NO180239B - Ekspresjonsvektor som koder for, og kan uttrykke et polypeptid med de biologiske og immunologiske egenskapene til EqIFN-, vertsorganisme transformert med denne, og fremgangsmåte for fremstilling av nevnte polypeptid - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en ekspresjonsvektor

som koder for, og kan uttrykke et polypeptid med de biologiske og immunologiske egenskapene til EqIFN-"Y, en vertsorganisme transformert med ekspresjonsvektoren, og en fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med de biologiske og immunologiske egenskapene til EqIFN-"Y. Dertil beskrives anvendelsen av proteinene.

Interferoner er proteiner som utskilles fra eukaryotiske celler etter virusinfeksjoner eller andre stimuleringer og på sin side kan beskytte cellene mot virusinfeksjoner. Tre klasser interferoner er for tiden kjente: De angis med interferon-a, interferon-/3 og interferon-gamma, (forkortet I FN-a, I FN-/? og IFN-gamma) . De adskiller seg i sin oppbygning

og i sine virkninger. Således kan interferonene påvirke immunsystemets celler regulerende eller også difrensieringen av celler og veksten av tumorer.

F. Wheelock oppdaget i 1965 et polypeptid som beskyttet bestemte celler mot virusinfeksjoner (Science 149, 310 (1965). Polypeptider med disse egenskaper kalles Immun-Interferon, TypII-interferon, Interferon-gamma eller IFN-gamma, skjønt det her dreier seg om et polypeptid som hører til klassen lymfokiner. Ved siden av human-interferon-gamma er det hittil kjent storfe-, muse- og rotte-interferon-gamma. Alle hittil kjente gamma-interferoner foreligger i glykosilert form, hvorunder glykosileringen imidlertid ikke utøver noen innflytelse på den biologiske aktiviteten (Keller et al., J. Biol. Chem. 258, 8010 (1983)).

I lang tid ble det antatt at interferonene virker spesifikt. In vitro-forsøk viste imidlertid at IFN-

preparatene fra kveg kunne utløse en antivirus-virkning hos aper og hos mennesker (Tovey, M.G. et al., J. Gen. Virol 36, 341-344 (1977). Denne arts-interaktiviteten henger muligens sammen med mer eller mindre stor homologi av genene hhv. proteinene; p.g.a de små mengder animalske interferoner kunne den antagelsen ikke kontrolleres.

Til tross for de fastslåtte arts-interaktiviteter er bivirkningene så som antigeniteter ved anvendelsen av artsfremde interferoner å finne som ikke kan tolereres for en terapi.

Da imidlertid på den annen side nytte- og husdyrhold har en betydelig økonomisk verdi, består et behov for interferoner for de forskjellige arter som veterinæren kan anvende.

Meget rent dyreinterferon fra forskjellige arter ville dertil by på kjærkommen anledning til å undersøke virkemeka-nismene for interferoner, for å komme til modellforestillinger som kunne overføres til menneskene.

De første undersøkelser med animalske interferoner ble utført med preparater av naturlig cellemateriale; utbytte og renhet av interferoner fremstilt ved denne fremgangsmåten viser at de er uegnet for fremstilling av legemidler.

Ved utviklingen av den rekombinante DNA-teknikk er det mulig å produsere heterologe proteiner fra mikroorganismer. Således ble det f.eks. også fremstilt human-interferoner (Hu-IFN); i den seneste tid også forskjellige ikke-human-interferoner .

Oppgaven for foreliggende oppfinnelse var å fremstille heste-interferon-gamma på genteknisk måte og frembringe de nødvendige DNA-sekvenser for dette.

Denne oppgaven løses ved anvendelse av den såkalte probeteknikk. Som probe anvendtes en DNA-sekvens kjent fra literaturen avledet fra det humane gamma-interferon (Gray og Goeddel; Nature 298/ 859-863 (1982)).

Likeledes er imidlertid også del- eller fullstendige sekvenser fra andre gamma-interferoner egnet som prober. Som utgangsmateriale ved søkningen tjente et DNA-bibliotek som stammet fra hestens normale levervev. For første gang kunne derigjennom genet som koder for EqIFN-gamma med de flankerende områder og den etterfølgende formel I isoleres:

Bemerkelsesverdig er det at EqIFN-gamma i likhet med alle andre hittil kjente gamma-interferoner i den aktuelle organisme kodes for av et gen som har store sekvenser som avbryter strukturgenet: Genene består av eksoner og introner, hvorunder bare eksonene koder for proteinet. Intronene kan bare forstås av bestemte systemer, f.eks. av systemer i pattedyrceller. For andre systemer, f.eks. i E.coli, kan DNA-sekvensen som inneholder introner ikke anvendes.

En videre oppgave for den foreliggende oppfinnelse var det derfor å frembringe en intron-fri DNA-sekvens som koder for EqIFN-gamma.

Løsningen av denne oppgaven er prinsipielt mulig på to måter.

1. På veien fra cellekjernen hvori transkripsjonen finner sted skjæres intronene ut i cytoplasmaet og ved spleising av ekson-RNA-fragmentene dannes mRNA-et til det eukaryotiske proteinet. Dette mRNA lar seg omkopiere med et enzym, den reverse transkriptase, i et DNA som kalles "copy-DNA" (cDNA).

Disse intron-frie DNA kan så innsettes i egnede plasmider som deretter sammen med egnede vertsorganismer, f.eks. E.coli, kan anvendes for produksjon av eukaryotiske proteiner i foreliggende tilfelle av EqIFN-gamma. Degenerasjonen av den genetiske kode kan virke uheldig ved denne fremgangsmåten. Denne degenerasjonen fører nemlig til at forskjellige organismer anvender forskjellige kodoner for de samme aminosyrer. Ved ikke-optimal tilpasning av det anvendte DNA kan man derfor få en dårligere ekspresjon av et eukaryotisk protein i en prokaryotisk system. 2. Den andre mulighet til å oppnå en intron-fri DNA-sekvens for et eukaryotisk gen består i med kjennskap til den kromosomale DNA-sekvens kjemisk å syntetisere en intron-fri DNA-sekvens. Som spesielt egnet for løsningen av oppgaven for opp finnelsen viste DNA-sekvensen med formel III seg å være som kan fremstilles etter i og for seg kjente fremgangsmåter. 16 forskjellige oligonukleotider ble nå syntetisert i to varianter. Den første fullstendige varianten koder for ferdig EqIFN-gamma med 146 aminosyrer pluss startmetionin (formel III), den andre for et polypeptid som er forkortet med 3 aminosyrer på amino-enden pluss startmetionin.

Begge varianter lar seg lett modifisere ved at man i stedet for ATG som koder for metionin tilknytter en sekvens som koder for et hydrofobt signalpeptid, f.eks. med formel IV.

ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC

Formel IV

Ved en slik signalfrekvens bevirkes sekresjonen av det ønskede polypeptid fra cytoplasmaet i bestemte vertsorganismer. Herunder behandles proteinet og signalpeptidet åvspaltes; man får det ferdige protein. Celler av vertsorganismer, f.eks. E.coli, som ikke er i stand til å behandle polypeptider som inneholder signalpeptidsekvensen, må opp-sluttes for å isolere det "uferdige" polypeptid. Også disse "uferdige" ÉqlFN-gammaer med fullstendig eller ufullstendig signalpeptidsekvenser er gjenstand for foreliggende oppfinnelse.

Startmetioninet lar seg skille fra på i og for seg kjente fremgangsmåter, f.eks. med CNBr eller CNC1, for å oppnå ferdig EqIFN-gamma.

Denne DNA-sekvensen koder for EqIFN-gamma, men inneholder utelukkende slike kodoner som anvendes i sterkt eksprimerte celleegne gener hos E.coli (Gouy og Gautier, Nucl. Acids Res. 10, 7055 (1982)).

En oppgave for foreliggende oppfinnelse besto videre i for første gang å frembringe EqIFN-gamma i homogen ren form.

Som allerede nevnt er isoleringen og rensingen av EqIFN-gamma fra naturlig cellemateriale ikke egnet for å løse denne oppgaven tilfredstillende. I oppfinnelsen anvendes derfor DNA-sekvensene med formel II, III og Illa for løsning av denne oppgaven. Denne sekvensen utstyres med tilsvarende kontrollsekvenser, innbygges i egnede vektorer og vertsorganismer eller vertscellekulturer som er transformert med disse dyrkes.

Ekspresjonsvektoren ifølge oppfinnelsen av den innled-ningsvis nevnte art er særpreget ved at den omfatter et DNA-molekyl som koder for et polypeptid med de biologiske og immunologiske egenskapene til EqIFN-7 med en sekvens som inneholder tryptofan-promotoren, valgt fra gruppen

hvori R<1> betyr

eller

TAT

og

hvori R<2> betyr

eller CAG

eller redundante variasjoner av de nevnte DNA-sekvenvene, hvilket DNA-molekyl er egnet for ekspresjon i Echerichia coli og er funksjonelt bundet til en ekspresjonskontrollsekvens.

De dannede polypeptider isoleres og renses ved kjente fremgangsmåter. De oppnådde polypeptider tilsvarer den følgende formel: hhv.

Ved anvendelse av den kromosomale sekvens (formel II) får man etter transformasjon av pattedyrceller EqIFN-gamma i den naturlige forekommende, glykosylerte form (autentisk EqIFN-gamma) .

Sekvensene med formel II, III hhv. Illa er f.eks. egnet for fremstilling av EqIFN-gamma i mikroorganismer, spesielt ved fremstillingen av EqIFN-gamma i E.coli, hvorunder polypeptidet eksprimeres i ikke-glykosylert form.

En videre oppgave for foreliggende oppfinnelse besto i å frembringe modifikasjoner av det naturlige EqIFN-gamma.

Modifikasjoner av et protein kan man fremstille, idet man f.eks. enten derivatiserer proteinet eller fragmenterer ved enzym-spaltning, eller modifiserer DNA-sekvensen som koder for proteinet ved delesjon eller fragmentering, og bringer denne sekvensen til ekspresjon i en egnet vertsorganisme.

For bruk i oppfinnelsen syntetiseres DNA-sekvensene som koder for modifikasjoner av EqIFN-gamma. For å muliggjøre en enkel manipulasjon av genet for forandringer av enkelte avsnitt, innbygges flere singulære restriksjonsenzym-

spaltningssteder i den fullstendige DNA-sekvensen.

Et polypeptid med de biologiske og immunologiske egenskapene til EqIFN-*Y fremstilles ifølge oppfinnelsen ved at a) E. coli transformeres med en ekspresjonsvektor ifølge krav 1-3 som koder for, og er istand til å uttrykke,

dette polypeotid; og

b) denne transformerte E.coli mikroorganismen dyrkes, og

c) polypeptidet isoleres.

For å løse den stilte oppgaven, ble høymolekylære DNA fra

et vev av hester, fortrinnsvis fra leveren isolert etter en modifisert fremgangsmåte ifølge Blin og Stafford (Blin, N.; Stafford, P.W. Nucl. Acids Res. (1976) 3 2303-2308) og fragmentert statistisk ved hjelp av spesielle endonukleaser. De derved oppnådde forskjellige store fragmenter ble fraksjonert etter størrelsen, fortrinnsvis for dannelse av 10 - 23 kb fragmenter, for å klones i en vektor, f.eks. i en lambda-vektor, f.eks. lambda EMBL3A. Deretter ble disse vektorer formert etter transformasjon i en vertsorganisme, f.eks. "E.coli. Dette equine DNA-bibliotek ble undersøkt ved hjelp av en human gamme-interferon "probe" under ikke stringente hybridiseringsbetingelser. Den lave stringens gjøre det mulig å finne DNA-sekvenser med forskjeller fra "proben".

De kan enten fremstilles ved spaltning av kjente plasmider fra literaturen ved hjelp av restriksjonsenzymer eller ved kjemisk syntese ved hjelp av i og for seg kjente oligonukleotid-syntese-fremgangsmåter. Denne "probe" har sekvensen som koder for HuIFN-gamma. Fem lambda-kloner kunne identifiseres som ga positive hybridiseringssignaler.

Fra disse isolerte rekombinante fager ble DNA-et renset ved vanlige metoder. Fag-DNA-ene ble karakterisert etter spaltning med forskjellige restriksjonsenzymer og etter-følgende Southern-analyse (Southern, J. Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) ved hybridisering med HuIFN-gamma "proben". Et singulært hybridiserende 4,6 kb langt BamHI fragment fra klonet lambda Eq-gamma-2 ble isolert og klonet i BamHI skjæringsstedet til plasmidet pUC9 (Vieira og Messing, Gene 19: 259-268, 1982).

Etter transformasjon av E.coli, f.eks. JM101, ble plasmid-DNA fremstilt fra de oppnådde kolonier i en minifremstillings-prosess (Birnboim og Doly, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523, 1979) og karakterisert ved spaltning med restriksjonsenzymer. Et plasmid med det ønskede BamHI-innskudd ble kalt pAHlll. Kantene til BamHI-innskuddet fra plasmid pAHlll ble sekvens-bestemt etter didesoksy-metoden (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977) etter innføring i Ml3mp8 hhv. M13mp9 vektorene (Vieira og Messing, Gene 19: 259-268, 1982). En sekvenssammenligning med det humane gamma-interferon-gen (Gray og Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) viste høy homologi med de ikke-kodende 5'-og 3'-områdene. Derav sluttet man at det fullstendige EqIFN-gamma "ble isolert.

Det 4,6 kb lange BamHI-innskudd fra plasmid pAHlll ble sekvensbestemt fullstendig ved didesoksy-metoden. Total-sekvensen av BamHI-fragmentet ble bestemt ved kombinasjon av delsekvenser av M13-subkloner, som erholdtes ved rettet kloning av restriksjonsfragmenter (EcoRI, Hindlll, Pstl, Pstl-Bglll, Hindlll-BamHI) i tilsvarende delte M13mp8 eller M13mp9 vektorer. Videre delsekvenser fikk man idet det 2,0 kb lange BamHI-Bglll-fragment, hhv. det 2,0 kb lange Pstl-fragment ble klonet etter "shotgun-metoden" i M13mp8-vektoren.

De erholdte delsekvensene ble forenet ved hjelp av et computerprogram til den 4664 bp lange totalsekvens som er vist på fig. 1.

Ved computerunderstøttet analyse av de åpne leserammene og sammenligning med gamma-interferongener fra andre arter (Gray og Goeddel, Nature 298: 859-863; Gray og Goeddel, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et al., EMBO J. 4: 761-767, 1985; Cerretti et al., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986) ble det proteinkodende området av det equine gamma-interferon-genet bestemt. Det proteinkodende området er avbrutt av tre introner, hvorunder det 20 aminosyre-lange, hydrofobe signalpeptid og 18 aminosyrer av det ferdige EqIFN-gamma kodes i det første ekson (base 366 -479). Det andre ekson koder for aminosyrene 19-41 (base 1639-1707), det tredje ekson koder for aminosyrene 42-102 (base 1808-1985), det fjerde ekson koder for karboksy-enden med aminosyrene 103-146 (base 3307-3441). I posisjonene 4010 og 4020 befinner det seg to signalsekvenser (AATAAA) for polyadenyleringen av mRNA. I posisjonene 86-88 av det ferdige EqIFN-gamma befinner det seg det eneste potensielle N-glykosyleringssted (ASN-Ser-Ser), som faller sammen med det andre N-glykosyleringsstedet til storfe-gamma-interferon (Asn-Gly-Ser) (Fig. 2). Det ferdige EqIFN-gamma inneholder overraskende bare en eneste cysteinrest i stilling 3, hvorunder analogt med de naturlige humane og muse-gamma-interferoner sansynligvis de første tre aminoterminale aminosyrer (i dette tilfellet Tyr-Tyr-Cys) avspaltes proteolytisk i kroppen.

For å eksprimere rekombinant EqIFN-gamma i sin ferdige form i Escherichia coli, ble et syntetisk gen konstruert fra oligonukleotidet. Det koder for den samme aminosyresekvens som det naturlige EqIFN-gamma, men inneholder utelukkende slike kodoner for de enkelte aminosyrer som anvendes i høyt eksprimerte, celle-egne gener av E.coli (Gouy og Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055-5074, 1982). I tillegg ble flere singulære restriksjons-enzyms-spaltningssteder innbygget, som muliggjør en enkelt manipulering av genet for forandring av de enkelte avsnitt. Det syntetiske genet for EqIFN-gamma ble konstruert i to varianter fra tilsammen 16 forskjellige oligonukleotider. Den første varianten koder for ferdig EqIFN-gamma med 146 aminosyrer pluss start-metionin, den andre formen for et polypeptid forkortet med 3 aminosyrer (Tyr-Tyr-Cys) på amino-enden pluss startmetionin, som antagelig kunne opptre i den naturlige organisme.

Strukturen til det syntetiske EqIFN-gamma-gen er vist i fig. 3. Oligonukleotidet som anvendes for fremstillingen ble syntetisert ved hjelp av en Applied Biosystems Model 381A DNA-syntetisator, renset ved elektroforese og avsaltet. Oligo-nukleotidene som er karakterisert i fig. 3 har følgende struktur:

Sammenbygningen av det syntetiske EqIFN-gamma genet fant sted i to avsnitt. Den første del av genet ble fremstilt ved hjelp av de åtte oligonukleotider EG-1 til EG-8 inntil Sall-spaltningsstedet, den andre halvparten av genet av de seks oligonukleotider EG-9 til EG-14 av Sall-spaltningsstedet til BamHI-spaltningsstedet. For den form av EqIFN-gamma som på amino-enden var forkortet med tre aminosyrer anvendtes i stedet for oligonukleotidene EG-1 og EG-2 oligonukleotidene EG-15 og EG-16.

I oppfinnelsen anvendes ikke bare gen-sekvenser som kodes spesifikt for interferonene ifølge oppfinnelsen, men likeledes modifikasjoner som kan oppnås lett og rutinemessig ved mutasjon, nedbygging, transposisjon eller addisjon. Enhver sekvens som koder for interferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen (d.v.s. har det biologiske aktivitets-spektrum som her", er beskrevet) og i sammenligning med de viste er degenerert, er likeledes innbefattet; fagfolk på dette området er i stand til å degenerere DNA-sekvenser av de kodende områder. Likeledes er hver sekvens som koder for et polypeptid med aktivitets-spekteret til interferonene fremstilt ifølge oppfinnelsen, og som hybridiserer med de viste sekvenser (eller deler derav) under stringente betingelser (f.eks. betingelser som selekterer for mer enn 85 %, fortrinnsvis mer enn 90 % homologi) innbefattet.

Hybridiseringene utføres i 6xSSC/5x Denhardfs løsning/0,1 % SDS ved 65°C. Stringensgraden fastlegges i vaske-trinnet. Således er betingelsene for en seleksjonering på DNA-sekvenser med ca. 85 % eller mer homologi 0,2xSSC/0,01 % SDS/65°C egnet, og for en seleksjonering på DNA-sekvenser med ca. 90 % eller mer homologi betingelsene 0,lx SSC/0,01 % SDS 65°C.

I oppfinnelsen kan interferon-gener innføres under betingelser i enhver organisme som fører til høye utbytter. Egnede verter og vektorer er velkjent for en fagmann; som eksempel henvises til EP-A-0.093.619.

Spesielt foretrekkes prokaryoter for ekspresjonen, f.eks. E.coli K 12, stamme 294 (ATCC nr. 31 446) eller E.coli X1776

(ATCC nr. 31 537). I likhet med de forannevnte stammer kan også E.coli W 3110 (F"' Lambda"' Prototrof, ATCC nr. 27325), basiller så som Bacillus subtilis og andre enterobacteriaceae så som Salmonelle typhimurium eller Serratia marcescens og forskjellige Pseudomonader anvendes.

Generelt kan plasmid-vektorer som inneholder kontrollsekvenser som stammer fra arter, hvilke er kompatible med vertscellene, anvendes i forbindelse med disse arter. Vektoren inneholder normalt ved siden av et replikasjonssete gjenkjennelses-sekvenser som gjør det mulig å selektere de transformerte cellene fenotypisk. For eksempel transformeres E.coli normalt med pBR322, et plasmid som stammer fra E.coli-arter (Bolivar, et al., Gene 2., 95 (1977)). pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklin-resistens og byr dermed på muligheten til å identifisere transformerte celler. pBR322-plasmidet eller også andre plasmider må dertil i seg selv inneholde promotorer eller må utstyres med promotorer som kan anvendes av den mikrobielle organisme for ekspresjon av sine egne proteiner. Promotorene som anvendes oftest ved fremstilling av rekombinant DNA, inneholder Beta-Lactamase-(Penicillinase) og Lactose-Promotor-systemene (Chang et al., Nature 275, 615 (1978); Itakura et al., Science 198. 1056

(1977); Goeddel et al., Nature 281. 544 (1979)) og Tryptofan (trp) promotor-systemene (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-A-0.036.776). Ved siden av disse spesielt anvendelige promotorer er også andre mikrobielle promotorer utviklet og benyttet. Gen-sekvensen for interferonene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan f.eks. anvendes under kontroll av Leftward-promotoren til bakteriofagen Lambda (PL) . Denne promotoren er en spesielt effektiv styrbar promotor. Styringen muliggjøres gjennom lambda-repressoren fra hvilket nabostående restriksjons-skjæringsstedet er kjente. Et temperatur-ømfintlig allel av dette repressor-genet kan tas inn i en vektor som inneholder 1 EqIFN-gamma-sekvens. Når temperaturen økes til 42°C, inaktiveres repressoren og promotoren aktiveres. Ved anvendelse av dette systemet er det mulig å etablere en klonbank, i hvilken en funksjonell IFN-sekvens plasseres i nærheten av et ribosom-bindingssted i varierende avstander til Lambda-PL-promotoren. Disse kloner kan så undersøkes og det med det høyeste utbytte selekteres.

Ekspresjonen og translasjonen av en sekvens som koder for proteinene som fremstilles ifølge oppfinnelsen kan også forløpe under kontroll av andre reguleringssystemer som gjelder som "homologe" til organismen i sin ikke transformerte form. Således inneholder f.eks. kromosomalt DNA fra en laktose-avhengig E.coli et laktose eller lak-operon, som ved utskillelse av enzymet )3-galactosidase muliggjør laktose-nedbrytningen.

Lak-kontroll-elementene kan erholdes fra bakteriofagen Lambda-plac5, som kan infisere E.coli. Fagens lak-operon kan stamme fra transduksjonen fra de samme bakterietyper.

Reguleringsystemer som kan finne anvendelse i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, kan også stamme fra plasmid-DNA, som er eget for organismen. Lak-promotor-operator-systemet kan induseres med IPTG.

Andre promotor-operator-systemer eller deler derav kan like godt anvendes: F.eks. arabinose-operator, Colicine E1-operator, galaktose-operator, alkalisk fosfatase-operator, trp-operator, xylose-A-operator, tac-promotor og lignende.

I tillegg til prokaryoter kan også eukaryotiske mikroorganismer så som gjærkulturer anvendes. Saccharomyces cerevisiae er den mest anvendte av de eukaryotiske mikroorganismer, skjønt en rekke andre arter er alminnelig tilgjen-gelig. For ekpresjon i Saccharomyces anvendes f.eks. plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al., Nature 282. 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper et al., Gene

10, 157 (1980)) og plasmidet YEpl3 (Bwach et al., Gene 8, 121-133 (1979)). Plasmidet YRp7 inneholder TRPl-genet, som gir en seleksjons-markering for en gjærmutant som er ute av stand til å vokse i tryptofanfritt medium, f.eks. ATCC nr. 44076.

Tilstedeværelsen av TRPl-skaden som karakteristikum for gjær-verts-genomet gir da et virksomt hjelpemiddel for å påvise transformasjon når man dyrker uten tryptofan. Helt lignende forholder det seg ved plasmidet YEpl3, som inneholder gjær—genet LEU-2. som kan anvendes for komplettering av en LEU-2-minus-mutant. Egnede promotor-sekvenser for gjærvektorer inneholder det 5'-flankerende området til genet for ADH I (Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201

(1983)), 3-fosfoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255. 2073 (1980)) eller andre glykolytiske enzymer (Kawaski og Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112 (1982)) så som enolase. glycerol-aldehyd-3-fosfat-dehydrogenase, heksokinase, pyruvat-dekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-5-fosfat-isomerase, fosfo-glukose-isomerase og glukokinase. Ved konstruksjonen av egnede ekspresjonsplasmider kan avslutnings-sekvensene i forbindelse med disse genene likeledes innsettes i ekspresjonsvektoren på 3'-enden av sekvensen som skal eksprimeres for å muliggjøre polyadenylering og avslutning av mRNA-et.

Andre promotorer som dertil har fordelen av transkripsjon kontrollert ved vekst-betingelser, er promotor-områdene til genet for alkohol-dehydrogenase-2, isocytokrom C, syre-fosfatase, nedbrytende enzymer som henger sammen med nitrogen-metabolismen, den ovenfor nevnte gycerolaldehyd-3-fosfat-dehydrogenase og enzymer som er ansvarlig for behandlingen av maltose og galaktose. Promotorer som reguleres ved gjær "Mating Typ Locus", f.eks. promotorer for genene BARI, MFOl, STE2. STE3, STE5. kan anvendes ved temperatur-regulerte systemer ved anvendelsen av temperatur-avhengige sir mutasjoner. (Rhine Ph.D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Herskowitz og Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces. part I,. 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Disse mutasjoner påvirker ekspresjonen av de hvilende "mating-typ" kassetter hos gjær og derved indirekte de "mating-typ" avhengige promotorer. Generelt er imidlertid enhver plasmid-vektor som inneholder en gjær-kompatibel promotor, originære replikasjons- og avslutnings-sekvenser egnet.

I tillegg til mikroorganismer er kulturer av flercellede organismer likeles egnede vertsorganismer. I prinsippet kan enhver av disse kulturer anvendes, enten den er av virveldyr-eller virvelløse dyrekulturer. Størst interesse består likevel for virveldyr-celler, slik at formeringen av virveldyr-celler i kultur (vevskultur) i de senere år ble til en rutinemessig metode (Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, Editors (1973)). Eksempler på slike nyttige vertscellelinjer er VERO- og HeLa-celler, CHO-celler og W138, BHK, COS-7 og MDCK-cellelinjer. Ekspresjonsvektorer for disse celler inneholder normalt (om nødvendig) et replikasjonsstartpunkt, en promotor, som befinner seg foran genet som skal eksprimeres, sammen med alle nødvendige ribosombindingssteder, RNA-spleisings-sted, polyadenyleringssted og transkripsjonene avslutnings-sekvenser.

Ved anvendelsen i pattedyrceller stammer kontroll-funksjonene på ekspresjonsvektorene ofte fra virusmateriale. F.eks. stammer de vanlig anvendte promotorer fra Polyoma Adenovirus 2, og spesielt ofte fra Simian Virus 40 (SV 40). De tidlige og sene ende-promotorer av SV 40 er spesielt nyttige, da begge er lette å få fra viruset som fragment, som også inneholder det virale replikasjonsstedet til SV 40.

(Fiers et al., Nature 273, 113 (1978)). Også mindre og større fragmenter av SV 40 kan anvendes, forutsatt at de inneholder den tilnærmet 250 bp lange sekvens som rekker fra Hindui-sk j ær ingsstedet til Bgll-skjæringsstedet i det virale replikasjonsstartpunkt. Dertil er det likeledes mulig og ofte anbefalelsesverdig å anvende promotor- eller kontrollsekvenser som normalt er knyttet til de ønskede gen-sekvenser, forutsatt at disse kontrollsekvenser er kompatible med vertscelle-systemene.

Et replikasjonsstartpunkt kan enten anbringes ved en tilsvarende vektorkonstruksjon for å bygge inn et eksogent startpunkt, f.eks. fra SV 40 eller andre viruskilder (f.eks. polyoma, adeno, VSV, PBV, osv.) eller kan anbringes gjennom de kromosomale replikasjonsmekanismene til vertscellen. Integreres vektoren i vertscellekromosomet, er det sistnevnte tiltaket som regel tilstrekkelig.

Fortrinnsvis kan DNA-sekvensen også eksprimeres i ekspresjonsplasmidet pERl03 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) og EP-A-0.115-613 - deponert hos DSM under nummer DSM 2773 den 20 desember 1983) i plasmidet parpER33 (EP-A-0.115-613) eller plasmidet pRHIOO, da disse vektorer alle inneholder reguleringselementer som fører til en høy ekspresjonsgrad av det klonede gen. I oppfinnelsen anvendes plasmidet pRHIOO som ekspresjonsvektor for det syntetiske EqIFN-gamma, som inneholder den regulerbare tryptofan-promotor fra Serratia marcescens og en kunstig ribosom-bindings-sted. For fremstilling av ekspresjonsplasmid pRHIOO ble plasmidet PER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-O.115.613) lineærisert med restriksjonsendonukleasen Hindlll og de 5'-terminale fosfatrester fjernet.

Disse plasmid-DNA ble blandet og ligert med de fosforylerte oligonukleotider d(AGCTTAAAGATGAGCT) og d(CATCTTTA). Ligase-reaksjonen ble foretatt med restriksjonsendonukleasen SacI og-ligert ved tilsetning av T4-PNK. Oligonukleotidene ble fremstilt analogt med den metode som er beskrevet i EP-A-0.115.613. Kompetente E.coli HB101 ble blandet med denne ligase-reaksjonen og inkubert. Fra de dannede bakterie-kolonier ble 12 plukket ut vilkårlig og plasmidene isolert fra dem i mikromålestokk (Birnboim og Doly, Nucl. Acids. Res. 7

(1979) 1513-1523). De resulterende DNA'er ble kappet med restriksjonsendonukleasen SacI og DNA'ene separert på en agarosegel (1 %, lx TBE-buffer). Vandringen av DNA som lineært molekyl med størrelse fra ca. 4.400 bp bekreftet innføringen av et Sacl-erkjennelsessted i plasmidet. Et av disse plasmider ble plukket ut vilkårlig. Med DNA fra det tilhørende minipreparat transformerte man igjen E.coli HB101. Fra de resulterende transformerte bakterier ble en koloni valgt ut og dyrket i større målestokk. Plasmidet som ble isolert fra dette ble kappet med restriksjonsendo-nukleasene EcoRI og BamHI, DNA'et separert på en 1 %ig agarosegel, og det mindre fragment isolert fra gelen ved elektroeluering. Dette ca. 460 bp lange EcoRI-BamHI DNA-fragment ble sekvensbestemt etter Sanger. (F. Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (1977) 5463-5467). Den således analyserte plasmidet ble kalt pRHIOO. Plasmidet ble kappet fullstendig med SacI, og de overhengende DNA-endene ble gjort rette ved behandling med Klenow-fragment (Amersham) i nærvær av alle fire desoksy-nukleotidtrifosfater. Reaksjonen stoppes ved fenol/kloroform-ekstraksjon, og DNA konsentreres ved etanolfelling. Gjennom denne behandlingen oppstår i tilknytning til tryptofan-promotoren en butt DNA-ende, som ender med translasjons-startkondonet "ATG". De lineæriserte plasmid-DNA'er etterkappes med BamHI og vektordelen isoleres.

Den derved forberedte pRHIOO-plasmid-vektoren blandes med de ligerte oligonukleotider EG-1 til EG-8 og EG-9 til EG-14 og inkuberes i ligeringsbufferen med T4 DNA-ligase. E.coli som er gjort kompetent, fortrinnsvis JM101, transformeres med denne ligeringsblandingen og inkuberes natten over. Fra de oppnådde transformanter isoleres plasmid-DNA i minipreparer-ingsmetoden og strukturen bestemmes ved restriksjonsanalyse og sekvensbestemmelse av Hindlll-BamHI-innskuddet. Et plasmid med den ønskede struktur for ekspresjonen av ferdig EqIFN-gamma kalles pEqG-YYCl. På fullstendig analog måte klones oligonukleotidene EG-15, 16 EG-3 til EG-8 og EG-9 til EG-14 i pRHl00-vektoren for å oppnå EqIFN-gamma som er forkortet med tre aminosyrer. Et plasmid med den ønskede struktur kalles pEqG-QAAl.

Transformasjon av cellene med bærerne kan oppnås ved mange metoder. For eksempel kan den skje ved kalsium, hvorunder enten cellene vaskes i magnesium og DNA'et tilsettes cellene oppslemmet i kalsium, eller cellene utsettes for en samfelling av DNA og kalsiumfosfat. Etterfølgende gene-ekspresjon overføres cellene til medier som selekterer for transformerte celler.

For påvisning av ekspresjonen av interferonaktivitet i E.coli JM101 som inneholder plasmidet pEqG-YYCl eller pEqG-QAA1 brytes bakteriene opp etter inkubasjonen i egnet kulturmedium og supernatanten prøves etter sterilfiltrering med hensyn til interferonaktivitet i en måling som måler den cytopatiske virkning (CPE) av VSV eller EMCV. Dertil anvendes NBL-6 celler (ATCC CCL 57 hestehud-epidermisk-celler) for dette som var blitt infisert med vesikulær-stomatitis-virus

(VSV) og/eller A549 (ATCC CCL185, human lungekarcinom-cellelinje) som var blitt infisert med encefalomyacardit virus

(EMCV).

Påvisningen av de eksprimerte heste-interferoner oppnås ved markering av proteinene i maksiceller. Plasmidkodede proteiner kan markeres ved anvendelse av maksicelleteknikk (Sancar, A. et al., J. Bacteriol, 137. 692-693 (1979) in vivo. E.coli stamme CSR603 (CGSC 5830) har ingen mekanisme for reparasjon av skader i DNA som er oppstått ved UV-bestråling. Ved bestråling med en egnet UV-stråledose ødelegges det bakterielle kromosom, men noen av de vesentlig mindre plasmid-DNA'er som er tilstede i flere kopier pr. celle forblir derimot funksjonelle. Etter at alle ikke-skadede celler som formerer seg med antibiotikumet D-cykloserin er drept og det endogene mRNA er brutt opp, transkriberes og translateres i de gjenværende celler bare gener som er kodet på plasmidet. De dannede proteiner kan markeres radioaktivt og påvises ved innbygging av <35>S-metionin. E.Coli CSR603 tranformeres etter vanlige metoder med ekspresjons-plasmidene og seleksjoneres på ampicillinholdige agarplater med hensyn til transformerte bakterier. Prepareringen av maksicellene og markeringen av proteiner skjer etter.forskriften til A. Sancar. Som molekylvekt-standard anvendes en <14>C-metylert proteinblanding (Amersham). Som kontroller anvendes plasmidet pER103, som bare inneholder promotoren uten interferongen og plasmidet pER21/l, som inneholder to kopier av det humane IFN-62arg genet.

For karakterisering av produktene fremstilt ifølge oppfinnelsen er de kjente biologiske og immunologiske målinger for interferoner egnet. Da både I FN-a, -/3 og -gamma er typiske for antivirusegenskapene som fastslås i PFU- og CPE-målingene, utnyttes for å skille mellom de ifølge oppfinnelsen frembragte EqIFN-gammaer av EqIFN-a og/el ler -j8- den forskjellige antigeniteten til interferonene.

Polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen nøytraliseres ikke av antisera mot EqIFN-a og/eller EqIFN-Ø. Som videre forskjells-kriterium anvendes syrelabiliteten til poly— peptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen, samt sensitiviteten overfor natriumdodecylsulfat (SDS). Både inkuberingen ved 0,2 %ig SDS-løsning og inkubasjonen av polypeptidene ved pH2 gjennom flere timer ved 4°C fører til et nesten fullstendig tap av antivirus-aktivitet. EqIFN-a og EqIFN-/3 er stabile under de samme betingelser.

For påvisning av totalantallet av sekvenser i hestegenom som har høy homologi med interferongenet, spaltes høymolekylære heste-DNA fullstendig med de tilsvarende restriksjonsenzymer, og disse kappede DNA separeres etter størrelsen. Etter Southern-overføring på nitrocellulose-filtere, denaturering og fiksering av DNA hybridiseres hvert filter med nicktranslatert probe. Som probe for EqIFN-gamma anvendes et fragment fra plasmidet pEqG-YYCl som inneholder den kodende sekvens for hele det ferdige interferon. Filteret vaskes- så under stringente betingelser. Autoradiografi finner sted på DuPont Cronex røntgen film under anvendelse av Kodak Lanex-Regulær forsterkerfolie 7 dager ved -80°C.

Etter ferdig transformasjon av verten, ekspresjon av genet og fermentering eller celledyrking under betingelser ved hvilke de foreliggende proteiner eksprimeres, kan produktet normalt ekstraheres ved kjente kromatografiske separasjons-metoder så man får et materiale som inneholder proteinene med eller uten leder- og hale-sekvenser. Interferonene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan eksprimeres med en leder-sekvens på N-enden (Pre-IFN), som kan fjernes fra noen vertsceller. Ellers er en avspaltning av leder-polypeptidet (når det foreligger) nødvendig for å oppnå ferdig IFN. Alternativt kan IFN-klonet modifiseres slik at det ferdige protein produseres direkte i mikroorganismen istedet for Pre-IFN. For dette tilfelle kan forstadie-sekvensen til gjær-"mating"-feromonet MF-alfa-1 anvendes for å gi en riktig "modning" av det fusjonerte protein og utskillelse av produktene i vekstmediet eller i det periplasmiske rom. DNA-sekvensen for funksjonelt eller ferdig I FN kan forbindes med MF-alfa-1 på det formodede katepsi-lignende skjæringssted (etter Lys-Arg) på posisjon 256 fra initieringskododnet ATG (Kurjan, Herskowitz, Cell 30, 933-943

(1982)) .

En fremgangsmåte etter hvilken EqIFN-gamma f.eks. fra bakterier kan renses, er beskrevet i det følgende generelle skj erna. 1. Ekstraksjon av celler i en lysebuffer (ca. pH 8) med høy ledningsevne ved hjelp av passasje gjennom en homo-genisator ved høyt trykk; avkjøling av strømmen ut i et

isbad.

2. Utfelling av DNA ved tilsetning av polyetylenimin under røring f.eks. ved 4°C. 3. pH-utfelling av de bakterielle proteiner hvorunder EqIFN-gamma forblir i løsning.

4. Frasentrifugering av de faste stoffer ved 4°C.

5. Konsentrering av supernatanten (etter fornyet innstilling av pH) f.eks. ved ultrafiltrering. 6. Dialyse av konsentratet mot en buffer med lav ledningsevne. 7. Frasentrifugering av faststoffene, hvorunder EqIFN-gamma forblir i løsning. 8. Ionebytter-kromatografi på karboksymetyl-cellulose, eluering med en gradient med tiltagende ionestyrke. 9. Kromatografi på kalsiumfosfat-gel og eluering med en gradient med tiltagende ionestyrke. 10. Ionebytter-kromatografi på karboksymetyl-cellulose under svak denaturerende betingelser og eluering med en

gradient med tiltagende ionestyrke.

11. Separasjon ved gelfiltrerings-kromatografi.

Den nevnte fremgangsmåte muliggjør produktutbytter med en renhet på mer enn 95 %.

Det skal her nevnes at ved de foreliggende interferoner dreier det.seg ikke om interferoner som er beskrevet i detalj, men likeledes om alle modifikasjoner av disse polypeptider som ikke vesentlig forandrer heste-gamma-IFN-aktiviteten. Disse modifikasjoner innbefatter f.eks. forkortelse av molekylet, f.eks. på N- eller C-terminale ender, utskifting av aminosyrer og andre rester, kjemiske eller biokjemiske bindinger av molekylet til andre molekyler som er inerte eller aktive. Ved de sistnevnte modifikasjoner kan det f.eks. dreie seg om hybrid-molekyler fra et eller flere interferoner fremstilt ifølge oppfinnelsen og/eller kjente a- eller /3-interferoner.

På grunn av sitt biologiske virknings-spektrum er de nye, foreliggende interferoner anvendelige for enhver behandlings-form som også de kjente interferoner kan anvendes for. Disse omfatter f.eks. herpes, rhinovirus, heste-abort-virus, forskjellige kreftformer o.l. De nye interferoner kan anvendes alene eller i kombinasjon med andre interferoner eller biologiske aktive produkter, f.eks. med IFN-alfa, IL-2, andre immun-modulatorer og lignende.

Interferoner fremstilt ifølge oppfinnelsen kan gis parallelt i tilfeller hvor anti-tumor- eller anti-virus-behandling er nødvendig, og i tilfeller hvor immuno-under-trykkende egenskaper viser seg. Dose og doseringshyppighet kan være lignende dem som for tiden gjelder ved kliniske undersøkelser for IFN-materialer, f.eks. ca. (1-10) x IO<6 >enheter daglig og ved preparater som er mer enn 1 % rene, opptil f.eks. 5 x IO<7> enheter daglig.

For en hensiktsmessig doseringsform ved et i det vesentlige homogent, bakterielt produsert IFN ifølge oppfinnelsen, løses f.eks. ved parenteral anvendelse 3 mg EqIFN-gamma i 25 ml 5 %ig animalsk serumalbumin, fortrinnsvis heste/hunde-serumalbumin. Denne løsningen føres så gjennom et bakteriologisk filter, og den filtrerte løsning fordeles aseptisk på 100 flasker, hvorav hver inneholder 6 x IO<6 >enheter rent IFN egnet for parenteral anvendelse. Glassene oppbevares før anvendelse fortrinnsvis kaldt (-20°C). Forbindelsene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan formuleres på kjent måte så man får farmasøytiske anvendelige midler, hvorunder polypeptidet blandes med en farmasøytisk akseptabel bærersubstans. Brukbare bærere og deres formulering er f.eks. beskrevet i E.W. Martin i Remington's Pharmaceutical Sciences, som det her henvises til. Interferonene fremstilt ifølge oppfinnelsen blandes med en tilmålt mengde av bærerstoffet for å frembringe egnede farmasøytiske midler som er egnet for en effektiv anvendelse hos mottageren (pasienten). Fortrinnsvis foretas en parenteral applikasjon.

Videre kan monoklonale antistoffer dannes mot polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen med hybridomaceller som produserer slike antistoffer. Fortrinnsvis er hybridomacellelinjene og de monoklonale antistoffer som utskilles av disse dem som reagerer spesifikt med EqIFN-gamma. Fremgangsmåten for fremstilling av slike monoklonale antistoffer er karakterisert ved at man immuniserer små pattedyr, f.eks. kaniner eller mus med polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen, fusjonerer B-lymfocytter av slike immuniserte dyr med myeloma-celler, kloner de dannede hybridomaceller, deretter dyrker in vitro eller ved injeksjon i mus og isolerer antistoffer fra kulturene.

Disse kan brukes som immuno-affinitets-kromatografi-søyler og forsøkssett for immunologiske målinger.

Ved fremstilling av antistoffene immuniseres mus, f.eks. Balb/c-mus på i og for seg kjent måte. I en foretrukket utførelsesform injiseres polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen ca. ukentlig eller også med større avstand i flere måneder, f.eks. 5-12 uker, inntil et tilstrekkelig antall antistoff-produserende B-lymfocytter er dannet.

Organer som inneholder B-lymfocytter, f.eks. miltceller, tas ut fra de immuniserte mus og fusjoneres med slike myeloma-celler som ikke vokser i et selektivt dyrkningsmedium p.g.a. en mutasjon. Slike myelomaceller er kjente og er f.eks. dem med betegnelsen X63-Ag8, X63-Ag8.6.5.3, MPC-11, NSl-Ag4/l, MOPC-21 NS/l eller SP 2/0. I en foretrukket utførelsesform fusjoneres miltceller fra immuniserte mus med myelomaceller av cellelinjen X63-Ag8.6.5.3. Fusjonen utføres etter i og for seg kjente metoder ved blanding av B-lymfocyttene og myeloma-cellene under tilsetning av et celle-fusjons-reagens så som polyetylenglykol, Sendai-virus, kalsiumklorid eller lysolecitin. Fortrinnsvis fusjonerer man i nærvær av polyetylenglykol, f.eks. med en molekylvekt mellom 1000 og 4000. Etter fusjonen dyrkes de dannede hybrider ved en i og for seg kjent fremgangsmåte i et selektivt dyrkningsmedium, som er komplementert med hypoksantin, aminoterin og tymidin (HAT-medium). Ikke fusjonerte myeloma-celler kan ikke vokse i dette medium og dør i likhet med normale lymfocytter.

Supernatanten av hybridoma-kulturen kan prøves med hensyn til innhold av spesifikke antistoffer ved i og for seg kjente metoder, f.eks. ved radio-immunologisk måling eller agglutinering. Hybridomacellene som produserer antistoffer med den ønskede spesifitet seleksjoneres ut fra blandingen som er oppstått ved fusjoneringen av forskjellige hybridomaceller ved kloning. For dette anvender man en i og for seg kjent fremgangsmåte som kalles "limiting dilution", kulturer ut fra en enkelt voksende celle.

For masseproduksjon dyrkes hybridoma-celleklonene som produserer antistoffer med den ønskede spesifitet, enten i, i og for seg kjente medier in vitro eller injiseres i mus for formering. I en foretrukket utførelsesform injiseres hybridoma-cellene i mus som er forbehandlet med Pristan, aszites-væske tas ut og derfra isoleres antistoffer ved felling med ammonium-sulfatløsning.

De spesifikke antistoffer som er oppnådd ved hjelp av disse hybridomaceller kan på i og for seg kjent måte anvendes for fremstilling av immuno-affinitets-kromatografi-søyler. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blandes et egnet bærermateriale (oppslemmet i en bufferløsning) med en antistoff-løsning, ubundede andeler vaskes deretter ut og ubesatte steder på bærermaterialet blokkeres. Antistoffene kan også anvendes i terapi.

De spesifikke antistoffer som oppnås ved hjelp av hybridoma-cellene kan på i og for seg kjent måte anvendes for fremstilling av forsøkssett. Disse forsøkssett kan bygge på forskjellige metoder, f.eks. på radio-immunologisk måling, Latex-agglutinering, "Tiipfel"-forsøk, kompetitiv eller Sandwich-radio-immunologisk måling, enzymatisk immunologisk måling, immuno-fluorescens eller immunokjemiske enzym-prøver.

Ved hjelp av oppfinnelsen tilveiebringes:

Polypeptider i vesentlig ren form

- med de biologiske og immunologiske egenskapene til heste-interferon-gamma (EqIFN-gamma) - i det vesentlige fri for andre proteiner av animalsk opprinnelse; - uten naturlig glykosylering; - -har aminosyren metionin foran den 1. aminosyren til N-enden; - inneholder et lederpeptid;

- inneholder aminosyresekvensen

Eksempelvis er de rekombinante DNA-molekyler innsatt i plasmidene pAHlll, pRH281/5, pRH282/5, pGNl, pGN3, pGN20, pEqG-QAA2 eller pEqG-QAA3.

Vertsorganismene er fortrinnsvis transformert med en av de ovenfornevnte rekombinante vektorer og velges fra, f.eks. prokaryoter, fortrinnsvis E.coli, spesielt E.coli JM101 eller HB101, eukaryoter, f.eks. Saccharomyces cerevisiae eller pattedyrceller, fortrinnsvis hestecellelinjer.

Polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes for terapeutisk behandling og/eller for immunisering eller for fremstilling av farmasøytiske preparater.

De forut nevnte monoklonale antistoffer kan anvendes for terapi og/eller for kvalitativ og/eller kvantitativ bestemmelse av et av polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen, samt for rensning av polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen.

Et prøvesett for bestemmelse av polypeptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen vil inneholde de ovenfor nevnte monoklonale antistoffer.

Forklaring på figurene:

Figur 1: DNA-sekvens av den 4664 bp lange BamHI-fragment fra Lambda Eq-gamma2. Den kodete aminosyresekvens og intronets stilling er angitt. Negativt numerert aminosyrer angir det hydrofobe signalpeptidet. Det eneste potensielle N-glykosyleringsstedet til det ferdige EqIFN-gamma i posisjon 86-88 er understreket. De viktige sekvensene CCATC og TATAAAA for bindingen av RNA-polymerase er understreket, likeledes to signalsekvenser for polyadenyleringen av mRNA (AATAAA). Figur 2: Sammenligning av aminosyresekvensene fra gamma-interferoner fra forskjellige arter. De aminosyrer som er nummerert med "S" stilt foran angir signalpeptidet. "Consensus"-sekvensen viser i store bokstaver de aminosyrer som forekommer identisk i alle gammainterferoner, med små bokstaver de aminosyrer som forekommer i mer enn 75 % av gamma-interferonene. Figur 3: Skjematiske angivelser av oligonukleotidene som anvendes for totalsyntesen av heste-gamma-interferon-genet. Lengden av de enkelte nukleotider og deres nummerering er angitt. Restriksjons-skjæringssteder som opptrer bare en enkelt gang innenfor det syntetiske genet, er nummererte. Figur 4: Sammenligning av de kodende sekvensene for ferdig EqIFN-gamma av det naturlige gen (eq) og det syntetiske (syn), for ekspresjonen i E.coli av optimalisert gen. Base som er forskjellige er markert med en stjerne. Figur 5: Tabell for de anvendte kodoner for ferdig EqIFN-gamma. På venstre kant er den første basen, i midten

den andre basen og på høyre kant den tredje basen av kodonet angitt. Tabellen viser antallet av anvendte kodoner for den enkelte aminosyre i det naturlige

gen, og i parentes for det syntetiske gen.

Figur 6: Konstruksjon av ekspresjonsplasmidet pRHIOO.

Figur 7: Konstruksjon og restriksjonskart for pGN20.

De følgende eksempler som ikke skal begrense oppfinnelsen beskriver oppfinnelsen i detalj.

Materialer

Utgangsmaterialene ble delvis kjøpt, delvis stammet de fra EMBL i Heidelberg. E.coli JM101 pUC9 og M13mp8 stammet fra Bethesda Research Laboratories, E.coli-stammene med supressor-faktoren sup F, for eksempel E.coli NM526, 538 og 539 og vektoren lambda-EMBL3 eller 3A stammer fra EMBL og kan

også fås fra firma Stehelin/Basel (Sveits).

1. Isolering av heste- DNA

Frosset vev, f.eks. hestelever ble oppmalt i flytende nitrogen til fint pulver og inkubert i 0,5M EDTA, 10 mM Tris-HC1 pH 8,0, 0,5 % SDS, 0,1 mg/ml proteinase K (20 ml/g vev) i 3 timer ved 55°C. Den oppnådde viskøse løsning ble befridd for protein gjennom en fenolekstraksjon og 3-gangers ekstraksjon med fenol/kloroform/isoamylalkohol (25/24/1 volumdel), dialysert mot 50 mM tris-HCl pH 8,0, lOmM EDTA, lOmM NaCl og DNA'et utfeldt med 2 volumdeler etanol. Etter fullstendig tørking i vakuum ble DNA'et brakt i løsning i TE-buffer (lOmM tris-HCl pH 8,0, ImM EDTA) ved 4°C og sentrifugert med 1,273 g CsCl/ml løsning i 62 timer med 40.000 opm ved 20°C (Sorvall 50Ti-rotor). CsCl-gradienten ble dryppet ut, de DNA-holdige fraksjoner dialysert mot TE-buffer, og DNA'et deretter utfelt med 2 volumdeler etanol, vasket med 70 % etanol, tørket og igjen oppløst i TE-buffer (4°C).

Det ferdige DNA-preparat var fritt for RNA og lenger enn 50 kb (bestemt ved elektroforese på en 0,45 %ig agarosegel).

2. Partiell endonuklease- oppdelina oa størrelses-fraksionering av heste- DNA

To ganger 50 ug heste-DNA ble inkubert med 1,6 enheter Sau3A i 450 jul reaksjonsmedium (10 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 ImM ditiotreitol) ved 37°c. Etter 15, 25 og 40 minutter ble 150 Ml alikvoter tatt ut og blandet med 15mM EDTA. Ved 10 minutters oppvarming til 70°C ble reaksjonen stoppet. Etter tilsetning av 0,3M Na-acetat pH 6,0 ble DNA'et utfelt med 2,5 volumdeler etanol. Etter gjenoppløsning i TE-buffer ble DNA'et skilt på en 0,45 %ig agarosegel i TBE-buffer (10,8 g/l tris, 5,5 g/l borsyre, 0,93 g/l Na2EDTA) ved ca. 1 V/cm ved elektroforese natten over etter størrelse. Ved hjelp av størrelsesmarkører (Lambda-DNA) dobbeltspaltet med EcoRI og Hindlll og spaltet med Hindlll) ble gelstykket med DNA av en lengde på 10-23 kb skåret ut, DNA'et ble elektroeluert ved 300V fra en gel i en dialyse-slange i 3 timer (buffer 0,1 x TBE) , renset på en Elutip-D-søyle (Schleicher og Schiill) ifølge anvendelsesforskriftene og deretter utfelt med etanol.

For å forhindre selv-ligeringen av heste-DNA-fragmenter, hvilket på den ene side kan føre til kunstige hybrider av heste-DNA-sekvenser, og på den annen side til for store og dermed ikke lenger lambda-fag forpakkbare DNA-stykker, ble de størrelsesfraksjonerte heste-DNA-stykker defosforylert.

Man inkuberte da DNA'et i 140 ul reaksjonsmedium (50 mM tris-HCl pH 9,5, 10 mM MgCl2, 0,1 mM Zn-acetat, 1 mM spermidin) med 5 enheter bovin tarmfosfatase i 30 minutter ved 37°C, tilsatt ytterligere 5 enheter enzymer inkubert i 30 minutter. Etter tilsetning av EDTA til 25 mM sluttkonsentrasjon ble DNA'et en gang ekstrahert med fenol/kloroform/iso-amylalkohol (25/24/1 vol), 2 ganger med kloroform/isoamyl-alkohol (24/1 vol) og 3 ganger med dietyleter, felt med etanol,- tørket og oppløst i 0,1 x TE-buffer.

3. Oppbygning av hestegenom- DNA- bibliotek

De defosforylerte lo - 23 kb heste-DNA-fragmenter ble klonet i en lambda-vektor, f.eks. lambda-EMBL3 eller -3A (Frischauf, A.M. et al., J. Mol. Biol., 170, 827-842 (1983)) med G-A-T-C kohesive ender oppnådd ved fjerning av det innvendige BamHI-fragmentet til fag-DNA.

Vektoren ble dyrket i en E.coli stamme med suppressor-faktor sup F, f.eks. E.coli NM526, 538 eller 539 (Frischauf, A.M. et al., J. Mol. Biol., 170. 827-842 (1983)), i LB-medium (Miller; Experiments in Molecular Genetics; Cold Spring Harbor Lab. Cold Spring Harbor, New York) med 5 mM MgS04, felt med polyetylenglykol og renset ved 2-gangers CsCl-tetthets-gradient-sentrifugering (0,71 g CsCl/ml løsning, 40 timer

45.000 opm, 20°C). Etter dialyse mot TE-buffer ble fag-DNA'et befridd for protein ved 2-gangers ekstraksjon med fenol/kloroform/isoamylalkohol (25/24/1 vol) og 2 gangers ekstraksjon med kloroform/isoamylalkohol (24/1 vol) og oppkonsentrert ved

etanolfelling.

For å oppnå sluttfragmentet av EMBL3A ble 50 ug fag-DNA oppdelt 2 timer ved 37°C i 450 lii reaksjonsmedium (10 mM tris-

HC1 pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitol) fullstendig med BamHi, reaksjonen stoppet ved 70°C med 15 mM EDTA i 10 minutter og DNA'et utfelt med etanol.

For å unngå religeringen ble midtfragmentet etterkappet med EcoRI og det vekkfallende oligonukleotid fjernet ved hjelp av isopropanolfelling.

Det BamHI-oppdelte lambda-DNA ble da oppdelt fullstendig 2 timer ved 37°C i 450 /il 10 mM tris-HCl pH 7,5 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 med EcoRi og reaksjonen stoppet ved tilsetning av 15 mM EDTA og 10 minutters oppvarming ved 70°C. Etter tilsetning av Na-acetat til en sluttkonsentrasjon på 0,3M ble de tre store DNA-fragmenter felt med 0,6 volumdeler isopropanol i 15 minutter ved 0°C, vasket to ganger med 0,45M Na-acetat/0,6 volumdeler isopropanol og en gang med 0,3 M Na-acetat/2,5 volumdeler etanol og oppløst i 15 /il 0,lx TE-buffer.- BamHI/EcoRI-linkeren forblir i løsning ved denne fremgangsmåte. EMBL3A fragmentene ( 8/ig) slås sammen med ca. 5/ig 10-23 kb heste-DNA og 10 enheter T4-DNA-ligase (NEN) og inkuberes natten over ved 14°C og en dag ved 4°C i 50 /il ligeringsmedium (66mM tris-HCl pH 7,2, 0,1 M NaCl, lOmM MgCl2, ImM EDTA, 5mM ditiotreitol, 0,5mM ATP). Den ligerte DNA-blanding ble pakket ved hjelp av et in vitro lambda-forpak-ningssystem (Scalenghe, F. et al., Chromosoma, 82., 205-216

(1981)) i fullstendige lambda-fag-partikler.

Bestanddelene i dette systemet, dvs. ultralyd-ekstrakt (SE), frosset-opptint-lysat (FTL), buffer Ml og A ble fremstilt ifølge (Scalenghe, F. et al., Chromosoma, 82., 205-216, (1983)). 10 /il alikvoter av den ligerte DNA-blanding ble inkubert i 2 minutter ved romtemperatur ved 25 /il SE, som likeledes var opptint som FTL 30 minutter fra is, blandet med 100 /il FTL og videre inkubert 60 minutter ved romtemperatur. Pakkings-blandingen ble fortynnet med 150 /il lambda-fortyn-ningsmiddel (100 mM tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgS04, 1 mM EDTA) og lagret ved 4°C.

4. Kloning og sekvens- bestemmelse av genet for heste- qamma-interferon fEqIFN- gamma)

A. Isolering av et fullstendig EqIFN-gamma gen klon

Det equine DNA-bibliotek ble anvendt for infeksjon av E.coli stammen NM528 (supF). En bakteriekultur som hadde vokst natten over i LB-næringsløsning (10 g/l trypton, 5 g/l gjærekstrakt) 10 g/l NaCl, pH 7,4) med 0,2 % maltose ble i 10 mM MgS04 innstilt på en optisk tetthet (600 nm) på 2,0. 0,5 ml porsjoner av denne suspensjonen ble infisert med 50.000 pfu (plaque-dannende enhet) lambda-fager fra DNA-biblioteket og fordelt med et LB-mykagar-skikt på LB-agar-plater med 10 mM MgS04 (13,5 cm diameter). Tilsammen ble l,5xl0<6> rekombinante lambda-fager utprøvet. Etter dyrking natten over ved 37°C ble det fra fagene på hver plate fremstilt 2 replikater på nitro-cellulose (Benton og Davis, Science 196:180-182, 1977). Etter denaturering av fag-DNA (1 min i 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl) nøytralisering (2 ganger 3 minutter i 05 M tris-HCl pH 7,5, 1,5 M NaCl) og spyling (1 min i 2xSSC, lxSSC, 0,15 M NaCl, 15 mM Na-citrat) ble filtrene tørket i luft og DNA'et fiksert ved 2 timers oppvarming ved 80°C. Filtrene ble vasket natten over ved 65°C i en løsning av 1,5 M NaCl, 10 mM tris-HCl pH 8,0, 0,1 % SDS og forhybridisert 4 til 6 timer ved 65°C (hybridi-seringsløsning: 0,9 M NaCl, 50 mM NaH2P04, pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,1 % Ficoll, 0,1 % polyvinylpyrrolidon, 0,1 % kvegserumalbumin, 0,1 % SDS, 20 mg/ml lydbehandlet og denaturert laksesperm-DNA.

Hybridiseringen fant sted i en frisk løsning med IO<6> cpm pr. filter av en etter vanlig metoder radioaktivt merket HuIFN-gamma "probe" i 20 timer ved 65°C. Filtrene ble vasket under ikke stringente betingelser i 3xSSC, 0,1 % SDS ved 65°C, tørket og autoradiografert. Etter tre gjennomløp med plaque-rensing kunne 5 lambda-kloner identifiseres som ga positive hybridiserings-signaler.

Fra disse isolerte rekombinante fager ble DNA'ene renset etter vanlige metoder (Maniatis et al., ibid.). Fag-DNA'ene ble karakterisert ved spaltning med forskjellige restriksjons-enzymer og etterfølgende Southern-analyse (Southern, J.Moi. Biol. 98: 503-517, 1975) gjennom hybridisering med HuIFN-gamma "probe". Et singulært hybridiserende 4,6 kb langt BamHI-fragment av klonet lambda Eq-gamma2 ble isolert og klonet i BamHI-skjæringsstedet til plasmidet pUC9 (Vieira og Messing, Gene 19: 259-268, 1982). Etter transformasjonen av E.coli JM101 ble plasmid-DNA fremstilt fra oppnådde kolonier i en mini-fremstillingsmetode (Birnboim og Doly, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523, 1979) og karakterisert ved spaltning med restriksjons-enzymer. Et plasmid med det ønskede BamHI-innskudd ble kalt pAHlll. Kantene til BamHI-innskuddet av plasmid pAHlll ble etter innføring i M13mp8 hhv. M13mp9 vektorene (Vieira og Messing, Gene 19, 259-268, 1982) sekvensbestemt etter didesoksy-metoden (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 74: 5463-5467, 1977). En sekvenssammenligning med det humane gamma-interferon-genet (Gray og Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) viste en høy homologi med de ikkerkodende 5'- og 3'-regioner. Derav sluttet man at det fullstendige EqIFN-gamma-genet ble isolert.

B. Sekvensbestemmelse av heste-gamma-interferongenet fra klon

lambda Eq-gamma2.

Det 4,6 kb lange BamHI-innskuddet fra plasmid pAHlll ble sekvensbestemt fullstendig etter didesoksy-metoden. Total-sekvensen av BamHI-fragmentet ble bestemt ved en kombinasjon av delsekvenser av M13-subkloner, som man fikk ved rettet kloning av restriksjonsfragmenter (EcoRI, Hindlll, Pstl, Pstl-Bglll, Hindlll-BamHI) i tilsvarende oppkappede M13mp8 eller M13mp9 vektorer. Videre delsekvenser fikk man idet det 2,0 kb lange BamHI-Bglll fragment, hhv. det 2,0 kb lange Pstl framgent ble klonet etter "Shotgun-metoden" i M13mp8 vektoren. De to DNA-fragmenter ble oppdelt ved ultralyd i mindre stykker, endene gjort butte ved inkubering med E.coli DNA-polymerase I (Klenow-fragment) i nærvær av 0,1 mM av alle fire desoksynukleotid-trifosfater (reaksjonsbuffer: 50 mg/ml kvegserumalbumin: 1 time ved 25°C). Etter størrelses-fraksjonering i en agarosegel ble DNA-fragmentene med en lengde på ca. 0,4 - 1,0 kb isolert bg ligert i Smal skjæringsstedet av M13mp8-vektoren. De oppnådde delsekvenser ble forenet ved hjelp av et computer-program til den 4664 bp lange totalsekvens som er vist på fig. 1.

Ved computerhjulpet analyse av de åpne leserammer og sammenligning med andre typer av gamma-interferongener (Gray og Goeddel, Nature 298: 859-863; Gray og Goeddel, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et al., EMBO J. 4: 761-767, 1985; Cerretti et al., J. Immunology 136: 4561-4564) ble det proteinkodende område av det equine gamma-interferon-genet målt. Det proteinkodende område er avbrutt med tre introner, hvorunder i det første eksonet kodets de 20 aminosyre lange, hydrofobe signalpeptidet og 18 aminosyrer av det ferdige EqIFN-gamma polypeptidet (baser 366-479) . Det andre ekson koder for aminosyrene 19-41 (baser 1639-1707), det tredje eksonet koder for aminosyrene 42-102 (baser 1803-1985), det fjerde eksonet koder for karboksy-enden med aminosyrene 103-146 (base 3307-3441). På posisjonene 4010 og 4020 befinner det seg to signalsekvenser (AATAAA) for polyadenyleringen av mRNA. På posisjonene 86-88 av det fullstendige EqIFN-gamma polypeptidet befinner det seg det eneste potensielle N-glykosyleringsstedet (ASN-Ser-Ser) som faller sammen med det andre N-glykosylerings-stedet til storfe-gamma-interferon (Asn-Gly-Ser) (Fig. 2). Det fullstendige EqIFN-gamma polypeptidet inneholder overraskende bare en eneste cysteinrest på posisjon 3, hvorunder analogt med de naturlige humane og musedyrs gamma-interferoner de første tre aminoterminale aminosyrer (i dette tilfellet Tyr-Tyr-Cys) sansynligvis avspaltes proteolytisk i organismen.

5. Fremstilling av et syntetisk gen for fullstendig EqIFN-gamma

For å eksprimere rekombinant EqIFN-gamma i sin fullstendige form i Escherichia coli konstruerte man et syntetisk gen fra oligonukleotider. Det koder for den samme aminosyresekvensen som det naturlige EqIFN-gamma genet, men inneholder utelukkende slike kodoner for de enkelte aminosyrer som anvendes i høyt eksprimerte, celleegne gener for E.coli (Gouy og Gautier, Nucl. Acids. Res. 10: 7055-7074, 1982). I tillegg ble flere singulære restriksjonsenzyms-skjæringssteder innbygget, som muliggjør en enkel manipulasjon av genet for forandring av de enkelte avsnitt. Det syntetiske genet for EqIFN-gamma ble konstruert i to varianter av tilsammen forskjellige oligonukleotider. Den første varianten koder for fullstendig EqIFN-gamma med 146 aminosyrer pluss start-metionin, og den andre formen for et polypeptid som er forkortet med tre aminosyrer (Tyr-Tyr-Cys) på amino-enden pluss startmetionin, som sansynligvis burde forekomme i den naturlige organisme.

Strukturen til det syntetiske EqIFN-gamma genet er vist på fig. 3. Oligonukleotiden som anvendtes for fremstillingen ble syntetisert ved hjelp av en Applied Biosystems Model 381A DNA-syntetisator, renset ved elektroforese i denaturerende 12 %ige polyakrylamidgeler (7 M urea) og avsaltet ved hjelp av utelukkelse-kromatografi gjennom Sephadex G-25 (Pharmacia).

Sammenbyqninq av oligonukleotidene til syntetisk EqIFN- gamma gen

Sammenbygningen av det syntetiske EqIFN-gamma genet fant sted i to avsnitt. Den første delen av genet ble fremstilt ved hjelp av de åtte oligonukleotider EG-1 til EG-8 frem til Sall-skjæringsstedet, den andre halvdelen av genet fra de seks oligo-nukleotider EG-9 til EG-14 fra Sall-skjæringsstedet til BamHI-skjæringsstedet. For dem med tre aminosyrer forkortede form av EqIFN-gamma på aminoenden anvendtes i stedet for oligo-nukleotidene EG-1 og EG-2 oligonukleotidene EG-15 og EG-16.

Oligonukleotidene som er komplementære til hverandre ble fosforylert parvis på 5'-enden. 100 pMol av hver av de to oligonukleotider (f.eks. EG-3 og EG-4, hhv. EG-5 og EG-6 osv.) ble inkubert i 9 /il kinase-buffer (70 mM tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol), 2/xCi [gamma"<32>P]ATP (Amersham) med 10 enheter T4-polynukleotidkinase (New England Biolabs) i 10 minutter ved 37°C, 1 /il av en 10 mM ATP-løsning tilsatt og inkubert ytterligere 50 minutter ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet ved 10 minutters oppvarming til 95°C. For å forhindre senere sammenkobling av DNA-endene ble oligonukleotidene EG-1, EG-15, EG-9 og EG-14 ikke fosforylert. De ble første etter inaktivering av polynukleotidkinasen blandet med det enkelte komplementære oligonukleotid, oppvarmet 5 minutter ved 95°C og avkjølt til romtemperatur.

Blandingene av oligonukleotidene EG-1+2 (hhv. i en andre sats EG-15+16), EG-3+4, EG-5+6 og EG-7+8 ble forenet, blandet med l/ul 5 M NaCl, oppvarmet 5 minutter til 70°C og avkjølt til romtemperatur. Til denne løsningen satte man 5 /ul 10 mM ATP, 2 /il ditiotreitol, 1,5 ul lOx ligeringsbuf f er (0,66 M tris-HCl pH 7,2, IM NaCl, 100 mM MgCl2, 10 mM EDTA, 50 mM ditiotreitol) og 80 enheter T4 DNA-ligase (New England Biolabs) og inkubert i 48 timer ved 4°C. Forløpet av ligase-reaksjonen ble forfulgt ved gelelektroforetisk separasjon av DNA-fragméhtene av en liten reaksjonsandel i en 5 %ig, ikke-denaturerende polyakryl-amidgel og etterfølgende autoradiografi. På samme måte ble de seks oligonukleotidene EG-9 til EG-14 knyttet sammen med hverandre. Reaksjonen ble stoppet ved fenol/kloroform-ekstraksjon, og DNA'et gjenvunnet ved etanolfelling.

6. Konstruksjon av ekspresionsplasmidet pRH 100

Alle enzymreaksjoner ble utført under de betingelser som er angitt av produsentene.

7 ug plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21

(1983) 237248, EP-A-0.115. 613) ble lineærisert i 50 /il reaksjons-medium med restriksjonsendonukleasen Hindlll. Etter en en-times inkubasjon ved 37°C ble 50 /il 2x CIP-buffer tilsatt (2x CIP-buffer = 20 mM tris, pH=9,2, 0,2 mM EDTA). Ved tilsetning av 2 enheter alkalisk fosfatase fra kalvetarm (CIP) ble de 5'-terminale fosfatrester fjernet og man inkuberte i 30 minutter ved 45°C. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 4 /il 0,5 mM EDTA-løsning samt tilsetning av 10 /u iM tris, pH=8,0 løsning. Proteinene ble fjernet ved 2 gangers fenol- og 1 gangs fenol-kloroform-ekstraksjon. DNA'et ble utfelt fra den vandige fasen ved tilsetning av 0,1 vol 3M natriumacetatløsning pH=5,5 og 250 /il etanol, DNA-fellingen vasket etter sentrifugering 1 gang med 70 %ig etanolløsning. DNA'et ble tørket, og klumpen så oppløst i 20 /il TE-buffer (10 mM tris pH=8,0, 1 mM EDTA). 1 /ig av hvert av de fremstilte oligonukleotider d (AGCTTAAAGATGAGCT) og d (CATCTTTA) ble fosforylert i 10 /il reaksjonsløsning under tilsetning av 10 enheter T4-PNK (poly-nukleotidkinase) samt 1 mM rATP. Reaksjonen fant sted ved 37°C og varte i 45 minutter. Reaksjonen ble avbrutt ved 10 minutters oppvarming til 70°C. 5 /il av hver plasmidløsning og de fosforylerte oligo-nukleotider ble blandet og oppvarmet 5 minutter ved 70°C. Deretter ble løsningen avkjølt til 0°C, og 2 /il 10x ligase-buffer (500 mM tris pH=7,5), 100 mM MgCl2, 200 mM DTT (ditiotreitol) , 1 mM rATP, 500 /tg/ml BSA (storfeserumalbumin) samt 2 /il vann. og 10 enheter T4-DNA-ligase ble tilsatt. Reaksjonen varte i 40 timer og ble gjennomført ved 4°C. Den ble stoppet ved 10 minutters oppvarming til 70°C. 2 /il av denne ligasereaksjonen ble spaltet i tilsammen 30 /il løsning med 10 enheter av restriksjons-endonukleasen SacI (New England Biolabs) i 3 timer ved 37°C. Reaksjonen ble stoppet etter 10 minutters oppvarming til"70°C. 5 /il av denne reaksjonsblandingen ble ligert i tilsammen 30 /il ved tilsetning av 10 enheter T4-PNK ved 14°c i 16 timer. 200 /il kompetente E.coli HB101 ble blandet med 10 /il av denne ligasereaksjonen. Bakteriene ble holdt 45 minutter på is og deretter oppvarmet i 2 minutter til 42°C for å mulig-gjøre DNA-opptaket. Så ble bakteriesuspensjonen igjen inkubert 10 minutter ved 0°C. Deretter ble de transformerte bakteriene strøket ut på en LB-agar som inneholdt 50 iiq/ T& l ampicillin. Fra de oppståtte bakteriekoloniene ble 12 utplukket vilkårlig og plasmidene isolert fra dem i mikromålestokk (Birnboim og Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). De resulterende DNA'er ble kappet med restriksjonsendonukleasen SacI, og DNA separert på en agaraosegel (1 %, lx TBE-buffer). DNA'ets vandring som et lineært molekyl med størrelse fra ca.

4.400 bp bekreftet innføringen av et Sacl-gjenkjennelsessted i plasmidet. Et av disse plasmidene ble utplukket vilkårlig. Med DNA'et fra det tilhørende minipreparat ble E.coli HB101 igjen transformert. Fra de resulterende transformerte bakterier ble en koloni valgt ut og dyrket i stor målestokk. Plasmidet som ble isolert fra dette ble kappet med restriksjonsendonukleasen EcoRI og BamHI, DNA'et separert på en 1 %ig agarosegel, og det mindre fragment ble isolert fra gelen ved elektroeluering. Dette ca. 460 bp lange EcoRI-BamHI DNA-fragment ble sekvens-bestemt ifølge Sanger (F. Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (1977) 5463-5467). Det således analyserte plasmidet ble kalt pRHIOO.

7. Innføring av det syntetiske EqIFN- gamma gen i ekspresionsplasmidet pRHIOO

16- Hg plasmid pRHIOO kappes i 100 ul reaksjonsbuffer med SacI fullstendig og enzymet inaktiveres ved 10 minutters oppvarming til 70°C. De overhengende DNA-endene gjøres butte ved behandling med Klenow-fragment (Amersham) i nærvær av 10 MM av alle fire desoksynukleotid-trifosfater (30 minutter, 25°C). Reaksjonen stoppes med fenol/kloroform-ektraksjon og DNA'et konsentreres ved etanolfelling. Gjennom denne behandlingen dannes i tilslutning til tryptofanpromotoren en butt DNA-ende som ender med translasjonsstartkodonet "ATG". Det lineæriserte plasmid-DNA etterkappes med BamHI og vektorandelen isoleres etter elektroforeseseparasjon på en agarosegel.

50 ng av den som beskrevet forberedte pRHIOO plasmid-vektoren blandes med 20 pMol av de ligerte oligonukleotider EG-1 til EG-8 og EG9 til EG-14 og inkuberes i 10 /il ligeringsbuffer (66 mM tris-HCl pH 7,2, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM ditiotreitol, 1 mM ATP) med en enhet T4 DNA-ligase (Boehringer Mannheim) 24 timer ved 14°C. E.coli JM101 som er gjort kompetente ved behandling av kalsiumklorid transformeres med denne ligeringsblandingen og inkuberes natten over ved 37°C. Fra de erholdte transformanter isoleres ved minipreparerings-metoden plasmid-DNA og strukturen bestemmes ved restriksjons-analyse og sekvensbestemmelse av Hindlll-BamHI-inskuddet. Et plasmid med den ønskede struktur for ekspresjon av fullstendig EqIFN-gamma kalles pEqG-YYCl.

På fullstendig analog måte klones oligonukleotidene EG-15,16 EG-3 til EG-8 og EG-9 til EG-14 i pRHIOO vektoren for å oppnå EqIFN-gamma som er forkortet med tre aminosyrer. Et plasmid med den ønskede struktur kalles pEqG-QAAl. 8. Eks<p>resjon av interferonaktiviteten gjennom E. coli JM101 som inneholder plasmidet pEa- YYCl eller pEqG- QAAl.

100 ml bakteriekultur inkuberes ved 37°C under kraftig rysting i følgende tryptofanfrie medium (angivelse pr. liter medium): 10 g (NH4)2P04, 3,5 g KH2P04 pH 7,3 med NaOH, 0,5 g NaCl, 21 g kasaminosyrer (surt hydrolysert), 11 g glukose, 1 mM MgS04, 0,1 mM CaCl2, 1 mg tiamin-HCl, 2 0 mg L-cystein, 20 mg 3-/J-ihdolakrylsyre (IAA, induktor for tryptofan-operon) , 50 til 100 mg ampicillin. Så sammenklumpes bakteriene ved sentrifugering i 5 minutter ved 4000 opm, oppslemmes med 1/10 av dyrkningsvolumet iskald 50 mM tris-HCl pH 8,0, 30 mM NaCl og brytes opp 2 x 30 sekunder iskjøling ved hjelp av ultralyd-probe (20 kHz, 100 Watt). Celleavfallet fjernes 10 minutter ved 10.000 opm (4°C) og supernatanten undersøkes etter sterilfiltrering med hensyn til interferonaktivitet i en måling som angir den cytopatiske virkning (CPA) for vesikulær stomatit-virus (VSV) eller encefalomyokardit-virus (EMCV).

Forsøkssystem: NBL-6 celler (ATCC CCL 57, hestehud-epidermis-celler/VSV

A549 (ATCC CCL 185, human lungekarsinom-cellelinje)/EMCV

Styrken på A 549-celler normeres med human-interferon-standard til internasjonale enheter.

9. Påvisning av eksprimerte heste- interferoner ved markering av proteinene i maksiceller

Plasmidkodede proteiner kan markeres selektivt in vivo ved anvendelse av maksicelle-teknikk. E.coli CSR603 transformeres etter vanlige metoder med ekspresjonsplasmidene og seleksjoneres med hensyn til transformerte bakterier på ampicillin-holdige agarplater. Prepareringen av maksicellene og markeringen av proteinene skjer etter en forskrift fra A. Sancar (a.a.O). Cellene dyrkes i 15 ml medium (se eksempel 8) uten indolakrylsyre ved 37°C opp til en OD600nm=0,5, og 10 ml av denne kulturen bestråles i en petriskål i 5 sek. fra 50 cm avstand med en UV-germicid-lampe (15 Watt) under bevegelse og videre-inkuberes en time ved 37°C. Kulturene blandes med 100 Mg/ml D-cykloserin, inkuberes 14 timer ved 37°C, og bakteriene høstes så ved sentrifugering. Cellene vaskes to ganger med 5 ml Hershey-salt-løsning, oppslemmes i 5 ml Hershey medium med 20 vg/ ml indolakrylsyre og inkuberes 2 timer ved 37°C. Hver kultur tilsettes 5 /xCi/ml <35>S-metionin (1000 Ci/mMol) og ristes en time ved 37°C. Cellene høstes i SDS- og 2-merkaptoetanol-holdig elektroforese-probebuffer, lyses og proteinene separeres på en 15 %ig polyakrylamidgel.

Et autoradiogram av den tørkede gelen vises etter 2 dagers eksponering på DuPont Cronex røntgen-film under anvendelse av et Kodak Lanex-regulær forsterkerfolie ved -80°C. Som molekyl-vekts-standard anvendes en <14>C-metylert proteinblanding (Amersham). Plasmidet pERl03 tjener som kontroll, hvilket bare inneholder promotoren uten interferon-genen og plasmidet pER21/l, som inneholder to kopier av det

humane IFN-02arg genet.

10. Påvisnin<g> av sekvenser som hybridiserer med EqIFN- gamma i genomisk heste- DNA

For påvisning av totalantallet av sekvenser i heste-genomet som har høy homologi med interferongenet EqIFN-gamma går man frem som følger. 30 /ig høymolekylært heste-DNA (eks. 1) spaltes med 100 enheter av det tilsvarende restriksjons-enzym i 300 /il reaksjonsvolum fullstendig og 10 /ig av hver av disse kappede DNA pr. spor separeres på en 0,8 %ig agarosegel etter størrelsen.

Etter Southern-overføring til nitrocellulosefilter, denaturering og fiksering av DNA'et hybridiserer man hvert filter med ca. 6xl0<6> cpm radioaktivt merket "probe" (17 timer ved 65°C, 5x SSC, 5x Denhardt-løsning, 0,1 % SDS, 20 ^ g/ xal denaturert laksesperm-DNA). Som "probe" for EqIFN-gamma anvendes et fragment fra plasmidet pEqG-YYCl som inneholder sekvensen som koder for hele det ferdige interferon. Filteret vaskes så under stringente betingelser: 4 ganger 45 minutter ved 65°C med 0,3x SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM Na3 citrat), 0,1 % SDS. Autoradiografien finner sted på DuPont Cronex røntgen-film under anvendelse av Kodak Lanex-regulær forsterkerfolie 7 dager ved -80°C. 11. Ekspresjon av equint interferon- gamma ( OAA) i E. coli HBl01/ pEgG- OAA2 og HBl0l/ pEgG- 0AA3.

For å få en forbedret ekspresjon ble

a) forbedrede ekspresjonsvektorer og

b) et forbedret ribosomalt bindingsted anvendt.

De forbedrede ekspresjonsvektorer bygger på trp-promotoren fra

Serratia roarcescens (Sma), som i -35 området er tilpasset til konsenus -35 området ved et baseutbytte (pRH281), hhv. på en hybrid-trp promotor, som har det første A/T-rike området til Escherichia coli (Eco) hhv. det andre av A/T-rike området pluss promotor av Sma (pRH282, S. Itoh, gene 44 (1966), 29-36). Som ribosomalt bindingssted anvendes det for E.coli enterotoksin II.

a) pRH28l/5

Følgende oligonukleotider ble fremstilt ved hjelp av en

Applied Biosystems DNA syntetisator 381A:

100 pMol av hvert oligonukleotid Trp-2 til Trp-5 ble fosforylert separat i 10 fil. Trp-1 og -2, Trp-3 og -4 samt Trp-5 og -6 ble hybridisert ved oppkoking og langsom avkjøling. Oligonukleotid-par-løsninger ble slått sammen og ligert ved tilsetning av T4-DNA-ligase. 3 fig pAT153 ble dobbeltkappet med EcoRI og Clal. Etter rensing av det store fragment ble dette blandet med ca. 20 pMol oligonukleotider og ligert. DNA'et ble så transformert i E.coli HB101 og plasmidene fra noen resulterende kolonier isolert. Pst-Hindlll-fragmentet som inneholdt promotoren, ble sekvens-bestemt. Etter bekreftelse på den ønskede sekvens ble et plasmid valgt ut og kalt pRH281/5.

Sekvensen til promotordelen lyder:

Fordelene ved den nye ekspresjonsvektoren er:

1) optimal -35 område i trp-Sma promotoren

2) singulært Xhol-setet foran det ribosomale bindings-setet (RBS) tillater utbytting av RBS mot et annet. 3) ekspresjonsplasmidet inneholder en translasjonsstart ATG i avstand på 5 nukleotider etter RBS 4) G'et i dette ATG er den første basen til Sstl-gjenkjennelses-sekvensen (GAGCTC). Ved kapp med Sstl og etterfølgende dannelse av en rett ende står en ekspresjonsvektor med ett translasjonsstart-ATG til rådighet, på hvilket et fremmed gen som begynner med

leserammens første base kan ligeres til.

5) forbindelsen RBS-ATG inneholder ikke noe G eller C

6) gjennom valget av oligonukleotid-sekvensen på 5'-enden ble det opprinnelige EcoRI skjæringsstedet ødelagt.

Derved kan det på 3'-enden av promotoren frembringes et multiklonings-sted bestående av Sstl, EcoRI, Clal og Hindlll (allerede i pAT153 andelen).

b) pRH282/5

På samme måte ble ekspresjonsvektoren pRH282/5

sammenbygget. Oligonukleotidene Trp-1 og Trp-2 ble erstattet med oligonukleotidene Trp7 og Trp-8:

Sekvensen til promotordelen i pRH282/5 lyder:

c) pGNl

1 fig pUCl8 ble dobbeltkappet med BamHI og Sali. Fra 10

Mg EqG-QAAl ble likeledes med BamHI-Sall dobbeltkapping den

andre halvdelen av det syntetiske heste-gamma-interferon-genet isolert og defosforylert. Ca. 20 ng vektor ble ligert med 100 ng innskudd og DNA'et transformert i E.coli JM101. Plasmidet fra en koloni ble prøvet ved hjelp av restriksjonsenzym-spaltning og kalt pGNl.

d) pGN3

Den første halvdelen av det syntetiske genet ble sammen

med det ribosomale bindingsstedet satt sammen av oligonukleotidene:

50 pMol av hvert oligonukleotid ble fosforylert som følger: EqG-2 sammen med EqG-5 i 7 /il, EqG-3 og EqG-8 alene i 8 fil hver. Kinasereaksjonen ble stoppet ved oppvarming til 100°C. Til EqG-3 satte man 50 pMol EqG-4 (1 fil) og til EqG-8 50 pMol

EqG-1 (1 Ml)• Løsningene ble igjen oppvarmet til 100°C og langsomt avkjølt. Oligonukleotid-parløsningene ble slått sammen og ligert med T4-DNA-ligase i tilsammen 3 0 Ml» 2 M9 pUCl8 ble dobbeltkappet med EcoRI og Hindlll, vektordelen gelrenset og oppløst i 50 Ml vann. 40 ng vektor og ca. 2 pMol ligerte oligonukleotider ble ligert i 10 m1 og DNA'et deretter transformert i E.coli JM101.

EcoRI-Hindlll innskuddet til noen resulterende plasmider ble omklonet i Ml3mp9 og sekvensen overprøvet. Et plasmid med den ventede sekvens ble valgt ut og kalt pGN-3.

e) pGN20

Ca. 3 M9 pGNl hhv. pGN3 ble dobbeltkappet med Hindlll og

Sali. Innskuddet av pGN3 og vektoren/2. halvdel av Eq-gamma-interferon-genet fra pGNl ble gelrenset. 0,2 ug pGN3 ble ligert med ca. 0,05 ug pGN3-innskudd, og DNA'et transformert i E.coli JM101. Plasmidet av et resulterende klon ble etter overprøving av restriksjonsmønsteret valgt ut og kalt pGN20.

f) pEqG-QAA2 hh. pEqG-QAA3

Fra ca. 10 M9 pGN2 0 ble XhoI-EcoRI innskuddet som

inneholdt det syntetiske heste-gamma-interferon-gen sammen med det ribosomale bindingsstedet for E.coli enterotoksin II (C.H. Lee et al., Infect. Immun. 42 (1983), 264-268; S.L. Moseley et al., Infect. Immun. 39 (1983), 1167-1174) isolert. pRH28l/5 hhv. pRH282/5 ble dobbeltkappet med Xhol og EcoRI. 20 ng vektor ble ligert med 20 ng innskudd, og DNA'et transformert i E.coli HB101. Noen kolonier ble valgt ut, plasmidene isolert og overprøvet med restriksjonsanalyse. Hver gang et plasmid ble valgt ut og kalt pEqG-QAA2 (vektor: pRH28l/5) hhv. pEqG-QAA3 (vektor: pRH282/5).

g) Lysatprøve på interferon-gamma-aktivitet.

En natten over kultur av E.coli HB101/pEqG-QAA2 hhv.

HB10l/pQaG-QAA3 ble fortynnet 1:100 med LB/Amp (LB:10 g/l trypton, 5 g/l gjærekstrakt, 5g/l NaCl, 50 mg/l ampicillin) og inkubert videre ved 37°C. Når man nådde en optisk densitet

(600 nm) på 0,3, ble 50 mg/l indolakrylsyre tilsatt og kulturen inkubert 2 timer til ved 37°C. Bakteriene ble sentrifugert fra og brutt opp ved hjelp av ultralyd. Den steril-filtrerte supernatanten ble prøvet på NBL-6-celler (ATCC CCL 57) med hensyn til gamma-interferon-aktivitet, hvorunder vesicular stomatitt virus (VSV) til slutt ble anvendt som virus. Lysatene av begge transformerte bakteriekulturer (E.coli HB101/pEqG-QAA2 hhv. HBl01/pEqG-QAA3) viser ca. 0,1 til 1 millioner enheter/ml interferonaktivitet. For kontroll ble et identisk fremstilt E.coli HBl01/pRH281 lysat prøvet. Dette kontroll-lysatet viste mindre enn ca. 100 enheter/ml.

Claims (6)

1. Ekspresjonsvektor som koder for, og kan uttrykke et polypeptid med de biologiske og immunologiske egenskapene til EqIFN-"Y, kara_kterisert ved at den omfatter et DNA-molekyl som koder for et polypeptid med de biologiske og immunologiske egenskapene til EqIFN-*Y med en sekvens som inneholder tryptofan-promotoren, valgt fra gruppen hvori R<1> betyr eller TAT og hvori R<2> betyr ATGAATTATA CAAGTTTTAT CTTGGCTTTT CAGCTGTGTG CGATTTTGGG 50 TCTTCTACCC AG, ATGCAG, eller CAG eller redundante variasjoner av de nevnte DNA-sekvensene, hvilket DNA-itiolekyl er egnet for ekspresjon i Echerichia coli og er funksjonelt bundet til en ekspresjonskontrollsekvens.

2. Ekspresjonsvektor ifølge krav l, karakterisert ved at tryptofan-promotoren er tryptofanpromotoren fra Serratia marcescens.

3. Ekspresjonsvektor ifølge krav l og 2, karakterisert ved at ekspresjonskontroll-sekvensen er valgt fra gruppen bestående av oa

4. Vertsorganisme, karakterisert ved at den er transformert med ekspresjonsvektoren ifølge krav 1-3.

5. Vertsorganisme ifølge krav 4, karakterisert ved at den er Escherichia coli.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av et polypeptid med de biologiske og immunologiske egenskapene til EqlFN-^, karakterisert ved at a) E. coli transformeres med en ekspresjonsvektor ifølge krav 1-3 som koder for, og er istand til å uttrykke dette polypeptid; og b) denne transformerte E. coli mikroorganismen dyrkes, og c) polypeptidet isoleres.