NO133673B

NO133673B -

Info

Publication number: NO133673B
Application number: NO14436562A
Authority: NO
Inventors: J S G Cox; H Fazackerley; J D Cocker
Original assignee: Glaxo Lab Ltd
Priority date: 1961-05-16
Filing date: 1962-05-12
Publication date: 1976-03-01
Also published as: CH565184A5; CH520709A; DE1795484A1; DE1795484B2; CH554371A; FR2030M; BE617687A; AT265520B; SE317380B; DE1745624C3; AT265513B; DE1745624B2; DK128611B; NO133673C; JPS3917936B1; DE1795727A1; DE1745624A1

Description

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til fremstilling -av nye cefalosporin-C-derivater og av salter av så-danne.

Cefalosporin C -har folgende strukturformel: - De nye -forbindelser som e-rholdes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen har en analog struktur og vil bli -vist under bibehold av den ovenfor angitte nummerering.

Det er tidligere kjent at forskjellige cef a losporin-forbindelse-r ka^n omsettes med pyridin og andre svake heterocycliske -baser under dannelse av der-ivater som i 3-sidekjeden er substituert med vedkommende -baserest, og at slike derivater i mange tilfelle har antibakteriell aktivitet. Det er -imidlertid „en vesentlig ulempe ved slike kjente reaksjoner at utbyttene er meget lave og at de resulterende<p>rodukter er lite stabi-le in vivo. De baser som anvendes i disse reaksjoner har relativt svak nucleofil natur.

Det er nu funnet at cefalosporin C og visse beslektede forbindelser reagerer med visse, i det folgende nærmere angitte, sterkt nucleofile forbindelser, under dannelse av derivater, ved fortrengning av acetoxygruppen i cefalosporin C-molekylets 3-stilling. Mange av de herved erholdte produkter har antibakteriell aktivitet som i noen tilfelle er sterkere enn utgangs-materialets aktivitet. Produktene har i alminnelighet den be-tydelige fordel at de viser en forbedret stabilitet mot avbyg-ning in vivo (som det eksempelvis fremgår av forsok med dyr) sammenlignet med de tilsvarende acetoxyforbindelser. Da sistnevnte oppviser aktivitet overfor penicillin-motstandsdyktige organismer, er dette meget viktig^ Fremgangsmåteproduktene ifolge oppfinnelsen har også betydning som utgangsmaterialer for fremstilling av andre cefalosporinderivater.

De cefalosporin C-derivater som erholdes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen tilsvarer den generelle formel I:

eller salter derav, i hvilken

formel r betegner et hydrogenatom eller en carboxylisk acylgruppe, mens A betegner et radikal av en sterkt nucleofil forbindelse som er valgt blant:

(a) thiourea-forbindelser med den generelle formel:

hvor<4>, R<5>, R<6>og R<7>kan være like eller forskjellige, og hver er et hydrogenatom, en alkylgruppe med fra 1 til 6 carbonatomer, en cycloalkylgruppe med 5 eller 6 carbonatomer i ringen, en alkenylgruppe med fra 2 til 6 carbonatomer, en fenylgruppe eller en benzylgruppe, eller R 4 og R 6danner sammen en alkylengruppe med fra 2 til 4 carbonatomer, (b) aromatiske og alifatiske thioamider med den generelle formel

tec hvor R og R har de ovenfor angitte betydninger, mens R er en alkylgruppe med fra 1 til 6 carbonatomer, en fenylgruppe eller en benzylgruppe,

(c) thiofenoler med den generelle formel

9 IO

hvor R og R kan være like eller forskjellige og hver er et hydrogenatom, en aminogruppe, en N-alkylaminogruppe med fra 1 til 6 carbonatomer, enN,N-dialkylaminogruppe i hvilken hver

av alkylgruppene har fra 1 til 6 cartonatomer, en nitrogruppe, en nitrosogruppe, en carboxylgruppe, en cyangruppe, en trifluormethylgruppe eller en NaO-SC^-gruppe, og natrium- og kaliumsalter herav,

{d) primære eller sekundære aminer med den generelle formel:

hvor R"*"1 er en nafthylgruppe eller gruppen 9 10 12 hvor R og R. har de ovenfor angitte betydninger, mens R er et hydrogenatom eller en alkylgruppe med fra 1 til 6 carbonatomer,

(e) -thioler med den generelle formel:

hvor R 13 er en alkylgruppe med fra 1 til 6 carbonatomer eller en sådan alkylgruppe som er substituert med en aminogruppe, en N-alkylaminogruppe med fra 1 til 6 carbonatomer, enJvj,N-dialkylaminogruppe A hvilken hver av alkylgruppene har fra 1 til 6 carbonatomer, en nitrogruppe, en nit rosogruppe, en carboxylgruppe, en cyangruppe eller en trifluormethylgruppe, eller en 5- eller 6-leddet heterocyclisk ring i hvilken heteroatomene er N, S eller 0 med den begrensning at minst ett heteroatom er nitrogen, og eventuelt substituert med N-alkyl eller keto-oxygen, eller en slik heterocyclisk ring kondensert med en carbocyclisk aromatisk ring, (f) alkalimetallsalter av azider, hydrogenfosfater eller thio-sulfater, eller

(g) pyrroler med den generelle formel:

hvor R^ er et hydrogenatom eller en alkylgruppe med fra 1 til 6 carbonatomer.

Det karakteristiske hovedtrekk ved oppfinnelsen er at man under anvendelse av et inert polart reaksjonsmedium, ved en pH-verdi fra 5 til 8 og ved en temperatur på minst 15°C omsetter en forbindelse med den generelle formel:

eller et salt herav, i hvilken generelle formel (II) R^ har de ovenfor angitte betydninger, med en sterkt nucleofil forbindelse av en av de under (a) til (g) ovenfor angitte formler og om ønskes , innfører en carboxylisk acylgruppe i en erholdt forbindelse hvor R^ er et hydrogenatom, eller hydrolyserer en erholdt forbindelse hvor R 3 er en carboxylisk acylgruppe og eventuelt re-acylerer den resulterende forbindelse for innføring av en annen carboxylisk acylgruppe i 7-stillingen, og/eller overfører en erholdt forbindelse til et salt.

Da R i den generelle formel (II) for utgangsmaterialet kan være gruppen HOOC-CH(NH2).(CH2)^-CO, vil det sees at der som ut-gangsmateriale kan anvendes cefalosporin C. Da R^ kan representere en carboxylisk acylgruppe generelt, kan man også bruke derivater av cefalosporinforbindelser hvor acylgruppen er alkanoyl-, alkenoyl-eller substituerte alkanoylgrupper som f.eks. aralkanoyl-, aryloxy-alkanoyl-, S-arylthioalkanoyl- og S-aralkylthioalkanoylgrupper. Typiske eksempler på slike acylgrupper kan defineres ved nedenstående generelle formler: (i) R' (CH2)nCO - hvor R* er aryl, cycloalkyl, substituert aryl eller substituert cycloalkyl, og n er et helt tall fra 1-4. Eksempler på denne gruppe innbefatter fenylacetyl, nitrofenyl-acetyl og fenylpropiony1.

fii) C H„ ,CD - hvor ra er et helt tall fra 2 - 7-- Alkyl-

V1m 2m+l

gruppen kan være uforgrenet eller forgrenet og kan eventuelt være avbrutt av et oxygenatom eller et svovelatom. Eksempler på slike grupper er hexanoyl-, heptanoyl-, octanoyl- og butylthioacetyl-grupper. (iii) CpH2p_iC0"hvor P er et helt tall fra 2 - 7- Alkenyl-gruppen kan være ufargrenet eller forgrenet og kan eventuelt -være avbrutt av et oxygenatom eller et svovelatom. Eksempler på slike grupper er acrylyl-, crotonyl- og allylthioacetylgrupper.

a b

(i-v) R'0 CR R .CO - hvor R' har den under (i) angitte betydning, og Ra og R er like eller -forskjellige, og hver er et hydrogenatom eller en alkylgruppe. Et eksempel på en sådan gruppe ex fenoxyacetyl.

(v) R'SCR<a>R<b>.CO - hvor R', Ra og R<b>er som angitt ovenfor. Eksempler på slike thiogrupper er S-fenylthioacetyl, S-klorfenyl-thioacetyl og S-bromfenylthioacetyl. (vi) R*(CH2)nS(CH2)qCRaRb.CO - hvor R', Ra og Rb har de ovenfor angitte betydninger, n er et helt tall fra 1 - 4, og q er 0 eller et helt tall fra 1 - 1+. Eksempler på slike grupper er S-benz-ylthioacetyl, benzylthiopropionyl og 8-fenethylthioacetyl. (vii) R'-CO-, hvor R<*>har samme betydning som ovenfor. Eksempler på slike grupper er benzoyl, substituert benzoyl og cyclo-pentanoyl. Hvis benzoylgruppen er substituert, kan substituentene være alkyl- eller alkoxygrupper, og substituentene kan være i 2-eller 2- og 6-stillingene. En egnet 2,6-disubstituert benzoyl-gruppe er derfor 2,6-dimethoxybenzoyl.

Reaksjonen kan bekvemt utføres ved å inkubere reaktantene i oppløsning ved en temperatur fra 15 til 70°C, fortrinnsvis 37 - 50°C, i et tidsrom fra noen timer eller endog døgn inntil man har fått det ønskede derivat i optimalt utbytte. Reaksjonen forløper særlig tilfredsstillende ved en temperatur på ca. 37°C i et tidsrom på 48 - 72 timer. Reaktantene anvendes fordelaktig i et forhold tilsvarende 1 - IO molekvivalenter av den nucleofile forbindelse pr. molekvivalent av forbindelsen med den generelle formel II. Reaksjonsoppløsningens pH-verdi holdes innenfor grensene 5, 0 og 8>fortrinnsvis mellom 6 og 7, hvilket gir best utbytte. Oia nødvendig reguleres oppløsningens pH til den ønskede verdi ved tilsetning av en puffer som f.eks. natriumacetat, eller, hvis der anvendes et alkalimetallsalt av cefalosporinforbindelsen med den generelle formel II, ved tilsetning av f.eks. eddiksyre.

Da reaksjonen forløper ved en polar eller ionisk mekanisme, er det nødvendig å bruke et sterkt polart medium for at reaksjonen skal forløpe med målbar hastighet. I alminnelighet er vann det best egnede oppløsningsmiddel, men i de tilfelle hvor derv nucleofile forbindelse ikke er godt oppløselig i vann, kan man- bruke en blanding av vann og et med vann blandbart organisk oppløsnings-middel såsom dimethylf ormamid, aceton eller ethanol. Pas-sende mengdeforhold ved anvendelse av slike oppløsningsmiddelblandinger er volumforhold på 50:50 eller 30:70. Ikke-vandige polare oppløs-n-ingsmidler som aceton kan også brukes.

Reaksjonsproduktet kan skilles fra reaksjonsblandingen som kan inneholde uforandret cefalosporin og andre stoffer, ved forskjellige metoder såsom krystallisasjon, ionoforese, papirkromatografi eller kromatografering på ionebytterharpikser.

Blant de foretrukne cefalosporinforbindelser med den generelle formel II er cefalosporin C. og dettes ben2-ylanalog (R — fenylacetyl), særlig i form av deres alkalimetallsalter, f.eks. natrium-,saltet. Det fremgår imidlertid av eksemplene nedenfor at andre slike analoger har ført til forbindelser med fordelaktig aktivitet.

Som eksempler på de under a) anførte thioureaer kan nevnes thiourea , N-fenylthiourea,•N,N'-difenylthiourea og ethylenthio-r rea .

De primære og sekundære aminer (d) kan f.eks. være anilin, p-nitroanilin, p-nitro-N-methylanilin, sulfanilsyre og p-aminoben-zoesyre. Gruppen omfatter også nafthylaminer, som f.eks. a-nafthyl-amin og alkyl-nafthylaminer.

Spesielt foretrekkes det å bruke substituerte thioler, her-under aminothioler og substituerte aminothioler som nucleofile forbindelser av gruppe (e). Eksempler på slike nucleofile forbindelser innbefatter 2-aminoethanthiol, 2-amino-2-methylpropan-l-thiol og 3-dimethylaminopropan-l-thiol,

Som før nevnt, er de forbindelser som fremstilles ifølge oppfinnelsen, nye forbindelser. Disse forbindelser kan inndeles i de følgende generelle klasser tilsvarende de ovenfor anførte klasser

3 14

av nucleofile forbindelser. I de følgende formler har R - R de ovenfor angitte betydninger.

(a) Forbindelser med den generelle formel:

(b) Forbindelser med den generelle formel: (c) Forbindelser med den generelle formel:

og deres alkalimefallsalter.

Sistnevnte klasse innbefatter forbindelser avledet fra thiofenoler som er substituert i kjernen med en amino-,

alkylamino- eller dialkylaminogruppe. Eksempler på slike thiofenoler er derfor o- og p-aminothiofenol. Klas-sen omfatter også forbindelser avledet fra thiofenoler inneholdende

en konjugert elektrontiltrekkende gruppe, dvs- en slik gruppe i en ertho- eller para-st illing eller om ønskes- i mere enn en sådan stilling'. Viktige eksempler på denne type av nucleofil forbindelse er forskjellige nitrothiofenoler , eksempelvis o-nitrothiofenol og o,p-dinit rothiofenol.

De elektront ilt rekkende grupper senr kan være tilstede på de nucleofile forbindelser som anvendes i foreliggende 9 10 fremgangsmåte, er angitt i definisjonen av R og R

(d) Forbindelser med den generelle formel:

og deres alkalimetallsalter; (e) Forbindelser med den generelle formel:

og deres alkalimetallsalter.

Viktige forbindelser tilhørende denne underklasse er forbindelser som avledes fra he-terocycliske forbindelser definert i rela-13

sjon til R . Vanligvis er mercaptogruppen bundet til et carbonatom i ien heterocycliske ring, og et heterocyclisk nitrogenatom er naboatom til dette carbonatom. Den heterocycliske ring kan inneholde andre substituenter såsom N-alkyl" eller keto-oxygen. Denne type innbefatter derivater av bl.a. thiazolin, hydantoin, imidazol, thiazol og oxazol, men ikke cycliske thioureaer.

Eksempler på heterocycliske nucleofile forbindelser som kan anvendes, innbefatter således 2-mercaptothiazolin, 2-mercapto-hydantoin, l-methyl-2-mercapto-imidazol, 2-mercapto-imidazol, 2-mercapto-benzimidazol, 2-mercapto-benzothiazol, 2-mercapto-benzoxa-zol og 2-mercapto-pyridin.

Eksempler på gruppen R 13 innbefatter således:

Selv om disse heterocycliske forbindelser er betegnet som thiol-(mercapto-) eller thionforbindelser, kan de foreligge som thion eller mercapto-zwitterion-tautomerer, og oppfinnelsen gjelder også anvendelsen av slike tautomere former. De heterocycliske forbindelser er beskrevet som mercapto- eller thionforbindelser av praktiske grunner.

(f) Forbindelser med den generelle formel:

og deres alkalimetallsalter.Forbindelser av denne type har vanligvis fordelaktige oppløselighetsegenskaper i vandige media og har forbedret aktivitet in vitro overfor gram-positive organismer sammenlignet med utgangs-cefalosporinet. (g) Forbindelser med den generelle formel:

hvor R<1>^ representerer gruppen -S20g eller -HPO^, samt deres a Ika timet a Ils alt er

(h) Forbindelser med den generelle formel:

samt deres alkalimetallsalter.

De ovenfor beskrevne forbindelser har ant ibakteriel-1 aktivitet, og noen av disse forbindelser viser en høyere antibakteriell aktivitet.overfor visse organismer enn-utgangs-cef alosporinderi-vatet. Forbindelser som er særlig viktige, er thiouronium, substituert thiouron-ium og azid-derivater.

En forbindelse som erholdes ifølge oppfinnelsen og. som har særlig god virkning, er thiouroniumderivatet av benzylcefalosporin som har følgende formel:

Det ultrafiolette spektrum av denne- forbindelse viste

^max 2600 ^'El<%>cm 189^ Forbindelsen viste markert biologisk aktivitet overfor Staphylococcus aureus og Bacillus subtilis. Aktiviteten av dette derivat overfor Staphylococcus aureus ble funnet å være høyere enn aktiviteten av cefa-losporin C, benzylcef alosporinet og thiouroniumsaltet av cefalosporin C. Ikke bare-ble det funnet å ha betydelig aktivitet overfor penicillin-sensi-

tive stammer av Staphylococcus aureus, men det ble ogsa funnet a ha markert aktivitet overfor viktige stammer av penicillin-resistent Staphylococcus aureus. Dessuten ble det funnet å være meget resistent overfor stafylokokk-penicillinase, hvilket også er tilfelle med cefalosporin C og benzyl-cefalosporin. En annen viktig forbindelse er thiouroniumsaltet av cefalosporin C, som ble funnet å være mere aktiv overfor Staphylococcus aureus og Bacillus subtilis enn cefalosporin C.

Andre viktige forbindelser som erholdes ifølge oppfinnelsen og som har noenlunde lignende aktivitet som forbindelsen ifølge formel XI, innbefatter

7-benzylthioacetamidocefalosporin-thiouroniumsalt 7-allylthioacetamidocefalosporin-thiouroniumsalt 7-p-benzylthiopropionamidocefalosporin-thiouroniumsalt 7-|3-f eny lpropionamidocef alosporin-thiouroniumsalt 7-pentanearboxamidocefalosporin-thiouroniumsalt 7-n-butylthioacetamidocefalosporin-thiouroniumsalt 7-p-klorfenylthioacetamidocef alosporin-thiouroniumsalt 7-p-fenethylthioacetamidocefalosporin-thiouroniumsalt 7-fenylacetamidocefalosporin-azid

7-benzylthioacetamidocefalosporin-azid

7-fenylacetamidocefalosporin-mercaptopyridin 7-fenylacetamidocefalosporin-N-ethyl-thiouroniumsalt, og 7-f enylacetamidocefalosporin-mereapt obenzoxa zolderivat et.

De forbindelser som erholdes nar R er acyl, kan hydrolyseres, spesielt de som erholdes direkte fra cefalosporin C, under dannelse av de tilsvarende 7-aminocefalosporansyrederivater med formelen:

Disse derivater kan re-acyleres på i og for seg kjent vis for å innføre den ønskede carboxyliske acylgruppe.

Fremgangsmåteproduktene kan på kjent vis opparbeides til farma-søytiske preparater.

De følgende eksempler vil ytterligere belyse oppfinnelsen. I eksemplene ble de følgende test- og eksperiment-fremgangsmåter fulgt.

Papirkromatograf i

Fosfat- pufret papir

7,05 g vannfritt dinatriumhydrogenfosfat i 2,5 liter vann (0,02 M) ble tilsatt fosforsyre til en pH på 6; papir av typen Whatman nr. 1 (30 x 50 cm) ble dyppet i ovennevnte oppløsning og tørret ved 37°C natten over.

Natriumacetat- pufret papir

13,6 g hydratisert natriumacetat i 1 liter vann (0,1M) ble tilsatt eddiksyre til en pH på 5-; papir av typen Whatman nr. 1

(30 x 30 cm) ble dyppet i oppløsningen og tørret.

Papirkromatogram ble utviklet på fosfatpufret papir i (A) butan-l-ol-ethanol-vann i volumforholdet 4:1:5, og (B) propan-l-ol-vann i volumforholdet 7:3»samt på natriumacetat-pufret papir i ethylacetat-natriumacetat-oppløsningsmiddelsystem (ethylacetat mettet med nat riumacetatpuffer, pH 5,0).

Elekt roforese

.Elektroforese ble utført på papir av typen Whatman 3MM ved

17 v/cm (i 2,5 - 4 timer med mindre annet er sagt) i vandig colli-dinacetatoppløsning (0,05 M til acetat), pH J, 0 og pyridinacetat-oppløsning (0,05 M til acetat), pH 4,0.

Elektroforeseresultatene uttrykkes som tilbakelagt distanse for derivatene sammenlignet med cefalosporin C (eller benzyl - cefalosporin C) under de samme betingelser. En positiv verdi (+) betyr bevegelse mot anoden, dvs. at molekylet er negativt ladet, mens en negativ verdi (-) viser bevegelse mot katoden, dvs. positiv ladning.

Forbindelser tilhørende benzylcefalosporingruppen viste seg som mørke flekker i ultrafiolett belysning (TV 230 - 300 nm) ("benzylcef alosporin"-derivater gir ikke noen farvning med ninhydrin). De ble også påvist ved hjelp av bioautografer på agarplater som var inokulert med S. aureus C864 (Oxford H stamme), B. subtilis • ATCC 6633 eller V. cholerae C833 (.svekket laboratoriestamme) .

Forbindelser tilhørende gruppen cefalosporin C viste seg som mørke flekker i ultrafiolett belysning (230 - 300 nm) og som purpur-i -.r vede flekker når papiret ble dusjet med ninhydrin. De ble også påvist ved hjelp av bioautografer på agarplater som var inokulert med enten S. aureus C864 (Oxford H stamme) eller B. subtilis ATCC 6633.

Eksempel 1

(a) Fremstilling av thiouroniumss lt av cefalosporin C

5 g av natriumsaltet av cefalosporin C og 8 g thiourea ble oppløst i 200 ml destillert vann og hensatt uten lystilgang ved 37°C i noen dager. Reaksjonen ble fulgt ved hjelp av papirkromatografi. Efter 4-5 dagers undersøkelse ved hjelp av denne teknikk var der lite cefalosporin C tilbake. Den resulterende opp-løsning ble behandlet med lOOO ml aceton og kjølt til 0°C. Det

oljeaktige bunnfall som hadde dannet seg, ble fraskilt ved sentrifugering og ga efter ytterligere behandling med aceton et lysebrunt fast stoff i en mengde på 3,79-Under de samme betingelser forble en oppløsning av thiourea (konsentrasjon 4 g/lOOO ml) ganske klar. Det lysebrune faste stoff, som inneholdt alt det biologisk aktive materiale, ble oppløst i 50 ml vann og ført gjennom en kolonne (26,0 x 2,5 cm) av "Dowex" - 1 (x 8) i acetatformen. Thiouroniumsaltet ble hurtig eluert fra kolonnen idet det kom ut nesten ved oppløsningsmiddelfronten. Kolonnen ble eluert med vann, og fraksjoner (25 ml) ble uttatt.

Undersøkelse av disse fraksjoner ved hjelp av papirkromatografi viste bare spor av thiourea i oppløsningene av thiouroniumsaltet, alt ureagert cefalosporin C var blitt fjernet. De vandige oppløs-ninger inneholdende thiouroniumforbindelsen ble frysetørret, hvorved man fikk 2,589av et kremfarvet fast stoff. Dette materiale ble ytterligere renset ved ekstraksjon med absolutt methanol (for å fjerne tilstedeværende natriumacetat), og thiouroniumforbindelsen erholdtes som et luftig.fast stoff (2,18 g) • Ultrafiolett absorpsjon (i H„0) A max. bredt 2590- 2640Å. E^% l6l.

vZ' ' i cm

Thiouroniumsaltet erholdtes som et hvitt, mikrokryst allinsk, fast stoff ved forsiktig utfelning fra vandig oppløsning ved hjelp av methanol. Ultrafiolett absorpsjon (i H„0) A max. bredt. 2590 -. 2640 Å, Ei°cm189- Når produktet ble underkastet elektroforese på papir, oppførte det seg som om det ikke hadde noen nettoladning ved pH 7,0 eller pH 4,0.

Ved papirkromatografi i butan-l-ol-ethanol-vann var Rf-verdien (ikke over 0,02) for saltet lavere enn for cefalosporin C (0,03). Likeledes hadde det i propan-l-ol-vann lavere Rf-verdi (0,11) enn cefalosporin C (0,22).Papirkromatografi viste at det ga både a-aminoadipinsyre og thiourea ved syrehydrolyse.

Alle disse egenskaper antydet at acetoxygruppen i cefalosporin C var blitt erstattet av en thiouroniumgruppe.

(b) Syrehydrolyse av cefalosporin- thiouroniumsalt

50 mg cefalosporin-thiouroniumsalt ble oppløst i 2 ml saltsyre av varierende styrke (a) N/10, (b) IN, (c) 2N, (d) 3N , (e) 4N,

(f) 5N og hensatt ved (i) romtemperatur ca. 25°C og (ii) 37°C i noen dager. Aliquote mengder (IO |U> ble uttatt med passende mellomrom. Reaksjonene ble undersøkt ved hjelp av papirkromatograf i og elektroforese. I alle tilfelle ble thiouroniumforbindelsen (Rf 0,11) omdannet til et hurtigere vandrende materiale

(Rf 0r20) som tross svak biologisk aktivitet overfor både S. aureus og B. subtilis lett kunne påvises under ultrafiolett lys som en mørk sone (som med alle cefalosporinderivater). Dusjing av kromatogrammet med (a) vandig pyri-din fulgt av (b) en oppløsning av fenylacetylklorid i aceton avslørte dette hurtigere vandrende materiale

(Rf 0,20) som et meget biologisk aktivt materiale. Lignende metoder ble brukt til påvisning av dette materiale efter elektroforese hvor det vandret hurtigere mot katoden ved pH 4,0 enn cefalosporin -thiouroniumsalt .

Ved direkte analogi med cefalosporin sluttes at dette materiale er 7-amino-cefalosporansyrethiouroniumsalt. Av disse forhånds-eksperimenter fant man at pas'sende betingelser for fremstillingen av 7-amino-cefalosporansyre-thiouroniumsalt (dvs. thiouronium-kjerne) erholdtes når thiouroniumsaltet ble behandlet med 2 - 3 N saltsyre i 3 - 4 dager.

(c) Separasjon av thiouronium-kjernen ved syrehydrolyse av cefalosporin C- thiouroniumsalt

Kolonnen og pufferne ble tilheredt i henhold til den av Hirs, Moore og Stein, J.Biol.Chem. 1952, 195, 669 beskrevne metode.

500 mg cefalosporin C-thiouroniumsalt ble oppløst f 20 ml 2N vandig saltsyre og hensatt i 3 dager.. Oppløsningens pH ble så innstilt på 4,0 med natriumhydrogencarbonat Oppløsningen ble ana-lysert (biologisk) på dette punkt og viste at oppløsningen fremdeles hadde ca. 30% av den opprinnelige biologiske aktivitet. Denne opp-løsning ble ført gjennom en kolonne (2,5 x 30 cm) av "Dowex"-50 (NH^-formen) og eluert med ammoniumformiat-puffer (pH 4,05; 0,2 M). Fraksjoner på IO ml ble uttatt og deres ultrafiolette absorpsjon undersøkt. Der ble uttatt 6o fraksjoner, hvorav nr. 8 - 28 var maksimumsfraksjonene.Undersøkelse av dette materiale efter fryse-tørring viste at det inneholdt uforandret cefalosporin C-thiouroniumsalt sammen med andre hydrolyseprodukter. Thiouronium-kjerne var ikke tilstede i noen av disse fraksjoner.

Fortsatt eluering av kolonnen med ammoniumacetat-puffer

(pH 6,8; 0,2 M) ga kjernen som et bredt maksimum (prøver nr. 70 - 90). Denne oppløsning som inneholdt thiouronium-kjernen (vist ved papirkromatografi og biologisk undersøkelse efter dusjing med pyri-din og fenylacetylklorid), ble fenylacetylert ved hjelp av et større overskudd av fenylacetylklorid, idet oppløsningens pH ble holdt ved pH 7 ved tilsetning av natriumhydrogencarbonat. Den resulterende oppløsning inneholdt benzylcefalosporin-thiouroniumsalt som det eneste aktive materiale. Direkte isolering av kjernen var ikke mulig i dette tilfelle på grunn av vanskelighetene med å fjerne all ammoniumacetat-puffer.

I eksemplene 2-19 ble følgende eksperimentelle fremgangsmåte anvendt.

250 mg av natriumsaltet av cefalosporin C (0,5 millimol) ble oppløst i 10 ml av en vandig oppløsning av den nucleofile forbindelse (5 millimol). Oppløsningens pH var mellom 5,0 og 7>5og ble (om nødvendig) justert til en verdi innen dette område ved tilsetning av eddiksyre. I visse tilfelle hvor oppløseligheten i vann var lav, eksempelvis difenylthiourea, ble reaksjonen utført i 50 volum% dimethylformamid. Blandingen ble holdt ved 37°C, og efter forskjellige intervaller, (eksempelvis 24, 48 og 72 timer) ble prøver på 5 eller 10 mikroliter avsatt på papir for analyse både ved elektroforese og kromatografi. Bioautografer viste det nye subst itusjonsprodukt og gjenværende cefalosporin C. Lignende resultater erholdtes efter dusjing med ninhydrin.

Elektroforeseresultater uttrykkes som tilbakelagt distanse for derivatet i forhold til moder-cefalosporinforbindelsen under de samme betingelser. En positiv (+) verdi betyr vandring mot anoden, dvs. molekylet er negativt ladet, mens en negativ (-) verdi indikerer vandring mot katoden, dvs. molekylet er positivt ladet. Resultatene i disse eksempler er bekvemt uttrykt i tabellform.

Eksempel 20

(a) 72 mg av natriumsaltet av benzylcefalosporin samt 128 mg thiourea ble oppløst i 3 ml destillert vann og hensatt uten til-gang på lys ved 37°C i noen døgn. Efter 3 døgn ble det hvite bunnfall som var dannet, fjernet ved sentrifugering-.

Dette materiale ble vasket med aceton og ether, hvorved man fikk 28,9 mg av et hvitt, fast stoff. En ytterligere mengde (ca. 5 mg) av dette materiale erholdtes fra morlutene. Det faste'stoff ga en enkelt biologisk aktiv flekk ved kromatografi i. sys-temet propanol/vann i volumf orholdet 7 = 3 •.• Rf-verdi 0,74-

R Benzyl-cef.-verdi =0,91.

Undersøkelse av morlutene ved kromatografi viste nærvær av uforandret benzylcefalosporin (natriumsaltet) (Rf 0,81), thiourea

(Rf 0,50) og små mengder benzylcefalosporin-thiouroniumsalt (Rf 0,74). Det således erholdte benzylcefalosporin-thiouroniumsalt var meget lite oppløselig i vann (meget mindre enn 5 mg/ml).

Papir-elektroforese viste at det ikke hadde noen nettoladning ved pH 7,0. Ultrafiolett spektrum (i H20) \ max. 2600 Å, ^ Y" cm 1^' (b) Fenylåcetylering av en blanding erholdt i henhold til eksempel l(b) i vandig aceton (50 volum%) under anvendelse av et stort overskudd av fenylacetylklorid (dvs. betingelser som var anvendt for den tilsvarende reaksjon med cefalosporin C - kjernen), ga en opp-løsning inneholdende benzylcef alosporin-thiouroniumsalt (identifisert ved dets Rf-verdi ved hjelp av autentisk materiale) sammen med annet biologisk aktivt materiale (eksempelvis cefalosporin C-thiouroniumsalt og N-fenylacetylcefalosporin C-thiouroniumsalt). Ut-byttet ved overføringen av cefalosporin C-thiouroniumsalt til benzylcef alosporin-thiouroniumsalt er av størrelsesorde]'- 4%.

Fremstilling i liten målestokk av forbindelser henhørende under cefalosporin C- gruppen ( eksempler 21 - 34)

250 mg (0,5 millimol) av natriumsaltet av cefalosporin C ble oppløst i 10 ml av en vandig acetonoppløsning (50 volum%) av den nucleofile forbindelse (1,5 millimol, dvs. 3 molekvivalenter). Opp-løsningens pH var mellom 5,0 og 7,5 og ble (om nødvendig) justert til en verdi innen dette område ved tilsetning av eddiksyre eller natriumbicarbonat.Blandingen ble holdt ved 37 eller 50°C, og efter forskjellige intervaller (eksempelvis 24, 48 og 72 timer etc.) ble prøver på 5 eller IO mikroliter uttatt for analyse ved både elektroforese og kromatografi. Bioautografer viste det nye substi-tus<*>jonsprodukt og gjenværende cefalosporin C. Lignende resultater erholdtes efter dusjing med ninhydrin.

Fremstilling i liten målestokk av forbindelser henhørende under gruppen " benzylcefalosporin C" ( eksempler 35 - 54)

På grunn av den alt i alt større mikrobiologiske aktivitet hos gruppen "benzylcefalosporin C" og av bekvemmelighetsgrunner ved undersøkelsen ble mere fortynnede oppløsninger anvendt enn de ovenfor nevnte, eksempelvis ble 10 mg 7- fenylacetamidocefalosporansyre ("benzylcefalosporin C") i form av natriumsaltet oppløst i 2 ml av en oppløsning av 3 molekvivalenter av den nucleofile forbindelse i 50% vandig aceton. Reaksjonen ble utført som i det foregående eksempel med unntagelse av at prøvemengder på ca. 1 mikroliter ble anvendt for kromatografi og elektroforese.

Resultatene er gjengitt i nedenstående tabeller II og III.

Eksempel 55

Fremstilling av 2- mercaptobenzoxazolderivatet av Cefalosporin C

5 g cefalosporin C i 75 ml vann ble under omrøring satt til en oppløsning av 5 g 2-mercaptobenzoxazol i 215 ml aceton og 60 ml vann, og pH endret fra 5 til 6,6 med N-natriumbicarbonat. Blandingen (ca. 60 volum% aceton) ble holdt ved 37°C i 4 døgn, hvorpå papirkromatografi viste nærvær av bare en liten mengde cefalosporin C. Reaksjonsblandingen ble derpå ved 0°C for-tynnet til 2 liter med aceton.

Filtrering efter 3 timers forløp ga et ikke helt hvitt, fast stoff (4 g; utbytte 80 vekt% av cefalosporin C-utgangsmaterialet), som ved kromatografi ble vist å inneholde en liten mengde (ca. 5%) cefalosporin C. Det rå substitusjonsprodukt viste de kromatografiske og elektroforetiske egenskaper som er angitt i tabell II (eksempel 28)• Det var meget oppløselig i vann.

Eksempel 56

Fremstilling av 2-mercaptobenzothiazolderivatet av benzylcefalosporin C

435 mg av natriumsaltet av benzylcef alosporin C i 4 nil vann ble satt til en oppløsning av 496 mg 2-mercaptobenzothiazol i 6 ml aceton og pH innstilt på 7,0 med N-natriumbicarbonat. Blandingen ble holdt på 50°C i 65 timer, hvorefter hovedsakelig alt utgangsmaterialet hadde reagert (papirkromatograf i). Acetonet ble så fjernet i vakuum og den gjenværende vandige suspensjon behandlet med 10 ml vann og ekstrahert med ethylacetat ved pH 6 i nærvær av mettet nat riumklor idoppløsning (5 ml).. Et ikke helt hvitt, fast stoff (A) fraskiltes under ekst raksjonen.

Den gjenværende vandige oppløsning ved denne ekstraksjon ble innstilt på en pH 2 og videre ekstrahert med ethylacetat. Det ved pH 6 erholdte ekstrakt (486 mg) inneholdt uforandret nucleofil forbindelse og det ønskede substitusjonsprodukt. Det ved pH 2 erholdte ekstrakt (65 mg) inneholdt spor av uforandret benzylcefalosporin C.

Det faste stoff (A) (uoppløselig i aceton; 136 mg) var det ønskede substitusjonsprodukt med de kromatografiske og elektroforetiske egenskaper som er angitt i tabell III (eksempel 4l) og var kromatografisk homogent.

Eksempel 57

Fremstilling av l-methyl-2-mercapto-imidazolderivatet av benzyl-cefalosporin C

100 mg av natriumsaltet av benzylcefalosporin C ble oppløst i

1 ml vann og behandlet med en oppløsning av 85 mg 1 -methyl-2-mercapto-imidazol (3 molekvivalenter) i 1 ml aceton. Den resulterende opp-løsning ble hensatt i noen døgn ved 37°C, idet reaksjonen ble fulgt ved hjelp av papirkromatografi. Efter 4 døgn ble overskuddet av nucleofil forbindelse fjernet fra reaksjonsblandingen ved ekstraksjon med kloroform (2 x 1 ml) og den gjenværende vandige oppløsning innstilt på en pH ca. 2,5 enten med fosforsyre eller "Amberlite" IR.120 (H+). Ekst raksjon med ethylacetat (3 x 2 ml) fjernet det gjenværende uforandrede benzylcefalosporin C. Den gjenværende vandige oppløsning inneholdende det nye subst itus jonsprr- J_ukt ble innstilt på pH 7 med nat r iumbicarbonat eller "Deacidite" G^O^") og frysetørret.

Undersøkelse ved hjelp av papirkromatografi og elektroforese viste bare et biologisk aktivt materiale, dvs. benzylcefalosporin-thio-imidazoliniumsalt, skjønt varierende mengder av anorganiske salter var tilstede avhengig av om der ble anvendt ionebytterharpikser for innstillingen av pH. Benzylcefalosporin-thio-imidazoliniumsalt var aktivt mot både S. aureus og V. cholerae.

Eksempel 58

(a) Fremstilling av fenoxymethylcefalosporin

500 mg 7-aminocefalosporansyre (7ACA) = 260, X = 300 nm) oppløst i 25 ml 3% NaHOg (5 molekvivalenter) og l6 ml aceton. Oppløsningen ble kjølt til under 5°C og magnetisk omrørt mens

376 mg fenoxyacetylklorid oppløst i 10 ml aceton ble tilsatt dråpevis i løpet av 30 minutter. Oppløsningen ble tilatt å oppvarmes til romtemperatur i løpet av 1 time. Acetonet ble fjernet i vakuum, og det vandige skikt ble ekstrahert med 2 x 25 ml ether. Efter at pH var innstilt på 4,0 med 3N H2S0^, ble overskudd av fenoxyeddiksyre ekstrahert med 1 x 50 ml benzen. Til slutt ble det vandige skikt innstilt på pH 2,0 og ekstrahert med 3 x 50 ml ethylacetat. Disse ekstrakter ble slått sammen, tørret med Na2S0^

(10minutter) og inndampet under vakuum, hvorved man fikk 724 mg av .en olje. Denne ble opptatt i et minimum av aceton (ca. 3 ml), og 326 mg natrium-2-ethylhexoat (1,1,molekvivalenter) i vandig aceton ble tilsatt. Oppløsningen ble kjølt i 1,5 time og produktet fraskilt ved filtrering, vasket med tørt aceton og tørret.

Utbytte-: 470 mg.

2. Kromatografi Propano l/vann (7*-3) RfO,73.

Ethylacetatpuffer, pH 5, Rf 0,3j.

3- Elektroforese Ved pH 4,0 og 7,0; R_ef C =1,0.

(b) Fremstilling av fenoxymethylcefalosporin-thiouroniumfor-bindelse

200 mg av natriumsaltet av fenoxymethylcefalosporin og 240 mg thiourea ble oppløst i 2 ml H20 og oppbevart mørkt i 3 døgn ved

37°C... Oppløsningen ble kjølt til 0°C, og et bunnfall erholdtes som ble frafiltrert ved 0°C og vasket med litt iskaldt vann. Det faste stoff ble tørret i vakuum-ekssikkator natten over, hvorved man fikk 67,2 mg av det faste stoff - 1. U . V _. Avtrapning ved 258-265 nmrA „ 237 nm-;hmir, 230 nm-——————— rn 3 x • ni _l 11 •

2. Kromatografi Propanal/H20 0,665

Ethylacetatpuffer 0

3. Elektroforese Ingen vandring ved pH 4,0 og 7,0.

Eksempel 59

(a) Fremstilling av n- heptylcefalosporin

500 mg 7A CA ble oppløst i- 25 ml 3% NaHCO^og 16 ml aceton. Oppløsningen ble kjølt til under 5°G, og 0,73 m-l (2,5 molekvivalenter) caprylylklorid i 10 ml tørt aceton ble dråpevis tilsatt i løpet av 30 minutter. Oppløsningen'ble derpå tillatt å oppvarmes til romtemperatur i løpet av 1 time, aceton ble fjernet under vakuum, og den gjenværende oppløsning ble ekstrahert med 2 x 25 ml ether. pH ble innstilt på 3 fø* benzenekstraksjon (1 x 50 ml), og derpå innstilt på 2,0 før ekstraksjon med ethylacetat (3 x 50 ml).Ethylacetatskiktene ble slått sammen-, tørret medNa^SO^og inndampet under vakuum, hvorved der erholdtes 391 mg av et krystallinsk fast stoff. Dette ble oppløst- i litt aceton og 170 mg (1,1 molekvivalenter) natrium-2-ethylhexoat i vandig aceton tilsatt. Opp-løsningen ble holdt under kjøling i 1 time og produktet isolert ved filtrering, vasket med tørt aceton og tørret.

Utbytte: 298 n;g.

1-U. V- Amin. 220,Amax. 263

2. Kromatografi Butanol/ethanol/H20 Rf 0,75

Propanol/H20 Rf 0,84

3. Elektroforese pH 7,0 R_ef. c = 1,0, pH 4,0 R- =1,04

(b) Fremst i 11ing av n- heptylcefalosporin- thiouroniumforbindeise 150 mg av natriumsaltet av n-heptylcefalosporin og 7CKmg thiourea ble inkubert mørkt i 5 ml H20 ved 37°C i 3 døgn. Denne oppløsning hadde størknet fullstendig i løpet av denne tid og ble triturert med H20, og det gelélignende materiale ble frafiltrertrvasket med vann og tørret i en vakuum-ekssikkator, hvorved der erholdtes 124 mg amorft pulver.

1. U. V. Avtrapning 258-265 ™, men prøven var ikke ren.

2. Kromatografi , Propanol/H20 Rf = 0,770 Ethylacetat/puffer Rf = 0,102

3. Elektroforese Ved pH 4,0 og 7,0 ingen vandring.

På lignende måte ble der fremstilt forskjellige andre acyl-derivater av cefalosporin-thiouroniumderivat. De erholdte resultater er gjengitt i tabellform i nedenstående tabeller IV og IVa.

Eksempler 71 - 79

Fremstilling av natriumsaltet av 7-allylthioacetamido-cef alosporansyre

1,9 g 7-aminocefalosporansyre (7 millimol) ble suspendert

i 100 ml ethylacetat og behandlet med 2 g. allylthioacetylklorid (13,3 millimol). Efter oppvarmning under tilbakeløp i 1 1/4 time ble oppløsningen filtrert og en liten- mengde uoppløselig materiale derved fraskilt, hvorpå filtratet ble inndampet til tørrhet i vakuum. Det gjenværende gummiaktige materiale ble oppløst i en blanding av 20 ml aceton og 20 ml ether, filtrert og behandlet med en 10% oppløsning av natriumethylhexanoat i 15 ml n-butanol og derpå med 150 ml ether_ Det resulterende kremfarvede bunnfall ble frafiltrert og tørret (2,34- g). Krystallisasjon fra vandig aceton ga produktet som et hvitt , krystallinsk, fast stoff (1,13 g) , \-max . (f osf atpuf f er ved pH 6) 26o nm (£ = 9.080). En ytterligere krystallisasjon ga et materiale med/\max (som ovenfor) 26o nm (€ = 9.300), [a]D: +117° (c'= o,87; H2oy.

Fremgangsmåten er også med hell blitt anvendt i forbindelse med acylering av 7-aminocefalosporansyre med cyclopentanoylklorid, p-bromfenylthioacetylklor id, n-butanoylklorid, p-nitrof enylacetyl-klorid, n-butancarboxylklorid, n-pentancarboxyklorid, trans-cinnamoylklorid og |3-f enylpropionylklorid .

De resulterende natriumsalter ble derpå hver for seg omsatt med thiourea i henhold til den ovenfor beskrevne generelle metode. De thiouroniumsalter som erholdtes, hadde de fø-lgende karakteristika.

På lignende måte ble azidene av n-pentancarboxamido-cefalosporansyre, benzylthioacetylamido-cefalosporansyre og 7-P~klcxrf enyltnioacet amido-cef alosporansyre fremstilt, hvilke viste de følgende U.V.-data.

Elementæranalyse av noen av de forbindelser som ble fremstilt i henhold til de ovenstående eksempler, er gitt i tabell VII:

Aktiviteten av de i ovenstående eksempler erholdte forskjellige forbindelser mot forskjellige stammer av S. aureus ble bestemt ved fortynningsforsøk og sammenlignet med beslektede cefalosporinforbindelser. Resultatene er gjengitt i nedenstående tabeller VIII, IX og X.

Claims

Fremgangsmåte til fremstilling av nye cefalosporin C-derivater med den generelle formel:

eller salter derav, i hvilken formel R <3> betegner et hydrogenatom eller en carboxylisk acylgruppe, mens A betegner et radikal av en sterkt nucleofil forbindelse som er valgt blant:(a) thiourea-forbindelser med den generelle formel:

4 5 6 "7 hvor R , R , R og R kan være like eller forskjellige og hver er et hydrogenatom, en alkylgruppe med fra 1 til 6 carbonatomer, en cycloalkylgruppe med 5 eller 6 carbonatomer i ringen, en alkenylgruppe med fra 2 til 6 carbonatomer, en 4 6 fenylgruppe eller en benzylgruppe, eller R og R danner sammen en alkylengruppe med fra 2 til 4 carbonatomer,(b) aromatiske og alifatiske thioamider med den generelle formel:

4 5 8 hvor R og-R har de ovenfor angitte betydninger, mens R er en alkylgruppe med fra 1 til 6 carbonatomer, en fenylgruppe eller en benzylgruppe, fe) thiofenoler med den generelle formel

hvorR ^ og R <10> kan være like eller forskjellige og hver er et hydrogenatom, en aminogruppe, en N-alkylaminogruppe med fra 1 til 6 carbonatomer, en N,N'-dialkylaminogruppe i hvilken hver av alkylgruppene har fra 1 til 6 carbonatomer, en nitrogruppe, en nitrosogruppe, en carboxylgruppe, en cyangruppe, en trifluormethylgruppe eller en NaO-S02-gruppe, og natrium-og kaliumsalter herav,(d) primære eller sekundære aminer med den generelle formel:

hvor R <11> er en nafthylgruppe eller gruppen

9 10 12 hvor R og R har de ovenfor angitte betydninger, mens R er et hydrogenatom eller en alkylgruppe med fra 1 til 6 carbonatomer ,(e) thioler med den generelle formel:

1 3 hvor R J er en alkylgruppe.med fra 1 til b carbonatomer eller en sådan alkylgruppe som er substituert med en aminogruppe, en N-alkylij .iiinogruppe med fra 1 til 6 carbonatomer, en N ,N-dialkylaminogruppe i hvilken hver av alkylgruppene har fra 1 til 6 carbonatomer, en nitrogruppe, en nitrosogruppe, en carboxylgruppe, en cyangruppe eller en trifluormethylgruppe, eller en 5- eller 6-leddet heterocyclisk ring i hvilken heteroatomene er N, S eller 0 med den begrensning at minst ett heteroatom er nitrogen, og eventuelt substituert med N-alkyl eller keto-oxygen, eller en slik heterocyclisk ring kondensert med en c.rbocyclisk aromatisk ring, (f) alkalimetallsalter av azider, hydrogenfosxater eller thio-sulfater, eller (g) pyrroleT med den generelle formel:

hvor R <1> ^ er et hydrogenatom eller en alkylgruppe med fra 1 til 6 carbonatomer, karakterisert ved at man under anvendelse av et inert polart reaksjonsmedium, ved en pH-verdi fra 5 til 8 og ved en temperatur på minst 15°C omsetter en-forbindelse med den generelle formel:

eller-et salt -herav, i hvilken generelle formel (IJ ) R ■3 har de ovenfor angitte betydninger, med en sterkt nucleofil forbindelse av en av de under (a) til (g) ovenfor angitte formler og, om ønskes, innfører en carboxylisk acylgruppe i en erholdt forbindelse hvor-R 3 er et hydrogenatom, eller hydrolyserer en erholdt forbindelse hvor R er en carboxylisk acylgruppe, og eventuelt re-acylerer den resulterende forbindelse for innføring av en annen carboxylisk acylgruppe i 7-stillingen, og/eller overfører en erholdt forbindelse til et -salt.