NL8602165A

NL8602165A - Antibiotica met antitumorwerking en de bereiding en isolering daarvan.

Info

Publication number: NL8602165A
Application number: NL8602165A
Authority: NL
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1985-08-27
Filing date: 1986-08-26
Publication date: 1987-03-16
Also published as: SE9200428L; CY1676A; SG109692G; JPS62116589A; SE8603597L; SE9200428D0; ATA231786A; IL79519A0; IT8621527A0; DK406086A; DK406086D0; FR2586686A1; GB2179649B; KR870002269A; GB8620118D0; BE905332A; LU86562A1; CH668598A5; DK170671B1; KR920010226B1

Description

'tv. 3 VO 8327

Antibiotica met antitumorwerkiag en de bereiding en isolering daarvan.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe antitumor-antibiotische stoffen en de produktie en isolering daarvan.

De antitumorverbindingen van de onderhavige uitvinding zijn nog niet qua struktuur geïdentificeerd. In verband met de aparte fysische, 5 chemische en biologische eigenschappen neemt aanvraagster echter aan dat de BBM-1675C en BBM-1675D antibiotica nieuwe stoffen zijn.

In de Britse octrooiaanvrage 2.141.425 wordt de fermentatie van Actinomadura verrucosospora stam H 964-92 (ATCC 39334} of Actinomadura verrucosospora stam A 1327Y (ATTC 39638) beschreven waarmee een nieuw 10 antitumor-antibiotisch komplex, aangeduid als BBM-1675, wordt bereid.

Er werden daarbij twee hoofdbioaktieve komponenten van het BBM-1675-konplex beschreven en aangeduid als BBM-1675A^ en De strukturen van de BBM-1675a^ en BEM-1675A2 antibiotica, tevens bekend als respektievelijk esperamicine A^ en esperamicine A2/ zijn 15 nog niet opgehelderd, maar beide komponenten vertonen een uitstekende antimicrobiële en antitumoraktiviteit.

In het Amerikaanse octrooischrift 4.530.835 wordt de fermentatie van een niet geïdentificeerd Actinomyceet isolaat WP-444 (ATCC 39363) beschreven voor de produktie van antitumor-antibiotica, aangeduid 20 als CL-1577A en CL-1S77B. De strukturen van de CL-1577 antibiotica zijn nog niet opgehelderd maar de karakteristieke eigenschappen die voor de antibiotica worden gegeven wijzen erop dat CL-1577A en CL-1577b een gelijksoortige struktuur hebben als de 3124-1675 antibiotica en in het bijzonder 3124-1675A^ en -A2 als boven vermeld in de 25 Britse octrooiaanvrage nr. 2.141.425.

Door R.H. Bunge et al, in J. Antibiotics, 37 (12), 1566-1571 (1984) wordt de fermentatie van Actinomadura sp. (ATCC 39363) beschreven voor de produktie van een bioaktief komplex, waaruit twee hoofdkomponenten PD 114,759 en PD 115,028 werden geïsoleerd. In J.

30 Chem. Soc. Chem. Commun. 919-920 (1985) wordt door J.H. Wilton et al de deelstruktuur van de antibiotica PD 114,759 en PD 115,028 toegelicht. De produktie, isolering en kenmerken van de PD 114,759 en PD 115,028 antibiotica blijken identiek te zijn aan de bovenvermelde respektievelijke CL-1577A en CL-1577B antibiotica.

35 In de Europese octrooiaanvrage nr. 95.154 wordt de fermentatie •i o " 2 13 3 ", 1 » - 2 - van Actinomadura pulveraceus sp. nov. nr. 6049 (ATCC 39100) beschreven voor de produktie van antitumor-antibiotica, aangeduid als WS 6049-A en WS 6049-B. De strukturen van de WS 6049 antibiotica zijn nog niet opgehelderd maar de karakteristieke eigenschappen die voor de anti-’5 biotica worden gegeven wijzen erop dat WS 6049-A en WS 6049-B een struktuur hebben die verwant is met de BBM-1675 antibiotica van de Britse octrooiaanvrage 2.141.425 en de CL-1577 antibiotica van het Amerikaanse octrooischrift nr. 4.530.835.

Door spektrale gegevens wordt echter aangetoond dat noch WS 6049-A 10 noch WS 6049-B identiek is aan één van de BH1-1675 komponenten. Bovendien kan het producerende organisme als beschreven in de Europese octrooiaanvrage nr. 95.154 duidelijk worden onderscheiden van Actinomadura verrucosospora als vermeld in de Britse octrooiaanvrage 2.141.425 wat de kleur van zijn luchtmycelium op ISP medium nrs. 2, 15 3 en 4, zijn positieve melkpeptonisering en zijn positieve verbruik van D-fructose, D-mannitol, trehalose en cellulose betreft. ·

Door de onderhavige uitvinding wordt voorzien in nieuwe, antitu-mor-antibioticastoffen, die hierin worden aangeduid als BBM-1675C en BBM-1675D, tevens bekend als respektievelijk EMY-27305 en BMY-27307, 20 welke stoffen worden geproduceerd door een selektieve chemische hydrolyse van de bioaktieve komponenten BH4-1675a^ (esperamicine ) of BBM-1675A2 (esperamicine A^) die zelf weer worden geproduceerd door het kweken van een BBM-1675 producerende stam van Actinomadura verrucosospora. De bioaktieve stoffen BBM-1675C en BBM-1675D kunnen 25 volgens gebruikelijke chromatografische procedures worden gescheiden en gezuiverd en beide stoffen vertonen uitstekende antimicrobiële en antitumoraktiviteit.

Beschrijving van de tekeningen.

30 De figuren tonen de volgende spectra:

Figuur 1 het ultraviolette absorptiespektrum van BBM-1675C; figuur 2 het ultraviolette absorptiespektrum van BH1-1675D; figuur 3 het infraroodabsorptiespektrum van BBM-1675C (KBr, film) ; figuur 4 het infraroodabsorptiespektrum van BBM-1675D (KBr, film); 35 figuur 5 het relatieve abondantie massaspektrum van BBM-1675C;

figuur 6 het relatieve abondantie massaspektrum van BBM-1675D; figuur 7 het magnetische proton-resonantiespektrum van BBM-1675C

dj £ A ft Ί ^ i » - 3 - ia CDC13 (360MHz);

figuur 3 het magnetische protonresonantiespektrum van BBM-1675D

in CDCl + 10% CD,QD (360 MHz); s 13 figuur 9 het C-magnetische resonantiespektrum van BM-1675C en 5 CDCl., (90,6 MHz); J 13 figuur 1QA het C-magnetische resonantiespektrum (110-200 dpm) van BBM-1675D in CDCl + 10% CD OD (90,6 MHz); 13 ά 6 figuur 10B het C-magnetische resonantiespektrum (0-110 dpm) van BBM-167SD in CDC13 + 10% CD'3OD (90,6 MHz) ; 10 figuur 11A het magnetische proton-resonantiespektrum van verbin ding 3A (c<-anomeer) in CDC13 (360 MHz); figuur llB het magnetische protonresonantiespektrum van verbinding 3B ( fi-anomeer) in CDCl3 (360 MHz) .

Deze uitvinding heeft betrekking op twee nieuwe antitumor-antibio-15 tische stoffen, die hierin worden aangeduid als BEM-1675C en BBM-1675D tevens bekend als EMY-27305 en BMY-27307, welke stoffen worden geproduceerd door een selektieve chemische hydrolyse van de bioaktieve komponenten BBM-1675A^ (esperamicine A^) of B1M-1675A2 (esperamicine A^), die zelf worden geproduceerd door het kweken van een BBM-1675-20 producerende stam van Actinomadura verrucosospora, met de meeste voorkeur Actinomadura verrucosospora, stam H 964-92 (ATCC 39334) of Actinomadura verrucosospora stam A 1327Y (ATCC 39638) of een mutant daarvan.

In een ander aspekt voorziet de onderhavige uitvinding in een 25 werkwijze voor het produceren van de BBM-1675C stof door selektieve hydrolyse van de bioaktieve komponenten BBM-1675A^ of BEM-1675A2.

In een verder aspekt voorziet de onderhavige uitvinding in een· werkwijze voor de bereiding van BBM-1675D door selektieve hydrolyse van de BBM-1675C stof of met de meeste voorkeur uit de bioaktieve kom-30 ponenten BEM-1675A^ of BBM-1675A2.

De isolering en zuivering van BBM-1675C en BEM-1675D uit het re-aktiemengsel kan men door gebruikelijke chromatografische procedures tot stand brengen.

De bioaktieve stoffen BEM-1675C en BEM-1675D vertonen een antimi-35 crobiële aktiviteit tegen een breed spektrum van micro-organismen en hebben tevens een remmende aktiviteit ten opzichte van verschillende muizentumorsystemen, zoals P-388 leukemie en Bl6 melanoma.

£602165 * * - 4 -

De zojuist beschreven stoffen van de onderhavige uitvinding kunnen derhalve als antimicrobiële middelen of als antitumormiddelen voor het remmen van tumors bij zoogdieren worden toegepast.

Gedurende het verloop van ontledingsstudies voor het ophelderen 5 van de struktuur van het antitumor-antibioticum BBM-167SA (esperami-cine A^) en BBM-löTSA^ (esperamicine werd een mengsel van kompo-nenten geproduceerd, hetgeen leidde tot de isolering en identifika-tie van twee inaktieve fragmenten, verbindingen met respektievelijk formules-1 en 2 van het formuleblad. Het was echter verrassend dat 10 de chemische ontleding tot de trapsgewijze vrijmaking van twee bio-aktieve fragmenten EBM-1675C en BBM-1675D leidde. Het was nog meer verrassend dat gevonden werd dat de twee verschillende antibiotica BBü-1675A^ en -A^ dezelfde bioaktieve fragmenten produceerden als geïllustreerd in reaktieschema A van het formuleblad.

15 Het was echter nog verrassender dat de kleinere molecuulgewichts- fragmenten BBM-1675C en BBM-1675D (met bij benadering 70% en 55% van het molecuulgewicht van respektievelijk de hoofd-antibiotica BBM-1675A^ en -A^) als antitumor- en antimicrobiële middelen meer effek-tief bleken te zijn dan BBM-1675A2 en vergelijkbaar met BBM-1675A^.

20 De BBM-1675C en BEM-1675D stoffen kunnen door.selektieve chemische hydrolyse van het antibioticum BBM-1675A1 worden bereikt als aangegeven in reaktieschema B van het formuleblad.

De uitgangs-BEM-1675-verbinding wordt bereid volgens de procedure beschreven in de Britse octrooiaanvrage 2.142.425. De gezuiver-25 de BBM-1675A^ komponent wordt gehydrolyseerd met een anorganisch of organisch zuur, zoals waterstofchloride, zwavelzuur, p-tolueensul-fonzuur, benzeensulfonzuur en dergelijke, in een organisch of gemengd waterig-organisch inert oplosmiddel bij een temperatuur van ongeveer 0°C tot de terugvloeikoelingstemperatuur van het oplosmiddel, tot 30 een aanzienlijke hoeveelheid van het gewenste BBM-1675C of BBM-1675D is geproduceerd. De hydrolyse wordt bij voorkeur uitgevoerd in C^-Cc alcohol-oplosmiddelen en met de meeste voorkeur wordt de. alcoho-

O

lyse uitgevoerd in methanol. De temperatuur van de reaktie is niet kritisch maar het heeft de voorkeur de reaktie bij ongeveer omge-3S vingstemperatuur tot 60°C en met de meeste voorkeur van ongeveer 40 tot S0°C uit te voeren.

De selektieve hydrolyse van BBM-1675a^ verloopt op een trapsgewij- ISS 21 δ 5 < i - 5 - ze wijze mét de aanvankelijke produktie van 3BM-1675C antibioticum en het inaktieve fragment van formule 1.

Latere of voortgezette behandeling onder hydrolysatie-omstandighe-den leidt tot de vrijmaking van een mengsel van ^ en j -anomeren van 5 de thiosuiker van formule 3 van het formuleblad en de produktie van het antibioticum BBM-1675D.

Het zal duidelijk zijn dat door wijziging van de reaktieomstandig-heden, zoals tijd, temperatuur en concentratie van het zuur, variërende relatieve hoeveelheden van de antibiotica BBM-1675C en BBM-10 1675D worden geproduceerd. Het is aldus gewenst het verloop van de reaktie door dunnelaagchromatografie, als in de voorbeelden hierin beschreven, te bewaken. Wanneer het wenselijk is alleen het BEM-1675D antibioticum te bereiden kan de selektieve hydrolyse worden uitgevoerd met aan organisch zuur, zoals p-tolueensulfonzuur, als hierin be-15 schreven, waarbij een kwantitatieve hoeveelheid van BBM-1675D wordt opgeleverd. De BBM-1675C en BBM-1675D stoffen kunnen tevens worden bereid door selektieve chemische hydrolyse van het antibioticum BBM-1675A2 als aangegeven in reaktieschaaa C van het formuleblad.

De uitgangs-BBM-1675A2-verbinding wordt bereid volgens de proce-20 dure, beschreven in de Britse octrooiaanvrage 2.141,425. De selektieve hydrolyse van gezuiverd BBM-1675A2 verloopt eveneens trapsgewijze met de aanvankelijke produktie van het BBM-1675C antibioticum en het inaktieve fragment van formule 2. Voortgezette behandeling onder hy-drolysatieomstandigheden leidt tot de vrijmaking van een mengsel van 25 λ-en - -anomeren van de thiosuiker van formule 3 en de produktie van het antibioticum SBM-1675D.

De voor de selektieve chemische hydrolyse van BBM-1675A2 toegepaste reaktieomstandigheden zijn nagenoeg dezelfde als die gebruikt voor de hydrolyse van BBM-1675A^, als boven beschreven. Op een wijze ge-30 lijk aan de produktie van BBM-1675D en BBM-1675A^ wordt de hydrolyse van het BBM-1675A2, wanneer het de voorkeur heeft alleen het BEM-1675D antibioticum te produceren, uitgevoerd tot nagenoeg al het BBM-1675A2 en BBM-1675C in BBM-1675D is omgezet. Met de meeste voorkeur wordt de hydrolyse uitgevoerd met een organisch zuur, zoals p-tolueen-35 sulf onzuur.

De ontdekking als hierin beschreven dat dezelfde BBM-1675C en BBM-1675D antibiotica uit twee verschillende antibiotica BBM-1675A^ en B 3 Λ o λ s 5 * *· -6.- BBM-1675A2 worden geproduceerd onder gelijktijdig verlies van twee inaktieve fragmenten volgens respektievelijk formules 1 en 2 en de thiosuiker van formule 3 levert een extra voordeel voor de onderhavige uitvinding.

5 Aldus wordt in een verder aspekt van de onderhavige uitvinding voorzien in een werkwijze voor de selektieve hydrolyse van een mengsel van BBM-1675A^ en BBM-1675A2 voor de produktie van het BBM-1675C en BBM-1675D, als geïllustreerd in reaktieschema D van het formuleblad. Dit voordeel wordt duidelijk wanneer men in aanmerking neemt 10 dat de relatieve hoeveelheden van BBM-1675A^ en BBM-1675A2, die in het fermentatieproces zijn geproduceerd, onderworpen zijn aan variatie. De produktie van BBM-1675C en BBM-1675D is derhalve onafhankelijk van de relatieve hoeveelheden BBM-1675A^ en BBM-1675A2, die als uitgangsmateriaal in de onderhavige uitvinding worden toegepast.

15 Als hierin beschreven resulteert de hydrolyse van de BBM-1675A^, BBM-1675A2 en BBM-1675C antibiotica in het vrijmaken van een inaktief thiosuikerfragment. Genoemde thiosuiker werd geïsoleerd om verdere informatie betreffende de chemische struktuur van het BBM-1675C antibioticum en aldus voor de BBM-1675A^ en BBM-1675A2 antibiotica te leve-20 ren. De verbinding met formule 3 werd geïdentificeerd als een mengsel van eC-en p- anomeren van een thiosuiker met de strife tuur als geïllustreerd in reaktieschema's B en C. Een verdere karakterisering werd mogelijk bij scheiding van de produkten van de alcoholyse, de ¢( - en β -anomeren. Het magnetische protonresonantiespektrum (360 MHz) van 25 verbinding 39 (^ -anomeer) en verbinding 36 -anomeer) wordt respektievelijk in figuren 1 IA en 11B weergegeven. Uit een analyse van de spektrale gegevens werd aan de thiosuiker methylglycosiden van formule 3 bij benadering de relatieve stereochemie van de formule 3' van het formuleblad toegekend.

30 Momenteel is de absolute stereochemie, dat wil zeggen D of L, nog niet vastgesteld. Aldus wordt gebaseerd op de onderhavige interpretatie van de spektrale gegevens geconcludeerd dat de thiosuiker van formule 3 (minus de CH^-groep uit het anomere methoxy, dat gedurende de methanolyse wordt opgenomen) een komponent is in de struktuur van 35 de antibioticum BBM-1675C en verder een komponent is in de struktuur van de uitgangs-BBM-1675A^ en -BBM-1675A2~antibiotica.

8602185

- A

- 7 -

Fysisch-chemische eigenschappen van BBM-1675C.

Omschrijving: amorfe vaste stof.

Ultraviolet absorptiespektrum: zie figuur 1.

Instrument: Hewlett-Packard 8458.

5 Oplosmiddel: methanol.

Concentratie: 0,0155 g/1.

X (nm) absoroties —max-— ———=- 10 210 21.770 274 .9.340 212 sh (schouder) 4.190

Er werd met zuur of base geen signifikante wijziging waargenomen.

15

Infraroodspektrum: zie figuur 3.

Instrument: Nicolet 5EK FT-IR.

Hoofdabsorptiebanden (KBr, film): 540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118, 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 1440, 1690, 1705, 20 1735, 2900, 2920, 2930, 2970, 3450 cm-1.

Massaspektrum: zie figuur 5.

Instrument: Finigan 4500 TSQ.

Methode: Ionisatie door bombardement met snelle atomen (FAD).

25 Matrix , ... , . „ , , .

- m/z Moleculair Relatief ion voorkomen

Glycerol 856. (M+H)+ 100%

Glycerol + NaCl 878 (M+Na)+ 100% 30 Dithiothreitöl:dithioery- thritol (3:1) (w:w) 856 (M+B) + 100%

Instrument: Kratos MS-50

Hoge resolutie FAB (m/z): (M+H)+ = 856,3362 35

Molecuulgewicht: schijnbaar MW * 855 (gebaseerd op boven beschreven massa spektrale gegevens).

86C2 125 * \ - 8 -

Elementsamenstelling: C^Hg^N^O^S^ (gebaseerd op de boven beschreven hoge resolutiegegevens).

Magnetische protonresonantiespektrum: zie figuur 7.

5 Instrument; WM 360 Bruker.

Oplosmiddel: CDCl^· *Η NMR 360 MHz $ (dpm) : 6,54 (1H, dd, J=7,7, 7,0); 6,21 (1H, brs); 5,87 (1H, d, J=9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6, 1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J=10,3, 1,8); 4,61 (1H, d, J=7,7); 4,25 (1H, s); 4,09 10 (1H, q, J=2,6); 3,97 (lH, t, J=9,6); 3,92-3,53 (10H), 3,45 (1H, dt, J=10,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (lH, m); 2,69 (1H, dt, J=9,9, 5,2); 2,49 (1H, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m); 2,13 (lH, m); 2,09 (3H, s); 1,50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J=5,9), 1,32 (3H, d, J=6,3); 1,08 (6H).

15 13 C magnetische resonantiespektrum: zie figuur 9.

Instrument: WM 360 Bruker.

Oplosmiddel: CDCl^.

13C NMR 90,6 MHz £ (dpm); 13,7, 17,5, 19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 20 35,2, 39,5, 47,7, 52,7, 55,8, 56,1, 57,7, 62,4, 64,7, 67,4, 69,3, 69,8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7, 79,7, 83,2, 88,4, 97,3, 99,7, 123,4, 124,6, 130,1, 193,1.

Fysisch-chëmische eigenschappen van BBM-1675D.

25 Omschrijving: amorfe vaste stof.

Ultraviolet absorptiespektrum: zie figuur 2.

Instrument: Hewlett-Packard 8458.

Oplosmiddel: methanol.

30 Concentratie: 0,01 g/1.

Λ (nm) absorpties -‘-max- --- 214 27.000 35 274 12.800 325 5.400 ,-r· Λ jï ! ??

W ** >*·« J 'J

ί .* - 9 -

Er werd met zuur of base geen signifikante verandering waargenomen.

Infraroodabsorptiespektrum: zie figuur 4.

Instrument: Nicolet 5 EK FT-IR.

5 Hoofdabsorptiebêinden (KBr, film): 735 , 855 , 910 , 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195, 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 1720, 1735, 2880, 2930, 2960, 3400 cm"1.

Massaspektrum: zie figuur 6.

10 Instrument: Finigan 4500 TSQ.

Methode: ionisatie door bombardement met snelle atomen (FAB). .

Matrix: thioglycerol.

Moleculair ion (m/z): (M+H)+ = 696.

Relatief voorkomen: 100%.

15

Instrument: Kratos MS-50.

Hoge resolutie FAB (m/z): (M+H)+ = 696,2794.

Molecuulgewicht: schijnbare MW = 695 (gebaseerd op bóven beschre-20 ven massaspektrale gegevens).

Elementsamenstelling: C29ÏÏ49N3°12S2 ^taseerd °P to ven beschreven hoge resolutiegegevens),

Hh 4* 25 Correlatie van (M+H) en ((M+H)+2) relatieve voorkomens ten opzich te van de berekende waarde bevestigt de elementsamenstelling afgeleid uit hoge resolutie-FAB-metingen.

Magnetische protonresonantiespektrum: zie figuur 8.

30 Instrument: WM 360 Bruker.

Oplosmiddel: CDCl^ + 10% CD^OD.

1H IMH 360 MHz $ (dpm): 6,43 (lH, dd, J=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s) ; . 5,81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (lH, d, J=8,8); 5,48 (lH, 6 brs); 4,48 (lH, d, ^8,1); 4,02 (1H, d, J=2,0); 3,95-3,80 (oplosmiddel achtergrond; 35 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm); 3,35 (1H, m); 3,28 (3H, s); _ 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s) ; 2,23-2,12 (2H, m) ; 1,42 (1H, brdt); 1,22 (3H, d, j=5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6); 0,87 (3H, SÖÜ2I35 * * - 10 - d, J=5,9).

13 C magnetische resonantiespektrum: zie figuren 10A en 10B. Instrument: WM 360 Bruker.

5 Oplosmiddel: CDC1, +10% CD-OD.

1 ·} ^ 3 C NMR 90,6 MHz £ (dpm); 17,5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52.3, 55,8, 62,1, 67,8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4, 83.3, 88,2, 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8, 134,3, 148,7, 192,8.

10

Biologische eigenschappen van BBM-1675 stoffen.

De antimicrobiële aktiviteit van de BBM-1675 stoffen werd ten opzichte van een veelvoud van grampositieve en gramnegatieve micro-15 organismen bepaald._

De onderstaande tabel A verstrekt gegevens in de vorm van resultaten van eert antimicrobiële onderzoekprocedure, die de hoofd-BEM-1675A^ komponent en de BBM-1675C en BEM-1675D stoffen van de onderhavige uitvinding betrof. In de onderzoeksprocedure werd elke proef-20 verbinding bij een uniforme concentratie van 10 microg/ml oplossing geïmpregneerd op een papierstrip, op de groeikweek gebracht waarbij de maat van antibiotische aktiviteit de resulterende remmingszone van de papierstrook is. Als weergegeven in tabel A tonen de BBM-1675C en BBM-1675D stoffen een breed spektrum van antimicrobiële aktiviteit en 25 zijn zij ten minste even effektief als de BEM-1675A^ komponent; in het bijzonder waren de BBM-1675C en BBM 1675D stoffen meer effektief als remstoffen ten opzichte van gramnegatieve organismen.

8 8 0? I 35 V y « i, ! « f * - 11 -

Tabel A.

Antimicrobiële aktiviteit van BBM-1675 stoffen.

Reimningszone, am

Proef micro-organisme BBM-1675A^ BEM—1675C BBM-1675D

Escherichia co'li AS 19 22 52 51

Escherichia coli K 12 13 . 36 35

Escherichia coli P 1373 12 34 33

Escherichia coli R Azaserine 14 35 34

Escherichia ccli R Netropsine · ll 32 32

Escherichia coli R MitomycineC 12 35 34

Escherichia coli R Bleómycine. 16 38 36

Escherichia coli R Daunomycin^ 19 45 44

Escherichia coli R Neomycin* 24 53 52

Escherichia coli R Sibiro'mycine 14 32 30

Escherichia coli R Hedamycine 14 30 25

Escherichia coli R Aclacinomycinc. 15 41 40

Bacillus subtilis ATCC 6633 34 43 41

Klebsiella pneumoniae 17 35 35

Staphylococcus 209 P 32 47 44

Staphylococcus R Actinoleukine 33 35 33

Staphylococcus R Streptonigrina 37 50 48

Staphylococcus faecalis P1377 30 39 33

Streptococcus aureus Smith P 36 47 45

Staphylococcus aureus Smith R 40 55 53

Actinomycine. D

Staphylococcus aureus Smith R 17 32 31

Aureolic acid

Aci ne tobac te r 16 33 32

Micrococcus luteus 35 57 55

Saccharomyces cerevisiae petite 2 2 42 43 R = resistent tegen genoemde antibiotica.

8' I i·* «Q< *» t - f \ Λ v \J v - 12 .-

* Λ X

Aktiviteit tegen P-388 leukemie.

Tabellen B en C geven de resultaten van laboratoriumproeven met CF^-muizen intraperitoneaal geïmplanteerd met een tumor-inoculum van 10 ascites-cellen van P-388 leukemie en behandeld met verschillende 5 doses van BBM-1675A^, C of D. De stoffen werden door intraperitoneale injektie toegediend. Er werden voor elke dosishoeveelheid groepen van 6 muizen gebruikt, die werden behandeld met een enkele dosis van de stof op de dag na de inoculatie. Er werd een groep van 10 met pekel behandelde kontrolemuizen in elke reeks van de proeven opgenomen. De 10 BBM-1675A^ behandelde groep in tabel C werd als direkte vergelijking opgenomen. Er werd een 30-dagen protocol toegepast, waarbij de gemiddelde overleveringstijd in dagen voor elke groep muizen werd vastgesteld en het aantal overlevenden bij het einde van de vijfdaagse periode werd opgeschreven. De muizen werden voor de behandeling en 15 opnieuw op dag 4 gewogen. Het verschil in gewicht werd als een maat voor de toxiciteit van het geneesmiddel opgenomen. Muizen met een gewicht van 20 g elk werden toegepast, waarbij een gewichtsverlies van tot bij benadering 2 g niet als overmatig werd beschouwd. De met drager behandelde controledieren stierven gewoonlijk binnen 9 dagen. 20 De resultaten werden vastgesteld als % T/C, hetgeen de verhouding van de gemiddelde overlevingstijd van de behandelde groep tot de gemiddelde overlevingstijd van de met drager behandelde kontrolegroep x 100 is. Een effekt, uitgedrukt in % T/C, gelijk aan of groter dan 125, is een indikatie dat een signifikant anti-tumoreffekt is be-25 reikt. De onderzoeksresultaten in tabel B tonen het aanvankelijk onverwachte niveau van anti-tumoraktiviteit van de BBM-1675C stof.

In tabel C worden de resultaten van een direkte vergelijking van BEM-1675A^ (esperamicine A^) en de BBM-1675C en BBM-1675D stoffen vermeld.

30 Uit de gegevens blijkt dat BBM-1675C ongeveer te vergelijken is met BBM-1675a^, wat kracht en anti-tumoreffekt betreft en dat het niet afhankelijk is van het toedieningsschema, terwijl BBM-1675D slechts in geringe mate minder effektief is.

Er wordt tevens in de onderhavige uitvinding vermeld dat dezelfde 35 stoffen BEM-1675C en BBM-1675D tevens uit de BBM-1675A2 (esperamicine A^) komponent kunnen worden verkregen. In vergelijking met de hierin vermelde gegevens voor BBM-1675C en BBM-1S75D en de gegevens vermeld 8-2 O O 1 % Ö V £ I V v' f * - 13 - in de Britse octrooiaanvrage 2.141.425 voor de BBM-ieTSA^ komponent is verrassender»!jze gebleken, dat de stoffen 3Bfl-i675k^ komponent waaruit zij zijn afgeleid.

5 Tabel B.

Effekt van BBM-1675C op F-388 leukemie (dag 1 behandeling).

Verbin- Dosis, IP MST Effekt AWC g Qverleven- jO ding mg/kg/inj. dagen MST % T/C dag 4 den dag 5 BBM-1675C 3,2 TOX TCK 0/6 0,8 TCK TOX - 0/6 0,2 TCK TOX - 0/6 15 0,05 TCK TOX -1,8 1/6 0,0125 11,0 122 ' -2,5 5/6 0,003125 13,5 150 -2,5 6/6

Drager - 9,0 100 0,4 10/10 - g 20 Tumor inoculum: 10 ascites-cellen i.p. geïmplanteerd.

Gastheer: CDF^ mannetjes muizen.

Evaluering: MST = gemiddelde overlevingstijd.

Effekt: % T/C = (MST-behandelde/MST-kontrole) x 100.

Criteria: % T/C £ 125 als signifikante antitumor-aktiviteit be-25 schouwd.

AWC: gemiddelde gewichtsverandering (behandeld-kontrole) in gram (op dag 4).

-,•30 2163 - 14 -

Tabel C.

Effekt van BBM-1675 stoffen op P-388 leukemie.

Verbinding Behande- Dosis, IP MST Effekt AWC g Overleven- _ lingsschema mg/kg/inj. dagen MST % T/C dag 4 den dag 5 BBM-16 75A1 d. 1 0.0512 TOX . TOX - 0/6 0.0256 TOX TOX - 0/6 0.0128 TOX TOX -1.8 3/6 0.0064 15.5 172 -0'. 3 6/6 0.0032 15.0 167 -0.6 ’ 6/6 0.0016 15.5' 172 0.6 6/6 0.0008 12.5 139 0.3 6/6 0.0004 12.0 133 1.4 6/6 0.0002 11.0 122 0.8 6/6 0.0001 11.5 128 1.4 6/6 BBM-1675C d. 1 0.0256 TOX TOX - 0/6 0.0128 TOX TOX -0.8 3/6 0.0064 11.5 128 -0.3 6/6 0.0032 14.5 161 -0.1 6/6 0.0016 10.5 117 0.0 6/6 0.0008 12.0 133 0.3 676 0.0004 11.5 128 0.8 6/6 0.0002 11.0 122 1.4 6/6 0.0001 11.0 122 0.8 6/6 0.00005 10.5 117 1.3 6/6

Ö Ό Μ £ i U

- · 15 -

Tabel C (vervolg).

Behande- Dosis, IP MST Effekt aWC g Overleven-

Verbinding lingsschema mg/kg/ in j. dagen MST % τ/C dag 4 dendag 5 5 BBM-1675D d. 1 0.0256 9.0 100 0.1 6/6 0.0128 11.5 128 0.3 6/6 0.0064 12.5 139 0.3 6/6 0.0032 12.0. 133 0.1 6/6 1° 0.0016 11.5 128 0.8 6/6 0.0008 10.0 111 0.2 6/6 0.0004 10.0 111 0’. 5 6/6 0.000 2 9.5 10 6 1.7· 6/6 0.0001 9.5 10 6 1.7 6/6 15 ' 0.00005 9.0 100 2.0 6/6 BBM-1675C d. 1-^5 0.0032 16.0 178 -1.3 6/6 0.0016 13.5 150 -1.0 6/6 0.0008 13.5 150 -0.3 6/6 20 0.0004 12.0 133 -0.4 6/6 0.0002 12.0 133 -0.4 6/6 0.0001 11.0 122 -0.4 5/6 0.00005 11.0 122 0.9 ? 6/6 0.000025 8.5 94 2.2 6/6 25 0.0000125 8.0 89 2.4 6/6 0.00000625 8.0 89 2.4 6/6

Drager - 9.0 10 0 2.4 10/10 30 6

Tumor inoculum: 10 ascites-cellen i.p. geïmplanteerd.

35 Gastheer: CDF^ mannetjes muizen.

Evaluering: MST = gemiddelde overleyingstijd

Effect: % T/C = (MST behandeld/MST kontrole) x 100 8302155 * - 16 - 4-

Criteria: % T/C > 125 als signifikante anti-tumoraktiviteit beschouwd.

AWC: gemiddelde gewichtsverandering (behandeld-kontrole) in gram (on dag 4).

5

Aktiviteit tegen B-16 melanoma.

Tabel D bevat de resultaten van anti-tumorproeven ten opzichte van B-16 melanoma bij muizen. BDF^-muizen werden gebruikt en subcutaan 10 met het tumorimplantaat gelnoculeerd. Er werd een 60 dagen protocol toegepast. Voor elke dosishoeveelheid die werd onderzocht werden groepen van 10 muizen gebruikt, waarbij de gemiddelde overlevingstijd voor elke groep werd vastgesteld. Kontroledieren werden op dezelfde wijze als de proefdieren geïnoculeerd en met de injektiedrager behandeld, 15 waarbij geen geneesmiddel een gemiddelde overlevingstijd van 22,5 dagen gaf. Bij elk dosisniveau werden de proefdieren met de proefverbinding op dagen 1, 5 en 9 door intraperitoneale injektie behandeld. Het effekt uitgedrukt in % T/C gelijk aan of groter dan 125 toont aan dat een signifikant anti-tumoreffekt was bereikt. De resultaten in tabel 20 D tonen aan dat bij een direkte vergelijking BEM-1675C tevens effek-tief was bij de behandeling van muizen die B-16 melanoma droegen en ongeveer vergelijkbaar was met BBM-1675A^ wat kracht betreft.

8602155 - 17 -

Tabel D.

Effekt van BBM-1675-stoffen op B-16 melanoma.

(dag 1, 5 en 9 behandelingen).

5 Verbindino Dosis, IP MST Effekt awc gm Overleven- __ mg/kg/inj. dagen MST % T/C dag 12 den dag 10 BBM-1675A1 0.0032 37.5 167 0.3 10/10 0.0016 37.5 167 0.3 ’ 10/10 10 0.0008 38.5 171 1.4 10/10 0.0004 37.0 164 1.8 10/10 0.0002 34.5 153 2.0 10/10 0.0001 32.0 142 1.9 10/10 15 BBM-1675C 0.0008 31.5 140 0.6 10/10 0.0004 37.0 164 1.2 10/10 0.0002 31.0 138 0.6 10/10 0.0001 31.5 140 1,0 10/10 0.00005 27.5 122 0.8 10/10 20 0.000025 25.0 111 0.5 10/10 3rager - 22.5 100 0.3 10/10 25

Tumor inoculum: 0,5 ml van een 1'%'s brei, I.P.

Gastheer: BDF^ vrouwtjes muizen.

30 Evaluatie: MST * gemiddelde overlevingstijd.

Effekt: % T/C = (MST-behandeld/MST kontrole) x 100.

Criteria: % T/C £ 125 wordt beschouwd als een signifikante antitumor-aktiviteit.

AWC; gemiddelde gewichtsverandering (behandeld-kontrole) in gram (op 35 dag 12).

16 Ö 2 ! o3 - *18 -

Als aangegeven door de antimicrobiële en muizen tumorgegevens als boven verstrekt zijn BBM-1675C en BBM-1675D aldus als antibiotica bruikbaar voor de therapeutische behandeling van zoogdieren en andere dieren tegen infektueuze ziekten en tevens als antitumormiddelen voor 5 het therapeutisch remmen van de groei van tumoren in zoogdieren.

De onderhavige uitvinding voorziet derhalve in een werkwijze voor het therapeutisch behandelen van een gastheerdier, dat door microbiële infektie of door een kwaadaardige tumor is getroffen, bestaande uit het aan genoemde gastheer toedienen van een effektieve antimicrobiële 10 of tumor-remmende dosis van BBM-1675C en BBM-1675D, of een farmaceutisch preparaat daarvan.

De uitvinding omvat tevens binnen zijn kader farmaceutische preparaten die een effektieve antimicrobiële of tumor-remmende hoeveelheid van BBM-1675C of BBM-1675D in kombinatie met een inerte farmaceutisch 15 aanvaardbare drager of verdunner bevatten. Dergelijke preparaten kunnen tevens andere aktieve antimicrobiële of antitumormiddelen bevatten en kunnen elke farmaceutische vorm omvatten die geschikt is voor de gewenste toedieningsroute. Voorbeelden van dergelijkë preparaten omvatten vaste preparaten voor orale toediening, zoals tabletten, kapsules, 20 pillen, poeders en korrels, vloeibare preparaten voor orale toediening, zoals oplossingen, suspensies, siropen of elixirs en preparaten voor parenterale toediening, zoals steriele waterige of niet-waterige oplossingen, suspensies of emulsies. Zij kunnen tevens worden bereid in de vorm van steriele, vaste preparaten, die in steriel water, fy-25 siologische pekel of een bepaald ander steriel injekteerbaar medium onmiddellijk vóór gebruik kunnen worden opgelost.

Ten gebruike als een antimicrobiéel middel wordt het BBM-1675C of BBM-1675D een farmaceutisch preparaat daarvan zodanig toegediend dat de concentratie van de aktieve komponent groter is dan de minimale 30 remmende concentratie voor het bepaalde, te behandelen organisme.

Ten gebruike als antitumormiddel kunnen optimale doseringen en voorschriften van BEM-1675C en BBM-1675D voor een bepaald zoogdier-gastheer gemakkelijk door de vakman worden -vastgesteld. Het zal uiteraard duidelijk zijn dat de aktuele dosis van BBM-1675C en BBM-1675D 35 als toegepast, zal afhangen van de bepaalde samengestelde preparaten, de toedieningswijze en de bepaalde plaats, gastheer en ziekte, die wordt behandeld. Vele faktoren die de werking van het geneesmiddel '802135 -.19 - kunnen beïnvloeden dienen in overweging te worden genomen, zoals leeftijd, gewicht, sexe, dieet, toedieningstijd, toedieningsroute, mate van excretie, toestand van de patiënt, geneesmiddelkombinaties, reak-tiegevoeligheid en de ernst van de ziekte. De toediening kan continu 5 of periodiek binnen de maximaal getolereerde dosis worden uitgevoerd. Optimale toedieningshoeveelheden voor een bepaalde reeks van omstandigheden kan men door de vakman met gebruikelijke dosisbepalingsproe-ven laten vaststellen, gelet op de bovenstaande richtlijnen.

De volgende voorbeelden dienen alleen voor illustratieve doelein-10 den.

Chemische bereiding en isolering van BBM-1675C en BBM-1675D.

Voorbeeld I.

15 Er werd een monster van BBM-1675A^ (50 mg)’opgelost in 2,5 ml metha nol en behandeld met 2,5 ml van een 0,1 molaire oplossing van water-stofchloride in methanol. Mèn liet de reaktie voortgaan bij een temperatuur van ongeveer 50°C, waarbij het verdwijnen van het uitgangsmateriaal (na bij benadering 30 minuten) elke 5-10 minuten werd ge-20 volgd door dunnelaagchromatografie (TLC) op silicagelplaten (Analtech, 250 micrometer, GP), waarbij tolueen : aceton (3:2, v/v) als elutie-oplosmiddel diende. Nadat het uitgangsmateriaal was verbruikt werd het reaktiemengsel geneutraliseerd met een verzadigde oplossing van NaHC03 in methanol, daarna onder verlaagde druk verdampt, waarbij een 25 droog residu werd verkregen, dat de bioaktieve fragmenten bevatte. De BBM-1675C stof werd uit het residu geïsoleerd door afdampkolomchroma-tografie over een 2 cm i.d. x 10 cm kolom gepakt met Woelm-silicagel (32-63 micrometer deeltjesgrootte). De kolom werd geëlueerd met tolueen : aceton (3:2, v/v), waarbij 3 ml frakties werden verzameld. Elke 30 fraktie werd door TLC (silicagel met tolueen/aceton (3:2, v/v) als eluent) geanalyseerd en de TLC-plekken werden zichtbaar gemaakt met een UV 254 nm lichtbron en een cerisulfaatnevel (1% cerisulfaat en 2% molyboolzuur in 10% zwavelzuur). Frakties 6-12 (R^-waarde voor BBM-1675C is 0,28) werden samengevoegd en drooggedampt en men verkreeg 12 35 mg (35%) van nagenoeg zuiver BBM-1675C.

De fysisch-chemische eigenschappen van BBM-1675C worden in de beschrijving gegeven en de ultraviolet, infrarood, massa-, HNMS- en <30 21 3 5 - '20 -

CtMR-spektra van de verbinding worden in figuren 1, 3, 5, 7 en 9 weergegeven.

Voorbeeld II.

5 Wanneer men dé reaktietijd van de procedure in voorbeeld 1 ver lengt neemt de hoeveelheid BBM-1675C af en verschijnen twee nieuwe produkten, zoals verbinding _3 (Rf «0,65) en BBM-1675D (Rf blijft op de basislijn) (TLC: silica, tolueen:aceton (3:2, v/v) die na verloop van tijd meer op de voorgrond blijken te treden.

10 De verbinding BBM-1675D die gewoonlijk de produktie van BBM-1675C

begeleidt, werd uit de chromatografiekolom, als beschreven in voorbeeld I, geïsoleerd door de kolom te elueren met chloroform:methanol (5:1, v.v). De geschikte frakties werden samengevoegd en drooggedampt en men verkreeg 18 mg van nagenoeg zuiver BBM-1675D uit de reaktie als 15 beschreven in voorbeeld I.

De BBM-1675D stof vertoont één hoofdplek bij R^ = 0,37 in omgekeerde fase TLC (Whatman MKC.aF, 200 micrometer) met 30% water in methanol 1 o als eluent en = 0,22 in normale fase silicagel TLC met chloroform: methanol (5:0,5, v/v) als eluent.

20

Voorbeeld III.

Er kan een aanzienlijke verbetering in de opbrengst van het BBM-1675D worden bereikt door p-tolueensulfonzuur in plaats van waterstof-chloride in de chemische hydrolyse van BBM-1675A^ of BBM-1675A^ toe 25 te passen, als geïllustreerd volgens de procedures van voorbeelden III en V.

Een monster van BBM-1675A2 (15,2 mg) werd gehydrolyseerd met een 0,03 molaire oplossing van p-tolueensulfonzuur in methanol (1 ml) bij een temperatuur van ongeveer 63°C gedurende ongeveer 1 uur. Het reak- o 30 tiemengsel werd daarna onder verlaagde druk bij ongeveer 30 c drooggedampt. De BBM-1675D stof werd uit het droge residu door afdampkolom-chromatografie op een kolom gepakt met Woelmsilicagel (32-63 micrometer deeltjesgrootte) geïsoleerd. De kolom werd geëlueerd met chloroform: methanol (5:0,5, v/v) en de verzamelde frakties werden geanaly-35 seerd volgens TLC (silicagel met chloroform:methanol (5:0,5, v/v) als eluent.

'021 65 -,21 - -Λ i

Door de toegepaste chromatografische omstandigheden was het moge-Xijk het mengsel van inaktieve verbindingen 2 en 3 (7 mg) uit de biologisch aktieve BBM-1675D-stof, die een R^-waarde van 0,22 heeft, af te scheiden. De geschikte frakties werden samengevoegd en droog-5 gedampt en gaven 8 mg van nagenoeg zuiver BBM-1675D in een bijna kwantitatieve opbrengst.

De fysisch-chemische eigenschappen van BBM-1675D blijken uit de beschrijving terwijl de ultraviolet, infrarood, massa-, HNMR- en QMR-spektra van de verbinding in figuren 2, 4, 6, 8 en gekombineerd 10 10A en 10B worden aangegeven.

Voorbeeld IV.

Een manster van BBM-1675A2 (40 mg) werd bij ongeveer 50°C gedurende ongeveer 2 uur volgens de algemene procedure en de isoleringsmetho-15 de als beschreven in voorbeeld I behandeld met 5 ml van een 0,5 mo-laire oplossing van waterstofchloride in methanol. Na neutralisatie met NaHC03 en droogdamping werd de BBM-1675C stof uit het residu geïsoleerd door afdampkolomchromatografie over een kolom gepakt met Woelm-silicagel (32-63 micrometer deeltjesgrootte) met tolueenraceton 20 (3:2, v/v) als eluent. De geschikte frakties werden gekombineerd en drooggedampt en gaven 8,4 mg van nagenoeg zuiver BBM-1675C, dat identiek is aan het produkt, geïsoleerd volgens voorbeeld I.

De chromatografiekolom als boven werd daarna geëlueerd met chlo-roform:methanol (5:0,25, v/v) en de verzamelde frakties werden samen -25 gevoegd en drooggedampt en gaven- BBM-1675D. De BBM-1675D stof werd verder gezuiverd door een extra afdamp-chromatografiekolom met sili-cagel onder gebruik van chloroformimethanol (5:0,5, v/v) als eluent.

De geschikte frakties werden gekombineerd en drooggedampt en gaven 6,3 mg van nagenoeg zuiver BBM-1675D, dat identiek is aan het produkt ge-30 isoleerd in voorbeeld III.

Voorbeeld V.

Een monster van BBM-1675A^ (49,3 mg) werd gehydrolyseerd met een 0,037 M oplossing van p-tolueensulfonzuur in methanol (1,5 ml) bij een 35 temperatuur van ongeveer 60°C gedurende ongeveer 1,5 uur, Het reak-tiemengsel werd onder verlaagde druk bij ongeveer 30°C drooggedampt, waarbij een residu werd verkregen, dat BBM-1675D en de inaktieve ver- -... ! 6 5 -.22 - bindingen bevat. De BBM-1675D biologisch aktieve stof werd uit het residu door afdampkolomchromatografie over een kolom gepakt met Woelm-silicagel (32-63 micrometer deeltjesgrootte) met chloroform:methanol (5:0,25 v/v als eluent) geïsoleerd. De geschikte frakties werden 5 gekombineerd en drooggedampt en leverden 27 mg van nagenoeg zuiver BEM-1675D, dat identiek is aan het produkt, geïsoleerd in voorbeeld III.

Voorbeeld VI.

10 Een monster van BBM-1675C (5,1 mg) werd met een 0,5 molaire oplos sing van waterstof chloride in methanol (1 ml) bij ongeveer 40-50°C gedurende de nacht gehydrolyseerd. Na neutralisatie met NaHCO^ en droog-damping werd de BBM-1675D biologisch aktieve stof uit het residu door afdampkolomchromatografie over een kolom gepakt met Woelm-silicagel 15 (32-63 micrometer-deeltjesgrootte) met chloroform:methanol (5:0,25, v/v) als eluent) geïsoleerd. De geschikte frakties leverden nagenoeg zuiver BBM-1675D, dat identiek is aan het produkt geïsoleerd in voorbeeld III.

20 Voorbeeld VII.

Bij herhaling van de algemene procedure van voorbeelden I en II, met uitzondering dat het uitgangsmateriaal BBM-1675A^ wordt vervangen door een equimolaire hoeveelheid van een mengsel dat BBM-1675A^ en BBM-1675A2 bevat, worden aldus de BBM-1675C en BBM-1675D stoffen ge-25 produceerd.

Voorbeeld VIII.

Bij herhaling van de algemene procedure van voorbeeld V met uitzondering dat het uitgangsmateriaal BBM-1675A^ wordt vervangen door 30 een equimolaire hoeveelheid van een mengsel dat BBM-1675A^ en BBM- 1675A2 bevat wordt aldus de BBM-1675D stof geproduceerd.

..’65

Claims

1. Antitumor-antibioticum BBM-1675C, dat in nagenoeg zuivere vorm: (a) het uiterlijk heeft van een amorfe vaste stof; (b) oplosbaar is in methanol, ethanol, ethylacetaat, aceton, te-trahydrofuran en chloroform? 5 (c) in silicagel-dunnelaagchromatografie met het oplosmiddelsysteem tolueen:aceton (3:2, v/v) een R^-waarde van 0,28 vertoont; (d) een schijnbaar molecuulgewicht van 855 heeft, bepaald volgens hoge resolutie FAD-massaspektroscopie; (e) een ultraviolet absorptiespektrum in methanoloplossing heeft, 10 die nagenoeg gelijk is aan die van voorbeeld I, waarbij ultraviolette absorptiemaxima en absorpties bij 210 nm (a = 21.770), 274 nm (a =* 9340) en 313 nm (schouder) (AS-4190) worden getoond met geen. signi-fikante verandering bij toevoeging van zuur of base; (f) een infrarood-absorptiespektrum (KBr, film) nagenoeg als weer-15 gegeven in figuur 3 heeft, dat hoofd-absorptiepieken vertoont bij: 540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118, 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930, 2970 en 3450 reciproke centimeters; (g) een lage resolutie-massaspektrum heeft, nagenoeg als weergege-ven in figuur 5 dat een moleculair ion (M+H) van 856 vertoont? (h) een 360 MHz magnetisch protonresonantiespektrum in CDCl^ heeft dat nagenoeg is als weergegeven in figuur 7 en signalen vertoont bij 6,54 (1H, dd, J=7,7, 7,0); 6,21 (1H, brs); 5,87 (lH, d, 25 9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6, 1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J=t0,3, 1,8); 4,61 (1H, d, J»7,7); 4,25 (1H, s); 4,09 (1H, q, J=2,6); 3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92-3,53 (10H); 3,45 (1H, dt, J=10,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (1H, m); 2,69 (1H, dt, J=9,9, 5,2)? 2,49 (1H, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, 30 2); 2,30 (2H, m)? 2,13 (IH, m)? 2,09 (3H, s)? 1,50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); en 1,08 (6H) delen per miljoen laagveld uit tetramethylsilaan; (i) een 90,6 MHz koolstof-*"^-magnetisch resonantiespektrum in

35 CDCl^ heeft, nagenoeg als weergegeven in figuur 9, dat signalen ver- C- * 0 1 -ï ^ - 2 4 toont bij 13.7, 17,5, 19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 35,2, 39,5, 47,7, 52.7, 55,8, 56,1, 57,7, 62,4, 64,7, 67,4, 69,3, 69,8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7, 79,7, 83,2, 88,4, 97,3, 99,7, 123,4, 5 124,6, 130,1 en 193,1 delen per miljoen laagveld uit tetra- methylsilaan.

2. Antitumor-antibiotidum BBM-1675D, dat nagenoeg in zuivere vorm: (a) het uiterlijk heeft van een amorfe vaste stof; (b) oplosbaar is in methanol, ethanol, aceton en tetrahydrofuran 10 en enigszins oplosbaar in chloroform; (c) in silicagel dunnelaagchromatografie met het oplosmiddelsys-teem chloroform:methanol (5:0,5, v/v) een R^-waarde van 0,22 vertoont en in omgekeerde fase silicagel-dunnelaagchromatografie met het oplosmiddelsysteem methanol:water (70:30, v/v) een Rf-waarde van 0,37 15 vertoont; (d) een schijnbaar molecuulgewicht heeft van 695 bepaald door hoge resolutie FAB-massaspektroscopie; (e) een ultraviolet absorptiespektrum in methanoloplossing heeft, nagenoeg als weergegeven in figuur 2, dat ultraviolette absorptiema- 20 xima en absorpties bij 214 nm (a - 27000), 274 nm (a = 12800) en 325 nm (a = 5400) vertoont zonder een signifikante wijzinging bij toevoeging van zuur of base; (f) een infraroodabsorptiespektrum (KBr, film) heeft, nagenoeg als weergegeven in figuur 4, dat hoofdabsorptiepieken vertoont bij 25 735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195, 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 1720, 1735, 2880, 2930, 2960 en 3400 reciproke centimeter; (g) een lage resolutiemassaspektrum heeft, nagenoeg als weergegeven in figuur 6, dat een moleculair ion (M+H)+ van 696 vertoont; 30 (h) een 360 MHz magnetisch protonresonantiespektrum heeft in CDCl^ + 10% CD^OD, nagenoeg als weergegeven in figuur 8, dat signalen vertoont bij: 6,43 (1H, dd, j=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J= 8,8); 5,70 (la, d, J»8,8); 5,48 (1H, 6 brs); 4,48 (1H, d,

35 J=8,1); 4,02 (1h, d, J*»2,0); 3,95-3,80 (oplosmiddelachter- grond); 3.77 (1H, t, J=9,0); 3,70-3,40 (11H, brm) ; 3,35 (lH, -=-" λ ·? 1 6 5 - 25 - m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66-2,55 (2h, m)? 2,38 (3H, s); 2,23-2,12 (2H, m); 1,42 (1H, brdt); 1,22 (3H, d, J=*5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6); en 0,87 (3h, d, J=5,9) delen per miljoen laagveld uit tetramethylsilaan; 5 (i) een 90,6 MHz koolstof-^-magnetisch resonantiespektrum heeft in CDCl^ + 10% CD^OD, nagenoeg als weergegeven in figuur 10 (figuren 10A + 10B), dat signalen vertoont bij: 17,'5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8, 62,1, 67,8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4, 83,3, 88,2, 10 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8, 134,3, 148,7 en 192,8 delen per miljoen laagveld uit tetramethylsilaan.

3. Werkwijze voor het bereiden van het antitumor-antibioticum BBM-1675C bestaande uit het hydrolyseren van BBM-1675A^ of BBM-1675A2 met een anorganisch of organisch zuur tot een aanzienlijke hoeveel- 15 heid van BBM-1675C is geproduceerd, waarna BBM-1675C uit het reaktia-medium wordt gewonnen.

4. Werkwijze voor het bereiden van het antitumor-antibioticum BBM-1675D, bestaande uit het hydrolyseren van het BBM-1675A^ of BBM-1675A2 met een anorganisch of organisch' zuur tot een aanzienlijke hoe- 20 veelheid van BBM-1675D is geproduceerd, waarna BBM-1675D uit het reaktiemedium wordt gewonnen.

5. Werkwijze voor het bereiden van het antitumor-antibioticum BSM-1675D, bestaande uit het hydrolyseren van BBM-1675C met een anorganisch af organisch zuur tot een aanzienlijke hoeveelheid van BBM- 25 1675D is geproduceerd, waarna BBi-16750 uit het reaktiemedium wordt gewonnen.

6. Werkwijze voor het bereiden van het antitumor-antibioticum BBM-1675C, bestaande uit het hydrolyseren van een mengsel van BBM-1675A^ en BBM-1675A2 met een anorganisch of een organisch zuur tot een aan- 30 zienlijke hoeveelheid van BBM-1675C is geproduceerd, waarna BBM-1675C uit het reaktiemedium wordt gewonnen.

7. Werkwijze voor het bereiden van een antitumor-antibioticum BEM-1675D, bestaande uit het hydrolyseren van een mengsel van BBM-1675A^ en BBM-1675A2 met een anorganisch of organisch zuur tot een aanzien- 35 lijke hoeveelheid van BBM-1675D is geproduceerd, waarna BBM-1675D uit het reaktiemedium wordt gewonnen. 360 21 o 5 - 26

8. Farmaceutisch preparaat bestaande uit een effektieve antimicro-biële hoeveelheid van BBM-1675c of BBM-1675D in kombinatie met een farmaceutische drager of verdunner.

9. Farmaceutisch preparaat bestaande uit een effektieve tumor- 5 remmende hoeveelheid van BEM-1675C of BBM-1675D in kombinatie met een farmaceutische drager of verdunner.

10. Werkwijze voor het therapeutisch behandelen van een dierlijke gastheer, die lijdt aan een microbiële infektie, bestaande uit het aan genoemde gastheer toedienen van een effektieve antimicrobiële do- 10 sis van BBM-1675C en BBM-1675D.

11. Werkwijze voor het therapeutisch behandelen van een dierlijke gastheer, die lijdt aan een kwaadaardige tumor gevoelig voor BBM-1675C of BBM-1675D, bestaande uit het aan genoemde gastheer toedienen van een tumor-remmende dosis van BB1-1675C of BBM-1675D. - 1 65