandre med hensyn til minst ett nukleotid; B utgjøres av en DNA-sekvens som skiller seg fra A og som koder en annen enn den oligopeptidenhet som kodes av A-enheten og som omfatter ca. 3-45 nukleotider hvorved B-enhetene kan være like eller forskjellige; n utgjøres av et helt tall i intervallet 1-100; hver p er selvstendig 0 eller 1; og q er minst 1 og velges slik at en DNA-sekvens med minst 90 nukleotider oppstår; M og N er like eller forskjellige og utgjøres av en DNA-sekvens av kodoner og utgjøres av 0-18 nukleotider i leseramme med respektive W og X hvorved de koder en aminosyresekvens; X er lik eller forskjellig fra W og har følgende formel: Y er lik eller forskjellig fra W og har følgende formel: i hvilken: alle symboler følger definisjonene for bokstavparene; x og y er 0 eller 1; i utgjøres av 1-100; og totalsummen av q, q<1> og q2 er minst 1 og ikke større enn ca. 50; og massen av polypeptidet som kodes av sekvensen er minst ca. 10 kDal; hvorved fremgangsmåten omfatter; dyrking av en prokaryot vert i henhold til patentkrav 12, i hvilket DNA-sekvensen befinner seg under transkripsjonen og translasjonen regulering av initierings- og termineringsreguleringsregionene funksjonelle i verten; og isolering av ekspresjonsproduktet.

14. Fremgangsmåte i henhold til patentkrav 13, karakterisert ved at peptidet omfatter minst en av de repeterende enhetene GAGAGS og GVGVP.