NO139483B

NO139483B - Analogifremgangsmaate ved fremstilling av nye pseudotrisaccharider

Info

Publication number: NO139483B
Application number: NO74742787A
Authority: NO
Inventors: Joseph Weinstein; Peter John Lovell Daniels; Gerald Howard Wagman; Raymond Testa; Alan Keith Mallams; John Jessen Wright; Tattanahalli L Nagabhushan
Original assignee: Scherico Ltd
Priority date: 1973-08-06
Filing date: 1974-08-01
Publication date: 1978-12-11
Also published as: DE2437160C3; AR215834A1; FI230474A; CY1018A; DK146298C; NL7410363A; KE2981A; GB1473733A; DE2462485A1; SE7409946L; IE40437B1; FR2240015B1; IL45385A; DK146298B; BE818431A; MY8000090A; LU70661A1; DD119037A5; BG25804A3; DE2437160B2

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte ved fremstilling av aktive 1-N-substituerte derivater av 4>6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler.

Det er kjent innen faget et bredt spektrum av antibakte-

rielle midler som kan klassifiseres kjemisk som 4>°-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler. Verdifulle antibakterielle midler av denne gruppe er de hvor aminocyclitolen er 2-deoxy-streptarain eller et derivat derav med aminofunksjoner i 1- og 3-stillingene.

Særlig verdifulle antibakterielle midler av 4,6-di-(aminoglycosyl)-2-deoxystreptaminer er de hvor aminoglycosylgruppen i 6-stilling er et garosaminylradikal. Innen klassen av 4-aminoglycosyl-6-garosaminyl-2-deoxystreptaminer er antibiotica slike som gentamicin-B, B-jy C-^, C^a, C2a' C2b °^ X2' s^-soinicin' verdamicin, Antibiotikum G-418, Antibiotikum G-52, Antibiotikum JI-20A og Antibiotikum JI-20B.

Foreliggende oppfinnelse angår fremstilling av forbindelser hvor aminogruppen i 1-stilling av 2-deoxystreptaminet.eller derivatet.derav i et 4>6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol ér selektivt N-substituert. De 1-N-subst ituerte derivater av 4»6-di-(aminoglycosyl)-2-deoxystreptaminer eller derivater: derav er- • verdifulle bredspektrede antibakterielle midler. : Nærmere bestemt angår oppfinnelsen fremstilling av 1-N-substituerte derivater av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocycli-tolene: gentamicin B, gentamicin B, , gentamicin C, , gentamicin C, ,

X X X 3 gentamicin C2, gentamicin C2a, gentamicin C^, sisomicin, verdamicin, Antibiotikum G-4l8, Antibiotikum 66-40B, Antibiotikum 66-40D, Antibiotikum JI-20A, Antibiotikum JI-20B, Antibiotikum G-52, mutamicin 1, mutamicin 2, mutamicin 4i mutamicin 5 og mutamicin 6, hvor substituenten er -CH2X hvor X er hydrogen, alkyl, alkenyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, N-alkylaminoalkyl, aminohydroxyalkyl, N-alkylaminohydroxyalkyl, fenyl eller benzyl, hvilke alifatiske radikaler har opptil 7 carbonatomer og, hvis de er substituert med amino og hydroxy, bærer substituentene på forskjellige carbonatomer og av farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav.

Innbefattet blandt substituentene som taes i betraktning for gruppen CH^X i de nye forbindelser, er rettkjedede og forgrenede alkylgrupper slik som ethyl, n-propyl, n-butyl, g-methylpropyl, n-pentyl, g-methylbutyl, Y~methylbutyl og B,3-dimethylpropyl, n-hexyl, S-methylpentyl, g-ethylbutyl, yethylbutyl, n-heptyl, e-methylheptyl, g-ethylpentyl, yethylpentyl, 6-ethylpentyl, Y-propylbutyl, n-octyl, iso-octyl, 3-ethylhexyl, 6-ethylhexyl, e-ethylhexyl, g-propylpentyl, y-propylpentyl, alkenylgrupper slik som (3-propenyl, g-methylpropenyl, g-butenyl, g-methyl-g-butenyl, p-ethyl-p-hexenyl, hydroxy-substituerte rettkjedede og forgrenede alkylgrupper slik som e-hydroxypentyl, 6-hydroxy-Y-methylbutyl, 6-hydroxy-8-methylpropy1, 6-hydroxybutyl, g-hydroxypropyl, Y~hydroxypropyl, u-hydroxyoctyl, amino-substituerte rettkjedede bg forgrenede alkylgrupper slik som"e-aminoperityl, - g-aminopropyl, Y_aminopropyl, 6-aminobutyl, g-amino-Y-methylbutyl og u)-aminooctyl og mono-N-alkylerte derivater derav slik som N-methyl, N-ethyl- og N-propylderivater, f.eks. ermethylaminopentyl, g-methylaminopropyl, g-ethylaminopropyl, 6-methylaminobutyl, g<->methylamino-Y-methylbutyl og aj-methylaminobutyl, amino- og hydroxy-disubstituerte rettkjedede og forgrenede alkylgrupper slik som 3-hydroxy-e-aminopentyl,Y-hydroxy-Y-niethyl-6-aminobutyl, <g>~hydroxy-6-aminobutyl, B-hydroxy-Y-aminopropyl og g<->hydroxy-g<->methyl-Y-aminopropyl og mono-N-alkylerte derivater derav slik som g<->hydroxy-e-methylaminopentyl, Y-hydroxy-Y-methyl-6-methylaminobutyl,<g->hydroxy-S-methylaminobutyl, g-hydroxy-Y-ethylaminopropyl og &-hydroxy-g<->methyl-Y-methylaminopropyl.

Forbindelsene er fortrinnsvis l-N-CH2X-derivater inneholdende garosaminyl som 6-aminoglycosidradikal og fortrinnsvis 2-deoxystreptamin som 1,3-diaminocyclitol.

2-deoxystreptaminet foreligger i alle de ovenfor angitte forbindelser unntatt mutamicinene. 1,3-diamino-cyclitolkjernen i hver av l-N-CH2X-mutamicin 1, 2, 4, 5 og 6 er henholdsvis streptamin, 2,5-dideoxystreptamin, 2-epi-streptamin, 5-amino-2,5-dideoxystreptamin og 5-epi-2-deoxystreptamin.

l-N-CH2X-4-aminoglycosyl-6-garosaminyl-2-deoxystrepta-minene er derivatene fra gentamicin B, genta-

micin B^, gentamicin C^, gentamicin C^a, gentamicin C2, gentamicin <C>2a' 9entamicin C2b' 9entam^c^-n x2' sisomic:i-n' verdamicin, Antibiotikum G-418, Antibiotikum JI-20A, Antibiotikum JI-20B og Antibiotikum G-52 hvilke forbindelser er definert ved følgende strukturformel I:

hvor X er som tidligere angitt, og hvor Y er en aminoglycosyl-funksjon valgt fra gruppen bestående av:

Andre anvendbare 1-N-CH2X-4,6-di-(aminoglycosyl)-2-. deoxy-streptaminer innbefatter l-N-CH2X-Antibiotikum 66-40D av den følgende formel III (hvilken er blant de foretrukne forbindelser som fremstilles ifølge oppfinnelsen):

hvor X er som tidligere angitt,

og 1-N-CH2X-Antibiotikum 66-40B av formel IV:

hvor X er som tidligere angitt,

1 -N-C^X-mutamicinene innbefatter l-N-CH2X-4-aminoglycosyl-6-garosaminyl-l,3-diaminocyclitoler av formel V:

hvor X er som tidligere angitt, og hvori 1-N-CH2X-mutamicin 1, V2 og W5 er hydrogen og W2 og V5 er hydroxyl,

hvori 1-N-CH2X-mutamicin 2, W2, B2, W5 og V& er hydrogen,

hvori l-N-CH2X-mutamicin 4, W2 og W5 er hydrogen og V2 og Vg er hydroxyl,

hvori 1-N-CH2X-mutamicin 5, V*2, V"2 og Wg er hydrogen og V5 er amino og

hvori l-N-CH2X-mutamicin 6, W2, V2 og V5 er hydrogen mens W5 er hydroxyl.

(I de ovenfor angitte strukturformler er de uangitte substituenter ved bindingene hydrogenatomer).

Også innbefattet innen oppfinnelsen er fremstilling av farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter av l-N-CH2X-4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitolene slik som angitt av formlene I, III, IV og V, hvilke salter fremstilles etter kjente metoder slik som ved nøytralisering av fri base med en egnet syre vanligvis til pH 5. Egnede syrer for dette formål innbefatter syrer slik som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre, salpetersyre, hydrobromsyre, eddiksyre, propionsyre, maleinsyre, ascorbinsyre, sitronsyre og lignende.

Da fysikalske utførelsesformer av syreaddisjonssaltene av 1-N-CH2X-4,6-di-(aminogjycosy1)-1,3-diaminocyclitolene er karakterisert ved å være hvite faste materialer som er løse-lige i vann, svakt løselige i de fleste polare løsningsmidler og uløselige i ikke-polare organiske løsningsmidler.

1-N-CH2X-4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diamino-cyclitolene slik som angitt av formlene I, III, IV og

V og deres ikke-toksiske farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter utviser en bredspektret antibakteriell aktivitet. I særdeleshet utviser de 1-N-lavere alkylderivater forbedrede antibakterielle aktiviteter sammenlignet med moder-antibiotikaene hvilket spesielt tilkjennegis ved en øket aktivitet av forbindelsene overfor organismer som er resistente overfor moderforbindelsen. Forbindelsene er f.eks; mer aktive overfor organismer som inaktiverer moder-antibiotikaene ved acetylering av 3-aminogruppen og/eller ved adenylering av 2"-hydroxylgruppen. Av disse utviser også enkelte anti-protozoal, anti-amøbisk og anthelmintiske egenskaper.

En foretrukken gruppe av forbindelser er de 1-N-substituerte derivater av 4-arninoglycosyl-6-garosaminyl-2-deoxy-streptaminene: gentamicin B, gentamicin B^ , gentamicin , gentamicin C, X 3 , gentamicin C £~, sisomicin, verdamicin, Antibiotikum JI-20A, Antibiotikum JI-20B, Antibiotikum G-52 og Antibiotikum G-4l8>av hvilke derivatene av gentamicin CX . , gentamicin CX . 3, sisomicin, verdamicin og Antibiotikum G-52 er foretrukne. Andre spesielt nyttige forbindelser er de 1-N-substituerte derivater av Antibiotikum 66-40D.

I 1-N-substituenten er X fortrinnsvis valgt frå hydrogen, alkyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, aminohydroxyalkyl, fenyl eller benzyl, hvilke alifatiske radikaler har opp til 7 carbonatomer, og hvis de er substituert med amino og hydroxyl, er substituentene båret på forskjellige carbonatomer. Av disse er de foretrukne radikaler hydrogen, alkyl, aminoalkyl og hydroxyalkyl med opp til 7 carbonatomer og aminohydroxyalkyl med opp til 3 carbonatomer og med substituentene på forskjellige carbonatomer.

Spesielt nyttige forbindelser er de

hvori X er hydrogen, methyl, ethyl og propyl og fortrinnsvis methyl og ethyl. En spesielt verdifull gruppe er l-N-CH2X-4-aminoglycosyl-6-garosaminyl-2-deoxystreptaminene av formel I hvor X er lavere alkyl med 1-3 carbonatomer, i særdeleshet de 1-N-lavere alkylderivater av gentamicin C^, gentamicin Cla, gentamicin C2, gentamicin C2a, gentamicin C^, sisomicin, verdamicin og Antibiotikum G-52 såvel som 1-N-lavere alkyl-Antibiotikum 66-40D av formel III, hvilke derivater er bredspektrede antibakterielle midler, som er aktive overfor gram-positive bakterier (f.eks. Staphylococcus aureus) og gram-negative bakterier (f.eks. Escherichia coli og Pseudomonas aeruginosa) slik som bestemt ved standard fortynnings-tester, innbefattet bakterier som er resistente overfor de 1-N-usubstituerte forløpere. Spesielt nyttige er 1-N-ethylverdamicin, og 1-N-lavere alkylsisomiciner, f.eks. 1-N-methylsisomicin, 1-N-(n-propyl)-sisomicin, 1-N-(n-butyl)-sisomicin og fortrinnsvis 1-N-ethylsisomicin som utviser aktivitet overfor gram-negative organismer som er resistente overfor deres 1-N-usubstituerte forløpere. Andre spesielt nyttige forbindelser er 1-N-ethylgentamicin C^a, 1-N-ethylgentamicin C^, 1-N-ethylantibiotikum G-52, 1-N-(n-propyl)-verdamicin, 1-N-(6-aminobutyl)-sisomicin, 1-N-methylverdamicin, 1-N-(n-butyl)-verdamicin, 1-N-(S-2-hydroxy-4-aminobutyl)-gentamicin Clt 1-N-(S-2-hydroxy-4-aminobutyl)-sisomicin og 1-N-(S-2-hydroxy-

4-aminobutyl)-verdamicin.

Flesteparten av de ovenfor angitte 1-N-usubstituerte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol-ant ibiotikaer f ra hvilke de 1-N-substituerte derivater fremstilles, er kjente, ytgangsforbindelsen angitt her som gentamicin ^3, er isolert , og karakterisert som angitt i fremstilling 1.

Utgangsforbindelsen angitt her som gentamicin C2b, er isolert og karakterisert som beskrevet i fremstilling 2, og som har den strukturforrael som er vist her, er i enkelte av de kjente publikasjoner beskrevet som gentamicin C„ .

Isoleringen, egenskapene og konfigurasjonen av gentamicin C2 er beskrevet i US patent nr. 3 651 042.

Antibiotikum 66-40B. og 66-40D, deres fremstilling, isolering, egenskaper og konfigurasjon er beskrevet i belgisk patentskrift nr. 811 370. Antibiotikumene koproduseres med sisomicin som er hovedproduktet ved fermentering av Micromonospora invoensis (beskrevet i britisk patentskrift nr. 1 274 518) og kan separeres fra fermenteringsmediet ved å underkastes spesielle kromatografiske separasjonsteknikker.

Mutamicin 1, 2, 4, 5 og 6 hvis konfigurasjon er vist ovenfor, kan fremstilles ved dyrkning av en mutant-stamme av Micromonospora invoensis, her betegnet som Micromonospora invoensis stamme 1550F-1G i et vandig næringsmedium. Denne mutant-stamme er ikke istand til å produsere et antibiotikum når den dyrkes under submerse aerobe betingelser i et vandig næringsmedium som mangler 1,3-diaminocyclitol-oppbygningsdelen. Når imidlertid visse slike forbindelser tilsettes til fermenteringsmediet, dannes mutamiciner. Når 2-deoxystreptamin tilsettes til fermenteringen; dannes det kjente antibiotikum sisomicin.

De nødvendige 1,3-diaminocyclitoler som må være tilstede

under fermenteringen for å oppnå mutamicinene^ er som følger:

streptamin for mutamicin 1

2,5-dideoxystreptamin for mutamicin 2

2-epistreptamin for mutamicin 4

2,5-dideoxy-5-aminostreptamin for mutamicin 5 5-epi-2-deoxystreptamin for mutamicin 6.

Fremstillingen av mutamicinene er beskrevet i ålment tilgjengelig svensk patentsøknad 7409945-8-

Foreliggende oppfinnelse angår således en analogifremgangsmåte for fremstilling av 1-N-substitu-

erte derivater av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitolene gentamicin B, gentamicin,B^, gentamicin C^, gentamicin C^Q, gentamicin ,C2> gentamicin; G2a,: .gentamicin £2%)' sisomicin, verdamicin, Antibiotikum G-418, Antibiotikum-66-40B, Antibiotikum 66-40D, Antibiotikum JI-20A, Antibiotikum JI-20B, Antibiotikum G-5 2, mutamicin 1, mutamicin 2, mutamicin 4, mutamicin 5 og mutamicin 6, hvori substituenten er

hvori X er hydrogen, alkyl, alkenyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, N-alkylaminoalkyl,. aminohydroxyalkyl, N-alkylaminohydroxyalkyl, fenyl eller benzyl, hvilke alifatiske radikaler har opp til 7 carbonatomer og, hvis X er substituert med amino og hydroxy, bærer substituentene på forskjellige carbonatomer,

og farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav,

hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at der anvendes en av de følgende prosedyrer A til G,

A) en åv de ovenfor angitte 4,6-di(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler som kan ha amino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra 1-stilling, behandles med et aldehyd av formelen

hvor X' er en gruppe som definert for X og hvor enhver tilstedeværende amino eller hydroxygruppe kan være beskyttet, i nærvær av et hydriddonator-reduserende middel, og, om nødvendig, at alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet fjernes,

B) redusering av N,C-dobbeltbindingen i et 1-N=CHX'-substituert

derivat av en av de ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diamihocyclitoler, hvori alle NH^-grupper er beskyttet og. NHCH^-grupper kan være beskyttet, hvor X' er en gruppe som definert for X, hvori enhver tilstedeværende amino eller hydroxygruppe kan være beskyttet, og at alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet fjernes,

C) et 1-N-substituert derivat av en av de ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler, hvori en eller flere aminogrupper kan være beskyttet og 1-N-substituenten er 0

II

-C-X"

hvor X" er hydrogen, alkyl, alkenyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, N-aikylaminoalkyl, aminohydroxyalkyl, N-alkylaminohydroxyalkyl, fenyl, benzyl eller hydrocarbyloxy, hvilke alifatiske,radikaler har opp til 7 carbonatomer, og hvis X er substituert med amino og hydroxy, bærer substituentene på forskjellige carbonatomer, og hvori enhver tilstedeværende amino eller hydroxygruppe kan være beskyttet, behandles med et amidreduserende hydridreagens, og om ønsket, at alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet fjernes, D) det for fremstilling av de ovenfor angitte 1-N-substituerte derivater av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler hvori substituentén er rettkjedet alkyl med opp til 5 carbonatomer, at en av de ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler , som utviser anino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra 1-stilling, og hvori 1-aminogruppen kan være aktivert, omsettes med et alkyleringsmiddel inneholdende en rettkjedet alkylgruppe med opp til 5 carbonatomer og en forlatende gruppe, og at de beskyttende grupper, og om ønsket tilstedeværende aktiverende gruppe eller grupper i molekylet fjernes,

E) det for fremstilling av de ovenfor angitte 1-N-substituerte

derivater av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler hvori substituentén er methyl, at en av de ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler som utviser amino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra 1-stilling, omsettes med formaldehyd og et cyclisk imid, hvorefter den

således erholdte forbindelse behandles med et hydrid-donator-reduserende middel, og at alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet fjernes,

F) det for fremstilling av de samme forbindelser som angitt i

punkt E, at en av de ovenfor angitte 4,6-di(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler som utviser amino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra 1-stilling, omsettes med formaldehyd i nærvær av maursyre og at alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet fjernes,

hvilke fremgangsmåtealternativer A til F efterfølges av

isolering av 'derivatet- som sådant eller som et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssålt.

Fremgangsmåtealternativ A) hvorved 1-aminofunksjonen i

et l-N-usubstituert-4, 6-di-(aminoglycosyl) -1, 3-diaminocyclitol selektivt kondenseres -med et- aldehyd og i tilknytning dertil in situ reduseres under dannelse av et l-N-alkyl-4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol-antibakterielt middel, utføres vanligvis ved romtemperatur i nærvær av luft, selv om det kan være fordelaktig å ut-føre denne under en inert atmosfære (f.eks. argon eller nitrogen). Fortrinnsvis fullføres reaksjonen innen kort tid, vanligvis mindre enn 30 minutter som bestemt ved tynnskiktskromatografi.

De hydrid-donator-reduserende midler som er anvendbare i denne fremgangsmåte innbefatter dialkylaminoboraner (f.eks. dimethyl-aminoboran, diethylaminoboran og fortrinnsvis morfolinoboran), tetraalkylammoniumcyanoborhydrid (f.eks. tetrabutylammoniumcyan-borhydrid)., alkalimetallborhydrid (f. eks. natriumborhydrid) og fortrinnsvis alkalimetallcyanborhydrid (f.eks. lithiumcyanborhydrid og natriumcyanborhydrid) .'

Fremgangsmåten utføres hensiktsmessig i et inert løs-ningsmiddel . Ved "inert løsningsmiddel" menes et hvilket som helst organisk eller uorganisk løsningsmiddel i hvilket 4,6-di-(aminoglycosyl 1-1, 3-diaminocyclitol-utgangsmaterialene og reagensene er løselige, og som ikke vil innvirke på prosessen under de anvendte reaksjonsbetingelser slik at det dannes et minimum av konkurrerende bireaksjoner. Selv om vannfri aprotiske løsningsmidler enkelte ganger med fordel kan anvendes ved fremgangemåten (slik som tetra-hydrdfuran når det anvendes morfolinoboran som hydrid-donator-reduserende middel) utføres fremgangsmåten vanligvis i protiske løsningsmidler, f.eks. i en lavere alkanol eller fortrinnsvis i

vann eller i en vandig lavere alkanol (f.eks. vandig methanol, vandig ethanol), selv om andre vann-blandbare ko-løsningsmiddelsyste-rner kan anvendes slik som vandig dimethylformamid, vandig hexamethyl-fosforamid, vandig tetrahydofuran og vandig ethylenglycoldimethyl-ether.

Fremgangsmåten utføres hensiktsmessig ved en pH innen området fra 1 til 11, fortrinnsvis fra 2 til 5 og forløper best innen området fra 2,5 til 3,5. Det sure medium som foretrekkes, kan erholdes ved å tilsette en organisk eller uorganisk syre til 4,6-di-(aminoglycosyl)-i,3-diaminocyclitol. Derved dannes syreaddisjonssalter av forbindelsene. En hvilken som helst organisk syre slik som eddiksyre, trifluoreddiksyre eller p-toluensulfonsyre eller uorganisk syre slik som saltsyre, svovelsyre, fosforsyre eller salpetersyre, kan anvendes. Det er mest hensiktsmessig å anvende svovelsyre. I en foretrukket utførelsesform av fremgangsmåten er det også hensiktsmessig å fremstille syreaddisjonssaltet av utgangsforbindelsen in situ ved å tilsette den ønskede syre (f.eks. svovelsyre) til en løsning eller suspensjon av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diamlnocyclitol (f.eks. sisomicin) i et protisk løsningsmiddel (f.eks. vann) inntil løsningens pH er justert til den ønskede pH.

Typiske aldehyder av formel X'CHO hvori X' er som tidligere angitt, som er anvendbare ved fremgangsmåten, innbefatter rettkjedede og forgrenede alkylaldehyder slik som formaldehyd, acetaldehyd, n-propanol, n-butanol, 2-methylpropanol, n-pentanal, 2-methylbutanal, 3-methylbutanal, 2,2-dimethylpropanal, n-hexanal, 2-ethylbutanal, n-heptanal og n-octanal, alkenylaldehyder slik som propenal, 2-methylpropenal, 2-butenal, 2-methyl-2-butenal, 2-ethyl-2-hexenal, benzaldehyd og fenylacetaldehyd,

hydroxyisubstituerte rettkjedede og forgrenede alkylaldehyder slik som 5-hydroxypentanal, 2-hydroxy-3-methylbutanal, 2-hydroxy-2-methylpropanal, 4-hydroxybutanal, 2-hydroxypropanal og 8-hydroxy-octanal, amino-substituerte rettkjedede og forgrenede alkylaldehyder slik som 5-aminopentanal',' 2-aminopropanal, 3-aminopropanal, '"4-- ~~ aminobutanal, 2-amino-3-methylbutanal, 8-aminooctanal og mono-N-alkyl-derivater derav, og amino- og hydroxyl-disubstituerte rettkjedede og forgrenede alkylaldehyder slik som 2-hydroxy-5-aminopentanal, 3-hydroxy-3-methyl-4-aminobutanal, 2-hydroxy-4-aminobutanal, 2-hydroxy-3-aminopropanal, 2-hydroxy-2-methyl-3-aminopropanal, 2-amino-3-hydroxyoctanal og mono-N-aikylderivater derav.

Hvis aldehydet utviser et chiralt senter, kan ved denne fremgangsmåte anvendes hver enantiomer separat eller sammen som et racemat hvorved det erholdes de respektive diastereoisomerer eller en blanding derav.

De aldehydreagenser som er anvendbare i fremgangsmåten,

er enten kjente forbindelser eller kan lett fremstilles fra kjente forbindelser under anvendelse av velkjente fremgangsmåter. Således kan f.eks. alkylaldehyder substituert med både hydroxyl og aminofunksjoner (f.eks. 2-hydroxy-5-aminopentanal) fremstilles fra et aminoaldehydacetal (f.eks. 4-aminobutanaldiethylacetal) ved å beskytte aminofunksjonen deri som en acetamido- eller fthalimidogruppe under anvendelse av kjente metoder, etterfulgt av fjerning av ace-talfunksjonen ved syrehydrolyse hvorved det erholdes et N-beskyttet aminoaldehyd (f.eks. ved å omdanne 4-aminobutanaldiethylacetal til det tilsvarende N-fthalimidoderivat som ved syrehydrolyse gir 4-fthalimidobutanal). Behandlingen av det N-beskyttede aminoaldehyd med hydrocyansyre gir det tilsvarende N-beskyttede-aminoalkylhydroxy-nitril (f.eks. 2-hydroxy-5-fthalimidovaleronitril) som ved kataly-tisk reduksjon (f.eks. hydrogen i nærvær av palladium) eller ved hy-dridreduksjon (f.eks. med di-isobutylaluminiumhydrid) gir et N-beskyttet aminp-hydroxyaldehyd (f.eks. 2-hydroxy-5-fthalimidopenta-nal) som er et aldehydreagens som anvendes i denne fremgangsmåte.- -

Når fremgangsmåten utføres ved at en l-N-usubstituert-4,6-di-(aminoglycosyl)-1, 3-diaminocy eli tol behandles med en hydrid-^ donator og et aldehyd for å gi det tilsvarende 1-N-substituerte derivat av en 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol, for å minske konkurrerende bireaksjoner når et aminoaldehyd anvendes som et reagens, foretrekkes det å beskytte aminofunksjonen i aldehydet.

f.eks. med en acyl-blokkerende gruppe slik som acetamido, fthali-mido eller lignende før fremgangsmåten utføres, og deretter fjerne den N-^beskyttende gruppe i den derved dannede forbindelse. Det kan også være fordelaktig å beskytte hydroxylgruppen i hydroxy1-holdige aldehyder ved utførelse av fremgangsmåten, imidlertid er dette van-nødvendig.

Det er også mulig å anvende acetalet eller hemiacetalet av aldehydreagenset i surt medium som gir opphav til in situ-dannelse av det nødvendige aldehyd.

En hensiktsmessig metode for utførelse av fremgangsmåten omfatter fremstilling av en løsning av et l-N-usubstituert-4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol-antibakterielt middel (f.eks. sisomicin eller verdamicin) i et protisk løsningsmiddel (fortrinnsvis vann) og justere pH på løsningen fra pH 2 til pH 5 med en syre (vanligvis fortynnet svovelsyre) og derved fremstille det nødvendige syreaddisjonssalt av utgangsforbindelsen. Når pH for løsningen er ca. pH 5, inneholder det derved dannede syreaddisjonssalt vanligvis ca. en ekvivalent syre for hver aminofunksjon i 4,6-di-(aminoglycosyl) -1 , 3-diaminocyclitol (f.eks. pr. mol sisomicin foreligger det 2,5 mol svovelsyre). Etter at syreaddisjonssaltløsningen er fremstilt, tilsettes minst en molar ekvivalent, og fortrinnsvis et stør-re molart overskudd av det ønskede aldehyd (f.eks. acetaldehyd, propanal eller butanal) etterfulgt innen en kort tid (vanligvis i løpet av 5 minutter) av tilsetning av ca. en molar ekvivalent (basert på utgangs 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol) av et hydrid-donator-reduserende reagens, fortrinnsvis et alkalimetall-cyanoborhydrid, vanligvis natriumcyanoborhydrid. Reaksjonen full-føres som oftest «i løpet av minst 30 minutter slik som fastslått ved tyhnskiktskromatografi, og det erholdes det tilsvarende 1-N-substituert derivat av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol (f.eks. 1-N-ethylsisomicin eller 1-N-ethylverdamicin). Isolering og.rensing av det derved dannede derivat skjer under anvendelse av kjente metoder slik som utfelling, ekstraksjon og fortrinnsvis kromatografi.

Fremgangsmåtealternativ A) ifølge oppfinnelsen tilveiebringer således en ny, behendig, én-reaksjonskarprosess hvor et aminoglycosid omsettes in situ med et aldehyd (fortrinnsvis i overskytende mengder) og med et hydrid-donator-

reduserende middel under dannelse av som hovedprodukt,

et mono-N-substituert derivat (f.eks. 1-N-ethyl-sisomicin),

i hvilken fremgangsmåte 1-aminogruppen bundet til et

sekundært carbonatom vanligvis alkyleres preferensielt i forhold til andre, aminogrupper bundet til primære og andre sekundære carbonatomer .i 4 , 6.-*di-(aminoglycosyl) -1,3-diaminocyclitol-utgangsmaterialet.

Det er også mulig å anvende delvis N-beskyttet 4,6-di-;(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler som utgangsmaterialer i denne fremgangsmåte. Generelt kan 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler som utviser en -CH^NI^-gruppe som 6<1->gruppen N-beskyttes i denne stilling da denne gruppe er mest reaktiv i blokkeringsreak-sjonen. Sisomicin kan beskytteai stilling 6' eller i stillingene og 6' eller i stillingene 2', 3 og 6'. Andre amino-beskyttende grupper kan være brodannende grupper i stillingene 3", 4", slik som carbonyl i de 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler som har 3"-amino og 4"-hydroxylgruppen i cis-stilling til hverandre. Således kan det f.eks. anvendes som utgangsmateriale en 1-N-usubstituert 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol hvor aminofunksjonen ved 6-carbonet er N-beskyttet (f.eks. 6 *-N-t-butoxycarbonylsisomicin) eller en l-N-usubstituert-4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol hvor aminofunksjonene ved C-2' og C-3 er N-beskyttet (f.eks. 2',3-di-N-trifluoracetylgentamicin C-^ og det vil dannes det tilsvarende delvis N-beskyttede 1-N-substituerte derivat (f.eks. 1-N-ethyl-6<1->N-t-butoxycarbonylsisomicin og l-N-ethyl-2',3-di-N-trifluoracetylgentamicin C-^) som ved fjerning av de N-beskyttende grupper etter kjente metoder, gir l-N-CH^X-forbindelser,

f.eks. 1-N-ethylsisomicin og 1-N-ethylgentamicin C-^.

De nødvendige utgangsforbindelser hvori aminogrupper er beskyttet, kan fremstilles etter metoder som er lite eller identiske med de som er beskrevet i fremstilling 3. Som anvendt her angir uttrykkene "blokkerende gruppe" eller "beskyttende gruppe" grupper som gjør de blokkerte eller beskyttede aminogrupper inerte overfor etterfølgende kjemisk behandling, men som lett kan fjernes etter at den kjemiske behandling er utført. Eksempler på slike amino-beskyt.tende grupper er benzyl, 4-nitrobenzyl, trif enylmethyl, 2,4-dinitrofenyl, acylgrupper slik som acetyl, propionyl og benzoyl, alkoxycarbonylgrupper slik som methoxycarbonyl, ethoxycarbonyl, 2,2,2-triklorethoxycarbonyl, t-butoxycarbonyl og 2-jodethoxycarbonyl, og arylalkoxycarbonylgrupper slik som carbobenzyloxy og 4-methoxy-benzyloxycarbonylgrupper.

I blokkeringsprosessen anvendes den beskyttende gruppe vanligvis i form av et syreimidazolderivat, og syreazid eller som aktive estere slik som ethylthioltrifluoracetat, N-benzyloxycarbonyl-

oxy-succinimid eller p-nitrofenyltriklorethylcarbonat. Således

kan de blokkerende grupper beskrives som å være avledet fra en forbindelse BgLg, hvori Bg er den blokkerende gruppe slik som syre-delen av en aktiv ester, og Lg er en forlatende gruppe slik som imidazol.

.... Fremgangsmåtealternativ B) ut-

føres på en måte som tillater dannelse av et 1-N-Schiffs-basederi-vat etterfulgt av redusering av den således erholdte Schiffs base. Fremgangsmåten for fremstilling av de 1-N-substituerte derivater av den ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler hvor substituentén er -CH2X og X er som definert ovenfor, omfatter redusering av N,C-dobbeltbindingen i et 1-N=CHX'-substituert derivat av en av de ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler, hvor alle NH2-grupper er beskyttet og NHCH3~grupper kan være beskyttet, hvor X' er som tidligere angitt, hvoretter alle tilstedeværende jbeskyttende grupper i molekylet fjernes og det ønskede derivat isoleres som sådant eller som et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt.

De 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler hvori 6-aminoglycosylradikalet er garosaminyl, utviser vanligvis en 3"-N-4"-O-beskyttende gruppe som er identisk med 1-N-substituenten i ut-gangsmaterialet fordi oxazolidinringen dannes samtidig med 1-N-Schiff-basegruppen. Således omdannes f.eks. 2',3-di-N-trifluoracetylgentamicin C-, ved omsetning med et aldehyd (f.eks. benzaldehyd, fenylacetaldehyd eller acetaldehyd) til det tilsvarende 3",4"-oxa-zolidin-l-yliden Schiff-baseutgangsmateriale ifølge denne fremgangsmåte (f.eks. l-N-3",N-4"-0-di-benzyliden-2',3-di-N-trifluoracetylgentamicin C-jy l-N-3 "-N-4"-0-di-f enethylidenS ' , 3-di-N-trif luorace-tylgentamicin C1 og l-N-3"-N-4"-G—diethyliden-2',3-di-N-trifluoracetylgentamicin C^), som ved reduksjon med natriumborhydrid og methanolisk natriummethoxyd gir det tilsvarende l-N-CH2X-3",4"-oxa-zolidin (f.eks. l-N-benzyl-3",N-4"-0-benzylidengentamicin C±, 1-N-fenethyl-3"-N-4"-0-fenethylidengentamicin og l-N-ethyl-3"-N-4"-O-ethylidengentamicin c^) som ved behandling med syre gir en 1-N-CH2X-forbindelse ifølge oppfinnelsen (f.eks. 1-N-benzylgentamicin C1# 1-N-fenethylgentamicin og 1-N-ethylgentamicin C^).

De nye 1-N-substituerte derivater av 4>6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler slik som definert av formlene I, III, IV og V, kan også fremstilles yed, f remgangsmåtealternativ C) som omfatter

.behandling av et 1-rN-substituert derivat av en av de ovenfor angitte

4,6-di-(aminoglycosyl) -ri,3-diaminocyclitoler, hvori én eller flere Aminogrupper kan være beskyttet og hvor 1-N-substituenten er

0

II

-C^X" hvor X" er hydrogen, alkyl, alkenyl,

hydroxyalkyl, aminoalkyl, N-alkylaminoalkyl, aminohydroxyalkyl, N-alkylaminohydroxyalkyl, fenyl, benzyl eller hydrocarbyloxy, hvilke alifatiske radikaler har opp til 7 carbonatomer, og hvis de er substituert med amino og hydroxyl, er substituentene båret på forskjellige carbonatomer, og hvor en hvilken som helst tilstedeværende amino- eller hydroxylgruppe kan beskyttes, med et amid-reduserende hydridreagens, og om nødvendig, fjerning av alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet, idet siste trinn etterfølges av isolering av det ønskede derivat som sådant eller som et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt.

Fremgangsmåten utføres vanligvis i et ikke-reaktivt organisk løsningsmiddel som betraktes å være et løsningsmiddel i hvilket utgangsforbindelsene og det amid-reagerende reagens er løselig og som ikke vil reagere med reagenset slik at det dannes et minimum av konkurrerende bireaksjoner. Ikke-reaktive organiske løsningsmidler som er anvendbare i reduksjonsprosessen,er ethere slik som dioxan, tetrahydrofuran, diethylenglycoldimethylether og lignende.

Foretrukne amid-reduserende hydridreagenser er aluminium-hydrider og borhydrider innbefattet lithiumaluminiumhydrid, lithium-trimethoxyaluminiumhydrid, aluminiumhydrid, diboran, di-isoamylboran og 9-borabicyclo(3,3,3)—nonan.

Generelt foretrekkes det å anvende diboran som det amid-reduserende middel unntatt når utgangsforbindelsen utviser en dob-beltbinding, som f.eks. i 1-N-acylsisomicin, 1-N-acylverdamicin, 1-N-acyl-Antibiotikum 66-40B, 1-N-acyl-Antibiotikum 66-40D og 1-N-acyl-Antibiotikum G-52, hvilke forbindelser hensiktsmessig reduseres ved hjelp av lithium-aluminiumhydrid.

Når X" betegner hydrocarbyloxy, slik som t-butoxy og ami-det underkastes reduksjon, dannes den tilsvarende 1-N-methylforbin-delse. q

ii

Hvis det i denne fremgangsmåte hvor en l-N-C-X"-4,6-di-(aminoglycosyll-1,3-diaminocyclitol reduseres til det tilsvarende 1-N-CH^X-derivat, acylsidekjeden av 1-N-acyl-mellomproduktet utviser et chirait senter, kan det anvendes hver av stereoisomerene separat eller en blanding derav, hvorved det erholdes de tilsvarende diastereoisomerer eller en blanding derav.

Fremgangsmåtealternativ D) for frem-

: stilling åv 1-N-substituerte derivater av de tid-

ligere angitte 4»6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler. hvor substituentén er rettkjedet alkyl med opp-

til 5 carbonatomer og farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter deravy omf atter omsetning av én av. disse-4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-. diaminocyclitoler som utviser amino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra stilling 1, og hvor 1-aminogruppen kan være aktivert, med et alkyleringsmiddel inneholdende

den rettkjedede alkylgruppe med opp til 5 carbonatomer og en forlatende gruppe, hvoretter de beskyttende grupper fjernes, og om-nødvendig, den aktiverende gruppe eller grupper som foreligger i molekylet, hvoretter derivatet isoleres som sådant eller som farma-søytisk akseptabelt syreaddisjonssalt. ..Eksempler på alkylerende midler som fortrinnsvis anvendes i denne fremgangsmåte, er alkyljodid, alkylbromid, dialkylsulfat, alkylfluorsulfonat og alkyl-p-toluensulfonat hvor alkylgruppen er den nødvendige rettkjedede alkylgruppe med opp til 5 carbonatomer.

,,, Andre alkylerende midler hvor alkylgruppen fortrinnsvis har én eller to carbonatomer, er trialkylanilimimhydroxyd, trialkyloxonium-fluorb<q>rat, trialkylsulfoniunifluorborat eller trialkylsulfoxonium- . fluorborat. Alle disse alkylerende midler inneholder en god forlatende gruppe, slik som Br", I~, 0S02F"", di-alkylanilin eller dialkylether.

Aminogruppen i 1-stilling i 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol kan være fri eller aktivert. Et eksempel på en

aktiverende gruppe er trifluormethylsulfonyl. Disse aktiverende grupper kan innføres i molekylet ved å omsette et 4,6-di-(aminoglycosyl) -1, 3-diaminocyclitol som utviser amino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra stilling 1, f.eks. 3"-N-4"-0-carbonyl-2',3,6'-tri-N-t-butoxycarbonyl-sisomicin med en forbindelse som tilveiebringer den aktiverende gruppe, slik som tri-fluormethylsulfonylklorid.

1-aminogruppen kan også alkyleres ved hjelp av det tilsvarende di-(2-cyanoethyl)-derivat som er avledet ved behandling med acrylonitril av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitol som utviser amino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra stilling 1. Det således fremstilte l-N-di-(2-cyanoethyl)-derivat alkyleres deretter med en av de ovenfor angitte alkyleringsmidler fulgt av fjerning av cyanoethylgruppene.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utføres under betingelser lik de som anvendes i de velkjente direkte alkyleringsmetoder av aminer.

F rem gan gsra åte alternativ E og F for fremstilling av 1-N-substituerte derivater av de ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler hvor substituentén er methyl, og farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav omfatter omsetning av én av disse 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler som utviser amino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra stilling 1, enten med formaldehyd og et cyklisk imid, fortrinnsvis succinimid, og behandling av den således erholdte forbindelse med et hydrid-donator-reduserende middel, fortrinnsvis natriumborhydrid, eller med formaldehyd i nærvær av maursyre, etterfulgt av fjerning av alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet og isolering av derivatet som sådant eller som et farmasøytisk akseptabelt syre-- addisjonssalt. Dannelsen av 1-N-methyl-substituenten med formaldehyd og maursyre er velkjent som Eschweiler-Clarke-reaksjonen.

De etterfølgende fremstillinger eksemplifiserer fremstilling av et flertall nødvendige utgangsmaterialer og de etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Fremstilling 1

Gentamicin C~

2a

Separasjon av Gentamicin C^a fra co- produsert antibiotica

Oppløs 96 g gentamicinbase (fremstilt fra sulfatsaltet erholdt etter fremgangsmåten som er beskrevet i eksempel 4 i US patentskrift 3 091 572) i 400 ml av den øvre fase som fremkommer når methanol, kloroform og 17 % ammoniumhydroxyd blandes i volum-forholdet 1:2:1. Tilsett en tiendedel av løsningen til hvert av de første ti rør i en 500 x 80 ml motstrømsekstraktor. Fyll alle rørene innbefattet de første ti helt med den nedre fase av den ovenfor beskrevne løsningsmiddelblanding. Innstill løsningsmiddelreservoaret til å avgi 40 ml av den øvre fase til rør nr. 1 (1) for hver over-føring. Innstill apparaturen på 500 overføringer. Når overførin-gene, er fullført, oppsaml hvert åttende rør for kromatografi (i duplikat) på Schleicher og Schuell papir nr. 590 ved bruk av den

nedre fase av den ovenfor beskrevne løsningsmiddelblanding. La kromatogrammene fremkalles i 16 timer og tørk deretter papirene. Legg et papir på en agarplate podet med Staphylococcus aureus (A.T.C.C. 6538P1, sprøyt duplikatet med vanlig ninhydrinløsning og oppvarm for fremkalling. Incuber agarplaten ved 37° C over natten og kombiner løsningen frå rørene'inneholdende det materiale som migreres som gentamicin Ci (dvs-, rørene 290 - 360).

Erstatt rørene 290 - 360 med friske rør inneholdende 40 ml av øvre fase og 40 ml av nedre fase. Innstill apparaturen for

-ytterligere 2800 overføringer og gjenta den tidligere utførte kromatografiske prosedyre. Kombiner rørene 1 - 16 og konsentrer i vakuum til 1,3 g gentamicin C0_ med følgende egenskaper: (a) en molekylvekt på 463 som bestemt ved massespektrometri

som er i overensstemmelse med empirisk formel på C20<H>41N5°7'

(b) en spesif ilde optisk rotasjon som målt ved natriumets D-linje ved 26° C på +114° + 5° i vann ved 0,3 % konsentrasjon og (c) et protonmagnetisk resonansspektrum (pmr) som følger: pmr(ppm) (D20), 6 0,99 (3H, d, J=6,5Hz, CH-CH3), 1,17 (3H, s, C-CH3), 2,47 (3H, s, N-CH3), 2,51 (1H, d, J=10,5 Hz, H-3"),

3,75 (1H, q, J=10,5, 4Hz, H-2"), 4,00 (1H, d, J=12Hz, H-5" eq), 5,04 (1H, d, J=4Hz, H-l"), 5,13 (1H, d, J=3,5 Hz, H-l').

Bestråling av den sekundære methylgruppe ved 6 0,99 ppm viser H-6' som en dublett (J=6,5 Hz) ved <S 2,81 ppm.

Fremstilling 2

Gentamicin Cg^

Separasjon av gentamicin fra co- produserte antibiotica

Separer hoved-gentamicin C bestanddelene (C^, C2 og C-j^) som beskrevet i US patentskrift 3 651 042, eksempel 2, og kombiner de fraksjoner som inneholder dominerende overlappende mengder av gentamicin C-^ og C2 fri base (500 g gentamicin C blanding gir 53,4 g overlapping) . Tilsett 1,5 g av denne gentamicin C-^ og C2 blanding til en kolonne inneholdende 50 g silicagel tilberedt i et løs-ningsmiddelsystem omfattende kloroform:methanol:15 % ammoniumhydroxyd (1:2:1). Eluer kolonnen med det samme løsningsmiddelsystem og overvåk, de eluerte fraksjoner ved tynnskiktskromatografi på silicagelplater ved. bruk av løsningsmiddelsystemet kloroform:-methanol:22% ammoniumhydroxyd (1:2:1) som fremkaller. Kombiner de fraksjoner som inneholder en blanding av gentamicin C1 og C2 sammen med gentamicin (fraksjoner 39 - 57 (410 mg)). Kromatografer på nytt fraksjonene 39 - 57 over silicagel ved bruk av et kloroform: methanol:7 % ammoniumhydroxyd (1:2:1) løsningsmiddelsystem og kombiner fraksjoner (38 - 1301 som inneholder rent gentamicin C , som bestemt ved tynnskiktkromatografi (utbytte 45 mg) med følgende kon--,,stanter(: , i;,.(a^D,; 165,5o1;(c=0,3 %, H20) , massespektrum m/e'463 (M+l)+, 446, 445, 433, 350, 332, 322, 304, 333, 305, 287, 191, 173,

163, 145, 160, 142, 118, 143, pmr(ppm)(D20): 6 1,25 (3H, s, C-CH3), ,2,40 (3H, s, N-CH3), 2,55 3H, s, N-CH3), 5,12 (1H, d, J=4Hz, H-l"), 5,22 (1H, d, J,3Hz, H-l'.).

Rent gentamicin C-^ kan adskilles fra gentamicin C-^ og C2 på grunn av dets bevegelighet ved tynnskiktskromatografi ved bruk av silicagelplater og en kloroform:methanol:22 % ammoniumhydroxyd (1:2:) løsningsmiddelsystem som fremkaller. De omtrentlige Rf-verdier i dette system er som følger:

Fremstilling 3

Selektivt blokkerte di-( aminoglycosyl)- 1, 3- diaminocyclitoler

A. 2', 3, 6'- trl- N- butoxycarbonyl- 3"- N- 4"- 0- carbonylsisomicin

1. Penta- N- carbobenzoxysisomicin

Oppløs 25 g sisomicin og 13 g natriumcarbonat i 625 ml destillert vann. Sett 100 ml til carbobenzoxyklorid til den omrørte løsning ved 25° C og omrør blandingen i 16 timer. Filtrer fra det faste materiale, vask grundig med vann, tørk i vakuum og vask deretter med hexan under dannelse av 62 g penta-N-carbobenzoxysisomicin (62 g) som et farveløst fast materiale, sm.p. = 165 - 173° C (a)-<26> + 96/2° (CH3OH) IR: y maks (CHCI3) 3400, 1720, 1515, 1215, 1050, 695, cm"<1> NMR: 6 (CDClg) 1,03 (3H, bred singlet, 4"-C-CH3) , 3,02 (3H, bred singlet, 3"-NCH3), 5,02 (10H, bred singlet, C<H>2CgH5), 3,28, 3,30 ppm (25H, bred singlet, -CH2CgH5).

2. Tetra- N- carbobenzoxy- 3"- N- 4"- O- carbonyl- sisomicin

Oppløs 5 g av penta-N-carbobenzoxy-sisomicin i 50 ml dimethylformaraid, tilsett 250 mg natriumhydrid til den omrørte løs-ning og omrør reaksjonsblandingen under argon ved romtemperatur i 2 timer., Filtrer og tilsett iseddik (2 ml) til filtratet som deretter^ konsentreres i, vakuum. Ekstraher residuet med kloroform ; (20.0. ml på forhånd ført gjennom basisk aluminiumoxyd) , vask ekstrak-tet med vann og tørk over natriumsulfat. Løsningen fordampes under dannelse av 3,5 g tetra-N-carbobenzoxy-3"-N-4"-O-carbonyl-sisomicin som et amorft pulver. SSi.p. = 210 - 213° C (a}^6 + 68,8 (C=0,22) IR: y.maks (Nujol) . 3500, 184,0, 1760, 1580 cm"1 NMR: <5(CDC13) 1,34 (3H, singlet, 4"-CH3), 2,68 (3H, singlet, 3"-N-Me), 5,04 (8H, bred singlet, -CH2CgH5) . • "

3. 3"- N- 4"- O- carbonyl- sisomicin

. Til en.løsning, .av .10,1 g 1,3,2',6'-tetra-N-benzyloxycarbo-nyl-3"-N-4"-0-carbonyl-sisomicin i 200 ml tetrahydrofuran tilséttes 1 1 liter flytende ammoniakk (redestillert fra natrium) . Til den om-rørte løsning tilsettes 6 g natrium i små stykker. Etter omrøring

i 3 timer ødelegges overskudd av natrium ved tilsetning av ammonium-klorid. Tillat løsningsmidler å fordampe under en nitrogenstrøm. Oppløs residuet i vann og før dette gjennom Amberlite IRC-50 harpiks (H form) og vask harpiksen godt med vann og eluer produktet med 2N ammoniumhydroxydløsning. Fordamp ammoniumeluatet i vakuum under dannelse av tittelforbindelsen (3",N-4"-carbonyl-sisomicin). Utbytte ca. 4 g.

IR: y.maks (Nujol) 1745 cm 1. Produktet kan anvendes i de etter-følgende trinn uten ytterligere rensing. Imidlertid kan en meget ren prøve erholdes ved kromatografi av produktet over silicagel ved bruk av den nedre fase av et kloroform:methanol:konsentrert ammoniumhydroxyd (1:1:1) løsningsmiddelsystem som elueringsmiddel. 4. 2', 3, 6'- tri- N- t- butoxycarbonyl- 3"-N-4"- O- carbonyl- sisomicin Oppløs 1,4 g, 3 mmol, 3"-N-4"-0-carbonyl-sisomicin i 10 ml 50 %-ig vandig methanol inneholdende 3,5 mmol triethylamin. Tilsett under omrøring 3,5 mmol t-butoxycarbonylazid dråpevis. Omrør blandingen i 2 dager ved romtemperatur. Tilsett 5 ml Amberlite IRA-401S (OH ) ionebytterharpiks sammen med 5 ml methanol og omrør i. h time. Fjern harpiksen ved filtrering og vask med methanol. Konsentrer filtratet og kromatografer residuet på en kolonne av silicagel (60 - 100 mesh, 20,0 g) ved bruk av kloroform:methanol:ammoniumhydroxyd (30:10:0,4) som løsningsmiddelsystem. Slå sammen de homo-gene fraksjoner som inneholder tittelforbindelsen og fjern løsnings-midlet ved fordampning i vakuum. Oppløs residuet i methanol og ut-fell med- overskudd av ether.. Isoler det faste produkt ved filtrering og tørk.

B. 2', 3- di- N- trifTuoracetyT- gentamicin C^

1. • 2'-N-trifluoracetyl-qentamicin C ±

Oppløs 1,7 g gentamicin C1 i 20 ml methanol, avkjøl

.blandingen til 4° C og tilsett 0,46 ml (0,563 g) ethylthioltrifluoracetat under omrøring. Tillat reaksjonen å fortsette i 2 timer og- konsentrer løsningen til et residuum i vakuum. Kromato-gråfer produktet på 80 g silicagel G under anvendelse av en nedre fase av en blanding av kloroform:methanol:vann:ammoniumhydroxyd i vdlumforholdet 10:5:4:1 som elueringsmiddel. Kombiner de fraksjoner som inneholder -hovedkomponenten og konsentrer under dannelse av 1,4 g av tittelf orbindelsen, sm.p. 108 - 111° C, (a).^6 = +128°

(c = 0,3 %, H20). Analyse for C^H^NgOgF^R^O

Beregnet: C = 46,69 %, H = 7,50 %, N = 11,84 %, F = 9,63 %.

Funnet : C = 46,66 %, H = 7,65 %, N = 11,60 %, F = 9,24 %

2. 2', 3- di- N- trifluoracetyl- gentamicin C^

Oppløs 0,66 g" av produktet fra trinn 1 i 10 ml methanol, avkjøl blandingen til 4° C og tilsett 0,148 ml (0,182 g) ethylthioltrifluoracetat løst i 3 ml methanol. Omrør reaksjonsblandingen i 16 timer og konsentrer til et residuum i vakuum. Kromatografer produktet på 30 g silicagel som beskrevet i trinn 1. Overvåk kolonnen ved tynnskiktskromatografi, kombiner de egnede reaksjoner og konsentrer under dannelse av 0,32 g av tittelforbindelsen, sm.p. 121 - 129° C (cOq<6> 121° (c = 0,3 %, H20) . Analyse for <C>25<H>41<N>5°9F6* Berégnet: C = 44,84 %, H = 6,17 %, N = 10,46 %

Funnet : C = 44,94 %, H = 6,35 %, N = 10,17 %

C. 6'- N- trifluoracetyl- sisomicin

Oppløs 20 g sisomicin i 1,2 liter vannfri methanol og tilsett dråpevis en løsning av 6 ml ethylthioltrifluoracetat i 60 ml methanol i løpet av 3 timer, under omrøring. Tillat reaksjonen å forløpe i 18 timer ved romtemperatur og fjern løsningsmidlet i vakuum under dannelse av et residuum på 23,8 g av produktet med en renhet på ca. 95 % med følgende fysiokjemiske egenskaper: .Massespektraldata: m/e 543 M<+>, andre topper ved m/e 413, 395, 385, 362, 223 og 126.

NMR (60MHz, D201 55,37 (dublett, J = 2Hz, H-l'), 5,22 (dublett, J=4Hz, H-l"), 4,96 (bred singlet, H-4') , 2,57 (singlet, N-CH2)', 1,26 (singlet, C-CH2).

D. 6'-N-t-butoxycarbonyT-qentamicin C^a

Oppløs 2,69 g gentamicin C^a i 60 ml methanol;vann (1:1), avkjøl til 5° C og tilsett 1,815 ml triethylamin. Tilsett under omrøring 1,91 g. t-butoxycarbonylazid dråpevis. Omrør blandingen

ved 5° C i 18 timer. Tilsett 20 ml Amberlite IRA^-401S harpiks (OH—form), omrør i 30 minutter, filtrer og fordamp filtratet til tørrhet i vakuum. Kromatografer det urene produkt over 350 g silicagel under anvendelse av den nedre fase av et 2:1:1 kloroform: , methanolukonsentrert ammoniumhydroxydløsningsmiddelsystem som elueringsmiddel. Ta 3 ml's fraksjoner og overvåk innholdet ved tynnskiktskromatografi. Kombiner fraksjoner inneholdende hovédreak-sjonsproduktet og fordamp under dannelse av tirtelforbindelsen ifølge dette eksempel (0,42 g, 13 %) , (a)£<6> + 137° (CH3OH), PMR 61,23 (3H, s, C-CH3), 1,45 (9H, s, C-(CH3)3), 2,53 (3H, s, N-CH3), 65,08 (2H, overlappende dubletter, J-3,5Hz, H-lV og H-l") PPM. Massespektrum m/e 550 [(M+l)^] og m/e 549 (M+) .

E. 6'- N- t- butoxycarbonyl- gentamicin B

Oppløs 1 g gentamicin B i 30 ml 50 %-ig vandig methanol og avkjølt til 5° C. Tilsett 0,297 g t-butoxycarbonylazid dråpevis under omrøring etterfulgt av 0,186 ml triethylamin og omrør den resulterende løsning i 18 timer. Fordamp reaksjonsblandingen i vakuum til et residuum og kromatografer residuet på 100 g silicagel under anvendelse av den nedre fase av et 2:1:1 kloroform:methanol: konsentrert ammoniumhydroxyd-løsningsmiddelsystem som elueringsmiddel. Oppsaml 2 ml's fraksjoner og overvåk kolonne effluent ved tynnskiktskromatografi. Kombiner fraksjoner inneholdende likt materiale (fraksjoner 180 - 230) og fordamp under dannelse av 0,830 g 6'-N-t-butoxycarbonyl-gentamicin B med følgende fysikalske konstanter: PMR (60 MHz, D20) , 6 1,21 (3H, s, C-CH3) , 1,42 (9H, s, C(CH3)3), 2,53 (3H, s, N-CHg), 5,2 (1H, d, J=4,5Hz H-l"), 5,23 (1H, d, J=3,0 Hz, H-l') PPM.

Fremstilling 4

1- N- acetylsisomicin

(A) Oppløs 1,25 g sisomicinsulfat i 200 ml methanol-vann (2:3, v/v) og avkjøl løsningen. Tilsett 1,5 ml eddiksyreanhydrid

og etter ca. 10 minutter, tilsett Q,125 ml triethylamin i 10 ml methanol i løpet av en 15 minutters periode. Tillat reaksjonsblandingen å oppvarmes til romtemperatur i løpet av 2 timer og fordamp deretter løsningsmidlet i vakuum. Oppløs residuet i vann og omdann produktet til den fri base ved aten vandig løsning derav føres

gjennom Amberlite IRA-401S harpiks i hydroxyd-ionform. Lyofiliser kolonneeluatet og kromatografer residuet på 50 g silicagel og anvend den nedre fase (2:1:1) kloroform, methanol, 7 % ammoniumhydroxyd-løsningsmiddelsystem som elueringsmiddel. Overvåk fraksjonene ved tynnskiktskromatografi og kombiner like fraksjoner, hvorved erholdes tittelf orbindelsen.

Utbytte - 0,185,g, sm.p. 128° - 130° C, (a)^<6> = 159°

(0,3% H20), NMR: (D20) <<$> 1,22 (3H, s, -C-CH3) ; 2,02 (3H, s, NH-CO-CH3); 2,53 (3H, s, N-CH3); 4,88 (1H, m,=CH-); 5,08 (1H, d, J=4Hz, H-<l>"); 5,35 (1H, d, J=2Hz, Hy) .

Massespektrum: (M + 1)<+> m/e 490, M+ m/e 489.

Fremstilling 5

Fremstilling av aldehyd-mellomprodukter

A. 2~acetam£do-3-hydroxyoctanal

Beskytt aminofunksjonen i 2-amino-3-hydroxyoctanoinsyren ved omdannelse av denne til en acetamidofunksjon, forestre deretter den resulterende 2-acetamido-3-hydroxyoctanoinsyre med methanol, reduser den resulterende 2-acetamido-3-hydroxyoctanoinsyremethyl-ester med di-isobutylaluminiumhydrid ifølge kjente metoder under dannelse av 2-acetamido-3-hydroxyoctanal.

B. 2-acetoxy-4-( N- methylacetamido)- butanal

Behandl diethylacetalet av 2-hydroxy-4-aminobutanal med eddiksyreanhydrid i pyridin etterfulgt av behandling av det resulterende diethylacetal av 2-acetoxy-4-acetamidobutanal med natriumhydrid og methyljodid ved dannelse av diethylacetalet av 2-acetoxy-4-(N-methylacetamido)-butanal. Fjern de acetal-beskyttende grupper ved hjelp av syre under dannelse av\2-acetoxy-4-(N-methylacetamido)-butanal.

Eksempel 1

1- N- substituert sisomicin

A. 1- N- ethylsisomicin

Til en løsning av 5 g sisomicin i 250 ml vann tilsettes IN svovelsyre inntil pH på løsningen er justert til ca. 5. Til løsningen av sisomicinsvovelsyreaddisjonssalt tilsettes 2 ml acetaldehyd, omrør i 10 minutter, og tilsett 0,85 g natriumcyanbbor-hydrid. Fortsett omrøringen ved romtemperatur i 15 minutter, konsentrer deretter løsningen i vakuum til et volum på ca. 100 ml, behandl-løsningen med en basisk ionebytterharpiks (f.eks. Amberlite IRA 401S (OH ) og lyofiliser til et residuum omfattende 1-N-ethyl-sisomicin.

Rens ved kromatografering på 200 g silicagel, eluer med den nedre fase av et kloroform-methanol-7% vandig ammoniumhydroxyd (2:1:1) system. Kombiner de like eluater som fastslått ved tynn-skiktskromatograf i og konsentrer de kombinerte eluater av hovedkomponenten i vakuum til et residuum omfattende 1-N-ethylsisomicin (utbytte 1,25 g). Rens ytterligere ved kromatografering på 100 g silicagel og eluer med et kloroform-methanol-3,5% ammoniumhydroxyd (1:2:1) system. Før de kombinerte, like eluater (som bestemt ved tynnskiktskromatografi) gjennom en kolonne av en basisk ionebytterharpiks og lyofiliser eluatet under dannelse av 1-N-ethylsisomicin (utbytte 0,54 g),

(a)^<6> + 164° (0,3 %, H20), pmr (ppm) (D20): 6 1,05 (3H, t, J=7Hz, -CH2C<H>3); 1,19 (3H, s, -C-CH3), 2,5 (3H, s, N-CH3); 4,85 (1H, m, =CH-); 4,95 (1H, d, J=4Hz, Hy) ; 5,33 (1H, d, J=2,5 Hz, H-^) .

Massespektrum: (M+l)<+> m/e 476

og m/e 127, 154, 160, 173, 191, 201, 219, 256, 299, 317, 332, 345, 350, 360, 378, 390, 400.

B. 1 - N- methylsisomicin

Til en løsning av 4,6 4 g sisomicin i 180 ml vann tilsett IN svovelsyre inntil løsningen har en pH på 5. Tilsett 1,2 ml

37 %-ig vandig formaldehyd, omrør i 10 minutter og tilsett deretter

460 ml narriumcyanoborhydrid. Før reaksjonsløsningen gjennom en kolonne av en basisk ionebytterhapiks (f.eks. Amberlite IRA 401S (OH-~form) og lyofiliser. Kromatograf er det resulterende residuum på silicagel og eluer med den nedre fase av en kloroform-methanol-7% srandig ammoniumhydroxyd . (.2:1:1) løsningsmiddelblanding. Kombiner de like eluater inneholdende hovedsakelig 1-N-methylsisomicin som bestemt ved tynnskiktskromatografi. Fordamp i vakuum til et residuum av 1-N-methylsisomicin} (a)D 2 6 + 153° (0,3 %, H20);

Maasespektxum: (M+l)<+> m/e 462

og m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336(w), 346, 376, 386.

C. 1- N-( h- propyl)- sisomicin

=^^^^^^^^ .B^ lignende beskrevet ii eksempel la' svovélsyreaddisjorissaltet av sisomicin i vann med propanal og natriumcyanoborhydrid. Isoler og rens det resulterende produkt på lignende måte som beskrevet, hvorved det erholdes 1-N-(n-propyl)-sisomicin; (a}^<6> +140° (0,3 %, H20);

pmr (ppm) (D20): 6 0,83, (3H, t, J=7Hz, -CH2CH3); 1,14 (3H, s, -C-CH3); 2,45 (3H, s, -N-CH^); 4,82 (1H, m, =CH-); 4,90 (1H, d, J=4Hz, Hi"); 5,78 (1H, d, J=2Hz, );

Massespektrum: (M+l)+ m/e 490

og 127, 160, 168, 187, 205, 215, 233, 256, 313, 331, 346, 359, 364, 374, 404, 414.

D» 1- N-( n- butyl)- sisomicin

Tilsett til en løsning av 3 g sisomicin i 200 ml vann IN svovelsyre inntil løsningen har en pH på 3,5. Tilsett 1,5 ml n-butanal, omrør i 10 minutter og tilsett deretter 450 mg natriumcyanoborhydrid. Fortsett omrøringen i 1 time og konsentrer deretter løsningen i vakuum til et volum på ca. 100 ml. Før denne løsning gjennom en kolonne av en basisk ionebytterharpiks (f.eks. Amberlite IRA 401S (QH~)) og lyofiliser^ Kromatografer det resulterende residuum på 140 g silicagel og eluer i den nedre fase av en kloroform-methanol-7% vandig ammoniumhydroxyd (2:1:1) løsnings-middelblanding. Kombiner de like fraksjoner inneholdende 1-N-(n-fautyl)-sisomicin som bestemt ved tynnskiktskromatografi og fordamp de kombinerte eluater i vakuum til et residuum omfattende 1-N-(n-butyl)-sisomicin; (ct)^<6> + 129° (0,3%, H20) , pmr (ppm) (D20)

5:0,82 (3H, t, J=*7Hz, -CH2CH3) ; 1,15 (3H, s, C-CH3);'2,46 (3H, s, -N-CH3); 4,82 (lH, m, =CH-); 4,92 (1H, d, J=4Hz, H^");

5,29 (1H, d, J=2Hz, %') .

Massespektrum: (M+l)+ m/e 504;

også m/e 127, 160, 182, 201, 219, 229, 247, 256, 327, 345, 360, 373, 388, 418, 428.

E. Andre 1- N- alkyl, 1- N- alkenyl og 1- N- aralkyl- sisomiciner

,. Gå frem som beskrevet i eksempel IA men i stedet for acetaldehyd anvend ekvivalente mengder av hvert av de følgende alkylaldehyder :

1. 2-ethylbutanal,

2. propenal.

Utfør i hvert tilfelle reaksjonen på samme måte som beskrevet i eksempel .IA og isoler og xens hvert av de resulter-

ende produkter på lignende måte som beskrevet, hvorved det

erholdes

1. 1-N-(g-ethylbutyl)-sisomicin { ol)* 6 + 121°

(c=0,4%, H20) pmr (ppm) (D20) : 6 0,75 (6H,

t, 6,5 Hz, CH2-CH3); 2,4 (3H, s, N-CH3);

4,78 (1H, m, =CH-) ; 4,88 (1H, d, 4,0 Hz, H^')

5,22 (1H, d, 2,0 Hz, H-, ') ;

Massespektrum: (M+l) m/e 532

også, m/e 127, 160, 210, 229,

256, 275, 355, 373, 388, 401, 406, 416, 446, 456,

2. 1-N-(P-propenyl)-sisomicin [a]£° + 147° (0,4, MeOH); nmr (D20) fi 1,18

(s, 3H, C-CH3); 248 (s, 3H, N-CH3) ; 3,75 (1H,

dd, J=4,H Hz, H-2"); 3,95 (1H, d, J=13<Hz,> H<->5<e>);

4,84 (1H, m, H-4<*>); 4,94 (1H, d, j=4hz, h-1");

5,30-5,0 (3H,+m, H-l1, =CH2); 5,8 (1H, m, -CH=CH2);

MS m/e 488 •

F. 1- N-( 5- aminobutyl)- sisomicin

Tilsett IN svovelsyre dråpevis til en løsning av 3 g sisomicin i 120 ml vann inntil pH på løsningen er justert til ca. 5. Tilsett til den vandige løsning av svovelsyre-addisjonssaltet av sisomicin 60 ml dimethylformamid etterfulgt av en løsning av 2 g 4-fthalimidobutanal i 10 ml dimethylformamid. Fortsett omrøringen i 10 minutter og tilsett 420 natriumcyanoborhydrid. Tilsett etter 20 minutter reaksjonsløsningen til 1 liter vannfri methanol under omrøring og oppsaml ved filtrering det resulterende bunnfall omfattende svovelsyreaddisjonssaltet av 1-N-(6-fthalimidobutyl)-sisomicin.

Rens ved oppløsning av bunnfallet i vann og før den vandige løsning over en basisk ionebytterharpiks. Fordamp løsningen i vakuum til et residuum, kromatografer residuet over silicagel og eluer med den nedre fase av en kloroform-methanol-7% vandig ammoniumhydroxyd (2:1:1) oppløsningsblanding, og fordamp de kombinerte,

like eluater til et residuum omfattende 1-N-(6-fthalimidobutyl)-sisomicin.

Til 0,5 g 1-N-(6-fthalimidobutyl)-sisomicin tilsett 5 ml 5 %-ig ethanolisk hydrazinhydrat og oppvarm under tilbakeløpskjøling i. 3 timer. Held reaksjonsløsningen over i et stort volum tetrahydrofuran og oppsaml ved filtrering det resulterende bunnfall omfattende 1-N- (6-aminobutyl) -sisomicin.

Alternativt kan forbindelsen ifølge dette eksempel fremstilles som følger:

(1) 4-acetamidobutyraldehyd

...<,>'„. r,,/,v .. -.-O<p>pløs-.5 g 4-racetamidobutyraldéhyddiethylacetal i 75 ml destillert vann og 5 ml IN svovelsyre. La løsningen stå ved romtemperatur inntil hydrolysen er fullført som fastslått ved tynn-skiktskromatograf i. Nøytraliser løsningen med natriumbicarbonat og mett deretter løsningen med natriumklorid og ekstraher med kloroform. Destiller de kombinerte kloroformeksrrakter til et residuum omfattende 4-acetamidobutyraldehyd, som kan anvendes uten ytterligere

rensing i den etterfølgende prosedyre.

(2) 1- N-( 6- acetamidobutyl)- sisomicin

Til 3 g sisomicin i 120 ml destillert vann tilsettes 0,1N svovelsyre inntil' løsningen har en pH på 5. Tilsett 6 g 6-acetamidobutyraldehyd fremstilt som ovenfor beskrevet, og etter 10 minutter 600 g fast natriumcyanoborhydrid. Etter 2 timer konsentreres løsningen til et lite volum og helles over i methanol. Oppsaml det resulterende bunnfall ved filtrering, løs i vann og før den vandige løsning gjennom en kolonne av Amberlite IRA 401-S (OH ) ionebytterharpiks. Fordamp elueringsmidlet og kromatografer det resulterende residuum på silicagel og eluer med den nedre fase av en kloroform:methanol:7 % ammoniumhydroxydløsningsmiddelblanding. Fordamp elueringsmidlet til et residuum omfattende 1-N-(6-acetamido-butyl) -sisomicin.

(3) 1- N-( 6- aminobutyl)- sisomicin

. ; v ^ Behandl: 1-N-(6-acetamidobutyl)-sisomicin erholdt i det foregående eksempel med 10 % vandig kaliumhydroxyd ved 100° C i 3 timer og nøytraliser deretter med Amberlite IRC-50 ionebytterharpiks og eluer med 2N vandig ammoniumhydroxyd. Konsentrer eluatet og løs det resulterende residuum i vann og lyofiliser under dannelse av 1-N-(6-aminobutyl)-sisomicin. (a)D O CL + 109° (c=0,3 %, H20)j Massespektrum: (M + 1)* m/e 519

i;:;: , i ; også 127, 160, 197, 216, 234, 244, 256, 262, 342, 360, 375, 388, 393, 403, 443.

G. 1-N-(g-aminoethyl)-sisomicin og 1-N-(y-aminopropyl) ,

sisomicin

På lignende måte som beskrevet i den alternative fremgangsmåte i eksempel 1- F, behandl en vandig løsning av sisomicin til hvilken 0.,1 N svovelsyre, er tilsatt til løsningen har nådd en pH på 5, med g-acetamidoacetaldehyd etterfulgt av fast'natriumcyanoborhydrid. Isoler og rens det resulterende produkt som tid-* ligere beskrevet hvorved det erholdes 1-N-(g-acetamidoethyl)-sisomicin. Hydrolyser 1-N-(g-acetamidoethyl)-sisomicin med 10 % vandig kaliumhydroxyd'og isoler og rens det resulterende produkt som beskrevet i avsnitt (3) av. den alternative fremgangsmåte ifølge eksmepel 1-F hvorved det erholdes 1-N-(g-aminoethyl)-sisomicin.

Massespektrum: (M + 1)<+> m/e 491,

også 160, 169, 187, 206, 216, 234, 256, 283, 314, 325, 334, 347, 360, 370, 375, 405, 415.

Hvis man ved den ovenfor angitte fremgangsmåte anvender y-acetamidopropanol i stedet for g-acetamidoacetaldehyd, dannes 1-N-(Y-acetamidopropyl)rsisomicin som ved hydrolysering med 10 % vandig kaliumhydroxyd etterfulgt av isolering og rensing gir 1-N-(y<->aminopropy 1 Jrs isomicin.

[a]<26> + 127° (H20)

nrar (D20): £l,2 (3H, s, -C-CH3); 2,5

(3H, s, N-CH3); 3,8 (1H, dd, J = 4, 10,5 Hz,

<H>2"); 4,0(1H, d, J = 12,5 Hz, H^' e);

4,85 (1H, m, -C=CH-); 4,95 (1H, d, J = 4 Hz,

H-,/'); 5,34 (1H, d, J = 2,5 Hz, I-y).

Massespektrum M<+> •♦• 1 m/e 5o4 også l6o, 202 , 220, 230, 248, 256, 328, 346, 361, 374, 379, 389,

407, 419 og 429.

Eksempel 2

1- N- substituert gentamicin C^^

A. 1- N- ethylgentamicin

Tilsett til 5 g gentamicin Cla i 125 ml vann 1 N svovelsyre inntil løsningens pH er 5,2. Tilsett deretter 2 ml acetaldehyd. Omrør løsningen i 5 minutter, tilsett deretter 1 g natriumcyanoborhydrid. Fortsett omrøringen ved romtemperatur i 30 minutter, konsentrer løsningen i vakuum til et volum på ca. 75 ml, før løsnin-gen gjennom en kolonne av basisk ionebytterharpiks (f.eks. Amberlite IRA 401S (0H~)), og lyofiliser deretter et residuum omfattende 1-N-ethylgentamicin c^a.

Rens ved kromatografi på 200 g silicagel og eluer den nedre fase av et kloroform-methanol-7% vandig ammoniumhydroxyd (2:1:1) system. Kombiner de like eluater som bestemt ved tynn-skiktskromatograf i og konsentrer de kombinerte eluater med hovedbestanddelen i vakuum til et residuum omfattende 1-N-ethylgentamicin C^a (utbytte 0,95 g). Rens ytterligere ved kromatograf! av 1-N-ethylgentamicin C^a på 100 g silicagel Og éluer med kloroform-methanol-3,5% ammoniumhydroxyd (1:2:1) system. Behandl de kombinerte, like eluater (som bestemt ved tynnskiktskromatografi) med en basisk ionebytterharpiks og lyofiliser eluatet under dannelse av 1-N-ethylgentamicin CX - cl (0,42 g) , { ol)U* 6 + 118° (c=0,3 %, H20) ; pmr (ppm) (D20): 61,06 (3H, g, J=7Hz, -CH2CH3); 1,19 (3H, s, -C-CH3);

2,51 (3H, s, -N-CH3); 4,97 (1H, d, J=4Hz, R^"); 5,16 (1H, d, J=3,5 Hz, H1').

Massespektrum (M + 1)<+> m/e 478

også m/e 129, 154, 160, 173, 191, 201, 219, 258, 301, 317, 319, 329, 332, 347, 350, 360, 378 og 402.

Eksempel 3

1- N- substituert- v erdamicin

A. 1- N- ethylverdamicin

Tilsett til 0,5 g verdamicin i 65 ml vann IN svovelsyre til løsningens pH er justert til 4,9 og tilsett deretter 0,2 ml acetaldehyd. Omrør løsningen, tilsett 65 mg natriumcyanoborhydrid, konsentrer løsningen i vakuum til et volum på ca. 10 ml og held løsningen over i 50 ml methanol under omrøring. Oppsaml ved filtrering det resulterende bunnfall omfattende 1-N-ethylverdamicin. Rens ved kromatograf! på 100 g silicagel og eluer med et kloroform-methanol-3,5% ammoniumhydroxyd (1:2:1) system. Oppsaml like fraksjoner som bestemt ved tynnskiktskromatografi og fordamp i vakuum de kombinerte fraksjoner inneholdende hovedbestanddelen til et residuum omfattende 1-N-ethylverdamicin. Rens ytterligere ved kromatograf! på 7 g silicagel og eluer med den nedre fase av et kloroform-methanol-7% ammoniumhydroxyd (2:1:1) system. Kombiner de like eluater og fordamp i vakuum til et residuum av 1-N-ethylverdamicin (utbytte 50 mg),

Massespektrum: (M + 1)<+> m/e 490

også m/e 141, 154, 160, 173, 191, 201, 219, 270, 313, 317(w), 331, 332, 341, 350(w), 357, 359, 360, 378, 390, 414.

,B> :Gjenta-fremgangsmåten ifølge ékse<p>pel 3A men i stedet for acetaldehyd anvend andre aldehydmellomprodukter. Isoler og rens hvert av de resulterende produkter på samme måte som tidligere beskrevet, hvorved det erholdes l-N-(n-propyl)-verdamicin, [a]p6 + 122° (c=0,3%, H20); pmr (ppm ) (D20); £0,88 (3H, X, J=7Hz, CH2CH3); 1,19 (3H, s, C-CH^; l,l6 (3H, d,

J=6Hz, CH-CH3); 4,81 (1H, m, =CH-) ; 4,97 (1H, d, J=4,OHz, H^') ;

5,30 (1H, d, J=2,OHz, ^'J;

Massespektrum: (M + 1) m/e 528

også m/e 141, 160, 168, 187, 205, 215, 233, 270, 346, 355, 373, 504.

1-N-(n-butyl) verdamicin (a}^<6> + 121° j(c=0,3%, H20) ; pmr (ppm)

(D20): 60,8 (3H, t, J=6,5Hz, CH2-CH3); 2,45 (3H, s, NCH-j) ; 4,8 (1H, m, C=CH-); 4,92 (1H, d, J=4,0 Hz, E^')} 5,25 (1H, d, J=2,oHz, ) ;

Massespektrum: (M + 1><+> m/e 518

også m/e 141, 160, 182, 201, 219, 229, 247, 270, 341, 360, 378, 387, 388, 418, 442.

Eksempel 4

1- N- substituert- gentamicin

A. 1- N- ethylgentamicin C^

Behandl på samme måte som beskrevet i eksempel IA 5 g gentamicin C-, i 250 ml vann med IN svovelsyre inntil løsningens pH er ca. 5. Behandl deretter den surgjorte løsning med acetaldehyd og natriumcyanoborhydrid på den beskrevne måte og isoler og rens det resulterende produkt, hvorved det erholdes 1-N-ethylgentamicin Cl' (°0d<6> + 114° (c=0>3%' H20) ; pmr (ppm) (D20) : 61,03 (3H, t, 7Hz, -CH2CH3); 1,03 (3H, d, J=6,5Hz, -CH-CH.^ ; 1,17 (3H, s, C-CH3);

2,32 (3H, s, 6'N-CH3); 2,49 (3H, s, 3"-NHCH3); 4,94 (1H, d, J=4Hz, H-,"); 5,13 (1H, d, J=3+,5Hz, H-,').

Massespektrum: (M +1) m/e 506

også m/e 154, 157, 160, 173, 191, 201, 219, 286, 317, 329(w), 347, 350, 360, 375, 430.

B. Gjenta fremgangsmåten ifølge eksempel 4A, men istedenfor acetaldehyd, anvend andre aldehydreagenser. Isoler

og rens hvert av de resulterende produkter som tidligere beskrevet, hvorved det erholdes 1-N-methylgentaraicin ,

,5 (D2p) l,p4 (3H, d, J=6,5Hz,. 6.V-CH3) ; 1,18 (3H, s, 4"-CH3) ; ! !-2,29 (3H, s, 1-HCH3); 2,32 (3H, s, 6'-HCH^ ; 2,49 (3H, s,

3"-HCH3); 4,95 (1H, d, J1",2"=4Hz, H^'); og 5,13 ppm (1H, d, Jj.' ,2'=3,5Hz, ^ •) ; M+ m/e 491 også 4l6, 384, 364, 36l, 346,

343, 336, 333, 318, 315, 303, 286, 205, 187, 177, 160, 159, 157-l-N-Y (3-hydroxyethyl ) -gent amicin c^

+ 98,0° (c=0,3%, H20); pmr (ppm) (D20); £0,99 (3H,

d, J=»&,5Hz, 6'-CE3)/ 1,13 (3H, s, 4"-CH3), 2,28 (3H, s, 6*-NCH3)f. 2,45 (3H, a, 3"-WCH^l,- 4,97 (1H, d, J~4Hz, E^') og 5,11 (1H, d, J=*3,5HZ, R^ U

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 522

også m/e 446, 404, 394, 391, 376, 373, 366, 363, 348, 345, 333, 286, 235, 217, 207, 189, 160, 157; v maks (KBR) 3300, 1060 cm<-1>.

1-N-(fenylethyl)-gentamicin C_

(a)D° + 99,4° (c=0,3%, H20); pmr (ppm) (D20): 6 0,99 (3H, d, J=6,5Hz, 6'-CH3), 1,10 (3H, s, 4"-CH3), 2,28 (3H, s, 6'-NCH3), 2,43 (3H, s, 3" -NCH3), 4,88 (1H, d, J=4Hz, Hy), 5,08 (1H, d, J=3,5HZ, H^) og 7,33 (5H, s, -CgH5) ;

Massespektrum: (M + 1)<+> m/e 582

også m/e 506, 464, 454, 451, 436, 433, 426,

423, 408, 405(w), 393, 295, 286, 277, 267, 249, 160, 157,

v maks (KBR) 3300, 1050, 1030 cm"<1>.

Eksempel 5

1- N- substituert- Antibiotikum G- 52

A. 1- N- ethyl- Antibiotikum G- 52

Oppløs 875 mg Antibiotikum G-52 i 40 ml destillert vann og tilsett 1 N svovelsyre inntil løsningens pH er justert til ca. 3,5. Tilsett 0,7 ml acetaldehyd, omrør reaksjonsblandingen i 10 minutter og tilsett deretter 100 mg natriumcyanoborhydrid. Overvåk reaksjonsløsningen ved tynnskiktskromatografi og når utgangs-Antibiotikum G-52 synes å ha reagert fullstendig (dvs. i ca. 10 minutter), konsentrer deretter løsningen i vakuum ved 35 til 40° C til et volum på ca. 10 ml. Før den konsentrerte løsning gjennom en basisk ionebytterharpiks og lyofiliser deretter til et residuum omfattende 1-N-ethyl-Antibiotdkum G-52. Rens, ved kromatografering på en silicagélkolonhe og eluer med den nedre fase av et kloroform-methanol-7% vandig ammoniumhydroxyd (2:1:1) system. Kombiner de like eluater som bestemt ved tynnskiktskromatografi og konsentrer de kombinerte eluater med hovedbestanddelen i vakuum til et residuum omfattende 1-N-ethyl-Antibiotikum G-52 (utbytte 60 mg). Rens ytterligere de overlappede eluater fra den foregående kromatografi ved kromatografering på silicagel og eluer med den nedre fase av et kloroform-methanol-7% vandig ammoniumhydroxyd (1:2:1) system hvorved det erholdes 35 mg av et residuum omfattende 1-N-ethyl-Antibiotkum G-52. Før de kombinerte residuer av 1-N-ethyl-AntihiotLkum G-52 gjennom en kolonne av basisk ionebytterharpiks (f.eks. Amberlite IRA 401S) og lyofiliser eluatet hvorved det erholdes 1-N-ethyl-Antibiotikum G-52 (utbytte 90 mg);

{ a}* 6 + 122,1° (c~0,3%, H20), pmr (ppm) (D20) : <S 1,06 (3H, t, J= 6,5 Hz, 1N-CH2CH3); 1,21 (3H, s, 4"-C-CH3); 2,30 (3H, s, 3"-N-CH3)j 2,50 (3H, s, 6'-N-CH3); 4,94 (1H, m, H4'); 4,97 (1H, d, J=»4,0Hz ^"1; 5.^34 (1H, d, J=2,5Hz, R±') .

Massespektrum: (M + 1)<+> m/e 490

også-m/e, 141, 154, 160, 173, 191, 201, 219,

270, 313, 317(w), 331, 332, 341, 350, 359, 360, 378, 390, 414.

Eksempel 6

A. Behandle på samme måte som beskrevet i eksempel IA hver av de følgende 4, 6-diaminog.lycosyl-l, 3-diaminocyclitoler i vann med svovelsyre efterfulgt av acetaldehyd og natriumcyanoborhydrid:

1. gentamicin B,

2. Antibiotikum JI-20B,

3- mutamicin 2,

4. mutamicin 6.

Isoler og rens hvert av de resulterende produkter på samme måte som beskrevet i eksempel IA, hvorved det erholdes de tilsvarende 1-N-ethylforbindelser, dvs.

1. 1-N-ethylgentamicin B,

[a]<*6> + 119,7° (c, 1 i vann)

Massespektrum m/e [MH]<+> 380, 352, 334, 378, 350, 332, 219, 191, nmr (6o MHz D20): 5 5,55 (H-l', JlV <=> 3'° HZ)' 5, 05 (H_1"' Jl"'2" <=> 4 <Hz>)' 2.9 (N-CH3), 1,05-1,5 (2C-CH3).

2. 1-N-ethyl-Antibiotikum JI-20B,

[a]<*6> + 112,5 (H20)

nmr (D20): 5 1,1 (3H, t, J=? Hz, CH2-CH3);

1,22 (3H, s, C-CH3); 1,3 (3H, d, -CH-CH3);

4,95 (1H, d, J=4 Hz, Hy); 5,35 (1H, J = 3,5Hz, Hy). Massespektrum M<+> + 1 m/e 524, også 154, l6o, 173, 175, 191, 201, 219, 304, 317, 332, 333, 350, 360.

3. l-N-ethylmutamicin 2,

Smp. 80-84°C

pmr (D20): £ 1,06 (t , J=7 Hz, 3, 1-N-CH2CH3), 1,19 (s, 3, 4"-CH3), 2,50 (s, 3, 3"-N-CH3), 2,53 (d, J2",3<n> = 10,5 Hz, 1, Hy), 3,75

(dd, J-l" ,2" = 4 Hz; J2» ,3" = 10,5 Hz, 1, H2<»>), 3,83 (d, Hy e<q> y 2x 12 Hz, 1, Hy), 4,86

(m, 1, Hy), 4,98 (d, Hyy = 4 Hz, i, Hy) og 5.10 (d, J^y = 2,5 Hz, 1, H1'). Massespektrum: m/e 459, 384, 329, 3l6, 311, 301, 283, 203, 185, 175, 160, 142, 127.

4- l-N-ethylmutamicin 6,

Smp. 118-122°C (spaltn.)

Massespektrum (M)+ m/e 475, (M + 1)<+> m/e 476, Monosaccharider: m/e l60, 127

2-deoxystreptaminer: m/e 219, 201, 191, 171 Disaccharider: m/e 355, 317, 299,

m/e 378, 350, 322

pmr ( £) D20

Eksempel 7 Fremstilling av HJ-?substituert-4,6-di- (aminoglycosyl) -1,3-di-aminocyclitoler via selektivt blokkerte mellomprodukter A. 1-N-ethylgentamic in via et 2', 3- di- N- substituert mellomprodukt

Oppløs 240 mg 2 *,3-di-N-trifluoracetylgentamicin C 1 i

10 ml vann-methanol (2:1) og juster løsningens pH til 3,5 ved tilsetning av 1 N svovelsyre. Tilsett 0,19 ml acetaldehyd, omrør i 10 minutter og tilsett deretter 27 mg natriumcyanoborhydrid og omrør reaksjonsblandingen i ytterligere 10 minutter. Fordamp reaksjonsblandingen i vakuum til et residuum omfattende 1-N-ethy1-2',3-di-N-trif luoracetylgentamicin C^. Oppløs det foregående residuum i 50 ml konsentrert ammoniumhydroxyd og la løsningen få stå ved romtemperatur i 24 timer. Fordamp blandingen i vakuum og kromatografer det resulterende residuum over. silicagel (12 g) og eluer med den nedre fase av en blanding av kloroform-methanol-10% vandig ammoniumhydroxyd (2:1:1). Kombiner de like fraksjoner (som bestemt ved tynnskikts-kromatograf i) og fordamp de kombinerte eluater i vakuum til et residuum omfattende 1-N-ethylgentamicin Ci (utbytte 80 mg) med samme karakteristika som angitt i eksempel 4A.

B. 1- N- ethylsisomicin via et 6'- N- substituert mellomprodukt

Behandl på samme måte som beskrevet i eksempel 7A 6'-N-t-butoxycarbonylsisomicin (fremstilt på samme måte som fremstilling 3D) i vandig methanol med svovelsyre, deretter acetaldehyd og natriumcyanoborhydrid. La reaksjonsblandingen stå ved romtemperatur i 30 minutter og fordamp deretter i vakuum, hvorved det erholdes 1-N-ethy1-6<1->N-t-butoxycarbonylsisomicin. Oppløs residuet i trifluoreddiksyre og la løsningen stå i 10 minutter. Tilsett deretter et overskudd av vannfri methanol, filtrer det resulterende bunnfall av trifluoreddiksyresaltet av 1-N-ethylsisomicin og kromatografer over silicagel og anvend den nedre fase av et kloroform-methanol-ammoniumhydroxyd-løsningsmiddelsystem på samme måte-som' beskrevet i eksempel 7A, hvorved det erholdes 1-N-ethylsisomicin med samme karakteristika som angitt i eksempel IA.

C. 1- N- methylsisomiciri fra 3"- N- 4"- O- carbonyl- sisomicin

- 5 g 3"-N-4,,-0-cårbbnyl-sisomicin i 300 ml destillert vann behandles med 1 N svovelsyre inntil løsningens pH er 2,5. 37 % vandig formaldehyd (2 ml) tilsettes, og etter 10 minutter tilsettes en løsning av 500 mg natriumcyanborhydrid i 5 ml vann dråpevis. Etter 1 time reduseres volumet på løsningen til halvparten ved fordampning i. vakuum, pH. på den konsentrerte løsning justeres til 11 ved tilsetning av 1 N natriumhydroxydløsning, og løsningen fordampes til tørrhet. Residuet ekstraheres med 3 x 100 ml methanol og de kombinerte methanolekstrakter fortynnes med et likt volum kloro-form, filtreres og fordampes til tørrhet under dannelse av urent l-N-methyl-3"-N-4"-O-carbonyl-sisomicin.

Det urene produkt behandles med 10 % vandig kaliumhydroxyd ved 100° C i 5 timer. Den avkjølte løsning føres gjennom en Amberlite IRC-50 (H<+>) ionebytterharpiks og elueres med 2 N vandig ammoniumhydroxyd og elueringsmidlet konsentreres og lyofiliseres under dannelse av urent 1-N-methyl-sisomicin.

Kromatografi av det urene materiale på silicagel (300 g) i kloroform-methanol-7% ammoniumhydroxyd (2:1:1) gir 1-N-methyl-sisomicin. (ct)J<6> + 153° (0,3 % H20) ;

Massespektrum: (M + 1)<+> m/e 462

også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336j[w) , 346, 376, 386.

D. 1- N- methy1verdamicin via et 3", 4"- N- O- oxazolidon-mellomprodukt

(1) Til en vandig løsning av 1 g verdamicin, tilsett natriumcarbonat inntil pH er innen området 8 til 9. Tilsett en løsning av 5 g p-nitrofenylklorcarbonat i 25 ml dimethylformamid dråpevis under omrøring i løpet.av ,3 timer mens pH på reaksjonsblandingen opprett-holdes i området 8 til 9 ved tilsetning av mer natriumcarbonatløs-ning. Etter endt tilsetning, fortsett omrøringen ved pH 8 til 9 i 16 timer. Fordamp blandingen i vakuum, ekstraher det resulterende residuum flere ganger med varm kloroform, kombiner og fordamp ekstraktene og kromatografer det resulterende residuum over 100 g silicagel og eluér med den nedre fase av et (2:1:1) kloroform-methanol-konsentrert ammoniumhydroxydløsningsmiddelsystem. Kombiner og fordamp de like fraksjoner som bestemt ved tynnskiktskromatografi, hvorved det erholdes verdamicin-3",4"-N,0-oxazolidon. (2) På samme måte som beskrevet i eksempel ID, behandl det foregående oxazolidonderivat i vann med svovelsyre, formaldehyd og natriumcyanborhydrid. Isoler og rens det resulterende produkt på samme måte som tidligere beskrevet, hvorved det erholdes 1-N-methylverdamic in-3 ", 4"-N,O-oxazolidon. (3) Oppløs 0,2 g l-N-methylverdamicin-3" ,4"-N,0-oxyzolidon i 10 ml 2 N natriumhydraxydløsning. Oppvarm under tilbakeløpskjøling 5 timer, nøytraliser reaksjonsblandingen med eddiksyre og fordamp til et residuum. Kromatografer residuet over 10 g silicagel og eluer med den nedre fase av et (2:1:1) system av kloroform-methanol-15% .ammoniumhydroxyd. Kombiner og' fordamp de like fraksjoner som bestemt ved tynnskiktskromatografi til et residuum, hvorved det erholdes 1-N-methylverdamicin.

Eksempel 8

1- N- benzylqentamicin C ^ - via et tri- N- beskyttet 1- N- Schiff- base-mellomprodukt

(1) Oppløs 0,3 g 2 *,3-di-N-trifluoracetylgentamicin C^ i 12 ml

ethanol og tilsett 0,9 ml benzaldehyd. Omrør reaksjonsblandingen i

3 timer og fordamp i vakuum. Oppløs det resulterende residuum i

0,8 ml kloroform og tilsett løsningen dråpevis til 25 ml hexan-ether (3:1). Separer det resulterende bunnfall ved filtrering og tørk i vakuum, hvorved det erholdes l-N-3"-N-4"-0-bis-benzylidin-2»,3-di-N-trifluoracetylgentamicin (utbytte = 0,38 g) , sm.p. 128 - 134° C, (a)£<6> + 74,6° (c=0,26 %, ethanol).

(2) Oppløs 1,37 g av det produkt som erholdes i eksempel 8(1)

i 100 ml ethanol og tilsett til en omrørt blanding av 1,37 g natriummethoxyd og 1,94 g natriumborhydrid i 100 ml ethanol. Omrør i 3 timer, surgjør blandingen til pH på ca. 3 med saltsyre pg rør

deretter i 16 timer. Ekstraher løsningen med ether, separer og kast etherskiktet. Tilsett ammoniumhydroxyd til iden vandige fase inntil den er basisk, fordamp deretter i vakuum til et residuum. Ekstraher residuet med 35 g varm ethanol. Kombiner ekstraktene

og fordamp i vakuum. Kromatografer det resulterende residuum over 75 g silicagel og eluer med den nedre fase av et kloroform-methanol-hydroxyd-vann (2:1:0,2:0,8) løsningsmiddelsystem. Kombiner like fraksjoner slik som bestemt ved tynnskiktskromato-graf! og fordamp til et residuum omfattende 1-N-benzylgentamicin Cpjm. p. 83 .- 88° C, (a}£<6> + 90° (c=0,3 %, H20) ; pmr (ppm)

(D20): & 1,03 (3H, d, J=7Hz, HC-CH3); 1,16 (3H, s, C-CH3);

~ T, 21 (3H, s, N-CH3); 2,50 (3H, s, N-CH3); 4,7 (D2<0><+> PhCH2N ); 4,92 (1H, d, J=4Hz, H-l"); 5,08 (1H, d, J=3,5 Hz, H-l'); 7,43 (5H, s, aromatisk H);

Massespektrum: (M + 1)<+> m/e 568

også m/e 440, 437, 412, 394, 379, 281, 263, 253, 235, 160, 157.

Eksempel 9

l- N- substituert- 4, 6- diaminoglycosy1- 1, 3- diaminocyclitoler fremstilt ved hydrldreduksjon av de tilsvarende 1- N- acylderivater _A«- 1- N- ( S-( S- amino- g- hydroxybutyl) - gentamicin

(1) Suspender 98 mg 1-N-(S-5-amino-8-hydroxybutyryl)-gentamicin i 8 ml tetrahydrofuran. Tilsett 14 ml IN diboran i tetrahydrofuran og oppvarm ved tilbakeløpstemperatur i 6 timer under nitrogenatmosfære. Tilsett forsiktig 2 ml vann for å spalte eventuelt overskudd av diboran og fordamp. Oppløs det resulterende residuum i hydrazinhydrat og oppvarm til tilbakeløpstemperatur under nitrogenatmosfære i 16 timer. Fordamp løsningen og ekstraher residuet med varm vandig ethanol. Fordamp de kombinerte ethanol-ekstrakter og kromatografer det resulterende residuum over 10 ml silicagel og eluer med den nedre fase av et kloroform-methanol-konsentrert ammoniumhydroxyd (2:1:1) løsningsmiddelsystem. Kombiner og fordamp de like fraksjoner slik som bestemt ved tynnskikts-kromatograf i , hvorved det erholdes 1-N-(S-6-amino-g-hydroxybutyl)-gentamicin C± (utbytte 14,5 mg), sm.p. 93 - 98° C, (ct)^r +72,4°

(c=0,35%, H20); pmr (ppm) (D20) 6 1,18 (3H, d, J=7Hz, CH-CH3);

1,24 (3H, s, C-CH3); 2,49 (3H, s, N-CH3); 2,54 (3H, s, N-CH3);

5,07 (1H, d, J=3,5Hz, H-l<n>); 5,24 (1H, d, J=3,5Hz, H-l').

Massespektrum: (M + 1)<+> m/e 565

også ra/e 528, 516, 490, 437, 434, 410, 397, 278, 250, 232, 160, 157.

Fremstill på samme måte l-N-(S-Y-methylamino-|3-hydroxypropyl)-gentamicin B,

pmr: D20: £1,21 (3H, s, C-CH.^) ; 2,33 (3H, s, 3,,,-N-CH3);

2,62 (3H, s, 3"-N-CH3); 5,02 (1H, d, J=k, 5 Hz, H-l<»>); 5,12

(1H, d, J=3,0 Hz, H-l').

Eksempel 10

1- N- methylsisomicin fra 3"- N- 4"- 0- carbonyl- 2', 3, 6'- tri- t-butoxycarbonyl- sisomicin

Oppløs 0,77 g 3"-N-4"-0-carbonyl-2',3,6'-tri-N-t-butoxycarbonyl-sisomicin i 20 ml tetrahydrofuran og avkjøl i et—isbad. Tilsett 0,12 g methylfluorsulfonat og la blandingen oppvarmes til/ romtemperatur. Fjern oppløsningsmidlet og oppløs residuet i trl-fluoreddiksyre. Fjern etter 5 minutter ved romtemperatur trifluor-eddiksyren i vakuum og behandl residuet med 10 % kaliumhydrøxyd-løsning ved 100° C i 5 timer. /"'

Før den avkjølte løsning ned gjennom en kolonne av Amberlite IRC-50 (H ) ionebytterharpiks og eluer med 2 N vandig ammoniumhydroxyd. Konsentrer elueringsmidlet og lyofiliser, hvorved det erholdes det urene titte lprodukt. ..Kromatografer det urene materiale på silicagel og eluer den nedre fase av et kloroform-methanol-7% ammoniumhydroxyd (2:1:1) løsningsmiddelsystem, hvorved det erholdes 1-N-methyl-sisomicin.

(a}£6 + 153° (0,3%, H20); Massespektrum: (M + 1)+ m/e 462

også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205,

256, 285, 303, 318, 331, 336(w), 346, 376, 386.

Eksempel 11

1- N- methylsisomicin

5 g 2',3,6'-tri-N-t-butoxycarbonyl-3"-N-4"-O-carbonylsisomicin i 100 ml ethanol behandles med 1 ml 37 %-ig vandig formaldehyd og 5 g ammoniumformiat og løsningen oppvarmes under tilbake-løp i 24 timer. Løsningen fortynnes med 200 ml vann og ekstraheres med 3 x 100 ml kloroform. De kombinerte ekstrakter reduseres til tørrhet og residuet inneholdende 2',3,6<1->tri-N-t-butoxycarbonyl-3"-N-4"-0-carbonyl-l-N-methyl-sisomicin løses i trifluoreddiksyre og etter 5 minutter ved romtemperatur fjernes løsningsmidlet i vakuum. Residuet behandles med 10 % kaliumhydroxyd (25 ml) ved 100° C i 5 timer. Den avkjølte løsning føres ned gjennom en kolonne av Amberlite IRC 50 (H<+>) ionebytterharpiks og det urene produkt elueres med 2 N vandig ammoniumhydroxyd. Det kombinerte elueringsmiddel reduseres til tørrhet i vakuum og residuet kromatograferes på 200 g silicagel og elueres med den nedre fase av et kloroform-methanol-7% ammoniumhydroxyd (2:1:1) løsningsmiddelsystem, hvorved det erholdes 1-N-methylsisomicin. (a)D + 153° (0,3%, H20); Massespektrum: (M + 1)<+> m/e 462

også m/e 122, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336(w), 346, 376, 386.

Eksempel 12

1- N- methylsisomicin

Behandl 0,77 g 2',3,6'-tri-N-t-butoxycarbonyl-3"-N-4"-carbonyl-sisomicin i 25 ml tetrahydrofuran med 101 mg methylamin og 290 mg trifluormethylsulfonsyreanhydrid ved 0° C i 18 timer. Reduser løsningen til tørrhet og oppløs residuet i 10 ml dimethylformamid og omrør med 300 mg methyljodid og 130 mg kaliumcarbonat i ytterligere 18 timer. Fjern løsningsmidlet ved fordampning og behandl residuet med 10 % vandig kaliumhydroxyd ved 100° C i 12 timer. Før den avkjølte løsning gjennom en kolonne av Amberlite IRC, 50 (H ) ionebytterharpiks. Det urene produkt elueres deretter med 2 N vandig ammoniumhydroxyd. Det kombinerte elueringsmiddel reduseres til tørrhet i vakuum og residuet kromatograferes på 200 g silicagel og elueres i den nedre fase av et kloroform-methanol-7% ammoniumhydroxyd (2:1:1) løsningsmiddelsystem, hvorved det erholdes 1-N-methylsisomicin. (a)^<6> + 153° (0,3%, H20);

Massespektrum: (M + 1)<+> m/e 462

også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205,

256, 285, 303, 318, 331, 336(w), 346, 376, 386.

Eksempel 13

1- N- methylsisomicin

0,77 g 2',3,6,-tri-N-t-butoxycarbonyl-3"-N-4"-0-carbonylsisomicin i 20 ml tetrahydrofuran behandles med 3 ml 37 %-ig vandig formaldehyd og 170 mg succinimid ved romtemperatur i 18 timer. Løs-ningen heldes over i en blanding av diethylether-hexan (1:1) og

bunnfallet oppsamles ved filtrering. Dette materiale behandles med 200 mg natriumborhydrid i 20 ml ethanol ved romtemperatur i 5 timer. Ethanolen fjernes i vakuum og residuet behandles med 10 % vandig kaliumhydroxyd i 12 timer ved 100° C. Den avkjølte løsning føres ned gjennom en kolonne av Amberlite IRC 50 (H<+>) ionebytterharpiks og det urene produkt elueres med 2 N vandig ammoniumhydroxyd. Det kombinerte elueringsmiddel reduseres til tørrhet i vakuum og residuet kromatograferes på silicagel (200 g) og elueres med den nedre fase av et kloroform-methanol-7% ammoniumhydroxyd (2:1:1) løsnings-middelsystem, hvorved det erholdes 1-N-methylsisomicin. (°0D

153° (0,3%, H20);

Massespektrum: (M + 1) m/e 462

også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205,

256, 285, 303, 318, 331, 336(w), 346, 376, 386.

Eksempel 14

1- N- methylsisomicin

Oppløs 0,77 g 2',3, 6'-tri-N-t-butoxycarbonyl-3n-N-4"-0-carbonylsisomicin i 100 ml diklormethan med 0,25 g acrylnitril og la blandingen stå ved romtemperatur i 24 timer. Fjern oppløsnings-midlet i vakuum og oppløs residuet i dimethylformamid og behandl med 180 mg methyljodid ved 50° C i 12 timer. Fjern løsningsmid-let, og behandl residuet med 10 % vandig kaliumhydroxyd ved 100° C i 18 timer. Den avkjølte løsning føres ned gjennom en kolonne av Amberlite IRC 50 (H ) ionebytterharpiks og det urene produkt elueres med 2 N vandig ammoniumhydroxyd. Det kombinerte elueringsmiddel reduseres til tørrhet i vakuum og residuet kromatograferes på 200 g silicagel og elueres med den nedre fase av et kloroform-methanol-7% ammoniumhydroxyd (2:1:1) løsningsmiddelsystem,,hvorved det erholdes 1-N-methylsisomicin. (a)^<6> + 153° (°'3%' H20^J

Massespektrum: (M + 1)+ m/e 462

også m/e 127, 140, 159, 160, 177, 187, 205, 256, 285, 303, 318, 331, 336(w), 346, 376, 386.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er bredspektrede antibakterielle midler som fordelaktig utviser aktivitet overfor mange organismer, i særdeleshet gram-negative organismer, som er resistente overfor deres 1-N-usubstituerte forløper. Således kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes alene eller i kombinasjon med andre antibiotiske midler for å forhindre vekst eller redusere antallet av bakterier i forskjellige omgivelser. De kan:, f.eks. anvendes for å desinfisere laboratorieglass, dentalt og medisinsk utstyr forurenset med Staphylococcus aureus eller andre bakterier som kan inhiberes av forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Aktiviteten av forbindelsene ifølge oppfinnelsen overfor gram-negative bakterier gjør dem nyttige til å bekjempe infeksjoner bevirket av gram-negative organismer, f.eks. arter av Proteus og Pseudomonas. De 1-N-substituerte derivater av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler, f.eks. 1-N-ethylsisomicin og 1-N-ethylverdamicin finner også anvendelse innen veterinærmedisinen, i særdeleshet ved behandling av mastitis i kveg og Salmonella indusert diaré i husdyr slik som hund'og katt.

Den etterfølgende tabell angir den minimale inhiberende konsentrasjon (MIC) av enkelte forbindelser ifølge oppfinnelsen. Forsøkene ble utført i Mueller-Hinton støp (pH 7,2) ved anvendelse av standard prosedyrer.

In v it ro- minimum inhiberende konsentrasjon ( MIC)

Beteg nelse av forbindelser i tabellen:

a) Nye forbindelser fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse:

Forbindelse 1: 1-N-ethylgentamicin C,

X3

Forbindelse 2: 1-N-ethylgentamicin

Forbindelse 3: 1-N-ethyl-Antibiotikum G-52

Forbindelse 4"- 1-N-(4-amino-2(S)-hydroxybutanj-gentamicin Forbindelse 5= 1-N-hydroxyethylgentamicin C-^

Forbindelse 6: 1-N-fenethylgentamicin C1

Forbindelse 7- 1-N-ethylverdamicin

Forbindelse 8= 1-N-ethylsisomicin

Forbindelse 9: l-N-(2-ethylbutyl) -sisomicin

Forbindelse 10: 1-N-(4-aroinobutyl)-sisomicin

Forbindelse 11: 1-N-ethylgentamicin B

Forbindelse 12: 1-N-ethyl-Antibiotikum JI-20B

Forbindelse 13: l-N-ethylmutamicin 2

Forbindelse 14: l-N-ethylmutamicin 6

b) Forbindelser kjent fra teknikkens stand:

Forbindelse 15: 1-N-(S-4-amino-2-hydroxybutyryl)-genta micin Cla (US patent 3 796 699)

Forbindelse l6: 1-N-(S-4-amino-2-hydroxybutyryi)-gentamicin C1 (US patent 3 780 018)

Testmetode

Fremstill og steriliser 20CO ml Mueller-Hinton nær-ingsvæske justert til pH 7>2. Overfør 5 ml av det sterile medium til hvert av 120 sterile 16 x 150 mm testrør med bomullspropper. Arranger rørene i IO grupper hver på 12 rør. Tilsett til hvert rør lO^ celler av en av de bakteriestammer som skal testes. Tilsett til hver gruppe en vandig løsning av det antibiotikum som skal testes under dannelse av følgende sluttkonsentrasjoner pr. rør: .50 mcg/ml, 25 mcg/ml, 10 mcg/ml, 5 mcg/ml, 2 mcg/ml,

1 mcg/ml, 0,5 mcg/ml, 0,2 mcg/ml, 0,1 mcg/ml, 0,05 mcg/ml,

0,01 mcg/ml, 0,005 mcg/ml og 0,0 mcg/ml (kontroll). Inkuber rørene i 24 timer ved 37°C. Bestem visuelt for hver gruppe av rør den laveste konsentrasjon av antibiotikum som inhiberer bakterievekst og den høyeste konsentrasjon av antibiotikum som tillater bakterievekst.

Bestem den minimale inhiberende konsentrasjon av test-antibiotikaene overfor hver av testbakteriene ved beregning av middelverdien mellom de to ovenfor funne verdier.

Vanligvis vil den dose som administreres av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, være avhengig av alder og vekt av den dyreart

som behandles, administreringsmetode og typen og tilstanden av den bakterieinfeksjon som skal forhindres eller reduseres. Generelt sett vil dosen ay derivatene av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler for å bekjempe en gitt bakterieinfeksjon være lik den dose som er nødvendig av de tilsvarende l-N-usubstituerte-4,6~di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan administreres oralt.

De kan også påføres topisk i form av salver, både hydrofile og hydrofobe, i form av lotions som kan være vandige, ikke-vandige

aller av emulsjonstypen eller i form av kremer. Farmasøytiske

bærere som er nyttige ved fremstilling av slike formuleringer, vil innbefatte f.eks. slike bestanddeler som vann, oljer, fett, poly-estere, polyoler og lignende.

For oral administrering kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen sammensettes i form av tabletter, kapsler, eliksirer eller lignende eller de kan til og med blandes med dyrefor. Det er i disse doseringsformer at de antibakterielle midler er mest effektive_^__ for behandling av bakterieinfeksjoner i den gastrointestinale<->tractus, hvilke infeksjoner fremkaller diaré.

Generelt vil topiske formuleringer inneholde fra 0,1 til

3,0 g av forbindelsene ifølge oppfinnelsen pr. 100 g salve, kremer eller lotion. De topiske formuleringer påføres vanligvis skånsomt på lesjoner 2 til 5 ganger pr. dag.

De antibakterielle midler ifølge oppfinnelsen kan anvendes

i væskeform slik som løsninger, suspensjoner og lignende som øre-og øyemidler og kan også administreres parenteralt via intramuskulær injeksjon. Den injiserbare løsning eller suspensjon vil vanligvis administreres med fra 1 mg til ca. 15 mg antibakterielt middel pr.

kg kroppsvekt pr. dag oppdelt i 2 til 4 doser. Den nøyaktige dose avhenger av infeksjonens grad og tilstand, mottageligheten av den infiserende organisme overfor det antibakterielle middel og de individuelle kjennetegn til de dyrearter som behandles.

Claims

1. Analogifremgangsmåte for fremstilling av 1-N-substituerte derivater av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitolene gentamicin B, gentamicin B^, gentamicin C^, gentamicin C^a, genta micin cy gentamicin C2a, gentamicin C^b' s^-som:'-c:i:n' verdamicin, Antibiotikum G-418, Antibiotikum 66-40B, Antibiotikum 66-40D, Antibiotikum JI-20A, Antibiotikum JI-20B, Antibiotikum G-52, mutamicin 1, mutamicin 2, mutamicin 4, mutamicin 5 og mutamicin 6, hvori substituentén er hvori X er hydrogen, alkyl, alkenyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, N-alkylaminoalkyl, aminohydroxyalkyl, N-alkylaminohydroxyalkyl, fenyl eller benzyl, hvilke alifatiske radikaler har opp til 7 carbonatomer og, hvis X er substituert med amino og hydroxy, bærer substituentene på forskjellige carbonatomer, og farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter derav, karakterisert ved at der anvendes en av de følgende prosedyrer A til G, Å) en av de ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-l, 3-diamino cyclitoler som kan ha amino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra 1-stilling, behandles med et aldehyd av formelen hvor X' er en gruppe som definert for X og hvor enhver tilstedeværende amino eller hydroxygruppe kan være beskyttet, i nærvær av et hydriddonator-reduserende middel, og, om nødvendig, at alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet fjernes, B) redusering av N,C-dobbeltbindingen i et 1-N=CHX'-substituert derivat av en av de ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler, hvori alle NH2~grupper er beskyttet og NHCH^-grupper kan være beskyttet, hvor X' er en gruppe som definert for X, hvori enhver tilstedeværende amino eller hydroxygruppe kan være beskyttet, og at alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet fjernes, C) et 1-N-suhstituert derivat av en av de ovenfor angitte 4,6- di-r (aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitbler, hvori en eller flere aminogrupper kan være beskyttet og 1-N-substituenten er 0 hvor X" er hydrogen, alkyl, alkenyl, hydroxyalkyl, aminoalkyl, N-r . alkylamiiroalkyl, aminohydroxyalkyl, N-alkylaminbnydroxyalkyl, fen- .yl, benzyl eller hydrocarbyloxy, hvilke alifatiské radikaler har opp til 7 carbonatomer, og hvis X er substituert med amino og hydroxy, bærer substituenteneipå forskjellige carbonatomer, og hvori enhver tilstedeværende amino eller hydroxygruppe kan være beskyttet, behandles med et amidreduserende hydridreagens, og om ønsket/ at allé tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet fjernes, . D) det for fremstilling av de ovenfor angitte 1-N-substituerte derivater av .4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitolér hvori substituentén er rettkjedet alkyl med opp til 5 carbonatomer, at en av de ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler , som utviser a mLno-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra 1-stilling, og hvori 1-aminogruppen kan være aktivert, omsettes med et alkyleringsmiddel inneholdende en rettkjedet alkylgruppe med opp til 5 carbonatomer og én forlatende gruppe, og at de beskyttende grupper, og om ønsket tilstedeværende aktiverende gruppe eller grupper i molekylet fjernes, E) det for fremstilling av de ovenfor angitte 1-N-substituerte derivater av 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler hvori substituentén er methyl, at en av de ovenfor angitte 4,6-di-(aminoglycosyl)-1,3-diaminocyclitoler som utviser amino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra 1-stilling, omsettes med formaldehyd og et cyclisk imid, hvorefter den således erholdte forbindelse behandles med et hydrid-donator-reduserende middel, og at alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet fjernes, F) det for fremstilling av de samme forbindelser som angitt i punkt E, at en av de ovenfor angitte 4,6-di«{aminoglycosyl) - 1,3-diaminocyclitoler som utviser amino-beskyttende grupper i en hvilken som helst stilling forskjellig fra 1-stilling, omsettes med formaldehyd i nærvær av maursyre og at alle tilstedeværende beskyttende grupper i molekylet fjernes. hvilke frémgangsmåtealternativer A til F efterfølges av isolering av derivatet som sådant eller som et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, k a rakt e r i sért ved at 1-N-ethylsisomicin. fremstilles og isoleres som sådant eller som et farmasøytisk akseptabelt syreaddisjonssalt.