NL8403625A - Werkwijze en inrichting voor het automatisch analyseren van biologische monsters. - Google Patents

Description

___ ' . Werkwijze en inrichting voor het automatisch analyseren van biologische monsters.

De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het continu en automatisch identificeren» sorteren en tellen 5 van deeltjes met zeer kleine afmetingen en in het bijzonder, doch niet uitsluitend micro-organismen van dierlijke of plantaardige oorsprong, alsmede voor het gebruik maken van de verkregen resultaten op verschillende gebieden, zoals het biologisch onderzoek van melk of bloed en het automatisch contro-10 leren van verontreinigingen door bacteriën in bijvoorbeeld automatisch bestuurde inrichtingen voor het zuiveren van industriële vloeistoffen of drinkwater en welke werkwijze niet alleen nauwkeurig is, doch ook snel en goedkoop kan worden uitgevoerd.

15 Er zijn r.eeds verschillende werkwijzen voor de bovenge noemde doeleinden bekend. Zo wordt bijvoorbeeld voor het onderzoeken van menselijk bloed gewoonlijk eerst met de hand een monster geprepareerd door middel van verschillende mechanische en/of chemische behandelingen en dit monster vervolgens micros-20 cop.isch onderzocht, teneinde de verschillende cel bestanddelen daarvan te analyseren en te tellen. Deze techniek is tijdrovend en omslachtig, terwijl het toegelaten foutpercentage daarbij desondanks tussen 20 en 30% ligt. Op overeenkomstige wijze moeten voor het analyseren en tellien van in een vloeistof aan-25 wezige bacteriën eerst monsters van de vloeistof worden genomen, vervolgens een kweek van elk monster worden gemaakt, teneinde de bacteriën tot ontwikkeling te brengen, hetgeen een vertraging van enkele uren veroorzaakt en tenslotte de bacteriën worden geanalyseerd en geteld door vergelijking daarvan 30 met bekende soorten bacteriën en hiervoor gelden dezelfde beperkingen en bezwaren als hierboven reeds zijn vermeld.

Meer in het algemeen kan worden gesteld, dat er tot dusverre geen automatische en repeterende werkwijze van de bovenbeschreven soort bestaat, waarmede de gezochte resultaten 35 op snelle en continue wijze en onder vermijding van menselijke fouten kunnen worden verkregen.

De uitvinding biedt de mogelijkheid om dit resultaat" te bereiken door toepassing van een reeks bewerkingen, waarvan het principe op zichzelf voor andere toepassingen bekend is, 40 doch die hier met het oog op dit nieuwe resultaat zijn gecom- 8403625 ^ /¾ - 2 - bineerd en aan elkaar zijn aangepast.

De eerste bewerking bestaat uit het preparen en op automatische en continue wijze op een continu bewegende drager aanbrengen van een reeks monsters, welke daarbij op deze 5 drager een voor een door een onderzoekinrichting met een videocamera voor het registreren daarvan worden gevoerd.

De tweede bewerking bestaat uit het door middel van de videocamera registreren van de beelden van deze monsters,welke worden geleverd door een microscoop, die van speciaal voor dit 10 doel bestemde optische middelen is voorzien.

De derde bewerking bestaat uit het door middel van een lijnenraster onderverdelen van het beeld van elk monster in een aantal nauwkeurig bepaalde zones of deelbeelden voor het analyseren van elk monster met behulp van op zichzelf bekende 15 technieken.

De vierde bewerking bestaat uit de genoemde beeldanalyse in afhankelijkheid van het helderheidsniveau van elk deel beeld met behulp van een rekenmachine, door welke de analyseresultaten van alle monsters statistisch worden verwerkt 20 en vervolgens in digitale vorm worden afgedrukt, hetgeen de mogelijkheid biedt om op elk ogenblik het analyseresultaat af te lezen, doch bovendien het verloop van dit resultaat in de tijd te volgen.

Met betrekking tot de uitvoering van deze verschillen-25 de bewerkingen dient nog het volgende te worden opgemerkt..

Bij de eerste bewerking wordt elk monster, alvorens het op de drager wordt aangebracht aan een fysisch-chemische behandeling onderworpen. Deze behandeling is vergelijkbaar met de gebruikelijke behandelingen voor dergelijke monsters, 30 doch wijkt op verschillende punten daarvan af.

Zo had bij de bekende behandelingstechnieken bijvoorbeeld de kleuring van een monster slechts tot doel, om een gehëlegroep cellen, zoals bacteriën zichtbaar te maken zonder daarbij eerst na te gaan of deze of leven of reeds dood zijn.

35 Volgens de onderhavige uitvinding dient de kleuring voor het aanduiden van de levensvatbaarheid van bepaalde cellen en het . zichtbaar maken daarvan zonder kleuring van de artefacten.

Voorts wordt na de kleuring een epifluorescentiebehan-deling (in het algemeen met ultraviolet strijklicht) toege 8403625 Τ' ' * - 3 - past, waarbij door filtering van de gereflecteerde straling alle cellen met een kern zichtbaar kunnen worden gemaakt, terwijl een immunofl uorescentiebehandel ing de mogelijkheid biedt om cellen van een bepaalde soort hieruit te selecteren.

5 Tenslotte wordt elk monster automatisch door verstuiving of met behulp van blaaslucht op de continu bewegende drager aangebracht in de vorm van druppels met een bepaalde dikte en een constante diameter. Deze druppels worden regelmatig en homogeen over de drager verspreid:, teneinde een voor een door 10 de videocamera te kunnen worden waargenomen. Bij een eerste • uitvoeringsvorm bestaattfe drager uit een om zijn as draaibare horizontale schijf en worden 'de druppels daarop aangebracht in concentrische cirkels, zodat deze of wel langs de opeenvolgende cirkels of wel in een afwisselend radiale en rondgaande bewe-15 ging kunnen worden onderzocht. Volgens een tweede uitvoering bestaat de drager uit een continu bewegende band, welke van een voorraadrol wordt afgewikkeTd en daarna op een opneemrol wordt gewikkeld en die tesamen met deze rollen in een wegwerp-cassette is aangebracht. Hierdoor wordt de noodzaak van het 20 afspoelen van de drager, zoals in het geval van de sóhijf vermeden. In het algemeen bedraagt het volume van het aantal druppels, waarvan het statische resultaat als meetwaarde voor o elk monster kan worden beschouwd 1 mm . Het zal duidelijk zijn, dat de schijfvormige drager na elke meting automatisch wordt 25 afgespoeld.

Bij de tweede bewerking wordt gebruik gemaakt van een combinatie van een microscoop met een speciaal voor het beoogde doel geschikt optisch stelsel en een videocamera, waarbij de met deze camera opgenomen beelden met het oog op de derde be-30 werking aan een minicomputer worden toegevoerd. Daar de microscoop continu gegevens levert moet er voor worden gezorgd, dat deze voortdurend juist is ingesteld. Voor dit doel is tussen het objectief en de monsterdrager een micrometerschroef aangebracht, welke een constante mechanische focussering waarborgt.

35 De microscoop is bij voorkeur ingericht voor een rechstreekse belichting met ultraviolet licht, omdat het gevormde beeld wordt gefotografeerd door de camera, welke meer licht kan -opnemen dan het menselijk oog.

Bij de derde bewerking wordt het door de camera vast-40 gelegde beeld van het monster aan de rekenmachine toegevoerd, 8403625 » - 4 - door welke het beeld dan volgens ingewikkelde, doch bekende technieken wordt geanalyseerd. Daar deze technieken op zichzelf bekend zijn behoeven deze hier niet in detail te worden beschreven, doch kan worden volstaan met de vermelding, dat 5 nadat het beeld in het geheugen van de rekenmachine is vastgelegd eerst de minimale helderheid van een met een te beschouwen. deeltje corresponderend deelbeeld wordt bepaald (drempelwaarde) en wanneer deze drempelwaarde voor een monster is vastgelegd de omtrek van elk deeltje wordt bepaald. In dit verband 10 wordt echter opgemerkt, dat de werkwijze volgens de uitvinding juist door de gebruikmaking van deze techniek wezenlijk verschilt van de tot dusver gebruikelijke werkwijzen, welke tot een visuele vergelijking van met de hand geprepareerde monsters met een reeks standaardmonsters zijn beperkt. Dit verschil le-15 vert tevens het voordeel van een nauwkeurige analyse en een snelle uitvoering van de bewerkingen in vergelijking met de eenvoudige visuele vergelijking, welke tijdrovend en onnauwkeurig is en een bron van fouten vormt.

De volgende fase van deze bewerking bestaat uit het 20 sorteren van de·aldus gedefinieerde deeltjes naar ~hun afmetingen en hun vormen. Deze sorteerbewerking wordt voor elke druppel uitgevoerd en de daarbij verkregen resultaten voor alle druppels worden vervolgens statistisch verwerkt, waardoor wordt gewaarborgd, dat zowel de op een bepaald tijdstip verza-25 melde gegevens als de verandering daarvan in de tijd steeds nauwkeurig worden weergegeven.

Daar de techniek van het analyseren van beelden of vormen (patroonherkenning) algemeen bekend is kunnen ook alle uit deze techniek bekende hulpbewerkingen, zoals een voorbehan-30 deling van het beeld voor het elimineren van achtergrondruis ter verbetering van de beeldkwaliteit, alsmede het filteren, het vergroten en het skeletteren van het beeld worden toegepast.

De uitvinding zal thans nader worden toegelicht aan 35-de hand van een beschrijving van twee voorbeelden van practi-sche toepassingen van de werkwijze.

Voorbeeld 1.

Dit voorbeeld heeft betrekking op toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding voor het onderzoeken van bac- 8403625 - 5 - teriën in melk.

In dit geval bestaat de eerste bewerking uit het kleuren van het monster door middel van acridine oranje met een pH-waarde 6. In de druppel worden dan zichtbaar niet-gekleur-5 de vetbolletjes, levende leucocyten met dezelfde vorm als de vetbolletjes, doch die zich daarvan onderscheiden door hun kleuring, bacillen in de vorm van staafjes en coccen met een ronde vorm die vérschijnen met of zonder ribonuclëinezuur (RNZ) wanneer zij aan het afsterven zijn en met desoxyribonuclë-10 inezuur (DNZ) weer tot leven kunnen worden gebracht. Men kent derhalve vanaf het begin het totale aantal kiemen en het aantal leucocyten, die kunnen worden geïdentificeerd door epiflu-orescentie en wel door belichting met uitraviole strijklicht met een golflengte van minder dan 400 μ, waarbij dan een 15 spectrum met een golflengte tot 600 nanoμ wordt gereflecteerd, dat kan worden gefilterd.

Voor wat de bacillen betreft kan vervolgens naar het voorkomen van Clostridium butyricum en pseudomonas fluorescens worden gezocht. Deze bacillen kunnen worden opgespoord door 20 middel van immunofluorescentie met een serum, dat met de gezochte bacil correspondeert en een specifiek kleurmiddel.

Hierna wordt het monster nog steeds bij lage temperatuur aan de navolgende bewerkingen onderworpen: a) Bepaling van het totale aantal bacillen door aan 25 het monster 1% cyanide en 10¾ acridine oranje toe te voegen en de druppels van het reactieproduct aan de bewerkingen 2 en 3 te onderwerpen.

b) Afzondering van het pseudomonas alleen door herhaling van de bewerking a doch zonder kleurmiddel.

30 c) Afzondering van het clostridium alleen door herha ling van de bewerking a doch onder toevoeging van zowel acridine oranje en het specifieke gekleurde serum.

Bij elk van de bewerkingen a, £ en c wordt het door de microscoop geleverde beeld gefotografeerd door middel van 35 een camera en wordt dit gefotografeerde beeld in het geheugen van de rekenmachine ingevoerd in de vorm van een rechthoek, welke door een raster van 512 horizontale en 512 verticale lijnen in 262144 beeldpunten is onververdeeld. De helderheid van elk beeldpunt, dat wil zeggen de hoeveelheid licht,die 8403S25

V

- 6 - daarvan wordt ontvangen wordt voorgesteld door een cijfer of bit. In het onderhavige geval wordt gewerkt met zes bits, dus 64 niveaus, waarbij het nul niveau met zwart en het niveau 63 met wit correspondeert. De beelden, welke heldere objecten vor-5 men tekenen zich af tegen een op storingen na volledig zwarte achtergrond. Bij het begin van een analysebewerking wordt de minimale helderheidswaarde (drempel) vastgelegd, vanaf welke een beeldpunt als deel van het object wordt meegerekend. Nadat deze drempelwaarde is vastgelegd wordt overgegaan tot het 10 bepalen van de omtreksvorm van elk object en worden alle objecten geregistreerd in een tabel, uit welke aan de hand van de gegevens omtrent elke omtreksvorm een bepaald aantal parameters wordt bepaaldszoals de grootste lengte alsmede een vormfactor, waarmede, ervan uitgaande, dat deze voor een .cirkel de waarde 15 1 bezit de objecten in langwerpige objecten en ronde óbjecten kunnen worden gescheiden. Vervolgens worden in de tabel alleen de van belang zijnde objecten aan de hand van de gekozen parameters gesorteerd en de hierbij verkregen resultaten worden tenslotte zowel voor elke druppel afzonderlijk als voor het 20 samenstel van alle druppels statistisch verwerkt. In het onderhavige geval bedraagt de tijdsduur voor het analyseren' van een druppel 1,5 seconden met een toegelaten foutpercentage van 5¾. Deze waarden zijn vele.malen kleiner dan die van de tot dusver gebruikelijke ana.lyseduur en het daarbij toegelaten foutpercen-25 tage en resulteren in een volledige automatisering van de bewerkingen.

Voorbeeld 2: Bloedonderzoek.

De toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding biedt in dit geval niet alleen de mogelijkheid om de aantallen 30 bloedcellen zelf, dat wil zeggen de rode en witte bloedlichaampjes snel en nauwkeurig te bepalen, doch verschaft tevens de mogelijkheid om de daarin aanwezige parasieten te ontdekken en automatisch te tellen, hetgeen tot dusverre op grond van de uiterst geringe grootte daarvan niet uitvoerbaar was. Zo 35 is het bijvoorbeeld door de uitvinding thans mogelijk^geworden om in het bloed voorkomende malariaparasieten, waarvan de afmeting in de orde van grootte van 2 micron ligt op te sporen en automatisch te tellen.

Het bloedonderzoek met behulp van de werkwijze volgens 8403625 <C? _ - 7 - de uitvinding wordt meer in het bijzonder op de navolgende wijze uitgevoerd.

In de eerste plaats wordt een bloedmonster continu en automatisch door verstuiving of met behulp van blaaslucht op 5 een drager aangebracht. Dit is een vooruitgang ten opzichte van de tot dusver gebruikelijke techniek, waarbij elke bloeddruppel wordt samengeperst tussen een drager en een glasplaatje, waardoor de cellen worden vernield of veranderd.

Door het kleuren met acridine oranje met een pH-waarde 10 6 ontstaat een onderscheid tussen de rode bloedlichaampjes, welke omdat zij geen kern bezitten^geen RNZ en geen DNZ bevatten en derhalve ongekleurd blijven, terwijl daarentegen de witte bloedlichaampjes, die leven een kern en verschillende insluitingen bevatten, welke verschillende kleuren aannemen (DNZ 15 voor de kern, RNZ voor de insluitingen).

Wanneer echter bloedparasieten in een rood bloedlichaampje aanwezig zijn wordt dit vastgesteld door een kleuring daarvan, omdat zij zowel DNZ als RNZ bevatten.

Vervolgens wordt een beeldanalyse volgens de in het 20 voorgaande beschreven technieken uitgevoerd, waarbij echter met de samengesteldheid van de objecten rekening wondt gehouden.

Met name zal in het geval dat bij het onderzoek van de omtreksvorm van de gekleurde witte bloedlichaampjes, die op 25 zichzelf algemeen bekend zijn en gemakkelijk kunnen worden geïdentificeerd en worden geteld binnen de buitenste omtreksrand een of meer inwendige omtreksvormen van zich daarin bevindende kernen worden ontdekt het onderzoek kunnen worden voortgezet, teneinde ook de betreffende verdere bestanddelen op te sporen.

30 Dit biedt derhalve de mogelijkheid om in afhankelijkheid van het aantal, aldus opgespoorde objecten verschillende soorten bestanddelen met meer kernen te identificeren en te tellen.

Hetzelfde geldtmet betrekking tot de parasieten in de rode bloedlichaampjes, hetgeen een belangrijk nieuw aspect 35 van de onderhavige werkwijze vormt. Zo doet bijvoorbeeld de malariaparasiet zich voor in de vorm van een open ring (RNZ), welke aan zijn beide uiteinden uitwassen of knobbels (DNZ) vertoont en dit biedt nu voor het eerst de mogelijkheid om deze parasieten, ondanks hun uiterst geringe afmetingen (2 micron) 8403625 -5* . -¾ - 8 - automatisch en continu te tellen.

Het aantal toepassingsmogelijkheden van de werkwijze volgens de uitvinding is nagenoeg onbegrensd en is met name niet beperkt tot het eenvoudige tellen van deeltjes in een vloeistof. i 5 Zo kan de werkwijze volgens de uitvinding bijvoorbeeld ook wor den toegepast voor het sorteren en tellen van onregelmatigheden in het oppervlak van vaste materialen.

10 15 i > 8403625

Claims (10)

1. Werkwijze voor het continu en automatisch identificeren, sorteren en tellen van deeltjes met kleine afmetingen, methet kenmerk, dat eerst een reeks monsters wordt geprepareerd en continu wordt aangebracht op een continu bewe-5 gende drager, door welke zij een voor een door een onderzoeksrichting met een videocamera voor het registreren van door een microscoop gevormde beelden van deze monsters worden gevoerd, dat het aldus geregistreerde beeld van elk monster vervolgens door een raster van elkaar snijdende lijnen in vakken 10 wordt onderverdeeld en daarna volgens de techniek van patroonherkenning wordt geanalyseerd en dat tenslotte de resultaten van deze analyse statistisch worden verwerkt en uitgedrukt in cijfers aan degene, die het onderzoek verricht ter beschikking worden gesteld.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t h e t kenmerk, dat de monsters worden geprepareerd door deze op een specifieke wijze te kleuren en vervolgens door epiflu-orescentie te observeren.

3. Werkwijze volgens conclusie 1, m e t het 20. e n m e r k, dat de monsters door continu verstuiven of blazen op de drager worden aangebracht.

4. Werkwijze volgens de conclusies 1 t/m 3, m e t het kenmerk, dat de continu bewegende drager bestaat uit een om een verticale as draaiende glazen schijf en continu 25 wordt afgespoeld.

5. Werkwijze volgens de conclusies 1 t/m 3, m e t het kenmerk, dat de drager bestaat uit een continu bewegende band, die van een eerste rol wordt afgewikkeld en na eenmalig gebruik op een tweede rol wordt gewikkeld en welke 30 band in een wegwerpcassette is opgenomen.

6. Werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 5, met het kenmerk, dat de microscoop is voorzien van middelen, door welke deze automatisch voortdurend op het monster ingesteld wordt gehouden.

7. Werkwijze volgens een der conclusies 1 t/m 5, m e t het kenmerk, dat de microscoop met ultraviolet licht werkt.

8. Werkwijze volgens een der voorgaande conclusies, 8403825 - 10 - 'f- met'het kenmerk, dat de bij het prepareren van de monsters gebruikte kleurstof uit acridine oranje^ en/of een gekleurd specifiek serum bestaat.

9. Toepassing van de werkwijze volgens de conclusies 5 1 t/m 8 voor het onderzoeken van bacteriën in melk.

10. Toepassing van de werkwijze volgens de conclusies 1 t/m 8 voor het analyseren van bloed en meer in het bijzonder het opsporen van in het bloed aanwezige parasieten, zoals het malaciavi rus. 15 3403625