NL8503055A - Werkwijze voor het vergroten van de vruchtbaarheid van zeugen. - Google Patents

Description

/ i/1 - * /'' ' ƒ (

Werkwijze voor het vergroten van de vruchtbaarheid van zeugen.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het vergroten van de vruchtbaarheid van zeugen, in het bijzonder van onvolwassen zeugen, zoals jonge vrouwtjes varkens ("gilts").

5 Vanwege het grote economische belang daarvan zijn onderzoekingen op de vermenigvuldigingsbiologie van levende have (huisdieren, vee) gedurende lange tijd gericht geweest op processen, onder toepassing waarvan de vruchtbaarheid van boerderij-dieren kan worden gemanipu-10 leerd.

Aangetoond is dat de ovulatie-snelheid (ovu-latie-mate) van schapen kan worden vergroot door immunisering van de schapen tegen steroïde androgenen of steroide oestrogenen, bijvoorbeeld onder gebruikmaking van conjugaten 15 van steroide androgenen of steroide oestrogenen met immuno gene proteïnen.

Bij volwassen zeugen is de factor, die de vruchtbaarheid (dat wil zeggen de grootte van de worp) beperkt, dikwijls eerder de uterus-capaciteit dan de ovulatie-20 snelheid, zoals het geval is bij vrouwtjes schapen (ooien).

Bij onvolwassen zeugen, zoals jonge zeugen ("gilts"), dat wil zeggen jonge vrouwtjes varkens met een lagere ovula-tie-snelheid dan volwassen zeugen, is dit niet altijd het geval. Aldus neemt bijvoorbeeld bij het jonge vrouwtjes var-25 ken de ovulatie-snelheid toe met de toenemende sexuele leef tijd (aantal oestrus-cycli) tot ongeveer de vierde post-pubertale oestrus (bronst); een zeug kan bij haar eerste na-drachtigheidsoestrus (bij de eerste oestrus na de worp van biggen) een verminderde ovulatie-snelheid vertonen als 30 gevolg van haar verminderde voedingstoestand bij de eerste zoging (melkafscheiding), een effect, dat de zwaardere volwassen zeug niet vertoont. Gebleken is dat in het geval van « * - 2 - onvolwassen zeugen de vruchtbaarheid kan worden vergroot door vergroting van de ovulatie-snelheid en in feite kan het vergroten van de ovulatie-snelheid van volwassen zeugen eveneens voordelig zijn.

5 Gevonden werd nu dat het mogelijk is de uterus-capaciteit meer volledig te benutten door vergroting van de ovulatie-snelheid van zeugen, in het bijzonder onvolwassen zeugen, en uiteindelijk hun vruchtbaarheid, door immunisering van de zeugen tegen één of meer steroide andro-10 genen of steroide oestrogenen, bijvoorbeeld onder gebruik making van conjugaten van dergelijke sterolden met immunogene dragers.

Volgens één aspect van de onderhavige uitvinding wordt aldus voorzien in een werkwijze voor het ver-15 groten van de ovulatie-snelheid bij een zeug, hierdoor ge kenmerkt, dat men deze zeug immuniseert tegen één of meer steroide androgenen of steroide oestrogenen.

Het zal duidelijk zijn dat de lagere ovulatie-snelheid van onvolwassen zeugen een natuurlijk verschijnsel 20 is en dat de immunisering volgens de uitvinding het effect heeft van het verhogen van de natuurlijke ovulatie-snelheid van dergelijke dieren tot een hoger niveau.

De hier gebruikte uitdrukking "steroide androgenen" omvat iedere steroide stof, die het tot uiting 25 komen van de secundaire geslachtskenmerken van het manne tjesdier stimuleert. De androgene activiteit kan worden vastgesteld door meting van de hergroei van de gekrulde ("involuted") kam van een gecastreerde haan na de andro-geen-toediening of door meting van de groei-respons van de 30 zaadblaasjes bij gecastreerde mannetjesratten na de andro- geen-toediening. De hier gebruikte uitdrukking "steroide oestrogenen" omvat iedere steroide stof, die het tot uiting komen van de secundaire geslachtskenmerken bij het vrouwtjesdier stimuleert. De oestrogene activiteit kan worden vast-35 gesteld door meting van de uterus-groei of de verhoorning van het vaginale epitheel na de oestrogeen-toediening aan * + - 3 - gesteriliseerde vrouwtjesratten of -muizen.

Een immunogeen conjugaat tussen een immunogene drager en een steroid androgeen-derivaat of een steroid oestrogeen-derivaat ten gebruike bij een werkwijze 5 volgens de onderhavige uitvinding kan volgens een in de techniek bekende methode worden bereid (zie bijvoorbeeld Britse octrooischrift 2.071.107 (CSIRO)). Geschikte steroi-de androgeenderivaten zijn bijvoorbeeld onder andere derivaten van androst-4-een-3.17-dion (androsteendion) of 10 testosteron. Geschikte steroide oestrogeen-derivaten zijn bijvoorbeeld onder andere derivaten van oestron.

Aldus worden voorkeursimmunogenen bereid door conjugering van een immunogene drager, bijvoorbeeld een immunogeen proteïen, met anörosfe-4-een-3.17-dion-derivaten, 15 die bijvoorbeeld gefunctionaliseerd zijn met een zuurgroep op de 1-, 7-, 11- of 15-plaats van de steroid-ring.

Voor de bereiding van immunogenen tegen testosteron kunnen testosteron-derivaten, gefunctionaliseerd met een zuurgroep op de 3- of 17-plaats worden ge-20 bruikt.

Het steroide androgeen-derivaat kan aldus testosteron-3-carboxy-methyloxim of meer bij voorkeur lla-hydroxy-androst-4-een-3.17-dion-lΙα-hemisuccinaat of 7a-(2-carboxyethylthio)androst-4-een-3.17-dion zijn.

25 De bevoorkeurde oestron-derivaten zijn die welke na de con jugering met proteïen en de toediening aan een dier een oestron-specifiek antilichaam vormen. Niet-beperkende voorbeelden van dergelijke oestron-derivaten, die reeds in de techniek bekend zijn, zijn onder andere oestron-3-hemi-30 succinaat, oestron-3-carboxymethylether, oestron-6-carboxy- methyloxim en 15-carboxymethyloestron. Het steroide oestrogeen-derivaat is bij voorkeur oestron-3-carboxymethylether.

De immunogene drager zal in het algemeen een proteïen met hoog molecuulgewicht, dat antigeen voor het 35 dier is, zijn. Zekere in de natuur voorkomende antigene proteïnen zijn in het bijzonder van belang, bijvoorbeeld • * - 4 - homologe en heterolcge serumalbuminen en -thyroglobulinen. In het algemeen geniet menselijk serumalbumine de voorkeur.

In het algemeen kunnen de immunogene pro-dukten bovendien een adjuvans, in het bijzonder diethyl-5 aminoethyldextraan, bevatten, maar ieder in de techniek bekend geschikt adjuvans kan worden gebruikt.

Een aspect van de uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het vergroten van de ovula-tie-snelheid bij zeugen, in het bijzonder onvolwassen 10 zeugen, welke omvat de toediening aan de zeugen van een immunogeen produkt, bevattende ten minste één immunogeen conjugaat tussen een immunogene drager en een androgeen sterold-derivaat of een oestrogeen steroïd-derivaat.

Een verder aspect van de onderhavige uit-15 vinding heeft betrekking op een werkwijze voor het ver groten van de ovulatie-snelheid van een kudde van zeugen, welke omvat het immuniseren van de zeugen in de kudde, in het bijzonder de onvolwassen zeugen, tegen één of meer steroide androgenen of steroide oestrogenen.

20 Volgens een verder aspect van de onderha vige uitvinding wordt voorzien in een werkwijze voor het vergroten van de vruchtbaarheid van zeugen, in het bijzonder onvolwassen zeugen, hierdoor gekenmerkt, dat men de zeugen immuniseert tegen één of meer steroide androgenen 25 of steroide oestrogenen voor het begin van de parings- periode, waardoor gedurende de paringsperiode steroïd-bindende antilichamen aanwezig zijn in deze dieren bij een voldoende hoge titer voor het bewerkstelligen van een aanzienlijke toeneming in de ovulatie-snelheid, maar bij 30 een voldoende lage titer om te verzekeren dat nagenoeg alle dieren een oestrus hebben vertoond voor het eind van deze periode.

Aldus wordt bijvoorbeeld de immuniteit wen-selijkerwijze vergroot, speciaal bij onvolwassen zeugen, 35 zoals jonge vrouwtjes biggen, door immunisering tegen één of meer steroide androgenen of steroide oestrogenen, - 5 - onder vorming van een gemiddelde sterold-bindende anti-iicfcaam-titer van 1 bij 10 tot 1 bij 5C00, bij voorkeur 1 bij 30 tot 1 bij 5000, bij het begin van de parings-periode en onder handhaving van deze titer op zodanige wijze, 5 dat deze ligt in het traject van 1 bij 10 tot 1 bij 1000, bij voorkeur 1 bij 30 tot 1 bij 10.000, bij de afsluiting (het eind) van de paringsperiode.

De steroïd-antilichaam-titers in het geval van de immunisering met een conjugaat tussen een immunogene 10 drager en androsteendion bijvoorbeeld kunnen worden geme ten onder gebruikmaking van een dextraan-beklede houtskool-radioimmunobepalingsprocedure. Seriële verdunningen van plasma worden bereid in buffer en een monster van 300 yil wordt gedurende de nacht gelncubeerd met 100 ul 3 15 (1.2.6.7- H) androsteendion (15.000 desintegraties per minuut: 20-25 picogram) bij 4°C. Na de incubatie worden de gebonden en vrije fracties gescheiden onder gebruikmaking van een met dextraan beklede houtskool-suspensie (500 ^il) en de radioactiviteit in de gebonden fractie, die achter-20 blijft in de bovenstaande vloeistof, wordt geteld in een vloeistof-scintillatie-teller. De androsteendion-antilichaam-titer van het monster is de verdunning van plasma, die 40 % van de toegevoegde totale radioactiviteit bindt.

De te immuniseren dieren zijn wenselijker-25 wijze gezien hun leeftijd in een matige tot goede conditie op het moment van de paring.

In het algemeen zal de begindosis van het hormoon-conjugaat voor de immunisering per dier liggen tussen 0,3-5 mg. Aldus kunnen bijvoorbeeld jonge vrouwtjes 30 varkens, die 100 kg wegen, aanvankelijk 1,2-3,6 mg van het conjugaat en bij voorkeur 2,4 mg van het conjugaat ontvangen. Eén of meer aanjager-doses in geschikte tussenpozen, bijvoorbeeld tussen 14 en 35 dagen, bij voorkeur 21 dagen, kunnen wenselijk zijn teneinde de hierboven aan-35 gegeven sterold-bindende antilichaam-titers te verkrijgen.

De totale effectieve dosis van het hormoon-conjugaat kan - 6 - aldus bijvoorbeeld liggen in het traject van 0,6-8,0 mg.

De toediening van het produkt wordt het meest geschikt parenteraal bewerkstelligd, bijvoorbeeld intradermaal, subcutaan of intramusculair.

5 In het algemeen zal het volume van het pro dukt, dat bij iedere toediening wordt gegeven, liggen in het traject van 1-6 ml, waarbij dit volume bij voorkeur 4 ml bedraagt. De concentratie aan hormoon-conjugaat in het produkt zal in het aLgemeen liggen in het traject 10 van 0,2-5 mg per ml.

Alle reeds bekende immuniseringstechnieken kunnen worden toegepast voor het verkrijgen van de gewenste antisteroid-antilichaam-titers.

De uitvinding wordt verder toegelicht maar 15 niet beperkt door het volgende voorbeeld.

Voorbeeld (a) Bereiding van steroid-protelen-immunogeen-produkt.

Een oplossing van 7a-(2-carboxyethylthio)-androst-4-een-3.17-dion (79 mg) in dioxan (5 ml) werd 20 afgekoeld tot 10°C, geroerd en behandeld met tri-n-butyl- amine (38 mg) en vervolgens met een oplossing van isobutyl-chloorformiaat (28 mg) in dioxan (2,5 ml). Deze oplossing werd gedurende 40 minuten onder nu en dan schudden op ongeveer 10°C gehouden. Deze werd vervolgens over een 25 periode van 2-3 minuten toegevoegd aan een geroerde op lossing van menselijk serumalbumine (HSA) (275 mg) in 0,1 M. fosfaatbuffer (pH 7,8) (10 ml).

Na 24 uren werd de enigszins troebele oplossing gedialyseerd tegen gedestilleerd water, (300 ml , 30 11 x veranderd), gedurende 192 uren bij 5°C. Het reten- taat werd gevriesdroogd, waarbij het steroïd-proteien-conjugaat werd verkregen als een witte schuim (194 mg).

De ultraviolet-absorptie daarvan bij 246 nm kwam overeen met een steroïd-opneming van 26 molen per mol.

35 (b) Bereiding van sterold-proteien-immunogeen-adjuvans- produkt.

>, -·=* - 7 -

Het. bovengenoemde steroïd-proteïen-conjugaat (12 mg) werd tot een pasta verwerkt in 0,9 %'s steriele zoutoplossing (0,2 ml). De pasta werd langzaam verdund met een verdere hoeveelheid 0,9 %'s steriele 5 zoutoplossing, onder kalm roeren, tot een totaal volume van 10 ml. Onderwijl werd een voorraadcplossing van DEAE-dextraan bereid door oplossen van 15 g in gedestilleerd water (100 ml), instellen van de pH op 7,5-7,7 door langzame toevoeging van tris-(hydroxymethyl)-methylamine en 10 vervolgens verdunnen tot 150 ml met gedestilleerd water.

Het immunogeen-adjuvans-produkt werd bereid door toevoeging van 10 ml van de DEAE-dextraan-voorraadoplossing aan de 10 ml conjugaat-oplossing in zoutoplossing.

(c) Immuniserings- en paringsonderzoekingen.

15 Jonge vrouwtjes varkens werden bestemd voor de behandeling bij een leeftijd van 150-170 dagen en in tussenpozen van 14 dagen geïnjecteerd met 2 ml van het steroïd-proteïen-immunogeen-adjuvans-produkt (equivalent aan 1,2 mg androsteendion-menselijk serumalbumine in 20 2 ml DEAE-dextraan als adjuvans). Bloedmonsters werden in tussenpozen verwijderd teneinde te bepalen of antilichamen tegen anörosteendion door de varkens waren gevormd. Uit de resultaten bleek dat een succesvolle antilichaam-vorming werd bewerkstelligd bij 100 % van de behandelde dieren en 25 het traject van de gevormde titers was 1 bij 10 tot 1 bij 5500. De controledieren werden onbehandeld gelaten .

De gemiddelde ± (SEM) leeftijd op het moment van de eerste waargenomen oestrus was 243 ± 7 dagen voor de geïnjecteerde jonge vrouwtjes varkens in vergelijking 30 met 233 ± 5 dagen voor de controle-dieren.

Elk jong vrouwtjes varken ontving daarom 5-7 injecties vóór de natuurlijke paring.

De rekenkundige gemiddelde ± (SEM) anti-lichaam-titers tegen androsteendion gedurende het verloop 35 van de paringsperiode varieerden van 1 bij (in) 626 ± 194 bij dag 230 tot dag 239 tot 1 bij (in) 544 ± 413 bij dag - 8 - 250 tot dag 259.

(d) Grootte van de worp.

Uit de gegevens met betrekking tot de grootte van de worp bleek dat geïmmuniseerde jonge 5 vrouwtjes varkens aanzienlijk (P < 0,05) grotere worpen (10,7 ± 0,7, gemiddelde ± SEM, n = 11 worpen) gaven dan de controle-dieren (9,1 ± 0,5, n = 8 worpen).

' ' ^ !

Claims (19)

1. Werkwijze voor het vergroten van de ovula-tie-snelheid bij een zeug, met het kenmerk, dat men de zeug 5 immuniseert tegen één of meer steroïde androgenen of ste- roïde oestrogenen.

2. Werkwijze voor het vergroten van de ovula-tiesnelheid van een kudde van zeugen, met het kenmerk, dat men de zeugen in de kudde immuniseert tegen één of 10 meer steroide androgenen of steroïde oestrogenen.

3. Werkwijze voor het vergroten van de vruchtbaarheid van zeugen, met het kenmerk, dat men de zeugen vóór het begin van de paringsperiode immuniseert tegen één of meer steroïde androgenen of steroïde oestro- 15 genen, waardoor sterold-bindende antilichamen in deze die ren gedurende de paringsperiode aanwezig zijn bij een voldoende hoge titer voor het bewerkstelligen van een aanzienlijke toeneming in de ovulatie-snelheid, maar bij een voldoende lage titer om te verzekeren dat nagenoeg alle dieren 20 voor het eind van deze periode een oestrus hebben vertoond.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de gemiddelde sterold-bindende antilichaam-titer tussen 1 bij 10 en 1 bij 5000 ligt bij het begin van de paringsperiode en tussen 1 bij 10 en 1 bij 10.000 ligt 25 bij de afsluiting (het eind) van de paringsperiode.

5. Werkwijze voor het vergroten van de ovulatie-snelheid bij zeugen, met het kenmerk, dat men aan de zeugen een immuncgeen produkt, bevattende ten minste één immuncgeen conjugaat tussen een immunogene drager en een 30 androgeen sterold-derivaat of een oestrogeen steroïd- derivaat, toedient.

6. Werkwijze volgens conclusies 1-5, met het kenmerk, dat men de immunisering van een onvolwassen zeug of onvolwassen zeugen bewerkstelligt.

7. Werkwijze volgens conclusies 1-6,met het kenmerk, dat de immunisering wordt bewerkstelligd tegen % c, -ιο - androst-4-een-3.17-dion en/of testosteron of oestron.

8. Werkwijze volgens conclusies 1-7, met het kenmerk, dat de immunisering wordt bewerkstelligd door toediening van een immunogeen conjugaat tussen een immuno- 5 gene drager en een androst-4-een-3.17-dion-derivaat, ge- functionaliseerd met een zuurgroep op de 1-, 7-, 1Ιοί 15-plaats van de steroid-ring.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, dat het androst-4-een-3.17-dion-derivaat 10 lla-hydroxy-androst-4-een-3.17-dion of 7a-(2-carboxy- ethylthio)-androst-4-een-3.17-dion is.

10. Werkwijze volgens conclusies 1-7, met het kenmerk,dat de immunisering wordt bewerkstelligd door toediening van een immunogeen conjugaat tussen een 15 immunogene drager en een testosteron-derivaat, gefunctio- naliseerd met een zuurgroep op de 3- of 17-plaats.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het kenmerk, dat het testosteron-derivaat testosteron-3-carboxymethyloxim is.

12. Werkwijze volgens conclusies 1-7, met het kenmerk, dat de immunisering wordt bewerkstelligd door toediening van een immunogeen conjugaat tussen een immunogene drager en een oestron-derivaat, gefunctionali-seerd op de 3-plaats.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het oestron-derivaat oestron-3-carboxymethyl-ether is.

14. Werkwijze volgens conclusies 8-13, met het kenmerk, dat menselijk serumalbumine de immunogene 30 drager is.

15. Werkwijze volgens een of meer der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat een immunogeen produkt, dat een adjuvans bevat, wordt gebruikt.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, met het 35 kenmerk, dat het adjuvans diethylaminoethyldextraan is.

17. Een immunogeen produkt ten gebruike bij -η - een werkwijze als gedefinieerd in conclusies 1, 2, 3 of 5, omvattende een immunogeen conjugaat tussen een immunogene drager en een steroid androgeen-derivaat of een steroid oestrogeen-derivaat.

18. Toepassing van een immunogeen conjugaat tussen een immunogene drager en een steroid androgeen-derivaat of een steroid oestrogeen-derivaat voor de bereiding van een immunogeen produkt ten gebruike bij een werkwijze als gedefinieerd in conclusies 1, 2, 2 of 5.

19. Werkwijzen en produkten als beschreven in de beschrijving en/of het voorbeeld.