NO147212B - Kormogent h.h.v. fluorescerende tripeptid for kvantitativ bestemmelse av proteolytiske enzymer - Google Patents
Kormogent h.h.v. fluorescerende tripeptid for kvantitativ bestemmelse av proteolytiske enzymer Download PDFInfo
- Publication number
- NO147212B NO147212B NO752386A NO752386A NO147212B NO 147212 B NO147212 B NO 147212B NO 752386 A NO752386 A NO 752386A NO 752386 A NO752386 A NO 752386A NO 147212 B NO147212 B NO 147212B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- mmol
- arg
- pro
- group
- phe
- Prior art date
Links
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims description 5
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims description 5
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 title claims description 4
- -1 4-methoxy-2-naphthyl group Chemical group 0.000 claims description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 27
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 27
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 27
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 claims description 25
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 9
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 8
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 8
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 6
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 6
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 6
- 125000004435 hydrogen atom Chemical class [H]* 0.000 claims description 6
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims description 5
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000000762 glandular Effects 0.000 claims description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- 230000002345 thrombinlike Effects 0.000 claims description 5
- 239000003053 toxin Substances 0.000 claims description 5
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 claims description 5
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 claims description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 4
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 4
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 claims description 4
- 102100034869 Plasma kallikrein Human genes 0.000 claims description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 3
- 125000004202 aminomethyl group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 125000000051 benzyloxy group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])O* 0.000 claims description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 claims description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 claims description 3
- 125000001622 2-naphthyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C(*)C([H])=C([H])C2=C1[H] 0.000 claims description 2
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 2
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 150000004945 aromatic hydrocarbons Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000001288 lysyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000636 p-nitrophenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1*)[N+]([O-])=O 0.000 claims description 2
- 229940055729 papain Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 claims description 2
- 125000000405 phenylalanyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 125000002233 tyrosyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 claims 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 137
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 95
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 84
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 59
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 51
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 51
- 238000000921 elemental analysis Methods 0.000 description 47
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 47
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 45
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 44
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 43
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 43
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 39
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 39
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 32
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 31
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 28
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 239000000047 product Substances 0.000 description 26
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 24
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 23
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 23
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 21
- 102000003827 Plasma Kallikrein Human genes 0.000 description 21
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 19
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 14
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 10
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 10
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 10
- XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N methyl 1-acetylthieno[3,2-c]pyrazole-5-carboxylate Chemical compound CC(=O)N1N=CC2=C1C=C(C(=O)OC)S2 XELZGAJCZANUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 8
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 8
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N hexamethylphosphoric triamide Chemical compound CN(C)P(=O)(N(C)C)N(C)C GNOIPBMMFNIUFM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 6
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 6
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 5
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 5
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 5
- YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N ethyl (2s)-2-benzamido-5-(diaminomethylideneamino)pentanoate Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(=O)OCC)NC(=O)C1=CC=CC=C1 YQDHCCVUYCIGSW-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 5
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 5
- NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 2,2,6,6-tetramethyloxan-4-one Chemical compound CC1(C)CC(=O)CC(C)(C)O1 NOGFHTGYPKWWRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N Dicyclohexylamine Chemical compound C1CCCCC1NC1CCCCC1 XBPCUCUWBYBCDP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N Fluorine atom Chemical compound [F] YCKRFDGAMUMZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100035792 Kininogen-1 Human genes 0.000 description 4
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 4
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 4
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 4
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N Oxalic acid Chemical compound OC(=O)C(O)=O MUBZPKHOEPUJKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 3
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 3
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 3
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Substances C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- AGJSNMGHAVDLRQ-IWFBPKFRSA-N methyl (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-amino-3-sulfanylpropanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxy-2,3-dimethylphenyl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoate Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)OC)CC1=CC=C(O)C(C)=C1C AGJSNMGHAVDLRQ-IWFBPKFRSA-N 0.000 description 3
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 3
- GFNKTLQTQSALEJ-UHFFFAOYSA-N 1-isocyanato-4-nitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(N=C=O)C=C1 GFNKTLQTQSALEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 2-methylpropyl carbonochloridate Chemical compound CC(C)COC(Cl)=O YOETUEMZNOLGDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 2-naphthylamine Chemical compound C1=CC=CC2=CC(N)=CC=C21 JBIJLHTVPXGSAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 4-toluenesulfonyl chloride Chemical compound CC1=CC=C(S(Cl)(=O)=O)C=C1 YYROPELSRYBVMQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FKLJPTJMIBLJAV-UHFFFAOYSA-N Compound IV Chemical compound O1N=C(C)C=C1CCCCCCCOC1=CC=C(C=2OCCN=2)C=C1 FKLJPTJMIBLJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 2
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010077861 Kininogens Proteins 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N Quinine Chemical compound C([C@H]([C@H](C1)C=C)C2)C[N@@]1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-WZBLMQSHSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 125000004103 aminoalkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- CHIHQLCVLOXUJW-UHFFFAOYSA-N benzoic anhydride Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OC(=O)C1=CC=CC=C1 CHIHQLCVLOXUJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010170 biological method Methods 0.000 description 2
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 2
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical group NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940125890 compound Ia Drugs 0.000 description 2
- 238000007257 deesterification reaction Methods 0.000 description 2
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 2
- 150000003840 hydrochlorides Chemical class 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N octanoic acid Chemical compound CCCCCCCC(O)=O WWZKQHOCKIZLMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001436 propyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 2
- NRTLTGGGUQIRRT-UHFFFAOYSA-N triethylazanium;bromide Chemical class [Br-].CC[NH+](CC)CC NRTLTGGGUQIRRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960001322 trypsin Drugs 0.000 description 2
- UEBBUHBSHNBANC-KCHLEUMXSA-N (2s)-1-benzoyl-n-[(2s)-1-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-2-(4-nitroanilino)pentanoyl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]pyrrolidine-2-carboxamide Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)C=1C=CC=CC=1)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UEBBUHBSHNBANC-KCHLEUMXSA-N 0.000 description 1
- FMCAFXHLMUOIGG-IWFBPKFRSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-formamido-3-sulfanylpropanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxy-2,5-dimethylphenyl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoic acid Chemical compound O=CN[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O)CC1=CC(C)=C(O)C=C1C FMCAFXHLMUOIGG-IWFBPKFRSA-N 0.000 description 1
- UCQFTYKBLBJWIO-UHFFFAOYSA-N (4-nitrophenyl) cyclohexanecarboxylate Chemical compound C1=CC([N+](=O)[O-])=CC=C1OC(=O)C1CCCCC1 UCQFTYKBLBJWIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 1,3-dicyclohexylurea Chemical compound C1CCCCC1NC(=O)NC1CCCCC1 ADFXKUOMJKEIND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 1-[6-[4-(5-chloro-6-methyl-1H-indazol-4-yl)-5-methyl-3-(1-methylindazol-5-yl)pyrazol-1-yl]-2-azaspiro[3.3]heptan-2-yl]prop-2-en-1-one Chemical compound ClC=1C(=C2C=NNC2=CC=1C)C=1C(=NN(C=1C)C1CC2(CN(C2)C(C=C)=O)C1)C=1C=C2C=NN(C2=CC=1)C AZUYLZMQTIKGSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RUFPHBVGCFYCNW-UHFFFAOYSA-N 1-naphthylamine Chemical compound C1=CC=C2C(N)=CC=CC2=C1 RUFPHBVGCFYCNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SKAWDTAMLOJQNK-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-(4-hydroxyphenyl)propanoic acid ethyl ester Chemical compound CCOC(=O)C(NC(C)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 SKAWDTAMLOJQNK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SFKZPTYRENGBTJ-UHFFFAOYSA-N 4-methoxynaphthalen-2-amine Chemical compound C1=CC=C2C(OC)=CC(N)=CC2=C1 SFKZPTYRENGBTJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FCSKOFQQCWLGMV-UHFFFAOYSA-N 5-{5-[2-chloro-4-(4,5-dihydro-1,3-oxazol-2-yl)phenoxy]pentyl}-3-methylisoxazole Chemical compound O1N=C(C)C=C1CCCCCOC1=CC=C(C=2OCCN=2)C=C1Cl FCSKOFQQCWLGMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010070586 Chromozym PK Proteins 0.000 description 1
- 235000001258 Cinchona calisaya Nutrition 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N Dextrotartaric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)[C@@H](O)C(O)=O FEWJPZIEWOKRBE-JCYAYHJZSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- RSYYQCDERUOEFI-JTQLQIEISA-N N-benzoyl-L-arginine Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)C1=CC=CC=C1 RSYYQCDERUOEFI-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N Tartaric acid Natural products [H+].[H+].[O-]C(=O)C(O)C(O)C([O-])=O FEWJPZIEWOKRBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CIUQDSCDWFSTQR-UHFFFAOYSA-N [C]1=CC=CC=C1 Chemical compound [C]1=CC=CC=C1 CIUQDSCDWFSTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 150000008065 acid anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000005904 alkaline hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N alpha-ethylcaproic acid Natural products CCCCC(CC)C(O)=O OBETXYAYXDNJHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-UHFFFAOYSA-N alpha-phenylglycine Chemical group OC(=O)C(N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 1
- 229960004050 aminobenzoic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N benzyl bromide Chemical compound BrCC1=CC=CC=C1 AGEZXYOZHKGVCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 125000006267 biphenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N cinchonine Natural products C1C(C(C2)C=C)CCN2C1C(O)C1=CC=NC2=CC=C(OC)C=C21 LOUPRKONTZGTKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- QLACLEPYLWLNTD-UHFFFAOYSA-N dihydrocinnamic acid Natural products COc1ccc(CCC(O)=O)c(O)c1OC QLACLEPYLWLNTD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000058 esterolytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 1
- NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N ethyl (e)-3-[3-amino-2-cyano-1-[(e)-3-ethoxy-3-oxoprop-1-enyl]sulfanyl-3-oxoprop-1-enyl]sulfanylprop-2-enoate Chemical compound CCOC(=O)\C=C\SC(=C(C#N)C(N)=O)S\C=C\C(=O)OCC NLFBCYMMUAKCPC-KQQUZDAGSA-N 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000007654 immersion Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002960 margaryl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- AGJSNMGHAVDLRQ-HUUJSLGLSA-N methyl (2s)-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-amino-3-sulfanylpropanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxy-2,3-dimethylphenyl)propanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoate Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)OC)CC1=CC=C(O)C(C)=C1C AGJSNMGHAVDLRQ-HUUJSLGLSA-N 0.000 description 1
- GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N methyloxidanyl Chemical group [O]C GRVDJDISBSALJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012452 mother liquor Substances 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 125000002801 octanoyl group Chemical group C(CCCCCCC)(=O)* 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 235000006408 oxalic acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 125000001147 pentyl group Chemical group C(CCCC)* 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical class OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 1
- 229960000948 quinine Drugs 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- BRBKOPJOKNSWSG-UHFFFAOYSA-N sulfaguanidine Chemical group NC(=N)NS(=O)(=O)C1=CC=C(N)C=C1 BRBKOPJOKNSWSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000002906 tartaric acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011975 tartaric acid Substances 0.000 description 1
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 description 1
- 150000004992 toluidines Chemical class 0.000 description 1
- 125000004044 trifluoroacetyl group Chemical group FC(C(=O)*)(F)F 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000000304 vasodilatating effect Effects 0.000 description 1
- ORQXBVXKBGUSBA-QMMMGPOBSA-N β-cyclohexyl-alanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1CCCCC1 ORQXBVXKBGUSBA-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
- C07K5/08—Tripeptides
- C07K5/0821—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp
- C07K5/0823—Tripeptides with the first amino acid being heterocyclic, e.g. His, Pro, Trp and Pro-amino acid; Derivatives thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
- C12Q2337/10—Anilides
- C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører tripeptid-er som kan
anvendes som kromogene henh. fluoriserende substrater for kvantitativ bestemmelse av proteolytiske enzymer fra enzymklassen E.C. 3.4.21., hvilke peptidkjeder på karboksylsiden spalter fra
både arginin og lysin, unntatt thrombin og thrombinlignende enzymer, i kroppsvæsker hos mennesker og pattedyr, samt i vegetabilske og animalske celleekstrakter og kjertelgifter hos kaldblodige dyr.
Kallikrein, et i kroppsvæsker ( f.eks. blodplasma) og visse
organer ( f.eks. pankreas) hos mennesker og pattedyr forekommende enzym med karutvidende aktivitet bestemmes på den ene siden ved biologiske metoder og på den annen side ved enzymatiske metoder. De biologiske bestemmelsesmetodene beror på måling av den av kallikrein bevirkede endringen av karotistrykket hos narkotiserte hund eller bestemmelse av kallikrein i isolert marsvintarm i tyrodeopplosning som folge av frigjoring av kinin fra kininasefri kininogenopplosning )(se f.eks. E.K. Frey et al., "Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren",
Ferdinand Enke Verlag, Stuttgart, 1968, S. 11 og 12). Disse biologiske metodene er beheftet med den store ulempe at man trenger forsoksdyr for å gjennomfore den. Derfor ble det såkalte ensymatiske bestemmelsesmetodene utviklet hvorved det ble gjort bruk av den esterolytiske virkningen av kalli-
krein på visse estersubstrater. Som substrat anvender man f.eks. Na<->benzoyl-L-arginin-etylester, som av kallikrein spaltes i Na<->benzoyl-L-arginin og etylalkohol. Spaltningen kan f.eks.
måles ved spektrofotometrisk bestemmelse av den tiltakende ekstinsjonen ved bolgelengden 253 nM. Videre proteolytiske spaltbare estersubstrater, som egner seg for kallikreinbestemmelsen er N CC -benzoyl-L-arginin-metylester, N CL-toluen-sulfonyl-L-arginin-metylester og Na<->acetyl-L-tyrosin-etylester (se f.eks. E.K.
Frey et al., "Das Kallikrein-Kinin-System und seine Inhibitoren", Ferdinand Enke Verlag, Stuttgart, 1968, s. 12-14 og G.L. Haberland et al., "Kinogenases (Kallikrein)", Ist Symposium on Physiological Properties and Pharmacological Rational, F.K. Schattauer Verlag, Stuttgart-New York, 1973, s. 43 og 44).
Disse enzymatiske bestemmelsesmetodene har den fordel at det
ikke trengs forsoksdyr for å gjennomfore dem, de er dog beheftet med vektige ulemper. Kallikreinopplosningene som anvendes for bestemmelsen må være optisk klare og deres kon-sentrasjoner må ikke bevirke noen sterkere egenabsorpsjon ved 253 nM. Den store ulempen ved denne esterspaltningsmetoden består deri at de anvendte oppløsningen av estersubstratet (f.eks. N cx-benzoyl-L-arginin-etylester) har en hoy egenabsorpsjon (ekstinksjonen av en 5 x lo molar opplosning i en celle på 1 cm utgjor ved 253 nM 2,1). Ved enda hoyere kallikreinkonsentrasjoner angir de fleste UV-spektrofotometere ingen ekstinksjonsverdier som er proporsjonale med anvendt konsentrasjon ( se G.L.
Haberland et al, ibid., side 44).
I DOS nr. 2.322.116 er beskrevet et såkalt amidsubstrat som spaltes amidolytisk av visse enzymer fra klasse E.C. 3.4.4.
(Enzymnomehklatur: "E.C. er forkortingen for "Enzyme Committee" fra "International Union of Biochemistery") særlig thrombin og thrombinlignende enzymer. Dette substratet oppviser en tripeptidkjede med formelen
hvori den N-avsluttende aminosyren er blokkert av en acylgruppe og den C-avsluttende aminosyren er substituert av en kromogen hhv. fluorescerende gruppe som avspaltes under innvirkning av nevnte enzymer og gir et spaltningsprodukt hvis mengde kan bestemmes fotometrisk. Dette substratet egner seg spesielt for bestemmelse av thrombin og thrombinlignende enzymer, men er dog fullstendig ubrukbar for bestemmelsen av kallikrein og-pre-kallikrein.
Oppgaven som ligger.til grunn for foreliggende oppfinnelse besto deri å utvikle et syntetisk amidsubstrat som skulle være lett og raskt hydrolytisk spaltbart av plasmakallikrein og gi spaltningsprodukter som skulle la seg lett bestemme ved spektrofotometriske metoder.
For å lose denne oppgaven ble det gått ut fra at kallikrein ved sjokktilstander hos mennesker ved hydrolytisk virkning frigjor det biologisk meget virksomme, smertefremkallende bradykinin (molekylvekt ca. looo) fra det naturlig forekommende substratet kininogen (molekylvekt ca. 5o.ooo) og at man ved anvendelse av et C-avsluttende strukturelement i bradykinin
og tilknytning av dette elementet til en kromogen hhv. fluorescerende gruppe kunne få et syntetisk amidsubstrat, som oppviser samme eller tilnærmet samme suspektibilitet ovefor plasma-kallikrein som det naturlige substratet og ved hydrolyse ville gi et kromogent hhv. fluorescerende spaltningsprodukt med boy molekylær ektinksjonskoeffisent målbar ved hoye bolgelengder, slik at innflytelsen av den biologiske væsken på målingen skulle være sterkt nedsatt.
Det er nå utviklet et syntetisk substrat som tilsvarer de ovenfor angitte krav.
Foreliggende oppfinnelse vedrører tripeptider, hvilke kan anvendes som kromogene henh. fluoriserende substrater for kvantitativ bestemmelse av proteolytiske enzymer fra enzymklassen E.C. 3.4.21., hvilke peptidkjeder på karboksylsiden både spalter fra arginin og lysin med unntak av thrombin og thrombinlignende enzymer i kroppsvæskene til mennsker og pattedyr, samt i vegetabilske og animalske celle-ekstrakter <p>g kjertelgifter hos kaldblodige dyr. Tripeptidene ifølge oppfinnelsen er karakterisert ved at de har den følgende struktur:
hvori R betyr hydrogen, en benzen- eller p-toluensulfonylgruppe
3 3
eller en R -CO-gruppé hvor R er en alifatisk hydrokarbonrest med
1 til 17 karbonatomer som eventuelt er substituert med en amino-gruppe i 6*>-stilling, en aralifatisk hydrokarbonrest med 7 til 17 karbonatomer som eventuelt er substituert med en aminogruppe i arylkjernen, en cykloalifatisk hydrokarbonrest som eventuelt er substituert med en amino- eller aminometylgruppe, en aromatisk hydrokarbonrest som eventuelt er substituert med en alkyl-, amino- eller aminoalkylgruppe eller en benzyloksy-
2
gruppe. R er en p-nitrofenyl-, 2-naftyl- eller 4-metoksy-2-naftylgruppe, x er én fenylalanyl-, Ø-cykloheksylalanyl-, fenylglycyl- eller tyrosylgruppe, og Y en protonisert arginyl- eller lysylgruppe, og salter av disse med en mineral-
syre eller en organisk syre. De avgir et spaltningsprodukt med formelen NI^-R 2under hydrolytisk påvirkning av enzymer, spektrometiske eller fluorescensfotometriske metoder.
R 3'kan særlig være en alkylgruppe som metyl-, etyl-, propyl-, butyl-, pentyl- osv. til heptadecyl. Denne alkylgruppen kan bære en aminogruppe i uv-stilling. Dermed kan R 3 f.eks. være en (U-aminopropyl-, id-aminopentyl eller (,0-aminononylgruppe. r kan videre betegne en benzyl-, 2-fenyletyl-, 3-fenyl-propyl-, osv. til 11-fenylundecylgruppe. Fenylresten i nevnté grupper kan være en aminogruppe i p-stilling. Dermed kan R<3 >være en p-aminobenzyl-, 2-(p-aminofenyl)-etyl-, 3-(p-aminofenyl)-propyl, osv. til 11-(p-aminofenyl)-undecylgruppe.
R 3kan ytterligere være en cykloheksyl-, 4-aminocykloheksyl-, 4-aminopropylcykloheksyl- eller 4-aminobutyl-cyklloheksyl-gruppe. R 3 kan enda utgjøre en fenyl-, a-naftyl, 3-naftyl eller bifenylgruppe. Disse gruppene kan på sin side være en aminogruppe, en aminoalkylgruppe eller en alkylgruppe.
Disse alkylgruppene kan være f.eks. metyl, etyl, propyl, isopropyl, butyl eller isobutyl, Endlig kan R 3 utgjøre en benzyloksygruppe. ■
Tripeptidderivatene med formel I kan være protonisert med en mineralsyre, f.eks. HC1, HBr, H2S04 eller I^PC^ eller en organisk syre, f.eks. maursyre, oksalsyre eller vinsyre.
De følgende enkeltvis opptelte tripeptidderivater har en særlig høy ømfintlighet (spaltbarhet) overfor plasmakallikrein og spaltes bare lite eller overhode ikke av andre plasmaproteaser (høy spesifisitet): Na<->3-fenylpropionyl-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid-hydroklorid, Na-cykloheksylkarbonyl-Pro-Phe-Arg-pNA-hydroklorid, Na<->benzoyl-Pro-Phe-Arg-p-nitroanilid-hydroklorid, Na<->Cbo-Pro-Phe-Arg-pNA-hydroklorid, Na<->oktanoyl-Pro-Phe-Arg-pNA-hydroklorid, H-Pro-Phe-Arg-pNA-dihydroklorid, Ha<->Ac-Pro-Phe-Arg-pNA-hydroklorid, Na<->4-metylbenzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA-hydroklorid, wa- co -aminokaproyl-Pro-Phe-Arg-pNA-dihydroklorid, Na<->4-aminometylcyklohek-sylkarbonyl-Pro-Phe-Arg-pNA-dihydroklorid, Na<->Tos-Pro-Phe-Arg-pNA-hydroklorid, Na<->4-aminofenyl-acetyl-Pro-Phe-Arg-pNA-di-hydroklorid, Na<->4-aminobenzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA-dihydroklorid, . Na-Bz-Pro-CHA-Arg-pNA-hydroklorid, Na<->Bz-Pro-Tyr-Arg-pNA-hydroklorid, Na<->Bz-Pro-Ph.Gly-Arg-pNA-hydroklorid, Na<->Bz-Pro-Phe-Arg-2-NA-hydroklorid, Na<->Bz-Pro-Phe-Arg-4-MeO-2-NA-hydroklorid.
Oppfinnelsen vedrører videre anvendelsen av det ovenfor angitte substratet
for kvantitativ bestemmelse av plasmakallikrein og indirekte inhibitorer derav, plasmaprekallikrein og akti-va torer derav, papain og prothrombinaktivatorer i kroppsvæsker hos mennesker og pattedyr, samt i vegetabilske og animalske celle-ekstrakter og kjertelgifter hos kaldblodige dyr.
1) Ved den første metoden ble de kromogene gruppene (R<2>
i formel I påhengt den C-avsluttende aminosyregruppen. Disse gruppene utøver samtidig funksjonen som C-avsluttende kar-boksylbeskyttelsesgrupper under den trinnvise påhenging av aminosyrer opp til det ønskede peptidskjellettet. De øvrige beskyttelsesgruppene avspaltes selektivt fra sluttproduktet uten at den kromogene gruppen påvirkes. Denne metoden er f.eks. beskrevet i "Peptide Synthesis" av Miklos Bodanszky et al, Interscience Publishers, 1966, side 163-
165. 2) I den andre metoden blir den kromogene gruppen koblet til det ferdige oppbyggede peptidskjellettet, og dette derved at etter avsluttet, trinnvis oppbygning av det onskede peptidskjellettet frigjores den C-avsluttende karboksylgruppen forst ved alkalisk hydrolyse av esteren, hvoretter den kromogene gruppen henges på karboksylsgruppen.
De ovrige beskyttelsesgruppene blir til slutt selektivt avspaltet og dette under betingelser hvorved den kromogene gruppen forblir intakt. Denne metoden er beskrevet i "Peptide Synthesis" se ovenfor, side 43 og 44. 3) Ved den tredje metoden blir den kromogene gruppen koblet til det ferdige oppbyggede peptidskjellettet etter at forst de ovrige beskyttelsesgruppene er blitt avspaltet.
Den C-avsluttende karboksylgruppen blir i dette tilfellet
satt fri ved racemiseringsfri enzymatisk esterspaltning. Disse esterspaltende enzymene kan enten være fri eller bundet til en matrise.
For å beskytte Na<->aminogruppen under den trinnvise oppbygningen av peptidkjeden kan det anvendes vanlige kjente aminobeskyttelses-grupper som kan avspaltes selektivt. Det dreier seg i forste linje om Cbo, MeOCbO, N02Cbo, MCbo, BOC, TFA eller formyl. Aminosyrenes a-karboksylgruppe kan gjores reaktiv ved forskjellige kjente metoder, f.eks. fremstilling av p-nitrofenylesterderivater, triklorfenylesterderivater, pentaklorfenylesterderivater, N-hydroksysukkinimidesterderivater og isolering av disse derivatene eller ved fremstilling i situ av syreazider eller syreanhydrider, som enten kan være symmetriske eller asymmetriske.
Aktiveringen av karbonylgruppen kan også utfores ved et karbo-diimid, som N,N<1->dicykloheksylkarbodiimid.
Karboksylgruppen som er C-endestående i peptidderivatene beskyttes enten ved hjelp av den kromogene amidgruppen eller som metyl-, etyl- eller isopropylesteren under den trinnvise oppbygningen av det onskede peptidskjellettet.
De ovrige frie reaktive gruppene, som ikke er delaktige
i oppbygningen av peptidskjellettet, kan blokkeres ved folgende
spesielle forholdsregler: S-guanidingruppen i arginin beskyttes gjennom NO^, Tos eller ved enkel protonisering.
Fremstillingen av substratet ifolge oppfinnelsen beskrives etter de ovenfor nevnte metoder i de folgende eksempler.
Analysen av de if&lge eksemplene erholdte eluater og produkter ble utfort ved tynnsjiktskromatografi. For dette formål ble anvende glassplater overtrukket med siliciumdioksydgel F 254 (Merck). For å utvikle tynnsjiktskromatogrammene
ble de de folgende opplosningsmiddelsystemer anvendt:
A Kloroform/metanol (9:1)
B n-propanol/eddiksyreetylester/vann (7:1:2)
C n-butanol/eddiksyre/vann (3:1:1)
Kromatogrammet ble forst utviklet i UV-lys og så ved reaksjon med klor/toluidin (se G. Pataki, "DUnnschichtchromatographie in der Aminosaure- und Peptid-Chemie", Walter de Gruyter & Co., Berlin, 1966, s. 125).
I den foreliggende beskrivelse (innbefattet patentkrav) anvendes folgende forkortelser:
Arg = arginin
Ile = isoleycin
Lys = lysin
Pro = prolin
Phe = fenylalanin
Tyr = tyrosin
Val = valin
C-PH.Gly = C-fenylglycin
CHA = (3-cykloheksylalanin
Såfremt det ikke er angitt noe annet, oppviser alle aminosyrene i peptidkjedene, som er beskrevet i eksemplene, L-konfigurasjon.
Ac = acetyl Ac20 = eddiksyreanhydrid
AcOH = eddiksyre
BOC = Tert.-butyloksykarbonyl
Bz = benzoyl
Bzl = benzyl
BZ2O = benzosyreanhydrid
Cbo = Karbobenzoksy
DCCI = Dicykloheksylkarbodiimid
DCHA = dicykloheksylamin
DCH = dicykloheksylurea
DMF = dimetylformamid
Et^N = trietylamin
HMPTA = N,N,N',N',N",N"-heksametylfosforsyretriamid MCbo = p-metoksyfenylazokarbobenzoksy MeOH = Metanol NA = naftylamin
OtBu = tert.-butyloksy
OEt = etyloksy
OMe = metyloksy
OpNP = p-nitrofenoksy
OisoPr = iso-propyloksy
pNA = p-nitroanilid
TFA = trifluoracetyl
Tos = p-tolyensulfonyl
DSC = tynnsjiktskromatografi
EKSEMPEL 1
I. Na<->Bz-Pro-Phe-Arg-P.NA.HCl.
a) Na<->Cbo-Arg(N02)-p.NA.
1) I en 5oo ml trehalsrundkolbe ble 32,55 g (92,1 mmol) godt
torket Cbo-Arg(N02)-0H i 2oo ml av N,N,N',N',N",N"-heksametyl-fosforsyretriamid,torket over P90j- og friskt destillert, opplost under utelukkelse av fuktighet ved 2o oC. Til denne oppløsningen ble forst 9,23 g (92,1 mmol) Et3N og etterpå
18,9o g (115,1 mmol) p-nitrofenylisocyanat i 25 %'ig overskudd prosjonsvis tilsatt. Etter 24 timers reaksjonstid ved romtemperatur ble under roring réaksjonsblandingen tilsatt dråpevis til 1,5 1 2%'ig NaHC03-oppl6sning. Det utfelte produktet ble avfiltrert og vasket tre ganger med hver o,7 1 2%'ig NaHCO^-opplosning, tre ganger med hver o,7 1 dest. vann, tre ganger med hver o,5 1 o,5-N HCL og til slutt tre ganger med hver o,5 1 dest. vann. Det på denne måten erholdte produkt ble torket ved 4o°C i vakuum og heretter ekstrahert to ganger med hver 2oo ml kokende metanol, hvorved hovedmengden av det utfelte N cx-Cbo-iu-nitroargininlaktamet fra biproduktet ved siden av bare små mengder av det onskede produkt ble utlost.
Det på denne måten erholdte, prerensede produkt ble etter torking ekstrahert to ganger med hver 5o ml DMF oppvarmet til 7o°C, hvorved det onskede produktet ble fullstendig utlost, mens biproduktet, nemlig N,N'-bis-p-nitrogenylurea ble uopplost tilbake. DMF-opplosningen ble inndampet i vakuum ved 4o°C. Etter tilsetning av MeOH krystalliserte det seg en substans, som var kromatografisk enhetlig i opplosningsmiddelsystemet A og B og oppviste et smp. på 186-188,5°C.
Utbytte: 29,75 g ( 68,2% teoretisk). Ved elementæranalyse
og beregning fra bruttoformelen C^t^^N^O^ ble de folgende verdier bestemt ( verdiene for bruttoformelen står i parantes): C = 5o,42% (5o,74%), H = 4,98% (4,9o%), N = 2o,9o% (2o,71%). /a/p<2> = 1,27° ( c = l,o, AcOH). 2) I en 5oo ml trehalsrundkolbe able 17,7 g (5o mmol) torket Cbo-Arg(N02)-0H i 35o ml THF:DMF (1:1) opplost, hvoretter 5,o5 g (5o mmol) Et3 ~N ble tilsatt tunder utelukkelse av fuktighet.
Etter avkjoling av reaksjonsopplosningen til -lo° ble så 6,85 g
(5o mmol) klormaursyreisobutylester, opplost i 3o ml THF, tildryppet i lopet av 15 minutter, hvorved det ble holdt en temperatur på -lo° - -5°C. Etter ca. lo minutter ble 8,2 g (5o mmol) p-nitroanilin opplost i 15 ml DMF, tildryppet, hvorved det ble holdt en temperatur på -lo - -5°C. Etter 2 timer ble kjolingen avbrutt og reaksjonsblandingen fikk stå i 24 timer ved romtemperatur. Etter avdestillering av opplosningsmiddelet i vakuum ble resten digerert etter hverandre med hver tre ganger dest.
vann, tire ganger med 5%'iger NaHCO^-opplosning og igjen tre ganger med est. vann. Etter torking i vakuum ble råproduktet opplost i metanol og latt lope over en soyle "Sephadex LH-2o ekvilibrert med metanol (fomettet Dextrangel) .Fra en fraksjon av eluatet erholdt man 7,67 g substans ( 32,4% av teorien) med de samme fysikalske egenskapene som det ifolge 1) erholdte sluttproduktet.
3) 17,7 g ( 5o mmol) Cbo-Arg(N02)-0H ble opplost i 75 ml DMF.
Etter avkjoling. til -lo°C ble opplosningen tilsatt med lo,3 g
(5o mmol) DCCI og 8,2 g (5o mmol) p-nitroanilin etter hverandre. Etter 4 timer ved -lo°C og 2o timer ved 2o°C ble den dannede
DCH avfiltrert og filtratet inndampet til torrhet. Råproduktet
ble opplost i MeOH og latt lope over en soyle "Sephadex LH-2o" ekvilibrert med MeOH. Ved siden av mye biprodukt, nemlig N-Cbo-Arg-(N02)-N,N'-dicykloheksylurea, ble det erholdt
fra en fraksjon av eluatet 4,32 g substans (17,9 % av det teoretiske) som hadde de samme fysikalske egenskapene som råproduktet fremstilt ifolge 1).
b) Na<->Cbo-Phe-Arg(N02)p.NA.
9,5 g (2o mmol) Na<->Cbo-Arg(N02)-p.NA ( se eksempel la) ble
behandlet i en kolbe med 8o ml 2-n HBr i iseddik under roring i en time ved 2o°C under utelukkelse av fuktighet, hvorved denne substansen oppldstes under C02-utvikling. Reaksjonsopplosningen ble tildryppet 4oo ml torket eter under intensiv roring, hvorved HBr.H-Arg(N02)-p.NA ble utfelt. Eterfasen ble oppsuget med en filtrerstav. Det utfelte som ble igjen ble behandlet 4 ganger til med hver 15o ml torr eter for å
fjerne det dannede benzylbromid og overskudd HBr samt eddiksyre.
Etter torking i vakuum over NaOH-flak ble det deblokkerte produktet erholdt i kvantitativt utbytte. Det torre hydrobromid-derivatet ble opplost i 5o ml DMF, avkjolt til -lo°C og tilsatt 4,16 ml ( 3o mmol) Et3N for å frigjore H-Arg(N02)-p.NA fra hydrobromidet. Det dannede Et3N.HBr-saltet ble franutsjet, vasket met litt kalt DMF og filtratet ble tilsatt 7,8 g (21 mmol) Cbo-Phe-OpNP ved -lo°C. Etter noen timer var reaksjonsblandingen kommet på romtemperatur. Den ble igjen avkjolt til -lo°C og puffret med 1,4 ml (lo mmol) Et^N. Etter ca. 24 timer ble reaksjonsopplosningen inndampet i vakuum ved 4o°C til torrhet. Resten ble digerert tre ganger med hver loo ml dest. H^O og igjen torket i vakuum ved 4o C over NaOH-flak. Det torkede produkt ble omkrystallisert fra metanol, hvorved det ble erholdt 7,84 g substans, som var kromatografisk enhetlig med de i opplosningsmiddelsystemene A og B. Fra moderluten ble ytterligere 3,14 g substans erholdt ved gelfiltrasjon over en soyle av "Sephadex LH-2o" ekvilibrert med MeOH. Således ble det totalt erholdt lo,98 g (88,5% av det teoretiske) enhetlig substans med et smp. på 2o3-2o5°C. Elemetæranalyse og beregning fra bruttof ormelen <C>2<gH>32<N>8°8^a de f°l(3enc^e verdier ( verdiene for bruttoformelen er satt i parantes): C = 55,88% (C = 56,12), H = 5,o5% ( H = 5,2o%), N = 18,31 %
(N = 18,o6%).
c) Na<->Cbo-Pro-Phe-Arg(N02)-p.NA
31,o g ( 5o mmol) N CL-Cbo-Phe-Arg(N02)-p.NA ( se eksempel IB)
ble behandlet med 25o ml 2-n HBr i iseddik (o,5 mol) og opparbeidet som i eksempel lb).Dipeptidderivatet til det over NaOh-flak i vakuum torkede hydrobromidet ble opplost i 15o ml DMF og tilsatt etter kjoling med 7,5 g Et^N i 15 ml DMF (75 mmol). Dannet Et^N.HBr ble avfiltrert og vasket med
litt kalt DMF. Til filtratet ble 18,5 g (5o mmol) Cbo-ProTOpKP tilsatt. Den videre opparbeidelsen fulgte analogt til eksempel lb). Gjennom gelfiltrering på en "Sephadex LH-2o"-s6yle ekvilibrert med MeOH ble erholdt etter eluering med MeOH 3o,9 g (86,2% av det teoretiske) en substans kromatografisk enhetlig fra i opplosningsmiddelsystemene A og B med et smp. på 184-186°C. Elementæranalysen og beregningen fra bruttoformelen C34H39<N>9°g
ga de folgende verdier: C 56,75% (56,9o%), H = 5,5o% ( 5,48%),
N 17,7o% (17,56%) (verdiene for bruttoformelen er satt i parantes).
d) Na<->Bz-Pro-Phe-Arg(N02)-p.NA
14.4 g ( 2o mmol) N cx-Cbo-Pro-Phe-Arg(N02)-p.NA ( se eksempel
lc) ble behandlet med 12o ml 2-n HBr i iseddik ( o,24 mol). Reaksjonsblandingen ble opparbeidet som i eksempel lb).
Etter opplosning av det torkede tripeptidhydrobromid-derivatet
i 6o ml DMF ble opplosningen tilsatt 4,16 ml Et^N (3o mmol)
etter avkjoling. Det dannede Et3N.HBr ble avfiltrert og vasket med litt kald DMF. Det erholdte filtratet ble tilsatt 6,8 g
(3o mmol) benzoysyreanhydrid. Deretter ble det puffret og opparbeidet som i eksempel lb). Det erholdte råproduktet ble renset over en "Sephadex LH-2o"-sdyle ekvilibrert med MeOH.
På denne måten erholdt, man 11,3 g ( 82,o%.av det teoretiske)
av i opplosningsmiddelsystemene A og B kromatogrifisk enhetlig, amorf substans. Elementæranalyse og beregning fra brutto-
formelen C^H^NgOg ga de folgende verdier: C = 57,51% (57,63%),
H = 5,38% (5,42%), N = 18,47% (18,33).
e) N<ft->Bz-Pro-Phe-Arg-P.NA.HCl.
688 mg ( 1 mmol) N°-Cbo-Pro-Phe-Arg(N02)-p.NA ( se eksempel ld)
innveiet i reaksjonskaret i et Sakakibara-apparat. lo ml torr fluorhydrogengass ble kondensert i reaksjonskaret.
Etter reaksjonstid på 1 time ved 0°C nitrobeskyttelsesgruppen avspaltet under roring. Den kondenserte fluorhydrogengassen ble avdestillert i vakuum og resten opplost i DMF. For å overfore peptid-derivatet i HCl-saltet ble o,5 ml kons. HC1 til-
satt og opplosningen inndampet til torrhet. Etter to gangers repetering av denne prosessen ble resten opplost i 5o ml 3o%'ig eddiksyre. For rensning ble eddiksyreopplosningen påfort en "Sephadex G-15"-s6yle ekvilibrert med 3o%'ig eddiksyre og eluert med 3o%'ig eddiksyre. Etter frysetorking av en del av eluatet erholdt man 572 mg ( 84,2% av det teoretiske) av et amorft pulver, som var kromatografisk enhetlig i opplosningsmiddelsystemet C. Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C33H3gNg06Cl ga.de folgende verdier: C = 58,12% (58,36%),
H = 5,7o% (5,79%), N16,65% (16,5o%) og Cl 5,15% (5,22%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrene i riktig forhold:
Arg: o,98 - Phe: l,o - Pro: o,97
EKSEMPEL 2
II. H-Pro-Phe-Arg-pNA.2HC1
718 g ( 1 mmol) N<tt->Coo-Pro-Ph-Arg(N02)-pNA fremstilt ifolge eksempel 1, avsnitt lc, ble innveiet i reaksjonskammeret til et Sakakibara-apparat. lo ml torket fluorhydrogengass ble kondensert i reaksjonskaret. Etter en reaksjonstid på 1 time ved 0°C ble nitrobeskyttelsesgruppen avspaltet under roring.
Den kondenserte fluorhydrogengassen ble avdestillert i vakuum
og resten opplost i DMF. For å overfore peptid-derivatet til HCl-saltet ble o,5 ml kons. HCl og opplosningen inndampet
til torrhet. Etter to gangers repetering av dette ble resten opplost i 5o ml 3o%'ig eddiksyre. For rensing ble eddiksyreopplosningen satt på en "Sephadex G-15"-s6yle ekvilibrert med eddiksyre og eluert med 3o%'ig eddiksyre. Etter fryse-tørkingen av en del av eluatet erholdt man 385 g (63,o% av det teoretiske) et amorft pulver,som var tynnsjiktskromatogra-fisk enhetlig i opplosningsmiddelsystemet C. Elementæranalyse og beregningen fra bruttof ormelen C26H36N8°5C"1"2 ^a ^e f°l9en<^e verdier: C = 5o,95% (51,o5%), H = 5,9o (5,93%), N = 18,41%
(18,32%) og Cl = 11,52% (ll,6o%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrene i riktig forhold:
Arg: o,95 - Phe: l,oo - Pro: l,oo
EKSEMPEL 3
III. N°-Ac-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl.
Illa. N°-Ac-Pro-Phe-Arg(N02)-pNA
1,44 g ( 2 mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge eksempel 1, avsnitt Ic, ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib, opplost i lo ml DMF og tilsatt med 42o fil (3mmol) Et3N. Etter avkjoling ble reaksjonsblandingen tilsatt 4oo u-l (rx 4 mmol) Ac20 og viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt ld. Rensing: Gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i metanol. Utbytte: l,o5 g amorf substans (83,9% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS A og B. Elementæranalyse og beregning fra bruttoformele<n> C28H3 5N9°8 ^a
de folgende verdier: C = 53,68% (53,75%), H = 5,6o% (5,64%),
N = 2o,2o% (2o,15%).
III. Na<->Ac-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
626 mg ( 1 mmol) av forbindelsen Illa ble omsatt til forbindelsen III ifolge eksempel I, avsnitt le. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 521 mg frysetorket amorft pulver ( 84,4% av detteoretiske), enhetlig i DSC i LMS
C. Elemetæranalyse og beregning fra bruttoformelen C^H^NgOgCl
ga de folgende verdier: C = 54,25% ( 54,5o%), H = 6,ol% (6,o4%),
N = 18,25% (18,16%), Cl = 5,71% ( 5,75%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminsyrer i riktig forhold:
Arg: o,99 - Phe: l,oo - Pro: o,97
EKS EMPEL 4
IV. Na<->.oktanoyl.-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
IVa. Na<->.oktanoyll-Pro-Phe-Arg (N02) -pNA
718 mg ( 1 mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge eksempel 1, avsnitt Ic, ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib,
opplost i lo ml DMF og tilsatt 21o U-l .(1,5 mmol) Et^N.
Etter avkjoling ble reaksjonsblandingen tilsatt 4oo mg (-^1,5 mmol) "oktahsyrei-p-nitrofenylester og reaksjonsproduktet ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Rensing: gelfiltrerting på "Sephadex LH-2o" i metanol. Utbytte: 49o mg amorf substans ( 68,8% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS A og B. Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C34H4gNgOg ga de folgende verdier: C = 57,51% (57,37%), H =
6,88% ( 6,94%), N = 17,8o% (17,71%).
IV. Na<->:0ktanoyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
356 mg ( o,5 mmol av forbindelsen IV a ble omsatt til forbindelsen IV ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensing:gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 226 mg frysetorket amorft . pulver (64,3% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C^H^Ng<OgCl>
ga de folgende verdier: C = 57,92% (58,o7%), H = 7,18% (7,31%),
N = 16,o8%) (15,93%), Cl = 4,98% ( 5,o4%).
Aminosyranalysen ga de ventede aminosyrene i riktig forhold:
Arg. o,99 - Phe: l,oo - Pro o,95
EKSEMPEL 5
V. Na<->cykloheksylkarbonyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl.
Va. Na<->cykloheksylkarbonyl-Pro-Phe-Arg(N02)-pNA.
718 mg ( 1 mmol) av forbindelsen erholdt ifolge eksempel 1, avsnitt Ic, ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib, opplost i
DMF og tilsatt 21o (il (1,5 mmol) Et-^N. Etter avkjoling ble reaksjonsblandingen tilsatt 375 mg ( 1,5 mmol) cykloheksankarboksylsyre-p-nitrofenylester. Reaksjonsproduktet ble ifolge eksempel 1, avsnitt Ib viderebehandlet. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i metanol. Utbytte: 593 mg amorf substans ( 85,5% av det teoretiske) enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C^H^<Ng>Og
ga de folgende verdier: C = 57,ol% ( 57,13%), H = 6,18% (6,25%), N = 18, 3o% (18,17%) .
V. N CL-cykloheksylkarbonyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl.
347 mg (o,5 mmol) av forbindelsen Va ble omsatt til forbindelsen V ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensing: Gelfiltrasjon på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 295 mg frysetorket amorft pulver ( 86,1 g av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregningen fra bruttoformélen .
<C>33<H>45<N>8°6C1 ga de f519ende verdier: C = 57,7o% (57,84%),
H = 6,66% (6,62%), N = 16,4o% (16,36%), Cl = 5,11% (5,17%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrene i riktig forhold:
Arg: o,97 - Phe: l,oo - Pro: o,95
EKSEMPEL 6
VI. Na<->4-metyl-benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
Via. N cc-4-metyl-benzoyl-Pro-Phe-Arg(N02)-pNA
718 mg ( 1 mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge eksempel 1, avsnitt Ic, ble ifolge eksempel 1, avsnitt Ib deblokkert,
opplost i lo ml DMF og tilsatt 21o (il (1,5 mmol) Et3N. Etter avkjoling ble reaksjonsblandingen tilsatt 386 mg (1,5 mmol) p-
toluensulfonsyre-p-nitrofenylester. Reaksjonsproduktet ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Rensing: Gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i metanol. Utbytte: 591 mg amorf substans ( 84,2% av det teoretiske), enhetlig i DSC
i LMS A og B.
Elemetæranalyse og beregning fra bruttoformelen C,,H,.N.On
34 39 9 8
ga de folgende verdier: C = 58,o7% (58,19%), H = 5,53% (5,6o%), N = 18,o6% (17,97%).
VI. Na<->4-metyl-benzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
351 mg (o,5 mmol) av forbindelsen Via ble omsatt til forbindelsen VI ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensing: Gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 248 mg frysetorket amorft pulver ( 71,5% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformele<n><C>34<H>4i<N>8°6C1 ga de folgende verdier: C = 59,ol% (58,91%), H = 5,86% (5,96%), N = 16,31% (16,17%), Cl = 5,o7% (5,11%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrene i riktig forhold: Arg: o,96 - Phe: l,oo - Pro: o,96
EKSEMPEL 7
VII. N°-3-fenyl-propionyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
Vila. N<rt->3-fenyl-propionyl-Pro-Phe-Arg(NO2)-pNA
718 mg ( 1 mmol) av forbindelsen erholdt ifolge eksempel 1, avsnitt Ic ble ifolge eksempel 1, avsats Ib deblokkert, opplost i lo ml DMF og tilsatt 21o (.il (1,5 mmol) Et N. Etter avkjoling ble reaksjonsblandingen tilsatt 4o7 mg ( 1,5 mmol) dihydrokanel-syre-p-nitrofenylester. Reaksjonsproduktet ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i metanol. Utbytte: 548 mg amorf substans (76,4% av det teoretiske) enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C35H4j_<Ng>°8
ga de folgende verdier: C = 58,58% (58,73%), H = 5,69% (5,77%), N = 18, 82% (17,16%) .
VII. Na<->3-fenyl-propionyl-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
358 mg ( o,5 mmol) av forbindelsen Vila ble omsatt til forbindelsen VII ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensing: Gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 3o3 mg frysetorket amorft pulver ( 85,7% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C^H^NgOgCl
ga de folgende verdier: C = 59,24% X59,44%), H = 6,11% (6,13%),
N = 15,98% (15,85%), Cl = 4,93% (5,ol%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrene i riktig forhold:
Arg: o,98 - Phe:l,oo - Pro: l,ol
EKS EMPEL 8
VIII. Na- (uj-aminokaproyl) -Pro-Phe-Arg-pNA. 2HC1.
Villa. Ntt- (N^Cbo-aminokaproyl-Pro-Phe-Arg (N02)-pNA.
718 mg ( 1 mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge eksempel 1, avsnitt Ic, ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib,
opplost i loi ml DMF og tilsatt 21o ^1 (1/5 mmol) Et3N.
Etter avkjoling ble reaksjonsblandingen tilsatt 49o mg ( 1,25 mmol) N^-Cbo-uj-aminokapronsyre-p-nitrof enylester. Reaks jonsproduktet ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Rensing: gelfiltrasjon på "Sephadex LH-2o" i metanol. Utbytte: 698 mg amorf substans ( 84,o% av det teoretiske) enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C4OH5oNio0io
ga de folgende verdier: C = 57,68% (57,82%), H = 6,o^(6,o7%),
N = 17,o2% (16,86%).
VIII. N cx- (tu-aminokaproyl)-Pro-Phe-Arg-pNA. 2 HC1.
415 mg ( o,5 mmol) av forbindelsen Villa ble omsatt til forbindelsen VIII ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 247 mg frysetorket amorft pulver (68,2% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C32H47<Ng>°6C-'-2
ga de folgende verdier: C = 52,85% (53,o4%)., H = 6, 5o% (6,54%),
N = 17,53% (17,4o%), Cl = 9,69 (9,79%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrene i riktig forhold: Arg: o,98 - Phe: l,oo - Pro o,95
EKS EMPEL 9
IX. N CX-4-aminometyl-cykloheksylkarbonyl-Pro-Phe-Arg-pNA.2 HC1. IXa. N cx-4-Cbo-aminometyl-cykloheksylkarbonyl-Pro-Phe-Arg(NC^)-pNA.
718 mg ( 1 mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge eksempel 1, avsnitt Ic, ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib, opplost i lo ml DMF og tilsatt 21o (il ( 1,5 mmol) Et3N. Etter avkjoling ble reaksjonsblandingen tilsatt 455 mg (1,1 mmol) 4-Cbo-aminometyl-cykloheksankarboksylsyre-p-nitrofenylester. Reaksjonsproduktet ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i metanol. Utbytte: 762 mg amorf substans ( 88,9% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C42H52Nio°lo ga de folgende verdier: C = 58,62% (58,87%), H = 6,o5% (6,12%), N = 16,54% ( 16,35%)..
IX. Na<->4-aminometyl-cykloheksylkarbonyl-Pro-Phe-Arg-pNA.2 HC1. 428 mg ( o,5 mmol) av forbindelsen IXa ble omsatt til forbindelsen IX ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 198 mg frysetorket amorft pulver ( 52,7% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C^H^<NgO>^<Cl >ga de folgende verdier: C = 54,22% (54,4o%), H = 6,53% (6,58%), N = 16,74% (16,58%), Cl = 9,36% (9,45%).
Aminosyreanlysen ga de ventede aminosyrer i riktig forhold: Arg: o,99 - Phe: l,oo - Pro: 1,ol
EKSE MPEL lo
X. Na<->Tos-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
Xa. Na<->Tos-Pro-Phe-Arg(N02)-pNA
718 mg ( 1 mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge eksempel 1, avsnitt Ic, ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib,
opplost i lo ml DMF og tilsatt 21o (.il (1/5 mmol) Et-jN. Etter avkjoling ble reaksjonsblandingen tilsatt 38o mg ( 2 mmol)/ tosylklorid. Reaksjonsproduktet ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Id. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i metanol. Utbytte: 225 mg amorf substans (3o,5% av
det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C-^H^gNgOgS
ga de folgende verdier: C = 53,59% (53,72%), H = 5,31 (5,33%),
N = 17,29 (17,o9%), S = 4,15% (4,35%).
X. Na<->Tos~Pro-Phe-Arg-pNA.HCl.
185 mg (o,25 mmol) av forbindelsen Xa ble omsatt til forbindelsen X ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensingi gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 127 mg frysetorket amorft pulver (69,6% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen <C>^H^N<gO>^<C>lS ga de folgende verdier: C = 54,18% (54,35%), H = 5,63% (5,67%), N = 15,52% (15,37%), Cl = 4,8o% (4,86%), S = 4,44% (4,4o%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrene i riktig forhold: Arg: o,95 _ Phe: l,oo - Pro: o,97.
EKSEMPEL 11
XI. Na<->4-aminofenyl-acetyl-Pro-Phe-Arg-pNA.2 HC1.
Xla. Na<->4-Cbo-aminofenyl-acetyl-Pro-Phe-Arg(N02)-pNA.
718 mg ( 1 mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge eksempel
.1, avsnitt Ic, ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt
Ib, opplost i lo ml DMF og tilsatt 21o [ il (1,5 mmol) Et^N. Etter avkjoling ble reaksjonsblandingen tilsatt 5o8 mg (1,25 mmol) 4-Cbo-aminofenyl-eddiksyre-p-nitrofenylester. Reaksjonsproduktet ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i metanol. Utbytte: 595 mg amorf substans (69,9% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C42H46Nio°lo
ga de folgende verdier: C = 58,96% (59,29%), H = 5,38% (5,45%),
N = 16, 55% (16,46%) .
XI. N ot-4-aminfenyl-acetyl-Pro-Phe-Arg-pNA.2HC1
425 mg (o,5 mmol) av forbindelsen Xla ble ifolge eksempel 1, avsnitt le omsatt til forbindelsen XI. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 315 mg frysetorket amorft pulver (84,6% av det teoretiske), enhetlig i DSC ±
LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C^H^NgOgCl,,
ga de folgende verdier: C = 54,72% (54,84%), H = 5,8o% (5,82%),
N = 17,o8% (16,93%), Cl = 9,43% (9,52%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrer i riktig forhold: Arg: o,99 - Phe: l,oo - Pro: o,96
EKSEMPEL 12
XII. Na<->4-aminobenzoyl-Pro-Phe-Arg-pNA.2HC1.
Xlla. N <cc->4-Cbo-aminobenzoyl-Pro-Phe-Arg(N02)-pNA.
718 mg ( 1 mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge eksempel 1, avsnitt Ic ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib, opplost i lo ml DMF og tilsatt 21o (il (1,5 mmol) Et3N. Etter avkjoling ble reaksjonsblandingen tilsatt 29o mg (1,25 mmol) 4-Cbo-amino-benzosyre-p-nitrofenylester. Reaksjonsproduktet ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Rensning: gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i metanol. Utbytte: 693 mg amorf substans (82,8% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C4i<H4>4<N>io<0>io ga de folgende verdier:C = 58,92% (58,84%), H = 5,16% (5,3o%),
N = 16,93% (16,74%).
XII. Na-4-aminobenzoyl-Proj-Pbe-Arg-pNA. 2 HC1
418 mg ( o,5 mmol) av forbindelsen Xlla ble omsatt til forbindelsen XII ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 282 mg frysetorket amorft pulver (77,2% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C33<H>4i<N>9°6<Cl>2
ga de folgende verdier: C = 54,o9% (54,25%), H = 5,60% (5,66%),
N = 17, 4896(17, 25%) , Cl = 9,65% (9,71%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrer i riktig forhold:
Arg: o,95 - Phe: l,oo - Pro: o,97
EKSEMPEL 13
XIII. Na<->Cbo-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl
Xllla. Cbo-Arg-pNA.HCl
I en trehalsrundkolbe med 25o ml innhold ble 16,o g (47,o mmol) Cbo-Arg-OH.HCl torket i vakuum over P2°5 opplost i 9o ml abs. HMPTA under fuktighetsutelukkelse ved 2o°C. Ved romtemperatur
ble den erholdte opplosningen forst porsjonsvis tilsatt en opplosning på 4,74 g (47,o mmol) Et-^N i lo ml HMPTA og deretter 16,4 g (loo mmol) p-nitrofenylisocyanat (loo%'ige overskudd). Etter 24 timers reaksjonstid ved 2o°C ble HMPTA avdestillert i storste del. Resten ble ekstrahert flere ganger med 3o%'ig eddiksyre. Resten ble kastet. De forente eddiksyreekstrakter ble videre renset ved gelfiltrering på en "Sephadex G-15"-s6yle,
som beskrevet i eksempel 1, avsnitt le. Etter frysetorking av en del av eluatet fikk man 12,6 g av et amorft pulver, som var enhetlig i DSC i LMS C og ble spaltet ved trypsin under fri-gjbring av pNA. Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C2oH25N6°5C1 da de f6' 1<3ende verdier: C = 51,29% (51,67%),
H = 5,48% (5,42%), N = 17,92% (18,08%), Cl = 7,5o% (7,63%).
Xlllb. Na<->Cbo-Phe-Arg-pNA.HCl
Unter utelukkelse av fuktighet ble 7,o g (15 mmol) av forbindelsen Xllla deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib og opparbeidet. Det således erholdte produkt ble opplost i 75 ml DMF, etter avkjoling tilsatt en opplosning på 1,52 g Et^N i lo ml DMF, hvoretter det dannede Et^N.HBr ble avfiltrert. Til filtratet ble 8,4 g ( 2o mmol) Cbo-Phe-OpNp tilsatt. Reaksjonen ble ellers utfort ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Reaksjonsopplosningen ble inndampet til torrhet i vakuum ved 4o°C, hvoretter resten ble opplost i 25o ml MeOH og opplosningen ble tilsatt 1,2o ml kons. saltsyre. Ved gelfiltrering på en "Sephadex LH-2o"-soyle i MeOH ble råproduktet renset. Fra en fraksjon erholdt man ved inndamping i vakuum 7,55 g (82,2% av det teoretiske) av det onskede produktet som var enhetlig i DSC i LMS C. Elementæranalyse og beregning fra bruttoformele<n><C>2<g>H3^<N>^OgCl
ga de folgende verdier: C = 57,o9% (56,91%), H = 5,5o% (5,60%),
N = 16,25% (16,o2%), Cl = 5,71%(5,79%).
XIII. Na<->Cbo-Pro-Phe-Arg-pNA.HCl.
673 mg ( 1,1 mmol) av forbindelsen XHIb ble deblokkert under utelukkelse av fuktighet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib og opparbeidet. Det torkede hydrobromidderivat ble opplost i lo ml DMF og etter kjoling (-lo°C) tilsatt 155 fil (1/1 mmol) Et^N. Deretter ble 555 mg ( 1,5 mmol) Cbo-Pro-OpNP. Etter 24 timers reaksjonstid ble reaksjonsopplosningen inndampet i vakuum til torrhet. Resten ble opplost i 3o ml MeOH og filtrert gjennom en soyle "Sephadex LH-2o" ekvilibrert med MeOH. For ytterligere rensing ble eluatet inndampet i vakuum og resten opplost i 3o% AcOH. Opplosningen ble filtrert gjennom en soyle av "Sephadex G-15". Etter frysetørking av en del av eluatet med tilsetning av 9o (il kons. HCl erholdt man 479 g (61,4% av det teoretiske) av et amorft pulver, som i DSC i LMS C var enhetlig. Elementæranalyse og beregning
fra bruttof ormelen C^<H>^<NgO>^<C>l ga de folgende verdier:
C = 57,11% (57,58%), H = 5,71% (5,83%), N = 16,15% (15,80%),
Cl = 4,92% (5,oo%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrer i riktig forhold:
Arg: o,95 - Phe: l,oo - Pro: o,98.
EKSEMPE L 14
XIV. Na<->Bz-Pro-CHA-Arg-pNA.HCl
XlVa. Na<->Cbo-CHA-Arg(N02)-pNA
9, 47 g ( 2o mmol) av forbindelsen fremstilt ifolge eksempel 1, avsnitt Ia ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Den torkede resten ble opplost i loo ml DMF. Etter avkjoling ble opplosningen tilsatt 3,o4 g ( 3o mmol) Et^N. Det dannede HBr-Et^N ble avfiltrert. Filtratet ble tilsatt ved-lo°C 9,37 g (22 mmol) Cbo-CHA-OpNP. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-2o"
i MeOH erholdt man 11,72 g (93,5% av det teoretiske) av den krystallinske forbindelsen XlVa, som smeltet ved 166-168°C og som var enhetlig i DSC i LMS A og B. Elementæranalyse og beregning
fra bruttoformele<n> CorH No0o ga de folgende verdier:
C = 55,2o% (55,58%), H = 5,98% (6,11%), N = 18,ol% (17,88%).
XlVb. Na<->Cbo-Pro-CHA-Arg(N02)-pNA.
6,27 g ( lo mmol) av forbindelsen XIV ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det torkede hydrobromidderivat ble opplost i 75 ml DMF. Etter avkjoling ble opplosningen tilsatt 2,o8 ml (15 mmol) Et^N. Det dannede HBr.Et^N ble frafiltrert. Filtratet ble tilsatt 4,o7 g (11 mmol) Cbo-Pro-OpNP ved -lo°C. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i MeOH erholdt man 6,18 g (85,3% av det teoretiske) av den amorfe forbindelsen XlVb, som var enhetlig i DSC i LMS A og B. Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C34H45Ng°g 9a de folgende verdier: C = 56,22% (56,42%), H = 6,14% (6,27%),
N 17,3 5% (17,42%).
XIVc. Na<->Bz-Pro-CHA-Arg(N02)pNA.
1,45 g ( 2 mmol) av forbindelsen XlVb ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte torre hydrobromidderivat ble opplost i 15 ml DMF. Etter avkjoling (-lo°C) ble opplosningen tilsatt o,3o g ( 3 mmol) Et^N og så med 68o mg (3 mmol) benzosyreanhydrid. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Id. Det erholdte råprodukt ble opplost i MeOH og renset ved filtrering gjennon en soyle av "Sephadex LH-2o" i MeOH. Man erholdt l,o3 g (74,2% avl det teoretiske)
av den amorfe forbindelsen XIVc, som var enhetlig i DSC i LMS A og B. Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen <C>^<H>^<NgOg>
ga de folgende verdier: C = 57,29% (57,13%), H = 6,3o% (6,25%),
N = 18,o9% (18,17%).
XIV. N°-Bz-Pro-CHA-Arg-pNA.HCl
694 mg ( 1 mmol) av forbindelsen XIV ble omsatt tilfforbindelsen XIV ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 571 mg frysetorket amorft pulver (83,3% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C^H^<NgCgCl>
ga de folgende verdier: C = 57,15% (57,84%), H = 6,49% (6,62%),
N = 16,7o% (16,35%), Cl = 5,o9% (5,17%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrer i riktig forhold: Arg: l,o4 - CHA: l,o2 - Pro: l,oo
EKSEMPEL 15
XV. Na<->Bz-Pro-Tyr-Arg-pNA.HCl.
XVa. Na-Cbo-Tyr(OBzl)-Arg(NC^)-pNA
2,37 g ( 5 mmol) av forbindelsen Ia ( se eksempel 1) ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte torkede hydrobromidderivat ble opplost i 3o ml DMF. Etter avkjoling ble opplosningen forst tilsatt l,o5 ml (7,5 mmol) Et^N og deretter 2,82 g (5,5 mmol) Cbo-Tyr(OBzl)-OpNP. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering gjennom en soyle av "Sephadex LH-2o" i MeOH ble erholdt 1,78 g (49,o% av det teoretiske) av den amorfe forbindelsen XVa, som var enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C-^H^<gNgO>g
ga de folgende verdier: C = 59,o8% (59,5o%), H = 5,11% (5,27%), N = 15,8o% (15,42%).
XVb. Na<->Cbo-Pro-Tyr(OBzl)-Arg(N02)-pNA.
1, 25 g ( 2 mmol) av forbindelsen XVa ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte hydrobromidderivat ble opplost i 15 ml DMF. Etter avkjoling ble opplosningen tilsatt o,3o g ( 3 mmol) Et^N og deretter med 815 mg (2,2 mmol) Cbo-Pro-OpNP. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering gjennom en soyle av "Sephadex LH-2o" i MeOH ble 928 mg ( 56,3% av det teoretiske) av den amorfe forbindelsen XVb erholdt, som var enhetlig i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C4i<H4>5<N>9<0>]_o
ga de folgende verdier:C = 56,72% (56,42%), H = 6,o9%(6,27%),
N = 17, 6o% (17,42%).
XVc. N<Q->Bz-Pro-Tyr(OBzl)-Arg(N02)-pNA.
824 mg ( 1 mmol) av forbindelsen XVb ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte produkt ble opplost i lo ml
DMF og tilsatt 21o (il (1,5 mmol) E^N. Etter avkjoling ble opplosningen tilsatt34o mg ( 1,5 mmol) benzosyreanhydrid. Reaksjonsproduktet ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Id. Rensing: Gelfiltrasjon på "Sephadex LH-2o" i MeOH. Utbytte: 422 mg amorf.substans (53,2% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C4oH43Ng0g
ga de folgende verdier: C = 6o,92% (6o,52%), H = 5,38% (5,46%),
N = 16,19% (15,88%).
XV. Na<->Bz-Pro-Tyr-Arg-pNA.HCl.
412 mg ( o,5 mmol) av forbindelsen XVc ble ifolge eksempel 1, avsnitt le omsatt til forbindelsen XV. Rensing: gelfiltrasjon på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 2o8 mg frysetorket amorft pulver (59,8% av det teoretiske), enhetlig i DSC
i LMS C
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C^^ ti^^! Q0^ cl
ga de folgende verdier: C = 57,43% ((57,ol%), H = 5,78% (5,65%), N = 16,35% (16,12%), Cl = 4,98% (5,lo%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrer i riktig forhold:
Arg: o,95 - Tyr: l,oo - Pro: o,98.
EKSEMPEL 16
XVI. N°-Bz-Pro-Ph.Gly-Arg-pNA.HCl.
XVIa. Na<->Cbo-Ph.Gly-Arg(N02)-pNA.
2,37 g ( 5 mmol) av forbindelsen Ia ( se eksempel 1) ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte hydrobromidderivat ble opplost i 3o ml DMF. Etter avkjoling til -lo°C ble opplosningen forst tilsatt l,o5 ml (7,5 mmol) Et^N og deretter 2,32 g (5,71 mmol) Cbo-Ph.Gly-OpNp. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering gjennom en soyle av "Sephadex LH-2o" i MeOH
ble 2,62 g (86,4% av det teoretiske) av den amorfe forbindelse XVIa. erholdt, som var enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning afra bruttoformelen C H NO
zo oO o o
ga de folgende verdier: C = 55,lo% (55,44%), H = 5,o8% (4,99%),
N = 18, 81% (18,47%).
XVLb. N°-Cbo-Pro-Ph.Gly-Arg(NC^)-pNA.
1,22 g ( 2 mmol) av forbindelsen XVIa ble ifolge eksempel 1, avsnitt Ib deblokkert. Det erholdte hydrobromidderivat ble opplost i 15 ml DMF. Etter avkjoling ble opplosningen tilsatt 3oo mg ( 3 mmol) Et3N og så med 815 mg (2,2 mmol) Cbo-Pro-OpNP. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering gjennon en soyle av "Sephadex LH-2o" i MeOH ble 1,17 g (83,1% av det teoretiske) av den amorfe forbindelsen XVIb erholdt, som var enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen <C>^H^NgOg
ga de folgende verdier: C = 56,o8% (56,32%), H = 5,21% (5,3o%), N = 18,o2% (17,91%).
XVIc. Na<->Bz-Pro-Ph.Gly-Arg(N02)-pNA.
7o4 mg ( 1 mmol) av forbindelsen XVIb. ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte produktet ble opplost i lo ml DMF og tilsatt 21o (il (1,5 mmol) Et3N. Etter avkjoling ble 34o mg (1,5 mmol) Bz^O tilsatt. Reaksjonsproduktet ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Id. Rensing: Gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i MeOH. Utbytte: 518 mg
amorf substans ( 76,9% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C^<H->^<NgOg >ga de folgende verdier: C = 56,85% (57,o5%), H = 5,19% (5,24%), N = 18,96% (18,71%).
XVI. Na<->Bz-Pro-Ph.Gly-Arg-pNA.HCl
337 mg (o,5 mmol) av forbindelsen XVIc. ble omsatt ifolge eksempel 1, avsnitt le til forbindelsen XVI. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 2o7 mg frysetorket amorft pulver ( 62,2% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen <C>^<H>^<NgOg>Cl ga de folgende verdier: C = 57,52% (57,78%), H = 5,73% (5,61%),
N = 16,98% (16,85%), Cl = 5,25% (5,33%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrer i riktig forhold:
Arg: o,97 - Ph.Gly: l,o5 - Pro: l,oo
EKSEMPEL 17
XVII. Na<->Bz-Pro-Phe-Arg-2-NA.HCl
XVIIa. N°-Cbo-Arg(N02)-2-NA
3.53 g ( lo mmol) godt torket Cbo-Arg(N02)-0H ble opplost i 15o ml THF:DMF ( 3:1) under fuktighetsutelukkelse. Etter avkjoling til -lo°C ble opplosningen tilsatt 1,39 ml (lo mmol) Et^N og deretter en opplosning på 1,35 g ( lo mmol) klormaursyre-isobutylester i 2o ml THF tildryppet i lopet av 15 minutter, hvorved temperaturen ble holdt mellom -lo° og -5°C. Den erholdte opplosning ble så tildryppet en opplosning av 1,72 g ( 12 mmol) (3-naftylamin i 15 ml THF, hvorved ovennenvte temperatur ble holdt. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ia-2. Etter gelfiltrering gjennom en soyle av "Sephadex LH-2o" i MeOH ble erholdt 3,75 g av den krystallinske forbindelsen XVIIa. (78,4% av det teoretiske) med smp. 173-174,5°C, som var enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C24H26<N>6°5
ga de folgende verdier: C = 6o,82% (6o,24%), H = 5,63% (5,48%),
N = 17, 48% (16, 72%) .
XVIIb. Na<->Cbo-Phe-Arg(N02)-2-NA.
2,87 g ( 6 mmol) av forbindelsen XVIIa ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte hydrobromidderivat ble opplost i 5o ml DMF. Etter avkjoling på -lo° ble opplosningen tilsatt 1,25 ml ( 9 mmol) Et^N. Det dannede Et^N.HBr ble frafiltrert og ettervasket med litt kald DMF. Den således erholdte DMF-opplosning ble tilsatt 2,78 g ( 6,6 mmol) CbO-Phe-OpNP. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering gjennom en soyle av "Sephadex LH-2o" i MeOH ble 3,23 g (86% av det teoretiske) av den amorfe forbindelsen XVIIIb. erhalten, som var enhetlig i DSC i LMS
A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C33H35N7°5
ga de folgende verdier: C = 63,lo% (63,35%), H = 5,54% (5,64%),
N = 15,8o% (15,67%).
XVIIc. Na<->Cbo-Pro-Phe-Arg(N02)-2-NA
1,88 g ( 3 mmol) av forbindelsen XVIIb. ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte produktet ble opplost i 2o ml DMF. Opplosningen ble tilsatt o,63 ml (4,6 mmol) Et3N
og så med 1,22 g (3,3 mmol) Cbo-Pro-OpNP. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering gjennom en soyle av "Sephadex LH-2o" i MeOH ble erholdt 1,72 g (79,3% av det teoretiske) av den amorfe forbindelsen XVIIc., som var enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C3gH42N8°7
ga de folgende verdier: C = 62,92% (63,14%), H = 5,82% (5,86%),
N = 15,75% (15,5o%).
XVIId. Na-Bz-Pro-Phe-Arg(N02)-2-NA.
l,o8 g (1,5 mmol) av forbindelsen XVIIc ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte produkt ble opplost i i 12 ml DMF og tilsatt 315 u-l (2,26 mmol) Et3N. Etter avkjoling ble opplosningen tilsatt 51o mg (2,25 mmol) Bz20. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Id. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i MeOH. Utbytte: 765 mg amorf substans ( 73,6% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformelen C37H4ONg05
ga de folgende verdier: C = 63,88% (64,15%), H = 5,75% (5,82%),
N = 16,49% (16,18%).
XVII. Na<->Bz-Pro-Phe-Arg-2-NA.HCl.
693mg ( 1 mmol) av forbindelsen XVIId. ble omsatt til forbindelsen XVII ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 455 mg frysetorket amorft pulver (66,5% av det teoretiske) enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C-^H^N^O^Cl
ga de folgende resultater: C = 65,18% (64,95%), H = 6,13% (6,19%),
N = 14,55% (14,33%), Cl = 5,o9% (5,18%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrer i riktig forhold:
Arg: o,98 - Phe: l,oo - Pro: o,94.
E KSEMPEL 18
XVIII. Na<->Bz-Pro-Phe-Arg-4-MeO-2-NA.HCl
XVIIIa. Na<->Cbo-Arg(N02)-4-MeO-2-Na
Til 3,53 g ( lo mmol) Cbo-Arg(N02)-0H ble tildryppet en
opplosning på 2,o8 g ( 12 mmol) 4-metoksy-2-naftylamin i 15 ml THF (i stedet for 2-naftylamin) ifolge eksempel 17, avsnitt
XVIIa. Etter gelfiltrering gjennom en soyle av "Sephadex LH-2o"
i MeOH ble 3,91 g av den amorfe forbindelsen XVIIIa (76,9% av det teoretiske) erholdt, som var enhetlig i DSC i LMS
A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformele<n> C^H^gN^Og
ga de folgende verdier: C = 59,2o% (59,o5%), H = 5,41% (5,55%),
N = 16,72% (16,53%).
XVIIIb. N°-Cbo-Phe-Arg(N02)-4-MeO-2-NA.
2.55 g ( 5 mmol) av forbindelsen XVIIIa. ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte hydrobromidderivat ble opplost i 5o ml DMF. Etter avkjoling til -lo°C ble opplosningen forst tilsatt l,o5 ml (7,5 mmol) Et^N og deretter 2,31 g (5,5 mmol) Cbo-Phe-OpNP. Reaksjonsblandingen ble viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering gjennom en soyle av "Sephadex LH-2o" i MeOH ble 2,55 g (77,8% av det teoretiske) av den amorfe forbindelsen XVIIIb erholdt, som var enhetlig i DSC i LMS. A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C^H^<N>^O.^
ga de folgende verdier: C = 61,95% (62,28%), H = 5,62% (5,69%),
N = 15,11% (14,95%).
XVIIIc. Na<->Cbo-Pro-Phe-Arg(N02)-4-MeO-2-NA
1,97 g ( 3 mmol) av forbindelsen XVIIIb. ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte produkt ble opplost i 2o ml DMF. Opplosningen ble tilsatt o,63 ml (4,6 mmol) Et^N
og så med 1,22 g (3,3 mmol) Cbo-Pro-OpNP. Reaksjonsblandingen
viderebehandlet ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Etter gelfiltrering gjennom en soyle av "Sephadex LH-2o" i MeOH ble det erholdt den amorfe forbindelsen XVIIIc, som var enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformele<n><C>39H44<Ng>°<g>
ga de folgende verdier: C = 62,o5% (62,22%), H = 5,91% (5,89%), N = 15,o8% (14,89%).
XVIIId. Na<->Bz-Pro-Phe-Arg(N02)-4-MeO-2-NA
1,13 g (1,5 mmol) av forbindelsen XVIIIc. ble deblokkert ifolge eksempel 1, avsnitt Ib. Det erholdte produkt ble opplost i 12 ml DMF og tilsatt 315 (il (2,25 mmol) Et3N. Etter avkjoling ble opplosningen tilsatt 51o mg (2,25 mmol) Bz^O. Reaksjonsblandingen ble ifolge eksempel 1, avsnitt Id viderebehandlet. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex LH-2o" i MeOH. Utbytte: 78o mg amorf substans (71,9% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS A og B.
Elementæranalyse og beregning fra bruttoformele<n><C>38H42<N>8°7
ga de folgende verdier: C = 63,48% (63,14%), H = 5,75% (5,86%), N = 15,78% (15,5o%).
XVIII.N<cX->Bz-Pro-Phe-Arg-4-MeO-2-NA.HC1.
723 mg ( 1 mmol) av forbindelsen XVIIId. ble omsatt til forbindelsen XVIII ifolge eksempel 1, avsnitt le. Rensing: gelfiltrering på "Sephadex G-15" i 3o% AcOH. Utbytte: 488 mg frysetorket amorft pulver (68,3% av det teoretiske), enhetlig i DSC i LMS C.
Elementæranalyse og beregning fra bruttof ormelen C^H^N^O^Cl ga de folgende verdier: C = 63,58% (63,9o%), H = 6,15% (6,21%), N = 14,o3% (13,73%), Cl = 4,88% (4,96%).
Aminosyreanalysen ga de ventede aminosyrene i riktig forhold: Arg: o,93 - Phe: l,oo - Pro: o,94.
Substratene ifolge oppfinnelsen, f.eks. det ifolge eksempel 1 erholdte substrat, mnemlig Na<->Bz-Pro-Phe-Arg-P.NA.HCl ble anvendt for bestemmelse av forskjellige enzymer i blodplasma. Bestemmelser forlbp etter det prinsipp at det ved den enzymatiske hydrolysen av substratet dannede spaltningsproduktet (NH^-R 2) besitter et UV-spektrum forskjellig fra det fra substratet og er forskjovet mot hoyere bolgelengder. Således oppviser substratet ifolge eksempel 1, dvs. Na<->Bz-Pro-Phe-Arg-p.NA.HCl et absorpsjons-maksimum ved 3o2 nm (nanometer) og en molar ekstinksjons-koeffsient på 1295o. Substratets absorpsjon ved 4o5 nm er praktisk nyll. p-nitroanilin (pNA), som ved enzymatisk hydrolyse av substratet dannede spaltningprodukt (NH^R 2) oppviser et absorp-sjonsmaksimum ved 38o nm og en molar ekstinksjonskoeffisent på 132oo. Ved 4o5 nm synker ekstinksjonskoeffisenten bare lite,
dvs. til 965o.
Ved spektrofotometrisk måling ved 4o5 nm lar graden av enzymatisk hydrolyse av substratet som er proporsjonalt med mengden av avspaltet p-nitroanilin seg lett bestemme. Substratet som er tilstede i overskudd forstyrrer derved ikke målingen ved 4o5 nm. Forholdende er for de andre substratene ifolge oppfinnelsen som inneholder en p-nitroanilinogruppe som kromofor gruppe praktisk identiske. Den spektrofotometriske målingen ble derfor i alle disse tilfellene gjennomfort ved 4o5 nm.
Den enzymatiske hydrolysereaksjonen kan skjematisk fremstilles
på folgende måte:
E = enzym
S = substrat
ES = enzym-substrat-kompleks
P^ og P = produkter
kjy k2, k^ og k^ = hastighetskonstanter
Dissosiasjonskonstanter for
(Michaelis-konstant)
Når / S. 7 -A /Éy og k4 c< k3, gjelder:
Hastighetskonstanten, ved hvilken P^ blir dannet, er v = k3./Es7 Når E er fullstendig bundet til S, så gjelder: /ÉS7 = Æ/ og
Lineweaver-Burk-likningen:
Av ligningen (2) folger at konstantene Km og k^ bestemmer substratets virksomhet for et gitt enzym. For bestemmelsen av disse konstantene anvender man folgende metode:
Man blander enzymet og substratet i en pufferopplosning
og forfolger hydrolysereaksjonen i lopet av 2 til 3o minutter. Konsentrasjonen av substrratet / Sj varierer, mens enzym-konsentrasjonen holdes konstant. Når ekstinksjonen (OD = optisk tetthet) opptegnes i et koordinatsystem som funksjon av tiden, erholder man en kurve hvis tangenter i mnullpunktet tilsvarer hydrolysens ideale forlop. Ved hjelp av disse tangentene kan man bestemme hydrolysens begynnelseshastighet.
Når — opptegnes som funksjon av ^S/ ^ar man et Lineweaver-Burk-diagram ( se "Kurzes Lehrbuch der Biochemie" av P.Karlson, Georg Thieme-Verlag, Stuttgart, 1967, side 7o), hvorfra v IT13 ,JCS
og lar seg grafisk bestemme.
a 3^ s cx
K og k-, = — ble bestemt under anvendelse av N -Bz-Pro-m ^ 3 E
Phe-Arg-P.NA.HCl (substrat ifolge eksempel 1) for plasma-kallikrein, Trypsin, Plasmin og thrombin. Resultatene er sammen-fattet i tabell I.
1) En plasmakallikrein-BAEE-enhet er den mengden enzym som under standardbetingelser hydrolyserer et (imol benzoyl-L-argininetylester pr min. 2) En trypsin-NF-enhet er den mengden enzym som bevirker
en absorpsjonsendring Z\OD = o,oo3 pr. minutt, målt på benzoyl-L-argininetylester under standardbetingelser (se "The National Formulary XII", utgitt av "The American Pharmaceutyical Association", Washington, D.C., 1965, sidene 417-418). 3) Thrombin-NIH-enheten er den ifolge "US National Institute of Health". 4) Plasmin-CE-enheten er den kasein-enheten som blir målt på kasein under standardbetingelser. 5) Enzymenhet = den mengden enzym som hydrolyserer 1 famol substrat i et minutt ved substratmetning.
I den tredje kolonnen i tabell I sammenlignes de fra substratet ifolge eksempel 1 målte enzymenhetene med de hittil vanlige enzymenhetene.
I de vedlagte tegningene har figurene folgende betydning:
Fig. 1 er en grafisk fremstilling hvori endringen av optisk tetthet .-\ OD, som frembringes gjennom hydrolytisk påvirkning av plasmakallikrein på substratet ifolge eksempel 1 i et tidsrom av 3o minutter, opptegnes som funksjon av plasma-kallikreinmengden i et koordinatsystem. Fig. 2 er en grafisk fremstilling, hvori reduksjonen i optisk tetthet A, OD opptegnes i et koordinatsystem som funksjon av mengden protease-inhibitor i et vandig puffret medium ved konstant mengde plasmakallikrein og substrat ifolge eksempel 1. Fig. 3 er en grafisk fremstilling hvori hemmingskapasiteten hhv. den induserte proteolytiske virkningen av rotteplasma etter induksjon av en sjokktilstand opptegnes i et koordinatsystem som funksjon av tiden ved konstant mengde substrat ifolge eksempel 1.
Dose-virkningskurven i fig. 1 ble målt for forskjellige konsentra-sjoner av plasmakallikrein ved konstant substratkonsentrasjon. Målingene ble utfort ved 25°C og pH 8,2 under anvendelse av
en tris-imidazol-puffer med en ionestyrke på o,15.
Målingene, hvis resultater er opptegnet i fig. 2, ble gjennom-ført som folger: o,25 ml plasmakallikreinopplosning ( o,o275 BAEE-enheter/ml) ble satt til 2,o ml tris-imidazol-puffer
(ph 8,2, ionestyrke = o,15). Så ble o,25 ml (protease-inhibitor-opplosning ( protease-inhibitor fra lungen) tilsatt og blandingen inkubert noyaktig lomin. ved 25°C. Så ble o, 5 ml vandig substratopplosning (o,679 mg av substratet ifolge eksempel 1 pr. ml) tilsatt. Blandingen ble inkubert 3o min. ved 25°C. Reaksjonen ble så avbrutt med l,o ml 2-n eddiksyre, hvorpå absorpsjonen ble målt ved hjelp av et spektrofotometer ved 4o5 nm.
Målingene, hvorav resultatene er oppfort i fig. 3, ble gjennom-ført som folger: for å fremkalle en sjokktilstand hos en rotte ble dens hoyre bakben skollet ved neddykking lo sek. i 8o°C
varmt vann. Så ble blod tappet fra rotten. 0,25 ml plasmakallikreinopplosning (o,o22 BAEE-enheter) ble satt til 2,o ml tris-imidazol-puffer (pH 8,2, ionestyrke = o,15). Så ble o,ol ml rotteplasma tilsatt og blandingen inkubert 5 minutter ved 25°C. Deretter ble o,5 ml vandig substratopplosning ( o,679
mg substrat ifolge eksempel 1 pr. ml) tilsatt og blandingen inkubert noyaktig 3o min. ved 25°C. Absorpsjonsokningen ble målt spektrofotometrisk ved 4o5 nm. Målingene ble videre gjennomfort med en blindprove inneholdende bare plasmakallikrein.
Fra tabell I fremgår at substratet ifolge oppfinnelsen oppviser en mye hoyere spesifitet overfor plasma kallikrein enn ov,erfor plasmin, trypsin og thrombin. v ma , Jes for plasmakallikrein er vesentlig hoyere enn for dé andre enzymene, hvorved det kommer til uttrykk at substratet ifolge oppfinnelsen hydrolyseres mye raskere ved plasmakallikrein enn av de andre nevnte enzymene. Derved er det mulig å bestemme små mengder plasmakallikrein eller dennes inhibitorer, hvilket er av stor betydning i klinikken, hvor ofte bare små mengder av prove Står til rådig-het.
Fra tabell I fremgår det ytterl igere at thrombin ikke forstyrrer bestemmelsen av plasmakallikrein eller dennes inhibitorer.
Substratet ifolge oppfinnelsen har videre den fordel
at den enzymatiske hydrolysen med plasmakallikrein folger Michaelis-Menton-loven og det er derved mulig å bestemme
de kinetiske konstantene K og v ..
m maks .
I fig. 1 og 2 kommer til uttrykk hvor noye og omfindtlig bestemmelsen av plasmakallikrein eller dennes inhibitorer er. Dette fremstiller en vesentlig fordel idet det blir mulig å kontinuerlig overvåke terapien ved sjokktilstander hos mennesker ved hjelp av protease-inhibitorer og noyaktig dosere disses anvendelse.
Fig. 3 viser hvordan en sjokktilstand kan fastslås ved hjelp av substratet ifolge oppfinnelsen, hvorved plasmakallikrein-systemet blir aktivert. Aktiveringen av plasmakallikrein-systemet som er karakteristisk for slike sjokktilstander, kan måles ved hjelp av substratet ifolge oppfinnelsen.
Spaltningsproduktet NH2-R 2kan forut for den fotometriske bestemmelsen forst diazoteres og koples med en koplings-komponent.
Claims (2)
1. Kromogent hhv. fluorescerende tripeptid for kvantitativ bestemmelse av proteolytiske enzymer fra klassifikasjonsgruppe E.C. 3.4.21., som spalter peptidkjeder på karboksylsiden såvel fra arginin som lysin, unntatt thrombin og thrombinlignende enzymer i kroppsvæsker hos mennesker og pattedyr samt vegetabilske og animalske celle-ekstrakter og kjerte-gifter fra kaldblodige dyr, karakterisert ved følgende strukturformel:
hvor R"*" betyr hydrogen, en benzen- eller p-toluen-3 3 sulfonylgruppe eller en R -CO-gruppe hvor R er en alifatisk hydrokarbonrest med 1 til 17 karbonatomer som eventuelt er substituert med en amino-gruppe i oJ-stilling,' en aralifatisk hydrokarbonrest med 7 til 17 karbonatomer som eventuelt er substituert med en aminogruppe i arylkjernen, en cykloalifatisk
hydrokarbonrest som eventuelt er substituert med en amino- eller aminometylgruppe, en aromatisk hydrokarbonrest som eventuelt er substituert med en alkyl-, amino- eller aminometylgruppe eller en benzyloksygruppe. R 2 er en p-nitrofenyl-, 2-naftyl-eller 4-metoksy-2-naftylgruppe, X er en fenylalanyl-, 3-cykloheksylalanyl-, fenylglycyl- eller tyrosylgruppe, og Y er en protonisert arginyl- eller lysylgruppe, og salter av disse med en mineralsyre eller en organisk syre.
2. Anvendelse av tripeptidderivatene ifølge krav 1 for kvantitativ bestemmelse av plasmakallikrein og"indirekte inhibitorer derav, plasmaprekallikrein og aktivatorer derav, papain og prothrombinaktivatorer i kroppsvæsker hos mennsker og pattedyr, samt i vegetabilske og animalske celle-ekstrakter og kjertelgifter hos kaldblodige dyr.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CH921074A CH609154A5 (en) | 1974-07-02 | 1974-07-02 | Method for the quantitative determination of proteolytic enzymes in body fluids from humans and mammals |
| CH608875 | 1975-05-09 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO752386L NO752386L (no) | 1976-01-05 |
| NO147212B true NO147212B (no) | 1982-11-15 |
| NO147212C NO147212C (no) | 1983-02-23 |
Family
ID=25698949
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO752386A NO147212C (no) | 1974-07-02 | 1975-06-30 | Kormogent h.h.v. fluorescerende tripeptid for kvantitativ bestemmelse av proteolytiske enzymer |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4016042A (no) |
| JP (1) | JPS5622280B2 (no) |
| AT (1) | AT345475B (no) |
| AU (1) | AU504338B2 (no) |
| CA (1) | CA1049506A (no) |
| DD (1) | DD120715A5 (no) |
| DE (1) | DE2527932C2 (no) |
| FR (1) | FR2279106A1 (no) |
| GB (1) | GB1520261A (no) |
| IL (1) | IL47554A (no) |
| IT (1) | IT1039558B (no) |
| NL (1) | NL188354C (no) |
| NO (1) | NO147212C (no) |
| SE (1) | SE424635B (no) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4162941A (en) * | 1974-12-05 | 1979-07-31 | Ab Kabi | Method for determining a proteolytic enzyme |
| US4169015A (en) * | 1975-07-11 | 1979-09-25 | Ab Kabi | Novel chromogenic thrombin substrates |
| SE407571B (sv) * | 1975-07-11 | 1979-04-02 | Kabi Ab | Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
| US4191808A (en) * | 1975-10-30 | 1980-03-04 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of measuring dipeptidyl-amino-peptidase activity |
| US4176009A (en) * | 1976-01-24 | 1979-11-27 | Ajinomoto Co., Inc. | Method of measuring collagenase activity |
| SE431201B (sv) * | 1976-01-24 | 1984-01-23 | Ajinomoto Kk | For anvendning vid metning av kollagenasaktivitet avsett peptidderivat jemte forfarande for nemnda metning |
| CH634662A5 (de) * | 1976-05-28 | 1983-02-15 | Pentapharm Ag | Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren. |
| SE437153B (sv) * | 1976-12-01 | 1985-02-11 | Kabi Ab | Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser |
| SE7801373L (sv) * | 1978-02-07 | 1979-08-08 | Kabi Ab | Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser |
| EP0009010B1 (en) * | 1978-07-18 | 1983-03-02 | Kabi AB | Bradykinin inhibiting tripeptide derivatives, process for their preparation and pharmaceutical preparations containing them |
| US4275153A (en) * | 1978-08-03 | 1981-06-23 | American Hospital Supply Corporation | Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes |
| JPS5827784B2 (ja) * | 1978-10-30 | 1983-06-11 | 鳥居薬品株式会社 | アミノ酸誘導体 |
| US4217269A (en) * | 1979-03-23 | 1980-08-12 | Abbott Laboratories | Dipeptide chromogenic substrates |
| US4260682A (en) * | 1979-04-04 | 1981-04-07 | Ryan James W | High sensitivity assays for angiotensin converting enzyme |
| US4219497A (en) | 1979-04-06 | 1980-08-26 | Abbott Laboratories | Chromogenic substrates |
| US4327178A (en) * | 1979-05-01 | 1982-04-27 | University Of Miami | Urinary kallikrein assay: specific substrates and assay method |
| CA1161431A (en) * | 1979-05-11 | 1984-01-31 | Lars G. Svendsen | Tripeptide derivatives |
| DE2936543A1 (de) * | 1979-09-10 | 1981-04-09 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen |
| US4308202A (en) * | 1979-10-25 | 1981-12-29 | Torii & Co., Ltd. | Prolylphenylalanylarginine derivatives, process for producing same and method for measuring activity of enzymes using same |
| US4335203A (en) * | 1980-07-10 | 1982-06-15 | The Regents Of The University Of California | Method for identifying potential contrast media reactors |
| WO1982000641A1 (en) * | 1980-08-25 | 1982-03-04 | Ab Kabivitrum | Peptide substrates for determination of protease activity |
| US4434096A (en) | 1981-06-30 | 1984-02-28 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Substrates for the quantitative determination of proteolytic enzymes |
| US4395401A (en) * | 1981-09-09 | 1983-07-26 | Smithkline Beckman Corporation | Renally active dipeptides |
| US4448715A (en) * | 1981-11-02 | 1984-05-15 | University Of Miami | Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein |
| CA1247086A (en) * | 1982-02-17 | 1988-12-20 | Francis R. Pfeiffer | Renally active tetrapeptides |
| DE3211254A1 (de) * | 1982-03-26 | 1983-09-29 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens |
| DE3244030A1 (de) * | 1982-11-27 | 1984-05-30 | Behringwerke Ag, 3550 Marburg | Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung |
| JPS6061557A (ja) * | 1983-09-14 | 1985-04-09 | Nitto Boseki Co Ltd | アルギニル−ｐ−ニトロアニリド化合物の製造方法 |
| DE3446714A1 (de) * | 1984-12-21 | 1986-06-26 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum nachweis des vorliegens einer allergie und zum spezifischen nachweis des fuer die allergie verantwortlichen allergens |
| DE3504405A1 (de) * | 1985-02-08 | 1986-08-14 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Bestimmung von prokallikrein |
| US4897444A (en) * | 1985-05-31 | 1990-01-30 | The Research Foundation Of The State University Of New York | Immobilized fluorogenic substrates for enzymes; and processes for their preparation |
| SE8701801L (sv) * | 1987-04-30 | 1988-10-31 | Kabivitrum Ab | Foerfarande foer identifiering av mikroorganismer |
| US5776718A (en) * | 1995-03-24 | 1998-07-07 | Arris Pharmaceutical Corporation | Reversible protease inhibitors |
| US6297024B1 (en) | 1998-10-15 | 2001-10-02 | Cell Activation, Inc. | Methods for assessing complement activation |
| US6235494B1 (en) | 1999-02-08 | 2001-05-22 | The Scripps Research Institute | Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL42124A (en) * | 1972-05-02 | 1977-02-28 | Kabi Ab | Substrate for the determination of proteolytic enzymes |
| SE380257B (sv) * | 1972-05-02 | 1975-11-03 | Bofors Ab | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hog specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser |
-
1975
- 1975-06-23 DE DE2527932A patent/DE2527932C2/de not_active Expired
- 1975-06-24 IL IL47554A patent/IL47554A/xx unknown
- 1975-06-30 DD DD186968A patent/DD120715A5/xx unknown
- 1975-06-30 US US05/592,023 patent/US4016042A/en not_active Expired - Lifetime
- 1975-06-30 IT IT24942/75A patent/IT1039558B/it active
- 1975-06-30 NO NO752386A patent/NO147212C/no unknown
- 1975-06-30 CA CA230,464A patent/CA1049506A/en not_active Expired
- 1975-07-01 SE SE7507545A patent/SE424635B/xx not_active IP Right Cessation
- 1975-07-01 AU AU82631/75A patent/AU504338B2/en not_active Expired
- 1975-07-01 AT AT505675A patent/AT345475B/de active
- 1975-07-01 NL NLAANVRAGE7507802,A patent/NL188354C/xx not_active IP Right Cessation
- 1975-07-02 JP JP8175475A patent/JPS5622280B2/ja not_active Expired
- 1975-07-02 GB GB27819/75A patent/GB1520261A/en not_active Expired
- 1975-07-02 FR FR7520756A patent/FR2279106A1/fr active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US4016042A (en) | 1977-04-05 |
| FR2279106B1 (no) | 1981-04-30 |
| NL188354C (nl) | 1992-06-01 |
| CA1049506A (en) | 1979-02-27 |
| GB1520261A (en) | 1978-08-02 |
| NO752386L (no) | 1976-01-05 |
| DE2527932C2 (de) | 1983-04-21 |
| FR2279106A1 (fr) | 1976-02-13 |
| AU504338B2 (en) | 1979-10-11 |
| SE424635B (sv) | 1982-08-02 |
| JPS5622280B2 (no) | 1981-05-23 |
| NL188354B (nl) | 1992-01-02 |
| DE2527932A1 (de) | 1976-01-22 |
| AU8263175A (en) | 1977-01-06 |
| DD120715A5 (no) | 1976-06-20 |
| ATA505675A (de) | 1978-01-15 |
| JPS5129998A (no) | 1976-03-13 |
| NO147212C (no) | 1983-02-23 |
| AT345475B (de) | 1978-09-25 |
| IL47554A (en) | 1978-06-15 |
| IL47554A0 (en) | 1975-08-31 |
| IT1039558B (it) | 1979-12-10 |
| NL7507802A (nl) | 1976-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO147212B (no) | Kormogent h.h.v. fluorescerende tripeptid for kvantitativ bestemmelse av proteolytiske enzymer | |
| US4070245A (en) | Substrate for the quantitative determination of proteolytic enzymes | |
| SU1277904A3 (ru) | Способ получени трипептидов | |
| FI56828C (fi) | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specificitet till trombin och andra proteolytiska enzymer av typen peptidyl-peptid-hydrolaser | |
| FI56829C (fi) | Nya diagnostiskt verksamma substrat med hoeg specifitet foer trypsin och andra enzymer av typen peptidylpeptidhydrolaser | |
| Coggins et al. | Affinity labelling of proteinases with tryptic specificity by peptides with C-terminal lysine chloromethyl ketone | |
| NO142812B (no) | Nye diagnostisk aktive kromogene enzymsubstrater | |
| NO151787B (no) | Tripeptidderivater og anvendelse av disse ved bestemmelser av enzymer | |
| NO142074B (no) | Nye kromogene enzymsubstrater for serinproteaser | |
| US4190574A (en) | Substrate for the quantitative determination of plasminogen activators | |
| US4428874A (en) | Tripeptide derivatives | |
| US4563305A (en) | Radiolabelled substrates for assaying mammalian enzymes | |
| US4450105A (en) | Substrates for measuring thrombin | |
| US4568636A (en) | Tripeptide derivatives | |
| DK168574B1 (da) | Peptidderivater og salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer samt anvendelsen heraf som substrat til kvantitativ bestemmelse af C1-esterase | |
| JPS62126197A (ja) | 新規な血漿キニノゲナーゼ測定用化合物 | |
| US5334506A (en) | Chromogenic method of detecting endoproteases | |
| US4434096A (en) | Substrates for the quantitative determination of proteolytic enzymes | |
| MAZALEYRAT et al. | Synthesis and enzymic hydrolysis of cyclic peptides containing an anthranilic acid residue | |
| JPH0244840B2 (no) | ||
| JPH0755942B2 (ja) | 酵素活性測定用ペプチド誘導体及びその使用法 | |
| García-Echeverría et al. | Kinetic studies of papain: effect of P3′ substituents and donor/acceptor pairs of intramolecularly quenched fluorogenic substrates | |
| CH609154A5 (en) | Method for the quantitative determination of proteolytic enzymes in body fluids from humans and mammals |