NO168989B - Fremgangsmaate for aa oeke loeseligheten av f. eks. immunokonjugatpreparater - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelsen av amfipatiske molekyler generelt, og mer spesifikt anvendelsen av amfipatiske molekyler, slik som anioniske syntetiske vaskemidler, for å øke løseligheten av immunokonjugater av toksiner, radio-isotoper og medisiner, og for å minske det ikke spesifikke opptak av monoklonale antistoffer, enten konjugerte eller ukonjugerte.

Anvendelsen av monoklonale antistoffer som mål- eller over-leveringsbærere har i de senere år frembragt en tilsynekomst av en rekke nye anticanserstrategier. Blant disse strategier er seroterapi som bruker ukonjugerte antistoffer såvel som konjugering av antistoffer med radio-isotoper, medisiner eller toksiner, hvilket resulterer i det som er kjent som "immunokonjugater". Det er flere fremgangsmåter for å koble disse stoffer til antistoffer; én som er vanlig brukt f.eks. for toksiner, involverer innføring av disulfidgrupper i antistoffet og sulfhy-drylgrupper i toksinet fulgt av dannelse av en kovalent disulfidbinding, for å danne et "immunotoksin". Disse modifikasjoner øker vanligvis hydrofobisiteten av konjugatene og fremmer deres aggregering og til og med presipitering. Til tross for forsøk på å kontrollere graden av substitusjon av antistoff, er konjugatene ofte ustabile under lagring og presipiterer spontant, hvilket resulterer i minsket potens, stabilitet og terapeutisk effektivitet. Tradisjonelt var den eneste måten å kontrollere løseligheten av immunokonjugatet å kontrollere graden av substitusjon av den hetérobifunksjonelle ligand. Denne teknikk har imidlertid den hovedulempe at den også begrenser mengden av toksin som kan konjugeres til antistoffet, og er ikke pålitelig i substitusjonen av funksjonelle grupper, slik som lycin, i både antistoff og toksin. I tillegg er noen ukonjugerte antistoffer, slik som antistoffer av IgG^-underklassen, svakt løse-lige etter at de er renset fra enten ascites eller brukt kulturmedium. Som et isolert antistoffpreparat kan de spontant presipitere under lagring ved 4°C eller ved rekonstituering fra -70°C. Denne underklasse av antistoff ville så produsere høyt uløselige og ustabile immunotoksiner. Selv om det er mange forskjellige fremgangsmåter for binding av medisiner, isotoper og toksiner til antistoffer, har de fleste lignende problemer med løselig-het .

Et videre problem eksisterer i fremstillingen av immuno-toksinkonjugater. For eksempel omfatter de mest vanlig brukte toksiner to polypeptidkjeder, betegnet A og B, som er bundet sammen med en disulfidbinding. Toksinene binder seg via et gjenkjenningssted på B-kjeden til reseptorer på celle-overflaten, og A-kjeden trenger så igjennom (eller blir translokert over) celle-membranen inn i cytosolen, hvor den inhiberer proteinsyn-tese. Mens de fleste immunotoksiner konstrueres ved å bruke A-kjeden alene bundet til spesifikke antistoffer, har anvendelsen av intakt toksin til immunotoksinpreparater en rekke potensielle fordeler. Intakte toksinkonjugater har typisk en høyere potens enn konjugatpreparater laget med A-kjeden alene. Dette er fordi B-kjeden utgjør en vital rolle i internalisering av immunotoksin, en begrensende faktor for immunokonjugatpotens.

I det vesentlige overføres økt internalisering til økt potens.

I tillegg er fremstilling av immunotoksiner mer vanskelig hvis man må separere A-kjede fra B-kjede før man prøver å fremstille konjugatet. Dette involverer typisk et affinitets-rensingstrinn og et trinn hvor bindingen mellom A-kjede og B-kjede reduseres for å spalte den intermolekulære disulfidbinding. Tilnærminger for å lage intakte toksinpreparater som kunne bevare selektiv potens mot antigen-positive celler, er blitt begrenset. Thorpe et al..(Immun. Rev. 62: 119 - 158,.1982) demonstrerte at selek-tive immunokonjugater kan dannes med intakt toksin konjugert med antistoff. Ved ganske enkelt å konjugere intakt toksin via N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP) til antistoff, har en viss prosent av immunotoksin-molekylene utelukket B-kjeder som ikke kan binde seg til karbohydrat og derfor ikke kan formidle toksisitet til ikke-antigen-bærende tumorceller eller normale celler. Konjugatmolekyler med B-kjeder som fortsatt bevarer evnen til å binde seg til karbohydrat, kan fjernes ved affinitetskromatografi. Imidlertid, selv etter utrensning, har noen immunotoksinpreparater fortsatt ofte en høy grad av ikke-spesifisitet og toksisitet. Grunnen til dette er uklar.

I tillegg til problemene med løselighet og toksisitet av immunokonjugater har ikke-spesifikt opptak av de monoklonale antistoffer og deres konjugater inn i de reticulo-endoteliale system (RES) organer, f.eks. lunge, lever, milt og benmarg.begrenset deres potensielle effektivitet og minsket deres terapeutiske indeks når anvendt in vivo. RES-elementer er også til stede i mange andre vev, inkludert lymfeknuter, tonsiller og tarmer. Fc-reseptorer kan stå for en hoveddel av det ikke-spesifikke opptak av monoklonale antistoffer og deres konjugater inn i RES-organene. Andre systemer slik som C3b-eller C3d-reseptorer, immunkompleks-reseptorer og karbohydrat eller glyko-proteinreseptorer, kan også delta i ikke-spesifikt opptak av antistoff. Som allerede demonstrert, binder reseptorer for karbohydrat også rester på toksinmolekylet, som kan fremme ikke-spesif ikt opptak av immunokonjugatet.

For tiden er enzymatisk fragmentering av antistoff standardteknikken for å minske Fc-reseptorformidlet opptak. Imidlertid har denne fremgangsmåte flere ulemper for både radio-merkede antistoffpreparater og immunokonjugatpreparater. For det første er enzymatisk spaltning av Fc-delen av antistoffet en prosess, dvs. fra et regulatorisk og kvalitetskontroll-syns-punkt, som er vanskelig å utføre siden man må teste for resten-zym i antistoffpreparater. For det andre er det blitt godt dokumentert at F(ab1)^- tragmenter har økte nedbrytningshastig-heter sammenlignet med intakte antistoffer, og for det tredje kan anvendelse av et F(ab)<1> eller Fab (monovalent fragment av antistoff) ha en tilleggsulempe i at affiniteten for antigenet er sterkt redusert pga. det faktum at antistoffet binder seg via bare ett bindingssted. I tillegg er ligandsubstitusjon på fragmenter av antistoff mer begrenset enn med helt antistoff

og øker sannsynligheten for substitusjon inn i det antigenkombi-nerende sted som ville minke fragmentets immunoreaktivitet. Det har vært få studier som har demonstrert en varig økning i tumoropptak eller en minskning i RES-organakkumulering med fragmenter sammenlignet med intakt antistoff.

Et annet problem som ofte påtreffes med rensede preparater av monoklonalt antistoff, er endotoksin-kontaminering. Endotoksin renses i noen tilfeller sammen med antistoffet og viser seg således å være bundet til det monoklonale antistoff. Konven-sjonelle affinitetsprosedyrer for å isolere endotoksin fra antistoffet i disse tilfeller, er ikke vellykkede, fordi fjerning av endotoksinet også fjerner antistoffet. Således kan disse kontaminerte antistoffpreparater ikke anvendes i pasienter fordi endotoksinet forårsaker feber og til og med sjokk.

Følgelig er det et behov på fagområdet for (a) et mer effektivt middel for å øke løseligheten av immunokonjugater etter tilsetning av linkere eller cyto-toksiner til antistoffer; (b) en fremgangsmåte for i det vesentlige å inhibere opptak av antistoff og antistoffkonjugater på Fc og andre reseptorer,

og således inn i RES-organene; (c) en fremgangsmåte for å redusere toksisiteten av intakte toksin-immunokonjugater; og (d) en fremgangsmåte for å redusere nivåene av endotoksinkontamine-rende antistoffpreparater uten signifikant å påvirke utvinningen av antistoff. Den foreliggende oppfinnelse oppfyller disse behov og gir videre andre,beslektede fordeler.

I korte trekk vedrører den foreliggende oppfinnelse fremgangsmåter for å eke løseligheten av immunkonjugatpreparater og for å redusere opptaket av antistoff (enten konjugert eller ukonjugert) i RES-organene via reseptorformidlede mekanismer, gjennom anvendelse av amfipatiske molekyler, slik som anioniske syntetiske vaskemidler.

Mer spesielt vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å øke løseligheten av et immunokonjugat-preparat, eller et ukonjugert immunoglobulin-preparat, uten vesentlig å

innvirke på immunoreaktiviteten til preparatet, og fremgangsmåten er karakterisert ved at den omfatter å inkubere immunokonjugat-preparatet eller immunoglobulin-preparatet i 30-60 min. ved 25-37 °C med molekyler av anionisk syntetisk vaskemiddel i en konsentrasjon av mellom 0,01 og 1 vekt/volum%; og å fjerne i

det vesentlige ethvert ikke-antistoffbundet anionisk vaskemiddel.

I en foretrukken utførelsesform av oppfinnelsen tilhører immunokonjugatpreparatet eller immunoglobulinpreparatet underklassen IgG3.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen kan benyttes til å redusere bindingen av antistoff til reseptorer, inkludert inkubering av antistoffer med amfipatiske molekyler, slik som et anionisk, syntetisk vaskemiddel, i en mengde som er tilstrekkelig til å redusere bindingen av antistoffet til reseptorer uten å forandre dets binding til målantigen.

Videre kan fremgangsmåten benyttes til å redusere toksisiteten av intakte toksinkonjugater, inkludert inkubering av toksinkonjugatet med amfipatiske molekyler, slik som et anionisk, syntetisk vaskemiddel i en mengde som er tilstrekkelig til å redusere toksisiteten av det intakte toksinkonjugat.

Fremgangsmåten kan også benyttes til å redusere nivået av endotoksin i monoklonale antistoffpreparater, inkludert inkubering av det monoklonale antistoffpreparat med amfipatiske molekyler, slik som et anionisk, syntetisk vaskemiddel, i en mengde som er tilstrekkelig til å redusere nivået av endotoksin i preparatet.

Andre anvendelser av fremgangsmåten vil fremkomme ved referanse til den følgende detaljerte beskrivelse og vedlagte tegning.

Figuren viser flow cytometri-profiler av behandlede, ubehandlede og F(åb')^- i.ragmenter av et monoklonalt antistoff 9.2.27 mot et humant melanomassosiert antigen og deres binding til Fc-reseptorer på human perifere monocytter.

Før man fremsetter oppfinnelsen kan det være til hjelp

for en forståelse av denne å fremsette definisjoner av noen betegnelser som brukes heretter.

Immunokonjugat: Et kovalent konjugat av et monoklonalt eller polyklonalt antistoff sammen med et plante-, sopp- eller bak-terietoksin eller en A-kjede av disse, et ribosomalt inaktive-rende protein, en medisin direkte bundet eller indirekte bundet gjennom et bærermolekyl til antistoff, en ligand for radio-isotoper, en biologisk responsomformer som indirekte eller direkte kan aktivere cytotoksiske mekanismer eller andre cytotoksiske stoffer.

Anionisk syntetisk vaskemiddel: Et negativt ladet vaskemiddel med en ikke-polar hydrokarbonende som er løselig i olje, lipid eller organiske løsningsmidler, og en polar ende som er løselig i vandige løsninger, eller et lignende amfipatisk molekyl.

Forestillingen om målrettet spesifikk cellelysis ved antistoffer mot tumorer ved passiv immunoterapi har dannet inter-resse i nesten et århundre. Imidlertid har antistoffers kapa-sitet til å ødelegge tumorer i dyr eller menneske alltid vært begrenset. Som et resultat har en rekke forsøk vært gjort for å gjøre effektorfunksjonen av antistoffer mer potent ved å

feste anticanserstoffer til disse antistoffer, først beskrevet

av Mathé et al. (CR. Acad. Sei. (Paris) 246: 1626, 1958); toksiner som initiert av Moolten og Cooperband (Science 169: 68, 1970); og radio-isotoper eller enzymer (Ghose et al., Ann. N.Y. Acad. Sei. 277: 671, 1976; Ghose og Blair, J. Nati. Cancer Inst. 61: 657, 1978). Høyere potens er imidlertid bare fordel-aktig for tumorterapi hvis den er spesifikk for målvevet, i den mening at det toksiske stoff konjugert med antistoff forblir inaktivt under transport i kroppen og blir aktivert bare etter binding av antistoffet til målcellene.

Mens det har vært gjort signifikant fremgang mot på en vellykket måte å angripe tumorceller gjennom anvendelse av cytotoksiske stoffer kovalent bundet til spesifikke antistoffer, (Jansen et al., Immun. Rev. 62: 186, 1982; Thorpe og Ross,

Immun. Rev. 62: 119, 1982), er den terapeutiske anvendelse

av immunokonjugater fortsatt problematisk. For eksempel, mens anvendelse av intakte toksiner krever mindre manipulering av toksinmolekylet og gir økt potens mot målcelle, har ikke-spesifikk binding av B-kjeden av toksinet, gjennom antatte hydrofobe områder, hittil gjort in vivo-leveringen av intakte toksinkonjugater som ikke kan brukes til alle antistoffer. Dette sistnevnte problem kan være en funksjon av antistoffet anvendt til konjugering, siden noen forskere rapporterer om toksiske intakte toksinkonjugater mens andre rapporterer om ikke-toksiske. Under oppfinnelsens hender danner et antistoff, 9.2.27 { y 2a underklasse) ikke-toksiske konjugater med intakt abrin, mens D3 Mab (y1 underklasse) mot det L10 hepatocellulære carcinom danner konjugater med intakt abrin som er høyt toksiske for normale vev. Denne toksisitet kan oppheves med SDS. Mens B-kjeden kan fjernes, og A-kjeden alene bindes til monoklonale antistoffer, resulterer fravær av B-kjede vanligvis i minsket potens av immunotoksinet.

Som nevnt ovenfor er det flere andre problemer i in-vivo-anvendelsen av immunokonjugater, inkludert det ikke-spesifikke opptak av antistoffer i RES-organene via andre former for binding, slik som til Fc-reseptorer, og tendensen til at immunokonjugater under lagring mister løselighet og presipiteres spontant, hvilket resulterer i minsket potens og terapeutisk effektivitet. Gjennom anvendelse av amfipatiske molekyler, slik som anioniske syntetiske vaskemidler, bedrer imidlertid den foreliggende

oppfinnelse de forannevnte problemer på en effektiv måte.

I den foreliggende oppfinnelse brukes amfipatiske molekyler, slik som anioniske, syntetiske vaskemidler til (a) å øke løseligheten av immunokonjugatpreparater; (b) å øke løselighe-ten av ukonjugerte iromunoglobulinpreparater; (c) å redusere bindingen av antistoff til Fc-reseptorer; (d) å redusere toksisiteten av intakte toksinkonjugater; og (e) redusere nivået av endotoksin i monoklonale antistoffpreparater.

Innen den foreliggende oppfinnelse kan en rekke anioniske syntetiske vaskemidler anvendes, inkludert natriumdodecylsulfat (natriumlaurylsulfat), cetylammoniumsulfat og taurokolsyre.

En spesielt foretrukket anionisk syntetisk vaskemiddel er na-triumdodecylsulf at (SDS). En liste over andre anioniske syntetiske vaskemidler som kan være egnet innen den foreliggende oppfinnelse, er funnet i McCutcheon<1>s Emulsifiers and Deter-gents, MC Publishing, Glen Rock, New Jersey. Anioniske, syntetiske vaskemidler er generelt karakterisert ved en stor ikke-polar hydrokarbonende og en polar ende, slik som SDS, som har den generelle strukturelle formel:

Anioniske, syntetiske vaskemidler, slik som SDS, antas

å binde seg både til positivt ladede grupper (dvs. y aminogrup-per av lysiner) og til de hydrofobe områder av proteiner. Det er sannsynligvis disse hydrofobe områder som er spesielt ansvar-lige for ikke-spesifikk binding av B-kjeden til ikke-antigen positive celler eller for binding av antistoffer til Fc-reseptorer .

Videre bidrar økt hydrofobisitet forårsaket av konjugering, til aggregering og presipitering av det resulterende immu-nokon jugat. SDS reduserer sannsynligvis, gjennom dets interak-sjon med hydrofobe områder, selvassosiering av molekylet, og minsker derved aggregering av preparatet.

Innen hver av fremgangsmåtene beskrevet ovenfor, er det nødvendig å inkubere antistoffpreparatet med et amfipatisk molekyl, slik som et anionisk, syntetisk vaskemiddel for å oppnå det ønskede resultat. En foretrukket vaskemiddelkonsen-trasjon er mellom 0,01% og 1% i vekt til volum. I tillegg er inkuberingsbetingelser på ca. romtemperatur (25°C) eller 37°C i 30 - 60 minutter foretrukket. Spesielt foretrukne tids-og temperaturkombinasjoner inkluderer inkubering ved 37°C i ca. 30 minutter og inkubering ved 25°C i en periode på ca. 1 time. Det er også foretrukket å fjerne ikke-antistoffbundet anionisk syntetisk vaskemiddel slik som ved krystallisering ved 4°C, ved gelfiltrering eller ved passasje over albumin-sefarose. Den sistnevnte fremgangsmåte er den mest effektive ved separe-ring av fri SDS fra det som er bundet til antistoff, med >90% utvinning av antistoff.

De foretrukne fremgangsmåter for å øke løseligheten av immunokonjugatpreparater og å redusere ikke-spesifikt opptak i RES-organer, er de som initieres etter binding av antistoff og cytotoksin. Som nevnt ovenfor involverer disse fremgangsmåter inkubering av immunokonjugatet med et anionisk, syntetisk vaskemiddel ved en konsentrasjon mellom 0,01 og 1 vekt/vol% SDS. Immunokonjugatpreparatet er typisk 1 mg/ml, selv om lavere

og høyere konsentrasjoner kan anvendes. Mer spesifikt~blir im-munokon jugatpreparatet behandlet ved en relativt høy konsentrasjon i et lite volum, for passende fortynning senere, dvs. hvis immunokonjugatpreparatet er tilstede som en 1 mg/ml løsning,,

så blir 1 ml behandlet med 10 ul av en 10% løsning av SDS. Etter blanding blir antistoffet tillatt å stå enten ved 37°C eller romtemperatur i den foretrukne inkuberingstid. Maksimums-konsentrasjonen av immunocytotoksinet som på en vellykket måte kan behandles ved 25°C, ble funnet å være 10 mg/ml. Ovenfor denne konsentrasjon mister generelt antistoff cytotoksinprepa-ratet løselighet ved behandling med SDS ved 25°C, men ikke ved 37°C. En viktig side av denne behandling er at den involverer bare en kort utsettelse for vaskemiddelet. Inkuberingstiden er typisk på 30 - 60 minutter og inkuberingstemperaturen enten romtemperatur (25°C) eller 37 °C.

Etter behandling blir ikke-antistoffbundet SDS fjernet ved de foran nevnte fremgangsmåter. Det første er et krystalli-seringstrinn hvor løsningen blir avkjølt ved 4°C som forårsaker krystallisering av overskudd av SDS. Supernatanten fjernes,

og brukes som den er, eller påføres på en G-25-kolonne for videre å separere lavmolekylærvekt-SDS fra immunokonjugat. Al-ternativt kan SDS-behandlet antistoff absorberes til albumin-sef arose og det ikke-adsorberte antistoff utvinnes. Hvis fore-

trukket kan rest-SDS som forblir bundet til protein eller fri, bestemmes ved binding med acridin-oransje og oppløsning i toluen.

SDS viser seg å være stabilt bundet til antistoff, siden passasje over albumin-sefarose fjerner bare fri SDS, ikke SDS bundet til antistoff, og fordi inhibering av RES-opptak av antistoff kan forekomme in vivo, selv etter sirkulering i serum hvor SDS sannsynligvis kunne konkurreres for av en rekke forskjellige proteiner.

Behandling med SDS kan utføres med enten ukonjugerte eller konjugerte monoklonale antistoffpreparater. I det sistnevnte tilfellet kan immunokonjugatpreparatet enten være tilstede som et løselig preparat, dvs. en supernatant fra et ultra-, sentrifugeringstrinn (100 000 xg i 60 minutter) eller kan være tilstede som et spontant presipitert immunokonjugat-preparat. Spontan presipitering forekommer ofte i konjugering med SPDP eller andre heterobifunksjonelle linkere og er et resultat av overkonjugering, dvs. utsettelse over lange tidsperioder eller for høy-konsentrasjoner av stoffet. Disse uløselige presipi-tater kan behandles med SDS og returneres til løselighet enda en gang. Mer viktig er det at SDS vil gjøre immunokonjugatpreparatet varig løselig, dvs. ved lagring ved 4°C vil immunokonjugatpreparatet forbli løselige og ikke gradvis presipitere med tiden, som er vanlig med ubehandlet immunokonjugat.

Videre er det blitt bestemt at med medisinkonjugater

kan over-derivatisert antistoff eller antistoff bundet til bærere som poly-L-lysin, returneres til løselighet ved anvendelse av SDS. Dette er spesielt relevant med medisiner slik som adriamycin, som synes å forårsake en høy grad av hydrofobisitet mot antistoff-medisinkonjugatet. I tilfeller med både toksinkonjugater og medisinkonjugater synes den resulterende testing for potens å indikere lite tap av aktivitet etter SDS-behandling, og ikke noe tap av antigen spesifisitet eller antigen selektivitet i drap av antigen positive celler.

I tillegg ble det bestemt at SDS kunne brukes til å løse-liggjøre også ukonjugert antistoff. For eksempel er IgG^-underklassen av antistoff svakt løselig med en gang det isoleres fra enten ascites eller brukt kulturmedium. Som et isolert antistoff preparat presipiterer det spontant ved lagring ved 4°C eller ved -70°C. Imidlertid, gjennom anvendelse av SDS som beskrevet her, blir løseligheten av denne spesielt ustabile underklasse forbedret. I tillegg synes kortvarig kontakt med SDS å ha liten virkning på immunoreaktivitet av denne ukonjugerte antistoff-underklasse.

For å summere eksemplene som følger, viser eksempel I virkningen av et egnet anionisk, syntetisk vaskemiddel på immunoreaktivitet. Eksempel II demonstrerer anvendelsen av et anionisk, syntetisk vaskemiddel for å inhibere Fc-reseptor-formidlet binding cg for å redusere ikke-spesifikt RES-opptak. Eksempel III demonstrerer anvendelsen av et anionisk, syntetisk vaskemiddel for å redusere in vivo-toksisiteten av intakte toksinkonjugater. Eksempel IV demonstrerer anvendelsen av et anionisk, syntetisk vaskemiddel for å redusere nivået av endotoksin i monoklonale antistoffpreparater.

De følgende eksempler er gitt for å illustrere oppfinnelsen.

EKSEMPEL I

Virkning av anioniske, syntetiske vaskemidler på immunoreaktivitet

Dette eksempel demonstrerer at inkubering av immunoglobu-liner eller immunokonjugater med et anionisk, syntetisk vaskemiddel for å få bedre løselighet, ikke i vesentlig grad påvir-ker antistoffs evne til å binde seg til antigen. Som vist i tabell I ble SDS tilsatt til ukonjugert antistoff (1 mg/ml)

i de angitte mengder i de angitte tider, og så ble fri SDS fjernet ved sentrifugering på en 0,5 ml minikolonne av G-25. Antistoff ble så bestemt for binding til melanomceller ved 0,1 ug 10~* celler. Fluorescentmerket anti-immunoglobulin ble tilsatt og cellene ble undersøkt ved flow cytometri. Den gjennomsnittlige fluorescensintensitet for melanomcellebinding ble bestemt for SDS-behandlede og ubehandlede antistoffpreparater. Den gjennomsnittlige fluorescensintensitet ble sammenlignet og beregnet som en prosent av mengden av binding av ubehandlet antistoff til melanomceller. Det var usignifikant inhibering av binding under 0,2% ved 25°C eller 0,1% ved 37°C inkubering.

EKSEMPEL II

SDS- formidlet inhibering av Fc- reseptorbinding og RES- opptak

Inkubering av anionisk, syntetisk vaskemiddel med antistoff-inhibert Fc-reseptor-formidlet binding til celler, som vist i fig. 1. Som beskrevet ovenfor Fc-reseptorbinding også spille en signifikant rolle i ikke-spesifikt RES-opptak. Som vist i tabell 2. minsket vaskemiddelbehandling av antistoffpreparater mengden av ikke-spesifikt antistoffopptak i RES-vevene, lever og milt.

A. Minskning av Fc- reseptor- formidlet binding

Vaskemiddel-behandlet antistoff, ubehandlet antistoff

og F(ab')^-fragmenter ble inkubert med humane monocytter og analysert ved flow cytometri. Dyrkede humane monocytter uttryk-ker en veldokumentert Fc-reseptor for muse-monoklonale antistoffer. Behandling av et monoklonalt antistoff 9.2.27, som er et IgG2a-antistoff, med konsentrasjoner av SDS så lave som

0,1%, reduserte effektivt bindingen til Fc-reseptorer til nivået som ble sett med kontroll F(ab 1)2~preparater (fig. 1).

Monoklonalt antistoff 9.2.27 (muse-anti-humant melanom) ble inkubert med 0,3 eller 1 vekt/vol% SDS i 30 minutter ved 25°C. SDS-behandlet antistoff (0,1 ug) ble inkubert med 5 x 10^ humane, oppslemmede monocytter (>95% renhet) i 30 minutter ved 4°C. Ubehandlet 9.2.27 og F(ab')2~fragment av 9.2.27 tjente som kontroller. Monocyttene ble vasket to ganger, inkubert med FITC-merket geite-anti-muse-F(ab')^°9 analysert ved flow cytometri. Fig. 1 demonstrerer at inkubering av monoklonalt antistoff 9.2.27 med 0,1% eller 1% SDS produserer en antistoff-bindende profil som er svært lik profilen til 9.2.27 (F(ab')2-fragmenter. Disse data indikerer at behandling av antistoff med SDS i det vesentlige inhiberer Fc-reseptor-formidlet binding til humane monocytter.

B. Reduksjon av ikke- spesifikt RES- opptak

Reduksjonen i bindingsaktivitet demonstrert i (A) ovenfor, ble undersøkt videre for å bestemme om in vitro-resultatene ville indikere redusert ikke-spesifikt opptak i nakne mus som hadde humane melanom-transplantater. Som vist i tabell 2 ble det ikke-spesifikke opptak av 1% SDS-antistoff in vivo, minsket i sammenligning med ubehandlet antistoff. Lokalisering til tumorstedet var imidlertid ekvivalent med de to antistoffpreparater, kanskje pga. tap av noe immunoreaktivitet etter behandling med SDS (se tabell 1). Videre eksperimenter med reduserte nivåer av SDS (0,1%) viser forbedring av tumoropptak. Tilleggs-eksperimenter har vist at så lite som 0,01% er tilstrekkelig til å inhibere RES-opptak.

Fremgangsmåten var som følger: 250 pg av et 125-merket (klor-amin-T) antistoff ble inkubert med 1 vekt/vol% SDS i 3 0 minutter ved 25°C. SDS-behandlet radio-jodert antistoff ble administrert intravenøst til gnagere ved 50 ug/dyr. Kontrolldyr mottok den samme dose av ubehandlet 1 25.j.-merket antistoff intra-venøst. Det var ingen forskjell i serumhalveringstid mellom vaskemiddelbehandlede og ubehandlede antistoffpreparater ( Th = 24 timer). Gnagerne ble avlivet 48 timer etter immunisering og radiomarkøren assosiert med forskjellig vev analysert. Prosent utvunnet dose ble beregnet som prosenten av den totale ut-vunnede cpm pr. gram av selektert vev. Prosent inhibering med SDS-behandling ble beregnet ved hjelp av følgende formel:

Som demonstrert i tabell 2 inhiberte SDS-behandling av antistoff signifikant ikke-spesifikt opptak av antistoff i RES-vev.

Ingen inhibering ble sett i lunge og thyroidea, to dejoderings-steder. cpm i disse vev kunne primært være fri markør som ikke var antistoff-assosiert. (Vist i tabell 3 er resultatene av behandling av et immunotoksin på biodistribuering in vivo.) Vist er et intakt abrin-9.2.27-konjugat; imidlertid ble lignende resultater oppnådd med et kermesplante-antiviralt proteinkonju-gat av 9.2.27. I begge disse tilfeller ble opptaket av immunotoksinpreparater minsket i RES-organene sammenlignet med de ubehandlede immunotoksinpreparater.

Det ikke-spesifikke opptak av intakte toksinkonjugater

kan effektivt reduseres ved å inkubere konjugatene (som mangler evne til å binde seg til karbohydrat via spesifikke B-kjede-reseptorer) med SDS før passiv terapi. I korte trekk ble 131I— merket monoklonalt antistoff 9.2.27 konjugert ved å bruke SPDP-til 125j-merket intakt abrin. Intakte toksinkonjugater som opprettholdt B-kjedebinding via karbohydrater ble fjernet ved adsorpsjon på galaktose/sefarose. De gjenværende intakte toksinkonjugater ble inkubert med 0,5 vekt/vol% SDS i 30 minutter ved 25°C. Ubehandlede og SDS-behandlede intakte toksin-immunokonjugater ble intravenøst administrert til nakne mus ved 50ug/dyr.

Det var ingen forskjell mellom serumhalveringstid for kontroll og vaskemiddel-behandlede intakte toksinkonjugater { Tk = 3,5 time). Gnagerne ble avlivet 24 timer etter immunisering og forskjellige vev ble fjernet og bestemt for assosiert radiomar-kør. Som vist i tabell 3, resulterer inkubering av intakte toksinkonjugater med SDS før in vivo-administrering i en markert nedgang i ikke-spesifikt opptak i RES-vev.

EKSEMPEL III

Reduksjon av in vivo toksisitet av intakte toksinkonjugater

D3 (MAb til L10 hepatocellulært carcinom fra marsvin) ble konjugert til intakt abrin via SPDP som ovenfor. Etter utrensing over galaktose-sefarose ble konjugater testet in vitro mot antigen positive og negative celler. Det var en 10 000 gangers forskjell i drap av antigen positive i forhold til negative celler (Id5q m°t antigen positive celler =10 -1 4M, ID^q mot antigen negative celler = 10-1<^M). Et typisk A-kjede-konjugat

-1 0 -7

av D3 var henholdsvis 10 og 10 M Id5q- Marsvin (350 grams kroppsvekt) ble injisert med det D3-intakte abrinkonjugat på 1 og 10ug doser/marsvin. Begge sett dyr døde innen 24 timer. Etter behandling med 0,5% SDS og fjerning av fritt vaskemiddel ble konjugatet administrert i 3 doser på 150ug hver, med tre dagers mellomrom ( kumulativ dose på 450 ug på 7 dager). Marsvin ble observert i 200 dager og hadde ingen synlig toksisitet.

Pseudomonas exotoxin A (PE) konjugater med monoklonale antistoffer har høy potens (10 -1 1 til 10 - 1 3 M ID^n mot antigen positive celler) med god selektivitet (10 til 10 M ID50

mot antigen negative cellelinjer). Imidlertid har disse konju-

gater in vivo, lik andre hele toksinkonjugater, signifikant levertoksisitet. Dette kan lett måles ved leverenzymnivåer SGOT, SGPT og LDH (se tabell for apedata) eller død (i mus).

I mus er PE-konjugater i alminnelighet letale ved 1 ug/mus. Hvis man behandler konjugatet først med SDS kan man administrere nivåer opp til 50 ug/mus uten noen synlig toksisitet (ingen høyere dose ble administrert). På samme måte ble i aper leverenzymnivåer, som ble forhøyet før død eller alvorlige symptomer etter administrering av ubehandlet konjugat, sterkt redusert etter behandling med SDS. Mer viktig, potens og selektivitet var praktisk talt uforandret etter SDS-behandling, som testet in vitro.

Det kan derfor konkluderes med at SDS også er effektiv

i redusering av toksisitet av hele toksinkonjugater produsert av bakterielle eksotoksiner, slik Pseudomonas exotoxin A. Lignende resultater kunne forventes med Diptheria toksin.

EKSEMPEL IV

Reduksjon i nivået av endotoksin i MAb- preparater

Inkubering av monoklonale antistoffer med anioniske, syntetiske vaskemidler resulterer i en minsking i endotoksinkonta-minering av antistoffpreparater, som vist i tabell 5. Monoklonalt antistoff (ved to proteinnivåer) renset fra vevskultursuper-natanter ved protein A sefarose-kromatografi, ble bestemt for endotoksin ved å bruke QCL limulus lysat-test (Whittaker/MA Bioproducts). Ekvivalente resultater ble oppnådd med en agglu-tinerings-assay (Pyrotel, Woods Hole, MA) og vist å ha endotok-sinkontaminering. Antistoffpreparater ble så inkubert med 0,1% SDS ved 37°C i 30 minutter. Overskudds-SDS ble krystallisert ved å avkjøle ved 4°C i 2 timer og ble fjernet ved sentrifugering ved 2000 xg i 10 minutter. En acridin-oransje-bindingsassay bestemte at 494 ug av SDS forble bundet pr. mg antistoff. Vaske-middelbehandlet antistoff viste en >95% reduksjon i endotoksin-nivået. Et kontrollforsøkt ble utført ved å bruke et vaskemid-delbehandlet antistoff-preparat renset fra ascites, som ikke inneholdt endotoksin. SDS-behandling hadde ingen virkning på vurderingen av en endotoksin positiv kontroll.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for å øke løseligheten av et immuno-kon jugat-preparat , eller et ukonjugert immunoglobulin-preparat, uten vesentlig å innvirke på immunoreaktiviteten til preparatet, karakterisert ved at den omfatter å inkubere immunokonjugat-preparatet eller immunoglobulin-preparatet i 30-60 min. ved 25-37<*>C med molekyler av anionisk syntetisk vaskemiddel i en konsentrasjon av mellom 0,01 og 1 vekt/volum%; og å fjerne i det vesentlige ethvert ikke-antistoffbundet anionisk vaskemiddel.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at immunokonjugat-preparatet eller immunoglobulin-preparatet tilhører underklassen IgG3.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det som anionisk syntetisk vaskemiddel anvendes natriumdodecylsulfat.