HU197915B

HU197915B - Process for producing new antibiotic bbm-1675c and d with antitumor effect and pharmaceutical compositions comprising same

Info

Publication number: HU197915B
Application number: HU863709A
Authority: HU
Inventors: Jerzy Golik
Original assignee: Bristol Myers Co
Priority date: 1985-08-27
Filing date: 1986-08-27
Publication date: 1989-06-28
Also published as: SE9200428L; CY1676A; SG109692G; JPS62116589A; SE8603597L; SE9200428D0; ATA231786A; IL79519A0; IT8621527A0; DK406086A; DK406086D0; FR2586686A1; GB2179649B; KR870002269A; GB8620118D0; BE905332A; LU86562A1; CH668598A5; DK170671B1; KR920010226B1

Description

A találmány tárgya eljárás új BBM-1675C és D tumor-ellenes antibiotikumok előállítására.

A találmány szerinti antibiotikumok pontos szerkezetét eddig még nem határoztuk meg, egyedülálló fizikai, kémiai és biológiai tulajdonságaik alapján azonban úgy véljük, hogy a BBM-1675C és BBM-1675D antibiotikumok új anyagok.

Az 1984. december 19-én közrebocsátott, 2 141 425 számú nagy-britanniai szabadalmi leírás szerint az Actinomadura verrucosospora H964-92 (ATCC 39334) vagy az Actinomadura verrucosospora Á1327Y (ATCC 39638) mikroorganizmus törzs fermentációja egy új tumor-ellenes antibiotikum komplexet eredményez, melyet BBM-1675-ként jelöltek. A BBM-1675-nek két, az említett szabadalmi bejelentésben leírt biológiailag aktív komponensét BBM-1675A,-nek és BBM-1675A₂nek nevezték. A másnéven esperamicin Α,-ként illetve esperamicin A₂-ként is ismert BBM-1675A, és BBM-1675A₂ antibiotikumok szerkezetét még nem derítették fel, de mindkét komponens kiváló antimikrobális és tumorellenes hatást mutat.

A 4 530 835 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egy WP-44 jelű (ATCC 39363), Actinomyces-fajként nem azonosított Actinomycete izolátum fermentá cióját ismerteti, melynek során a CL-1577A és CL-1577B jelű tumor-ellenes antibiotikumok keletkeztek. A CL-1577 antibiotikumok szerkezete egyelőre ugyancsak ismeretlen, de jellemző tulajdonságaik arra utalnak, hogy szerkezetileg a CL-1577A és CL-1577B antibiotikumok hasonlóak a BBM-1675 antibiotikumokhoz, különösen a fentemlített, a 2 141 425. számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban szereplő BBM1675A, és A₂ antibiotikumokhoz.

R.H. Bunge és munkatársai a J. Antibiotics, 37(12), 1566-1571 (1984) folyóiratban megjelent cikke az Actinomadura sp. (ATCC 39363) fermentációjával foglalkozik, mely két nagyobb komponenst, a PD 114 759 és a PD 115 028 komponenseket, eredményezte. A.J. Chem. Soc. Chem. Commun. 919—920 (1985) folyóiratban Wilton és munkatársai részben azonosították a PD 114 759 és a PD 155 028 antibiotikumok szerkezetét. A PD 114 759 és PD 115 028 antibiotikumok termelése, izolálása és jellemzői azonosnak tűnnek a fent említett CL-1577A, illetve CL-1577B antibiotikumok megfelelő paramétereivel.

A 95 154 számon közrebocsátott európai szabalmi bejelentés szerint Actinomadura pulveraceus sp. nov. No.6049 (ATCC 39100) fermentációja a WS 6049-A és WS 6049-B jelű tumor-ellenes antibiotikumok keletkezéséhez vezet. A WS 6049 antibiotikumok szerkezetét még nem derítették fel, de megadott jellemző tulajdonságaik azt mutatják, hogy a WS 6049-A és WS 6049-B szerkezetileg rokon a 2 141 425 számú nagy-britanniai szabadalmi bejelentésben szereplő BBM-1675 2 antibiotikumokkal és a 4 530 835 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban ismertetett CL-1577 antibiotikumokkal. A spektrális adatok azonban azt is világosan mutatják, hogy sem a WS 6049-A sem a WS 6049-B nem azonos egyik BBM-1675 komponenssel sem. Ezen kívül, a 95 154 számú európai szabadalmi bejelentésben szereplő termelő mikroorganizmus egyértelműen eltér a 2 141 425 számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban használt Actinomadura verrucosospora mikroorganizmustól, a 2.,

3. és 4. számú ISP táptalajokon nőtt légmicélium színében, pozitív tej peptonizációjában és pozitív D-fruktóz, D-mannit, trehalóz és cellulóz hasznosításában.

A találmány olyan új tumor-ellenes, BBM-1675C-nek és BBM-1675D-nek (vagy másnéven BMY-27305-nek és BMY-27307nek) nevezett antibiotikumok előállítására vonatkozik, amelyek a BBM-1675A, (esperamicin A,) vagy a BBM-1675A₂ (esperamicin A₂) szelektív kémiai hidrolízisével keletkeznek, míg az utóbbiakat az Actinomadura verrucosospora egy BBM-1675 termelő törzse termeli. A BBM-1675C és BBM-1675D bioaktív anyagok, szokásos kromatográfiás eljárásokkal különíthetők el és tisztíthatók, és mindkét anyag kiváló antimikrobiális és tumor-ellenes hatást mutat.

Rájzismertetés

1. ábra:	a BBM-1675C ultraibolya abszorpciós spektruma
2.ábra:	a BBM-1675D ultraibolya abszorpciós spektruma
3. ábra:	a BBM-1675C infravörös abszorpciós spektruma (KBr, film) a BBM-1675D infravörös abszorp-
4. ábra:
	ciós spektruma (film)	'a
5. ábra:	a BBM-1675C relatív eloszlási tömegspektruma
5. ábra:	a BBM-1675D relatív eloszlási tömegspektruma	e
7. ábra:	a BBM-1675C CDC1₃ - bán (360 MHz) felvett proton mágneses rezonancia spektruma
8. ábra:	a BBM-1675D CDCI₃-ben (360 MHz) felvett proton mágneses rezonancia spektruma
9. ábra:	a BBM-1675C CDC1_S - bán (90,6 MHz) felvett ^,3C mágneses rezonancia spektruma
10a. ábra:	a BBM-1675D CDC1₃ + 10%

CD₃OD-ben (90,6 MHz) felvett ¹³C mágneses rezonancia spektruma (110—200 ppm)

10b. ábra: a BBM-1675D CDC1₃ + 10%

CD₃OD (90,6 MHz) felvett ^I3C mágneses rezonancia spektruma (0—110 ppm) i la. éhra: a 3A vegyület (alfa-anomer) proton mágneses rezonancia spektruma CDCI₃-ban (360 MHz)

Slb. ábra: a 3B vegyület (béta-anomer) proton mágneses rezonancia spektruma CDCl₃-ban (360 MHz).

-2197915

A találmány tárgya eljárás az új BBM-1675C, illetve BBM-1675D, vagy másnéven BMY-27305, illetve BMY-27307 tumor-ellenes antibiotikumok előállítására a BBM-I675A, (esperamicin A,) vagy BBM-1675AJ (esperamicin A₂) bioaktív komponensek szelektív kémiai hidrolízisével. Az utóbbiak előállítása az Actinomadura verrucosospora egy BBM-1675 termelő törzsének, előnyösen az Actinomadura verrucosospora A1327Y (ATCC 39638) törzsnek vagy ennek valamilyen mutánsa tenyésztésével történik. Közelebbről, a találmány a BBM-1675C előállítására vonatkozik a BBM-1675A, vagy BBM-1675A₂bioaktív komponens szelektív kémiai hidrolízisével. A találmány ezen kívül kiterjed a BBM-1675D előállítására a BBM-1675C vagy — még előnyösebben — a BBM-1675A, vagy BBM-1675A₂ bioaktív komponensek szelektív hidrolízisével. A BBM-1675C és BBM-1675D komponensek szokásos kromatográfiás eljárásokkal különíthetők el a reakcióelegyből és tisztíthatók.

A BBM-1675C és a BBM-1675D bioaktív anyagok a mikroorganizmusok széles skálájával szemben antimikrobiális hatást mutatnak, és különböző egér tumor rendszerekben, például P-388 leukémia és B16 melanoma esetében gátló hatást fejtenek ki. A találmány szerint előállított új anyagok ezért antimikrobiális vagy tumor-ellenes, emlősök tumorainak kezelésére alkalmas szerekként hasznosíthatók.

A BBM-1675A, (esperamicin A,) illetve a BBM-1675A₂ (esperamicin A₂) szerkezetének felderítését célzó degradációs vizsgálatok során olyan komponens-elegy keletkezett, amely két inaktív komponens, az 1. illetve

2. képletű vegyületek izolálásához és azonosításához vezetett. Meglepő módoii azt találtuk azonban, hogy a kémiai degradáció két bioaktív fragmentum, a BBM-1675C és a BBM-1675D lépcsőzetes felszabadulásához vezetett.

Még meglepőbb volt, hogy a két különböző antibiotikum, a BBM-1675A, és A₂ azonos bioaktív fragmentumokat eredményeztek, amint ez az 1. reakcióvázlaton látható. Még ennél is meglepőbb, hogy a kisebb molekulatömegű BBM-1675C és D fragmentumokat (amelyek molekulatömege a BBM-1675A,, illetve A₂ antibiotikumok molekulatömegének mintegy 70, illetve 55%-a) hatékonyabbnak találtuk, mint a BBM-1675A₂-t és hatásukban összevethetőnek a BBM-1675A, gyei, mind a tumor-ellenes, mind az antimikrobiális hatás tekintetében.

A BBM-1675C és a BBM-1675D a BBM-1675A, antibiotikum szelektív kémiai hidrolízisével állítható elő a 2. reakcióvázlaton szemléltetett módon.

A kiindulási BBM-1675A, vegyület előállítása a 2 141 425 számú közrebocsátott nagy-britanniai szabadalmi leírásban ismertetett eljárással történik. A tisztított BBM1675A! komponenst egy ásványi vagy egy szerves savval, például hidrogén-kloriddal, kénsavval, p-toluol-szulfonsavval, benzol-szulfon savval hidrolizáljuk, szerves oldószerben vagy vizes-szerves oldószer elegyében, körülbelül 0°C és az alkalmazott oldószer visszafolyási hőmérséklete közötti hőmérsékleten, míg a kívánt BBM-1675C vagy BBM-1675D jelentős mennyiségben nem keletkezik. A hidrolízist előnyösen 1—6 szénatomos alkoholokban, legelőnyösebben metanolban végezzük. A reakcióhőmérséklet nem kritikus, de a reagáltatást előnyösen szobahőmérséklet és 60°C között, legelőnyösebben 40—60°C-on végezzük.

A BBM-1675A, szelektív hidrolízise lépcsőzetesen megy végbe, melynek első lépésében a BBM-1675C antibiotikum és az 1. képletű inaktív fragmentum keletkezik. A hidrolízis továbbfolytatása azonos körülmények között a 3. képletű tio-cukor alfa- és béta-anomerjei elegyének felszabadulásához és a BBM-1675D antibiotikum keletkezéséhez vezet. Szakember számára nyilvánvaló, hogy a reakciókörülmények, így az idő, a hőmérséklet és a savkoncentráció megváltozása a BBM-1675C és D antibiotikumok keletkezési arányának megváltozásához vezet. így célszerű a reakció előrehaladását — a későbbi példákban szemléltetett módon — vékonyréteg-kromatográfiásan követni.

Ha a cél kizárólag a BBM-1675D antibiotikum előállítása a szelektív hidrolízist előnyösen egy szerves savval, például p-toluol-szulfonsavval végezzük, és így a BBM-1675D kvantitatív mennyiséghez jutunk.

A BBM-1675C és BBM-1675D anyagok a BBM-1675A₂ antibiotikum szelektív kémiai hidrolízisével is előá 11 íthatők, a 3. reakcióvázlaton bemutatott módon.

A BBM-1675A₂ kiindulási anyag előállítása a 2 141 425. számú közrebocsátott nagy-britanniai szabadalmi leírás szerint történik. A tisztított BBM-1675A₂ szelektív hidrolízise szintén lépcsőzetesen zajlik, és először a BBM-1675C antibiotikumot, és a 2. képletü inaktív fragmentumot eredményezi. A további hidrolízis a 3. képletü tio-cukor alfa- és béta-anomerjei elegyének felszabadulásához és a BBM-1675D antibiotikum keletkezéséhez vezet.

A BBM-1675A₂ szelektív kémiai hidrolíziséhez alkalmazott reakciókörülmények lényegében azonosan a BBM-1675A, hidrolízisével kapcsolatban a fentiekben részletezett körülményekkel. A BBM-1675D BBM-1675A,ből történő előállításához hasonlóan, ha csak BBM-1675D antibiotikumot kívánunk előállítani, a BBM-1675A₂ hidrolízisét addig végezzük, amíg lényegében minden BBM-1675A₂és BBM-1675C BBM-1675D-vé alakul. A hidrolízist legelőnyösebben egy szerves savval, >gy p-toluol-szulfonsavval hajtjuk végre.

Az a felismerés, hogy ugyanazok a BBM-1675C és D antibiotikumok keletkeznek két különböző antibiotikumból, a BBM-1675A,-ből 3

-3197915 és a BBM-1675A₂-ből, két inaktív fragmentum, az 1. és 2. képletű fragmentumok és a

3. képletű tio-cukor egyidejű keletkezése mellett, a találmány szerinti eljárás további előnyét jelenti. Ennék megfelelően, a találmány 5 további tárgya eljárás a BBM-1675A, és A₂elegyének szelektív hidrolízisére a BBM-1675C és D előállítására, a 4. reakcióváziaion szemléltetett módon.

Ez az előny nyilvánvalóvá válik, ha meggondoljuk, hogy a fermentáció során keletkezett BBM-1675A, és A₂ relatív mennyisége változó. A BBM-1675C és D termelés tehát független a BBM-1675A, és A₂ kiindulási 15 anyagok relatív mennyiségétől.

Mint említettük, a BBM-l675A,,A₂ és C antibiotikumok hidrolízise egy inaktív tio-cukor fragmentum felszabadulásához vezet. Ezt a tio-cukrot izoláltuk, annak érdekében, hogy 20 további információhoz jussunk a BBM-1675C, és ezen keresztül a BM-1675A, és A₂ antibiotikumok szerkezetével kapcsolatban. A 3. képletű vegyület egy olyan tio-cukor alfa- és béta-anomerjeinek elegyeként azonosítottuk, 25 amelyek szerkezetét a 2. és 3. reakcióvázlaton mutatjuk be. A további jellemzésre akkor volt lehetőség, amikor az alkoholizis termékeit, al alfa- és béta-anomereket elkülönítettük. A 3A képletű vegyület (alfa-ano- 30 mer) és a 3B képletű vegyület (béta-anomer) proton mágneses rezonancia spektrumát (360 MHz) a 11A és 1 IB ábrákon mutatjuk be. A spektrum adatok analízise alapján a 3. képletű tio-cukor metil-glikozidoknak a (III) képlet szerinti sztereokémiái szerkezetet tulajdonítjuk. Egyelőre az abszolút konfigurációt, tehát, hogy D vagy L konfiguráció-e, még nem határoztuk meg. Ennek megfelelően, a spektrum adatok jelenlegi kiértékeléséből kiindulva arra a következtetésre jutottunk, hogy a 3. képletü tio-cukor (kivéve az anomer metoxicsoport CH₃ csoportját, amely a metanolízis során épül be) a BBM-1675C és, ezen keresztül, a kiindulási BBM-1675A_t és A₂ antibiotikumok szerkezeti eleme.

A BBM-1675C fizikai kémiai tulajdonságai

Megjelenés: amorf szilárd anyag

Ultraibolya abszorpciós spektrum: lásd Lábra eszköz: Hewlett-Packard 8458 oldószer: metanol koncentráció: 0,0155 g/1 max. (nm) abszorpciók

210 21 770

274 9 340

313 sh (váll) 4 190

Sav vagy bázis hatására nincs szignifikáns változás.

Infravörös abszorpciós spektrum: lásd 3.ábra eszköz: Nicolex 5DX FT-IR

Fő abszorpciós sávok (KBr, film): 540, 740, 955,990, 1017, 1065, 1080, 1118, 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 1440, 1690, 1705, '735, 2900, 2920, 2930, 2970, 3450 cm^-1Tömegspektrum: lásd 5. ábra eszköz: Finigan 4500 TSQ módszer: gyors atom bombázás (FAB) ionizáció

Mátrix	m/z	Mólekula ion	Relatív abundancia
glicerin	856	LM+h]⁺+	100%
glicerin + NaCl	878	[M+Na]	100%
dithiotreitol:ditioerit-
ritol	856	[μ+ηΓ	100%

(3:1) (s:s) eszköz: Kratos MS-50 nagy feloldóképességű FAB (m/z):

[M+H] +=856,3362 molekulatömeg: vélhetően m.s. = 855 (a fenti tömegspektrum adatokra alapozva) Elemösszetétel: C₃₆H₆|N₃Oi₄S₃(a fenti nagy-feloldású adatokra alapozva) Proton mágneses rezonancia spektrum: lásd

7. ábra eszköz: WM 360 Bruker oldószer: CDC1₃

Ή NMR 360 MHz δ (ppm): 6,54 (1H, dd, J=7,7, 7,0); 6,21 (1H, brs); 5,87 (1H, d, J=9,6); 5,78 (1H, dd, J=9,6, 1,5); 5,66 (1H, brd, J=2,9); 4,94 (1H, dd, J=10,3, 1,8); 4,61 (1H, d, J=7,7); 4,25 (1H, s); 4,09 (1H, 4 q; J=2,6); 3,97 (1H, t, J=9,6); 3,92—3,53 (10H), 3,45 (1H, dt, J=10,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (IH, m); 2,69 (1H, dt, J=9,9, 5,2);

2.49 (IH, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 55 2,30 (2H, m); 2,13 (IH, m); 2,09 (3H, s);

1.50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); 1,08 (6H).

^HC mágneses rezonancia spektrum: lásd

9. ábra eszköz: WM 360 Bruker oldószer: CDC1₃ ^,3C NMR 90,6 MHz δ (ppm): 13,7, 17,5,

19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2, 35,2, 39,5, 47,7,

52.7, 55,8, 56,1, 57,7, 62,4, 64,7, 67,4, 69,3,

69.8, 71,9, 76,1, 77,1, 77,7, 79,7, 83,2, 88,4, ^bí> 97,3, 99,7, 123,4, 124,6, 130,1, 193,1.

-4197915

A BBM-1675D fizikai-kémiai tulajdonságai Megjelenés: amorf szilárd anyag Ultraibolya abszorpciós spektrum:lásd2.ábra eszköz: Hawlett-Packard 8458 oldószer: metanol koncentráció:

max.(nm)

214

274

325

0,01 g/l abszorpciók 27 000 12 800 5 400

Sav vagy bázis hatására nincs szignifikáns változás:

Infravörös abszorpciós spektrum:lásd4.ábra eszközök: Nicolet 5DX FT-IR

Fő abszorpciós sávok (KBr, film): 735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150, 1195, 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 1720, 1735, 2880, 2930, 2960, 3400 cmTömegspektrum: lásd 6. ábra eszköz: Finigan 4500 TSQ módszer: gyors atom bombázás (FAB) ionizáció mátrix: tioglicerol molekuláris ion (m/z): [M+H]^=696 relatív abundancia: 100% eszköz: Kratos MS-50 nagy feloldáséi FAB (m/z):

[M-f-H] +=696,2794 molekulatömeg: vélhetően m.s. = 695 (a fenti tömegspektrum adatokra alapozva) Elemösszetétel: C₂₉H₄₉N₃O_I2S₂(a fenti nagy feloldáséi adatára alapozva)

Az [M+H] ⁺ és [ (M+H) +2]⁺ relatív abudanciák korrelációja számított értékükkel igazolja a nagy feloldású-FAB mérésekből kapott elem-összetételt.

Proton mágneses rezonancia spektrum: lásd

8. ábra eszköz: WM 360 Bruker oldószer: CDC1₃+IO% CD₃OD ’H NMR 360 MHz δ (ppm): 6,43 (1H, dd, J=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J= =8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5,48 (1H, 6 brs); 4,48 (1H, d, J=8,l); 4,02 (1H, d, J=2,0);

3,95—3,80 (oldószer háttér); 3,77 (IH, t,

J=9,0); 3,70—3,40 (11H, brm); 3,35 (IH, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66—2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23—2,12 (2H, m); 1,42 (IH, brdt); 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d, J=6,6); 0,87 (3H, d, J=5,9).

¹³C mágneses rezonancia spektrum: lásd 10A és 10B ábrák eszköz: WM 360 Bruker oldószer: CDCI₃+10% CD₃OD ^,3C NMR 90,6 MHz δ (ppm): 17,5, 21,6,

22.2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4, 52,3, 55,8, 62,1,

67.8, 69,8, 70,1, 71,3, 75,8, 77,1, 78,1, 82,4,

83.3, 88,2, 97,4, 99,6, 122,6, 124,8, 130,1,

130.8, 134,3, 148,7, 192,8.

A BBM-1675 anyagok biológiai tulajdonságai

A BBM-1675 anyagok antimikrobiális hatását számos Gram-pozitív és Gram-negativ mikroorganizmussal szemben vizsgáltuk. Az I. táblázat egy olyan antimikrobiális szűrő eljárás eredményeit mutatja, amelyben a kiindulási BBM-1675A, komponens és a találmány szerinti BBM-1675C és BBM-1675D anyagok hatását vizsgáltuk. A vizsgálati eljárás során minden vizsgált anyag egységesen 10 gg/ml koncentrációjéi oldatával átitattunk egy papír csíkot, majd ezt a növesztett tenyészetbe helyeztük, és az antibiotikus aktivitás mértékéül a papír csíkon megfigyelt gátlási zónát választottuk. Mint az I. táblázat adataiból látható, a BBM-1675C és D széles spektrumú antimikrobiális hatást mutatott, amely mértékében legalább megegye40 zett a BBM-1675A, komponens hatásával: sőt a BBM-1675C és D anyagok hatékonyabbnak bizonyultak a Gram-negatív mikroorganizmusok inhibitoraiként.

I. táblázat

Vizsgált mikroorganizmus a gátlás zónája (mm)

	BBM-	-1675Ai	BBM-1675C	BBM-1675D
Escherichia coli AS 19	22	52	51
Escherichia coli K	12	13	36	35
Escherichia coli P	1373	12	34	33
Escherichia coli R	Az aseriné	14	35	34
Escherichia coli R	Netrops in	1 1	32	32
Escherichia coli R	Mitomycin C	12	35	34
Escherichia coli R	Bleomycin	16	38	36
Escherichia coli R	Daunomyc in	19	45	44
Escherichia coli R	Neomycin	24	53	52
Escherichia coli RSibiromycin	14	32	30
Escherichia coli R Hedamycin	14	30	25
Escherichia coli R.	Aclacinomycin	15	41	40
Bacillus subtilis ATCC 6633	34	43	41
Klebsiella pneumoniae	17	35	35

-5197915

10

I. táblázat (folytatás)

Vizsgált mikroorganizmus	BBM-1675Ai	a gátlás BBM-1675C	zónája (mm) BBM-1675D
Staphylococcus 209 P	32	47	44
Staphylococcus E. Actinoleukin	33	35	33
Staphylococcus R. Streptonigrin	37	50	48
Staphylococcus faecalís P1377	30	39	38
Streptococcus aureus Smith P	36	47	45
Strapylococcus aureus Smith R	40	55	53
Actinomycin D
Straphylococcus aureus Smith R	1 7	32	31
Aureolic acid
Ac inetobacter	16	33	32
tlicrococcus luteus	35	57	55
Saccharoiayces cerevisiae petite	22	42	43

R = rezisztens az adott antibiotikummal szemben

A P-388 leukémiával szembeni hatás A II. és III. táblázatban közöljük azokon a CDF, egereken kapott kísérleti eredményeket, amelyekbe ÍO⁶ P-388 leukémia ascites sejtet implantáltunk intraperitoneálisan, tumor inokulum formájában, és amelyeket a BBM-1675A,, C vagy D anyagok különböző dózisaival kezeltünk. A vizsgált anyagokat intraperitoneális injekció formájában adagoltuk. Minden dózis esetében hat egérből álló csoportokat kezeltünk, és a kezelést az inokulációt követő napon egyetlen dózissal végeztük. Az egyes kísérleti sorozatokban kontrollként tíz, konyhasó-oldattal kezelt egeret használtunk. A BBM-l675A,-gyel kezelt csoportot a III. táblázatban közvetlen kontrollként tüntetjük fel. Az állatokat 30 napig figyeltük, minden egér csoportra meghatározva az átlagos túlélési időt, és feljegyeztük az 5-napos periódus végén még életben lévő állatok számát. Az egereket a kezelés előtt, majd a negyedik napon ismét megmértük. A tömegváltozást a gyógyszer toxicitása mértékének tekintettük. 20 g tömegű egereket használtunk, és a kb. 2 g-ig terjedő tömegveszteséget nem tekintettük jellemzőnek. A vivőanyaggal kezelt állatok (kontroll) rendszerint kilenc napon belül elhullottak. Az eredményeket T/C % formájában határoz25 tűk meg, ami a kezelt csoport átlagos túlélési idejének aránya a vivőanyaggal kezelt kontroll csoportéhoz viszonyítva, százalékban kifejezve. Egy 125-el azonos vagy ennél nanyobb T/C % érték arra utal, hogy szignifikáns tumor-ellenes hatás jelentkezett. A II. táblázatban megadott vizsgálati eredmények a BBM-1675C anyag kezdetben váratlan szin³⁵ tű tumor-ellenes hatását mutatják. A III. táblázatban a BBM-1675A, (esperamicin A,) és a BBM-1675C és D anyagok közvetlen összehasonlításának adatait tüntetjük fel. Az adatok azt mutatják, hogy a BBM-1675C hatásában körülbelül összevethető a BBM-1675A, hatásával, mind erősségét, mind antitumor hatását tekintve, és a hatás nem függ a kísérleti sorozattól. A BBM-1675D pedig csak kismértékben kevésbé hatékony.

Ezen felül, a találmány szerint a BBM1675C és BBM-1675D anyagok a BBM1675A₂ (esperamicin A₂) komponensből is előállíthatok. A saját, BBM-1675C és BBM1675D anyagra kapott vizsgálati eredményeink és a 2 141 425. számú nagy-britanniai szabadalmi leírásban közzétett adatok összevetéséből az a meglepő tény tűnik ki, hogy a BBM-1675C és D hatékonyabb tumor-ellenes szerek, mint a kiindulási BBM-1675A₂komponens, amelyből származnak.

-6197915

II. táblázat

A BBM-1675C hatása P-388 leukémiára 1 . napi kezelés

Dózis IP	MST	MST hatás AWC	túlélők
Vegyület mg/kg/inj.	napok	% T/C 4. nap	5. nap
BBM-1675C 3,2	TOX	TOX	0/6
0,8	TOX	TOX	0/6
0,2	TOX	• TOX	0/6
0,05	TOX	TOX -1,8	1/6
0,0125	11,0	122 -2,5	5/6
0,003125	13,5	150 -2,5	6/6
Vivöanyag	9,0	100 0,4	10/10
Tumor inokulum: 10⁶ ascites sejt i.p	. implantálva
Gazda: CDFj hím egerek
Kiértékelés: MST= a túlélési	idő közepéiteké
Hatás: % T/C = (MST kezelt/MST kontroll) x 100
Feltetel: 2 T/C 125-et tekintjük s	zignifikans anti-tumor hatásnak<
AWC: átlagos tömegváltozás (kezelt -	kontroll) g-ban (a 4. napon)
TOX: toxikus adag (6 egérből	nem maradt legalább 4 túlélő)
	III.	táblázat
A BBM-1675 anyagok	batasa P-388 leukémiára

Vegyület	Kezele'sí mód	Dozzis IP mg/kg/inj.	MST napok	MST hatás	AWC 4. nap	Túlélők 5. nap
BBM-1675Ai	d. 1	0,0512	TOX	TOX		0/6
		0,0256	TOX	TOX	-	0/6
		0,0128	TOX	TOX	-1,8	3/6
		0,0064	15,5	1 72	-0,3	6/6
		0,0032	15,0	167	-0,6	6/6
		0,0016	15,5	1 72	0,6	6/6
		0,0008	12,5	139	0,3	6/6
		0,0004	12,0	133	1,4	6/6
		0,0002	1 1,0	122	0,8	6/6
		0,0001	11,5	128	1,4	6/6
BBM-1675C	d. 1	0,0256	TOX	TOX	-	0/6
		0,0128	TOX	TOX	-0,8	3/6
		0,0064	11,5	128	-0,3	6/6
		0,0032	14,5	161	-0,1	6/6
		0,0016	10,5	117	0,0	6/6
		0,0008	12,0	133	0,3	6/6
		0,0004	11,5	128	0,8	6/6
		0,0002	11,0	122	1,4	6/6
		0,0001	11,0	122	0,8	6/6
		0,0005	10,5	1 1 7	1,3	6/6
BBM-1675D	d. 1	0,0256	9,0	100	0,1	6/6
		0,0128	11,5	128	0,3	6/6
		0,0064	12,5	139	0,3	6/6
		0,0032	12,0	133	0,1	6/6
		0,0016	11,5	128	0,8	6/6
		0,0008	10,0	1 1 1	0,2	6/6

-7197915

III. táblázat (folytatás)

A BBM-1675 anyagok hatása P-388 leukémiára

Kezelési Dózis IP MST MSI AWC Túlélők

Vegyület	mo'd	mg/kg/inj. na	pok ha	itás 4.	nap 5.	nap
			0,0004	10,0	11 1	0,5	6/6
			0,0002	9,5	106	1,7	6/6
			0,0001	9,5	106	1,7	6/6
			0,00005	9,0	100	2,0	6/6
BBM-1675C	d.	1 5	0,0032	16,0	178	-1,3	6/6
			0,0016	13,5	150	-0,3	6/6
			0,0003	13,5	150	-0,3	6/6
			0,0004	12,0	133	-0,4	6/6
			0,0002	12,0	133	-0,4	6/6
			0,0001	1 1,0	122	-0,4	5/6
			0,00005	11,0	122	0,9	6/6
			0,000025	8,5	94	2,2	6/6
			0,0000125	8,0	89	2,4	6/6
			0,00000625	8,0	89	2,4	6/6
Vivőanyag			-	9,0	100	2,4	10/10

Tumor inokulum: 10⁵ ascites cells i.p. implantálva

Gazda: CDFi nőstény egér

Kie'rtékelés: MST = túlélési idő középértéke

Hatás: 7. T/C = (MST kezelt/MST kontroll) x 100

Feltétel: T/C ^125-et tekintjük szignifikáns anti-tumor hatásnak

AWC: átlagos tömegváltozás (kezelt-kontroll) g (a 4. napon) d.1. csak a kísérlet 1. napján beadott adag

d. 1-5: a kísérletnek mind az 5 napján beadott adag

A B16 melanomával szembeni aktivitás 40

A IV. táblázatban olyan tumor-ellenes vizsgálatok eredményeit foglaljuk össze, amelyeket egérben nőtt B16 melanomán végeztünk. A vizsgálatokhoz BDF, egereket használtunk, amelyeket szubkután úton inokuláltünk a tumor implantátummal. 60 napos jegyzőkönyvet használtunk. Minden vizsgált dózisra tíz egérből álló csoportokat használtunk, és meghatároztuk az egyes csoportok esetében az átlagos túlélési időt. A kontroll 50 állatok, amelyeket a kezelt állatokkal azonos módon, de injekciós vivőanyaggal inokulálIV. táblázat

A BBM-1675 anyagok hatása

1,5 es 9. napi k *unk, 22,5 napos átlagos túlélési időt mutattak. Minden dózis esetében a vizsgált állagokat intraperitoneális injekció formájában az I., 5. és 9. napon kezeltük a vizsgált vegyületekkel. A 125-tel azonos vagy ennél nagyobb T/C % érték azt jelenti, hogy szignifikáns ⁺ umor-ellenes hatást értünk el. A IV. táblázatban feltüntetett eredmények azt mutatják, hogy a BBM-1675C közvetlen összehasonlí'ásban a B16 melanomát hordozó egerek esetében is hatékony volt, és hatása összevethető volt a BBM-1675A, hatásával.

B16 melanomára zelesek

Vegyület	Dózis mg/kg/inj.	MST napok	MST hatás	AWC 12. nap	túlélők 10. nap
BBM-1 675Ai	0,0032	37,5	167	0,3	10/10
	0,0016	37,5	167	0,3	10/10

-8197915

IV. táblázat (folytatás)

Vegyület	Dózis mg/kg/inj.	MST napok	MST hatás	AWC 12. nap	túlélők 10. nap
	0,0008	38,5	171	1,4	10/10
	0,0004	37,0	164	1,8	10/10·
	0,0002	34,5	153	2,0	10/10
	0,0001	32,0	142	1,9	10/10
BBM-1675C	0,0008	31,5	140	0,6	10/10
	0,0004	37,0	164	1,2	10/10
	0,0002	31,0	138	0,6	10/10
	0,0001	31,5	140	1,0	10/10
	0,00005	27,5	122	0,8	10/10
	0,000025	25,0	111	0,5	10/10
Vivöanyag	—	22,5	100	0,3	10/10

Tumor inokulum: 0,5 ml 10% brei IP

Gazda: BDFi nőstény eger

Kiértékele's: MST = középes túlélési idő

Hatás: % T/C = (MST kezelt/MST kontroll) x 100

Feltelel: % T/C 7/ 125-et szignifikáns tumorellenes aktivitásnak tekintjük. AUC: átlagos tömegváltozás (kezelt-kontroll) g (a 12. napon)

Amint a fentiekben ismertetett antimikro- 30 biális és egér tumor adatok mutatják, a BBM-1675C és BBM-1675D hasznos antibiotikumok fertőző betegségben szenvedő emlősök és más állatok kezelésében, és egyben tumor-ellenes szerek, amelyek terápiásán gá- 35 tolják emlősök tumorainak növekedését.

Ezért a találmány szerinti vegyületek alkalmasak mikrobiális fertőzésben szenvedő állatok vagy rosszindulatú daganatot hor- 40 dozó állatok kezelésére, amely abban áll, hogy az állatokat a BBM-1675C vagy BBM-1675D antimikrobiális vagy tumor-ellenes hatás szempontjából hatásos mennyiségével vagy egy megfelelő gyógyszerkészítménnyel 45 kezeljük.

A találmány kiterjed olyan gyógyszerké_:szítmények előállítására is, amelyek a BBM-1675C vagy a BBM-1675D hatásos antimik- 50 robiális vagy tumorgátló mennyiségét tartalmazzák, inért, gyógyászatilag elfogadható vivőanyagok vagy hígítóanyagok kíséretében. Az ilyen készítmények egyéb hatásos antimikrobiális vagy tumor-ellenes szereket 55 is tartalmazhatnak, és kiszerelhetők bármely, a kívánt adagolási módnak megfelelő gyógyszerkészítmény formájában, ilyen készítmények lehetnek például szilárd, orális adagolásra alkalmas készítmények, így tabletták, θθ kapszulák, pirulák, porok és granulátumok, orális adagolásra alkalmas folyékony készítmények, így oldatok, szuszpenziók, szirupok vagy elixirek, és parenterális adagolásra alkalmas készítmények, így steril vizes vagy nem-vizes oldatok, szuszpenziók vagy emuiziók. Kiszerelhetők olyan steril szilárd készítmények formájában is, amelyek steril vízben fiziológiás sóoldatban vagy más steril, injektálható közegben közvetlenül alkalmazás előtt feloldhatók.

Antimikrobiális szerként történő felhasználásra a BBM-1675C-Í vagy BBM-1675D-Í vagy ezeket tartalmazó gyógyszerkészítményeket úgy adagoljuk, hogy a hatóanyag-koncentráció nagyobb legyen, mint a kezelni kívánt szervezet esetében a minimális gátló koncentráció. Tumor-ellenes szerként a BBM-1675C és BBM-1675D optimális dózisait egy adott emlős esetében szakember könnyen meghatározhatja. Természetesen a BBM-I675C és a BBM-1675D aktuális dózisa az adott készítménynek, az adagolás módjának és az adott állapotnak, gazda szervezetnek és a kezelni kívánt betegségnek megfelelően széles határok között változhat. Sok a gyógyszer hatását befolyásoló tényezőt, így a kort, súlyt, a kezelt állat nemét, az etetésre használt táplálékot, az adagolás idejét, az adagolás módját, a kiválasztás sebességét, a beteg állapotát, a gyógyszer kombinációkat, a reakció érzékenységét és a betegség súlyosságát is figyelembe kell venni. Az adagolás történhet folyamatosan vagy szakaszosan, a maximálisan elviselhető dózison belül. Adott körülmények között az optimális adagolási mód és dózisok megállapítása szakember számára nem okoz problémát, a fenti útmutatások és szokásos vizsgálatok alapján.

Találmányunkat a következő példákkal szemléltetjük.

-9197915

A BBM-1675C és a BBM-1675D kémiai előállítása és izolálása

1. példa

A BBM-1675A, 50 mg-os mintáját feloldjuk 2,5 ml metanolban, majd hozzáadják hidrogén-klorid 0,1 mólos metanolos oldatának 2,5 ml-ét. A reagáltatást körülbelül 50°C-on végezzük, és a kiindulási anyag eltűnését (körülbelül 30 perc) minden 5—10 percben vékonyréteg-kromatográfiásan (TLC) követjük, szilikagél lapon (Analtech, 250 mikron, GF), az eluáláshoz toluol és aceton 3:2 térfogatarányú elegyét használva. Miután a kiindulási anyag elfogyott, a reakcióelegyet nátrium-hidrogén-karbonát telített metanolos oldatával semlegesítjük, majd csökkentett nyomáson bepároljuk A kapott száraz maradék tartalmazza a bioaktív fragmentumokat. A BMM-1675C-Í „flash“ oszlop-kromatográfiás módszerrel, egy 2 cm belső átmérőjű, 10 cm-es, Woelm szilikagéllel töltött (32—63 mikronos részecske méret) oszlopon izoláljuk a maradékból. Az oszlopot toluol és aceton 3:2 térfogatarányú elegyével eluáljuk, 3 ml-es frakciókat gyűjtve. Minden frakciót TLC-ve! analizálunk (szilikagél, toluohaceton 3:2 tf/tf), és a TLC foltokat 24 nm-es UV fényforrással és ce'rium-szulfát-spray-vel (1% cérium-szulfát és 2,5% molibdénsav 10%-os kénsavban) tesszük láthatóvá. A 6—12. frakciókat összegyűjtjük (Ráérték a BBM-1675Cre 0,28), és szárazra pároljuk. 12 mg (35%) lényegében tiszta BBM-1675C-t kapunk.

A BBM-1675C fizikai-kémiai tulajdonságait már megadtuk a leírásban, az ultraibolya, infravörös, tömeg, ’H-NMR és ^l3C-NMR spektrum adatok pedig az 1,3, 5, 7. és

9. ábrákon szerepelnek.

2. példa

Ha az i. példa szerinti reakcióban növeljük a reakcióidőt, a BBM-1675C mennyisége csökken, és két új termék: a 3. képletű vegyület (Rf=0,65) és a BBM-1675D (Rp az alapszinten marad) (TLC: szilikagél, toluohaceton 3:2 (tf/tf) jelenik meg, és idővel jellemzővé válik.

A BBM-1675D vegyületet, amely szokásosan a BBM-1675C keletkezését kíséri az 1. példában ismertetett kromatográfiás oszlopon izoláljuk, az eluáláshoz kloroform és metanol 5:1 térfogatarányú elegyét használva. Az alkalmas frakciókat összegyűjtjük, és szárazra pároljuk. 18 mg lényegében tiszta BBM-1675D-t kapunk az 1. példában ismertetett reakció eredményeképpen.

A BBM-1675D egy nagyobb foltot ad Rp=0,37-nél a reverz fázisú TLC mérésnél (Whatman MKC_lgF, 200 mikron), az eluáláshoz 30%-os vizes metanol oldatot használva, és R/=0,22-nél normál fázisú szilikagél TLC mérésben, eluálószerként kloroform és metanol 5:0,5 térfogatarányú elegyét használva.

3. példa

A BBM-1675D hozamában lényeges javulás érhető el, ha a BBM-1675A₂ vagy BBM-1675A, kémiai hidrolízise során hidrogén-klorid helyett p-toluol-szulfonsavat használunk, amint ezt a 3. és 5. példák szemléltetik.

A BBM-1675A₂ 15,2 mg-os mintáját 1 ml 0,03 mólos metanolos p-toluol-szulfonsav oldattal hidrolizáljuk körülbelül 63°C-os hőmérsékleten, mintegy egy órán keresztül. Ezután a reakcióelegyet szárazra pároljuk, csökkentett nyomáson, körülbelül 30°C-on. A száraz maradékból a BBM-1675D-Í flash oszlopkromatográfiával izoláljuk, Woelm szilikagéllel töltött oszlopon (részecske méret: 32—63 mikron). Az oszlopot kloroform és metanol 5:0,5 térfogatarányú elegyével eluáljuk, majd az összegyűjtött frakciókat TLC-vel analizáljuk (szilikagél, kloroforrmmetanol 5:0,5 tf/ /tf). Az alkalmazott kromatográfiás körülmények között a (2) és (3) inaktív vegyületek elegye (7 mg) elkülöníthető a BBM-1675D bioaktív anyagtól, amelynek R/-értéke 0,22. Az alkalmas frakciókat összegyűjtjük és szárazra pároljuk. 8 mg lényegében tiszta BBM-1675D-t kapunk, csaknem kvantitatív kitermeléssel.

A BBM-1675D fizikai-kémiai tulajdonságait már megadtuk. Ultraibolya, infravörös, tömeg, Ή-NMR és ¹³C-NMR spektruma a 2, 4, 6, 8. és 10A és 10B ábrákon látható.

4. példa

A BBM-1675A₂ 40 mg-os mintáját hidrogén-klorid 0,5 mólos metanolos oldatának 5 ml-ével kezeljük, körülbelül 50°C-on, 2 órán keresztül, az 1. példában ismertetett általános eljárást és izolálást módszert követve. Nátrium-hidrogén-karbonáttal végzett semlegesítés és szárazra párlás után a BBM-1675C-t flash oszlop-kromatográfiával izoláljuk a maradékból (Woelm szilikagéllel töltött oszlop, 32—63 mikronos részecskeméret, toluohaceton 3:2 tf/tf). Az alkalmas frakciókat egyesítjük és szárazra pároljuk. 8,4 mg lényegében tiszta BBM-1675C-t kapunk, amely azonos az 1. példában izolált termékkel.

A fenti kromatográfiás oszlopot ezután kloroform és metanol 5:0,25 térfogatarányú elegyével eluáljuk, és az összegyűjtött frakciókat szárazra pároljuk. BBM-1675D-t kapunk. A BBM-1675D-t újabb flash kromatográfiás oszlopon (szilikagél, kloroforrmmetanol 5:0,5 tf/tf.) tovább tisztítjuk. Az alkalmas frakciókat összegyűjtjük és szárazra pároljuk. 6,3 mg lényegében tiszta BBM-1675D-t kapunk, amely azonos a 3. példában kapott termékkel.

5. példa

A BBM-1675A, 49,3 mg-os mintáját 1,5 ml 0,03/ mólos metanolos p-toluol-szulfonsav oldattal hidrolizáljuk, körülbelül 60°C-on, 1,5 órán keresztül. A reakcióelegyet csökkentett nyomáson és körülbelül 30°C-on szárazra pá-10197915 roljuk, amikor a BBM-1675D-t, az 1. és 3. inaktív vegyületeket tartalmazó maradékot kapunk. A BBM-1675D bioaktív anyagot flash oszlop-kromatográíiásan izoláljuk a maradékból, Woelm szilikagéllel töltött oszlopon (32—63 mikronos részecskeméret), eluensként kloroform és metanol 5:0,25 térfogatarányú elegyét használva. Az alkalmas frakciókat összegyűjtjük, és szárazra pároljuk. 27 mg lényegében tiszta BBM-I675D-Í kapunk amely azonos a 3. példában izolált termékkel.

6. példa

A BBM-1675C 5,1 mg-os mintáját 1 ml

0,5 mólos metanolos hidrogén-klorid oldattal hidrolizáljuk, körülbelül 40—50°C-on, egy éjszakán keresztül. Nátrium-hidrogén-karbonáttal végzett semlegesítés és szárazra párlás után a BBM-1675D bioaktív anyagot flash oszlop-kromatográfiával izoláljuk a maradékból, Woelm szilikagéllel töltött oszlopon (32—63 mikronos részecskeméret), eluálószerként kloroform és metanol 5:0,25 térfogatarányú elegyét használva. Az alkalmas frakció összegyűjtésével lényegében tiszta BBM-I675D-Í eredményez, amely azonos a 3. példában izolált termékkel.

7. példa

Ha az 1. és 2. példában leírt eljárást ismételjük, de kiindulási anyagként BBM-1675A, helyett egy BBM-1675A,-et és BBM-1675A₂-t tartalmazó elegy ekvimoláris menynyiségét használjuk, BBM-1675C és BBM-1675D keletkezik.

8. példa

Ha az 5. példa szerinti eljárást ismételjük, de a BBM-1675A, kiindulási anyag helyett egy BBM-I675A,-et és BBM-1675A₂-t tartalmazó elegy ekvimoláris mennyiségét használjuk, a BBM-1675D-hez jutunk.

Claims

1. Eljárás a BBM-I675C tumor-ellenes antibiotikum — amely (a) amorf szilárd anyag formájában jelenik meg;

(b) oldható metanolban, etanolban, etil-acetátban, acetonban, tetrahidrofuránban és kloroformban;

(c) szilikagél vékonyréteg-kromatográfiában 0,28 R/-értéket mutat, oldószer-rendszerként toluol és aceton 3:2 térfogatarányú elegyét használva;

(d) nagy feloldási FAB tömegspektrumetriásan meghatározva 855 molekulatömeget mutat;

(e) metanolban felvett ultraibolya spektruma az 1. ábrán feltüntetett, amely 210 nm (a=21 770), 274 nm (a=9 340) és 313 nm (váll) (a=4 190) értékeknél mutat ultraibolya abszorpciós maximumot, amely sav vagy bázis hozzáadására nem mutat szignifikáns változást;

(f) infravörös abszorpciós spektruma (KBr, film) a 3. ábrán feltüntetett, és a következő értékeknél mutat alapvető abszorpciós csúcsokat:

540, 740, 955, 990, 1017, 1065, 1080, 1118, 1150, 1250, 1305, 1325, 1340, 1370, 1385, 1440, 1690, 1705, 1735, 2900, 2920, 2930, 2970 és 3450 cm-';

(g) kis felbontású tömegspektruma az 5. ábrán feltüntetett, amely 856-os (M+H) ⁺molekula iont mutat (h) 360 MHz-es mágneses rezonancia spektruma CDCl₃-ban a 7. ábrán megadott, amely a következő jeleket mutatja:

6,54 (IH, dd, J=7,7, 7,0); 6,21 (IH, brs); 5,87 (IH, d, J=9,6); 5,78 (IH, dd, J= =9,6, 1,5) 5,66 (IH, brd, J=2,9); 4,94 (IH, dd, J=10,3, 1,8); 4,61 (IH, d, J= =7,7); 4,25 (IH, s); 4,09 (IH, q, J=2,6); 3,97 (IH, t, J=9,6); 3,92—3,53 (10H), 3,45 (IH, dt, J=I0,3, 4,0); 3,37 (3H, s); 2,77 (IH, m); 2,69 (IH, dt, J=9,9, 5,2);

2.49 (IH, dd, J=10,3, 2,6); 2,48 (3H, s); 2,30 (2H, m), 2,13 (IH, m); 2,09 (3H, s);

1.50 (2H, m); 1,37 (3H, d, J=5,9); 1,32 (3H, d, J=6,3); és 1,08 (6H) ppm (tetrametil-szilán);

(i) 90,6 MHz-nél C-13 mágneses rezonancia spektruma CDCl₃-ban a 9. ábrán feltüntetett, amely a kővetkező jeleket tartalmazza:

13.7, 17,5, 19,8, 22,3, 22,7, 23,5, 34,2,

35,2, 39,5, 47,7, 52,7, 55,8, 56,1,57,7, 62,4,

64.7, 67,4, 69,3, 69,8, 71,9, 76,1, 77,1,

77.7, 79,7, 83,2, 88,4, 97,3, 97,3, 99,7,

123,4, 124,6, 130,1 és 193,1 ppm (tetrametil-szilán) — valamint a BBM-1675D tumor-ellenes antibiotikum — amely (a) amorf szilárd anyag formájában jelenik meg;

(b) oldható metanolban, etanolban, acetonban tetrahidrofuránban, kissé oldódik kloroformban.

(c) szilikagél vékonyréteg-kromatográfiásan 0,22 Rf értéket mutat, oldószer-rendszerként kloroform és metanol 5:0,5 térfogatarányú elegyét használva, és fordított fázisú szilikagél vékonyréteg-kromatográfiásan meghatározva Rf-értéke 0,37, oldószer-rendszerként metanol és víz 70:3 térfogatarányú elegyét használva;

(d) nagy feloldású FAB tömegspektrométerrel meghatározva molekulatömege 695nek adódik;

(e) metanolos oldatban felvett ultraibolya abszorpciós spektruma a 2. ábrán feltüntetett, amely 214 nm (a=27 000), 274 nm (a=12 800) és 325 nm (a=5400) értékeknél mutat abszorpciós maximumot, amely sav vagy bázis hozzáadására nem mutat szignifikáns változást;

(f) infravörös abszorpciós spektruma (KBr, film) lényegében a 4. ábra szerinti, amely a következő értékeknél mutat alapvető abszorpciós csúcsokat:

735, 755, 910, 960, 1000, 1020, 1085, 1150,

-11197915

1195, 1250, 1310, 1335, 1365, 1385, 1445, 1510, 1685, 1720, 1735, 2880, 2930, 2960 és 3400 cm^-1;

(g) kis felbontású tömegspektruma a 6. ábrán megadott, amely 696-os (M-(-H) ⁺molekula iont mutat;

(h) 360MHz-en meghatározott proton mágneses rezonancia spektruma CDC1₃+1O% CD₃OD-ben a 8. ábra szerinti, amely a következő értékeknél mutat jeleket:

6,43 (1H, dd, J=4,4, 10,3); 6,13 (1H, s); 5,81 (1H, d, J=8,8); 5,70 (1H, d, J=8,8); 5,48 (1H, 6 brs); 4,48 (1H, d, J=8,l); 4,02 (1H, d, J=2,0); 3,95—3,80 (oldószer háttér); 3,77 (1H, t, J=9,0); 3,70— 3,40 (11H, brm); 3,35 (1H, m); 3,28 (3H, s); 3,22 (3H, brs); 2,66—2,55 (2H, m); 2,38 (3H, s); 2,23—2,12 (2H, m); 1,42 (1H, brdt); 1,22 (3H, d, J=5,9); 0,94 (3H, d,J=6,6); és 0,87 (3H, d, J= =5,9) ppm (tetrametil-szilán) (i) 90,6 MHz-es C-13 mágneses rezonancia spektruma CDC1,₃+1O% CD₃OD-ban a

10. ábra szerinti (10A+10B ábra) amely a következő értékeknél mutat jeleket:

17.5, 21,6, 22,2, 23,0, 33,4, 39,2, 46,4,

52,3, 55,8, 62,1, 67,8, 69,8, 70,1, 71,3,

75,8, 77,1, 78,1, 82,4, 83,3, 88,2, 97,4,

99.6, 122,6, 124,8, 130,1, 130,8, 134,3, 148,7 és 192,8 ppm (tetrametil-szilán) — előállítására, azzal jellemezve, hogy a BBM-1675A, vagy BBM-1675A₂ antibiotikumot vagy ezek elegyét ásványi vagy szerves savval — adott esetben fokozatosan, szelektív módon — hidrolizáljuk, és a képződött BBM-1675C és BBM-1675D antibiotikumot — célszerűen kromatográfiával — elkülönítjük; és kívánt esetben a képződött BBM-1675C

5 antibiotikumot további ásványi vagy szerves savas hidrolízissel BBM-1675D antibiotikummá alakítjuk át.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás BBM-1675C antibiotikum előállítására, azzal jel10 lemezve, hogy a fokozatos — előnyösen ásványi savval lefolytatott — hidrolízis során elsőként keletkező BBM-1675C antibiotikum képződése után a hidrolízist megszakítjuk és a képződött BBM-1675C antibiotikumot

15 a reakcióelegyből — célszerűen kromatográfiával — elkülönítjük.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás BBM-1675D antibiotikum előállítására, azzal jellemezve, hogy a fokozatos — előnyösen szer20 vés savval, különösen p-toluol-szulfonsavval lefolytatott — hidrolízist a BBM-1675C antiobiotikum képződése után illetőleg az abból keletkező BBM-1675D antibiotikum képződéséig folytatjuk, és a képződött BBM-1675D

25 antibiotikumot a reakcióelegyből kinyerjük.

4. Eljárás gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1—3. igénypontok bármelyike szerint előállított BBM3Q -1675C vagy BBM-1675D antibiotikumot gyógyászati szempontból elfogadható vivőanyaggal és/vagy egyéb gyógyszerészeti vivőanyaggal összekeverve gyógyszerkészítménynyé alakítjuk.