DK170054B1 - DNA-sekvenser, transformerede værtsorganismer, polypeptid med biologisk aktivitet som gamma-hesteinteferon, fremgangsmåde til fremstilling heraf og farmaceutisk præparat indeholdende polypeptidet - Google Patents

Description

i DK 170054 B1

Opfindelsen angår DNA-sekvenser kodende for po-lypeptider med y-hesteinterferonaktivitet, andre DNA-sekvenser med anvendelighed som sonder hertil, po-lypeptider med en sådan aktivitet, fremgangsmåde til 5 fremstilling heraf samt farmaceutiske præparater omfattende sådanne polypeptider som aktive ingredienser.

y-Hesteinterferon (også benævnt equin y-interferon eller EgIPN-y) beskrives i J. Interferon Res. 2 (1982), 363-370, idet der her påvises syrelabil, 10 antiviral aktivitet i overstande fra mononukleare hesteblodceller efter stimulering med phytohæmagglutinin. Aktiviteten er dog ikke nærmere karakteriseret og der foreligger ikke oprensning af proteinet.

Interferoner er proteiner, der udskilles af 15 eukaryotiske celler efter virusinfektioner eller andre stimuleringer, og som på den anden side kan beskytte cellerne mod virusinfektioner. I øjeblikket kendes 3 klasser af interferoner: Disse betegnes som a-inter-feron, β-interferon og γ-interferon (forkortet IFN-a, 20 IFN-β og IFN-y). Forskellen ligger i deres opbygning og deres virkninger. Interferoner kan have regulerende virkning på cellerne i immunsystemet, endvidere på differentiering af celler og på vækst af tumorer.

F. Wheelock opdagede i 1965 et polypeptid, der 25 beskyttede bestemte celler mod virusinfektion (Science 149, 310 (1965). Polypeptider med disse egneskaber blev betegnet immun-interferon, type Il-interferon, y-inter-feron eller IFN-y selv om det drejede sig her om et polypeptid, der hørte til klassen af lymfokiner. Foru-30 den human γ-interferon har man hidtil kendt y-interferon fra kvæg, mus og rotter. Alle hidtil kendte y-interferoner foreligger på glykosyleret form, idet dog glykosyleringen ingen indflydelse på den biologiske aktivitet (Keller et al., J. Biol. Chem. 258, 8010 35 (1983)).

Man antog længe, at interferonerne virkede art- DK 170054 B1 2 specifikt. In vitro-forsøg viste dog, at IFN-præparater fra kvæg kunne udløse en antiviral virkning hos aber og hos mennesker (Tovey, M.G. et al. J. Gen. Virol 36, 341-344 (1977). Denne vekselvirkning mellem arter hæn-5 ger muligvis sammen med en mere eller mindre stor homo-logi i generne eller i proteinerne, men på grund af den ringe mængde, man besad af dyriske interferoner, kunne man ikke gennemprøve denne teori.

Man må trods den fastslåede artsvekselvirkning 10 være opmærksom på bivirkninger som antigeniteter ved anvendelse af interferoner fra fremmede arter. Disse kan eventuelt ikke tolereres ved en terapi.

Da på den anden side husdyr og nyttedyr har en betydelig kommerciel værdi, eksisterer der et behov for 15 interferoner for de forskellige arter, der kan anvendes af dyrlæger. Høj rensede dyreinterferoner fra de forskellige arter ville give en meget velkommen lejlighed til at undersøge virkningsmekanismen for interferonerne, så man kunne opstille modeller, der kunne overføres 20 til mennesker.

Man gennemførte de første undersøgelser på dyriske interferoner med præparater fra naturligt cellemateriale. Udbytte og renhed af interferoner fremstillet ifølge disse fremgangsmåder var imidlertid sådan 25 at de var uegnede til fremstilling af lægemidler.

Efter udviklingen af rekombinant DNA-teknik er det blevet muligt at producere heterologe proteiner ved hjælp af mikroorganismer. På denne måde har man f.eks. også fremstillet humane interferoner (Hu-IFN) og i den 30 seneste tid også forskellige ikke humane interferoner.

EP-A 88 622 beskriver α-, β- og γ-interferoner * fra kvæg samt DNA-sekvenser kodende for disse interferoner. EP-A 186 .098 beskriver α-, β- og ω- e interferoner fra heste samt DNA-sekvenser kodende for 35 disse interferoner. Disse interferoner sammenfattes sædvanligvis som type I-interferoner, da de overfor DK 170054 B1 3 hinanden opviser en høj homologi og, i hvert fald hvad angår IFN-α og IFN-β, binder til samme receptor. De har dog kun en ringe homologi til IFN-γ, der binder til en anden receptor og betegnes som type Il-interferon 5 (Nature 295 (1982), 503-508).

En opgave for opfindelsen var at fremstille y-hesteinterferon genteknologisk og at tilvejebringe de hertil nødvendige DNA-sekvenser.

Opgaven blev løst ifølge opfindelsen ved an-10 vendelse af den såkaldte sondeteknik. Man anvendte som sonde en fra human-γ interferon afledt DNA-sekvens, der er kendt fra litteraturen (Gray og Goeddel; Nature 298, 859-863 (1982)).

Dele eller fuldstændige sekvenser af andre y-15 interferoner er dog lige så egnede som sonder. Ved forskningen benyttede man som udgangsmateriale et DNA-bibliotek, der stammede fra normal levervæv fra heste.

Man isolerede først genet, der kodede for EgIFN-y, med flankerende områder og med efterfølgende formel I: 20 25 30 35

V

5 DK 170054 B1 4 GGATC 5 CCACAAGAATGGCACGGGTGGGCATAATGGGTCTGTCTCATCGTCAAAAGACCCAAGGAG 6 5 TTGAAAGGAAACTCTAACTACAACACCAAAATGCCACAAAACCATAGTTATTAATACAAA 1.2 5 CTAACTAGCATCTGTGCCTATCTGTCACCATCTCATCTGAAAAAACTTGTGAAAATACGT 18 5 . n AATCCTGATGAGACTTCAATTAGGTATAAAAACCAGCCCCAGAAGGCGAGGCAGTACACT 24 5 1U CTTCTGATCGCCGGTAGGGCAGCTATTAGAAAAGAAAGATCAGCTGAGGCCTTGGGACCT 305 GATCAGCTTAGTACAGAAGTGACTGCTTTCAACTACTTAGGCCTAACTCTCTCCGAAACA 365 -20 -15 -10

Met Asn Tyr Thr Ser Phe Ile Leu Ala Phe Gin Leu Cye Ala Ile ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT 410 -5 -11 5 10

Leu Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu 15 TTG GGT TCT TCT ACC TAT TAC TGC CAG GCC GCG TTT TTT AAA GAA 455 15

Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe ATA GAA AAC CTA AAG GAA TAT TTT GTAAGTATGACCTTTTAATAATACTTAC 507 I N T R O N 1 TTGTGGTTGAAATGACTGAACGTTGTCTTGGAGTTGGATCTCTGATAGGCTGTCCTCTCT 567 ACTCCACAGTCATCTTGAGAAGACTGGGTGTTATTTTCTCTGTTTGTTGACTGGATGAGT 627 20 TTTTCTTTTTTTTACTAAATGATCTAGATATTGCTTTAACCCTCTGCTCAATTTGCTATA 687 G AGACTTAGAG AGGGTTCATGAATCTTCCAAAAGATGGGCTTAACAGGTTTATAAAGCAT 747 AGTGAAGTTGACAATTTTGTGGTGAGAAGCCACTGAATTGTGATAAGTCAAGTAGTGTGG 807 ACATTGAAAAAATGACTAGCTATTAGTTTCTAACTTCTCAGGTTACTATGATGGTGACAA 867 TAAAAGGTCAAGATTAGCATTAAAATGGTAATCTGAAATAATTGATCAGTTAAAGAAGGC 927 GCTGTCCTGAAAGGTTTGGCTGAAAAAAAATCACTTTCAGGTGTTTTCCTCCAAAAAATG 987 ATTTTAAAATCTTACTGCCCCGTTTGTGTTAGCTGTGAAGTACTCTGGAACTCAGTCAAT 1047 TGCTGAGATTTTGTACGAGTTATAAGCTGGCTTATATTTAAAAAATTTTTTTGTTTTTGT 1107 TTTATGAGTTTCTTTTAAAATGTTATTTATGGTTAATTAAAATAGTTTTTGCATTTTAAA 1167 25 TATTTTATTATTTGTCCAAAATTTAGCTATTTTAATTATAGTTGGAGCTCTCTTTTAGAG 1227 CTGACATAAGACCATAGGGGAGGCACAGATAGATGTGATGGAGCCCTGTACCAGACGGGG 1287 GCAGTATCTTATAGTGGGTTGCCTTTGCTGATCTTTTTACTAGACTTGAAATTATTTGCT 1347 TTTCCTTCCTATGGTTATTTGGGACTATTGAAGTATCACCAGCCCTGTTGAGTTCATCTG 1407 TAATATTGTAATTCAAGGGTTACACTAGAAAATAAGAAAGCTAAAACAGCACGATAATCT 1467 TTGGCTACATCCAACACAATAGCTTTTGGGAATACTTATTGTTAGAACTAAACAGAGGGT 1527 TGAAAAGAAAATCAGTGAATACTGTCAGCATCTGAGTTCAATAAAACGTGAAGTACATTT 1587 20 2Q Asn Ala TTAGGGCAATTCATGGACTAATTGTAAACCAAGTTTTCCTTCCTTTTTCAG AAC GCA 1644 25 30 35

Arg Asn Pro Asp Val Gly Asp Gly Gly Pro Leu Phe Leu Asp Ile AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT GGT GGG CCT CTT TTC CTG GAT ATC 1689 * 35 DK 170054 B1 5 5 40 INTRON2

Leu Lys Asn Trp Lys Glu TTG AAG AAC TGG AAA GAG GTAAGCTAAGTATTTCCATTTGGTTGATTTTCCTGT 1743 TGCTTATTTTCTGGTGGATGAATTCACACCAACCTCTCTTTGTGCTCTTTTCTCCCTAG 1802 45 50 55

Asp Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Val ser Phe Tyr GAT AGT GAC AAA AAA ATA ATT CAG AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC 1847 10 60 65 70

Phe Lys Leu Phe Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin Val Ile Gin Lys TTC AAA CTC TTT G AA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG 189 2 75 80 85

Ser Met Asp Thr Ile Lys Glu Asp Leu Phe Val Lys Phe Phe Asn AGC ATG GAC ACC ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC 1937 90 95 100 15 Ser Ser Thr Ser Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile AGC AGC ACC AGC AAG CTG G AA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT 1982

INTHON

Pro CCG GTGAGGAGATCTTAATTCTTTCTTTGGTTTCATTACAGAGGTTCTTGCAAAGTGCT 2041 TA CGTCCCAGAAAGTAGAAATGAACTATGAAATGAACCCGTGGCCAAAACTCCTCCTTCC 2101 TAATTCCATTTGTGCTTTGAGAGACTTTGCTAAGTCAGTATGGGAATCATTTAAATTTGT 2161 GATTTGGGGAAATGCTGGCACTATGACTACTGCACAAAGGCAGGTGAAGGGACAAATCCA 2221 2 o GTGAGGAGGGGGCAGTGAAGAAGTGGAGGGGAGTCTGGAGAAGCAGGTCTCTCCTTGCCC 2281 CTTGTTCGTGAG ATGAAATCCTCCTGCTTTGGATGGGAGGCTGCGTGTCTTGGTGGAAAG 2341 AGCAGTGGGAGGAGGGAG AAGATTTGTGCTCCTCCCAGCTCAGCCACCAAGAAACTGTGA 2401 CCTCAGATGAATCACAGGCCTGGCTGGGGCTCAGTTTCCTCATCTTAAAAGAGGCCTATT 2461 GGGTTCACTAAAATTTCTATGATCTTCTTTGCTCTATAATCCTACAATTCTGTGGACAGA 2521 AAATGAAATGAGGTAGGAGAAAGAAATAGCCTTTGAAGAGGTTCTTGGGCATTCCACTGC 2581 CAGGCTCTGGTCAACCTTCATACTCTGCAGCCCAAGAAGAGGCAAGACCATTTGTCTGTT 2641 TTTGGAAATGCAA ATAGGCGGCATTTATACCTCACGAAAGAACTGTTCTGTCAACTTTTG 2701 GATACTGGGCTATCTTGGCTGGAGAAATCCTTAGGCTCCCAAACTTTCTCTCATGAAATT 2761 o C GTCTTGAGTCTTTAAATTTATGGCTTCTCGAAGCTGAGAGATAACTTTAAGCATAAAGAC 2821 AAATTACATTTTCCAACATTTTGTCTAAGAGACAAAGACCTCCACATGCCTTTGGGTTTG 2881 GCCTGGATCTA A ATGGGCTTGA ATGAGAAGGGGAGGGTGTTGTTATGACTATGTTTAGAA 2941 GAGAAAACAGAGGTTTGGAGAGGTTAAGTGGCTGGTTCAAAGTCAGAGTTATTGCACACA 3001 CAGGATTCG AACCCATATGTTTTGTCCCTCCACTTTAGGGTTCTTTTCGCTACATAATTT 3061 TGAGAATTCTGTACCAGTCAATTTAAGGATGTGTGATGTTCCCCATCCTATTACAGCACA 3121 ACCAGCAATTTAATTATAATTTTAGTCTTAACTGCTGAAGAAAGCAGCATTACATATTAA 3181 GCTAACATATTCCTGGTGAAAGCAACTTTTTCAAAGGAATATTTCTATTTTCATGGACCA 3241 TGACAGTAGCACAGCCTGATGGCTTGTATGCCTGAAACTAATTTTGCTGTTTTCTTTCCC 3 301 30 J 105 110 115

Val Asn Asp Leu Lys Val Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu AATAG GTA AAT GAT CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC 3348 120 125 130

Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys ATC AAA GTG ATG AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG 3393 35 DK 170054 B1 6 135 140 145

Arg Lys Arg Ser Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin CGG AAG AGG AGT CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA 3438 * ft ft 5 TAG TGGTCATCCTGCCTGCAATATTTGAATTTTTAAATCTAAATCTATTTATTAATATT 3497 TAATATTTTACATTATTTATATGGGGAATATATTTTTAAACTCATCAAAGTATTTATAAT 3557 AGCAACTTTTATGTAATGAAAATGGGTATCTATTAATATATATATTATTTATAATTCCTG 3 617 TATGGTGTGACTATTTCACTTGACCCTTTTTTTTCTGACCAACTAGGCAAGATTATGTGA 3677 1 TTACAAGGCTTTAACTCAGGGGCCAACTAGGGAGTGGGTAGCCGACCTACCAAGACCCTG 3737 TGAGCTGTGTGTTTATTTCCCTCAATGATACAATGAACACTTATAAAGGAAAGGAGGGCC 3797 TCCAGTCACTGCCTGTTGGAGAACATGTCTGCATTGTGAGCCACTGCTTAATGGCATGTC 3857 AAACCACGCTTGAATGTGTCAGATGATAGGGCTTGTCCCCTGATAAAGCTTAGTATCTCC 3917 TCTCATGCCTAGTGCTTCAGAATATTGTTGACAACTGTGACTGCACCCAAATGG AAAGTA 3 977 10 ATTTATTTGTTTAGTTTACCAATATTTAATAAATATGAATAAAGTATAATTTCATAACTA 4037 TTTATGCTGCGTCCGGCTTTTTCTAAGTGAGGACTGGGGTAAATGAACTACAAACTAATG 4097 AATCAGTAAGAGGGAACTCGTTTTTAGCGGTGGAAATCTTAGCTGGATTAAGCCCCATGA 4157 AACGTGGTATTTCTCTCCACTGGAGATTTGTTGGCTACTACTCCTCCATGTAGCAGCTCT 4217 TTATCTTTCCAAAATATAAATTTAATTATGTCACCATTTACTTCAGAGCTTCTGCGATGG 4277 AAAGTAGTTCAAATAGTTTAGCTTAGCACACAAAGCTTTGTTTCTCCCTCCTCCCTCAAC 4337 TCTGCACTGTGCTCTTCATCTTGGTGTCCCCACGTCCTCTGTCCACTTCGGGCAAACCAC 4397 CGGGAATGTCATGGTGAGGGTGAGCTCTAGGGAGAGAGGGCTGGATTAGAATTTCGGCCC 4457 CACCATTACCAGTAGTATGACCTTTAATGAATTACTTGTATTCTCTAAGCTCCAGTTTCC 4517 15 TCATCTGACACAAGAGAATAATTGTGCCTAAAATTGTGGTGAGAGTTTGTTCTTTCACTC 4577 AAGAAGTGTTTACTGGAGCATCCACTAGTTGCCTAGTGCTGTTCTAGGCACTTGAGATAC 4637 ATTTGTGAACAAA? TAGTCAAGGATCC 4664 f 20 25 30 35 DK 170054 B1 7

Det er bemærkelsesværdigt, at EqIFN-y lige som alle indtil nu kendte γ-interferoner fra forskellige organismer kodes for af et gen, der opviser store sekvenser, der afbryder strukturgenet: Genet består af 5 exoner og introner, idet kun exonerne koder for proteinet. Intronerne kan kun forstås af bestemte systemer, f.eks. af systemer i pattedyrceller. Til andre systemer f.eks. E.coli kan man ikke anvende DNA-sekvenserne, der indeholdende introner.

10 En yderligere opgave for opfindelsen var således at tilvejebringe en intronfri DNA-sekvens, der kodede for EqIFN-y.

Løsning af denne opgave kan principielt foregå på to måder.

15 1. På vejen fra cellekernen, hvor transkriptionen foregår, og til cytoplasmaet bliver intronerne udskåret, og ved sammensplejsning af exon-RNA-fragmenterne opstår mRNA, der tilhører det euka-ryotiske protein. Dette mRNA kan ved hjælp af et 20 enzym, revers transkriptase omkopiere DNA, der betegnes som "copy DNA" (cDNA).

25 30 35 DK 170054 B1 8 15 10 15

TAT TAC T6C CA6 GCC GCG TTT TTT AAA 6AA ATA GAA AAC CTA AAS

20 25 30 GAA TAT TTT AAC GCA AGA AAC CCA GAT GTA GGG GAT G6T GGS CCT 4 35 40 45

5 CTT TTC CTG GAT ATC TTG AAG AAC TGG AAA GAG GAT AGT 6AC AAA

50 55 60

AAA ATA ATT CAS AGC CAA ATC GTC TCC TTC TAC TTC AAA CTC TTT

65 70 75

GAA AAC TTG AAA GAT AAC CAG GTC ATT CAA AAG AGC ATG GAC ACC

80 85 90

ATC AAG GAG GAC CTG TTC GTT AAG TTC TTT AAC AGC AGC ACC AGC

95 100 ' 105

AAG CT6 GAA GAC TTC CAA AAG CTG ATT CAG ATT CCG GTA AAT GAT

10 110 115 120

CTG AAG GTC CAG CGC AAA GCA ATA AGT GAA CTC ATC AAA GTG ATG

125 130 135

AAT GAT CTG TCG CCC AAA GCT AAC CTG AGG AAG CGG AAG AGG AGT

140 145 CAG AAT CCA TTT CGA GGC CGG AGA GCG TTG CAA TAG . .

15 Formel II

Dette intronfrie DNA kan derefter indsættes i egnede plasmider, der derefter kan anvendes til produktion af eukaryotiske proteiner, i dette tilfælde af EqIFN-γ, sammen med egnede værtsorganismer, f.eks.

20 E.coli. Degenerationen af den genetiske kode kan ved denne fremgangsmåde være en ulempe. Denne degeneration fører nemlig til, at forskellige organismer benytter forskellige codoner for samme aminosyre. Ved en ikke optimal tilpasning af det anvendte DNA kan man risike-25 re en forringet ekspression af et eukaryotisk protein i et prokaryotisk system.

2. En anden mulighed for at tilvejebringe en in-tronfri DNA-sekvens for et eukaryotisk gen består i, udfra kendskab til den kromosomale DNA-30 sekvens, kemisk at syntetisere en intronfri DNA- sekvens.

DNA sekvensen beskrevet med nedenstående formel III har vist sig særligt egnet til løsning af opgaven ifølge opfindelsen. 1 DK 170054 B1 9 -11 5 10 15 ATG TAC TAC TG C CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA 20 25

GAA TAC TTC AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG

35 40 45

5 CTG TTC CTG GAC ATC CTG AAA AAC TGG AAA GAA GAC TCT GAC AAA

50 55 60

AAG ATC ATC CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC

65 70 75

GAA AAC CTG AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAC ACT

80 . 85 90

ATC AAA GAA GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT

95 100 105

AAA CTG GAA GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCAGTT AAC GAC

10 110 Π5 120

CTG AAA GTT CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG

125 130 135

AAC GAC CTG TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT

140 145

CAG AAC CCA TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA

15 Formel in der kan fremstilles ved kendt teknik.

Man syntetiserede 16 forskellige oligonucleotider i to varianter. Den første fuldstændig variant koder for færdig Eq-IFN-γ med 146 aminosyrer plus startme-20 thionin (formel ill), den anden koder for et polypep-tid, der ved aminoterminus er forkortet med 3 aminosyrer plus startmethionin.

25 30 35 DK 170054 B1 10 -11 .5 10 15 ATG CAG GCT GCT TTC TTT AAA GAA ATC GAA AAC CTG AAA GAA TAC TTC 20 25 30 AAC GCT CGT AAC CCA GAC GTT GGT GAC GGT GGT CCG CTG TTC CTG '35 40 45 -GAC ATC CTG AAA AAC TGS AAA GAA GAC TCT GAC AAA AAG ATC ATC c ’ 50 55 60 CAG TCT CAG ATC GTT TCT TTC TAC TTC AAA CTG TTC GAA AAC CTG 65 70 75 AAA GAC AAC CAG GTT ATC CAG AAA TCG ATG GAG ACT ATC AAA GAA 80 ' 85 .90 GAT CTG TTC GTT AAA TTC TTC AAC TCG TCG ACT TCT AAA CTG GAA 95 100 105 GAC TTC CAG AAA CTG ATC CAG ATC CCA GTT AAC GAC .CTG AAA GTT Π0 115 120 ηn CAG CGT AAG GCT ATC TCT GAA CTG ATC AAA GTT ATG AAC GAC CTG 1U 125 130 135 TCT CCA AAA GCT AAC CTG CGT AAA CGT AAA CGT TCT CAG AAC CCA 140 143

TTC CGT GGT CGT CGT GCT CTT CAG TAA

15 Formel Illa

Man kan let modificere begge varianter, idet man i stedet for ATG, der koder for methionin, tilknytter en sekvens, der koder for et hydrofobt signalpeptid, f.eks. med formel IV

20 ATG AAT TAT ACA AGT TTT ATC TTG GCT TTT CAG CTG TGT GCG ATT TTG GGT TCT TCT ACC

Formel IV

En sådan signalsekvens forårsager i bestemte værtsorganimer, at det ønskede polypeptid bliver uds-25 kilt fra cytoplasmaet. Herved bearbejdes proteinet og signalpeptidet bliver fraspaltet: Man får det færdige protein. Celler af værtsorganismer, f.eks. E.coli, der ikke er i stand til bearbejde polypeptider, der indeholder signalpeptidsekvensen, må oplukkes til isolation 30 af det "ufærdige" polypeptid. Også disse "ufærdige" former for EqIFN-γ med fuldstændige eller med ufuldstændige signalpeptidsekvenser er omfattet af opfindelsen.

Man kan ved i sig selv kendt teknik, f.eks. med , 35 CNBr eller CNCl fraskille startmethioninen til opnåelse af færdig EqIFN-γ.

DK 170054 B1 11

Denne DNA-sekvens koder for EqIFN-γ, men indeholder dog udelukkende sådanne codoner, der anvendes i gener, der hører hjemme i E.coli, og her i høj grad ek-sprimeres (Gouy og Gautier, Nucl. Acids Res. 10, 7055 5 (1982)).

En opgave for opfindelsen var ydermere for første gang at tilvejebringe EqIFN-γ på homogen, ren form.

Som allerede nævnt er isolering og rensning af EqIFN-γ fra naturligt cellemateriale ikke en proces, 10 der forløber tilfredsstillende. Ifølge opfindelsen anvendte man derimod DNA-sekvenserne ifølge formlerne II, III og illa til løsning af opgaven. Disse sekvenser indbygges, når de er forsynet med passende kontrolsekvenser, i egnede vektorer, og man dyrker dermed transfor-15 merede egnede værtsorganismer eller værtscellekulturer.

De i dannede polypeptider isoleres og renses ved kendt teknik.

De tilvejebragte polypeptider svarer til de følgende formler 20 15 10 15

Tyr Tyr Cys Gin Ala Ala Phe Phe Lys Glu Ile Glu Asn Leu Lys 20 25 30

Glu Tyr Pne Asn Ala Arg Asn Pro Asp Val Gly Asp Gly 61y Pro 35 40 45

Leu Phe Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys 50 . 55 60 25 Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe 65 70 75

Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gl° Va1 Ile Gin Lys Ser Met Asp Thr 80 ·. 85 90

Ile Lys Glu Asp Leu Phe val Lys Phe Phe Asn Ser Ser Thr Ser 95 100 105

Lys Leu Glu Asp Phe Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro val Asn Asp 110 115 120

Leu Lys val Gin Arg Lys Ala Ile Ser 61u Leu Ile Lys Val Met 30 125 130 135

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser 140 145

Gin Asn Pro Phe Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin ***

Formel V 35 ,henholdsvis DK 170054 B1 12

Sin Ala Ale Phe Phe Lys G1u Ile 6*u Asn Leu Lys

Glu Tyr Pfie Asn Ala Arg Asn Pro Asp Val Gly Asp Gly Sly Pro *

Leu Pne Leu Asp Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Asp Ser Asp Lys

Lys Ile Ile Gin Ser Gin Ile Val Ser Pne Tyr Pne Lys Leu pne

Glu Asn Leu Lys Asp Asn Gin val Ile Gin Lys Ser Het Asp Thr i

Ile Lys Glu Asp Leu Phe val Lys Pne Pne Asn Ser Ser Tnr Ser

Lys Leu Glu Asp Pne Gin Lys Leu Ile Gin Ile Pro Yal Asn Asp 10 Leu Lys Val Gin Arg Lys Ala Ile Ser Glu Leu Ile Lys val Met

Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ala Asn Leu Arg Lys Arg Lys Arg Ser

Gin Asn Pro Pne Arg Gly Arg Arg Ala Leu Gin *** 15 Formel Va

Ved anvendelse af den kromosomale sekvens (formel II) tilvejebringer man efter transformation af pattedyrceller EqIFN-γ på den naturligt forekommende glykosylerede form (autentisk EqIFN-y).

20 Sekvenserne ifølge formlerne II, III, henholdsvis Illa er særlig egnede ved fremstilling af

EqIFN-y1 er i mikroorganismer, især ved fremstilling af EqIFN-γ i E.coli, hvorved polypeptidet blev exprimeret på ikke glykosyleret form.

25 En yderligere opgave for opfindelsen var at til vejebringe modifikationer af naturligt forekommende former for EqIFN-y.

Man kan foretage modifikationer af et protein f.eks. enten ved at fremstille derivater af proteinet 30 eller ved at fragmentere det ved fordøjelse med enzymer, eller man kan modificere den DNA-sekvens, der koder for proteinet ved udslettelse eller fragmentering, og bringe denne sekvens til expression i en egnet værtsorganisme.

35 Ifølge opfindelsen syntetiserer man kemisk DNA- sekvenser for modifikationer af EqIFN-y. For at forenk- DK 170054 B1 13 le manipulationen af genet, når man ønsker at ændre enkelte afsnit, indbygger man adskillige singulære gennemskæringssteder for restriktionsenzymer i den fuldstændige DNA-sekvens.

5 yderligere modificerede former af EqIFN-y til vej ebringer man ifølge opfindelsen, idet man indbygger de forskellige oligonucleotider alene eller i forskellige kombinationer forsynet med passende kontrolsekvenser i egnede vektorer, man dyrker dermed transformerede 10 værtsorganismer og isolerer og renser de dannede proteiner .

Til løsning af opgaven isolerede man højmolekylær DNA fra hestevæv, fortrinsvis fra leveren, ved en ændret fremgangsmåde ifølge Blin og Stafford (Blin, N.; 15 Stafford, P.W. Nucl. Acids Res. 3 (1976), 2302-2308), og man fragmenterede den på statistisk måde ved hjælp af specielle endonucleaser. De således tilvejebragte fragmenter af forskellig størrelse blev fraktioneret efter størrelse, fortrinsvis til dannelse af fragmenter 20 på 10-23 kb, til kloning i en vektor, f.eks. i en λ-vektor f.eks. λ EMBL3A. Derefter opformerede man disse vektorer efter transformation i en værtsorganisme, f.eks. E.coli. Dette equine DNA-bibliotek blev gennemsøgt ved hjælp af en human γ-interferon sonde under ik-25 ke stringente hybridiseringsbetingelser. Den lave stringens gjorde det muligt at finde DNA-sekvenser med visse forskelle fra sonden.

Disse kan enten fremstilles ved fordøjelse af plasmider kendt fra litteraturen ved hjælp af restrik-30 tionsenzymer eller ved kemisk syntese ved hjælp af oli-gonucleotidsyntesefremgangsmåder ved kendt teknik. Sonden opviser den sekvens, der koder for HuIFN-y. Man kunne identifisere fem λ-kloner med positive hybridise-ringssignaler.

35 Fra disse isolerede rekombinante phager oprense- de man DNA ved kendt teknik. DNA fra phagerne blev ef- DK 170054 B1 14 ter fordøjelse med forskellige restriktionsenzymer og påfølgende Southern-analyse (Southern, J.Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) karakteriseret ved hybridisering med

HuIFN-y sonden. Et singulært hybridiserende 4,6 kb lan-5 gt BamHI fragment fra klonen λ Eg-y2 blev isoleret og klonet i BamHI gennemskæringsstedet i plasmidet pUC9 (Vieira og Messing, Gene 19: 259-268, 1982).

Efter transformation af E.coli, f.eks. JM101, fremstillede man ved hjælp af en minipræparations-10 fremgangsmåde fra opnåede kolonier (Birnboim og Doly, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523, 1979) plasmid-DNA, og man karakteriserede det ved fordøjelse med restriktionsenzymer. Et plasmid med det ønskede BamHI indsætningsstykke blev benævnt pAHlll. Randene af BamHI 15 indsætningsstykkerne fra plasmidet pAHlll blev efter indsætning i M13mp8, henholdsvis M13mp9 vektorerne (Vieira og Messing, Gene 19, 259-268, 1982) sekvensopdelt ved didesoxy-fremgangsmåden (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977). En 20 sekvenssammenligning med det humane y-interferongen (Gray og Goeddel, Nature 298: 859-863, 1982) opviste høj homologi i de ikke kodende 5'- og 3'-regioner. Deraf sluttede man, at man havde isoleret det fuldstændige EqIFN-y-gen.

25 Det 4,6 kb lange BamHI indsætningsstykke fra plasmidet pAHlll blev fuldstændig sekvensopdelt ved didesoxy-fremgangsmåden. Hele sekvensen for

BamHI-fragmentet blev opnået ved kombination af delsekvenser fra Ml3-underkloner, der blev tilvejebragt 30 ved planlagt kloning af restriktionsfragmenter (EcoRl, Hindm, Pstl, Pstl-Bglll, Hindlll-BamHI) i tilsvarende gennemskårne Ml3mp8 eller M13mp9 vektorer. Yderligere delsekvenser blev tilvejebragt, idet man klonede det 2,0 kb lange BamHI-Bglll fragment, henholdsvis det 35 2,0 kb lange Pstl fragment ved "shotgun-"fremgangsmåden i M13mp8 vektoren.

DK 170054 B1 15

De tilvejebragte delsekvenser blev ved hjælp af et computerprogram samlet i den 4664 bp lange totalsekvens, der vises i fig. 1.

Ved computeranalyser af de åbne læserammer og 5 sammenligning med γ-interferongener fra andre specier (Gray og Goeddel, Nature 298: 859-863; Gray og Goeddel,

Proc. Natl.Acad.Sci.USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et al., EMBO J. d 4: 761-767, 1985; Cerretti et al., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986) fandt man det prote-10 inkodende område i heste γ-interferongenet. Den proteinkodende region er afbrudt af tre introner, idet der i første exon kodes for det 20 aminosyrer lange, hydrofobe signalpeptid og 18 aminosyrer af det færdige EqlFN-y polypeptid (baser 366479). Det andet exon koder for 15 aminosyrerne 19-41 (baser 1639-1707), det tredje exon koder for aminosyrerne 42-102 (baserne 1803-1985) og det fjerde exon koder for carboxyterminus med aminosyrerne 103-146 (baserne 3307-3441). På positionerne 4010 og 4020 befinder sig to signalsekvenser (AATAAA) for 20 polyadenylering af mRNA. På positionerne 86-88 af det færdige EqIFN-y polypeptid befinder sig det eneste potentielle N-glykosyleringssted (ASN-Ser-Ser), der falder sammen med det andet N-glykosyleringssted i y-in-terferon fra kvæg (Asn-Gly-Ser) (Fig. 2). Det færdige 25 EqIFN-y polypeptid indeholder overraskende kun en enkelt cysteinrest på position 3, hvorved i analogt med de naturlige humane og murine y-interferoner sandsynligvis de tre første aminoterminale aminosyrer (i dette tilfælde Tyr-Tyr-Cys) proteolytisk fraspaltes i lege-30 met.

Til eksprimering af rekombinant EqIFN-y på færdig form i Escherichia coli konstruerede man et syntetisk gen ud fra oligonucleotider. Det koder for den samme aminosyresekvens som det naturlige EqIFN-y gen, 35 men indeholder dog kun sådanne kodoner for de enkelte aminosyrer, der i E.coli anvendes af højeksprimerede DK 170054 B1 16 egne gener. (Gouy og Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055-7074, (1982)). Derudover indbyggede man adskillige singulære gennemskæringssteder for restriktionsenzymer for at gøre en simpel manipulering af genet ved 5 ændring af enkelte afsnit mulig. Man konstruerede det syntetiske gen for EqIFN-γ med to varianter ud fra i alt 16 forskellige oligonucleotider. Den første variant koder for færdig EqIFN-γ med 146 aminosyre plus startmethionin, den anden for et ved aminoterminus 10 med 3 aminosyrer (Tyr-Tyr-Cys) forkortet polypeptid plus startmethionin, der formodentlig forekommer som sådan i naturlige organismer.

Strukturen af det syntetiske EqIFN-y gen er vist i fig. 3. De til fremstillingen anvendte oligonucleoti-15 der blev syntetiseret ved hjælp af en Applied Biosystems Model 381A DNA Synthesizer og renset ved elek-troforese og udsaltning. De i fig. 3 benyttede oligo-nukleotider har følgende struktur: 5 17 DK 170054 Bl EG-1 5'-TACTACTGCC AGGCTGCTTT CTTTAAAGAA ATCSAAAACC TSAAAGAATA CTTCAACGCT CG-3* ES-2 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTGGCA GTAGTA-3' EG-3 5' -TAACCCAGAC GTTGGTGACS GTGGTCCGCT GTTCCTSGAC ATCCTSAAAA ACTGGAAAGA ASACTCTG-3' EG-4 5‘-TTCTTTCCAG TTTTTCA6SA TGTCCAGGAA CAGCS6ACCA CCSTCACCAA C6TCT6GSTT AC6AGCS-3'

EG-5 5‘-ACAAAAA6AT CATCCAGTCT CAGATCGTTT CTTTCTACTT CAAACTGTTC

15 6AAAACCTGA AAGACAACC-3* t

EG-6 5'-TTTCA&STTT TCGAACAGTT TGAAGTAGAA A6AAACGATC TGAGACTGGA

TGATCTTTTT GTCAGAGTC-3' EG-7 5'-AGGTTATCCA GAAATCGATG GACACTATCA AAGAAGATCT GTTCGTTAAA TTCTTCAACT CG-3'

f'6-6 5 '-TCGACGASTT GAAGAATTTA ACGAACA6AT CTTCTTTGAT AGTGTCCATC

20 GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTC-3' EG-9 5'-TCGACTTCTA AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATCCAGA TCCCAGTTAA CGACCTGAAA-3' f.G-10 5' -GCTGAAC7TT CAG6TCGTTA ACTGGGATCT GGATCAGTTT CTGGAAGTCT· TCCAGTTTAG AAG-3' EG-11 5'-GTTCAGCGTA AGGCTATCTC TGAACTGATG AAAGTTATGA ACSACCTGTC 25 TCCAAAAGCT AA-3* EG-12 51-CGCAGGTTAG CTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA TCAGTTCAGA GATAGCCTTA C-3* EG-13 5‘-CCTGCGTAAA CGTAAACGTT CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC TTCAGTAAG-31

EG-14 5’-6ATCCTTACT GAAGAGCACG ACGACCACGG AATGGGTTCT GA6AACGTTT

30 ACGTTTA-31 EG-IS 51-CAGGCTGCTT TCTTTAAAGA AATCGAAAAC CTGAAAGAAT ACTTCAACGC TCG-3* EG-16 5'-TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTG-3' 35 DK 170054 B1 18

Sammenbygningen af det syntetiske EqIFN-y gen foregik i to omgange. Den første del af genet blev fremstillet ved hjælp af otte oligonucleotider EG-1 til EG-8 indtil Sall gennemskæringsstedet, den anden halv-5 del af genet ved hjælp af de seks oligonucleotider EG-9 til EG-14, fra Sall gennemskæringsstedet til BamHI gennemskæringsstedet. Til formen af EgIFN-γ, der ved aminosyreterminus er forkortet med tre aminosyrer, benyttede man i stedet for oligonucleotiderne EG-1 og 10 EG-2 oligonukleotiderne EG-15 og EG-16.

Opfindelsen angår ikke kun DNA-sekvenser, der specifikt koder for interferoner ifølge opfindelsen, men også modifikationer, der let kan tilvejebringes ved mutation, sletning, transposition eller addition.

15 Enhver sekvens, der koder for interferoner ifølge opfindelsen (dvs. sådanne der viser det her beskrevne biologiske aktivitetsspektrum), og som er degenereret i sammenligning med de viste, er inkluderet.

Fagmanden er i stand til at foretage degenere-20 ringer i sekvenserne i de kodende regioner. Ligeså er enhver sekvens, der koder for et polypeptid med aktivitetsspektret af interferoner ifølge opfindelsen, og som under stringente betingelser (nemlig betingelser, der udvælger for mere end 85%, foretrukken for mere end 25 90% homologi), af de viste sekvenser (eller dele deraf) omfattede.

Man gennemfører hybridiseringerne i 6xSSC/5x Denhardt's opløsning/0,1% SDS ved 65°C. Graden af stringensen fastlægges ved vask. Således er for en 30 selektionering af DNA-sekvenser med ca. 85% eller højere homologi betingelserne 0,2xSSC/0,01% SDS/65°C egnede, og for selektionering af DNA-sekvenser med ca. 90% eller højere homologi betingelserne 0,1XSSC/0,01% SDS/65°C egnede.

35 Interferongener ifølge opfindelsen kan under be tingelser indføres i enhver organisme, der fører til DK 170054 B1 19 høje udbytter. Egnede værtsorganismer og vektorer kendes af fagmanden, vi kan her eksempelvis henvise til EP-A-0-093.619.

Til expression foretrækkes prokaryoter, f.eks.

5 E.coli K12, stamme 294 (ATCC nr. 31.446) eller E.coli X1776 (ATCC nr. 31.537). I lige så høj grad som de ovenfor nævnte stammer kan man også anvende E.coli W 3110 (F“, λ", prototof, ATCC nr. 27325), baciller som Bacillus subtilis og andre enterobacteriaceae, som 10 Salmonella typhimurium eller Serratia marcescens og forskellige pseudomonader.

Alment kan man anvende plasmidvektorer, der indeholder kontrolsekvenser stammende fra arter, der er forligelige med værtscellerne, sammen med disse vær-15 ter. Vektoren indeholder sædvanligvis foruden et repli-kationssted genkendelsessekvenser, der gør det muligt at udvælge de transformerede celler fænotypisk. Eksempelvis transformerer man sædvanligvis E.coli med pBR3222, et plasmid, der stammer fra E.coli (Bolivar, 20 et al., Gene 2, (1977)). pBR322 indeholder gener for ampicillin- og tetracyclin-resistens og tilbyder dermed en mulighed for at identificere transformerede celler. Derudover må pBR32-plasmidet eller andre anvendte plas-mider indeholde promotere eller må forsynes med pro-25 motere, der kan anvendes af den mikrobielle organisme, til eksprimering af dens egne proteiner. De promotere, der oftes anvendes ved fremstilling af rekombinante DNA, omfatter β-lactamase-(penicillinase) og lactose-promoter-systemer (Chang et al., Nature 275, 615 30 (1978); Itakura et al., Science 198, 1056 (1977); Goed-del et al., Nature 281, 544 (1979)) og tryptophan (trp) promotersystemer (Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8, 4057 (1980); EP-A-0-036.776). Foruden disse særlig anvendelige promotere har man også udviklet andre mikro-35 bielle promotere til anvendelse. DNA-sekvensen ifølge opfindelsen for γ-hesteinterferon kan f.eks. indsættes DK 170054 B1 20 under kontrol af leftward-promoteren fra bakteriophagen λ (PL). Denne promoter er en særlig effektiv styrbar promoter. Styringen gøres mulig ved hjælp af λ-repres-soren, i hvilken man kender nabostillede gennemskæ-5 ringssteder for restriktionsenzymer. En temperaturfølsom allel af dette repressorgen kan indføjes i en vektor, der indeholder en EqIFN-γ sekvens. Hvis man forhøjer temperaturen til 42°C, bliver repressoren in-aktiveret og promoteren aktiveret. Ved anvendelse af 10 disse systemer er det muligt at etablere en klonbank, hvori man kan anbringe en funktionel IFN-sekvens i nærheden af et ribosombindingssted og i forskellige afstande fra X-PL-promoteren. Man kan derefter gennemprøve disse kloner og udvælge sådanne med det højeste 15 udbytte.

Ekspressionen og translationen af en sekvens, der koder for proteiner ifølge opfindelsen, kan også stå under kontrol af andre reguleringssystemer, der kan regnes som "homologe" til organismen i sin ikke 20 transformerede form. Således indeholder f.eks. chromosomal DNA fra en lactoseafhængig E.coli et lactose eller lac-operon, der ved udrystning med enzymet β-ga-lactosidase gør nedbrydning af lactose mulig. Man kan også tilvejebringe lac-kontrolelementerne fra bakte-25 riophagen X-plac5, der er infektiøs for E.coli. Lac-operon fra phagen kan ved transduktion stamme fra de samme bakteriearter.

Reguleringssystemer, der kan anvendes ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen, kan også stamme fra 30 plasmidisk DNA, der hører til organismen. Lac-promoter-operatorsystemet kan induceres ved hjælp af IPTG.

Man kan lige så vel anvende andre promoter-operatorsystemer eller dele derfra, f.eks. arabinose-operator, colicin E^operator, galactose-operator, al-35 kalisk phosphatase-operator, trp-operator, xylose-A-operator, tac-promoter, etc..

DK 170054 B1 21

Foruden prokaryoter kan man også anvende euka-ryotiske mikroorganismer såsom gærkulturer. Saccharo-myces cerevisiae er den mest anvendte af de eukaryoti-ske mikroorganismer, skønt et antal andre arter er al-5 mindeligt tilgængelige. Til eksprimering i Sacchromyces anvender man f.eks. plasmidet YRp7 (Stinchcomb et al, Nature 282, 39 (1979); Kingsman et al., Gene 7, 141 (1979); Tschumper et al., Gene 10, 157 (1980)) og plasmidet YEpl3 (Bwach et al., Gene 8, 121-133 (1979)).

10 Plasmidet YRp7 indeholder TRPl-genet, der stiller en selektioneringsmarkør for en gærmutant til rådighed; denne gærmutant er ikke i stand til at vokse i try-phthophanfrit medium, f.eks. ATCC nr. 44076.

Tilstedeværelsen af TRP1 defekten til karakteri-15 sering af gærværtsgenomet tilvejebringer et virksomt hjælpemiddel til at påvise en transformation, idet man dyrker uden tryptophan. På ganske lignende måde forholder det sig med plasmidet YEpl3, der indeholder gærgenet LEU 2, der kan anvendes til supplering af en LEU-2-20 minusmutant. Egnede promotersekvenser for gærvektorer indeholder den 51-flankerende region fra genet for ADH I (Ammerer G., Methods of Enzymology 101, 192-201 (1983)), 3-phosphoglycerat-kinase (Hitzeman et al., J.

Biol. Chem. 255, 2073 (1980)) eller andre glykolytiske 25 enzymer (Kawaski og Fraenkel, BBRC 108, 1107-1112)) som enolase, glycerinaldehyd-3-phosphatdehydrogenase, hexokinase, pyruvatdecarboxylase, phosphofructokinase, glucose-6-phosphatisomerase, phosphoglucoseisomerase og glucokinase. Ved konstruktionen af egnede ekspres-30 sionsplasmider kan man også indsætte terminerings-sekvenser, der associerer med disse gener i ekspressionsvektoren i 3'-enden af den sekvens, der skal eks-primeres, til opnåelse af, at polyadenylering og terminering af mRNA bliver mulig.

35 Andre promotere, der derudover besidder for delen at besidde transkription kontrolleret af vækstbe- DK 170054 B1 22 tingeiserne, er promoterregionerne i genet for alkohol-dehydrogenase-2, isocytochrom C, sur phosphatase, nedbrydende enzymer, der er koblet med nitrogenmetabolismen, det ovenfor nævnte glycerinaldehyd-3-phosphatdehy- .

5 drogenase og enzymer, der er ansvarlige for videre forarbejdningen af maltose og galaktose. Promotere, der reguleres ved gær Mating type Locus, f.eks. promotere fra generne BARI, MFal, STE2, STE3, STE5, kan ved temperaturregulerede systemer anvendes, idet man anvender 10 temperaturafhængige sir-mutationer. (Rhine Ph.D. Thesis, University of Oregon, Eugene, Oregon (1979), Her-skowitz og Oshima, The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, Part I, 181-209 (1981), Cold Spring Harbor Laboratory). Disse mutationer har indflydelse på 15 ekspressionen af de hvilende mating-type kassetter i gær og derved indirekte på mating-type afhængige promotorer. Almindeligvis kan man dog som egnet plasmidvek-tor anvende enhver sådan, der indeholder en gærforligelig promoter og dertil svarende replikations-20 terminationssekvenser.

Man kan med fordel også eksprimere DNA-sekvenser ifølge opfindelsen i ekspressionsplasmidet pER103 (E. Rastl-Dworkin et al., Gene 21, 237-248 (1983) og EP-A- 0.115 613 - deponeret ved DSM under nr. DSM 2773 den 25 20. december 1983), i plasmidet parpER33 (EP-A-0.613) eller plasmidet pRHIOO, da disse vektorer indeholder alle reguleringselementer, der fører til en høj ekspression af det klonede gen. ved opfindelsen anvender man som ekspressionsvektor for det syntetiske EglFN-γ-30 gen plasmidet pRHIOO, der indeholder en regulerbar tryptophanpromoter fra Serratio marcescens og et kunstigt ribosombindingssted. Til fremstilling af ekspressionsplasmidet pRHIOO lineariserede man plasmidet pERl03 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 35 237-248, EP-A-0.115 613) med restriktionsendonukleasen Hindlll og fjernede 5'-terminale phosphatrester.

DK 170054 Bl 23

Dette plasmid-DNA blev blandet med de phosphory-lerede oligonucleotider d(AGCTTAAAGATGAGCT) og d(CATCTTTA) og ligeret. Man fordøjede ligasereaktionen med restriktionsendonucleasen SAcl og ligerede ved 5 tilsætning af T4-PNK. Oligonucleotiderne blev fremstillet analogt til metoden beskrevet i EP-A-0.115 613. Man lod forberedte E.coli HBlOl-celler inkubere med denne ligasereaktion. Blandt de dannede bakteriekolonier udvalgte man 12 vilkårligt og isolerede derfra i mi-10 kromålestok plasmidet (Birnboim og Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979) 1513-1523). Det opnåede DNA blev gennemskåret med restriktionsendonucleasen SacI, og man opdelte DNA på en agarosegel (1%, lx TBE-puffer). Vandringen af DNA som et lineært molekyle med en størrelse på ca.

15 4.400 bp bekræftede indførelsen af et Sacl-genkendel-sessted i plasmidet. Man udvalgte vilkårligt et af disse plasmider. Med DNA fra den tilhørende minipræparation transformerede man endnu en gang E.coli HB101, udvalgte blandt de resulterende transformerede bakte-20 rier en koloni og dyrkede den i større målestok. Det derfra isolerede plasmid blev gennemskåret med restrik-tionsendonucleaserne EcoRI og BamHI. Man opdelte DNA på en 1% agarosegel og isolerede det lille fragment fra gelen ved elektroeluering. Dette ca. 460 bp lange Eco-25 RIBamHI DNA-fragment blev sekvensopdelt ifølge Sanger.

(P. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. sci. (1977) 5463-5467). Det på denne måde analyserede plasmid blev betegnet pRHIOO.

Plasmidet blev fuldstændig gennemskåret med 30 SacI, og man opfyldte de overhængende DNA-ender ved behandling med Klenow-fragment (Amersham) under tilstedeværelse af alle fire desoxynucleotidtriphosphater. Reaktionen blev standset ved ekstraktion med phenol-chloroform, og man indkoncentrerede DNA ved ethanolud-35 fældning. Ved denne behandling opstår i tilslutning til tryptophanpromoteren en stump DNA-ende, der afsluttes DK 170054 B1 24 med translationsstartcodonet "ATG". Det lineariserede plasmid DNA eftergennemskæres med BamHI, og man isolerer vektordelen.

Den således forberedte pRHIOO plasmid-vektor 5 blandes med de ligerede oligonucleotider EG-1 til EG-8 og EG-9 til EG-14, og man inkuberer i ligationspuffer med T4 DNA-ligase. Forberedte E.coli celler, fortrinsvis JM101, transformeres med denne ligationsblanding, og man inkuberer natten over. Fra de tilvejebragte 10 transformanter isolerer man ved hjælp af en minipræparation plasmid-DNA og analyserer strukturen ved hjælp af restriktionsanalyse og sekvensopdeling af Hindlll-BamHI indsætningsstykket. Et plasmid med den ønskede struktur til ekspression af færdig EgIFN-y betegnes 15 pEqG-YYCl. På fuldstændig analog måde kloner man oligo-nucleotiderne EG-15,16, EG-3 til EG-8, og EG-9 til EG-14 i pRHIOO vektoren til opnåelse af EqIFN-γ forkortet med tre aminosyrer. Et plasmid med den ønskede struktur benævnes pEqG-QAAl.

20 Transformeringen af cellerne med vehiklerne kan opnås ved et stort antal fremgangsmåder. Fx kan man benytte calcium, hvorved man enten vasker cellerne i magnesium og tilsætter DNA til celler suspenderet i calcium eller udsætter cellerne for en fælles udfældning 25 af DNA og calciumphosphat. Ved den følgende genekspression overføres cellerne til medier, der udvælger transformerede celler.

Til påvisning af ekspression af interferonaktivitet af E.coli JM101, der indeholder plasmiderne pEqG-30 YYC1 eller pEqG-QAAl, opbryder man bakterierne efter inkubation i et egnet kulturmedium og afprøver overstanden efter sterilfiltrering for interferonaktivitet i et assay, der måler den cytopatiske effekt (CPE) af VSV eller EMCV. Til dette formål anvender man NBL-6 35 celler (ATCC CCL 57, epidermisceller fra hestehud), der var inficeret med Visicular-Stomatitis-virus (VSV) DK 170054 B1 25 og/eller A549 (ATCC CCL185, en human lungecarcinom-cellelinie), der var inficeret med encephalomyocardi-tisvirus (EMCV).

Påvisning af de eksprimerede hesteinterferoner 5 opnås ved mærkning af proteiner i maxiceller. Plasmid-kodede proteiner kan ved anvendelse af maxicelleteknik (Sancar, A. et al., J. Bacteriol, 137, 692-693 (1979)) selektivt mærkes in vivo. E.coli stammen CSR 603 (CGSC 5830) besidder ingen mekanisme til reparering af 10 skader på DNA forårsaget af UV-stråler. Ved bestråling med en egnet UV-dosis ødelægges det bakterielle kromosom, hvorved nogle af de væsentligt mindre og i flere kopier pr. celle tilstedeværende plasmid-DNA'er bliver funktionelle. Efter bortdøen af alle ikke beskadigede 15 celler, der formerer sig, pga. antibiotikum D-cyclose-rin og efter opbrug af endogen mRNA vil i de resterende celler kun gener ved plasmidet blive transkriberet og translateret. De dannede proteiner kan mærkes radioaktivt ved indbygning af 35S-methionin og påvises. E.coli 20 CSR603 transformeres ved sædvanlig teknik med ekspres-sionsplasmiderne, og der udvælges for transformerede bakterier på ampicillinholdig agarplader. Udpræparering af maxiceller og mærkningen af proteinerne følger A. Sancar's forskrift. Som standard for molekylvægt benyt-25 ter man en 14C-methyleret proteinblanding (Amersham).

Som kontrol benytter man plasmidet pER103, der kun indeholder promoteren uden interferongen og plasmidet pER21/l, der indeholder to kopier af human IFN-a2arg genet.

30 Til karakterisering af produkterne ifølge opfin delsen er kendte biologiske og immunologiske assays for interferoner egnede. Da både lFN-α, -β og -γ er specielle for antivirale egenskaber målt ved PFU og CPE-assays, benytter man for at skelne EqIFN-y'er fra 35 EqIFN-a og/eller -β den forskellige antigenitet af interferonerne.

DK 170054 B1 26

Polypeptiderne ifølge opfindelsen neutraliseres ikke af antisera mod EqlFN-α og/eller EglFN-β. Som yderligere kriterium på forskellene er syrefølsomheden af polypeptiderne ifølge opfindelsen, samt sensitivite-5 ten på natriumdodecylsulfat (SDS) egnede. Både inkube-ring med 0,2% SDS-opløsning og inkubering af polypeptiderne ved pH=2 i nogle timer med 4°C fører til et næsten fuldstændigt tab af den antivirale aktivitet. EqlFN-α og EqIFN-β er stabile under tilsvarende betin-10 gelser.

Til påvisning af det totale antal af sekvenser i hestegenomet, der udviser høj homologi med interferongenet, lader man højmolekylært heste-DNA fuldstændigt fordøje med relevante restriktionsenzymer og opdeler 15 dette gennemskårne DNA efter størrelse. Efter Southern-transfer på nitrocellulosefilter, denaturering og fixe-ring af DNA hybridiserer man hvert filter med en haktranslateret sonde. Som sonde for EqXFN-y benytter man et fragment af plasmidet pEQG-YYCl, der indeholder 20 den kodende sekvens for total færdig interferon. Derefter vasker man filteret under stringente betingelser. Autoradiografien foretages på DuPont Cronex røntgenfilm under anvendelse af Kodak Lane?^ Regular forstærkningsfolie i 7 dage ved -80°C.

25 Efter udført transformation af værtsorganismen, ekspression af genet og fermentation eller celledyrkning under betingelser, hvorunder proteiner ifølge opfindelsen bliver eksprimeret, kan man ekstrahere produktet ved kendt teknik f.eks. ved chromatografiske 30 adskillelsesmetoder til opnåelse af materiale, der indeholder proteinerne med eller uden leadersekvenser og tailingsekvenser. interferonerne ifølge opfindelsen kan eksprimeres med en leadersekvens ved N-terminus (PrælFN), der kan fjernes af visse værtsceller. Hvis 35 dette ikke finder sted, er en fraspaltning af det eventuelle leaderpolypeptid nødvendigt til opnåelse af DK 170054 B1 27 færdig IFN. Alternativt kan man modificere iFN-klonen på en måde, så det færdige protein direkte produceres i mikroorganismen i stedet for præ-IFN. I dette tilfælde kan man anvende precursor-sekvensen fra gær-mating-5 pheromonet MF-a-l til opnåelse af en korrekt færdiggørelse af det fusionerede protein og udskillelse af produktet i vækstmediet eller i periplasmaet. DNA-sekvensen for funktionel eller færdig IFN kan sammem-bindes med MF-a-l ved det formodede kathepsinlignende 10 gennemskæringssted, ( efter Lys-Arg) ved position 256 regnet fra initiationscodon ATG (Kurjan, Herskowitz,

Cell 30, 933-943 (1982)).

En fremgangsmåde, hvorved man f.eks. kan rense EqIFN-γ fra bakterier beskrives i det følgende almene 15 skema: 1. Ekstraktion af cellerne i en lyserende puffer (ca. pH 8) med høj ledningsevne ved passage gennem en homogenisator ved højt tryk; afkøling af det udlø- 20 bende produkt i et isbad.

2. Udfældning af DNA ved tilsætning af polyethylenimin under omrøring fx ved 4°C.

25 3. pH-udfældning af de bakterielle proteiner, hvorved EqIFN-γ forbliver i opløsning.

4. Fracentrifugering af de faste andele ved 4°C.

30 5. Koncentrering af overstanden (efter fornyet indstilling af pH-værdien) f.eks. ved ultrafiltrering.

DK 170054 B1 28 6. Dialyse af koncentratet mod en puffer med lav ledningsevne.

7. Fracentrifugering af de faste andele, hvorved 5 EqIFN-γ forbliver i opløsning.

8. Ionbytterchromatografi på carboxymethylcellulose, eluering med en gradient med tiltagende ionstyrke.

10 9. Chromatografi på calciumphosphat-gel og eluering med en gradient med tiltagende ionstyrke.

10. Ionbytterchromatografi på carboxymethylcellulose under svagt denaturerende betingelser og eluering 15 med en gradient med voksende ionstyrke.

11. Fraskillelse ved gelfiltreringschromatografi.

Ved denne fremgangsmåde kan man opnå udbytter med en 20 renhed på mere end 95%.

På basis af deres biologiske virkningsområde er de nye interferoner ifølge opfindelsen anvendelige til enhver art behandling, hvorved man også kan benytte kendte interferoner. Dette omfatter f.eks. herpes, rhi-25 novirus, hesteabort-virus, forskellige former for kræft og lignende. De nye interferoner kan benyttes alene eller kombineret med andre kendte interferoner eller biologisk aktive produkter, f.eks. med lFN-α, IL-2, andre immunmodulatorer og lignende.

30 Interferonerne ifølge opfindelsen kan indgives parenteralt i tilfælde, hvor der er brug for antitumorbehandling eller antiviralbehandling, og i tilfælde, hvor de immunundertrykkende egenskaber skal udnyttes. Dosis og doseringshastighed kan være som man 35 anvender nu ved kliniske undersøgelser med iFN-mate-riale f.eks. ca. (1-10) x 106 enheder daglig, og DK 170054 B1 29 ved præparater, der er mere end 1% rene, op til f.eks.

5 x 107 enheder daglig.

Eksempelvis kan man til en egnet doseringsform ved en i det væsentlige homogen, bakterielt fremstillet 5 IFN ifølge opfindelsen til parenteral anvendelse opløse 3 mg EqIFN-y i 25 ml 5% dyrisk serumalbumin, fortrinsvis fra heste eller hunde. Denne opløsning lader man derefter passere et bakteriologsk filter, og man fordeler den filtrerede opløsning aseptisk på 100 små 10 flasker, der hver indeholder 6 x 106 enheder rent IFN til parenteral indgivelse. Før anvendelse bør man fortrinsvis opbevare beholderene i kulden (-20°C). Substanserne ifølge opfindelsen kan formuleres ved kendt teknik til opnåelse af farmaceutiske anvendelige mid-15 ler, hvorved man blander polypeptidet ifølge opfindelsen med en farmaceutisk acceptabel bærer. Egnede bærere og deres formulering er f.eks. beskrevet af E.W. Martin i Remington's Pharmaceutical Sciences, hvortil vi udtrykkeligt henviser. Interferonerne ifølge opfin-20 delsen blandes med en afmålt mængde bærestof til opnåelse af egnede farmaceutiske midler, der er egnet til en effektiv anvendelse på modtageren (patienten). Man anvender foretrukken en parenteral indgivelse.

Sammenfattende angår opfindelsen for proteiner 25 med den biologiske aktivitet af γ-hesteinterferon kodende DNA-sekvenser, der er ejendommelige ved det i krav l's kendetegnende del angivne, hvilket vil sige at de indeholder et udvalgt af nucleotidsekvenserne vist med ovenstående formler II, III og Illa, med/uden 30 startmethionin og sådanne med en tilknyttet signalsekvens (formel IV, se ovenfor) samt af nucleotidsekven-ser, der under betingelser selekterende for mere end 85% homologi hydridiserer med den komplementære streng for en af disse sekvenser.

DK 170054 B1 30

Endvidere angår opfindelsen polypeptider, der er ejendommelige ved, at de kodes for af ovennævnte DNA-sekvenser og har den biologiske aktivitet af y-hesteinterferon.

5 Yderligere angår opfindelsen værtsorganismer, der er ejendommelige ved at være transformeret med en sådan DNA-sekvens.

Yderligere angår opfindelsen en DNA-sekvens, der er ej endommelig ved det i krav 6' s kendetegnende del 10 angivne, idet herved DNA-sekvensen indeholder et udvalg af de ovenfor nævnte oligonucleotider EG-1 til EG-16.

Det omhandlede polypeptid kan ifølge opfindelsen og under anvendelse af den omhandlede værtsorganisme fremstilles ved en fremgangsmåde, der er ejendommelig 15 ved det i krav 8's kendetegnende del angivne; og endelig kan det benyttes i farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen, idet et sådant er ejendommelig ved det i krav 9's kendetegnende del angivne.

20 På tegningen angiver:

Figur 1: DNA-sekvensen for det 4664 pb lange BamHl-fragment fra lambda Eq-y2. Den kodende amino-syresekvens og positionen af intronerne er angivet. Negativt nummerede aminosyrer angiver 25 det hydrofobe signalpeptid. Det eneste poten-

ielle N-glykosyleringssted i færdig EqIFN-y ved position 86-88 er understreget. De for bindingen af RNA-polymerase vigtige sekvenser CCATCC og TATAAAA er understreget, ligesom 30 to signalsekvenser for polyadenylering af mRNA

(AATAAA).

Figur 2: Sammenligning af aminosyresekvenser for y-interferoner fra forskellige arter. De med et foranstående S nummerede aminosyrer angiver 35 signalpeptidet. "Consensus"-sekvenser viser med store bogstaver alle aminosyrer, der er DK 170054 B1 31 identiske i alle γ-interferoner, med små bogstaver de aminosyrer, der forekommer i mere end 75% af y-interferonerne.

Figur 3: Skematisk oversigt over de oligonukleotider, 5 der anvendes ved totalsyntesen af heste-y- interferongenet. Længden af de enkelte oligonukleotider og deres nummerering er angivet. Restriktionsgennemskæringssteder, der kun forekommer en enkelt gang i det syntetiske 10 gen, er nummereret.

Figur 4: Sammenligning mellem de kodede sekvenser for færdigt EqlFN-y i det naturlige gen (eg) og det syntetiske (syn), der er optimeret for ekspression i E.coli. Baser, der er forskelli-15 ge, er mærket med en stjerne.

Figur 5: Tabel over de anvendte codoner i færdigt EqIFN-y. Til venstre står den første base, i midten den anden base og i højre kant den tredje base i codonet. Tabellen viser antal-20 let af anvendte codoner for de enkelte amino syrer i det naturlige gen, såvel som, i parentes, for det syntetiske gen.

Figur 6: Konstruktion af ekspressionsplasmidet pRHIOO.

Figur 7: Konstruktion og restriktionskort for pGN20.

25

De følgende eksempler beskriver opfindelsen detaljeret.

MATERIALER.

30 Udgangsmaterialerne var dels tilgængelige i handlen, dels stammede de fra EMBL i Heidelberg. E.coli JM101, pUC9 og M13mp8 stammede fra Bethesda Research Laboratories, E.coli stammen med suppressorfaktoren sup F, f.eks. E.coli NM526, 538 og 539 og vektoren X-EMBL3 35 eller 3a, stammede fra EMBL og kan også tilvejebringes fra firmaet Stehelin/Basel (Schweiz).

DK 170054 B1 32 1. Isolering af heste-DNA.

Man knuste frosset væv, f.eks. hestelever, i flydende nitrogen til et fint pulver og inkuberede i 0,5M EDTA, 10 mM Tris HC1 pH 8,0, 0,5% SDS, 0,1 mg/ml 5 proteinase K (20 ml/g væv) 3 timer ved 55°C. Den tilvejebragte viskose opløsning blev ved en phenolekstrak-tion og en 3 gange foretaget ekstraktion med phenol/chloroform/isoamylalkohol (25/24/1 vol) befriet for protein, dialyseret mod 50mM Tris-HCl pH 8,0, lOmM 10 EDTA, lOmM NaCl, og DNA blev udfældet med 2 rumfang ethanol. Efter fuldstændig tørring under vakuum overførte man DNA til TE-puffer (10 mM Tris-HCl pH 8,0, lmM EDTA) ved 4°C som opløsning, og man centrifugerede med 1,273 g CsCl/ml opløsning 62 timer ved 20eC og 40.000 o/m 15 (Sorvall 50Ti-rotor). Man opdelte CsCl-gradienten, dialyserede de fraktioner, der indeholdt DNA mod TE-puffer og udfældede derefter DNA med 2 rumfang ethanol, vaskede med 70% ethanol, tørrede og opløste i TE-puffer (4°C).

20 Det færdige DNA-præparat indeholdt ikke RNA og var længere end 50 kb (bestemt ved elektroforese på en 0,45% agarosegel).

2. Delvis fordøjelse med endonuklease og fraktionering 25 efter størrelse af heste-DNA.

Man inkuberede to gange 50 pg heste-DNA med 1,6 enheder Sau3A i 450 pi reaktionsmedium (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2 lmM dithiothreitol) ved 37°C. Efter 15, 25 og 40 min. udtog man portioner på 150 pi og 30 tilsatte 15mM EDTA. Man standsede reaktionen ved 10 min. opvarmning til 70°C, efter tilsætning af 0,3M Na-acetat pH 6,0 fældede man DNA med 2,5 rumfang ethanol. Efter ny opløsning i TE-puffer opdelte man DNA på en 0,45% agarosegel i TBE-puffer ( 10,8 g/1 Tris, 35 5,5 g/1 borsyre, 0,93 g/1 Na2EDTA) med ca. 1 V/cm natten over elektroforetisk efter størrelse. Ved hjælp DK 170054 B1 33 af størrelsesmarkører (dobbeifordøj et med EcoRl og Hin-dlll og enkeltfordøj et med Hind III lambda-DNA) udskar man gelstykket med DNA på en længde på l0-23kb, elek-troeluerede DNA fra gelen i en dialyseslange i 3 timer 5 ved 300V (puffer 0,1 x TBE), rensede på en Elutip-D-søjle (Schleicher og Schull) efter fabrikantens forskrift og fældede til slut med ethanol.

Til forhindring af celleligering af heste-DNA-fragmenter, hvad der på den ene side kan føre til 10 kunstige hybrider af heste-DNA-sekvenser, på den anden side til for store DNA-stykker, der derfor ikke mere kan indgå i λ-phager, dephosphorylerede man de efter størrelse fraktionerede heste-DNA-stykker.

Dertil inkuberede man DNA i 140 yl reaktions-15 medium (50 mM Tris-HCl pH 9,5, 10 mM MgCl2, 0,1 mM

Zn-acetat, 1 mM spermidin) med 5 enheder bovin intestinal phosphatase ved 37°C i 30 min.. Man tilsatte yderligere 5 enheder enzym og inkuberede i 30 min.. Efter tilsætning af EDTA til en slutkoncentration på 25 mM, 20 ekstraherede man DNA en gang med phenol/chloroform/-isoamylalkohol (25/24/1 vol), 2 gange med chloroform/-isoamylalkohol (24/1 vol) og 3 gange med diethylether, man fældede med ethanol, tørrede og opløste i 0,1 x TE-puffer.

25 3. Opbygning af hestegenom-DNA-bibliotek.

Man klonede de dephosphorylerede l0-23kb heste-DNA-fragmenter i en λ-vektor, f.eks. X-EMBL3 eller -3A (Prischauf, A.M. et al. J. Mol. Biol., 170, 827-842 30 (1983)) med G-A-T-C kohæsive ender, tilvejebragt ved fjernelse af de interne BamHI-fragmenter fra phag-DNA.

Man dyrkede vektoren i en E.coli-stamme med sup-pressorfaktor sup F, f.eks. E.coli NM526, 538 eller 539 (Frischauf, A.M. et al. J. Mol. Biol., 170, 827-842 35 (1983)), i LB-urt (Miller; Experiments in Molecular Genetics; Cold Spring Harbor Lab. Cold Spring Harbor, New DK 170054 B1 34

York) med 5 mM MgS04, man fældede med polyethylenglycol og rensede ved gentagen CsCl-densitetsgradientcentri-fugering (0,71 g CsCl/ml opløsning, 40 timer 45.000 o/m, 20°C). Efter dialyse mod TE-puffer blev phag-DNA 5 befriet for protein ved 2 gange fældning med phenol/-chloroform/isoamylalkohol (25/24/1 vol), og 2 gange ekstraktion med chloroform/isoamylalkohol (24/1 vol) og koncentreret ved fældning med ethanol.

Til udvinding af endefragmenterne fra EMBL3A 10 fordøjede man 50 yg phag-DNA 2 timer ved 37°C i 450 μΐ reaktionsmedium (10 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol) fuldstændigt med BamHI, man standsede reaktionen med 15mM EDTA 10 min. ved 70°C og fældede DNA med ethanol.

15 Til forhindring af religering blev det midterste fragment efterskåret med EcoRI, og man fjernede det bortfaldende oligonucleotid ved fældning med isopro-panol.

Til dette formål fordøjede man det BamHI-for-20 døjede λ-DNA 2 timer ved 37°C i 450 μΐ 10 mM Tris-HCl pH 7,5 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 fuldstændigt med EcoRI og standsede reaktionen ved tilsætning af 15 mM EDTA og 10 min. opvarmning til 70°C. Efter tilsætning af Na-acetat til en slutkoncentration på 0,3M fældede man 25 de tre store DNA-fragmenter med 0,6 rumfang isopropanol 15 min. ved 0°C, man vaskede to gange med 0,45M Na-acetat/0,6 rumfang isopropanol og 1 gange med 0,3M Na-acetat/2,5 rumfang ethanol og opløste i 15 μΐ 0,1 x TE-puffer. Ved denne fremgangsmåde forbliver BamHI/EcoRI-30 linkeren i opløsningen. Fragmenterne fra EMBL3A (8 yg) forenedes med ca. 5 yg 10-23kb heste-DNA og 10 enheder til T4-dNA-ligase (NEN), og man inkuberede natten over ved 14°C og en dag ved 4°C i 50 yl ligationsmedium (66mM tris-HCl pH 7,2, 0,1M NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM 35 EDTA, 5 mM dithiothreitol, 0,5 mM ATP). Den ligerede DNA-blanding blev ved hjælp af et in vitro-Xpakkesystem DK 170054 Bl 35 (Scalenghe, F. et al; Chromosoma, 82, 205-216 (1981)) indpakket i en færdig λ-phagpartikel.

Komponenterne i dette system, dvs. ultralydekstrakt (SE), fryse-optøningslysat (FTL), puffer Ml og 5 A, blev fremstillet ifølge (Scalenghe, F. et al; Chromosoma, 82, 205-216 (1981)). 10 μΐ portioner af den li-gerede DNA-blanding blev inkuberet i 2 min. ved stuetemperatur med 25 μΐ SE, der ligesom FTL havde opholdt sig 30 min. på is, man tilsatte 100 μΐ FTL og inkube-10 rede videre 60 min. ved stuetemperatur. Pakningsblandingen blev fortyndet med 150 μΐ λ-fortynder (100 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgS04 1 mM EDTA) og oplagret ved 4°C.

15 4. Kloning og sekvensopdeling af genet for heste-vinter feron (EqIFN-y).

A. Isolering af en fuldstændig EqIFN-γ genklon.

Man anvendte heste-DNA-biblioteket til infektion 20 af E.coli stammen NM528 (supF). En natten over i LB-næringsopløsning (10 g/1 trypton, 5 g/1 gærekstrakt,

10 g/1 NaCl, pH 7,4) med 0,2% maltose dyrket bakteriekultur blev indstillet i 10 mM MgS04 på en optisk tæthed (600 nm) på 2,0. Portioner på 0,5 ml af denne su-25 spension blev inficeret med 50.000 pfu (plakdannende enheder) λ-phager fra DNA-biblioteket og fordelt med et lag af blød LB-agar på LB-agarplader med 10 mM MgS04 (13,5 cm i diameter). I alt gennemsøgte man 1,5 x 106 rekombinante λ-phager. Efter dyrkning natten over ved 30 37°C fremstillede man fra phagerne på hver platte 2 x replika på nitrocellulose (Benton og Davis, Science 196:180-182, 1977). Efter denaturering af phag-DNA

(1 min. i 0,5 N NaOH, 1,5 M NaCl), neutralisering (2 x 3 min. i 0,5 M Tris-HCl pH 7,5 1,5 mNaCl) og skylning 35 (1 min. i 2 x SSC, 1 x SSC, 0,15 M NaCl, 15 mM Na-citrat) tørrede man filtrene i luften og fikserede DNA

DK 170054 B1 36 ved 2 timers bagning ved 80°C. Man vaskede filtrene natten over ved 65°C i en opløsning af 1,5 M NaCl, 10 mM Tris-Hcl pH 8,0, 0,1% SDS og forhybridiserede

4-6 timer ved 65°C (hybridiseringsopløsning: 0,9 M

5 NaCl, 50 mM NaH2P04, pH 7,4, 5 mM EDTA, 0,1% Ficoll, 0,1% polyvinylpyrrolidon, 0,1% serumalbumin fra kvæg, 0,1% SDS, 20 mg/ml lydbehandlet og denatureret laksesperma DNA).

Hybridiseringen blev foretaget i en frisk op-10 løsning med 10^ cpm pr. filter af en ved sædvanlig fremgangsmåde fremstillet radioaktivt mærket HuIFN-y-"sonde" 20 timer ved 65°C. Man vaskede filtrene under ikke stringente betingelser i 3 x SSC, 0,1% SDS ved 65°C, tørrede og autoradiograferede. Efter 3 gange 15 plak-rensning kunde man identificere 5 λ-kloner, der gav positive hybridiseringssignaler.

Fra disse isolerede rekombinante phager oprense-de man DNA ifølge kendt teknik (Maniatis et al., ibid.). Man karakteriserede phag-DNA efter fordøjelse 20 med forskellige restriktionsenzymer og påfølgende Southern-analyse (Southern, J.Mol. Biol. 98: 503-517, 1975) med hybridisering med HuIFN-γ-"sonden". Et singulært hybridiserende 4,6 kb langt BamHI fragment fra klonen X-Eq-y2 blev isoleret og klonet i BamHI gennem-25 skæringsstedet af plasmidet pUC9 (Vieira og Messing,

Gene 19: 259-268, 1982). Efter transformation af E.coli JM101 fremstillede man fra de tilvejebragte kolonier ved en minipræparationsfremgangsmåde (Birnboim og Doly, Nucl. Acids Res. 7: 1513-1523, 1979) plasmid-DNA og 30 karakteriserede det ved fordøjelse med restriktionsenzymer. Et plasmid med det ønskede BamHI indsætningsstykke blev kaldt pAHlll. Kanterne af BamHI indsætningsstykket i plasmidet pAHlll blev efter anbringelse i M13mp8, henholdsvis M13mp9, vektoren (Vieira og Mes-35 sing, Gene 19, 259-268, 1982) sekvensopdelt ved di- desoxy-fremgangsmåden (Sanger et al., Proc. Natl.

DK 170054 B1 37

Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977). En sekvenssammenligning med det humane y-interferongen (Gray og Goed-del, Nature 298, 859-863, 1982) viste en høj homologi med de ikke kodende 5'- og 3'-regioner. Deraf sluttede 5 man, at man havde isoleret det fuldstændige EqlFN-y-gen.

B. Sekvensopdelinq af heste-y-interferongenet fra klon X-Eq-2.

10 Man sekvensopdelte det 4,6 kb lange BamHI ind sætningsstykke fra plasmid pAHlll fuldstændigt ved di-desoxy-fremgangsmåden. Totalsekvensen for BamHI fragmentet blev opnået ved kombination af delsekvenser fra Ml3 underkloner, som blev tilvejebragt ved planlagt 15 kloning af restriktionsfragmenter (EcoRI, Hindm,

PstI, Pstl-Bglll, Hindlll-BamHl) i tilsvarende gennem-skårne M13mp8 eller M13mp9 vektorer. Man tilvejebragte yderligere delsekvenser, idet man klonede det

2,0 kb lange PstI fragment ved "shotgun"-fremgangs-20 måden i vektoren M13mp8. Begge DNA fragmenter blev ved ultralydsbehandling opdelt i mindre stykker, DNA-enderne blev udfyldt ved inkubering med E.coli DNA-polymerase I (Klenow-fragment) under tilstedeværelse af 0,1 mM af hver af alle fire desoxynucleotidtriphospha-25 ter (reaktionspuffer: 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM

MgClj, 1 mM dithiothreitol, 0,5 mg/ml serumalbumin fra kvæg: 1 time ved 25°C). Efter fraktionering efter størrelse på en agarosegel isolerede man DNA-fragmenter med en længde på ca. 0,4-1,0 kb og ligerede i Smal gennem-30 skæringsstedet på vektoren Ml3mp8. De tilvejebragte delsekvenser blev forenede ved hjælp af et computerprogram til den 4664 bp lange totalsekvens, der er vist i fig. 1.

Ved en analyse ved hjælp af computer af den åbne 35 læseramme og sammenligning med y-interferongener fra andre organismer (Gray og Goeddel, Nature 298: 859-863; DK 170054 B1 38

Gray og Goeddel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5842-5846, 1983; Dijkema et al., EMBO J. 4: 761-767, 1985; Cerretti et al., J. Immunology 136: 4561-4564, 1986) tilvejebragte man det proteinkodende område af 5 det equine γ-interferongen. Den proteinkodende region er afbrudt af tre introner, hvorved der i første exon kodes for det 20 aminosyrer lange, hydrofobe signalpeptid og 18 aminosyrer af det færdige EqIFN-γ po-lypeptid (basen 366-479). Det andet exon koder for ami-10 nosyrerne 19-41 (baser 1639-1707), det tredje exon koder for aminosyrerne 42-102 (base 1803-1985), det fjerde exon koder for carboxy-terminus med aminosyrer 103-146 (baser 3307-3441). På positionerne 4010 og 4020 findes to signalsekvenser (AATAAA) for polyadenylering 15 af mRNA. På positionerne 86-88 af det færdige EqIFN-γ polypeptid finder det eneste mulige N-glykosylerings-sted ASN-Ser-Ser), der falder sammen med det andet N-glykosyleringssted i bovin γ-interferon (Asn-GlySer) (fig. 2). Det færdige EqIFN-γ polypeptid indeholder 20 overraskende kun en eneste cysteinrest ved position 3, hvorfor sandsynligvis, i analogi med de naturlige humane og murine y-interferoner, de første tre amino-terminale aminosyrer (i disse tilfælde Tyr-Tyr-Cys) er blevet proteolytisk fraspaltet i organismen.

25 5. Fremstilling af et syntetisk gen for færdigt EgIFN-y.

Til eksprimering af rekombinant EqIFN-γ på færdig form i Escherichia coli konstruerede man et synte-30 tisk gen ud fra oligonucleotider. Det koder for den samme aminosyresekvens som det naturlige EqIFN-γ gen, men indeholder dog udelukkende sådanne codoner for de enkelte aminosyrer, der anvendes af de i E.coli høj grad eksprimerede gener, der hører til cellen (Gouy og 35 Gautier, Nucl. Acids Res. 10: 7055-7074, 1982). Derudover indbyggede man adskillige singulære restriktions- DK 170054 B1 39 enzymgennemskæringssteder til mulighed for en simpel manipulering af genet, når man ønskede at ændre enkelte afsnit. Det syntetiske gen for EqIFN-y blev konstrueret med to varianter ud fra i alt 16 forskellige oligo-5 nucleotider. Den første variant koder for færdig EqlFN-γ med 146 aminosyrer plus start-methionin, den anden form for et polypeptid, der ved aminoterminus er forkortet med 3 aminosyrer (Tyr-Tyr-Cys) plus start-methionin, som det formodentligt vil optræde i den 10 naturlige organisme.

Strukturen af det syntetiske EqIFN-γ gen er vist i fig. 3. De oligonucleotider, der blev anvendt ved fremstillingen, blev syntetiseret ved hjælp af en Applied Biosystems Model 381A DNA-Synthesizer, de blev 15 renset ved elektroforese i denaturerende 12% polyacry-lamidgeler (7 M urinstof) og ved hjælp af udelukkelses-chromatografi udsaltet på Sephade>^ G-25 (Pharmacia).

Sammenbygning af oliqonucleotiderne til det synte-20 tiske EgIFN-y gen.

Sammenbygningen af det syntetiske EqIFN-γ gen blev foretaget i to afsnit. Den første del af genet blev fremstillet ved hjælp af de otte oligonucleotider EG-l til EG-8 op til Sall gennemskærings stedet, 25 den anden halvdel af genet ud fra de seks oligonucleotider EG-9 til EG-14 fra Sall gennemskæringsstedet til BamHI gennemskæringsstedet. Til den ved aminoterminus med tre aminosyrer forkortede form af EqIFN-γ benyttede man i stedet for oligonucleotiderne EG-l og EG-2 oligo-30 nucleotiderne EG-15 og EG-16.

De gensidigt komplementære oligonucleotider blev hver gange parvis phosphorylerede ved 5'-enden. Man inkuberede hver gang 100 pMol af begge oligonucleotider (f.eks. EG-3 og EG-4, henholdsvis EG-5 og EG-6 osv.)

35 i 9 μΐ kinasepuffer (70 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM

MgCl2> 5 dithiothreitol), 2 yCi [y“32P]ATP

DK 170054 B1 40 (Amersham) med 10 enheder T4-polynucleotidkinase (New England Biolabs) 10 min. ved 37°C, man tilførte 1 μΐ af en 10 mM ATP-opløsning og inkuberede videre i 50 min. ved 37“C, hvorefter man standsede reaktionen ved 10 5 min. opvarmning til 95°C. Til forhindring af en senere sammenknytning af DNA-enderne phosphorylerede man ikke oligonucleotiderne EG-1, EG-15, EG-9 og EG-14. De blev først efter inaktivering af polynucleotidkinasen blandet med det hver gang komplementære oligonucleotid, op-10 varmet 5 min. til 95°C og afkølet til stuetemperatur.

Blandingen af oligonucleotiderne EG-1+2 (henholdsvis i en anden serie EG-15+16), EG-3+4, EG-5+6 og EG-7+8 blev samlede, man tilsatte 1 μΐ 5 M NaCl, opvarmede 5 min. til 70°C og afkølede til stuetemperatur.

15 Til denne opløsning satte man 5 μΐ 10 mM ATP, 2 μΐ dit-hiothreitol, 1,5 μΐ 10 x ligationspuffer (0,66 M Tris-HCl pH 7,2, 1 M NaCl, 100 mM MgCl2, 10 mM EDTA, 50 mM dithiothreitol) og 80 enheder T4 DNA-ligase (New England Biolabs) og man inkuberede 48 timer ved 4°C. For-20 løbet af ligasereaktionen blev fulgt ved genelektro-foretisk opdeling af DNA-fragmenterne af en lille prøve af reaktionen på en 5% ikke denaturerede polyacrylamid-gel og påfølgende autoradiografi. På lignende måde knyttede man de seks oligonucleotider EG-9 til EG-14 25 til hinanden. Man standsede reaktionen ved ekstraktion med phenol/chloroform og udvandt igen DNA-ved udfældning med ethanol.

6. Konstruktion af ekspressionsplasmidet pRH 100.

30 Man gennemførte alle reaktioner med enzymer un der anvendelse af fabrikantens reaktionsbetingelser.

Man lineariserede 7 μg plasmid pER103 (Eva Dworkin-Rastl et al., Gene 21 (1983) 237-248, EP-A-0.115-613) i 50 μΐ reaktionsmedium med restrik-35 tionsendonukleasen Hindlll. Efter en times inkubering ved 37°C tilsatte man 50 μΐ 2 x CIP-puffer (2 x CIP- DK 170054 B1 41 puffer - 20 mM Tris, pH = 9,2, 0,2 mM EDTA). Ved tilsætning af 2 enheder alkalisk phosphatase fra kalvetarme (CIP) kunne man fjerne de 5'-terminale phosphat-rester; man inkuberede i 30 min. ved 45°C, hvorefter 5 man standsede reaktionen ved tilsætning af 4 μΐ 0,5 mM EDTA-opløsning og 10 μΐ 1M Tris, pH = 8,0. Man fjernede proteinerne ved en dobbel phenolekstraktion og en enkelt phenol/chloroformekstraktion. DNA blev udfældet fra vandfasen ved tilsætning af 0,1 rumfang 3M natrium-10 acetatopløsning, pH 5,5 og 250 μΐ ethanol, og man vaskede DNA bundfaldet efter centrifugering en gang med 70% ethanolopløsning. Man tørrede DNA og opløste bundfaldet i 20 μΐ TE-puffer (10 mM Tris pH = 8,0, 1 mM EDTA) .

15 1 yg af hvert af de syntetisk fremstillede oli-

gonucleotider d(AGCTTAAAGATGAGCT) og d(CATCTTTA) blev phosphorylerede hver i 10 yl reaktionsopløsning under tilsætning af 10 enheder T4-PNK (polynucleotidkinase) samt 1 mM rATP. Reaktionen foregik ved 37°C og varede 20 45 min., hvorefter man afbrød den ved 10 min. opvarmning til 70°C. Man blandede i hvert tilfælde 5 μΐ af plasmidopløsningen og de phosphoryliserede oligonu-cleotider og opvarmede 5 min. til 70°C. Derefter afkølede man opløsningen til 0°C, og man tilsatte 2 μΐ 25 10 x ligasepuffer (500 mM Tris, pH = 7,5), 100 mM

MgCl2, 200 mM DTT (dithiothreitol), 1 mM rATP, 500 yg/ml BSA (serumalbumin fra kvæg), samt 2 μΐ vand og 10 enheder T4-DNA ligase. Reaktionen varede 40 timer ved 4°C, man afbrød den ved 10 min. opvarmning til 70°C.

30 2 μΐ af denne ligasereaktion blev fordøjet i ialt 30 μΐ opløsning med 10 enheder af restriktionsen-donukleasen SacI (New England Biolabs) i 3 timer ved 37°C. Reaktionen blev afbrudt ved opvarmning i 10 min. til 70°C. 5 μΐ af denne reaktionsblanding blev i ialt 35 30 yl ligeret ved tilsætning af 10 enheder T4-PNK ved 14°C i 16 timer.

DK 170054 B1 42

Man blandede 200 μΐ forberedte E.coli HB101 med 10 yl af denne ligasereaktionsblanding. Bakterierne blev holdt 45 min. på is, hvorefter de blev opvarmet 2 min. til 42°C til muliggørelse af optagelse af DNA.

5 Derefter inkuberede man igen bakteriesuspensionen ved 0°C i 10 min.. Til sidst udstrøg man de transformerede bakterier på en LB-agar, der indeholdt 50 yg/ml ampi-cillin.

Blandt de dannede bakteriekolonier udsøgte man 10 vilkårligt 12 og isolerede derfra i mikromålestok plas-miderne (Birnboim og Doly, Nucl. Acids Res. 7 (1979)

1513-1523). Det opnåede DNA blev gennemskåret med re-striktionsendonucleasen SacI, og man opdelte DNA på en agarosegel (1%, 1 x TBE-puffer). Vandringen af DNA

15 som et lineært molekyle med en størrelse på ca. 4.400 pb bekræftede, at man havde fjernet et Sacl-gen-kendelsessted fra plasmidet. Et af disse plasmider blev vilkårligt udvalgt. Med DNA fra den tilhørende minipræparation transformerede man endnu en gang E.coli HB101.

20 Af de dannede transformerede bakterier udvalgte man en koloni, som man dyrkede i større målestok. Det derfra isolerede plasmid blev gennemskåret med restriktionsen-donucleaserne EcoRl og BamHI, man opdelte DNA på en 1% agarosegel og isolerede det mindre fragment fra gelen 25 ved elektroeluering. Dette omtrent 460 bp lange EcoRI-BamHI DNA-fragment blev sekvensopdelt ifølge Sanger (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (1977) 5463-5467). Det på denne måde analyserede plasmid blev tegnet pRHlOO.

30 7. Indførelse af det syntetiske EqlFN-y gen i ekspres-sionsplasmidet pRHlOO.

Man gennemskår 10 yg plasmid pRHlOO i 100 yl reaktionspuffer fuldstændigt med SacI og inaktiverede en-35 zymet ved 10 min. ophedning til 70°C. De over ragende DNA-ender blev opfyldt ved behandling med Klenow-frag- DK 170054 B1 43 ment (Amersham) under tilstedeværelse af 10 ym af hver af alle fire desoxynucleotidtriphosphater (30 min., 25°C). Man standsede reaktionen ved ekstraktion med phenol/chloroform og koncentrerede DNA ved ethanol-5 udfældning. Ved denne behandling opstår i tilslutning til tryptophanpromotoren en stump DNA-ende, der slutter med translationsstartcodonet "ATG". Det lineariserede plasmid-DNA efterskæres med BamHI, og man isolerer vektordelen efter elektroforetisk opdeling på en agarose-10 gel.

50 ng af den som beskrevet forberedte pRHIOO plasmidvektor blev blandet med 20 pMol af de ligerede oligonucleotider EG-1 til EG-8 og EG-9 til EG-14, og man inkuberede i 10 yl ligationspuffer (66 mM Tris-HCL 15 pH 7,2, 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 5 mM dit-hiothreitol, 1 mM ATP) med en enhed T4 DNA-ligase (Boehringer Mannheim) 24 t ved 14°C. Man transformerede E.coli JM101 celler, der var forbehandlet med calcium-chlorid, med denne ligationsblanding og inkuberede nat-20 ten over ved 37°C. Fra de tilvejebragte transformanter isolerede man ved minipræparation plasmid-DNA og bestemte strukturen af Hindlll-BamHI indsætningsstykket ved restriktionsanalyse og sekvensopdeling. Et plasmid med den ønskede struktur til eksprimering af færdig 25 EqIFN-γ blev betegnet pEqG-YYCl. På fuldstændig analog måde klonede man oligonucleotiderne EG-15,16 EG-3 til EG-8 og EG-9 til EG-14 i pRHIOO vektoren til opnåelse af EqlFN-y, der var forkortet med 3 aminosyrer. Et plasmid med den ønskede struktur blev betegnet 30 pEqG-QAAl.

8. Ekspression af interferonaktivitet af E.coli JM101, der indeholder plasmidet pEq-YYCl eller pEqG-QAAl.

Man inkuberede 100 ml bakteriekultur ved 37°C 35 under kraftig omrystning i følgende tryptophanfrie medium (angivelser per liter medium): DK 170054 B1 44 10 g (CH4)2P04/ 3,5 g KH2P04 pH 7,3 med NaOH, 0,5 g

NaCl, 21 g casaminosyrer (hydrolyseret surt), 11 g glucose, 1 mM MgS04, 0,1 mM CaCl2, 1 mg thiamin-HCl, 20 mg L-cystein, 20 mg 3-3-indolacrylsyre (IAA, induktor for 5 tryptophan-operon), eventuelt 50-100 mg ampicillin. Derefter udcentrifugerede man bakterierne i 5 min. ved 4000 o/m, man suspenderede med 1/10 af dyrkningsrumfanget af iskoldt 50 mM Tris-HCL pH 8,0, 30 mM NaCl og brød bakterierne under isafkøling ved 2 gange 30 sekun-10 ders behandling med ultralyd (20 kHz, 100 watt). Man fjernede cellerester ved centrifugering 10 min. ved 10.000 o/m (4eC) og afprøvede overstanden efter sterilfiltrering for interferonaktivitet i et assay, der målte den cytophatiske effekt (CPE) af Vesikular Stomati-15 tis Virus (VSV) eller Encephalomyocarditis virus (EMCV).

Prøvesystem: NBL-6 celler (ATCC CCL 57, he-

stehud-epidermis-celler)/VSV

20 A549 (ATCC CCL 185, human lungecarcinom-cellelinie)/-EMCV.

Måleværdien på A 549-celler omsættes ved hjælp af 25 human-interferonstandard til internationale enheder.

9. Påvisning af eksprimerede heste-interferoner ved mærkning af proteiner i maxiceller.

Man kan ved anvendelse af maxicelleteknik selek-30 tivt mærke plasmidkodede proteiner in vivo. Man transformerer E.coli CSR603 ved kendt teknik med ekspres-sionsplasmider og udvælger transformede bakterier på ampicillinholdige agarplader. Præparationen af maxiceller og mærkningen af proteinerne følger en fores-35 krift af A. Sancar (se ovenfor). Man dyrker cellerne i 15 ml medium (se eksempel 8) uden indolacrylsyre ved DK 170054 B1 45 37°C til en værdi for 0D6qq nrT) = 0,5, og man bestråler 10 ml af denne kultur i en petriskål 5 sek. med 50 cm afstand med en UV-germicid-lampe (15 watt) under omrystning, hvorefter man inkuberer videre 1 time ved 5 37°C. Kulturerne tilsættes 100 pg per ml D-cycloserin, der inkuberes 14 timer ved 37 °C, og man udvinder derefter bakterierne ved centrifugering. Man vasker cellerne to gange med 5 ml Hershey-saltopløsning, suspenderer dem i 5 ml Hershey-medium med 20 yg/ml indocryl-10 syre og inkuberer 2 timer ved 37°C. Til hver kultur sætter man 5 yCi/ml 1 2 3 4 5 6S-methionin (1000 Ci/mmol), og man holder blandingen under omrystning 1 time ved 37°C. Cellerne udvindes i SDS- og 2-mercaptoethanolholdig elektroforese-sondepuffer, hvor de lyserer, og man op-15 deler proteinerne på en 15% polyacrylamidgel.

Hershey-saltopløsning (per liter) Hershey-medium (per 100 ml Her-shey-saltopløs- 20 _ning)_ 5,4 g Nacl 2 ml 20% glucose 3.0 g KCl 0,5 ml 2% threo in 1.1 g NH4Cl 1,0 ml 1% leucin 15 mg Cacl2, 2H20 1,0 ml 2% prolin 25 0,2 g MgCl2, 6H20 1,0 ml 2% arginin 0,2 mg FeCl3, 6H20 0,1 ml 0,1% thiamin 87 mg KH2P04 12.1 g Tris-HCl pH 7,4

Et autoradiogram af den tørrede gel fremstilles 2 efter 2 dages eksponering på DuPont Cronex-røntgenfilm 3 under anvendelse af en Kodak Laneil^ Regular forstær 4 kningsfolie ved -80°C. Som standard for molekylvægt be 5 nytter man en 14C-methyleret proteinblanding 6 (Amersham). Som kontrol benyttes plasmidet pER103, der kun indeholder promotoren uden interferongen og plasmi- DK 170054 B1 46 det pER21/l, der indeholder 2 kopier af human IFN-a2arg gen.

10. Påvisning af sekvenser, der hybridiserer med EqlFN- 5 y i qenomisk heste-DNA.

Til påvisning af alle de sekvenser i hestegeno-met, der opviser en høj homologi med interferongenet EqIFN-γ, går man frem på følgende måde. Man fordøj er 30 yg højmolekylært heste-DNA (eksempel 1) med 100 en-10 heder af det tilsvarende restriktionsenzym i 300 μΐ reaktionsrumfang fuldstændigt og opdeler i hvert tilfælde 10 yg af dette gennemskårne DNA per spor på en 8,0% agarosegel efter størrelse.

Efter Southern-transfer til nitrocellulosefilt-15 re, denaturering og fiksering af DNA hybridiserer man hvert filter med en ca. 6 x 106 cpm radioaktivt mærket "sonde" (17 timer ved 65°C, 5 x SSC, 5 x Denhardt-opløsning, 0,1% SDS, 20 yg/ml denatureret laksesperm-DNA). Som "sonde" for EqIFN-γ benytter man et fragment 20 fra plasmidet pEqG-YYCl, der indeholder den kodende sekvens for hele det færdige interferon. Derefter vasker man filtret under stringente betingelser: 4 x 45 min. ved 65°C med 0,3 x SSC (45 mM NaCl, 4,5 mM Na3citrat), 0,1% SDS. Autoradiografien foregår på 25 DuPont Cronex-røntgenfilm under anvendelse af Kodak Lane^® Regular forstærkerfolie 7 dage ved -80°C.

11. Ekspression af equin interferon-y (QAA) i E.coli HB101/pEqG-QAA2 oq HB101/pEqG-QAA3.

30 Til opnåelse af en forbedret ekspression anvend te man a) forbedrede ekspressionsvektorer og b) et forbedret ribosomalt bindingssted. De forbedrede ekspressionsvektorer baseredes på trp-promoteren fra Serratia marcescens (Sma), der er indføjet i -35 regionen til 35 konsensus -35 regionen ved en udbytning af baser (pRH281), henholdvis på en hybrid-trp-promoter, der be- DK 170054 B1 47 sidder den første A/T-rige region fra Escherichia coli (Eco), henholdsvis den anden A/T-rige region plus promoter fra Sma (pRH282, S. Itoh, Gene 44 (1966), 29-36).

Som ribosomalt bindingssted brugte man et fra E.coli 5 enterotoxin II.

a) pRH2 81/5

Man fremstillede følgende oligonucleotider ved hjælp af en Applied Biosystems DNA Synthesizer 381A: 10

Trp-l: 51-AATTGACGCTG-3'

Trp-3: 5 ' -ATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGCCTTCGCGAACCA GTTAACTAGTACACA-3·

Tr p- 5: 5 ' -AGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCAT- 3 ’

TrP-2: 5·-TTAGCGATCAGCGTC-3· 15 Trp-4: 5 * -CGTGAACTTGTGTACTAGTTAACTGGTTCGCGAAGGCAATGTCAACCCT CTTTTTGCACAATGTT-3·

Trp-6: 5'-CGATGAATTCGAGCTCATATTAAACCTCCTTACCGTCTCGAGC-3· 20 100 pmol af hver af oligonucleotiderne Trp-2 til Trp-5 blev hver for sig phosphoryleret i 10 yl. Trp-l og -2,

Trp-3 og -4 såvel som Trp-5 og -6 blev hybridiseret ved opkogning og langsom afkøling. Man samlede opløsningerne af oligonucleotidpar og ligerede ved tilsætning af 25 T4-DNA ligase. Man gennemskår 3 yg pAT153 dobbelt med EcoRI og Clal. Efter rensning af det store fragment, satte man til dette ca. 20 pmol oligonucleotider, og man ligerede. Man transformerede derefter DNA i E.coli HB101 og isolerede plasmiderne fra nogle af de opnåede 30 kolonier. Pst-Hindlll fragmentet, der indeholdt promotoren, blev sekvensopdelt. Efter bekræftelse af den ønskede sekvens udvalgte man et plasmid og betegnede det med pRH281/5.

Sekvenserne i promotordelen lyder: DK 170054 B1 48 -35

5·-GAATTGACGCTGATCGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGC 3'-CTTAACTGCGACTAGCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACG

5

Xhol -10 iTranskriptionsstart

CTTCGCGAACCAGTTAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAG GAAGCGCTTGGTCAATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTC

KBS Seti EcoRI Clal 10 GAGGTTTAATATGAGCTCGAATTCATCGAT-3' CTCCAAATTATACTCGAGCTTAAGTAGCTA-5'

Fordelene ved den nye ekspressionsvektor er: 1) optimal -35 region i trp-Sma promotoren, 15 2) singulært Xhol-sted før det ribosomale bindings sted (RBS) tillader udbytning af RBS med et andet, 3) ekspressionsplasmidet indeholder en transla tionsstart ATG i en afstand på 5 nukleotider ef- 20 ter RBS, 4) G'et i dette ATG er den første base i Sstl- genkendelsessekvensen (GAGCTC). Ved gennemskæring med SstI og påfølgende opnåelse af en lige ende, vil en ekspressionsvektor med en 25 translationsstart-ATG stå til rådighed, med hvilken man kan ligere et fremmed gen, der begynder med den første base i læserammen.

5) Forbindelsen RBS-ATG indeholder ingen G eller C, 30 6) ved valget af oligonucleotidsekvensen ved 5'- enden destruerede man det oprindelige EcoRI-gennemskæringssted. Herved kan man i 3'-enden af promotoren opnå et multikloningssted, der består af SstI, EcoRI, Clal og Hindlll (findes 35 allerede i pAT153).

DK 170054 B1 49 b) pRH282/5.

På lignende måde sammenbyggede man ekspressionsvektoren pRH282/5. Oligonucleotiderne Trp-1 og Trp-2 blev erstattet med oligonucleotiderne Trp-7 og Trp-8: 5

Trp-7: 5'-AATTGCCCGTTCTGGATAATGTTTTTTGCGCCGACATCATCATGCT-3'

Trp-8 i 5’-TTAGCGATCAGCATGATGATGTCGGCGCAAAAAACATTATCCAGAACGGGC-3·

Sekvensen for promoterdelen i pRH282/5 er som 10 følger:

5'-GAATTGCCCGTTCTGGATÅATGTTTTTTGCGCCGACATCATCATGCTGAT 3·-CTTAACGGGCAAGACCTATTACAAAAAACGCGGCTGTAGTAGTACGACTA

15 “3S

CGCTAAAACATTGTGCAAAAAGAGGGTTGACATTGCCTTCGCGAACCAGT

GCGATTTTGTAACACGTTTTTCTCCCAACTGTAACGGAAGCGCTTGGTCA

Xhol

-10 iTtanekriptioneetart RBS

TAACTAGTACACAAGTTCACGGCTCGAGACGGTAAGGAGGTTTAATATGA

ATTGATCATGTGTTCAAGTGCCGAGCTCTGCCATTCCTCCAAATTATACT

20

Seti EcoRI Clal GCTCGAATTCATCGAT-3' CGAGCTTAAGTAGCTA-5 * 25 C) pGNl.

Man gennemskår 1 yg pUC18 to gange med BamHI og Sall. Fra 10 yg EqG-QAAl isolerede man, ligeledes ved BamHI-Sall dobbelgennemskæring, den anden halvdel af 30 det syntetiske heste-γ-interferongen, og man dephospho-rylerede det. Man ligerede ca. 20 ng vektor med 100 ng indsætningsstykke og transformerede DNA i E.coli JM101. Plasmidet i en koloni blev prøvet ved restriktionsenzymfordøjelse og betegnet med pGNl.

DK 170054 B1 50 d) pGN3.

Den første halvdel af det syntetiske gen blev, sammen med det ribosomale bindingssted, sammensat af oligonucleotider: 5

EqG-1: 5'-AGCTTCCCTCGAGAGGTTGAGGTGATTTATGCAGGCTGCTTTCTTTAAAG

AAATCGAAAACCTGAAAGAATACTTCAACGCTCGTAACCCAGACGTTGGT-3' EqG-2: 5'-GACGGTGGTCCGCTGTTCCTGGACATCCTGAAAAACTGGAAAGAAGACTC TGACAAAAAGATCATCCAGTCTCAG-3 * 10 EqG-3: 5 *-ATCGTTTCTTTCTACTTCAAACTGTTCGAAAACCTGAAAGACAACCAGGT TATCCAGAAATCGATGGACACTATCAAAGAAGATCTGTTCGTTAAATTCT TCAACTCGTCGACTCCG-3·

EqG-4: 5·-AATTCGGAGTCGACGAGTTGAAGAATTTAACGXACAGATCTTCTTTGATA GTGTCCATCGATTTCTGGATAACCTGGTTGTCTTTCAGGTTTTCGAACAG TTTGAAGTAGAAAGAAACGATCTGAGACTG-3'

EqG-5: 5 *-GATGATCTTTTTGTCAGAGTCTTCTTTCCAGTTTTTCAGGATGTCCAGGA ACAGCGGACCACCGTCACCAACGTC-3 * 15 EqG-6: 5·-TGGGTTACGAGCGTTGAAGTATTCTTTCAGGTTTTCGATTTCTTTAAAGA AAGCAGCCTGCATAAATCACCTCAACCTCTCGAGGGA-3· 20 Man phosphorylerede 50 pmol af hvert af oligo- nucleotiderne på følgende måde:

EqG-2 sammen med EqG-5 i 7 yl, EqG-3 og EqG-8 alene i hver 8 yl. Man standsede kinasereaktionen ved ophedning til 100°C. Til EqG-3 satte man 50 pmol EqG-4 (1 yl), og 25 til EqG-8 satte man 50 pmol EqG-1 (1 yl). Man opvarmede igen opløsnigerne til 100°C og kølede langsomt af. Oligonucleotidopløsningerne blev samlet og ligeret med T4-DNA ligase i i alt 30 yl, man gennemskår 2 yg pUCl8 med EcoRI og Hindlll dobbelt, man rensede vektordelen 30 på en gel og opløste i 50 yl vand. 40 ng vektor og ca. pmol ligerede oligonucleotider blev ligeret i 10 yl, hvorefter man transformerede DNA i E.coli JM101.

Man omklonede EcoRI-Hindlll indsætningsstykket fra et af de dannede plasmider i M13mp9 og kontrollere-35 de sekvensen. Et plasmid med den ventede sekvens blev udvalgt og betegnet pGN3.

DK 170054 Bl 51 e) pGN20.

Man gennemskår ca. 3 yg pGNl, henholdsvis pGN3 med HindiII og Sall, to gange. Indsætningsstykket i pGN3 og vektoren/2. halvdel af Eq-y-interferon genet 5 fra pGNl blev renset på gel. 0,2 yg pGN3 blev ligeret med ca. 0,2 yg pGN3-indsætningsstykke, og man transformerede DNA i E.coli JM101. Plasmidet i en af de dannede kloner blev, efter kontrol af restriktionssekvensen, udvalgt og betegnet med pGN20.

10 f) pGqG-QAA2, henholdsvis pEqG-QAA3.

Fra ca. 10 yg pGN20 isolerede man Xhol-EcoRI indsætningsstykket, der indeholder det syntetiske heste-y-interferongen sammen med det ribosomale bin-15 dingssted fra E.coli Enterotoxin II (C.H. Lee et al., Infect. Immun. 42 (1983), 264-268; S.K. Moseley et al., Infect. Immun. 39 (1983), 1167-1174)). Man gennemskår pRH281/5, henholdsvis pRH282/5, dobbelt med Xhol og EcoRI. 20 ng vektor blev ligeret med 20 ng indsætnings-20 stykket, og man transformerede DNA i E.coli HB101. Nogle kolonier blev udvalgt, man isolerede plasmiderne og kontrollerede ved restriktionsanalyse. I hvert tilfælde udvalgte man et plasmid, og betegnede dem med pEqG-QAA2 (vektor: pRH281/5), henholdsvis pEqG-QAA3 25 (vektor: pRH282/5).

g) Lysatprøve på interferon-y-aktivitet.

Man fortyndede en kultur dyrket natten over af E.coli HB101/pEqG-QAA2, henholdsvis HB101/pEqG-QAA3 30 1:100 med LB/amp (LB: 10 g/1 trypton, 5 g/1 gærek strakt, 5 g/1 NaCl, 50 mg/1 ampicillin), og man inkuberede videre ved 37°C. Når den optiske tæthed nåede 0,3 ved 600 nm, tilsatte man 50 mg/1 indolacrylsyre og inkuberede kulturen yderligere 2 timer ved 37°C.

35 Man fracentrifugerede bakterierne, og brød dem op ved hjælp af ultralyd. Den sterilfiltrerede overstand blev DK 170054 B1 52 prøvet for y-interferonaktivitet på NBL-β celler (ATCC CCL 57), idet man benyttede Vesicular Stomatitis Virus (VSV) som virus. Lysaterne fra begge de transformerede bakteriekulturer (E.coli HB101/pEqG-QAA2, henholdsvis 5 HB101/pEqG-QAA3) viste ca. 0,1-1 million enheder/ml interferonaktivitet. Til kontrol afprøvede man et på lignende måde fremstillet E.coli HB101/pRH281 lysat. Dette kontrollysat udviste mindre end 100 enheder/ml.

Claims (9)

1 D TTTCAGGTTT TCGAACAGTT TGAAGTAGAA AGAAACGATC TGAGACTGGA TGATCTTTTT GTCAGAGTC, AGGTTATCCA GAAATCGATC GACACTATCA AAGAAGATCT GTTCGTTAAA TTCTTCAACT CG, TCGACGAGTT GAAGAATTTA ACGAACAGAT CTTCTTTGAT AGTGTCCATC 20 GATTTCTGGA TAACCTGGTT GTC, TCGACTTCTA AACTGGAAGA CTTCCAGAAA CTGATCCAGA TCCCAGTTAA CGACCTGAAA, t GCTGAACTTT CAGGTCGTTA ACTGGGATCT GGATCAGTTT CTGGAAGTCT TCCAGTTTAG AAG,

25 GTTCAGCGTA AGGCTATCTC TGAACTGATC AAAGTTATGA ACGACCTGTC TCCAAAAGCT AA, CGCAGGTTAG CTTTTGGAGA CAGGTCGTTC ATAACTTTGA TCAGTTCAGA GATAGCCTTA C, CCTGCGTAAA CGTAAACGTT CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC TTCAGTAAG, DK 170054 B1 56 GATCCTTACT GAAGAGCACG ACGACCACGG AATGGGTTCT GAGAACGTTT ACGTTTA, CAGGCTGCTT TCTTTAAAGA AATCGAAAAC CTGAAAGAAT ACTTCAACGC 5 TCG, TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTG 10 at mindst to af disse DNA-sekvenser er sammenknyttet i vilkårlig orden, eller at en eller flere tripletter er blevet erstattet med sådanne, der koder for samme aminosyre.

1. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den indeholder et udvalg af nucleotidsekvenserne a)

2. DNA-sekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den er funktionelt sammenknyttet med en ekspressionskontrolsekvens.

3. DNA-sekvens ifølge krav 2, kendeteg net ved, at ekspressionskontrolsekvensen er en modificeret trp-promoter fra Serratia marcescens.

4. DNA-sekvens ifølge krav 3, kendetegnet ved, at ekspressionskontrolsekvensen indeholder 20 et udvalg af nucleotidsekvenserne a) GAATTGACGC TGATCGCTAA AACATTGTGC AAAAAGAGGG TTGACATTGC 50 CTTCGCGAAC CAGTTAACTA GTACACAAGT TCACGGCTCG AGACGGTAAG 100 GAGGTTTAAT ATGAGCTCGA ATTCATCGAT, 25 og b) GAATTGCCCG TTCTGGATAA TGTTTTTTGC GCCGACATCA TCATGCTGAT 50 CGCTAAAACA TTGTGCAAAA AGAGGGTTGA CATTGCCTTC GCGAACCAGT 100 TAACTAGTAC ACAAGTTCAC GGCTCGAGAC GGTAAGGAGG TTTAATATGA 150 30 GCTCGAATTC ATCGAT.

5. Polypeptid, kendetegnet ved, at der kodes for af en af DNA-sekvenserne ifølge krav i, 35 og at det har den biologiske aktivitet for y-heste-interferon. 5 55 DK 170054 B1

5 R1TACTGCCAGG CTGCTTTCTT TAAAGAAATC GAAAACCTGA AAGAATACTT 50 CAACGCTCGT AACCCAGACG TTGGTGACGG TGGTCCGCTG TTCCTGGACA 100 TCCTGAAAAA CTGGAAAGAA GACTCTGACA AAAAGATCAT CCAGTCTCAG 150 ATCGTTTCTT TCTACTTCAA ACTGTTCGAA. AACCTGAAAG ACAACCAGGT 200 TATCCAGAAA TCGATGGACA CTATCAAAGA AGATCTGTTC GTTAAATTCT 250 TCAACTCGTC GACTTCTAAA CTGGAAGACT TCCAGAAACT GATCCAGATC 300 • CCAGTTAACG ACCTGAAAGT'TCAGCGTAAG GCTATCTCTG AACTGATCAA 350 AGTTATGAAC GACCTGTCTC CAAAAGCTAA CCTGCGTAAA CGTAAACGTT 400

10 CTCAGAACCC ATTCCGTGGT CGTCGTGCTC TTCAGTAA, hvorved R1 betegner

15 ATGAATTATA CAAGTTTTAT CTTGGCTTTT CAGCTGTGTG CGATTTTGGG 50 TTCTTCTACC TAT, ATGTAT, eller

20 TAT, b) R2GCTGCTTTCT TTAAAGAAAT CGAAAACCTG AAAGAATACT TCAACGCTCG 50 TAACCCAGAC GTTCGTCÅCG GTGGTCCGCT GTTCCTGGAC ATCCTGAAAA 100 ACTGGAAAGA AGACTCTGAC AAAAAGATCA TCCAGTCTCA GATCGTTTCT 150 TTCTACTTCA AACTGTTCGA AAACCTGAAA GACAACCAGG TTATCCAGAA 200

25 ATCGATGGAC ACTATCAAAG AAGATCTGTT CGTTAAATTC TTCAACTCGT 250 CGACTTCTAA ACTGGAAGAC TTCCAGAAAC TGATCCAGAT CCCAGTTAAC 300 GACCTGAAAG TTCAGCGTAA GGCTATCTCT GAACTGATCA AAGTTATGAA 350 CGACCTGTCT CCAAAAGCTA ACCTGCGTAA ACGTAAACGT TCTCAGAACC 400 CATTCCGTGG TCGTCGTGCT CTTCAGTAA, hvorved R^ betegner 30 DK 170054 B1 54 ATGAATTATA CAAGTTTTAT CTTGGCTTTT CAGCTGTGTG CGATTTTGGG 50 TCTTCTACCC AG, ATGCAG, 5 eller GAG, c) en sekvens, der under betingelser selekterende for mere end 85% homologi hybridiserer med den komplementære streng for en af de ovennævnte sekvenser, og som ko-10 der for et protein med den biologiske aktivitet af y-hesteinterferon.

6. DNA-sekvens, kendetegnet ved, at den indeholder et udvalg af sekvenserne TACTACTGCC AGGCTGCTTT CTTTAAAGAA ATCGAAAACC TGAAAGAATA CTTCAAGCTC CG, TTGAAGTATT CTTTCAGGTT TTCGATTTCT TTAAAGAAAG CAGCCTGGCA GTAGTA,

10 TAACCCAGAC GTTGGTGACG GTGGTCCGCT GTTCCTGGAC ATCCTGAAAA ACTGGAAAGA ACACTCTG, TTCTTTCCAG TTTTTCAGGA TGTCCAGGAA CAGCGGACCA CCGTCACCAA CGTCGGGGTT ACGAGCG, ACAAAAAGAT CATCCAGTCT CAGATCGTTT CTTTCTACTT CAAACTGTTC ._ GAAAACCTGA AAGACAACC,

7. Værtsorganisme, kendetegnet ved, 15 at den er transformeret med en DNA-sekvens ifølge et kravene 1 til 4.

8. Fremgangsmåde til fremstilling af et polypep-tid ifølge krav 5, kendetegnet ved, at a) en værtsorganisme transformeres med en af DNA-se-20 kvenserne ifølge kravene 1 til 4 b) den transformerede værtsorganisme dyrkes, og c) polypeptidet isoleres.

9. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det udover sædvanlige hjælpe- og/eller bære- 25 stoffer indeholder en virksom mængde af et polypeptid ifølge krav 5.