NO179505B - Fremgangsmåte for fremstilling av en syntetisk ekstracellulær matriks - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av en syntetisk ekstracellulær matriks bestående av: a) et ikke-naturlig forekommende syntetisk peptid inneholdende aminosyresekvensen Y-Gly-Asp, hvori Y er R eller

dR, og med færre enn 30 aminosyrer; og

b) en bionedbrytbar polymer utvalgt fra hyaluronsyre, chondroitinsulfat, heparin, heparansulfat, polylaktat og

polyglykolsyre;

hvor den syntetiske ekstracellulære matriks, som ikke er et fast støttemateriale, fremmer cellebinding og migrering og hvori den bionedbrytbare polymer er bundet til peptidet uten vesentlig å redusere den cellebindingsfremmende aktivitet av peptidet.

Den langsomme heling eller mangel på heling av både dermalsår, slik som liggesår, alvorlige brannsår og diabetiske sår og øyelesjoner, slik som tørt øyesår og korneasår, er et alvorlig medisinsk problem som angriper millioner av individer og forårsaker alvorlig smerte eller død for mange pasienter. Selv heling av kirurgiske sår er et problem, i særdeleshet i eldre og diabetiske individer. Selv om sår kan være svært ulike når det gjelder årsak, morfologi og angrepet vev, deler de en felles helingsmekanisme. Hver reparasjonsprosess krever sluttelig at den korrekte type av celle vandrer inn i såret i tilstrekkelig antall for å ha en effekt: makrofager for å ut-vide sår, fibroblaster for dannelse av nytt kollagen og andre ekstracellulære matrikskomponenter i sår hvori den ekstracellulære matriks er blitt skadet, kapillære endoteliale celler for å tilveiebringe blodtilførsel og epitelceller for sluttelig å dekke såret.

Den usårede dermis får mye av dens struktur og styrke fra interaksjoner av celler med den ekstracellulære matriks. Denne matriks inneholder flere proteiner kjent for å under-støtte binding av et vidt antall celler. Disse proteiner innbefatter fibronektin, vitronektin, trombospondin, kollagener og laminin. Selv om fibronektin finnes i relativt lave konsen-trasjoner i uskadet hud, oppstår plasmafibronektinavsetning raskt etter skade. Når vevet er skadet, må den ekstracellulære matriks bli erstattet for å tilveiebringe en plattform for å

understøtte cellebinding og migrering.

I tillegg til å tilveiebringe en plattform kan ekstracellulære matriser også styre cellulær proliferering og differensiering. En ekstracellulær matriks kan derfor styre heling av et vev på en slik måte at den korrekte vevsgeometri gjenvinnes. Påført på sår resulterer eksogent fibronektin i en forøkt sårheling, epitelial migrering og kollagen avsetning. Et utall betraktninger innbefattende pris, tilgjengelighet og ustabilitet gjør imidlertid fibronektin og andre ekstracellulære matriksproteiner mindre ideelle for slik behandling. Da de enn videre er blodavledete produkter kan ekstracellulære matriksproteiner være vektorer for infeksiøs sykdom.

I tillegg til behandling med fibronektin er forsøk også blitt gjort på å aktivere heling ved å tilveiebringe cellevekstfaktorer, slik som fibroblastvekstfaktor (FGF), eller epidermal vekstfaktor (EGF). Slike faktorer vil uten tvil bli anvendbare ved behandling av sår, men fordi de ikke kan bevirke den korrekte geometri av nytt vev, kan de føre til altfor vaskularisert vev og unormal heling.

Det er nå erkjent at bindingsområdet for fibronektin og andre addisjonsproteiner er lokalisert i aminosyresekvensen Arg-Gly-Asp-X (også angitt som RGD-X i henhold til standarden for énbokstavsforkortelser for aminosyrer) hvori X kan være forskjellige aminosyrer eller substituenter slik at peptidet har celleaddisjonsaktiverende aktivitet. Arg-Gly-Asp-holdige peptider og deres anvendelse er f.eks. beskrevet i følgende bevilgede patenter og patentsøknader: patent nr. 4.578.079 og 4.614.517; søknadsnummer 744.981 og 738.078. Fra disse opp-dagelser har arbeider ført frem til utvikling av forskjellige Arg-Gly-Asp-holdige peptider med forskjellige spesifisiteter for bestemte celleoverflatereseptorer.

Det foreligger således et behov for et effektivt middel for å aktivere cellemigrering og binding til setet for et sår. Fortrinnsvis skal et slikt middel være billig, sterilt og ha langvarig stabilitet og effektivitet.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således en fremgangsmåte for fremstilling av en syntetisk ekstracellulær matriks bestående av: a) et ikke-naturlig forekommende syntetisk peptid inneholdende aminosyresekvensen Y-Gly-Asp, hvori Y er R eller

dR, og med færre enn 30 aminosyrer; og

b) en bionedbrytbar polymer utvalgt fra hyaluronsyre, chondroitinsulfat, heparin, heparansulfat, polylaktat og

polyglykolsyre;

hvor den syntetiske ekstracellulære matriks, som ikke er et fast støttemateriale, fremmer cellebinding og migrering og hvori den bionedbrytbare polymer er bundet til peptidet uten vesentlig å redusere den cellebindingsfremmende aktivitet av peptidet, kjennetegnet ved at aminosyrekjedene eller terminalene av peptidet bindes til en karboksylamino- eller sulfhydrylgruppe på den bionedbrytbare polymer ved hjelp av et tverrbindings-/koblingsmiddel utvalgt fra l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl)karbodiimid (EDC), disykloheksylkarbodiimid, glutaraldehyd, cyanogenbromid og N-hydroksyravsyreimid, idet den bionedbrytbare polymer blandes i en bufferløsning med koblingsmidlet og peptidet under egnede betingelser og tilstrekkelig tid til at koblingen finner sted, etterfulgt av rensing av den således erholdte syntetiske, ekstracellulære matriks.

Kort beskrivelse av tegningene

Figur 1 viser sårstyrkeforbedringen erholdt under anvendelse av konjugatet hyaluronat og R6GDSPK over en 10 dagers test sammenlignet med kontrollen. Figur 2 viser resultatene av figur 1 som en prosent av kontrollen. Figur 3 viser resultatene av et andre sårstyrkeforsøk under anvendelse av konjugatet av hyaluronat-G(dR)5G3(dR)-GDSPASSK. Figur 4 viser dataene fra figur 3 som en prosent av kontrollsårene.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Den ekstracellulære matriks av pattedyrdermis inneholder flere proteiner kjent for å understøtte binding og aktivere migrering og differensiering av et lite antall celler, innbefattende fibronektin, vitronektin, kollagener og laminin. Når dermis kuttes, brennes eller nedslites, kan den ekstracellulære matriks separeres eller tapes. Denne matriks må erstattes før såret kan repareres ved cellulær migrering og replikasjon fordi celler krever at matriksen må være på plass før cellemigrering og heling kan finne sted.

Ved naturlig sårheling erstattes vevet via migrering av celler og syntesen av ekstracellulær matriks av disse. Pro-sessen er tidkrevende, krever ofte mer enn ett år for å full-føres og resulterer i arrdannelse og i vev som er svakere enn det omgivende, uskadede vev.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer stabile "syntetiske matriser" som kan anvendes for å understøtte heling av mange forskjellige sår ved å tilveiebringe cellene med en bindingsbase for cellemigrering.

Den "syntetiske matriks" omfatter et konjugat av en bionedbrytbar polymer og en peptidsekvens som dermalceller kan anvende som bindingssete under migrering. Fortrinnsvis inneholder peptidet sekvensen Arg-Gly-Asp eller D-Arg-Gly-Asp. For dermale sår vil disse to komponenter fortrinnsvis danne en viskøs semigel, omfattende peptidet koblet til en hydratisert matriks. Semigelen anbringes direkte på såret ved setet eller setene for matriksdestruksjon. Såret behandles ellers på normal måte. Som en semigel er konjugatet ikke tilbøyelig til å migrere bort fra sårstedet, enten på grunn av fysikalske effekter, slik som bevegelse av pasienten, eller ved absorp-sjon av pasientens eget system. Konjugatet virker som en temporær erstatningsmatriks som fremmer cellemigrering inn i såret og fremskynder legning. Ettersom såret leges brytes konjugatet langsomt ned av de migrerende celler og erstattes av naturlig erstatningsmatriks, som vist i eksempel VI. For andre anvendelser, slik som med korneaavslitning forårsaket av en tilstand med tørt øye eller andre omstendigheter, er et konjugat bestående av et Y-Gly-Asp-peptid koblet til chondroitinsulfat foretrukket. Dette konjugat bindes til eksponert dermiskollagenmatriks og tilveiebringer bindingsseter for hornhinneepitelceller. Et slikt materiale kan tilveiebringes i væskeform, slik som øyedråper.

Følgende standardforkortelser anvendes her for å identifisere aminosyrer.

En del av de foretrukne aminosyresekvenser anvendt ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er avledet fra den av fibronektin. Fibronektin er et naturlig forekommende protein som er til stede i lave nivåer i uskadet dermis og i høyere nivåer i skadet dermis. Fibronektin er blitt vist å være en viktig faktor ved heling fordi det tilveiebringer et bindingssete for migrerende celler som kommer inn for å erstatte celler som er tapt på grunn av skade. Aminosyresekvensen i fibronektin fordret for cellebinding er Arg-Gly-Asp-X hvori X er serin. Imidlertid kan X være andre aminosyrer eller substituenter slik at peptidet har cellebindingsaktiverende aktivitet. (Pierschbacher og Ruoslahti, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:5985-5988 (1984)). Arg-Gly-Asp er også en cellebindingsaktiverende sekvens i et utall av andre adhesive proteiner innbefattende vitronektin, kollagen, fibrin og tenascin. Syntetiske peptider inneholdende sekvensen er i stand til å aktivere cellebinding når de presenteres som et uløselig substrat så vel som inhibering av cellebinding til fibronektin eller andre adhesive proteiner når de foreligger i oppløsning. Flere reseptorer for denne peptidsekvens er blitt identifisert i forskjellige celletyper (Pytela et al., Cell 40:191-198

(1985); Ruoslahti og Pierschbacher, Science 238: 491-497

(1987)). Avhengig av typen av celle som skal bindes kan Arg-Gly-Asp-X-sekvensene være modifisert til å bindes preferensi-elt til individuelle reseptorer, og kan derfor tiltrekke individuelle typer av celler (Pierschbacher og Ruoslahti, J. Biol. Chem. 262:14080-14085 (1987)). I tillegg inneholder mesteparten av ekstracellulære matriksproteiner en basisk "heparinbindings"-region som synes å forbedre all adhesjon. Denne kvalitet kan etterlignes av polyarginin, polylysin eller polyornitin, eller av andre basiske rester. Imidlertid kan peptidet være lineært eller syklisk.

I foretrukne utførelsesformer av oppfinnelsen innbefatter følgelig polypeptider som er anvendbare i kombinasjon med en bionedbrytbar polymer for å aktivere sårlegning, følgende: hvori R er aminosyren arginin (Arg); dR er aminosyren D-arginin (D-Arg); G er aminosyren glysin (Gly); D er aminosyren asparaginsyre (Asp); S er aminosyren serin (Ser); P er aminosyren prolin (Pro); K er aminosyren lysin (Lys); A er aminosyren alanin (Ala) og nMe er en n-metylgruppe.

Disse peptider er syntetiske, relativt enkle å frem-stille (sammenlignet med f.eks. fibronektin) og behøver ikke å ekstraheres fra blod. I tillegg muliggjør den mindre størrel-sen av peptidet (sammenlignet f.eks. med fibronektin) at mange flere bindingsseter kan bindes til et gitt volum av bionedbrytbar polymer. Disse peptider er også meget mer stabile enn fibronektin i oppløsning. I særdeleshet bibringer D-Arg proteaseresistens. Da enn videre peptidene ikke bærer arts-spesifikke immunologiske determinanter, kan de derfor anvendes i både veterinær- og humananvendelsesområder. Fortrinnsvis inneholder slike peptider minst én gruppe på minst tre aminosyrer valgt fra D- eller L-former av Arg, Lys eller ornitin til N-endesiden av Arg-Gly-Asp-sekvensen.

En foretrukket bionedbrytbar polymer anvendt ifølge oppfinnelsen er hyaluronsyre. Hyaluronsyre består av alterner-ende, rester av D-glukuronsyre og N-acetyl-D-glukosamin. Polymeren finnes i den dermale matriks og er kommersielt til-gjengelig fra mange kilder i ren form. Den kan danne geler eller viskøse løsninger fordi den er en vannløselig polymer. Polymeren kan være tverrbundet for å stabilisere dens fysikalske egenskaper.

En alternativt foretrukket bionedbrytbar polymer, i særdeleshet for oftalmiske anvendelser på grunn av dets evne til spesifikt å binde eksponert kollagen/matriks, er chondroitinsulfat. Slike konjugater danner stabile løsninger som kan tilveiebringes i væskeform, slik som øyedråper. Andre poly-merer som med fordel kan anvendes innbefatter heparin, hapa-ransulfat, dekstran, polylaktat og polyglykolsyre. I tillegg vil disse materialer bli anvendt i dermal anvendelse ved tverrbinding av disse under dannelse av en gel, eller ved dannelse av en meshlignende struktur.

De to komponenter av det sårlegende konjugat kan forbindes ved et utall prosedyrer. Fortrinnsvis forbindes de under anvendelse av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid

(EDC), et tverrbihdings-/koblingsmiddel. Andre tverrbindings-/koblingsreagenser kan også anvendes, slik som disykloheksylkarbodiimid (DDC), glutaraldehyd, cyanogenbromid eller N-hydroksysuccinimid. Andre metoder vel kjent innen faget kan alternativt anvendes.

Et peptid-hyaluronsyrekonjugat danner en semigel hvis viskositet kan forandres ved tilsetning av ukonjugert hyaluronat eller variere graden av peptidkonjugat. Fortrinnsvis er forholdet mellom peptid og polymer 0,2-0,3:1, selv om andre områder også er anvendbare. Semigelen kan anbringes direkte i et sår for å medhjelpe til legning ved tilveiebringelse av en kunstig bionedbrytbar matriks. Vekstfaktorer, slik som over-førende vekstfaktor p (TGF-p) eller blodplateavledet vekstfaktor (PDGF), kan anvendes sammen med konjugatet for ytterligere å aktivere legning. I alternative utførelsesformer kan konjugatet belegges på et bionedbrytbart nett eller annet implan-tert materiale, eller kan i seg selv formes til ark eller andre strukturer, eller kan være tilveiebrakt som en stabil løsning. Slike konjugater kan anvendes på hvilke som helst sår som innbefatter kroppsvev som er kuttet bort, bortslipt eller på annen måte skadet. Slike sår innbefatter kroniske hudsår, brannsår, hornhinnesår og innsnitt. Regenerering av vev (slik som brusk, ben eller nervevev) kan også forbedres ved påføring av konjugatet.

De etterfølgende eksempler er beregnet på mer klart å illustrere aspekter ved oppfinnelsen.

Eksempel I

Peptidsvntese

Peptidet G (dR) (dR) (dR) (dR) (dR) G G G (dR) G D S P A S S K ble syntetisert under anvendelse av en automatisert peptidsyntetisator (modell 430A; Applied Biosystems, Foster City, California) i henhold til de retningslinjer som er tilveiebrakt av fabrikanten. Etter spalting fra harpiksen med hydrogenfluorid ble peptidene vasket i kald etyleter og utfelt fra oppløsning i trifluoracetat med iskald eter. Peptidene ble deretter oppløst på nytt i destillert vann og ble lyofilisert. Peptidene ble ytterligere renset ved HPLC under anvendelse av en Waters Bondapak™ C18 (3 x 30 cm; 10 um pakking, Waters Assoc., Milford, MA). Andre peptider kan fremstilles ved samme metode.

For store volumer kan alternativt peptidet fremstilles ved følgende metode. Cirka 30 g t-boc-lysinpolystyren-harpiks (inneholdende ca. 19,5 mM t-boc-lysin) ble utveid og anbrakt i et glasspeptidsyntesereaksjonskar. Vekten av harpiksen kan økes eller reduseres, avhengig av den ønskede mengde ønsket produkt. Følgende aminosyrer med beskyttende grupper, som indikert, ble anvendt for fremstilling av peptidet:

1-serin (benzyl, bzl)

1-alanin

1-prolin

1-asparaginsyre (o-sykloheksyl; OcHx)

glysin

d-arginin (p-toluensulfonyl; tos).

Hver aminosyre ble utveid i en mengde for å gi et firedobbelt forhold på en molarbasis med den av t-boc-lysin, og ble fylt i individuelle 500 ml Erlenmeyer-glasskolber.

Hver aminosyre (bortsett fra t-boc-lysin-polystyrenharpiksen) ble oppløst og aktivert ved tilsetning av 1 M hydroksybenzotriazol i N-metylpyrrolidon. Hydroksybenzotriazol ble tilsatt i et volum til å gi en ekvimolar konsentrasjon med den av aminosyren. Aktivering av hver aminosyre (bortsett fra t-boc-lysin-polystyrenharpiksen) ble fullført ved tilsetning av et volum av 1 M disykloheksylkarbodiimid i N-metylpyrrolidon under dannelse av en ekvimolar konsentrasjon av disyklo-heksylkarbodiimidet med den av den oppløste aminosyre. Materialene ble inkubert i minst 30 min for å muliggjøre full-stendig aktivering. Hver aminosyre ble omdannet til den Hobt-aktive ester. De aktiverte aminosyrer ble filtrert gjennom et Whatman nr. 1 filterpapir for å fjerne ethvert uløselig materiale.

For å fjerne den t-boc-beskyttende gruppe fra amino-enden av den N-terminale aminosyre, ble t-boc-aminosyre-polystyrenharpiksen svellet og deretter vasket tre ganger med diklormetan (ca. 12 ml pr. gram harpiks) i 5 min. Etter hver vasking ble væsken fjernet fra reaksjonskaret. Etter svelling og vasking ble harpiksen surgjort ved vasking med 50 % trifluoreddiksyre i diklormetan (ca. 6 ml pr. gram harpiks) i 2 min. Væsken ble fjernet fra reaksjonskaret. Avbeskyttelse av t-boc-aminosyre-polystyrenharpiksen ble fullført ved tilsetning av et ytterligere volum 50 % trifluoreddiksyre i diklormetan (ca. 12 ml pr. gram harpiks), og materialet fikk inku-beres i ca. 30 min eller lenger.

Etter avbeskyttelse ble trifluoreddiksyren i diklormetan fjernet fra reaksjonskaret, og den avbeskyttede aminosyre-polystyrenharpiks ble vasket to ganger med diklormetan (ca. 12 ml pr. gram harpiks). Den avbeskyttede aminosyre-polystyrenharpiks ble vasket to ganger med diklormetanisopropanol-vaskeløsning (50 % v/v, ca. 12 ml pr. gram harpiks), og vas-keløsningene ble kastet. Harpiksen ble deretter vasket to ganger med diklormetan (ca. 12 ml pr. gram harpiks).

Den surgjorte, avbeskyttede aminosyre-polystyrenharpiks ble nøytralisert ved vasking tre ganger med 10 mM di-isopropyletylamin i diklormetan (ca. 12 ml pr. gram harpiks). Nøytraliseringsvaskeløsningene ble kastet etter hver syklus. Den nøytraliserte aminosyre-polystyrenharpiks ble vasket tre ganger med diklormetan (ca. 12 ml pr. gram harpiks) og tre ganger med N-metylpyrrolidon (ca. 12 ml pr. gram harpiks). Vaskeløsningene ble kastet etter hver syklus.

Den egnede aktiverte aminosyre ble tilsatt reaksjonskaret inneholdende aminosyre-polystyrenharpiksen i en mengde til å gi et molarforhold på 4 til 1 (aktivert aminosyre til avbeskyttet aminosyre kjedet til harpiks). Den egnede aminosyre ble valgt i henhold til den ønskede peptidsekvens. Materialet ble blandet i 30 min eller lenger for å tillate at koblingsreaksjonen fikk fullføres. Reaksjonen ble overvåket under anvendelse av ninhydrinreaktiviteten. Harpiksen inneholdende de koblede aminosyrer ble vasket to ganger med N-metylpyrrolidon (ca. 12 ml pr. gram harpiks) og to ganger med diklormetan (ca. 12 ml pr. gram harpiks). Hver vaskeløsning ble kastet etter endt syklus.

Fremgangsmåten som starter ved surgjøring og avbeskyttelse av t-boc-aminosyre-polystyrenharpiksen via dette trinn, ble gjentatt for hver etterfølgende aminosyre som skulle tilsettes peptidkjeden. Aminosyresekvensen som ble fulgt for fremstilling av peptidet, er angitt i det etter-følgende:

Etter fullførelse av alle koblingstrinn for peptidet ble harpiksen vasket to ganger i diklormetan (ca. 12 ml pr. gram harpiks ved hver vasking). Harpiksen ble oppsamlet og tørket ved spyling med argongass. Den tørkede harpiks ble brakt i eksikkator og lagret ved omgivende temperatur inntil ytterligere bearbeidelse.

Den tørkede og oppveide harpiks ble anbrakt i et egnet reaksjonskar med egnet størrelse inneholdende en om-rørerstav. Anisol ble tilsatt harpiksen til et volum på 1 ml pr. gram peptidharpiks under omrøring. Pentametylbenzen ble tilsatt reaksjonskaret inneholdende anisol og peptidharpiks i en mengde lik 50 mg pentametylenbenzen pr. gram peptidharpiks. Innholdet i karet ble avkjølt til ca. -70 °C. Hydrogenfluorid-gass ble deretter kondensert i reaksjonskaret til et volum på 10 ml pr. gram peptidharpiks. Temperaturen på reaksjonskaret ble hevet langsomt til ca. -15 °C under omrøring og ble opprettholdt under 0 °C hele tiden i 60 min eller lenger. Ved fullførelse av spaltingstrinnet og fjerning av beskyttende grupper ble alt hydrogenfluorid fordampet fra reaksjonskaret ved spyling med nitrogengass i ca. 1 time mens innholdet i karet ble opprettholdt under omrøringsbetingelser og ved en temperatur under 0 °C.

Det spaltede peptid ble oppløst i HPLC-kvalitetsvann og etyleter (vannfri) i et tilnærmet vann-til-eterforhold på 1:1,5 og ble filtrert gjennom en glassfrittetrakt for å fjerne den uløselige harpiks fra det frie peptid. Etter filtrering ble den vandige fase inneholdende det spaltede peptid oppsamlet og reekstrahert ytterligere to ganger med etyleter (vannfri). pH på den løselige, vandige peptidløsning ble justert til 6,5-7,5 med 2 M ammoniumbikarbonat. Den nøytraliserte løsning ble skallfryst og lyofilisert for å gjenvinne det urene peptid.

Reversfase-væskekromatografi med høy ytelse (RPHPLC) ble anvendt for rensing av det syntetiske peptid. Denne prose-dyre utnytter hydrofobisiteten av peptidsekvensen. Peptidet ble fylt på en kolonne under anvendelse av et vandig, polart løsningsmiddel for å sikre kolonnebinding. Peptidet ble effektivt renset ved utbytting av det polare, vandige løsningsmid-del med det av et ikke-polart, organisk løsningsmiddel under anvendelse av en lineær gradientløsning.

Cirka 6 g av det urene, lyofiliserte peptid ble opp-løst i ca. 100 ml HPLC-vann inneholdende 0,05 % TFA (buffer A) og ble filtrert gjennom Whatman nr. 1 filterpapir i en glass-kolbe. Den vandige løsning av urent peptid ble fylt på en 30 cm radial kompresjons-C-18-kolonne preekvilibrert med buffer A til en tilnærmet strømningshastighet på 30 ml/min. Etter oppfylling av urent peptid ble kolonnen spylt med ca.

50 ml buffer A til en tilnærmet strømningshastighet på

30 ml/min for å sikre peptidbinding til kolonnen. Peptid ble eluert ved økning av acetonitril til vanngradienten på fra 0 til 20 % i løpet av en 50 minutters periode. Rensingen ble fulgt ved overvåking av absorbans ved 210 nm. Peptidtopper ble oppsamlet manuelt ved 12-15 min og 34-38 min. Dette materialet var tilnærmet 80 % rent, som bestemt ved toppintegrasjon. Det halvrensede peptid ble skallfryst, lyofilisert og 3?agret i en eksikkator ved romtemperatur.

Det halvrensede peptid ble oppløst i buffer A til et tilnærmet volum på 100 ml pr. 900 mg peptid og ble filtrert gjennom et Whatman filterpapir nr. 1 i en egnet silikonbehand-let glassbeholder av egnet størrelse. Den vandige løsning av halvrenset peptid ble fylt på en 5,54 cm 30 cm radialkompre-sjons-, preekvilibrert kolonne i en mengde ekvivalent med 1 g delvis renset peptid pr. 350 g C-18-harpiks i en strømnings-hastighet på tilnærmet 30 ml/min. Kolonnen inneholdt 350 g 15 u C-18-harpiks. Kolonnestørrelsen var basert på mengden av peptid som skulle tilsettes. For rensinger i større målestokk ble en kolonne på 10,16 x 60 cm anvendt. Etter fylling av det halvrensede peptid på kolonnen ble kolonnen spylt med ca. 50-100 ml buffer A i en tilnærmet strømningshastighet på 30 ml/min for å sikre peptidbinding til kolonnen. Peptidet ble eluert ved økning av acetonitril til vanngradienten på fra 0 til 7 % over en 20 minutters periode under anvendelse av en strømningshastighet på ca. 30 ml/min. Isokratisk eluering til 7 % acetonitrilkonsentrasjon fortsatte i ca. 60 min, ved hvilket tidsrom peptidet var eluert. Fraksjoner ble oppsamlet ved 0,3 minutters intervaller. Rene fraksjoner ble oppsamlet og lyofilisert etter analytisk HPLC-analyse. Hver ansamling ble betraktet som en sats. 1 % av hver sats av renset peptid ble oppsamlet, samlet sammen og analysert ved omvendt fase-C-18-HPLC. Samlede prøver må utvise en renhetsprofil større enn 95 % med ingen urenhet større enn 1 %. Det rene peptid ble deretter koeluert med en standard som en prosesskontroll. De samlede peptidsatser ble oppløst i HPLC-kvalitetsvann og filtrert gjennom et Whatman filterpapir nr. 1. Utbyttet av syntesen ble beregnet. Den store blanding av oppsamlet peptid ble fryst, lyofilisert, veid og lagret i en eksikkator ved romtemperatur inntil den ble anvendt i sluttproduktfremstilling.

Det rensede peptid ble analysert under anvendelse av en kvantitativ aminosyreanalyse (tabell II), aminoterminal sekvensanalyse (tabell III) og massespektroskopi ved hurtig atombombardement (FAB-MS). Alle resultatene var i overensstem-melse med den forventede struktur av peptidet. Molekylærionet fra fire (FAB-MS) analyser var 1913,2 ± 0,5, meget nær den teoretiske verdi på 1913,5.

Eksempel II

Fremstilling av peptid- hvaluronsvrekoniugat

Konjugater ble fremstilt ved blanding av en løsning av hyaluronsyre (bakterielt avledet; Genzyme, Boston, MA), bufret i fosfatbufret saltvann, med koblingsmidlet l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid i en konsentrasjon på 0,07 M i 30 min. Etter dette tidsrom ble peptidet ifølge eksempel I tilsatt til en vekt lik den av hyaluronatet. Denne blanding ble ristet over natten, hvoretter produktet ble renset ved dialyse og utfelling med 3 volumer aceton eller etanol. Typiske fremstillinger bestod av et konjugat inneholdende mellom 20 og 30 vekt% peptid. Tilsetning av sterilt, fosfatbufret saltvann resulterer i klare løsninger hvis viskositet kan justeres ved tilsetning av ukoblet hyaluronat.

For å separere fritt peptid fra konjugat, ble dialyse utført under anvendelse av standard dialysemembraner med en nominell molekylvektavkutting på 8-14.000. 100 ml prøve (med startkonsentrasjon av HA og peptid til 4 mg/ml) ble dialysert mot 2 1 fosfatbufret saltvann, pH 7,4, med bufferforandringer tre ganger daglig i totalt 50 timer. Peptidet ble analysert ved standard proteinbestemmelse (BCA-bestemmelse, Pierce Chemical, Rockford, IL), og l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-urea (EDU) ble undersøkt under anvendelse av aminosyreanalyse.

Som vist i tabell IV ble et lavmolekylært biprodukt (EDU) av koblingsprosedyren dialysert bort fra konjugatet mens peptidet forblir med konjugatet. Det skal bemerkes at beting-elsene viser det dobbelte av normal koblingsprosedyre. Mengden av peptid gjenværende var 20-30 % av utgangsmaterialet. Da man startet med like mengder, var peptidet 20-30 % av mengden av hyaluronat i sluttproduktet.

Eksempel III

Fremstilling av et chondroitinsulfatkonjugat

Peptidet ifølge eksempel I ble konjugert til chon-droitinsulf at ved blanding av chondroitinsulfat (Hepar Indu-stries, Inc., Franklin, OH) til 100 mg/ml i vann med l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC) til 70 mM i 30 min, etterfulgt av tilsetning av peptidet ifølge eksempel I til 10 mg/ml og risting over natten ved romtemperatur. Konjugater ble deretter utfelt ved tilsetning av NaCl til 1 % og 3 volumer aceton, etterfulgt av sentrifugering i 5 min ved 2000 x G. Konjugatet ble deretter tørket under vakuum og resuspendert i fosfatbufret saltvann til 100 mg/ml. Typisk peptidinkorporering var 74 mg peptid/g konjugat. Chondroitin-sulf atkonjugat resulterte i binding til et nivå på 700-1000 celler/mg konjugat, bestemt som beskrevet i eksempel IV.

Eksempel IV

Produksjon av peptidkonjugater med forskjellige biopolvmerer

Peptidet som fremstilt i eksempel I ble konjugert til potetstivelse under anvendelse av cyanogenbromidaktiverings-metoden som følger: 25 mg CNBr ble oppløst i 20 ml H20. pH ble raskt hevet til pH 11 med 1 N NaOH, ved hvilket tidspunkt 500 mg potetstivelse (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) ble tilsatt. pH ble opprettholdt ved 11 i 3, 6 eller 12 min (ved tilsetning av ytterligere NaOH og med konstant omrøring), ved hvilket tidspunkt stivelsen ble oppsamlet på filterpapir (Whatman nr. 2) og vasket med kaldt vann og aceton. 200 mg av disse aktiverte prøver ble tilsatt 10 ml koblingsbuffer (0,2 M natriumbikarbonat, pH 9,5) inneholdende 20 mg av peptidet YAVTGRGDSPASSKPISNYRTELLDKPSQM og ble omrørt over natten i kulden. Om morgenen ble konjugatene samlet på Whatman filterpapir nr. 2, ble vasket med koblingsbuffer, 0,01 N HC1, 1 M NaCl og gradert vann/aceton (80 %, 60 %, 40 %, 20 %) og deretter aceton. Peptidinkorporering ble undersøkt ved ninhydrin-bestemmelsen. Utbyttet var ca. 10 mg peptid inkorporert/g stivelse.

Alternativt ble peptidet konjugert til potetstivelse under anvendelse av disykloheksylkarbodiimid (DCC)-aktivering. 0,2 g potetstivelse ble suspendert i 6 ml dioksan, 100 ug DCC ble tilsatt, og blandingen ble ristet i 30 min. Stivelsen ble deretter oppsamlet på et fritteglassfilter og ble vasket med dioksan. Etter lufttørking ble den tilsatt 8 ml 1 M Na2C03, pH 10. 1,2 mg peptid ble tilsatt, og blandingen ble ristet over natten ved 4 °C. Om morgenen ble konjugater oppsamlet ved filtrering, ble vasket med vann, 1 M NaCl, vann og gradert aceton/vann som tidligere. Peptidinkorporeringen ble bestemt ved ninhydrin. Typiske utbytter var 3-4 mg peptid inkorporert/g potetstivelse.

Peptidet ble også konjugert til agarose (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD), slik som ved den ovenfor angitte disykloheksylkarbodiimidaktiveringsmetode, under anvendelse av 40 ug DDC i stedet for 100 ug DDC.

Et peptid fremstilt ved metoden ifølge eksempel I ble konjugert til "Sepharose" i henhold til en modifikasjon av metoden ifølge Pierschbacher og Ruoslahti (Nature, 309:30-33

(1984), som er inkorporert herved ved referanse). 50 mg "Sepharose" i 7,5 ml 1 M Na2C03 ble aktivert med 20 mg CNBr i 10 min. Etter oppsamling og vasking ble prøvene resuspendert i 5 ml 1 M Na2C03 og ristet med 1 mg av peptidet GRGDSPK over natten i kulden. Konjugatene ble deretter oppsamlet og vasket som tidligere, og peptidinkorporeringen ble bestemt ved BCA-proteinbestemmelse (Pierce Chemical Co.) under anvendelse av peptid som standard. Inkorporeringen var ved et nivå på

5 mg/ml perler.

Disse konjugater ble testet med hensyn til cellebinding ved immobilisering av disse på vevskulturplast belagt med 100 ug/ml kaninimmunoglobulin G. Dette ble foretatt ved tilsetning av konjugatet til brønnen, etterfulgt av tilsetning av konsentrert l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimid (EDC) for å koble konjugatet til proteinbelegget. Etter 4 timer ble brønnene vasket, og cellene (normale rottenyre-celler til 2 x 10<5>/ml) ble tilsatt og inkubert i 1 time ved 37 °C. Etter festing og beising ble cellebindingen bestemt.

Alle konjugater utviste peptidavhengig cellebinding, det var ingen eller liten cellebinding til biopolymeren alene, men signifikant cellebinding til peptid-biopolymerkonjugatet. Potetstivelseskonjugatene resulterte i binding på ca.

150 celler/mg konjugert stivelsesgel.

Eksempel V

Måling av sårstvrke oa legning etter behandling med peptid-hyaluronatkon i ugater

Voksne Wistar-Firth-hannrotter (175-250 g) ble bedøvd ved intraperitoneal injeksjon av pentobarbital (60 mg/kg kroppsvekt). Rottenes ryggområde ble tett barbert, og hvert dyr ble anbrakt og festet for kirurgi. Under anvendelse av aseptisk teknikk ble hudinnsnitt i hudens fulle tykkelse,

1,5 cm lange, foretatt på ryggområdet. Hvert innsnitt ble behandlet med 0,05-0,10 ml av en blindprøve av peptidet, RRRRRRGDSPK-konjugert til hyaluronat eller med 0,05-0,10 ml humant fibronektin (3 mg/ml i PBS, Collaborative Research, Bedford, MA) eller rottefibronektin (2 mg/ml i PBS, Telios Pharmaceuticals, Inc., San Diego, CA) eller forble ubehandlet som kontroll. Etter behandling ble innsnittene lukket med standard 4-0 nylonsuturer for anbringelse av 5-7 atskilte suturer. Rottene ble brakt tilbake til deres bur for rekon-valesens og observasjon. Ved postoperative dager 2-7 og 10 ble dyrene bedøvd som ovenfor angitt og ble eutanasert med en intrahjerteinjeksjon på 0,5 cm<3> T-61.

Etter eutanasi ble skinnet fjernet fra rotten og 5 mm brede og 2 cm lange hudremsehalverende innsnitt ble foretatt. Histologiske prøver fra huden nær strekkstyrkeremsen ble også tatt for å måle strekkstyrke, og en ende av remsen ble klemt under anvendelse av en 1 mm Michel Clipper (Militex Instruments Co. ) som ble bundet til en kraftfortrengningstransduk-tor, Grass-modell FT03C. Den andre enden av remsen ble klemt under anvendelse av en lettvektshemostat som var festet til en "skyv-trekk"-infusjonspumpe av Harvard-modell 901 (Harvard Instruments, Millis, Mass.) under anvendelse av en bomullstråd over en trinse. Transduktoren var festet til en Grass-polygraf (modell 7D) for nedtegnelse av resultatene. Etter kalibrering ble pumpen innstilt til å trekke i en hastighet på 64 mm/min. Mengden av kraft som var nødvendig for å trekke huden bort ved innsnittet, ble nedtegnet på polygrafen. Resultatene er vist i figurene 1 og 2. Som disse figurer viser, ble sårstyrken økt ved anvendelse av konjugatene for dagene 3-7 etter innsnitt, hvor den maksimale effekt kan ses ved dag 5 hvor de konjugat-behandlede sår oppnådde 211 % av styrken av de ubehandlede

sår.

Eksempel VI

Testing av peptid- hyaluronatkonjuqater i en polwinylalkohol-svampimplantatmodell

Peptid-hyaluronatkonjugater ble testet under anvendelse av modellen ifølge Davidson et al., J. Cell Biol., 100:1219-1227 (1985), som er inkorporert herved ved referanse. Denne modellen innbefatter implantasjon av inerte PVA-svamper fylt med konjugatene eller kontrollmaterialer under huden på rotter. Svampene ble fjernet fra dyrene 4-10 dager etter implantasjon og analysert med hensyn til celleinnveksttall og type og kollageninnhold, blodkardannelse (angiogenesis) og inflammatorisk respons, så vel som bibeholdelsen av konjugatet i såret. Resultatet av disse studier indikerte: A. Svamper inneholdende hyaluronat konjugert med peptidet R6GDSPK ved metoden ifølge eksempel II, ga opphav til forøkt angiogenesis, kollagenutskillelse og fibroblastmigrer-ing ved tidlige tidspunkter, og hvor effekten avtok ved senere tidspunkter slik at svampen syntes å være lik kontrollsvampene etter avslutning av forsøket, bortsett fra at mer kollagen var kontinuerlig blitt avsatt i svampene fylt med hyaluronat-peptidkonj ugater.

B. Hyaluronatkonjugater forsvant langsomt fra svampen med markert mindre konjugat tilstedeværende 14 dager etter implantasjon.

Eksempel VII

Testing av peptid- hvaluronatkoniugater i rottedermale innsnitt

Metoden ifølge eksempel V ble anvendt for å teste hvorvidt konjugater under anvendelse av peptidet G(dR)5G3(dR)-GDSPASSK (som ble funnet å ha mer aktivitet enn RGDSPK-peptidkonjugatet testet i eksempel V i in vitro-bestemmelser av typen beskrevet i Pierschbacher et al., Nati. Acad. Sei., 80:1224-1227 (1983)) også hadde overlegen aktivitet in vlvo. Som det fremgår fra figurene 3 og 4, utviste konjugater av dette peptid tidligere aktivitet (nådde 160 % av kontrollen på dag 2) og vedvarende aktivitet (opprettholdt aktivitet større

enn kontrollen i dag 10).

En blanding av hyaluronat og peptid (dannet ved blanding av like mengder av hyaluronsyre og peptid) ble testet 1 en sårstyrkemodell under anvendelse av den ovenfor angitte protokoll. Ved dag 4, punktet for maksimal aktivitet av konjugatet, var aktiviteten av blandingen 100,8 % av kontrollen, den av konjugatet var 125 % av kontrollen. Som det kan ses fra dataene, utviste blandingen ingen sårlegende aktivitet.

Eksempel VIII

Behandling av tort øye- syndrom med chondroitinsulfat- peptid-koniugater

Tørt øye-tilstand ble fremkalt i seks katter på dag 0 ved utskjæring av tåretraktene og blinkmembranene fra øyet. Kattene ble oppdelt i fire grupper og ble behandlet som følger: Gruppe 1 ble behandlet med to dråper humant fibronektin, 3 mg/ml to ganger pr. dag fra dag 17 til dag 34, og to dråper pr. dag tre ganger daglig fra dag 34 til dag 43. Gruppe 2 ble behandlet med to dråper chondroitinsulfat-peptidkonjugat, G(dR)5G3(dR)GDSPASSK, 100 mg/ml, to ganger pr. dag fra dag 17 til dag 34, og to dråper pr. dag tre ganger pr. dag fra dag 34 til dag 43. Gruppe 3 ble behandlet med fosfatbufret saltvann, to dråper to ganger pr. dag. Gruppe 4 ble behandlet. Øyne ble undersøkt ved avtrykkscytologi hvori et avtrykk av overflaten av øyet foretas ved anbringelse av en polymer på øyeoverflaten og cellene klebet til overflaten undersøkt mikroskopisk, og ved beising av øyet med bengalsk rose, en rødaktig beis som selektivt beiser den eksponerte matriks og underliggende basalepitelceller, men som ikke beiser uskadet hornhinneepitel.

Katter i gruppe 1 og 2, behandlet med fibronektin eller peptidkonjugat, utviste markert reduksjon av tørt øye-tilstand. Katter behandlet med fosfatbufret saltvann alene og ubehandlede katter viste ingen forandring i øyetilstanden over den viste tid.

Eksempel IX

Behandling av epidermale sår

Tre unge, spesifikke patogenfrie (SPF) griser som veide 20-25 kg ble kondisjonert i 2 uker før eksperimentering. Dyrene mottok vann og en basaldiett uten antibiotika (Purina Control Factor) ad 11b. og ble rommet individuelt eller i søkerens dyrefasiliteter (som oppfyller American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care [AAALAC]-kravene) med kontrollert temperatur (19-21 °C) og lys og mørke (12 timer/12 timer LD).

Forsøksdyrene ble klemt med standard dyreklemmer. Huden på ryggen og begge sider av dyret ble preparert for sårdannelse ved vasking med en ikke-antibiotisk såpe ("Neutro-gena").

På dagen for sårdannelse (dag 0) ble grisene bedøvd med ketamin (i.m.) og inhalering av halotan-, oksygen- og nitrogenoksidkombinasjon. Fem spesielt konstruerte, sylind-riske messingstaver som veide 358 g hver ble oppvarmet i et kokende vannbad til 100 °C. En stav ble fjernet fra vannbadet og avstrøket før den ble påført hudoverflaten for å forhindre at vanndråper fra den dannede damp brant huden. Messingstaven ble holdt i en vertikal posisjon på huden med alt trykk til-ført ved hjelp av tyngden, i 6 sekunder, for å fremkalle et brannsår på 8,5 mm i diameter x 0,6 mm i dybde. Umiddelbart etter brenning ble toppen på brannblemmen fjernet med en steril spatel. Brannsårene ble foretatt ca. 2 cm fra hver-andre. Hyaluronsyre alene ble anvendt som kontroll. Peptid-hyaluronsyrekonjugat ble fremstilt (bakterielt avledet; Genzyme) ved metoden ifølge eksempel II. Sårene ble behandlet med eller uten "Tegaderm" (3M; St. Paul, MN), en okklusiv bandasje som forhindrer luftsirkulasjon.

Sårene på tre dyr ble oppdelt i tre behandlings-grupper og behandlet som følger:

Cirka 110-120 brannsår ble foretatt på den fremre 2/3 av dyret. Den bakre tredjedel av dyret ble ikke anvendt på grunn av anatomiske forskjeller resulterende i mer hurtig legning av de fremre sår.

Brannsårene ble behandlet én gang med tilstrekkelig materiale for å dekke såret (ca. 0,1 ml) umiddelbart etter sårdannelse. Peptidkonjugatet og hyaluronat (bærer) ble belagt med "Tegaderm"-bandasje. Dyrene ble omviklet med "Coban" klebende bandasje (Johnson og Johnson, New Brunswick, NJ) for å sikre at sårbehandlingsmaterialet var på plass. Sårbehand-lingsmaterialene ble holdt på plass gjennom hele forsøket.

På dagene 7-15 ble fem brannsår fra hver behandlings-gruppe kirurgisk skåret ut under anvendelse av elektrokeratom (0,6 mm dypt). Enhver prøve som ble utskåret, men som ikke var intakt, ble kastet. De utskårne brannsår og den omgivende normale hud ble inkubert i 0,5 M NaBr i 24 timer ved 37 °C (figur 4). Etter inkubering ble prøvene separert i epidermale og dermale ark. Epidermis ble deretter undersøkt mikroskopisk for defekter i området for brannsårene. Epitelialisering ble betraktet som fullført hvis ingen defekter var tilstedeværende (leget); og enhver defekt i brannområdet indikerer at legning er ufullstendig. Det epidermale ark ble anbrakt på en papplate for permanent nedtegning.

Antall legende sår (epitelialiserte) ble dividert med totalt antall sårprøver pr. dag og multiplisert med 100, som vist i tabell I.

På dag 9 etter sårdannelse var de peptid-hyaluronat-konjugatbehandlede sår 90 % epitelialisert sammenlignet med de lufteksponerte, hyaluronat- og kontrollbehandlede sår, 0 %,

10 % og 70 % respektive, som indikerer at peptid-hyaluronat-

konjugatet aktiverer sårlegning.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en syntetisk ekstracellulær matriks bestående av: a) et ikke-naturlig forekommende syntetisk peptid inneholdende aminosyresekvensen Y-Gly-Asp, hvori Y er R eller dR, og med færre enn 30 aminosyrer; og b) en bionedbrytbar polymer utvalgt fra hyaluronsyre, chondroitinsulfat, heparin, heparansulfat, polylaktat og polyglykolsyre; hvor den syntetiske ekstracellulære matriks, som ikke er et fast støttemateriale, fremmer cellebinding og migrering og hvori den bionedbrytbare polymer er bundet til peptidet uten vesentlig å redusere den cellebindingsfremmende aktivitet av peptidet; karakterisert ved at aminosyrekjedene eller terminalene av peptidet bindes til en karboksylamino- eller sulfhydrylgruppe på den bionedbrytbare polymer ved hjelp av et tverrbindings-/koblingsmiddel utvalgt fra l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl )karbodiimid (EDC), disykloheksylkarbodiimid, glutaraldehyd, cyanogenbromid og N-hydroksyravsyreimid, idet den bionedbrytbare polymer blandes i en bufferløsning med koblingsmidlet og peptidet under egnede betingelser og tilstrekkelig tid til at koblingen finner sted, etterfulgt av rensing av den således erholdte syntetiske, ekstracellulære matriks.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et syntetisk peptid som ytterligere omfatter minst én gruppe av minst tre identifiserte aminosyrer i sekvens valgt fra K, dK, R, dR, ornitin eller D-ornitin.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et peptid som har aminosyren Lysin (K) ved dets C-terminal.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et peptid valgt fra: og polypeptider inneholdende hvilke som helst av de ovenfor angitte sekvenser.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som bionedbrytbar polymer anvendes hyaluronsyre.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som bionedbrytbar polymer anvendes chondroitinsulfat.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det som tverrbindings-/koblingsmiddel anvendes l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbo-diimid.

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et peptid med aminosyresekvensen og en bionedbrytbar polymer som er chondroitinsulfat.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes et peptid med aminosyresekvensen og en bionedbrytbar polymer som er hyaluronsyre.