NO303544B1

NO303544B1 - FremgangsmÕte for fremstilling av et polypeptid med Ún eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskaper til granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF)

Info

Publication number: NO303544B1
Application number: NO871679A
Authority: NO
Inventors: Lawrence M Souza
Original assignee: Kirin Amgen Inc
Priority date: 1985-08-23
Filing date: 1987-04-22
Publication date: 1998-07-27
Also published as: SA92130186B1; CN1020924C; CA1341537C; DE3650788D1; EP0237545A4; NO20032250D0; JP2660179B2; JPH042599B2; JPH08231412A; PT83242B; FI110576B; FI20010334L; NO871679D0; NO982132D0; SG35892G; JPH0231675A; PT83242A; WO1987001132A1; IL79805A0; SG48964A1

Description

Bakgrunn

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte

for fremstilling av et polypeptid med én eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskapene til naturlig forekommende granulocyttkolonistimulerende faktor (hpG-CSF) med flere forskjellige virkninger, fragmenter og polypeptidanaloger derav.

Det humane bloddannende (hematopoietiske) system er-statter forskjellige hvite blodlegemer (deriblant neutrofiler, makrofager og basofiler/mast-celler), røde blodlegemer (erythrocytter) og klump-dannende celler (megakaryocyter/blodplater). Det bloddannende system hos det gjennomsnittlige menneske av hankjønn er blitt anslått å produsere i størrelsesorden 4,5 x 10^ granulocytter og eryhtrocytter hvert år, noe som er ekvivalent med en årlig erstatning av den samlede kropps-vekt. Dexter et al., BioEssays, 2, 154-158 (1985).

Det antas at små mengder av bestemte vekstfaktorer for bloddannelse er ansvarlig for differensieringen av et lite antall forløper-"stamceller" til de forskjellige blodcelle-linjene, for den voldsomme formeringen av disse linjene, og for den endelige differensiering av ferdig utviklede blod-celler fra disse linjene. Ettersom vekstfaktorene for bloddannelse er tilstede i svært små mengder, har påvisningen og identifikasjonen av disse faktorene vært basert på en lang rekke prøver som hittil bare skjelner mellom de forskjellige faktorer på grunnlag av stimulerende virkninger på dyrkede celler under kunstige betingelser. Som et resultat av dette, har et stort antall navn blitt laget for å betegne et mye mindre antall faktorer. Som et eksempel på den resulterende forvirring, er uttrykkene IL-3, BPA, multi-CSF, HCGF, MCGF

og PSF alle kortord som nå antas å gjelde for en enkelt murin vekstfaktor for bloddannelse. Metcalf, Science, 229, 16-22,

(1985). Se også Burgess et al., J. Biol. Chem., 252, 1988

<5>(1977), Das et al., Blood, 58, 600 (1980), Ihle et al.,

J. Immunol., 129, 2431 (1982), Nicola et al., J. Biol. Chem., 258, 9017 (1983), Metcalf et al., Int. J. Cancer, 30, 773,

(1982) og Burgess et al., Int. J. Cancer, 26, 647 (1980),

som vedrører forskjellige murine vekstregulerende glycoproteiner.

Anvendelsen av rekombinante genetiske teknikker har bragt en viss orden i dette kaoset. F.eks. har man oppnådd aminosyre- og DNA-sekvensene for human erythropoietin som stimulerer produksjonen av erythrocytter. (Se Lin, PCT publisert søknad nr. 85/02610, publisert 20. juni 1985). Rekombinante metoder er også blitt anvendt for isolering av cDNA

for en human granulocytt-makrofag-kolonistimulerende faktor.

Se Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 4360-4364

(1985) og Wong et al., Science, 228, 810-814 (1985). Se også Yokota et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 81, 1070 (1984), Fung et al., Nature, 307, 233 (1984) og Gough et al., Nature, 309, 763 (1984) vedrørende kloning av murine gener, samt Kawasaki et al., Science, 230, 291 (1985) vedrørende human-M-CSF.

En human vekstfaktor for bloddannelse kalt human koloni-stimulerende faktor med flere forskjellige virkninger (hpCSF) eller pluripoiétin, er blitt påvist å være tilstede i dyrknings-mediet til en human carcinomcellelinje fra urinblære betegnet 5637 og deponert under restriktive betingelser ved American Type Culture Collection, Rockville, Maryland som A.T.C.C de-poneringsnr. HTB-9. Den hpCSF som renses fra denne cellelinje, er blitt rapportert å stimulere formering og differensiering av forløperceller med flere forskjellige virkninger som fører til produksjonen av alle de viktigste blodcelletypene, i prøver hvor det brukes human benmarg-forløperceller. Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1530 (1985). Ved rensing av hpCSF ble det brukt: (NH4)2S04~utfelling, anionbytterkromatografi ( DEAE-cellulose, DE52), gelfiltrering (AcA54-kolonne) og C18 væskekromatografi i omvendt fase med høy yteevne. Et protein identifisert som hpCSF som elueres i den andre av to aktivitetstopper i fraksjoner fra C18 HPLC i omvendt fase, ble angitt å ha en molekylvekt (MW) på 18.000 bestemt ved hjelp av natriumdodecylsulfat (SDS)-polyacrylamid-gelelektroforese (PAGE) under anvendelse av sølvfarging.

hpCSF ble tidligere angitt å ha et isoelektrisk punkt på 5,5

[Welte et al., J. Cell. Biochem., Supp 9A, 116 (1985)] og en høy differenseriengsaktivitet for den myelomonocyttiske leukemicellelinje WEHI-3B D<+>fra mus [Welte et al., UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, Gale et al.,

utg., New Series, 2Q, (1985)]. Foreløpige undersøkelser indikerer at faktoren identifisert som hpCSF i overveiende grad har granulocytt-kolonistimulerende aktivitet i løpet av de første 7 dagene i en human CFU-GM-prøve.

En annen faktor, betegnet human CSF-(3, er også blitt isolert fra human urinblære carcinomcellelinje 5637 og er

125

blitt beskrevet som en konkurrent til munn 1-merket granulocytt-kolonistimulerende faktor (G-CSF) når det gjelder binding til WEHI-3B D<+->celler i et doseresponsforhold som er identisk med forholdet til umerket murin G-CSF [Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985)].Dette doseresponsforhold var tidligere blitt rapportert å være enestående for umerket murin G-CSF og ikke å finnes hos slike faktorer som M-CSF, GM-CSF eller multi-CSF [Nicola et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 81 f 3765-3769 (1984)]. CSF-(3 og G-CSF er også enestående blant CSF-er ved at de deler en høy grad av evne til å indusere differensiering av WEHI-3B D<+->celler. Nicola et al., Immuno-logy Today, _5, 76-80 (1984) . Ved høye konsentrasjoner stimulerer G-CSF blandede granulocytt/makrofag-kolonidannende celler [Nicola et al., (1984) supra], noe som er i overensstemmelse med foreløpige resultater som indikerer frem-komsten av granulocyttiske, monocyttiske, blande granulocy-tiske/monocyttiske og eosinofile kolonier (CFU-GEMM) etter 14 dagers inkubasjon av humane benmargkulturer med hpCSF. CSF-P er også blitt angitt å stimulere dannelse av neutrofile granulocyttiske kolonier i prøver hvor det ble anvendt benmargceller fra mus, en egenskap som har vært et kriterium for identifikasjon av en faktor som en G-CSF. På grunnlag av disse likheter, er human CSF-(3 blitt identifisert med G-CSF (granulocyttisk kolonistimulerende faktor). Nicola et al., Nature, 314, 625-628 (1985).

På grunnlag av de felles egenskaper synes det som om human SCF-(3 ifølge Nicola et al., supra, og hpCSF ifølge Welte et al., supra, er den samme faktor som passende kunne refereres til som en human granulocytt-kolonistimulerende faktor (hpG-CSF). Karakterisering og rekombinant produksjon av hpG-CSF ville være særlig ønskelig på bakgrunn av den rapporterte egenskap hos murin G-CSF til å undertrykke en in vitro WEHI-3B 3<+>leukemisk cellepopulasjon fullstendig ved "helt normale konsentrasjoner", og den rapporterte egenskap-hos rå, injiserte preparater av murin G-CSF til å undertrykke etablerte transplanterte myeloid-leukemier i mus. Metcalf, Science, 229, 16-22 (1985). Se også Dachs Scientific American, 284 ( 1) , 40-47 (1986).

I den utstrekning hpG-CSF kan vise seg å være terapeutisk betydningsfull og således trengs å være tilgjenge-

lig i mengder i kommersiell skala, er det usannsynlig at isolering fra cellekulturer kan utgjøre en adekvat material-kilde. Det er f.eks. verd å legge merke til at det fore-ligger restriksjoner mot kommersiell bruk av celler fra human tumorbank, slik som den humane urinblære-carcinomcellelinje 5637 (A.T.C.C. HTB9) som er blitt angitt som kilder for naturlige hpCSF-isolater i Welte et al. (1985 supra).

Oppsummering av oppfinnelsen

For anvendelse i forbindelse med oppfinnelsen tilveiebringes DNA-sekvenser som koder for hele eller en del av hpG-CSF. Slike sekvenser kan omfatte: innlemmelse av kodoner som er "foretrukket" for ekspresjon ved hjelp av utvalgte ikke-pattedyrverter, tilveiebringelsen av steder for spalting ved hjelp av restriksjonsendonukleaseenzymer, og tilveie-bringelse av initielle, terminale eller mellomliggende DNA-sekvenser som letter konstruksjon av lett uttrykte vektorer. Det tilveiebringes også DNA-sekvenser

som koder for mikrobiell ekspresjon av polypeptidanaloger eller derivater av hpG-CSF som skiller seg fra naturlig forekommende former når det gjelder identiteten og lokaliseringen av én eller flere aminosyrerester (dvs. "deletion"-analoger som inneholder mindre enn alle restene som er angitt for hpG-CSF; substitusjonsanaloger, slik som [Ser<17>]hpG-CSF, hvor én eller flere av de angitte rester er erstattet med andre rester; og addisjonsanaloger hvor én eller flere aminosyrerester er tilført en terminal eller medial del av polypeptidet)

og som deler noen av eller alle egenskaper til naturlig forekommende former.

Nye DNA-sekvenser som kan anvendes, omfatter sekvenser som kan brukes til å sikre ekspresjon i prokaryote eller eukaryote vertceller av polypeptidprodukter som har minst en del av den primære strukturkonf ormas jon og én eller_. flere av biologiske egenskapene til naturlig forekommende granulocytt-kolonistimulerende faktor med flere forskjellige virkninger. DNA-sekvenser som kan anvendes, viser seg spesielt å omfatte: (a) DNA-sekvensen som er angitt i tabell VII og tabell VIII, eller de komplementære kjeder til denne; (b) en DNA-sekvens som hybridiserer (under slike hybridi-seringsbetingelser som her er vist, eller strengere betingelser) til DNA-sekvensene i tabell VII eller fragmenter derav; og (c) en DNA-sekvens som, hvis det ikke hadde vært for den genetiske kodes degenerasjon, ville ha hybridisert til DNA-sekvensen i tabell VII. Spesielt omfattet i del (b) er genom-DNA-sekvenser som koder for alleliske variantformer av hpG-CSF og/eller koder for andre pattedyrarter av granulocytt-kolonistimulerende faktor med flere forskjellige virkninger. Spesielt omfattet av del (c) er fremstilte DNA-sekvenser som koder for hpG-CSF, fragmenter av hpG-CSF og analoger av hpG-CSF, DNA-sekvenser som kan omfatte kodoner som letter translasjon av budbringer-RNA i mikrobielle verter. Slike fremstilte sekvenser kan lett konstrueres ifølge metodene

til Alton et al., PCT publisert søknad nr. WO 83/04053.

Fremstilt ved foreliggende oppfinnelse er den klassen av polypeptider som kodes for av deler av DNA-komple-mentet til den øverste kjeden i human cDNA- eller genomiske DNA-sekvenser ifølge tabellene VII og VIII, dvs. "komple-mentært inverterte proteiner" som beskrevet av Tramontano et al., Nucleic Acids Res., 12, 5049-5059 (1984).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid, kjennetegnet ved at den omfatter dyrking under egnede næringsbetingelser av prokaryote eller eukaryote vertsceller som er transformert eller transfektert med en renset og isolert DNA-sekvens som koder for ekspresjon av et polypeptid med én eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskapene til naturlig forekommende granulocyttkolonistimu-lerende faktor (hpG-CSF) med flere forskjellige virkninger, og en del av eller hele hpG-CSF-aminosyresekvensen angitt i tabellene VII og VIII, eller en polypeptidanalog derav med samme biologiske virkning, og isolering av ønskede polypeptidprodukter fra ekspresjonen av_. DNA-sekvenser. Avhengig av den verten som anvendes, kan polypeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen være glycosylerte med pattedyr- eller andre eukaryote carbohydrater, eller kan være ikke-glycosylerte. Polypeptider fremstilt ifølge oppfinnelsen kan også omfatte en initiell methionin-aminosyrerest ( i stilling -1).

Polypeptidene kan anvendes i farmasøytiske preparater som omfatter effektive mengder av polypeptidprodukter fremstilt ifølge oppfinnelsen sammen med egnede fortynningsmidler, hjelpestoffer og/eller bærere som kan anvendes i hpG-CSF-terapi.

Polypeptidproduktet kan "merkes" ved tilknytning til et påvisbart markørstoff (f.eks. merkes radioaktivt med<125>I), hvorved det fåes reagenser som kan brukes ved påvisning og kvantifisering av human hpG-CSF i faste vev- og væskeprøver, slik som blod og urin. DNA-produkter som anvendes kan også merkes med påvisbare markører, (slik som radioaktive markører og ikke-isotopiske markører, slik som biotin), og anvendes i fremgangsmåter for DNA-hybridisering for å lokalisere stillingen til det humane hpG-CSF-gen og/eller stillingen til en nær beslektet genfamilie i et kromosomkart. De kan også brukes til å identifisere feil i det humane hp-CSF-gen på DNA-nivået og brukes som genmarkører for å identifisere nabogener og feil i disse.

Polypeptidproduktet fremstilt ifølge oppfinnelsen kan, alene eller sammen med andre faktorer for bloddannelse eller legemidler, være anvendbar ved behandlingen av feil i bloddannelsen, slik som aplastisk anemi. De kan også være anvendbar ved behandlingen av mangler i bloddannelsen som oppstår av kjemoterapi eller av stråleterapi. F.eks. kan vel-lykketheten ved benmargstransplantasjon økes ved anvendelse av hpG-CSF. Sårhelende behandling av brannskade og behandling av bakteriebetennelse kan også dra nytte av anvendelse av hpG-CSF. I tillegg kan hpG-CSF også være nyttig ved behandlingen av leukemier basert på en rapportert evne til å differensiere leukemiceller. Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1530 (1985) og Sachs, supra.

En rekke aspekter og fordeler ved oppfinnelsen vil være åpenbare for fagfolk innen teknikken ut fra den nærmere beskrivelse nedenunder som gir illustrasjoner på utøvelsen av oppfinnelsen ved dens for tiden foretrukne utførelsesformer. Kort beskrivelse av tegningene

Figuren er et partielt restriksjonsendonukleasekart over hpG-CSF-genet ledsaget av piler som viser den sekven-seringsstrategi som er brukt for å komme frem til genomsekvensen.

Nærmere beskrivelse

I forbindelse med oppfinnelsen er DNA-sekvenser som koder for en del av eller hele polypeptidsekvensen til hpG-CSF, blitt isolert ogkarakterisert.

De følgende eksempler er gitt for å illustrere oppfinnelsen og er spesielt rettet mot fremgangsmåter utført før identifikasjon av hpG-CSF-cDNA og -genomkloner, mot fre-gangsmåter som fører til slik identifikasjon, og mot sekvenseringen, utviklingen av ekspresjonssystemer basert på cDNA, genomgener og fremstilte gener, og verifikasjon av ekspresjon av hpG-CSF og analoge produkter i slike systemer.

Nærmere bestemt er eksempel 1 rettet mot aminosyre-sekvensering av hpG-CSF. Eksempel 2 er rettet mot fremstillingen av et cDNA-bibliotek for screening av kolonohybridi-sering. Eksempel 3 vedrører konstruksjon av hybridiseringsprober. Eksempel 4 vedrører hybridiseringsscreening, identifikasjon av positive kloner, DNA-sekvensering av en positiv cDNA-klon og frembringelsen av informasjon vedrørende primær polypeptidstrukturkonformasjon (aminosyresekvens). Eksempel 5 er rettet mot identifikasjonen og sekvenseringen av en genomklon som koder for hpG-CSF. Eksempel 6 er rettet mot konstruksjonen av et fremstilt gen som koder for hpG-CSF, hvor det anvendes kodoner som begunstiges av E. coli.

Eksempel 7 er rettet mot fremgangsmåter for konstruksjon av en E. coil transformasjonsvektor som omfatter hpG-CSF-kodende DNA, bruken av vektoren i proKaryot ekspresjon av hpG-CSF, og analyse av egenskaper til fremstilte rekombinante produkter. Eksempel 8 er rettet mot fremgangsmåter for frem-bringelse av analoger av hpG-CSF hvor cysteinrester er erstajt-tet med en annen egnet aminosyrerest ved hjelp av mutagenese utført på DNA som koder for hpG-CSF. Eksempel 9 er rettet mot fremgangsmåter for konstruksjon av en vektor som omfatter hpG-CSF-analog-kodende DNA avledet fra en positiv cDNA-klon, bruken av vektoren for transfeksjon av COS-l-celler, og de transfiserte celler i vekst i kultur. Eksempel 10 vedrører fysiske og biologiske egenskaper hos rekombinante polypeptidprodukter fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Eksempel 1

A.Sekvensering av materiale tilveiebragt ved hjelp av metoder ifølge litteraturen

En prøve (3-4 ug, 85 - 90% ren etter SDS, sølvfarge-PAGE) av hpG-CSF ble erholdt fra Sloan Kettering Institute, New York, New York, isolert og renset i henhold til Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1630 (1985).

Den N-terminale aminosyresekvens til denne prøve av hpG-CSF ble bestemt i et forsøk nr. 1 ved mikrosekvens-analyse under anvendelse av et AB407A gassfase-sekvensapparat (Applied Biosystems, Foster City, California) for å tilveie-bringe sekvensinformasjonen som er angitt i tabell I nedenunder. I tabellene I - IV er det anvendt en bokstavkoder, "X" betegner en rest som ikke ble entydig bestemt, og rester i paranteser ble bare alternativt eller forsøksvis utpekt.

En stor grad av bakgrunnsforstyrrelse var tilstede i hver runde av forsøket som det er gjengitt resultater for i tabell I, noe som indikerer at prøven hadde mange forurensende bestanddeler, sannsynligvis i form av kjemiske rester fra rensing. Sekvensen ble beholdt bare for bruk som referanse.

I forsøk nr. 2 ble en andre prøve (5-6 ug,,~95% ren) erholdt fra Sloan Kettering som for forsøk nr. 1 og det ble utført en sekvenseringsprosedyre som for forsøk nr. 1. Denne prøven var fra det samme parti av materiale som ble anvendt til å frembringe figur 4 hos Welte et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 1526-1530 (1985). Resultatene er gjengitt i tabell II.

Selv om flere rester ble identifisert, ga ikke forsøk nr. 2 en tilstrekkelig lang, entydig sekvens hvorfra et rimelig antall prober kunne konstrueres for å lete etter hpG-CSF-DNA. Det ble beregnet at minst 1536 prober ville ha vært påkrevet for å forsøke isolering av cDNA basert på sekvensen ifølge tabell II. Igjen ble det antatt at forurens-ning av prøven var problemet.

Følgelig ble det erholdt en tredje prøve (3-5 ug, 40% ren) fra Sloan Kettering som ovenfor. Dette preparatet ble elektroblottet etter separasjon ved hjelp av SDS-PAGE i et forsøk på ytterligere rensing. Sekvensanalyse av denne

prøven ga ingen data.

(B) Sekvensering av materialer tilveiebragt ved hjelp av reviderte metoder

For å oppnå en tilstrekkelig mengde rent materiale til å utføre passende avgrenset aminosyresekvensanalyse, ble det erholdt celler fra en urinblære-carcinomcellelinje 5637 (sub-klon 1A6) fremstilt ved Sloan-Kettering fra dr. E. Platzer. Celler ble først dyrket i Iscove's medium (GIBCO, Grand Island, New York) i kolber inntil sammenflyting. Etter sammenflyting ble kulturene trypsinert og plassert i rulleflasker

(1 - 1/2 kolber/flaske) som hver inneholdt 25 ml forkondi-sjonert Iscove's medium under 5% C02. Cellene ble dyrket over natten ved 37°C ved 0,3 rpm.

Cytodex-l-kuler (Pharmacia, Uppsala, Sverige) ble vasket og sterilisert ved å bruke følgende fremgangsmåter. 8 g kuler ble innført i en flaske og 400 ml PBS ble tilsatt. Kulene ble oppslemmet ved forsiktig rotering i 3 timer. Etter å ha latt kulene få synke ned, ble PBS trukket av, kulene ble skylt i PBS og frisk PBS ble tilsatt. Kulene ble auto-klavert i 15 minutter. Før bruk ble kulene vasket i Iscove's medium + 10% kalveforsterserum (FCS) før det ble tilsatt friskt medium + 10% FCS for å oppnå behandlede kuler.

Etter fjerning av alt bortsett fra 30 ml av mediet

fra hver rulleflaske, ble det tilsatt 30 ml friskt medium + 10% FCS og 40 ml behandlede kuler til flaskene. Flaskene ble gasset med 5% CC^og alle boblene ble fjernet ved avsuging. Flaskene ble plassert i rullerader ved 3 rpm i en halv time før hastigheten ble redusert til 0,3 rpm. Etter 3 timer ble en ytterligere kolbe trypsinert og tilsatt hver rulleflaske som inneholdt kuler.

Ved 40 - 50% sammenflyting ble rulleflaskekulturene vasket med 50 ml PBS og rotert i 10 minutter før fjerning

av PBS. Cellene ble dyrket i 48 timer i medium A (Iscove's medium som inneholdt 0,2% FCS, 10 hydrokortison, 2 mm glutamin, 100 enheter/ml penicillin og 100 ug/ml strepto-mycin) . Deretter ble kultursupernatanten innhøstet ved sentrifugering ved 3000 rpm i 15 minutter og lagret ved -70°C. Kulturene ble på nytt tilført medium A inneholdende 10% FCS

og ble dyrket i 4 8 timer. Etter at mediet var kassert, ble cellene vasket med PBS som ovenfor og dyrket i 48 timer i medium A. Supernatanten ble på nytt innhøstet og behandlet som tidligere beskrevet.

Omtrent 30 liter medium kondisjonert ved hjelp av 1A6-celler ble oppkonsentrert til ca. 2 liter på en Millipore<®>-. Pellicon-enhet utstyrt med 2 kassetter med avkuttinger med molekylvekt 10.000, ved en filtreringshastighet på ca. 200 ml/minutt og en tilbakeholdelseshastighet på ca. 1000 ml/ minutt. Konsentratet ble diafiltrert med ca. 10 liter 50 mM Tris (pH 7,8) under anvendelse av det samme apparat og de samme strømningshastigheter. Det diafUtrerte konsentrat ble påfylt ved 4 0 ml/minutt på en 1 liters DE-cellulose-kolonne ekvilibrert i 50 mM Tris (pH 7,8). Etter påfylling ble kolonnen vasket ved den samme hastighet med en 1 liter 50 mM Tris (pH 7,8) og deretter med 2 liter 50 mM Tris (pH 7,8)

med 50 mM NaCl. Kolonnen ble så i rekkefølge eluert med 6

én liters oppløsninger av 50 mM Tris (pH 7,5) som inneholdt følgende konsentrasjoner av NaCl: 75mM, 100 mM, 125 mM,

200 mM og 300 mM.Fraksjonene (50 ml) ble samlet opp og aktive fraksjoner ble slått sammen og oppkonsentrert til 65 ml på

en Amicon ultrafiltreringscelleenhet med omrøring utstyrt med en YM5-membran. Dette konsentratet ble fylt på en 2 liter AcA54 gelfiltreringskolonne ekvilibrert i PBS. Kolonnen ble kjørt ved 80 ml/time og 10 ml fraksjoner ble samlet opp. Aktive fraksjoner ble slått sammen og påfylt direkte på en

CA væskekromatografikolonne med høy yteevne (HPLC).

Prøver som varierte i volum fra 125 ml til 850 ml, og som inneholdt 1 - 8 mg protein hvorav ca. 10% var hpG-CSF, ble fylt på kolonnen ved en strømningshastighet som varierte fra 1 ml til 4 ml pr. minutt. Etter påfylling og en innledende vasking med 0,1 M ammoniumacetat (pH 6,0 - 7,0) i 80% 2-propanol ved en strømningshastighet på 1 ml/minutt, ble 1 ml store fraksjoner samlet opp og undersøkt med hensyn på proteiner ved 220 nm, 260 nm og 280 nm.

Som et resultat av rensing ble fraksjoner som inneholdt hpG-CSF klart separert (som fraksjoner 72 og 72 av 90) fra andre protein-holdige fraksjoner. hpG-CSF ble isolert

(150 - 300 ug) ved en renhet på ca. 85 - 5% og et utbytte på ca. 50%. Fra dette rensede materiale ble 9 ug brukt i forsøk nr. 4, en aminosyresekvensanalyse hvor proteinprøven ble til-ført en TFA-aktivert glassfiberplate uten polybren. Sekvensanalyse ble utført med en AB 470A-sekvenser ifølge fremgangsmåtene til Hewick et al., J. Biol. Chem., 256, 7990-7997 (1-981) og Lai,Anal. Chim. Acta, 163, 243-248 (1984). Resultatene fra forsøk nr. 4 fremgår av tabell III.

Etter 31 sykluser i forsøk nr. 4 (svarende til rest 31 i tabell III) ble det ikke oppnådd noen ytterligere signifikant sekvensinformasjon. For å oppnå en lengre utve-tydig sekvens ble 14 ug hpG-CSF renset fra kondisjonert medium redusert med 10 yl p-mercaptoethanol i 1 time ved 45°C i et forsøk nr. 5, deretter grundig tørket under vakuum. Proteinresten ble så på nytt oppløst i 5% maursyre før den ble tilført en polybrenisert glassfiberplate. Sekvensanalyse ble utført som for forsøk nr. 4 ovenfor. Resultatene fra forsøk nr. 5 er gjengitt i tabell IV.

Aminosyresekvensen som er gjengitt i tabell IV var tilstrekkelig lang (44 rester) og entydig til å konstruere prober for å oppnå hpG-CSF-cDNA som beskrevet nedenunder.

Eksempel 2

Blant standardfremgangsmåter for isolering av cDNA-sekvenser av interesse er fremstillingen av plasmidbårne cDNA-"bibliotek" avledet fra revers-transkripsjon av mRNA som det finnes rikelig av av donorceller valgt på grunnlag av ekspresjon av et målgen. Når vesentlige deler av aminosyresekvensen til et polypeptid er kjent, kan det anvendes merkede, énkjedede DNA-probesekvenser som duplikerer en sekvens som antas å være tilstede i "mål"-cDNA, i DNA/DNA-hybridiserings-fremgangsmåter utført på klonede kopier av den cDNA som er blitt denaturert til énkjedet form. Weissman et al., U.S. patentskrift nr. 4 394 443; Wallace et al., Nucleic Acids Res., 3543-3557 (1979), Reyes et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 19, 3270-3274 (1982) og Jaye et al., Nucleic Acids Res., 11, 2325-2335 (1983). Se også U.S. Patentskrift nr. 4 358 535 som vedrører DNA/DNA-hybridiseringsfremgangs-måter for å utføre diagnoser, og Davis et al., "A Manual

for Genetic Engineering, Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1980), sider 55 - 58 og 174 - 176 som vedrører koloni- og plakk-hybridiseringsteknikker.

Total RNA ble ekstrahert fra omtrent 1 g celler fra

en urinblære-carcinomcellelinje 5537 (1A6) ved å bruke en guanidinthiocyanatfremgangsmåte for kvantitativ isolering av intakt RNA. [Chirgwin et al., Biochemistry, 18, 5294-5299

(1979)].

Den sterile vandige RNA-oppløsning inneholdt total RNA fra I 6-cellene. For å oppnå bare budbringer-DNA fra den totale RNA-oppløsning, ble oppløsningen sendt gjennom en kolonne som inneholdt oligodeoxythymidylat [oligo(dT)] (Colla-borative Research, Inc., Waltham, Massachusetts. Poly-adeny-lerte (poly-A<T>) haler som er karakteristiske for budbringer-RNA fester seg til kolonnen mens ribosom-RNA elueres. Som et resultat av denne fremgangsmåte, ble det isolert omtrent 90 ug poly-adenylart budbringer-RNA (poly-A<+->mRNA). Den iso-lerte poly-A<+->budbringer-RNA var forbehandlet med methyl-kvikksølvhydroxyd (Alpha Ventron, Danvers, Massachusetts) ved en sluttkonsentrasjon på 4 mM i "5 minutter ved værelsetemperatur før bruk i en cDNA-reaksjon. Methylkvikksølvhydroxyd-behandlingen denaturerte reaksjonsprodukter av budbringer-RNA, både med seg selv og med forurensende molekyler som inhiberer translasjon. Payvar et al., J. Biol. Chem., 258, 7636-7642

(1979).

Ifølge Okayama-fremgangsmåten [Okayama et al., Molecular&Cellular. Biology, 2, 161-170 (1982)], ble en cDNA-bank fremstilt ved å bruke mRNA erholdt fra IA6-celler. cDNA-ene ble deretter transformert ved inkubasjon i en vertmikro-organisme E. coli K-12 stamme HB101 for forsterkning.

Eksempel 3

Hybridiseringsprober utformet på grunnlag av den hpG-CSF-aminoterminale sekvens ifølge tabell IV besto av et sett av 24 oligonukleotider som hver var 23 baser lange og inneholdt 3 inosinrester. Probeoligonukleotidene ble fremstilt ifølge fremgangsmåten til Caruthers et al., Genetic Engi-

32

neer ing, 4_, 1-18 (1982) og merket med 7- P ATP ved kinase-behandling med polynukleotidkinase. Probeoligonukleotidene som svarte til budbringer-RNA for restene 23-30 i sekvensen ifølge tabell IV, er illustrert i tabell V.

Opprettelsen av nøytralitet hos I var basert på det publiserte arbeide av Takahashi et al., Proe. Nati. Acad.

Sei. ( USA), 82, 1931-1935 (1985) og Ohtsuka et al., J. Biol. Chem., 260, 2605-2608 (1985). Inosin kan imidlertid ha en destabiliserende virkning dersom det er baseparet med et G eller T. Ifølge Takahashi et al. kan inosiner vise seg å ha en nøytral virkning ettersom de gjennomsnittlig kommer ut som en gruppe nær nøytralitet (f.eks. tre som på gunstig måte har dannet par med C og to som ikke-på gunstig måte danner par med T).

For å teste virkningen av. at I har dannet basepar med G, ble det utformet kontrollforsøk ved å bruke en.N-myc-gen-sekvens og klon. Sekvensene tatt ut fra N-myc-genet hadde det samme totale G- og C-innhold i de to første stillingene i hvert kodon, slik det var foreskrevet ved hjelp av hpG-CSF-probene. Således hadde N-myc-testprobene den samme lengde, inneholdt I-er i de samme relative stillinger og hadde potensielt den samme gjennomsnittlige Tm (62 - 66°C, hvor de 3 eller 4 inosinrestene inkludert ikke telte med) som hpG-CSF-probene.

Det ble konstruert to sett med N-myc-testprober ifølge fremgangsmåten til Caruthers et al., supra. Sett I omfattet som vist i tabell VI: 1, en 23 mer med perfekt tilpasning;

2, hvor tre C-er i tredje stilling var erstattet med I-er slik at det verst mulige tilfelle for tilsetning av I-er var frembragt; og 3, hvor fire C-er i tredje stilling var erstattet med I-er. Det andre settet av testprober ble utformet for å utgjøre en mer tilfeldig fordeling av inosin-basepar som ville kunne gi en samlet nøytral baseparingseffekt. Sett II omfattet som vist i tabell VI: 4, inneholdende to I-er

som ville danne basepar med C-er, og en med en G; og 5, iden-

tisk med 4, med tillegg av et I:G-basepar mer.

Fem replikafiltere som inneholdt N-myc-DNA-sekvenser

og kylling-veksthormon-DNA-sekvenser (som en negativ kontroll), ble oppvarmet i en vakuumovn i 2 timer ved 80°C før hybridisering. Alle filtrene ble hybridisert som beskrevet i eksempel 4 for hpG-CSF-probene, bortsett fra at hybridiserings-tiden bare var 6 timer. Filtrene ble vasket tre ganger ved værelsetemperatur, deretter én gang ved 45°C, 10 minutter hver. Filtrene ble undersøkt med en Geiger-teller.

Filteret som representerte N-myc-probe 3 ga et svært svakt signal i forhold til de øvrige fire filtrene med prober og ble ikke vasket noe mer. Etter vasking i 10 minutter ved 50°C ga Geiger-telleren følgende prosentvise signal, idet Probe 1 var satt til 100%: Probe 2: 20%, Probe 3 (45°C):2%, Probe 4: 92% og Probe 5: 75%. Etter vasking ved 55°C var prosenttallene: Probe 2: 16%, Probe 4: 100% og Probe 5: 80%. En sluttvask ved 60°C ga følgende prosenttall: Probe 2: 1,6%, Probe 4: 90% og Probe 5: 70%.

I nærvær av tre I-er, som i Probe 2 og 4, ble det således iakttatt opp til en 60 gangers forskjell i signal når den teoretiske Tm (I-er ikke inkludert i beregningen) nåes [basert på et verste tilfelle I-baseparing (Probe 2) og et forholdsvis nøytralt I-basparingstilfelle (Probe 4)].

Den standardiseringsinformasjon som ble vunnet ved hjelp av N-Myc-testhybridiseringene ble benyttet ved vasking og undersøkelse av hpG-CSF-hybridiseringen som angitt nedenunder, for å måle den sikkerhetsgrad som resultatene fra mindre nøye vasking kan aksepteres ved.

Eksempel 4

Ifølge fremgangsmåten til Hanahan et al., J. Mol. Biol., 166, 557-580 (1983), ble bakterier som inneholdt rekombi-nanter med cDNA- innskudd fremstilt ifølge eksempel 2 spredd ut på 24 nitrocellulosefiltere (Millipore<®>, Bedford, Massachusetts) lagt på agarplater. Platene ble deretter inkubert slik at det ble etablert omtrent 150.000 kolonier som ble replika-utplatet på 24 andre nitrocellulosefiltere. Replikaene ble inkubert inntil utydelige kolonier kom til syne. Bakteriene på filtrene ble lysert på ark av Whatman 3 mm papir såvidt mettet med natriumhydroxyd (0,5M) i 10 minutter, deretter blottet med Tris (IM) i 2 minutter etterfulgt av blotting med Tris (0,5M) som inneholdt NaCl (1,5M) i 10 minutter. Da filtrene var nesten tørre, ble de varmet opp i 2 timer ved 8 0°C

i en vakuumovn før nukleinsyrehybridisering. [Wahl et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 76, 3683-3687 (1979)] og Mania-tiset al., Cell, 81, 163-182 (1976).

Filtrene ble forhybridisert i 2 timer ved 65°C i 750

ml 10X Denhardfs, 0,2% SDS og 6X SSC. Filtrene ble skylt i 6X SSC, deretter ble fire plassert i en pose og hybridisert i 14 timer i 6X SSC og 10X Denhardfs. Det var omtrent 15 ml oppløsning pr. pose som inneholdt 50 x 10 cpm -P-merket probe (oligonukleotider).

Etter hybridisering ble filtrene vasket tre ganger i

6X SSC (1 liter/vask) ved værelsetemperatur i 10 minutter hver. Filtrene ble så vasket to ganger ved 45°C i 15 minutter hver, en gang ved 50°C i 15 minutter og en gang ved 55°C i 15 minutter under anvendelse av 1-litervolumer i 6X SSC. Filtrene ble autoradiografert i 2 timer ved -70°C under anvendelse av et forsterkergitter og Kodak<®>XAR-2-film. På den autoradio-graf ble det påvist 40 - 50 positive signaler, deriblant 5 svært sterke signaler.

Områdene som inneholdt de fem sterkeste signalene og ytterligere fem positive områder ble avskrapet fra master-platene og på nytt platet ut for en andre screening under anvendelse av den samme probeblanding under de samme betingelser. Vaskefremgangsmåten adskilte seg ved at høytemperatur-vaskingene besto av to ved 55°C i 15 minutter hver og deretter en ved 60°C i 15 minutter. Basert på N-myc-probeunder-søkelsen ifølge eksempel 3 ble sluttemperaturene ved vasking i den andre screening økt fordi aggregatsmeltepunktet for de 24 23-merer var 60 - 6 8°C, det samme som for N-myc-probene. Like etter den andre vasking ved 55°C ble filtrene etterlatt fuktige og det ble utført en autoradiografering. Sammenligning av denne autoradiografering med den andre autoradiografering utført for et lignende tidsrom etter en sluttvasking ved 60°C, viste at bare to av de ti klonene som ble testet, ikke led av et vesentlig tap i signal når man økte fra 55 til 60°C. Disse to klonene ble senere vist å ha nesten identiske lengder og restriksjonsendonukleasemønstere. En klon betegnet Ppo2 ble valgt, ut for sekvensering.

Sekvensering av den rekombinante hpG-SCF-cDNA-klon, Ppo2, oppnådd ved hjelp av fremgangsmåten ovenfor ble ut-ført ved hjelp av dideoxymetoden til Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 74, 5463-5467 (1977). Den énkjedede DNA-fag M-13 ble brukt som en kloningsvektor for å skaffe tilveie énkjedede DNA-templater fra de dobbeltkjedede cDNA-kloner. Metoden til Sanger et al. avslørte den sekvens som er gjengitt i tabell VII ledsaget av dens aminosyretranslasjon og en komplementær kjede i det polypeptidkodende område.

Følgende kjennetegn ved sekvensen ifølge tabell VII

er verd å merke seg. Ved 5 *-enden i sekvensen er det vist baser svarende til de i poly G cDNA-linkeren. Det oppstår så ca. 5 baser (betegnet som "N") med en sekvens som ikke lett kunne bestemmes éntydig ved hjelp av metoden til Sanger et al. på grunn av de mange G-er som går forut. Sekvensen legger deretter for dagen en serie på 12 kodoner som koder for en del av en antatt ledersekvens for polypeptidet. Basert på samsvarhet med N-aminosekvensen i naturlige isolater av hpCSF beskrevet i eksempel 1, er den første threoninrest: i den antatt "ferdige" form av hpG-CSF angitt ved +1. Ferdig hpG-CSF viser seg deretter å omfatte 174 rester som angitt. Etter "stopp"-kodonet (OP-kodonet, TGA) kommer det omtrent 856 baser av en ikke-translatert 3'-sekvens og flere A-er av poly A "halen". Unike HgiAi- og Apal-restriksjonsendonukleaser-gjenkjenningssteder, samt to Stul-steder (omtalt nedenunder når det gjelder konstruksjon av prokaryote og eukaryote ekspresjonssystemer) er også betegnet i tabell VII. På grunn av mangel på asparaginrester i polypeptidet, er det ingen klare steder for N-glycosylering. De understrekede 6 baser nær enden av den 3'-ikke-translaterte sekvens utgjør et potensielt polyadenyleringssted. ;Det er verd å merke seg at hver av to ytterligere cDNA-kloner identifisert ved hjelp av hybridiseringsfrem-gangsmåtene beskrevet ovenfor, fra et samlet antall på 450.000 kloner, unnlot å ta opp DNA som koder for hele ledersekvensen fra transkripsjonsinitieringsstedet og fremover. Faktisk terminerte alle tre hpG-SCF-klonene i 5<1->området nøyaktig på samme tid, noe som indikerer at sekundærstrukturen til den transkriberte mRNA på ugunstig måte hindrer cDNA-dannelse utenfor dette sted. Som en sak av praktisk betydning, kunne derfor slik cDNA-ekspresjonsscreening som beskrevet iOkayama et al., Mol, and Cell. Biol., 3^, 280-289 (1983), og som faktisk anvendes for å isolere GM-CSF i Wong et al., Science, 228, 810-814 (1985), kunne ikke lett ha vært anvendt til isolering av hpCSF-DNA ettersom slike isoleringssystemer vanligvis beror på tilstedeværelsen av en cDNA-transkript ;i full lengde i de analyserte kloner. ;Sekvensen ovenfor er ikke lett mottagelig for sikring av direkte ekspresjon av hpG-CSF i en mikrobevert. For å sikre slik ekspresjon, bør det hpG-CSF-kodende område være forsynt med et første ATG-kodon og sekvensen bør være innskutt i en transformasjonsvektor på et sted som er under kontroll av en egnet promoter/regulator-DNA-sekvens. ;Eksempel 5 ;I dette eksemplet ble cDNA som koder for hpG-CSF som isolert i eksemplet ovenfor, brukt til å undersøke en genomklon. Et genombibliotek med fag lambda human fosterlever, (fremstilt ifølge fremgangsmåten til Lawn et al., Cell, 15, 1157-1174 (1978) og erholdt fra T. Maniatis) undersøkt ved å bruke en "nick"-translatert probe bestående av to hpG-CSF-cDNA-fragmenter isolert ved oppløsning med HgiAI og Stul ( HgiAI til Stul, 649 b.p., Stul til Stul, 639 b.p.). Tilsammen ble omtrent 500.000 fager platet ut på 12 (15 cm) petriskåler og plakk tatt ut og hybridisert til probe ved å bruke fremgangsmåten til Benton/Davidson [Benton et al., Science, 196, 180 (1977)]. Det ble tilsammen iakttatt 12 positive kloner. Tre kloner (1-3) som ga de sterkeste signaler etter autoradiografi i en sekundær screening, ble dyrket i 1 liter kulturer og kartlagt ved hjelp av restrik-sjonsenzymoppløsning og Southern-blotting under anvendelse av et radioaktivt merket 24-mer oligonukleotid (kinase behandlet med7-<32>P- ATP)5'-CTGCACTGTCCAGAGTGCACTGTG3<1>. Resultatene fra kartleggingen viste at isolatene 1 og 3 var identiske, og at to inneholdt 2000 ytterligere baser 5' til hpG-CSF-genet. Klon 2 ble derfor brukt til ytterligere karakterisering. DNA fra klon 2 ble oppløst med Ri for å frigi en 8500 bp hpG-CSF som inneholder fragment som deretter ble subklonet inn i pBR322, og ytterligere kartlagt ved hjelp av restriksjonsnedonuklaseoppløsninger, Southern-blotting,M13-subkloning og sekvensering. Sekvensen som ble oppnådd, er som angitt i tabell VIII. ; ; Et restriksjonsendonukleasekart (omtrent 3,4 Kb) av genom-DNA som inneholdt hpG-CSF-genet, er spesifisert i fig. ;1. Restriksjonsnedonukleasene som er vist i figur 1 er: ;Ncol, N; Pstl, P; BamHI, B; Apal, A; Xhol, X og Kpn, K. Pilene under kartet viser sekvenseringsstrategien som ble brukt for å oppnå genomsekvensen. De innrammede områder er~ de som ble funnet i cDNA-klonen, idet rammen med stiplet åpen ende representerer en sekvens som ikke var tilstede i cDNA-klonen, men identifisert ved å undersøke mRNA-flekker. Identifikasjonen av de antatte kodende sekvenser for exon 1 ble utført ved hjelp av Northern blotteanalyse. En 24-mer 5 > 3» oligonukleotidprobe, -CAGCAGCTGCAGGGCCATCAGCTT , som spente over sammenknytningspunktene for exoner 1 og 2 som var forutsagt, ble hybridisert til hpG-CSF-mRNA i et Northern blotteformat. Den resulterende flekk oppviste en mRNA med den samme størrelse (ca. 1650 bp) som den som fåes med en exon 2 oligonukleotidprobe. Disse data sammen med evnen til å styre ekspresjon av hpG-CSF fra pSVGM-Ppol-vektoren (eksempel 9) under anvendelse av Met-initieringkodonet vist i tabell VIII, definerer de kodende sekvenser som finnes i exon 1. Exonene 1-5 defineres ved hjelp av de kodende sekvenser erholdt i cDNA-klonen i hpG-CSF-genet (tabell VII). ;Eksempel 6 ;Dette eksemplet vedrører fremstilling av et produsert gen som koder for hpG-CSF og omfatter E. coli preferansekodoner. ;I korte trekk var den anvendte fremgangsmåte som angitt i beskrivelsen i PCT patentsøknad nr. WO83/04053. Genene ble utformet for først å samle komponentoligonukleotider i multiple duplekser som deretter ble samlet i tre adskilte avsnitt. Disse avsnittene ble utformet for hurtig forsterkning og, etter fjerning fra forsterkningssystemet, kunne de samles i rekkefølge eller gjennom en flertrinns fragment-ligering i en egnet ekspresjonsvektor. ;Konstruksjonen av avsnittene I, II og III er illustrert i tabellene IX - XIV. Ved konstruksjonen av avsnitt I ble, som vist i tabellene IX og X, oligonukleotidene 1-14 samlet i 7 duplekser (1 og 8), 2 og 9, 3 og 10, 4 og 11, 5 og 12, 6 og 13, og 7 og 14). Disse dupleksene ble deretter ligert slik at de utgjorde avsnitt I som vist i tabell X. Det kan også legges merke til i tabell X at avsnitt I omfatter en oppstrøms Xbal klebrig ende og en nedstrøms BamHI klebrig ende som kan benyttes til ligering for å forsterke og ut- — trykke vektorer, og for ligering til avsnitt II. ; Som vist i tabellene XI og XII, ble oligonukleotidene 15 - 30 ved konstruksjonen av avsnitt II samlet i 8 duplekser (15 og 23, 16 og 24, 17 og 25, 18 og 26, 19 og 27, 20 og 28, 21 og 29 og 22 og 30). Disse 8 dupleksene ble deretter ligert, hvorved man fikk avsnitt II, som vist i tabell XII. Som videre vist i tabell XII, har avsnitt II en oppstrøms BamHI klebrig ende og en nedstrøms EcoRI klebrig ende som kan brukes for ligering til en forsterkningsvektor og for ligering til avsnitt I. Nær sin nedstrøms ende omfatter avsnitt II også et nedstrøms Sstl-sted som kan brukes i den eventuelle ligering av avsnittene II og III. Til slutt ble avsnitt III konstruert som vist i tabellene XIII og XIV. Til denne konstruksjon ble oligonukleotidene 31 - 42 samlet i 6 duplekser (31 og 37, 32 og 38, 33 og 39, 34 og 40, 35 og 41 og 36 og 42). De 6 dupleksene ble deretter ligert, hvorved man fikk avsnitt III som vist i tabell XIV. Som også vist i tabell XIV omfatter avsnitt Ill-en oppstrøms BamHI klebrig ende og on nedstrøms EcoRI klebrig ende som kan brukes for ligering i en forsterkningsvektor, og i det minste i tilfellet med EcoRI-enden, i en ekspresjonsvektor. I tillegg har avsnitt III et oppstrøms Sstl-sted som kan brukes ved den eventuelle ligering av avsnittene II og III. ; Fragmentet fra Xbal til BamHI dannet av avsnitt I ble ligert inn i en M13mpll fagvektor som var åpnet med Xbal ogBamHI. Vektoren ble deretter på nytt åpnet ved oppløsning medBamHI og EcoRI etterfulgt av ligering med BamHI-EcoRI-fragmentet dannet av avsnitt II. På dette trinn var avsnittene I og II blitt knyttet sammen i korrekt orientering. Deretter ble en annen M13mpll-vektor åpnet ved hjelp av BamHI- EcoRI-oppløsning og deretter ligert med BamHI- EcoRI-fragmentet dannet av avsnitt III. ;Vektoren som inneholdt avsnittene I og II, ble opp-løst med Xbal og Sstl. På samme måte ble vektoren som inneholder avsnitt III, oppløst med Sstl og EcoRI. Begge de minste av de to fragmentene som fåes fra hver oppløsning, ble ligert inn i et plasmid pCFM1156 som på forhånd var blitt åpnet med Xbal og EcoRI. Produktet fra denne reaksjon var et ekspre-sjonsplasmid som inneholder en sammenhengende DNA-sekvens som vist i tabell XV, og som koder for hele hpG-CSF-polypeptidet med et aminoterminalt methioninkodoii (ATG) for E. coli translasjonsinitiering. ; Selv om hvilken som helst egnet vektor kan anvendes til å uttrykke denne DNA, kan ekspresjonsplasmidet pCFM1156 lett konstrueres fra et plasmid pCFM836, hvis konstruksjon er beskrevet i den publiserte europeiske patentsøknad nr. 136 490. pCFM836 ble først kuttet med Ndel og deretter gjort butt i endene med Poll slik at begge de foreliggende-Ndel-steder ble ødelagt. Deretter ble vektoren oppløst med Clal og SacII for å fjerne en tilstedeværende polylinker før ligering til en substituttpolylinker, slik som vist i tabell XVI. Denne substituttpolylinker kan konstrueres ifølge fremgangsmåten til Alton et al., supra. Kontroll av ekspresjon i ekspresjonsplasmidet pCFM1156 skjer ved hjelp av en lambda-PL<->promoter som selv kan være under kontroll av et C1857~ repressorgen (slik som det som er tilveiebragt i E. coli stamme Kl2AHtrp). ; Eksempel 7 ;Dette eksempel vedrører ekspresjon i E. coli av et hpG-CSF-polypeptid ved hjelp av en DNA-sekvens som koder for [Met ]-hpCSF. Den anvendte sekvens var delvis syntetisk og delvis cDNA-avledet. I den syntetiske sekvens ble det brukt E. coli preferansekodoner. ;Plasmid Ppo2 som inneholder hpG-CSF-genet vist i tabell VII, ble oppløst med HgiAI og Stul slik at man fikk et fragment med omtrent 6 45 basepar inkludert genet for ferdig hpCSF (som vist i tabell VII) med syv av ledersekvens-kodonene i 5<1->enden og 100 basepar av 3<1->ikke-kodende område. HgiAI-oppløsning etterlot en klebrig 5<1->ende med 4 baser som er identisk med det som fåes med Pstl, og Stul etterlot en stump ende. Dette muliggjorde hurtig innskudd av fragmentet i M13 mp8 (Rf) kuttet med Pstl og med restriksjonsenzymet HincII som gir stumpe ender. Etter forsterkning i M13, ble hpG-CSF-DNA tatt ut ved oppløsning med Apal og BamHI som kutter henholdsvis ved Apal-stedet og strekker seg over kodonene for restene +3 til +5 i hpCSF, og ved et BamHI-sted "nedstrøms" fra HincII-stedet i M13 mp8 restriksjons-linkeren. For å muliggjøre ekspresjon i E. coli av hpG-CSF-polypeptidet, ble det fremstilt et syntetisk fragment som angitt i tabell XVII nedenunder. ; Som det kan bestemmes ut fra analyse av tabell XVII, omfatter linkeren en Apal klebrig ende, kodoner som angir de første tre restene i aminoenden av hpG-CSF ("gjeninnsetter" ;12 3 ;de Thr -, Pro -, Leu -spesifiserende kodoner fjernet etter ;Apal-oppløsning av M13-DNA beskrevet ovenfor og som anvender kodoner som fortrinnsvis uttrykkes i E. coli), et translasjons-initierings-ATG, en sekvens med 24 basepar som gir et ribosom-bindende sted og en Xbal klebrig ende. \ ;Ekspresjonsvektoren som ble anvendt for ekspresjon i E. coli, var den som er beskrevet som pCFM536 i europeisk patentsøknad nr. 176 490, publisert 10. april 1975. (Se også A.T.C.C. 39974, E. coli JM103 som inneholder pCFM536). I korte trekk ble plasmid pCFM536 opløst med Xbal og BamHI. hpG-CSF-fragmentet ( Apal/ BamHI) og linkeren ( Xbal/ Apal) beskrevet ovenfor ble deretter ligert inn slik at det ble dannet et plasmid betegnet p536Ppo2. ;Plasmid p536Ppo2 ble transformert inn i en fag-resi-stent variant av E. coli AM7-stammen som tidligere var blitt transformert med plasmid pMWl (A.T.C.C. nr. 39933) ' som inne-857 ;holder et CI -gen. Transformasjon ble bekreftet på grunnlag av markørgenet for antibiotisk (amp)-resistens som .'bæres på ;-t ;pCFM536 forløperplasmidet. Kulturer av celler i LB dyrknings-væske (ampicillin 50 ug/ml) ble holdt ved 28°C og etter vekst av celler i kultur til A600 = 0,5, ble hpCSF-ekspresjon indu-sert ved å øke dyrkningstemperaturen til 42°C i 3 timer. Den endelige O.D. i kulturen var A600 =1,2. ;Ekspresjonsnivået for hpG-CSF i de transformerte celler ble bestemt på en SDS-polyacrylamidgel farget med "coomassie blue"-fargestoff til 3 - 5% av det totale cellulære protein. ;Cellene ble innhøstet ved sentrifugering ved 3500 g ;i 10 minutter i en JS-4.2-sentrifuge. Celler ved 25% (vekt/ volum) i vann ble brudt ned ved å passere tre ganger gjennom en "French Pressure Cell" ved 10.000 p.s.i. Suspensjonen av nedbrudte celler ble sentrifugert ved 10.000 g i 15 minutter ;i en JA-20-sentrifuge. Pelleten ble på nytt oppslemmet i vann og oppløseliggjort ved ca. 5 mg/ml totalt protein i 1% laurin-syre, 50 mM Tris, pH 8,7. Det oppløseliggjorte pelletmateriale ble sentrifugert ved 15.000 g i 10 minutter og det ble tilsatt 20 mM CuSO^til supernatanten. Etter 1 time ble denne prøven fylt på en C4 HPLC-kolonne for rensing i henhold til fremgangsmåtene ifølge eksempel 1 (B) , idet det. ble gjort regu-leringer for volum og konsentrasjon. ;En andre rensingsfremgangsmåte ble utviklet for å gi større mengder hpG-CSF formulert i en buffer uten organiske forbindelser. Dette materiale er egnet for in vivo under-søkelser. 150 g cellemasse ble på nytt oppslemmet i ca. 600 ;ml 1 mM DTT og sendt fire ganger gjennom en Manton Gualin homogenisator ved ca. 7000 PSI. Suspensjonen av nedbrudte - celler ble sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter og pelleten ble på nytt oppslemmet i 400 ml 1% deoxycholat (DOC), 5 mM EDTA, 5mM DTT og 50 mM Tris, pH 9. Denne suspensjon ble blandet ved værelsetemperatur i 30 minutter og sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble på nytt oppslemmet i ca. 400 ml vann og sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløseliggjort i 100 ml 2% "Sarkosyl" og 50 mM ;ved pH 8. CuS04ble tilsatt til 20 um og blandingen ble omrørt i 16 timer ved værelsetemperatur og deretter sentrifugert ved 20.000 g i 30 minutter. Til supernatanten ble det tilsatt 300 ml aceton. Denne blanding ble plassert på is i 30 minutter og deretter sentrifugert ved 5000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløst i 250 ml 6 M guanidin og 40 mM natriumacetat ved pH 4, og sendt over en 1200 ml G-25-kolonne ekvilibrert og betjent med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. hpG-CSF-toppen (ca. 400 ml) ble slått sammen og tilført en 15 ml CM-cellu-losekolonne ekvilibrert med 20 mM natriumacetat ved pH 5,4. Etter påfylling ble kolonnen vasket med 60 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 25 mM natriumklorid, og deretter ble kolonnen eluert med 200 ml 20 mM natriumacetat ved pH 5,4 og med 37 mM natriumklorid. 150 ml av dette elueringsmiddel ble oppkonsentrert til 10 ml og tilført en 300 ml G-75-kolonne ekvilibrert og betjent med 20 mM natriumacetat og 100 mM natriumklorid ved pH 5,4. Toppfraksjonene som utgjorde 35 ml, ble slått sammen og filtersterilisert. Sluttkonsentra-sjonen av hpG-CSF var 1,5 mg/ml, var mer enn 95% ren bestemt ved analyse på en gel og inneholdt mindre enn 0,5 mg pyrogen pr. 0,5 mg hpG-CSF. Pyrogennivået ble bestemt ved å bruke et prøvesett for "Limulus Amebocyte Lysate" (LAL) (M.A. Bio-products, Walkersville, Maryland) . ;Eksempel 8 ;Dette eksempel vedrører bruken av rekombinante metoder for å generere analoger av hpG-CSF hvor tilstedeværende cysteinrester i posisjonene 17, 36, 42, 64 og 74 individuelt ble erstattet med en passende aminosyrerest. ;Stedrettede mutagenesefremgangsmåter ifølge Souza et al., publisert PCT patentsøknad nr. WO85/00817, publisert 28. februar 1985, ble utført på (Met-1 ]-kodende DNA fra plasmid p536Ppo2, beskrevet nedenunder, ved å bruke syntetiske oligonukleotider som varierte i størrelse fra 20 til 23 baser, slik som vist i tabell XVIII nedenunder. Oligonukleotid nr. ;1 ga dannelse av et gen som koder for [Ser 17]hpG-CSF, oligonukleotid nr. 2 ga dannelse av [Ser 3 6]hpG-CSF, osv. ; De mot Cys til Ser stedrettede mutageneserestriksjoner ble utført ved å bruke M13 mplO med et Xbal- BamHI hpG-CSF-fragment isolert fra p536Ppo2 som et templat. DNA fra hver M13 mplO-klon inneholdende en Cys-Ser-substitusjon ble behandlet med Xbal og BamHI. Det resulterende fragment ble klonet inn i ekspresjonsvektor pCFM746 og ekspresjonspro-dukter ble isolert som i eksempel 7. ;Plasmidet pCFM746 kan konstrueres ved å spalte et plasmid pCFM73 6 (konstruksjonen av dette fra deponerte og ålment tilgjengelige materialer er beskrevet i Morris, publisertPCT patentsøknad nr. WO85/00829, publisert 28. februar 1985) med Clal og BamHI for å fjerne en tilstedeværende polylinker, og ved å bytte ut følgende polylinker. ; Ved en rensefremgangsmåte for Cys-Ser-analoger fremstilt ifølge oppfinnelsen ble ca. 10 - 15 g cellemasse på nytt oppslemmet i 40 ml 1 mM DTT og sendt 3 ganger gjennom en "French Pressure Cell" ved 10.000 psi. Suspensjonen av nedbrudte celler ble sentrifugert ved 1000 g i 30 minutter. Pelleten ble på nytt oppslemmet i 1% DOC, 5 mM EDTA, 5 mM DTT, 50 mM Tris, pH 9 og fikk blandes i 30 minutter ved værelsetemperatur. Blandingen ble sentrifugert ved 10.000 g i 30 minutter, på nytt oppslemmet i 40 ml 1^0 og resentrifu-gert ved 10.000 g i 30 minutter. Pelleten ble oppløst i 10 ml 2% "Sarkosyl", 50 mM DDT, 50 mM Tris, pH 8. Etter blanding i 1 time ble blandingen klaret ved sentrifugering ved 20.000 g i 30 minutter og deretter tilført en 300 ml G-75-kolonne ekvilibrert og betjent med 1% "Sarkosyl, 50 mM Tris, pH 8. Fraksjoner som inneholdt analogen, ble slått sammen og fikk oxyderes i luft ved henstand med eksponering mot luft i minst 1 dag. Sluttkonsentrasjonene varierte fra 0,5 til 5 mg/ml. ;Eksempel 9 ;I dette eksempel ble et ekspresjonssystem for pattedyrceller utformet for å sikre at et aktivt polypeptidpro-dukt av hpG-CSF-DNA kunne bli uttrykt i og utskilt fra pattedyrceller (COS-1, A.T.C.C. CRL-1650). Dette systemet ble utformet for å sørge for sekresjon av en polypeptidanalog til hpG-CSF via ekspresjon og sekresjonsbearbeiding av en delvis syntetisk, delvis cDNA-avledet konstruksjon som koder for [Ala^J-hpG-CSF som kommer etter et lederpolypeptid med den rekkefølge av rester som er tilskrevet human GM-CSF i Wong et al., Sience, 228, 810-815 (1985) og Lee et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 82, 4360-4364 (1985). ;Den ekspresjonsvektor som ble anvendt til foreløpige undersøkelser av ekspresjon av fremstilte polypeptidprodukter, var en 11 ferge "-vektor som omfatter både pBR322-og SV40-DNA som var blitt utformet for å gi autonom replika-sjon i både E. coli-celler og pattedyrceller, med pattedyrcelleekspresjon av innskutt eksogen DNA under kontroll av en virus-promoter/regulator-DNA-sekvens. Denne vektor, betegnet pSVDM-19, plassert i E. coli 101, ble deponert 3. august 1985, ved American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, og fikk tilvékstnum-meret A.T.C.C. 53241. ;De bestemte manipulasjoner som er involvert i konstruksjonen av ekspresjonsvektoren, var som følger. En leder-kodende DNA-sekvens ble syntetisert som angitt i tabell XX nedenunder. ; Som angitt i tabell XX, omfatter sekvensen Hindlll ogApal klebende ender og kodoner for de 17 aminosyrerestene ;som tilskrives "lederen" til human GM-CSF. Det følger kodoner som angir en alaninrest, en prolinrest og en leucinrest. Pro-lin- og leucinrestene duplikerer aminosyrene som er tilstede i stillingen +2 og +3 i hpG-CSF, mens alaninresten er et duplikat av den første aminoenderesten (+1) i GM-CSF, og ikke i hpG-CSF. Erstatning av threonin med alanin ble bestemt for lettere å gi korrekt vertcelle-"processing off" av GM-CSF-lederen ved hjelp av cellulære mekanismer som vanligvis er involvert i sekretorisk behandling av GM-CSF. ;Plasmid pSVDM-19 ble oppløst med Kpnl og oppløsnings-stedet ble gjort stumpt i endene med Klenow-enzym. Deretter ble DNA kuttet med Hindlll. Det resulterende store fragment ble kombinert og ligert med Hindlll/ PvuII-fragment vist i tabell VII (isolert fra plasmid Ppo2 som det neststørste fragment som resulterte fra Hindlll-oppløsning og delvis oppløs-ning med PvuII), hvorved det ble dannet plasmid pSV-Ppol. ;Det fremstilte GM-CSF-ledersekvensfragment ifølge tabell ;VIII ble så ligert inn i pSV-Ppol (etter dets spalting med Hindlll og Apal), hvorved man fikk plasmid pSVGM-Ppol. ;Kalsiumfosfatutfellinger (1-5 ug) av plasmid pSVGM-Ppol-DNA ble transformert i doble 6 0 ml plater med COS-1-celler, i det vesentlige som beskrevet i Wigler et al., Cell, 14, 725-731 (1978). Som en kontroll, ble også plasmid pSVDM-19 transformert i COS-l-celler. Vevkultursupernatanter ble inn-høstet 5 dager etter transfeksjon og analysert med hensyn på hpG-CSF-aktivitet. Utbytter av [Ala<1>]hpG-CSF fra kultursupernatanten var i størrelsesorden 1 til 2,5 ug/ml. ;Etter vellykket ekspresjon av det [Ala<1>]hpG-CSF-produkt-kodende plasmid pSVGM-Ppol i COS-l-celler, ble en annen vektor konstruert som omfattet den humane GM-CSF-ledersekvens, men hadde et kodon for en threoninrest (som naturlig opptrer i stilling 1 i hpG-CSF) som erstatning for kodonet for alanin i denne stillingen. I korte trekk ble et oligonukleotid syntetisert( 5'CAGCATCTCTACACCTCTGGG) for stedrettet mutagenese (SDM). hpG-CSF-fragmentet fra Hindlll til BamHI i pSVGM-Ppol ble ligert inn i Ml3mpl0 for SDM. Det nysyntetiserte hpG-CSF-gen som inneholdt et Thr-kodon i stilling 1, ble isolert ved spalting med Hindlll og EcoRI. Fragmentet ble deretter klonet inn i pSVDM-19 fremstilt ved spalting med de samme to restriksjonsendonukleasene. Den resulterende vektor pSVGM-Ppo(Thr) ble transformert inn i COS-celler og utbyttene av hpG-CSF målt i kultursupernatantene varierte fra 1 til ug/ml. ;Til slutt ble den genomsekvens som det er beskrevet isolering av i eksempel 5, anvendt til å danne en ekspresjonsvektor for pattedyrcelleekspresjon av hpG-CSF. Nærmere bestemt ble pSVDM-19 oppløst med Kpnl og Hindlll og det store fragmentet brukt i en fireveis ligering med en syntetisk linker med Hindlll og Ncol klebrige ender, som vist i tabell XXI. Et NcoI- BamHI-fragment som inneholdt exon 1 isolert fra pBR322 (8500 hpG-CSF), en genomsubklon og et BamHIII- Kpnl-fragment som inneholdt exoner 2-5 isolert fra plasmidet pBR322 (8500 hpG-CSF-genomsubklon). Den resulterende patte-dyrekspresjonsvektor, pSV/ghG-CSF ga 1 til 2,5 ug/ml hpG-CSF fra transformerte COS-celler. ; Eksempel 10 ;Dette eksempel, vedrører fysiske og biologiske egenskaper hos rekombinante polypeptidprodukter fremstilt ifølge oppfinnelsen. ;1. Molekylvekt ;Rekombinante hpG-CSF-produkter fra E. coli-ekspresjon som i eksempel 7 hadde en tilsynelatende molekylvekt på 18,8 kD når de ble bestemt i reduserende SDS-PAGE (som ville bli forutsagt ut fra den utledede aminosyreanalyse i tabell 7, mens naturlige isolater renset som beskrevet i eksempel 1 hadde en tilsynelatende molekylvekt på 19,6 kD. Tilstedeværelsen av N-glycaner forbundet med de naturlige isolater kunne effektivt utelukkes på grunnlag av mangelen på asparaginrester i primærsekvensen til hpG-CSF i tabell VII, og det ble derfor stilt opp en fremgangsmåte for å bestemme om 0-_. glycaner var ansvarlige for molekylvektforskjeller mellom naturlige isolater og de ikke-glycosylerte rekombinante produkter. Omtrent 5 ug av materialet fra det naturlige isolat ble behandlet med neuraminidase (Calbiochem., LaJolla, California) , en 0,5 ug prøve ble fjernet og det gjenværende materiale ble inkubert med 4 mU O- Glycanase (endo-x-n-acetyl-galactoseaminidase, Genzyme, Boston, Massachusetts) ved 37°C. Aliquoter ble fjernet etter en halv, 2 og 4 timer med inku-bering. Disse prøvene ble underkastet SDS-PAGE side om side med det rekombinante materiale avledet fra E. coli. Etter neuraminidasebehandling skiftet den tilsynelatende molekylvekt til isolatet fra 19,6 kD til 19,2 kD, noe som tyder på fjerning av en sailinsyrerest. Etter 2 timers behandling med O-glycanase skiftet molekylvekten til 18,8 kD, identisk med den tilsynelatende molekylvekt for det materiale som er avledet fra E. coli. Carbohydratstrukturens følsomhet overfor neuraminidase og O-glycanase antyder følgende struktur for carbohydratbestanddelen: N-acetylneuraminsyre-ot (2-6) (galac-tose-p-(1-3)-N-acetylgalactosamin-R, hvor R er serin eller threonin. ;2. Opptak av 3 H- thymidin ;Formeringsinduksjon av humane benmargceller ble under-søkt på grunnlag av økt innlemmelse av<3>H-thymidin. Human benmarg fra friske donorer ble utsatt for en densitetskutt med Ficoll-Hypaque (1,077 g/ml, Pharmacia) og celler med ;lav densitet ble oppslemmet i Iscove's medium (GIBCO) som inneholdt 10% bovint fosterserum og glutamin "pen-strep". Deretter ble 2 x 10 4 humane benmargceller inkubert med enten kontrollmedium eller det rekombinante E. coli materiale fra eksempel 7 i 96 flatbunnede brønnplater ved 37°C i 5% C02i luft i 2 dager. Prøvene ble undersøkt in duplo og konsentra- ;sjonen varierte over et område på 10.000 ganger. Kulturer ble deretter pulset i 4 timer med 0,5 u Ci/brønn med<3>H-thymidin (New England Nuclear, Boston, Massachusetts). Opp-taket av<3>H-thymidin ble målt som beskrevet i Ventua et al., Blood, 61, 781 (1983) . I denne prøven kan humane hpG-CSF-isolater indusere<3>H-thymidin-innlemmelse i humane benmargceller ved nivåer på omtrent 4-10 ganger høyere enn kon-trollsupernatanter. Det E. coli avledede hpG-CSF-materiale ifølge eksempel 6 hadde lignende egenskaper. ;En andre undersøkelse av human benmargcelleformering ble utført ved å bruke dyrkningsmedium fra transfiserte COS-l-celler slik disse er fremstilt i eksempel 9 og ga lignende resultater, noe som indikerte at kodede polypeptidprodukter faktisk ble utskilt i dyrkningsmedium som aktive stoffer. ;3. WEHI- 3B D+ differensieringsinduksjon ;Kapasiteten til rekombinante E. coli avledede materialer når det gjelder å indusere differensiering av den murine myelomocyttiske leukemi-cellelinje WEHI-3B D<+>ble undersøkt i halvfast agarmedium som beskrevet i Metcalf, Int. J. Cancer, 25, 225 (1980). Det rekombinante hpG-CSF-produkt og mediekontroller ble inkubert med ca. 60 WEHI-3B D<+>celler/ brønn ved 37°C i 5% CO2i luft i 7 dager. Prøvene ble inkubert i 24 flatbunnede brønnplater og konsentrasjonen varierte over et område på 2000 ganger. Koloniene ble klassifisert som ikke-differensierte, delvis differensierte eller fullstendig differensierte, og kolonicelletellinger ble utført mikroskopisk. E. coli rekombinantmateriale ble funnet å indusere differensiering. ;4. CFU- GM-, BFU- E- og CFU- GEMM- analyser ;Naturlige isolater av human G-CSF (hpG-CSF) med flere forskjellige virkninger og det rekombinante humane G-CSF (rhpG-CSF) med flere forskjellige virkninger ble funnet å forårsake at humane benmargceller formerer seg og differen-sieres. Disse aktivitetene ble målt i CFU-GM [Broxmeyer et al., Exp. Hema tol., 5_, 87, (1971] BFU-E- og CFU-GEMM-analyser [Lu et al., Blood, 61, 250 (1983)] under anvendelse av lavdensitets, ikke-vedhengende benmargceller fra friske humane frivillige. En sammenligning av de biologiske virkninger av CFU-GM, BFU-E og CFU-GEMM under anvendelse av enten 500 enheter hpG-CSF eller rhgG-CSF er vist i tabell XXII nedenunder. ;Alle kolonianalysene ble utført med lavdensitets ikke-vedhengende benmargceller. Humane benmargceller ble utsatt for en densitetskutt med Ficoll-Hypaque (densitet, 1,077 g/ cm 3, Pharmacia). Lavdensitetscellene ble deretter på nytt oppslemmet i Iscove's modifiserte Dulbecco's medium som inneholdt kalvefosterserum og plassert for binding på Falcon vevkultur-plater (Nr. 3003, Becton Dickenson, Cockeysville, MD.) il-l/2 time ved 37°C. ; Mediumkontroll besto av Iscove's modifiserte Dulbecco's medium pluss 10% FCS, 0,2 mM hemin og 1 enhet rekombinant erythropoietin. ;For CUF-GM-analysen ble målceller platet ut ved ;1 x 10 i 1 ml 0,3% agardyrkningsmedium som omfattet supplert McCoy's 5A medium og 10% varmeinaktivert kalvefosterserum.Kulturer ble bedømt med hensyn på kolonier (mer enn 40 celler pr. aggregat) og morfologi bestemt på dag 7 av dyrkingen. Antallet kolonier er vist som middelverdien - SEM bestemt fra plater in kvadrupel. ;For BFU-E- og CFU-GEMM-analysene ble celler (1 x IO<5>) tilsatt til en 1 ml blanding av Iscove<*>s modifiserte Dul-becco's medium (GIBCO), 0,8% ethylcellulose, 30% kalvefosterserum, 0,05 nM 2-mercaptoethanol, 0,2 mM hemin og 1 enhet rekombinant erythropoietin. Plater ble inkubert i en fuktet atmosfære av 5% C02og 5% 02. Lav oxygenspenning ble oppnådd ved å bruke et oxygenreduksjonsapparat fra Reming Bioinstru-ments (Syracuse, N.Y.). Kolonier ble bedømt etter 14 dagers inkubasjon. Antallet kolonier er vist som gjennomsnitts-verdien - SEM, som bestemt ut fra plater in duplo.

Kolonier dannet i CFU-GM-analysen ble alle funnet å være kloracetatesterasepositive og ikke-spesifikk esterase (ot-nafthylacetatesterase)-negative, i overensstemmelse med at koloniene er granulocytter av type. Både naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF ble funnet å ha en spesifikk aktivitet på omtrent 1 x 10 g E/mg rent protein når de ble analysert ved hjelp av seriefortynning i en CFU-GEMM-prøve. BFU-E- og CFU-GEMM-dataene i tabell XXII er representative for tre separate for-søk og svarende til de data som er rapportert tidligere for naturlig hpG-CSF. Det er viktig å legge merke til at rhpG-CSF er svært rent og fritt for andre potensielle pattedyr-vekstfaktorer i kraft av fremstillingen i E. coli. Således er rhpG-CSF i stand til å understøtte blandet kolonidannelse (CFU-FEMM) og BFU-E når det tilsettes i nærvær av rekombinant erythropoietin.

5. Prøver på cellebindinq

Det ble tidligere rapportert at WEHI-3B(D<+>)-celler og humane leukemiceller fra nydiagnostiserte leukemier vil

125 binde I-merket murin G-CSF og at denne binding kan gjøres fullstendig ved tilsetning av umerket G-CSF eller humanCSF-(3. Evnen til naturlig hpG-CSF og rhpG-CSF når det gjelder å konkurrere for binding av<1>25I-hpG-CSF til humane og murine leukemiceller, ble testet. Sterkt renset naturlig hpG-CSF (mer enn 95% rent, 1 ug) ble jodert [Tejedor et al., Anal.Biochem., 127, 143 (1982) ] og ble separert fra reaktanter ved hjelp av gelfiltrering og ionebytterkromatografi. Den

125

spesifikke aktivitet til den naturlige I-hpG-CSF var omtrent uCi/ug protein. Murin WEHI-3B(D<+>) og to humane myeloid-leukemicellepreparater fra perifert blod (ANLL, en klassifisert som M4, den andre som M5B) ble testet med henyn på evne til å binde<125>I-hpG-CSF.

De murine og nylig erholdte humane myeloidleukemi-celler fra perifert blod ble vasket tre ganger med PBS/1%

BSA. WEHI-3B(D<+>)-celler (5 x IO<6>) eller nye leukemiceller

(3 x IO<6>) ble inkubert in duplo i PBS/1% BSA (100 ul) i fravær eller nærvær av forskjellige konsentrasjoner (volum: 10 ul) med umerket hpG-CSF, rhpG-CSF eller GM-CSF, og i nærvær av<125>I-hpG-CSF (omtrent 100.000 cpm eller 1 ng) ved 0°C

i 90 minutter (totalt volum: 120 ul). Cellene ble deretter på nytt oppslemmet og lagt opp på 200 pl iskald FCS i et 350 ul sentrifugerør av plast og sentrifugert (1000 g, 1 minutt). Pelleten ble samlet opp ved å kutte av enden av røret og pellet og supernatant telt hver for seg i en -jr-teller (Packard).

Spesifikk binding (cpm) ble bestemt som total binding

i fravær av en konkurrent (gjennomsnitt av duplikater) minus binding (cpm) i nærvær av 100 gangers overskudd umerket hpG-CSF (ikke-spesifikk binding). Den ikke-spesifikke binding var maksimalt 2503 cpm for WEHI-3B(D<+>)-celler, 1072

cpm for ANLL (M4)-celler og 1125 cpm for ANLL (M5B)-celler. Forsøk 1 og 2 ble utført på forskjellige dager under an-

125 . vendelse av det samme preparat av I-hpG-CSF og gir inn-byrdes overensstemmelse i den prosentvise inhibering som fåes for 2000 enheter hpG-CSF. Erholdte data er gjengitt i tabell XXIII nedenunder.

125

Som vist i tabell XXIII, oppviste I-hpG-CSF binding til WEHI-3B(D<+>) leukemiceller. Bindingen ble inhibert på en doseavhengig måte ved hjelp av umerket naturlig hpG-CSF

eller rhpG-CSF, men ikke med GM-CSF. I tillegg ble binding av naturlig hpG-CSF til humane myelomonocyttiske leukemiceller (ANLL, M4) iakttatt. Bindingen til disse cellene ble sammenlignet med hensyn på respons med naturlig hpG-CSF i væskekul-turer ved differensiering til ferdige makrofager bedømt ved

125

hjelp av morfologi. Fraværet av binding av naturlig I-hpG-CSF til monocyttiske leukemiceller fra en annen pasient (ANLL,

M5B) antyder at visse leukemier differensielt kan uttrykke eller mangle reseptorer for hpG-CSF. Evnen til rhpG-CSF når det gjelder å konkurrere for binding av naturlig<125>I-hpG-CSF på samme måte som naturlighpG-CSF,antyder at reseptorene gjenkjenner begge formene like godt.

Disse undersøkelsene som viser bindingen av naturlig

125

I-merket hpG-CSF til leukemiceller, ble sammenlignet i kultur ved hjelp av naturlig hpG-CSF's evne til å indusere granulocyttisk og monocyttisk differensiering av benmargceller med lav densitet erholdt fra en pasient med en akutt promyelocyttisk leukemi (M3) og en andre pasient med en akutt myeloblastisk leukemi (M2). Celler fra hver pasient ble dyrket i 4 dager i medium alene eller i nærvær av 1 x IO<5>enheter rhpG-CSF. Celler fra M3-kontrollkulturene inkubert i medium alene var fortsatt promyelocyttisk av type; mens celler dyrket i nærvær av rhpG-CSF oppviste ferdige celler av myeloid-typen inkludert en metamyelocytt, "giant band"-form og segmenterte neutrofiler og monocytt. De faktiske forskjeller

for denne pasienten, på 100 celler evaluert for kontrollen, 100% promyelocytter, og for de behandlede rhpG-CSF-celler,

22% blåster pluss promyelocytter, 7% myelocytter, 35% metamyelocytter, 20% "band"-former pluss segmenterte neutrofiler, 14% monocytter og 2% makrofager. Det bør legges merke til det faktum at en av de polymorfonukleære granulocytter fortsatt inneholdt en fremtredende Auer-stav, hvilket tyder på

at i det minste denne cellen utgjorde en differensiert celle som tilhører den leukemiske klon. Celler fra den andre pasienten med en myeloblastisk leukemi (M2) ble også dyrket i

4 dager i nærvær eller fravær av rhpG-CSF. Visuell analyse av M2-celler dyrket i medium alene avslørte store "blast-lignende" celler, hvorav noen hadde nukleoler. Noen av M2-cellene differensierte, når de ble behandlet med rhpG-CSF, til ferdig segmenterte neutrofiler med rester av Auer-staver i sentrumsneutrof ilen, noe som tyder på at dif f erensiering_. har oppstått i en celle som tilhører den leukemiske klon. Den faktiske differensiering av 100 celler evaluert morfo-logisk avslørte at kontrollceller besto av 100% blastceller. rhpG-CSF-behandlede celler besto av 43% blastceller, 1% myelocytter, 15% metamyelocytter. 28% "Band"-former pluss segmenterte neutrofiler, 2% promonocytter og 11% monocytter. Leukemicellen ble også undersøkt med hensyn på differens-lering ved 4 andre konsentrasjoner av rhpG-CSF (5 x 10 3), 1 x IO<4>, 2,5 x IO<4>og 5 x IO<4>E/ml, data ikke vist). Selv ved den laveste konsentrasjon av rhpG-CSF som ble testet (5 x 10<3>E/ml), var det signifikant differensiering (celler differensierte utover myelocytter) av M3-(50%) og M2-(37%) leukemiceller .

6. Immunologisk analyse

For å fremstille polyklonale antistoffer for bruk

ved immunologisk analyse, var det antigen som ble anvendt, G-CSF med flere forskjellige virkninger renset fra den humane urinblære-carcinomcellelinje 5637 (1A6) fremstilt ifølge eksempel 1 (B). Dette materiale ble bedømt til å være 85% rent basert på sølvnitratfarging av polyacrylamidgeler. 6 uker gamle Balb/C-mus ble immunisert med subkutane injek-sjoner av antigen på flere steder. Antigenet ble på nytt oppslemmet i PBS og emulgert med like store volumdeler Freund's komplette hjelpestoff. Dosen var 5 - 7 ug antigen pr. mus pr. injeksjon. En forsterkningsimmunisering ble administrert 18 dager senere med den samme mengde antigen emulgert med et like stort volum Freund's ukomplette hjelpestoff. 4 dager senere ble det tatt ut museserum for å teste med hensyn på

det antistoff som er spesifikt for human G-CSF med flere forskjellige virkninger.

"Dynatech Immulon II Removawell"-stripper

i holdere (Dynateck Lab., Inc., Alexandria, Virginia) ble belagt med 5 ug/ml hpG-CSF i 50 mM carbonat/bicarbonat-buffer, pH 9,2. Brønner ble belagt med 0,25 ug i et volum på 50 ul. Antigenbelagte plater ble inkubert 2 timer ved værelsetemperatur og over natten ved 4°C. Oppløsningen ble dekantert og platene ble inkubert i 30 minutter med PBS som inneholdt 5-%-BSA for å blokkere den reaktive overflate. Denne oppløsning ble dekantert og de fortynnede preimmun- eller testsera ble tilsatt til brønnene og det ble inkubert i 2 timer ved værelsetemperatur. Sera ble fortynnet med PBS, pH 7,0, som inneholdt 5% BSA. Serumoppløsningen ble dekantert og platene ble vasket tre ganger med "Wash Solution" (KPL, Gaithers-burg, Maryland). Omtrent 200.000 cpm jodert kanin-anti-mus-IgG (NEN, Boston, Massachusetts) i 50 ul PBS, pH 7,0, som inneholdt 1% BSA, ble tilsatt til hver brønn. Etter inku-bering i 1 - 1/2 time ved værelsetemperatur ble oppløsningen dekantert og platene ble vasket 5 ganger med "Wash Solution". Brønner ble fjernet fra holder og helt i en Beckman 5500 teller. Høy-titrede museserum oppviste mer enn 12 ganger høyere reaktivitet enn de tilsvarende preimmunsera ved en fortynning på 1:100.

De immunologiske egenskaper til hpG-CSF avledet fra

E. coli ble bestemt ved hjelp.av reaktivitet til høy-titretmuseserum som er spesifikt for pattedyrcelleavledet hpG-CSF. 0,25 ug 90% rent protein avledet fra E. coli ble belagt på "Immulon II Removawells" i et volum på 50 ul og museserum ble analysert som beskrevet ovenfor.

Høytitrede musesera oppviste 24 ganger høyere reaktivitet mot materiale avledet fra E. coli enn de tilsvarende preimmunsera ved en fortynning på 1:100.

7. Biologiske analyser av Serin analoger

[Ser<17>]hpG-CSF-, [Ser3<6>]hpG-CSF-, [Ser<42>]hpG-CSF-, [Ser<64>]hpG-CSF- og [Ser<74>]hpG-CSF-produkter fremstilt ifølge eksempel 9 ble analysert med hensyn på hpG-CSF-aktivitet i

<3>H-thymidin-opptaks-, CFU-GM- ogWEHI3BD+-prøver. Il.hver prøve hadde [ser 17]-analogen en aktivitet som var sammenlignbar med aktiviteten til rekombinante molekyler med den naturlig fore-

kommende struktur. De gjenværende analoger hadde i størrelses-orden 100 ganger mindre aktivitet i<3>H-thymidin-opptaksprøven, 250 ganger mindre aktivitet i CFU-GM-prøven og 500 ganger mindre aktivitet i WEHI-3B D<+->prøven. Disse data understøtter forslaget om at cysteiner i stillingen 36, 42, 64 og 74 kan være nødvendig for full biologisk aktivitet.

8. In vivo biologisk analyse

Osmotiske pumper av type "Alzet" (Alzet Corp., Palo Alto, CA; Model 2001) ble tilknyttet innsatte katetere i den høyre halsvene som var implantert subkutant i 7 syriske gull-hamstere av hankjønn. 4 av pumpene inneholdt en buffer [20 mM natriumacetat (pH 5,4) og 37 mM natriumklorid] og 1,5 mg/ml hpG-CSF avledet fra E. coli, mens 3 inneholdt buffer alene. Den pumpehastighet som var påkrevet for de osmotiske pumpene, var 1 ul/time i opp til 7 dager. På den tredje dag etter im-plantering av pumpene var det gjennomsnittlige granulocytt-tall for de 4 behandlede hamstere 6 ganger høyere enn for de 3 (buffer) kontrollene, og det økte granulocytt-tall ble gjenspeilet i en 4 ganger økning i totalt antall lymfocytter. Erythrocytt-tall var uforandret etter behandlingen. Disse resultatene indikerer at det rekombinante materiale gir en spesifikk økning i produksjon og/eller frigivelse.av granulocytter i et pattedyr.

I tillegg til de naturlig forekommende allelformer av hpG-CSF, omfatter foreliggende oppfinnelse også andre hpG-CSF-produkter, slik som polypeptidanaloger av hpG-fCSF og fragmenter av hpG-SCF. Ved å følge fremgangsmåten>ifølge den ovenfor angitte publiserte søknad fra Alton et ali, (WO/83/ 04053), kan man lett utforme og fremstille gener som koder for mikrobiell ekspresjon av polypeptider med primærkonfor-masjoner som adskiller seg fra konformasjonene som her er

l angitt når det gjelder identiteten av eller plasseringen av én eller flere rester (f.eks. substitusjoner, terminale og mellomliggende addisjoner og "deletions"). Alternativt kan modifikasjoner av cDNA og genomgener lett utføres ved hjelp av velkjente stedsrettede mutageneseteknikker, og anvendes til å frembringe analoger og derivater derav. Slike produkter

ville ha minst én av de biologiske egenskapene til hpG-CSF, men kan være forskjellig med hensyn til andre. Som eksempler

>mfatter tilsiktede produkter fremstilt ifølge oppfinnelsen de som er blitt forkortet ved f.eks. "deletions"; eller de som er ier stabile overfor hydrolyse (og derfor kan ha mer uttalte iller langvarige virkninger enn naturlig forekommende produk-:er); eller de som er blitt endret for å fjerne ett eller :lere potensielle steder for O-glycosylering (som kan resul-:ere i høyere aktiviteter for gjærproduserte produkter); eller som har én eller flere cysteinrester fjernet eller erstattet ned, f.eks. alanin- eller serinrester, og er potensielt Lettere å isolere i aktiv form fra mikrobesystemer; eller som iar én eller flere tyrisonrester erstattet med fenylalanin og kan binde mer eller mindre lett til hpG-CSF-reseptorer på målceller. Også omfattet er polypeptidfragmenter som duplikerer bare en del av den kontinuerlige aminosyresekvens eller sekundære konformasjoner i hpG-CSF, fragmenter som kan ha én aktivitet (f.eks. reseptorbinding) og ikke andre (f.eks. kolonivekststimulerende aktivitet). Det er verd å merke seg at aktiviteten ikke er nødvendig for at ett eller flere av produktene fremstilt ifølge oppfinnelsen skal ha terapeutisk utnyttbarhet [se Weiland et al., Blut. 44, 173-175 (1982)] eller utnyttbarhet i andre sammenhenger, slik som i prøver på hpG-CSF-antagonisme. Konkurrerende antagonister kan være svært nyttige i f.eks. tilfeller med overproduksjon av hpG-CSF.

Den DNA-sekvens som her er beskrevet og som koder for hpG-CSF-polypeptider, er verdifull med hensyn til den informasjon som tilveiebringes vedrørende aminosyresekvensen til pattedyr-proteinet som hittil har vært utilgjengelig til tross for analytisk bearbeiding av isolater av naturlig forekommende produkter. DNA-sekvensene er også påfallende verdifulle som produkter som kan brukes til å bevirke mikrobiell syntese av hpG-CSF i stor skala ved hjelp av en rekke forskjellige rekombinante teknikker. Sagt på en annen måte så er DNA-sekvenser som er tilveiebragt, anvendbare når det gjelder å frembringe nye og nyttige virale og ringformede plasmid-DNA-vektorer, nye og nyttige transformerte og transfiserte mikrobi elle prokaryote og eukaryote vertceller (inkludert bakterie-og gjærceller og pattedyrceller dyrket i kultur), og nye og nyttige metoder for vekst i kultur av slike mikrobevertceller som er i stand til å gi ekspresjon av hpG-CSF og dets beslektede produkter. DNA-sekvenser som anvendes er også påfallende egnede matrialer for bruk som merkede prober ved isolering av hpG-CSF og beslektede protein-kodende human genom-DNA, samt cDNA- og genom-DNA-sekvenser for andre pattedyrarter. DNA-sekvenser kan også være anvendbare ved forskjellige alter-native fremgangsmåter for proteinsyntese (f.eks. i insektcel-ler), eller ved genetisk terapi av mennesker og andre pattedyr. DNA-sekvenser som anvendes forventes å være anvendbare ved utvikling av transgenetiske pattedyrarter som kan tjene som eukaryote "verter" for fremstilling av hpG-CSF og hpG-CSF-produkter i større mengder. Det vises generelt til Palmiter et al., Science. 224( 4625). 809-814 (1983).

Anvendbare på hpG-CSF-fragmenter og polypeptidanaloger fremstilt ifølge oppfinnelsen er rapporter vedrørende den immunologiske aktivitet til syntetiske peptider som i vesentlig grad duplikerer aminosyresekvensen som finnes i naturlig forekommende proteiner, glycoproteiner og nukleoproteiner. Nærmere bestemt er forholdsvis lavmolekylære polypeptider blitt påvist å delta i immunreaksjoner som i varighet og utstrekning er lik

med immunreaksjonene til fysiologisk signifikante proteiner, slik som virusantigener, polypeptidhormoner og lignende. Inkludert blant immunreaksjonene til slike polypeptider er fremkallingen av dannelse av spesifikke antistoffer i immunologisk aktive dyr. Se f.eks. Lerner et al., Cell, 23, 309-

310 (1981); Ross et al., Nature, 294, 654-656 (1981); Walter et al., Proe. Nati. Acad. Sei ( USA), 77'5197-5200 (1980); Lerner et al., Proe. Nati. Acad. Sei ( USA), 78, 3403-3407

(1981) ; Walter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA), 78, 4882-4886 (1981); Wong et al., Proe. Nati. Acad. Sei. ( USA) , 78, 7412-7416 (1981); Green et al., Cell, .28, 477-487 (1982);

Nigg et al., Proe. Nati. Acad, Sei. ( USA), 79, 5322-5326

(1982) ; Baron et al., Cell, 28, 395-404 (1982); Dreesman et al., Nature, 295, 185-160 (1982) og Kerner et al., Scientific American, 248, nr. 2, 66-74 (1983). Se også Kaiser et al., Science, 223, 249-255 (1984) vedrørende biologiske og immunologiske virkninger av syntetiske peptider som omtrentlig deler sekundærstrukturer hos peptidhormoner, men ikke be-høver å dele deres primære strukturkonformasjon.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid,karakterisert vedat den omfatter dyrking under egnede næringsbetingelser av prokaryote eller eukaryote vertsceller som er transformert eller transfektert med en renset og isolert DNA-sekvens som koder for ekspresjon av et polypeptid med én eller flere av de hematopoietiske biologiske egenskapene til naturlig forekommende granulocyttkolonistimu-lerende faktor (hpG-CSF) med flere forskjellige virkninger, og en del av eller hele hpG-CSF-aminosyresekvensen angitt i tabellene VII og VIII, eller en polypeptidanalog derav med samme biologiske virkning, og isolering av ønskede polypeptidprodukter fra ekspresjonen av DNA-sekvenser.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-sekvensen koder for en analog av hpG-CSF valgt fra gruppen bestående av: [Ser<17>]hpG-CSF, [Ala^hpG-CSF, [Ser<36>]hpG-CSF, [Ser<42>]hpG-CSF, [Ser<64>]hpG-CSF, [Ser<74>]hpG-CSF, [Mef ^hpG-CSF, [Met'<1>, Ser17]hpG-CSF, [Mef1, Ser<36>]hpG-CSF, [Met-<1>, Ser<42>]hpG-CSF, [Met-<1>, Ser<64>]hpG-CSF og [Mef1, Ser<74>]hpG-CSF.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert vedat DNA-sekvensen koder for aminosyresekvensen 1-174 ifølge tabell VII, med en ytterligere metionylrest i stilling -1.