NO152253B - Analogifremgangsmaate for fremstlling av 4-(n-(3`,4`-dihydroksybenzyliden)aminometyl)-cykloheksan-1-karboksylsyre med terapeutisk aktivitet - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstilling av 4-[N-(3', 4 '-dihydroksybenzyliden)aminometyl]cykloheksan-l-karboksylsyre med terpeutisk aktivitet og med formelen:

hvor cykloheksanringen omfatter trans- og cisformen, samt farmasøytisk akseptable salter og laverealkylestere derav.

Saltene er alkali- eller jordalkalimetallsalter slik som natriumsalt, kaliumsalt, kalsiumsalt, magnesium-salt osv., eller substituerte eller ikke-substituerte ammoniumsalter. Esteren er som nevnt en laverealkylester, hvor alkylgruppen har 1-3 karbonatomer, slik som metyl-, etyl- eller n- eller isopropylgruppen.

Forbindelsen med formel I fremstilles ifølge oppfinnelsen ved omsetning av 3,4-dihydroksybenzaldehyd med formelen (II) : rned 4-aminoniL ty Icyk loheksan-l-karboksylsyre med formel (III):

hvor cyklohekoanringen omfatter trans- og cisformen, eller en laverealkylester derav, og den ønskede forbindelse (syre-eller esterform) erholdes ved dehydratisering-kondensa-sjon.

Omsetningen av forbindelsen med formel (II) med forbindelsen med formel (III) eller en ester derav utføres

i et organisk oppløsningsmiddel ved en temperatur lavere enn 150°C, foretrukket 0 - 120°C, under inertgassatmosfære. Ved temperaturer høyere enn 150°C reduseres utbyttet av det ønskede produkt på grunn av forskjellige bireaksjoner. Et-hvert organisk oppløsningsmiddel som ikke deltar i reaksjonen kan brukes ved omsetningen. Vanligvis brukes en lavere alkohol slik som metanol eller etanol, benzen, toluen, dimetylformamid, acetonitril eller lignende som oppløsnings-middel.

Ettersom reaksjonen finner sted sammen med vann-avspalting, utføres omsetningen i nærvær av et dehydratiseringsmiddel eller ved fjerning av vann fra dannet under reaksjonen ved tilbakeløpskokingen av oppløsningsmidlet. Et an-hydrid av en lavere alkohol slik som vannfri metanol eller etanol kan brukes som oppløsningsmiddel og på samme tid være dehydratiseringsmiddel.

Forbindelsen med formel I isoleres ved å behandle reaksjonsblandingen ved kjent fremgangsmåte eller reaksjon.

Forbindelsen i saltform fremstilles ved den

vanlige fremgangsmåten for nøytralisering ved å bruke en base slik som hydroksyd, karbonat eller bikarbonat av et alkali- eller et jordalkalimetall f.eks. natrium, kalium, kalsium eller magnesium, ammoniakk eller et primært, sekun-dært eller tertiært amin. F.eks. erholdes et natriumsalt ved nøytralisering av forbindelsen ifølge oppfinnelsen (i syreform) oppnådd ved den ovenfor nevnte omsetningen med en alkoholisk eller vandig oppløsning av natrium-hydroksyd under inertgassatmosfære ved en temperatur lavere enn 100°C, vanligvis ved 0-5°C.

Forbindelsen utviser en inhiberende virkning

på blodplatesammenklumping, spredning av polynukleære leukocytter, uttrengning av polynukleære leukocytter til betennelsesstedet og hurtigvekst av betent granuloma,

en profylaktisk virkning på leddbetennelse, antisvulstvirkning, lav akutt toksisitet, ingen skader på magesekkslimhinnen og ingen mutagenvirkning, som det vil frem-

gå av eksemplene. Den fremstilte forbindelse er følgelig nyttig som et middel mot forskjellige sykdommer slik som betennelser, tromboser, hjerneblødning, høyt blodtrykk,

astma eller kreft etc, særlig mot kroniske sykdommer slik som reumatisme eller hudsykdommen systemisk lupus erythematosus (SLE), etc.

Forbindelsen kan administreres peroralt, rektalt eller ved injeksjon i forskjellige doseringsformer som et preparat sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer og/eller et hjelpestoff. I disse tilfellene kan det brukes en blanding av to eller flere sorter av forbindel-

sen eller en blanding sammen med andre farmasøytisk aktive stoffer som den aktive bestanddel i et farmasøytisk preparat.

Administrasjonsformen for preparatet kan være som

tablett, tablett til å ha under tungen, pulver, kapsel, suge-tablett oppløsning på vann- eller oljebasis, suspensjon, emul-sjon, sirup, injeksjonsoppløsning på vann- eller oljebasis. Et eksempel på en bærer nevnt ovenfor, er vann-eller oljebasis. Et eksempel på en bærer nevnt ovenfor er vann, gelatin, laktose, stivelse, pektin, magnesium-stearat, stearinsyre, talkum, vegetabilsk olje, gummi arabikum, polyalkylenglykol, vaselin, sorbitantioleat, polyoksyetylen-sorbitanmonooleat, alkylfenol, alifatisk alkohol, polyvinylpyrrolidon eller lignende. I preparatet kan det, om nødvendig, i tillegg benyttes søtningsmidler, smaksstoff, fargestoff, preserverings-middel, salt for regulering av osmose eller buffer, dvs. de vanlige farmasøytiske hjelpestoffer.

Innholdet av forbindelsen i det farmasøytiske preparatet kan varieres ettersom det passer, det er imidlertid 0,01-100 vekt-%, foretrukket 0,05-80 vekt-%

av preparatet.

Det farmasøytiske preparatet administreres til menneske eller dyr parenteralt, f.eks. rektalt, ved injeksjon (under huden, intramuskulært eller intra-venøst, eller ved drypp), foretrukket peroralt (f.eks. under tungen etc.).

En dose av det farmasøytiske preparatet er 0,1-500 mg, foretrukket 0,5-200 mg pr. dag pr. kg. kroppsvekt i tilfelle av peroral administrering til et, menneske, og 0,01-200 mg, mer foretrukket 0,1-100 mg, i tilfelle ved parenteral administrering, og legemidlene administres 1-4 ganger pr. dag. Dosen av det farmasøytiske preparat avhenger imidlertid av alder, individuelle forhold, forhold ved sykdommen etc. hos menneske i eller dyr, og det kan brukes doser utenfor de ovennevnte grenser.

Egenskapene, fremgangsmåten for fremstilling og farmasøytiske virkninger til forbindelsen med formel I beskrives konkret i eksemplene.

Eksempel!

Fremstilling av trans-4-[N-(3',4'-dihydroksybenzyliden)-aminometyl] cykloheksan- l- karboksylsyre

1,753 g (12,7 mmol) 3,4-dihydroksybenzaldehyd ble

oppløst i 30 ml dehydratisert og renset metanol. Den resulterende oppløsning ble dryppet til 1,994 g (12,7 mmol) trans-4-aminometylcykloheksan-l-karboksylsyre under nitrogenatmosfære og den blandede oppløsning ble tilbakeløpskokt i 3 timer under omrøring. Etter avkjøling av reaksjonsblandingen til romtemperatur ble de utfelte orangegule krystaller filtrert, vasket med metanol og vakuumtørket. 2,9 g trans-4-[N-(3<1>,4'-dihydroksybenzyliden)aminometyl]cykloheksan-l-karboksylsyre ble erholdt i et utbytte på 82,7%.

Den erholdte forbindelse (syreform) hadde følgende karakteristika: (1) smeltepunkt: 222°C med dekomponering (målt ved kapillarmetode), (2) elementæranalyse: (3) kjernemagnetisk resonans- (NMR) spektrum i dimetylsulfoksyd: 0,9 - 2,0 (9H, m), 2,1 - 2,2 (1H), 3,33 (2H, d), 6,73 (1H, d), 6,97 (1H, d), 7,19 (1H, s), 8,03 (1H, s). (4) infrarødt absorbsjons- (IR) spektrum ved KBr-tablett-metoden: vist i fig. 1.

Eksempel 2

Fremstilling av natrium-trans-4-[N-(3<1>,4<1->dihydroksybenzyli-den) aminometyl] cykloheksan- l- karboksylat

1,00 g (3,61 mmol) av trans-4-[N-(3',4•-dihydroksy-benzyliden) aminometyl]cykloheksan-l-karboksylsyre erholdt i eksempel 1 ble tilsatt til 3,6 ml IN natriumhydroksydoppløs-ning i metanol og oppløst under omrøring i 20 - 30 minutter ved romtemperatur under nitrogenatmosfære. Etter filtrering ble metanolen dampet og 1,121 g natrium-trans-4-[N-(3',41 -

dihydroksybenzyliden)aminometyl]cykloheksan-l-karboksylat ble erholdt.

I fig. 2 er det vist IR-spektrum (KBr-tablettmetode) av den erholdte forbindelse (natriumsalt).

På ultrafiolett (UV) absorbsjonsspektrum i metanol ble de følgende to topper funnet:

^maks : 271'5 mp og 309 my.

Eksempel 3

Fremstilling av etyl-trans-4[N-(3',4'-dihydroksy-benzyliden) aminometyl] cykloheksan- l- karboksylat .0,835 g 3,4-dihydroksybenzaldehyd og 1,2 g<1> etyl-trans-4-aminometylcykloheksan-l-karboksylat ble oppløst i 20 ml metanol. Den resulterende oppløsning ble tilbakeløpskokt i 1 time under nitrogenatmosfære. Etter at reaksjonsblandingen hadde stått ved 0°C over natten, ble de utfelte fiolet-te skivekrystaller filtrert og tørket, hvorved man fikk 1,525 g av forbindelsen (etylesteren).

Den erholdte etylester hadde følgende karakteristika :

(1) . smeltepunkt: 50 - 62°C (målt ved kapillarmetode),

(2) elementæranalyse:

(3) IR-spektrum: vist i fig. 3.

Eksempel 4 Fremstilling av cis-4-[N-(3 1 , 4 1-dihydroksybenzyliden)'amino-metyl] cykloheksan- l- karboksylsyre

0,395 g (2,86 mmol) 3,4-dihydroksybenzaldehyd ble tilbakeløpskokt i dehydratisert og renset metanol for å rea-gere med 0,4 50 g (2,86 mmol) cis-4-aminometyl-cykloheksan-l-karboksylsyre i 1 time. Etter avdamping av metanolen under redusert trykk fra den rødorange reaksjonsblanding, ble det erholdt 0,7910 g gult pulver av cis-4-[N-(3',4'-dihydroksy-benzyliden) aminometyl]cykloheksan-l-karboksylsyre..

Den erholdte forbindelsen (cis-form) hadde følgende karakteristika: (1) smeltepunkt: 121 - 129°C (målt ved Hot Plate-metoden),

(2) NMR i dimetylsulfoksyd:

6 = 1,02 - 1,84 (9H, m), 2,0 - 2,1 (1H), 3,35 (2H, d),

6,82 (1H, d), 6,97 (1H, d), 7,20 (1H, s), 8,04 (1H, s).

Biologiske forsøk

A. Inhiberende virkning på blodplatesammenklumping, spredning

av polynukleære leukocytter og akutt toksisitet Farmakologiske virkninger og akutt toksisitet for den fremstilte forbindelse ble undersøkt, nemlig: Prøve I: Natrium-trans-4-[N-(3',4'-dihydroksybenzyliden)-aminometyl]cykloheksan-l-karboksylat erholdt i eksempel 2,

II: Natriumsaltet av cis-4-[N-(3<1>,4'-dihydroksybenz-yliden) aminometyl] cykloheksan-l-karboksylsyre erholdt i eksempel 4,

Sammenligningsprøve III: indomethacin,

IV: homochlorcyclizine.

Sammenligningsprøvene III og IV som har lignende farmakologiske virkninger som forbindelsen ifølge oppfinnelsen, er kommersielt tilgjengelige i Japan.

Undersøkelsen ble utført i henhold til fremgangs-måtene beskrevet nedenfor.

(1) Fremgangsmåte for undersøkelse av inhiberende virkning

på blodplatesammenklumping

Plasma rikt på blodplater fra kanin (PRP) ble brukt ved sammenklumpingsprøvene. PRP ble fremstilt ved å sentri-fugere blod hentet fra ørevenen hos kanin og fortynnet med blodplatefattig plasma til antallskonsentrasjon 300.000/yl. Blodplatesammenklumping ble indusert ved hjelp av natriumarachidonat og målt med en 4-kannals blodplatesammenklump-ingmåler "PAT-4A". Røret i sammenklumpingsmåleren som inneholdt 2 30 yl PRP ble deretter inkubert ved 37°C i 5 minutter med hver prøve.

(2) Fremgangsmåte for undersøkelse av inhiberende virkning

på spredning av polynukleære leukocytter

Spredning av polynukleære leukocytter hos rotter

ble undersøkt på følgende måte etter Boyden-metoden (se Japanese J. Clin. Med., 27(9), 172 (1969)): en blanding av 10 volumdeler kulturfiltrat fra E. coli og 1 volumdel serum ble inkubert ved 37°C i 1 time og fortynnet til 5 ganger volumet med fysiologisk saltoppløsning, den resulterende blanding ble brukt som tiltrekningsmiddel. Etter inkubering av suspensjonen med polynukleære leukocytter med hver prøve i 10 minutter, ble spredningen av polynukleære leukocytter undersøkt. (3) Fremgangsmåte for undersøkelse av akutt toksisitet

Akutt toksisitet ble undersøkt ved administrere peroralt en vandig oppløsning av hver prøve til JCL-ICR hunn-mus 5-6 uker etter fødselen.

Resultatene er vist i tabell 1.

Merknader: 1) Minimumskonsentrasjonen (yM) av hver prøve for å inhibere fullstendig (100%) blodplatesammen-klumpingseffekten til natriumarachidonat (prøvet ved 400 yM). 2) Den gjennomsnittlige verdi av inhiberingsgraden (%) for spredning av polynukleære leukocytter ved hver konsentrasjon (yM) for hver prøve. 3) Midlere dødelig dose (LD^q), dvs. doser som trengs for å drepe 50% av musene, i måleen-het mg/kg kroppsvekt av mus.

Forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen har,

som vist i tabell 1, inhiberende virkning på blodplatesammenklumping og spredning av polynukleære leukocytter,

og den har en lav akutt toksisitet. Den kan følgelig brukes som et anti-betennelsesmiddel og som et middel mot andre forskjellige sykdommer.

B. Inhiberende virkning på overføring av polynukleære leukocytter;

Den inhiberende virkning av natrium-trans-4-[N-(3',-4'-dihydroksybenzyliden)aminometyl]cykloheksan-l-karboksy-

lat på overføring av polynukleære leukocytter til betennel-sessted ble undersøkt ved å bruke hannrotter med kroppsvekt på omkring 150 g og Granuloma CMC-lommemetoden (se Yakugaku Zasshi, 88, 1472 (1968)).

Etter å ha klippet rotten på overflaten omkring

5 cm i diameter, ble 5 ml luft injisert under huden på

stedet for å danne en lomme. Etter 24 timer ble 5 ml av en vandig 2% (vekt/volum) oppløsning av CMC-natriumsalt ved 37°C injisert i lommen og samtidig ble en vandig oppløsning av forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen .administrert peroralt til rotten i doser på 50, 100 og 200 mg/kg. For sammenligning ble indomethacin administrert peroralt til rotten i en dose på 10 mg/kg i form av en vandig suspensjon.

Væsken i lommen ble, etter injeksjon av CMC, sam-let opp litt etter litt i mengder på 0,5 ml og farget. Så

ble antallet polynukleære leukocytter overført til lommen telt. Resultatene er vist i fig. 4. Som vist i fig. 4 kan forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen justere overføringen av polynukleære leukocytter i en grad som avhenger av doser-ingsmengden.

I tillegg ble etyl-trans-4-[N-(3',4'-dihydroksy-benzyliden) aminometyl ] cykloheksan-l-karboksylat undersøkt på samme måte og det viste seg at esteren også inhiberte overføringen av polynukleære leukocytter.

C. Inhiberende virkning på vekst av betendt granu-

loma

Den inhiberende virkning av natrium-trans-4-[N-(3<1>,-4'-dihydroksybenzyliden)aminometyl]cykloheksan-l-karboksylat på vekst av betendt granuloma ble undersøkt ved å bruke 5

uker gamle hannrotter (Donryu) og fremgangsmåte til Fujimura et al (se Pharmacometrics, 19 (3), 329 (1980)).

Et ark filterpapir som var 13 mm i diameter og

0,26 mm tykt ble dyppet i en vandig 2% oppløsning av CMC

som inneholdt 0,1 mg/ml dihydroksystreptomycin og penicillin (million enheter). Arket ble deretter innført under huden hos en bedøvet rotte. Etter at rotten hadde kommet til krefter igjen, ble forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen administrert peroralt én gang om dagen i 8 dager med en Idose på

25, 50 og 100 mg/kg pr. dag og for sammenligning ble indomethacin administrert på samme måte i en dose på 3 mg/kg pr. dag. Økningen i kroppsvekt, granulomavekt og skaden på magesekkslimhinnen ble undersøkt på den niende dag.

Resultatene er vist i tabell 2.

Merknader: 1) Forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen ble ikke administrert. 2) P < 0,01, P angir grensen for statistisk på-litelighet. 3) P < 0,05. 4) Røde flekker ble observert hos 2 rotter.

Forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen inhiberer, som vist i tabell 2, effektivt veksten av betent granuloma i en grad som avhenger av den administrerte dose, og den inhiberer ikke vektøkningen som følger av administreringen. Videre ble det ikke funnet noen bieffekt slik som skader på magesekkslimhinnen som man ser ved bruk av konvensjonelle ikke-steroide anti-betennelsesmidler.

D, Skader på magesekkslimhinnen

De vanlige anti-inflammatoriske midler gir ofte skader på magesekkslimhinnen som en bivirkning. Muligheten for at forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen skulle kunne forår-sake slike skader ble undersøkt ved å bruke fremgangsmåten til Fujimura et al som vist i eksempel 7.

Etter å ha fastet JCL-SD hunn-rotter i 24 timer, ble natrium-trans-4-[N-(3',4'-dihydroksybenzyliden)amino-metyl] cykloheksan-l-karboksylat administrert peroralt til rottene. Rottene ble slaktet etter 3 timer. Magesekken ble deretter tatt ut og lengden (mm) av skaden på slimhinnen ble målt etter metoden til Okabe et al (se Pharmacometrics,

18 (1), 1 (1979)). Den totale summen av lengder ble brukt som sårindeks. For sammenligning ble indomethacin administrert peroralt i en dose på 30 mg/kg. Resultatene er vist i tabell 3. forts. tab. 3 Merknader: 1) Forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen ble ikke ad ministrert. 2) Adminstrert peroralt i form av en vandig opp-løsning . 3) Administrert peroralt i form av en vandig opp-løsning.

Som vist i tabell 3, forårsaket forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen, selv ved en så høy dose som 500 mg/kg,' ikke skader på slimhinnen i magesekken.

E, Profylaktisk virkning på leddbetennelse frembragt med et hjelpestoff

Den profylaktiske virkning av forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen på leddbetennelse frembragt med et hjelpestoff ble undersøkt ved å bruke 6 syv uker gamle JCL-SD hunnrotter og den vanlige fremgangsmåten (se Fujihira et al, Pharmacometrics, 5(2), 169-183, (1971).

Freund's fullstendige hjelpestoff (0,6 mg/0,1 ml) ble inokulert i høyre bakpote på en bedøvet rotte. Etter at rotten hadde kommet til krefter igjen, ble natrium-trans-4-[N-(3',4'-dihydroksybenzyliden)aminometyl)cykloheksan-l-karboksylat administrert peroralt én gang om dagen i 24 på-følgende dager. Forandringen i bakpotevolum og kroppsvekt som følge av leddbetennelsen ble undersøkt fortløpende. For sammenligning ble et steroid (prednisolone) administrert peroralt på samme måte.

Resultatene er vist i fig. 5 og 6. I fig. 5 angir blindprøve ingen inokulering av hjelpestoff. Som vist i fig. 5 og 6, forhindret forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen effektivt leddbetennelsen uten noen reduksjon i kroppsvekt hos rotten, som man ofte ser når det administreres et steroid til rotter.

Rottene ble slaktet på den 25. dagen etter inoku-leringen av hjelpestoffet og vekten av hvert organ hos rot-

tene ble målt. Ingen tilbakedannelse av brisselen ble funnet i rottene som hadde fått forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen, mens en signifikant tilbakedannelse av brisselen ble funnet hos rotter som hadde fått steroidet (prednisolone). Forbindelsen kan følgelig brukes som et middel mot kroniske sykdommer slik som reumatisme.

F, Antisvulstvirkning

Antisvulstvirkningen av forbindelsen ifølge oppfinnelsen ble undersøkt.

1 x 10^ celler av Sarcoma-180 ble implanert i akselhulen hos ICR-JCL mus. 24 timer etter implanteringen ble en oppløsning av natrium-trans-4-[N-(3',4'-dihydroksy-benzyliden) aminometyl] cykloheksan-l-karboksylat i sterili-

sert og renset vann administrert peroral én gang om dagen i 21 påfølgende dager i doser på 100 og 500 mg/kg. På den 22. dagen etter implanteringen ble svulstene tatt ut og inhiberingsgraden (I.R. i %) ble beregnet ved hjelp av den følgende formel:

(1 - T/e) x 100 = I.R. (%)

hvor T og e angir middelvektene av svulstene hos henholds-

vis den behandlede gruppen og kontrollgruppen.

I.R.-verdiene var henholdsvis 55,8 og 45,3% ved

en dose på 100 og 500 mg av forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen.

G. Mutagenegenskaper

Mutagene egenskaper hos forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen ble undersøkt ved Rec-prøve.

Bacillus subtilis M 45 (en stamme som mangler evne til å reparere genskader ved rekombinasjon) og B. subtilis H 17 (en stamme med evne til å reparere genskader ved rekombinasjon) ble strøket ut på B-II-agar på en slik måte at startpunktet for de to strekene ble overlappet. B-II-agarkulturen var fremstilt ved å løse 10 g kjøttekstrakt, 10 g polypepton, 5 g natriumklorid og 15 g agar i 1000 ml destillert vann hvoretter pH var justert til 7,0.

Så snart som oppløsningen av natrium-trans-4-[N-(3',4'-dihydroksybenzyliden)aminometyl]cykloheksan-l-karboksylat var absorbert på et rundt filterpapir med 8 mm i diameter, ble de to startpunktene for strekene dekket med filterpapiret. Etter inkubering av stammene ved 37°C over natten, ble lengden av vekstinhiberingssonen målt. Kanamycin ble brukt som en negativ kontroll og mitomycin som en posi-tiv kontroll. Resultatene er vist i tabell 4.

Som vist i tabell 4, utviste forbindelsen Ifølge oppfinnelsen ingen mutagene egenskaper og den er funnet å ha en høy grad av sikkerhet.

Claims (1)

1. Forbindelsen fremstilt ifølge oppfinnelsen er, ut fra resultatene i eksemplene 5-11, funnet å ha svært spesifikke farmakologiske egenskaper, ingen toksisitet og bivirkninger. De kan følgelig brukes i farmasøytiske preparater som har en høy grad av sikkerhet og er et middel mot og en beskyttelse for forskjellige sykdommer.

   PatentkravAnalogifremgangsmåte for fremstilling av 4-[N-(3',4'-dihydroksybenzyliden)aminometyl]cykloheksan-l-karboksylsyre med terapeutisk aktivitet og med formelen:

   hvor cykloheksanringen omfatter trans- og cis-formen, samt farmasøytisk akseptable salter og laverealkylestere derav, karakterisert ved at man omsetter 3,4-dihydroksybenzaldehyd med formelen:

   med 4-aminometylcykloheksan-l-karboksylsyre med formelen:

   hvor cykloheksanringen omfatter trans- og cis-formen, eller en laverealkylester derav, og, om ønsket, omdanner en således oppnådd fri syre til et farmasøytisk akseptabelt salt derav.