NO116870B

NO116870B -

Info

Publication number: NO116870B
Application number: NO16157266A
Authority: NO
Inventors: I Millman
Original assignee: Merck & Co Inc
Priority date: 1965-02-05
Filing date: 1966-02-04
Publication date: 1969-06-02
Also published as: ES323024A1; DK116019B; BR6676831D0; FR5347M; GB1109742A; FR1592058A; BE676109A; IL25042A; NL6600706A

Description

Fremgangsmåte ved fremstilling av et materiale som inneholder et pertussis antigen. Method for producing a material containing a pertussis antigen.

Foreliggende oppfinnelse angår en ny og forbedret fremgangsmåte ved fremstilling av et materiale som inneholder et pertussis antigen, fra celler av Bordetella. pertussis, hvilket åntigen-holdige materiale kan opparbeides for fremstilling av forbedrede The present invention relates to a new and improved method for producing a material containing a pertussis antigen from cells of Bordetella. pertussis, which antigen-containing material can be processed for the production of improved ones

.énverdige eller flerverdige vaksiner. .monovalent or multivalent vaccines.

Kikhoste er en akutt, meget smittsom, infeksjonssykdom som forårsakes av Bordetella. pertussis og som for barn under 4 år er farlig og åannsynligvis rangerer forst som årsak til spebarn-dodelighet. Immunisering mot denne sykdom har tidligere vuirt gjennoinfort ved injeksjon yv drept cellevaksine eller ekstrahert antigen. Imidlertid har hyppig inntrufne bivirkninger, s;j.soihfeber, irritabilitet, betennelse og nekrose, og sjeldne men nedrslående innberetninger dm hjernébetennelse ansporet tii videre j forskning for å komme frem til bedre vaksiner. Whooping cough is an acute, highly contagious, infectious disease caused by Bordetella. pertussis and which for children under 4 is dangerous and probably ranks first as a cause of infant mortality. Immunization against this disease has previously been carried out by injection of killed cell vaccine or extracted antigen. However, frequently occurring side effects, such as fever, irritability, inflammation and necrosis, and rare but discouraging reports of encephalitis have spurred further research into better vaccines.

Det er kjent å fremstille et materiale innehold ude pertussLs antigen fra pertussisceller ved å sprenge pertussis-cellene og deretter underkaste den erholdte cellemasse diverse ekstraksjonsbe-I handlinger for å rense det antigenholdige materiale. Etter sprenj-! ningen eller oppbrytingen av cellene har man hittil brukt hele ; cellemassen eller de deler av denne som ikke er blitt avsatt ettsr I centrifugering, ved den påfolgende ekstraksjonsbehandling, slik j iat både celleveggmateriale og protoplasma har deltatt i ekstrak-I sjonsprosessen. Det har imidlertid nu vist seg at protoplasmaet i pinrnoetheoin ldei r hbly itke onav senantrtiagsejnonet , mseom n kaat n deft ordårersaimkoe t doindnen ehvoledd er fortoskoksisk It is known to produce a material containing pertussis antigen from pertussis cells by bursting the pertussis cells and then subjecting the resulting cell mass to various extraction procedures in order to purify the antigen-containing material. After exploding! the ning or breaking up of the cells has hitherto been used entirely; the cell mass or those parts of it which have not been separated by centrifugation, during the subsequent extraction treatment, so that both cell wall material and protoplasm have participated in the extraction process. However, it has now been shown that the protoplasm in pinrnoetheoin ldei r hbly itke onav senantrtiagsejnone, mseom n kaat n deft ordårersaimkoe t doindnen ehvoledd is fortoskoksik

på laboratoriedyr, og har ubnskede bivirkninger når det er til-stede i vaksiner som administreres klinisk. Celleveggmaterialet, derimot, har vist seg,å ha et hbyt innhold av antigen, og det har videre vist seg at det antigenholdige celleveggmateriale kan gjdres fritt for toksiske substanser. on laboratory animals, and has unwanted side effects when present in vaccines administered clinically. The cell wall material, on the other hand, has been shown to have a high content of antigen, and it has also been shown that the antigen-containing cell wall material can be fertilized free of toxic substances.

På grunnlag av disse erkjennelser tilveiebringes der nu en fremgangsmåte ved fremstilling av et materiale som inneholder et pertussis antigen, ved hvilken celler av Bordetella pertussis sprenges mekanisk og cellemateriale suspenderes i vann til en suspensjon inneholdende fra 100'til 2000 B/ml, suspensjonen til- On the basis of these findings, a method is now provided for the production of a material containing a pertussis antigen, in which cells of Bordetella pertussis are mechanically disrupted and cell material is suspended in water to a suspension containing from 100 to 2000 B/ml, the suspension to-

] settes fra 1 til 5 voituidéler av en væske valgt blant ketoner med j 2 - 4 carbonatomer, aldehyder med 2-3 carbonatomer og énverdige \ alkoholer med 2-4 carbonatomer, blandingen holdes ved en tém-peratur lavere enn romtemperatur i inntil 24 timer og væsken i hives, hvilken fremgangsmåte utmerker seg ved at man etter den ] is added from 1 to 5 voituidels of a liquid chosen from ketones with j 2 - 4 carbon atoms, aldehydes with 2-3 carbon atoms and monovalent \ alcohols with 2-4 carbon atoms, the mixture is kept at a temperature lower than room temperature for up to 24 hours and the liquid in is raised, which method is distinguished by the fact that one after it

j mekaniske sprengning av cellene skiller celleveggmaterialet fra j protoplasmaet, utforer ekstraksjonsbehandlingen bare med celle-|. veggm8terialet og oppsamler det b.ehandlede celleveggmateriale i inneholdende det beskyttende antigen. j mechanical bursting of the cells separates the cell wall material from the j protoplasm, carrying out the extraction treatment only with cell-|. the wall material and collects the treated cell wall material containing the protective antigen.

Ved hjelp av fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen skaffes dei By means of the method according to the invention, they are obtained

I således et materiale inneholdende et B. pertussis antigen av In thus a material containing a B. pertussis antigen of

i vesentlig forbedret renhet, som er i stand til å gi langvarig I immunitet mot kikhoste, og som ikke frembringer de ubnskede bi-1 virkninger som hefter ved vanlige kjente vaksiner. in significantly improved purity, which is capable of providing long-term immunity against whooping cough, and which does not produce the unwanted bi-1 effects associated with commonly known vaccines.

Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsén består som nevnt i at mm bryter ned den intakte B. pertussis celle ag isolerer celleveggene ..ved....^ j De Isolerte cellevegger vaskes deretter praktisk talt fri for i cellemateriale og behandles med aceton eller en énverdig alkohol av lavere molekylvekt og som enten har en rettkjedet eller for-grenet molekylstruktur og inneholder fra 2-4 cajrbonatomer eller en hvilken som helst av de aldehyder eller ketoner av lavere molekylvekt som er blandbare med vann, såsom methylethylketon, acetsldehyd og lignende. Fra 1 til 5 volumdeler av det valgte keton, aldehyd eller alkohol tilsettes celleveggsuspensjonen, og blandingen holdes ved en temperatur lavere enn romtemperatur, så~ The method according to the invention consists, as mentioned, in breaking down the intact B. pertussis cell and isolating the cell walls. molecular weight and which either has a straight-chain or branched molecular structure and contains from 2-4 carbon atoms or any of the aldehydes or ketones of lower molecular weight which are miscible with water, such as methyl ethyl ketone, acetaldehyde and the like. From 1 to 5 parts by volume of the selected ketone, aldehyde or alcohol is added to the cell wall suspension, and the mixture is kept at a temperature lower than room temperature, so~

j som ved en temperatur mellom -20°C og romtemperatur, i et tids- j as at a temperature between -20°C and room temperature, for a period of

; rom opp til 24 timer. Den tid man lar blandingen stå, er avhengig av temperaturen. Ved hoyere temperaturer er et kortere tidsrom tilstrekkelig til å gjore celleveggmaterialet ufarlig for anvendelse som en vaksine, mens der ved lavere temperaturer kreves noe lengre tid. Eksempelvis oppnåes ved -20°C de beste resultater (hva angår sikkerhet og utbytte) i lopet av 18 - 24 timer, mens det ved en temperatur nær romtemperatur er tilstrekkelig med mindre enn 1 time for å gjore celleveggmaterialet i det alt vesentlige ufarlig for anvendelse, ennskjont dette skjer på bekostning av utbyttet av aktivt beskyttende antigen. ; room up to 24 hours. The time you let the mixture stand depends on the temperature. At higher temperatures, a shorter period of time is sufficient to render the cell wall material harmless for use as a vaccine, while at lower temperatures a somewhat longer time is required. For example, at -20°C the best results (in terms of safety and yield) are achieved within 18 - 24 hours, while at a temperature close to room temperature, less than 1 hour is sufficient to make the cell wall material essentially harmless for use , although this occurs at the expense of the yield of active protective antigen.

i in

i Celler som anvendes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen,j kan"'dyrkes i et hvilket som helst av de kjente, egnede media, séj-som trekull-agar-mediet, væskemediet eller Cohen-Wheeler dyrknirlgs-mediet. Etter vekstperioden oppsamles cellene ved • sentrif ugeringf i og kan benyttes i denne form ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen, eller cellepastaen kan fryses og lagres ved -30°C inntil i det er behov for den. Om onskes, kan de oppsamlede eller innhostjede celler lyofiliseres og deretter lagres inntil det er behov for j dem, eller cellene kan drepes med "Thimerosal" eller ved hjelp av andre metoder som det er kjent ikke bdelegger beskyttende B. pertussis antigen. Cells used in the method according to the invention can be grown in any of the known, suitable media, such as the charcoal-agar medium, the liquid medium or the Cohen-Wheeler culture medium. After the growth period, the cells are collected by • centrifugation and can be used in this form in the method according to the invention, or the cell paste can be frozen and stored at -30°C until needed. If desired, the collected or coughed-up cells can be lyophilized and then stored until needed for j them, or the cells can be killed with "Thimerosal" or by means of other methods which are known not to affect the protective B. pertussis antigen.

Cellene suspenderes påny i kaldt (2 - 5°C) destillert vann ; og underkasjtes eksplosiv trykkavlastning i et cellesprengningsapparat, spesielt i en "Ribi Cell Fract* ionator" ved 2110 kg/cm<2>og en temperatur av 20°C eller mindre.! Ennskjont gode resultater j oppnåes nårj ■ man anvender et trykk på 21■ 10 kg/cm 2 , har det vist seg at tilfredsstillende resultater oppnåes når der anvendes trykk i området omtrent fra 1055 til 3515 kg/cm 2 .Også "andre metoder til å nedbryte cellene og isolere celleveggene kan be nyttes, såsom lydoscillesjoner, mekanisk maling, osv., men er-faringene viser at nevnte cellesprengningsapparat gir de hoyesté utbytter av rent veggmateriale. For bruk er det fordelaktig å i sterilisere cell'esprengningsapparatet ved st hele dens rorsystenj The cells are resuspended in cold (2 - 5°C) distilled water; and subjected to explosive depressurization in a cell bursting apparatus, specifically in a "Ribi Cell Fract* ionator" at 2110 kg/cm<2>and a temperature of 20°C or less.! Although good results are obtained when a pressure of 21■ 10 kg/cm 2 is used, it has been shown that satisfactory results are obtained when pressures in the range from approximately 1055 to 3515 kg/cm 2 are used. Also "other methods of breaking down the cells and isolating the cell walls can be used, such as sound oscillations, mechanical painting, etc., but experience shows that the aforementioned cell blasting apparatus gives the highest yields of clean wall material. For use, it is advantageous to sterilize the cell blasting apparatus by st its entire pipe system

i bringes i kontakt med ethylenoxyd i et tidsrom av 24 timer og deretter spyles med steril nitrogengass. Trykkenheten sterili- j seres i 1 time, fortrinnsvis ved at alle dens deler bringes i kontakt med p-proplolacton (0,5 %) og deretter spyles med sterilt, destillert vann. Et "multifase"-bokterietilbakeholdelsesfilter eller onnet egnet filter forbinder trykkavlastningskammeret med-en nitrogenoeholder. \ in is brought into contact with ethylene oxide for a period of 24 hours and then flushed with sterile nitrogen gas. The pressure unit is sterilized for 1 hour, preferably by bringing all its parts into contact with p-proplolactone (0.5%) and then rinsing with sterile, distilled water. A "multiphase" bacterial retention filter or other suitable filter connects the pressure relief chamber to a nitrogen container. \

Suspensjonen av B. pertussis celler ledes til kompresjons- i kammeret i nevnte "Ribi Cell Fractionator", hvor de utsettes foi et trykk fra 105b til 351-5kg/cm<c>' som tvinger cellene inn i trykkavlastningskammeret, hvor de nedbrytes eksplosivt. Trykkavlastningskammeret holdes ved 20°C eller mindre ved hjelp av f orhåndsk jbli| nitrogengass som ledes gjennom "Multifase"-filteret og inn i : kammeret. Avlopet fra trykkavlastningskammeret, som inneholder celleveggene og protoplasma, oppsamles i en steril beholder som. er neddykket i-et isbad. The suspension of B. pertussis cells is led to the compression chamber in the aforementioned "Ribi Cell Fractionator", where they are exposed to a pressure from 105b to 351-5kg/cm<c>' which forces the cells into the pressure relief chamber, where they break down explosively. The pressure relief chamber is maintained at 20°C or less by means of manual jbli| nitrogen gas which is passed through the "Multiphase" filter and into the : chamber. The effluent from the depressurization chamber, containing the cell walls and protoplasm, is collected in a sterile container which. is immersed in an ice bath.

Avlopet inneholdende det nedbrutte cellemateriale sentrifugeres, den ovenstående va;ske hives, og det tilbakeblivende celleveggmateriale kan vaske med kaldt, destillert vann for å fjerne: meget toksiske, opploseiige protoplasma bestanddeler. Enten vas-; kede eller uvaskede cellevegger suspenderes i en puffer til en konsentrasjon mellom ca. 100 B/ml (100 x lo^/ml) og 200 B/ml, ennskjont der for praktiske formål vanligvis benyttes en konsentrasjon av 500 B/ml. Celleveggkonsentratet blandes deretter langsomt med 1-5 volumdeler aceton eller en alkohol av lavere: molekylvekt eller et aldehyd eller keton av lavere molekylvekt som er blandbart med vann, og settes bort, fortrinnsvis ved -20 <C The effluent containing the decomposed cell material is centrifuged, the supernatant liquid is lifted, and the remaining cell wall material can be washed with cold, distilled water to remove: highly toxic, insoluble protoplasmic constituents. Either vas-; Bored or unwashed cell walls are suspended in a buffer to a concentration between approx. 100 B/ml (100 x lo^/ml) and 200 B/ml, although for practical purposes a concentration of 500 B/ml is usually used. The cell wall concentrate is then slowly mixed with 1-5 parts by volume of acetone or a lower molecular weight alcohol or a lower molecular weight aldehyde or ketone which is miscible with water, and set aside, preferably at -20<C

1 18 - 24 timer. Ennskjont man med godt resultat har benyttet hoyere temperaturer, resulterer de lavere temperaturer i hoyerei utbytter av aktivt,beskyttende antigen. De behandlede vegger I ounnfelles deretter ved sentrifugering og kan vaskes med kaldt destillert vann. Bunnfellingen resuspenderes med kaldt destillert vann til en ekvivalens på 500 B/rnl og homogeniseres. Homogeni-seringen kan utfores ved at man forer blandingen gjennom en lydb-scillator såsom "Raytheon" 10 KC eller ved hjelp av forskjellige 1 18 - 24 hours. Although higher temperatures have been used with good results, the lower temperatures result in higher yields of active, protective antigen. The treated walls are then separated by centrifugation and can be washed with cold distilled water. The sediment is resuspended with cold distilled water to an equivalence of 500 B/rnl and homogenized. The homogenisation can be carried out by passing the mixture through a sonic oscillator such as "Raytheon" 10 KC or by means of various

Dlundere ei ler moller. i Dlundere ei ler moller. in

Suspensjonen av beiir-mulede cellevegger konserveres deretter med en effektiv mengde konserveringsmiddel, såsom "Thimerosal", "Benzethoniumklorid", benzylalkohoi, gamma-picoliniumklorid ellar andre kjente formålstjenelige konserveringsmidler og fortynnes i onsket grad. The suspension of beir-mulled cell walls is then preserved with an effective amount of preservative, such as "Thimerosal", "Benzethonium chloride", benzyl alcohol, gamma-picolinium chloride or other known useful preservatives and diluted to the desired degree.

Celleveggene som inneholder beskyttende antigen og som er gjort ikke-toksiske ved den nye fremgangsmåte ifolge oppfinnelsen, kan anvendes for fremstilling av en vandig vaksine, eller materialet inneholdende antigenet kan forst adsorberes på hjelpemateria-ler såsom aluminiumhydroxyd eller -fosfat eller utfelles med alum og deretter opparbeides som en vaksine. Da det beskyttende antigen er foriikelig med andre antigener og/eller toksoider, kan det anvendes sammen med disse på konvensjonell måte for å skaffe en flerverdig vaksine i enhetsdoseform. The cell walls which contain protective antigen and which have been made non-toxic by the new method according to the invention, can be used for the production of an aqueous vaccine, or the material containing the antigen can first be adsorbed on auxiliary materials such as aluminum hydroxide or -phosphate or precipitated with alum and then processed as a vaccine. As the protective antigen is compatible with other antigens and/or toxoids, it can be used together with these in a conventional manner to obtain a multivalent vaccine in unit dose form.

Den foreliggende oppfinnelse har mange klare fordeler. Produktet som fåes ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen, er fritt for alle protoplasmabestanddeler, av hvilke én, nemlig det varme-labile toksin, er kjent for å vture ytterst toksisk for laboratoriedyr og kan vajre årsaken for enkelte av bivirkningene på 'mennesker. Produktet er fritt for dyrkningsmedium og kjemiske fremmedstoffer. Produktet er forlikelig med andre antigen-mate-rialer som ofte kombineres med pertussis-antigen. Fremgangsmåten er enkel og lett å utfore og gir reproduserbare hoye utbytter av aktivt materiale. The present invention has many clear advantages. The product obtained by the method according to the invention is free of all protoplasmic constituents, one of which, namely the heat-labile toxin, is known to be extremely toxic to laboratory animals and may be the cause of some of the adverse effects on humans. The product is free of culture medium and chemical foreign substances. The product is compatible with other antigen materials that are often combined with pertussis antigen. The procedure is simple and easy to carry out and gives reproducibly high yields of active material.

Nedenfor beskrives fremstillingen av en hjelpevaksine ut fra et antigenholdig celleveggmateriale fremstilt ved fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen. The preparation of an adjuvant vaccine from an antigen-containing cell wall material produced by the method according to the invention is described below.

178 ml sterilt 10 %- ig kaliumalun tilsettes langsomt under rystning til en suspensjon av celleveggmateriale erholdt i hen-; 178 ml of sterile 10% potassium alum is slowly added with shaking to a suspension of cell wall material obtained in hen-;

hold til nedenstående eksempel, og blandingen settes bort ved 2 - 5°C i 18 timer. Den klare væske over den flokkulerte bunn-felning kan dekanteres, og/eller bunnfellingen kan sentrifugeres kald ved 1000 - 2000 omdreininger pr. minutt og den ovenstående! væske hives. Bunnfellingen vaskes to ganger ved sentrifugering j med volumer av kaldt destillert vann lik 2-5 ganger volumet ai bunnfellingen, og den vaskede bunnfelling resuspenderes i steril pufret saltopplosning av pH 7,2, til et volum på 3100 ml ved en' keep to the example below, and put the mixture away at 2 - 5°C for 18 hours. The clear liquid above the flocculated bottom sediment can be decanted, and/or the bottom sediment can be centrifuged cold at 1000 - 2000 revolutions per minute. minute and the one above! liquid rises. The sediment is washed twice by centrifugation j with volumes of cold distilled water equal to 2-5 times the volume ai of the sediment, and the washed sediment is resuspended in sterile buffered saline solution of pH 7.2, to a volume of 3100 ml at a'

!. ekvivalens -, 258 B/ml. Vaksinekonsentrasjonen kan justeres til ;32 B/ml eller mindre ved tilsetning av steril saltopplbsning av ipH 7,2, eller 0,3 M glycinpuf fer. "Thimerosal" tilsettes som et konserveringsmiddel i en tilstrekkelig mengde til at der fåes en ;konsentrasjon på l:10ooo etter fortynning. Denne vaksine forblir 1 stabil når den lagres ved 2 - 5°C. !. equivalence -, 258 B/ml. The vaccine concentration can be adjusted to ;32 B/ml or less by adding sterile saline solution of ipH 7.2, or 0.3 M glycine buffer. "Thimerosal" is added as a preservative in a sufficient amount to obtain a concentration of 1:1000 after dilution. This vaccine remains 1 stable when stored at 2 - 5°C.

j j

Det alunflokkulerte celleveggpreparat inneholder fortynnet :: til en ekvivalens på 32 B/ml, 15,7 beskyttelsesenhe"ter pr. total-kose for mennesker (1,5 ml) sammenlignet med N.I.H. nr. 6 stand-arden som inneholder 12 beskyttelsesenheter pr. totaldose for mennesker, og kan anvendes for fremstilling av hjelpevaksiner jeller flerverdige vaksiner. The alum flocculated cell wall preparation contains, diluted :: to an equivalence of 32 B/ml, 15.7 protective units per total human clove (1.5 ml) compared to the N.I.H. No. 6 standard which contains 12 protective units per total dose for humans, and can be used for the production of auxiliary vaccines or multivalent vaccines.

Styrken av celleveggpreparatet og N.I.H.-standarden bestemmes |ved at man administrerer en rekke fortynninger av ekstrakten og jblindproven på flere grupper mus og deretter besmitte dyrene intra-Ikranielt med 0,03 ml av en fortynning av kjent, ondartet B. per-I :tus3is inneholdende 10 5 organismer pr. ml. Resultatene av flere jslike forsok og middelverdien av disse er gjengitt nedenfor: The strength of the cell wall preparation and the N.I.H. standard is determined |by administering a series of dilutions of the extract and jblank to several groups of mice and then infecting the animals intra-Icranially with 0.03 ml of a dilution of known malignant B. per-I :tus3is containing 10 5 organisms per ml. The results of several similar trials and the average value of these are reproduced below:

i Hjelpevaksinen ble funnet å være ikke-toksisk ifblge N.I.H.-istandardene, som krever at der ved intraperitoneal injeksjon av:det halve av en enkeltdose for mennesker på mus ikke finner sted i The auxiliary vaccine was found to be non-toxic according to the N.I.H. standards, which require that by intraperitoneal injection of: half of a single dose for humans in mice no

: |noe vekttap i 3 dager, at der finner sted en netto vectokning på i 3 g i lopet av 7 dager, og at der ikke inntrer mer enh 5 % dbde-■ lighet for de dyr som studeres. Ved intrateritoneal injeksjon av ' ,0,25 ml av ekstrakten av det beskyttende antigen på 10 mus ble I ',det obserbert en midlere vektbkning på 2,4 g etter 3 dager, og en midlere vektbkning på 4,7 g etter 7 dager, ute n at noen dbda- : some weight loss for 3 days, that there is a net weight gain of 3 g over the course of 7 days, and that no more than 5% mortality occurs for the animals being studied. By intraperitoneal injection of 0.25 ml of the extract of the protective antigen into 10 mice, a mean weight loss of 2.4 g was observed after 3 days, and a mean weight loss of 4.7 g after 7 days. out n that some dbda-

I fall var inntruffet etter endt forsøksperiode. If the case occurred after the end of the trial period.

i Vaksinen besto også sikkerhetsproven på dyr ved at der ikke i inntraff noe dodsfall og der ikke viste seg noen symptomer da det j halve av en enkeltdose for mennesker ble injisert i hver av to 20 g<*>s mus og det tredobbelte av en enkeltdose for mennesker ble injisert i hver av de' 350 g's marsvin. In the vaccine, the safety test on animals also consisted of the fact that no deaths occurred and no symptoms appeared when j half of a single dose for humans was injected into each of two 20 g<*>s mice and three times the amount of a single dose for humans was injected into each of the 350 g guinea pigs.

i Konvensjonelle sterilitetsprover viste at ekstrakten var f i i!for mugg og bakterier. i Conventional sterility tests showed that the extract was f i i!for mold and bacteria.

i in

j Elektroforetisk analyse og Ouchterlony-analyse viste at vaksinen var fri for størstedelen av de antigener som i tillegg til det beskyttende antigen finnes i de opprinnelige hele cellei . j Electrophoretic analysis and Ouchterlony analysis showed that the vaccine was free of the majority of the antigens which, in addition to the protective antigen, are found in the original whole cells.

j Den endelige vaksine inneholder en tredjedel eller mindre av del j totale nitrogeninnhold som finnes i konvensjonelle vaksiner. j The final vaccine contains one-third or less of the part j total nitrogen content found in conventional vaccines.

! Fremgangsmåten ifolge oppfinnelsen illustreres i det neden- ! The method according to the invention is illustrated in the following

( stående eksempel. (standing example.

Eksempel Example

Cellene fra en 48 timers dyrkning av B. pertussis i et Coh^n-Wheeler medium oppsamles ved justering av mediets pH til 7,0 mec konsentrert saltsyre og sentrifugering i en "Sharples" sentrifuge. Den erholdte cellepasta resuspenderes i destillert vann, ledesj The cells from a 48-hour cultivation of B. pertussis in a Cohn-Wheeler medium are collected by adjusting the medium's pH to 7.0 mec concentrated hydrochloric acid and centrifugation in a "Sharples" centrifuge. The resulting cell paste is resuspended in distilled water, as directed

j gjennom en 200-mesh nylonsikt for å fjerne store partikler, og filtratet innstilles til en konsentrasjon av 500 B/ml. Cellekoni ; ! sentrasjonen bor fortrinnsvis være i området 100 - 1000 B/ml.I\j through a 200-mesh nylon screen to remove large particles, and the filtrate is adjusted to a concentration of 500 B/ml. Cell cone; ! the concentration should preferably be in the range 100 - 1000 B/ml.I\

i 1600 ml av cellekonsentratet ledes til en på forhånd steri^i- in 1600 ml of the cell concentrate is directed to a previously sterile

\ sert "Ribi Cell Fractionator" og utsettes for et trykk på 2110'■ 1 ; I kg/cm 2 . Cellene u^.der trykk o ekstruderes inn i trykkavlastnings-j' ! j kammeret, som holdes ved 20 C eller ved lavere temperatur ved \ sert "Ribi Cell Fractionator" and subjected to a pressure of 2110'■ 1 ; In kg/cm 2 . The cells u^.where pressure o is extruded into pressure relief-j' ! j the chamber, which is kept at 20 C or at a lower temperature at

I hjelp av avkjolt nitrogengass,.hvor cellene nedbrytes eksplosiv ;. With the help of cooled nitrogen gas, where the cells are broken down explosively.

i Cellematerialet renner fra trykkavlastningskammeret til en ster|.l beholder neddykket i et isbad. Det fåes 1600 ml avlbp. i The cell material flows from the depressurization chamber into a sterile container immersed in an ice bath. 1,600 ml of avlbp is obtained.

I Avlopet sentrifugeres i et "Spinco" 18 000 bolleformet rotor-hode for satsvis drift ved 16 000 omdreininger pr. minutt i 3 timer. Også andre sentrifugeringsapparater kan anvendes, såsom I f.eks. "Sh8rplés" sentrifugen. Den ovenstående væske dekanteres In Avlopet, 18,000 bowl-shaped rotor heads are centrifuged in a "Spinco" for batch operation at 16,000 revolutions per hour. minute for 3 hours. Other centrifugation devices can also be used, such as in e.g. "Sh8rplés" the centrifuge. The supernatant liquid is decanted

j fra rotorhodet, og hodet kan påfylles og kjores en eller flere j ganger, om Snakes, uten at man fjerner residuet. Den ovenstående I væske som fjernés og hives, inneholder den meget toksiske proto- j from the rotor head, and the head can be filled and run one or more j times, about Snakes, without removing the residue. The above I liquid, which is removed and sieved, contains the highly toxic proto-

:plasmafraksjon av cellekonsentratet. :plasma fraction of the cell concentrate.

Residuet som blir tilbake i rotorhodet, fjernes fortrinnsvis ved tilsetning av stålkuler til rotorhodet og forsiktig rystning I av hodet ved at det anbringes på en mekanisme som gir en rullende* bevegelse. Imidlertid kan også andre kjente metoder anvendes for i å ta residuet ut av rotorhodet. ' The residue remaining in the rotor head is preferably removed by adding steel balls to the rotor head and gently shaking the head by placing it on a mechanism which produces a rolling* motion. However, other known methods can also be used to remove the residue from the rotor head. '

Residuet vaskes ut av rotorhodet med omtrent 1600 ml kaldt destillert vann (2 - 5°C) . 3 Voluiudeler aceton (som holdes kaldt ; The residue is washed out of the rotor head with approximately 1600 ml of cold distilled water (2 - 5°C). 3 Voluiuderen acetone (which is kept cold ;

ved hjelp av et bad av tbrris og aceton) tilsettes under stadig omrbring, og blandingen settes bort ved -20°C i 18 timer. Kon-sentrasjonen av cellevegger og aceton kan gjerne justeres til en: pertussis-konsentrasjon svarende til 100 - 2000 B/ml, og der kan'using a bath of ice and acetone) is added with constant stirring, and the mixture is stored at -20°C for 18 hours. The concentration of cell walls and acetone can easily be adjusted to a: pertussis concentration corresponding to 100 - 2000 B/ml, and there can

anvendes aceton eller en énverdig alkohol med 2-4 carbonatomer eller et hvilket som helst lavmolekylært aldehyd eller keton som tidligere nevnt. Materialet sentrifugeres deretter ved 2000 omdreininger pr. minutt i 30 minutter, og den ovenstående væske hives. Det bunnfelte materiale vaskes to ganger med kaldt destil-r lert vann (et volum svarende til den ovenstående væske som hives) ved sentrifugering og resuspenderes i kaldt sterilt destillert vann til en ekvivalens på 500 B/ml. Den vaskede bunnfeining homogeniseres deretter ved at den ledes gjennom en "Raytheon" lydo-scillator (10 KC) i 5 minutter. Den vaskede bunnfelling resuspenderes i steril pufret saltopplbsning av pli 7,2 til et volum av 1600 ml. Den kan lagres i det uendelige som sådan ved 2 - 5°C. acetone or a monohydric alcohol with 2-4 carbon atoms or any low molecular weight aldehyde or ketone as previously mentioned is used. The material is then centrifuged at 2000 rpm. minute for 30 minutes, and the supernatant liquid is removed. The sedimented material is washed twice with cold distilled water (a volume corresponding to the supernatant which is lifted) by centrifugation and resuspended in cold sterile distilled water to an equivalence of 500 B/ml. The washed bottom sweep is then homogenized by passing it through a "Raytheon" lydo-oscillator (10 KC) for 5 minutes. The washed sediment is resuspended in sterile buffered saline solution of pli 7.2 to a volume of 1600 ml. It can be stored indefinitely as such at 2 - 5°C.

Dette preparat kan fortynnes i henhold til de standarder som forf utskrives av N.I.H. og anvendes for fremstilling av vandige hjelpevaksiner eller flerverdige vaksiner. This preparation can be diluted according to the standards prescribed by the N.I.H. and used for the production of aqueous adjuvant vaccines or multivalent vaccines.

Claims

Process for the production of a material containing a pertussis antigen, in which cells of Bordetella pertussis. is broken mechanically and cell material is suspended in water to a suspension containing from 100 to 2000 B/ml, the suspension is added from 1 to 5 parts by volume of a liquid selected from ketones! with 2-4 carbon atoms, aldehydes with 2-3 carbon atoms and monovalent alcohols with 2-4 carbon atoms, the mixture is kept at a temperature lower than room temperature for up to 24 hours, and the liquid is stirred, characterized by J mechanical rupture of the cells separates the cell wall material from the protoplasm, carries out the extraction treatment only with the cell wall material and collects the treated cell wall material in

j holding the protective antigen.