NL8000334A - Polymeren immunoregulerende middelen. - Google Patents

Description

^' ƒ

. N

Polymeren immunoregulerende middelen.

De uitvinding heeft betrekking op polymere verbindingen die bruikbaar zijn bij de immuno regulerende behandeling van tumor therapie.

Ofschoon het terrein van de tumor-therapie 5 onderwerp is geweest van uitvoerig onderzoek, zijn tot nu toe zeer weinig verbindingen gevonden die daarvoor bruikbaar zijn.

Volgens een benadering zijn pogingen gedaan om het immuunsysteem van het lichaam te beïnvloeden. Het wordt b.v. in het algemeen onderkend, dat de thymusklier van groot 10 belang is bij de ontwikkeling en het oud worden van het immunologisch vermogen. Met verschillende mechanismen waarvan wordt aangenomen dat die in wezen hormonaal zijn, oefent de thymusklier controle uit over de door de T-lymphociet overgebrachte immune-verking. Een verscheidenheid van natuurlijk voorkomende en 15 synthetisch bereide peptiden zijn op deze wijze onderzocht als stimulanten en/of onderdrukkingsmiddelen voor dit immuunsysteem met verschillende resultaten.

Andere middelen waarvan gevonden is dat ze immune versterkende werking bezitten zijn b.v. Bacillus Calmette-20 Guerin (BCG), Corynebacterium parvum, glucan, levamisol en tiloron. Enkele vancfeze verbindingen verhogen de vorming van anti-lichamen terwijl anderen ofwel door cel overgebrachte immuniteit verhogen of verhinderen.

Verschillende biologisch werkzame synthetische 25 poly-elektrolieten zijn ook voorgesteld als bruikbare anti tumor-middelen. Zo vonden Regelson en Holland een breed spectrum van anti-tumorwerking bij muizen voor het natriumzout van polyethyleensulfonaat. Nature (Londen) 181, 1+6 (1958). Een 8000334 2 * 1 »·*' aantal carbonzuurpolymeren van aanmerkelijk hoog mol.gew., b.v. polyacrylzuur, polymetacrylzuur en ethyleen-maleïnezuur- anhydridecopolymeer (EMA) bleken daarna antineoplastiache werking te bezitten die overeenkomt met die van natrium poly- ethyleensulfonaat. Regelson c.s., Nature (Londen) 186, 778-780 (1960); Regelson, "Water-Soluble Polymers” in "Polymer Science and Technology”, vol. 2 (ed. N.K. Bikales), 161-177, Plenum Press,

New York, 1973). De anti-neoplastische werking van de EMA type polymeren wordt ook beschreven in Canadees octrooischrift 66k.326. Het bruikbare mol. gew. van deze polymeren wordt gezegd te liggen in het trajekt tussen 500 en 1,5 miljoen. Ein van deze polymeren, het half-amide, half-ammoniumzout van EMA met een gemiddeld mol.gew. van 20.000 - 30 000 is later beschreven chronisch giftig te zijn voor knaagdieren en honden. Mihich c.s.,

Fed. Proceedings, vol. 19, no. 1, deel 1, maart i960. Chronische 15 giftigheid werd later ook vermeld voor het 2000 - 3000 mol.gew. polymeer bij honden door Mihich c.s., Fed. Proceedings, vol. 20, no. 1, deel 1, maart 1961. Deze bevindingen van .giftigheid pleiten tegen het klinisch onderzoek van de polymeren.

Daarna vertoonde het verwante 1,2-divinyl 20 ether-maleïnezuuranhydridecopolymeer anti-tumorwerking bij proeven die zijn uitgevoerd door het National Cancer Institute. Breslow, Pure & Appl. Chem. U6, 103-113 (1976). Deze copolymeer staat ook bekend als pyraancopolymeer of DIVEMA, en een bekend 2^ monster is aangeduid als NSC !+6015· Het gebruik van deze pyraancopolymeren als anti-tumormiddelen wordt ook beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 3.22^.9^3 en 3.79^.622, waarin het bruikbare mol.gew. wordt beschreven als liggende in het trajekt van 5000 - 30 000. De anti-tumorwerking van pyran-2Q copolymeer is toegeschreven aan een immunoversterking of aan een werking op de immunorespons door het reticuloendothelialsysteem (RES) door verhogen van de macrofage werking in een aantal artikelen waartoe b.v. behoren Breslow, Pure & Appl. Chem. jró, 103-113 (1976), Mohr c.s., Prog. Cancer Res. Ther. 7, ^15-^26 35 (1978), Schultz c.s., idem 7, 1+59-^7 (1978) en Dean c.s., 8000334 * * 3

Cancer Treatment Reports, 62, september 1978.

Ondanks de eerder vermelde chronische giftigheid van verschillende EMA type polymeren met hoog mol.gev. hebben we onderzoekingen gedaan om polymeren van dat algemene type voor 5 immunoregulerende werking verder te beoordelen. Nieuwe benaderingen en nieuwe methoden voor beoordeling werden ontwikkeld waardoor het mogelijk was de immonoregulerende werking te onderkennen zonder bijgaande eytotoxieiteit. Als gevolg daarvan bleken bepaalde enkele van deze recentelijk beoordeelde verbindingen geen direkte 10 cytotoxische werking te bezitten en toch werd gevonden dat ze zeer werkzaam waren tegen tumor-metastasen en het terugkomen van tumoren na uitsnijden of verwijdering van tumormassa. Derhalve zijn deze verbindingen geïndiceerd als bijzonder bruikbaar voor de behandeling bij tumortherapie met een immunologisch mechanisme.

15 Ze zijn bruikbaar voor het voorkomen van het terugkeren van tumoren of door ontwikkling van metastasen door toediening na uitsnijden of verwijderen van tumormassa door chirurgisch ingrijpen, röntgenstralen of cytotoxische chemotherapie.

Overeenkomstig de uitvinding is een nieuwe 2o groep verbindingen van het bovengenoemde algemene EMA type gesynthetiseerd, die werkzaam zijn tegen tumormetastasen en het terugkeren van tumoren bij zoogdieren, zelfs ofschoon ze geen sterke primaire antitumorwerking bezitten. Deze verbindingen zijn copolymeren van ethylenisch onverzadigde monomeren met 25 2-b koolstofatomen en α,β-onverzadigde polycarbonzuuranhydriden met h-6 koolstofatomen, die een gemiddeld mol.gew.bezitten van 300 - 1500, en waarvan derivaten zijngsvormd die zowel een half-amide, half-carbonzuurzoutfunktie als een imidefunktie bevatten, waarin de imidefunktie 5-^0 % uitmaakt van de 30 derivaatfunktie. Voorbeelden van dergelijke ethylenisch onver zadigde monomeren zijn etheen, propeen en isobuteen; voorbeelden van dergelijke polycarbonzuuranhydriden zijn maleïnezuuranhydride, citraconzuuranhydride en aconietzuuranhydride. Van deze mono-meercomponenten wordt de voorkeur gegeven aan etheen en maleine-35 zuuranhydride.

8000334 5 * if

Bij wijze van toelichting kunnen de voorkeurs-eopolymeren van etheen en maleïnezuuranhydride, waarvan geschikt derivaten zijn gevormd, worden weergegeven met daarin voorkomend de volgende strukturele eenheden of groepen: 5 (a) half-amide, half-carbonzuurzout met formule 1 en (b) imide met formule 2, waarin X waterstof of een alkylgroep met 1-Λ koolstofatomen, bij voorkeur waterstof, is; Y waterstof, ammonium of een farmaceutisch aanvaardbaar metaal kation, bij voorkeur ammonium, is en Z waterstof, een alkylgroep 10 met 1-lf koolstofatomen, ammonium of een farmaceutisch aanvaardbaar metaal kation, bij voorkeur waterstof, is. De respectieve eenheden of groepen (a) en (b) zijn verdeeld over een in wezen lineair, continu koolstofatoommolekuul. 5-^0 % van deze eenheden dienen te bestaan uit imide en de rest bestaat in hoofdzaak 15 uit half-imide- halfcarbonzuur zout eenheden.

Deze eenheden kunnen willekeurig verdeeld liggen over de keten en/of willekeurig verdeeld in het polymeer. Het zal duidelijk zijn, dat een klein gedeelte (naar wordt aangenomen minder dan 10 %) mono-ammonium carboxyl of andere 20 farmaceutisch aanvaardbare zoutgroep en/of dicarboxylgroep ook aanwezig kan zijn, zoals het gevolg kan zijn van gedeeltelijk gereageerde of ongereageerd zuuranhydride tijdens de bereiding van deze verbindingen.

Van de bovengenoemde in derivaat omgezette 25 groepen, is de (a) half-amide, half-carbonzuurzoutgroep bij voorkeur half-amide, half-ammoniumzout en de (b) imide groep bij voorkeur ongesubstitueerd imide.

Ter nadere toelichting kan het voorkeurs-copolymeer van etheen en maleïnezuuranhydride, als een voorkeurs-30 vorm in derivaat omgezet, warden weergegeven met inbegrip van de volgende struktuureenheden of groepen: (a) half-amide, half-ammoniumzout met formule 3 en (b) ongesubstitueerd imide met formule U.

Zoals boven vermeld zijn de respectieve eenheden 35 (a) en (b) verdeeld over een in wezen lineair, continu koolstof- 8000334 Η 5 atoom-molekuul. 5-1*0 % van deze eenheden zijn hij voorkeur ongesubstitueerd imide en de rest bestaat in hoofdzaak uit de bij voorkeur voorkomende half-amide, half-ammoniumzouteenheden. Deze eenheden kunnen willekeurig in de keten zijn geplaatst of wille-5 keurig in het polymeer. Het zal duidelijk zijn, dat een kleine hoeveelheid (aangenomen wordt minder dan 10 %) monoammonium-carboxyl of dicarboxylgroepen aanwezig kan zijn zoals deze kunnen voorkomen door gedeeltelik gereageerd of ongereageerd zuur-anhydride tijdens de bereiding van deze verbindingen.

10 De polymere immunoregulerende middelen volgens de uitvinding zijn bij voorkeur ook water-oplosbaar.

De uitvinding w <rdt nader toegelicht. aan de hand van de bijgaande tekeningen waarin fig. 1 het vingerafdrukgebied van het infraroodabsorptiespectrum toont van een representatief 15 polymeer volgens de uitvinding dat in derivaatvorm 20 % imide bevat. Zie voorbeeld III, tabel D, loop 5» hieronder. In fig. 1 is langs de horizontale as het golfgetal in cm”1 afgezet en langs de vertikale as de doorlaatbaarheid in procent. De grafiek geeft de golflengte in yum.

20 Fig. 2 toont ter vergelijking het vingerafdruk gebied van het infraroodabsorptiespectrum van een overeenkomstig polymeer dat 0 % imide bevat. Zie voorbeeld II (a) hieronder.

De assen in fig. 2 zijn net als in fig. 1.

Fig. 3 toont een vergelijking het vingerafdruk-25 gebied van het infrarood absorptiespectrum van een overeenkomstig polymeer dat als derivaat 100 % imide bevat. Zie voorbeeld V hieronder. Ook in fig. 3 zijn de assen net als in fig. 1.

Ofschoon Canadees octroóischrift 661*.326 het gebruik beschrijft van de half-amide, half-ammoniumzouten van 30 EMA type copolymeren of het gebruik van imiden of gedeeltelijk in imide omgezette derivaten van EMA type copolymeren voor anti-neoplastische werking, wordt aangenomen, dat de specifieke polymeren volgens de uitvinding die de combinatie bezitten van zowel (a) de half-amide, half-carbonzuurzoutfunktie en (b) de 35 imide-funktie in de hierin vermeldeverhoudingen en met een 8000334 6 ·« * betrekkelijk laag mol.gew. van 300-1500, nieuw zijn. Deze nieuwe polymeren hebben bruikbare immunoregulerende eigenschappen, die niet voorkomen bij de overeenkomstige polymeren die alleen maar de (a) of de (b) funktie bevatten of een aanzienlijk hoger 5 mol.gew. bezitten. Eveneens zijn, ter vergelijking, de overeenkomstige monomere delen van deze polymeren, n.l. succinimide en succinamidezuur (geammonieerd barnsteenzuuranhydride) eerder beschreven als vrij te zijn van enige significante tumor-verhinderende doelmatigheid, Regelson c.s., Nature (Londen) 10 J86» 778-780 (1960).

De niet in derivaatvorm omgezette copolymeren met laag mol.gew., die gebruikt worden voor het bereiden van de gewenste immunoregulerende middelen volgens de uitvinding kunnen worden bereid volgens bekende methoden, zoals b.v. worden 15 beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 2.857.365, 2.913Λ37, 2.938.016 en 2.980.653. Karakteristiek wordt de ethylenisch onverzadigde verbinding, b.v. etheen, tot reaktie gebracht met het polycarbonzuuranhydride, b.v. malexnezuuranhydride bij een temperatuur in het trajekt van ^0-100°C in aanwezigheid 20 van een vrij radikaal bevorderende katalysator en een vloeibaar oplosmiddel, d.w.z. een oplosmiddel voor de reaktiedeêlnemers en een niet-oplosmiddel voor het gevormde interpolymeer. Gebruikelijke peroxydetype en azotype vrij radicaal bevorderend polymerisatiekatalysatoren zijn uitstekend geschikt voor dit doel 25 en benzoylperoxyde verdient b.v. de voorkeur. Inerte oplosmiddelen, zoals benzeen, halogeenbenzeen en halogeenparaffinen zijn bruikbare oplosmiddelen voor de polymerisatie-reaktie. Een gealky-leerde aromatische koolwaterstof met tenminste 1a-waterstof, zoals b.v. ethylbenzeen, isopropylbenzeen, diisopropylbenzeen, 30 tolueen of xyleen is echter een bij voorkeur gebruikt vloeibaar medium voor de polymerisatiereaktie teneinde het mol.gew. van het copolymeerprodukt te verlagen, zoals beschreven wordt in Amerikaans octrooischrift 2.913.^37.

Ethylbenzeen verdient in het bijzonder de voorkeur 35 als vloeibaar medium voor laatstgenoemd doel. Het copolymeer 8000334 7 bevat bij voorkeur een vrijwel equimolaire hoeveelheden van het ethylenisch onverzadigde residu en het zuuranhydride residu, zoals wordt verkregen bij gebruik van ongeveer equimolaire hoeveelheden van de monomere reaktiedeelnemers. Het verkregen copolymeer-5 produkt wordt in vaste vorm verkregen en kan gemakkelijk door filtreren, centrifugeren of dergelijke scheidingsmethoden worden teruggewonnen.

Het zal duidelijk zijn dat de vrije radikaal starter, zowel door het starten van de polymerisatiereaktie en de 10 daaropvolgende beëindiging of telomerisatie met het uit gealky-leerde aromatische koolwaterstof bestaande vloeibare medium, de invoering veroorzaakt van verschillende organische groepen in de polymeerstruktuur. Het percentage van deze groepen in de totale polymeersamenstelling neemt toe naarmate het mol.gew.

15 van het polymeer wordt verlaagd. Bij gebruik van b.v. benzoyl-peroxyde als de vrije radikaal starter en ethylbenzeen als het vloeibare reaktiemedium worden hun respectieve aromatische groepen in de polymeerstruktuur ingevoerd. Deze groepen vormen een hogere percentage van de totale struktuur van de polymeren 20 met een mol.gew. van rond 300 dan b ij de polymeren met een mol.gew. van rond 1500.

Het zal verder duidelijk zijn, dat bij de bereiding van deze copolymeren met laag mol.gew. een bepaalde hoeveelheid verknopingsmiddel kan worden opgenomen in het co-25 polymeer om daardoor het produkt onoplosbaar te maken in water. Voorbeelden van dergelijke verknopingsmiddelen zijn vinyl en allylesters, in het bijzonder de acrylaten en crotonaten, zoals beschreven in Amerikaans octrooischrift 3.165Λ86. De copolymeren kunnen ook onoplosbaar worden gemaakt na derivaatvorming, met 30 verschillende methoden, zoals b.v. door verknopen met diamine, zoals beschreven in Amerikaans octrooischrift 3.55^.985 of door vastzetten op dragers, zoals bentoniet, latexdeeltjes of erythrocyten.

Het is bekend, dat amidederivaten van het EMA 35 type copolymeren bereid kunnen worden door het copolymeer te 8000334 8 i laten reageren met ammoniakgas bij gewone of verhoogde temperatuur, zoals beschreven in Canadees octrooischrift 66U.326 en in de Amerikaanse octrooischriften 2.883.287 en 3.157.595· Het is ook bekend, dat de reaktie bij hogere temperatuur de imidevorming 5 bevorderd, terwijl reaktie in een inert organisch vloeibaar oplosmiddelmedium zoals benzeen gebruikt kan worden voor het regelen van de reaktietemperatuur en dit de imidevorming vertraagt. Hen andere bekende methode voor de amidevorming bestaat uit reaktie van het polymeer in vloeibare ammoniak bij -33°C.

10 Ofschoon de bovengenoemde methoden in het algemeen bruikbaar zijn voor de bereiding van het half-amide, half-ammoniumzout als een tussentrap voor de bereiding van de imidebevattende derivaten, hebben ze niet een tijd-diffusie-werking van ammoniak in de binnenste kern van de EMA deeltjes 15 voor de doeleinden van de uitvinding, zoals beschreven in voorbeeld II, hieronder. Een voorkeursmethode voor de doeleinden van de uitvinding bestaat eruit dat men eerst het EMA type copolymeer oplost in aceton, daarna het opgeloste polymeer laat reageren met vloeibare ammoniak en aceton. Het gewenste half-amide, half-20 ammoniumzoutprodukt slaat neer uit de oplossing en kan dan gemakkelijk worden teruggewonnen door filtreren, centrifugeren of een dergelijke scheidingsmethode, zoals nader toegelicht in voorbeeld II, de delen a, b en c. Fig. 2 van de bijgaande tekeningen toont het infraroodspectrum van het half-amide, 25 half-ammoniumzoutprodukt van het voorbeeld 11(a), dat 0 % imide bevat.

De bereiding van het gewenste imidebevattende derivaat kan dan geschieden doordat men het tussenprodukt half-amide, half-ammoniumzout laat reageren met ammoniak om het co-30 polymeer verder in derivaat om te zetten zodat het zowel (a) half-amide, half-ammoniumzout groepen als (b) imidegroepen bevat, waarin deze imidegroepen 5-^0 gev.% uitmaken van de derivaat-groepen en desgewenst deze half-ammoniumzoutgroep omzet in andere farmaceutisch aanvaardbare zoutgroepen. De reaktie wordt 35 uitgevoerd in een geschikt of organisch oplosmiddel als medium, 8000334

1 V

9 zoals b.v. tolueen of xyleen, bij terugvloeitemperatuur tot het gewenste percentage imidederivaat gevormd is, zoals nader toegelicht in de onderstaande voorbeelden III en IV. De terug-vloeitemperaturen variëren van 50°C tot 200°C, bij voorkeur 60°C 5 tot 150°C en liefst 100°C tot 150°C.

Fig. 1 van de bijgaande tekeningen toont het infraroodspectrum van een representatief voorbeeld (voorbeeld III, tabel D, loop 5) van het gewenste polymeer dat in derivaat wordt omgezet zodat het zowel (a) de half-amide, half-ammoniumzout-10 funktie als de (b) imidefunktie bevat, en waarin het imide 20 gev.% uitmaakt van het gevormde derivaat. Het polymeer van dit voorbeeld bezit een gemiddeld mol.gew. van 850 en het 20 % imide ligt binnen het voorkeurstrajekt van 10-25 % imide.

Ter vergelijking werd ook een volledig 100 % 15 imidederivaat van het EMA copolymeer bereid, zoals toegelicht in voorbeeld V. Fig. 3 van de tekeningen toont het infrarood spectrum van dit polymeer.

Een nadere beschrijving van de infTarood-analyse ter identificatie van de verschillende bovengenoemde 2o funktionele groepen wordt weergegeven in fig. 1-3 zoals hieronder uiteengezet na voorbeeld I.

Om de werkzaamheid van polymeren volgens de uitvinding bij de immunoregulerende behandeling van tumortherapie aan te tonen worden representatieve monsters van de polymeren 25 op de volgende wijze onderworpen aan verschillende proeven:

In een reeks proeven werden de polymeren onderzocht in een door virus veroorzaakt, niet-metastatische muizen-tumormodel. Het gebruikte model was het door SV40 virus veroorzaakte fibrosarcoom (m KSA) van syngeneïsch BALB/c muizenoorsprong.

30 Dit murinetumor, mKSA-TU5, stamt van Kit c.s., Int. J. Cancer 4_, 384-392 (1989) en daarvan is niet bekend dat het regressie vertoont in syngeneïsche BALB/c muizen. In deze reeks proeven hielden de waargenomen tumorregressies verband met immuno-stimulerende en vermindering van tumorbelasting overeenkomstig Dean c.s., Int. J. Cancer, J6, 465-475 (1975) die aantoonde dat 8000334 10 mKSA met tumor verband houdende antigenen bevatte, en dat in kleine tumordragende dieren er een goed verband bestond met door cellen overgedragen immuniteit. De muizen werden behandeld met drie verschillende doses van de proefVerbinding hetzij voor of 5 na of zovel voor als na uitdaging met levensvatbare tumorcellen bij een TD10Q en TD^Q. De groei van tumoren werd daarna beoordeeld in de behandelde dieren ten opzichte van normale niet-behandelde controlemuizen. In deze reeks proeven vertonen polymeren volgens de uitvinding met een gemiddeld mol.gev. van omstreeks 850 een 10 aanzienlijk grotere tumor regressieaktiviteit dan de overeenkomstige polymeren met een mol.gev. van 2000 - 3000 en -een mol.gev. van 20 000-50 000.

In een andere reeks proeven werden representatieve polymeren volgens de uitvinding onderzocht in een chemisch opgewekt metastaserend rattentumormodel. Het gebruikte model was 15 een door 3-methyleholanthreem veroorzaakte galblaastumor (BLCA) in Fischer 3^ ratten. R.T. Prehn c.s., J. Nat. Can. Inst., 18. 769 (1957) en H. Falk c.s., Surgery, oktober (1978).

De tumorcellen waren in de celkweek in een tijd-2o bestek van 5 jaren overgegaan en na subcutane (SC) implantatie, was daarvan bekend dat ze metastase naar de longen vertonen linnen één week na de implantatie. De gebruikelijke overlevingsduur na subcutane tumorimplantatie bedraagt 3 weken of minder.

In een deel van deze proeven bij het metastaserende 25 rattentumormodel, werd het proefpolymeer periodiek met tussenpozen van een week toegediend gedurende 3 weken na de tumorimplantatie. Deze behandelde dieren vertoonden een overlevingspercentage dat meer dan 3xzo groot was dan dat van de onbehandelde controle-dieren en er werd geen metastatische groei vastgesteld gedurende 30 de 6 weken van de waarneming.

Een ander deel van deze proeven met het metastaserende rattentumormodel werd het proefpolymeer toegediend als een toevoegsel aan tumorexcisie 7-10 dagen na de tumorenting.

De behandelde dieren werden beoordeeld op terugkering van tumor 35 na excirsie ten opzichte van onbehandelde vergelijkingsdieren.

8000334 11

Bij de vergelijkingsdieren bedroeg de terugkeer van de tumor 100 % binnen 6 weken na resectie met een gemiddelde tijdsduur van 32 dagen, terwijl bij de dieren diebehandeld waren met voorkeurspolymeren velgens de uitvinding in een hoeveelheid van 5 80 mg/kg er geen terugkeer voorkwam gedurende de eerste 6 weken en na 10 weken de terugkeer van de tumor slechts bij 13 % van de dieren werd waargenomen.

Bij nog een andere reeks proeven werden representatieve polymeren volgens de uitvinding onderzocht in normale 10 Lewis-stam ratten en bleken immuunresponsen te bevorderen, zoals bleek door een verhoging van antilichaamproduktie.

Nog andere proeven bij normale Lewisstamratten toonde B-cel aktivering door respresentatieve polymeren volgens de uitvinding zonder aanwezigheid van T-cellen, hetgeen het gebruik 15 van deze polymeren als een thymusfunktievervanging indiceert.

T-cellen zijn van de thymus afgeleide lymphocyten, terwijl B-cellen lymphocyten zijn die zich ontwikkelen in het slijmbrug equivalent of beendermerg.

Verdere proeven met normale Lewisstam ratten 20 op de toename in peritonale macrofagen en de werking van latex fagocytosis van de macrofagen heeft aangegeven, dat de immuno-regulerende werking van deze polymeren op B-celaktiviteit niet veroorzaakt wordt door het stimuleren van macrofage werking. De polymeren volgens de uitvinding blijken derhalve anders te 25 werken dan de verwante pyrancopolymeren volgens de stand van de techniek, die verken via de RES door verhoging van de macrofage werking.

Een nadere beschrijving van bovengenoemde en andere dergelijke proeven en de daarbij behorende resultaten 30 zijn vastgelegd in de voorbeelden VIII-XXIII.

In het algemeen kunnen de polymeren volgens de uitvinding aan een gastheer worden toegediend in een werkzame immunoregulerende hoeveelheid als een toevoegsel bij tumorchemo-therapie, tumorbestralingstherapie en/of tumorsxci.-sie. Als 35 dergelijke toevoegsels bij de behandeling van tumortherapie kunnen 8000334 tl 12 ze worden toegediend ongeveer tegelijkertijd als een dergelijke therapie of binnen een geschikte tijdsduur voorafgaande aan of na een dergelijke therapie. In het algemeen ligt dit binnen een periode van 2 dagen onmiddellijk voorafgaande en 1 maand onmiddel-5 lijk volgende op een dergelijke therapie. Uit studies blijkt, dat verwijdering van een bij voorkeur gebruikt water oplosbaar polymeer volgens de uitvinding plaats vindt in ongeveer 30-60 dagen en derhalve wordt aangenomen, dat toediening van booster-doses van het polymeer ongeveer iedere 6 weken moeten worden toe-10 gediend.

De polymeren knnnen parenteraal alsmede oraal worden toegediend in hoeveelheden in van b,v. ongeveer 1-100 mg/kg lichaamsgewicht. Ze kunnen zowel intraveneus als intraperitonaal worden toegediend, bij voorkeur in waterige oplossing zoals 15 steriel water of zoutoplossing. Oraal kunnen ze worden toegediend in de vorm van tabletten, poeders, capsules, elixers en dergelijke doseringsvormen vermengd met gebruikelijke vaste en vloeibare verdunningsmiddelen, dragers, suspensiemiddelen en toevoegsels, zoals b.v. maïszetmeel, lactose, talk, stearinezuur, magnesium-20 stearaat, gelatine, acacia en Sint Jansbroodbomengom, alkohol, water, dimethylsulfoxyde (DMS0), plantaardige dLiën en dergelijke materialen. De orale doseringsvorm is bij voorkeur vast en wordt in een geschikt vloeibaar mengsel overgebracht ten tijde van de toediening teneinde de stabiliteit van de twee groepen (a) 25 half-amide, halfcarbonzuurzout en (b) imide te handhaven. Andere geschikte doseringen van de polymeren voor het verschaffen van een gewenst immunoregulerende werking kunnen worden bepaald onder verwijzing naar de specifiekevoorbeelden die^hieronder volgen.

Een voorkeursdoseringsvorm voor toediening van het polymeer is 30 in fysiologische zoutoplossing.

Ofschoon de onderstaande voorbeelden een nadere toelichting van de uitvinding verschaffen, zal het duidelijk zijn dat de uitvinding niet daartoe beperkt is. In alle voorbeelden is het procent opbrengst het procent opbrengst volgens de theorie, 35 betrokken op de teruggewonnen produkt.

8000334 13

Voorbeeld I

Bereiding van EMA

De gewenste grondstof etheen/maleïnezuuranhydride (EMA) copolymeer werd bereid in een verwarmde 3»79 1 roestvrij 5 stalen reaktor voorzien van een inwendige waterkoelspiraal, magnetisch aangedreven roerder die optimaal werkt bij 1000-1200 rpm, een etheentoevoer en een toevoer waardoor aanvullende katalysator kan worden toegevoegd aan een oplossing die wordt ingedrukt door etheen. Monsters kunnen worden afgenomen <£ de 10 eindinhoud kan worden afgelaten door een bodempoort. Hulpapparatuur voor het regelen van de verwarming en de koeling werden verschaft. In een karakteristieke loop bestond de lading van de reaktor uit 1025 g (1875 ml) ethylbenzeen, 190 g (1,9^ mol) malexnezuur-anhydride en 1^,1 g (0,058 mol) benzoylperoxyde, ppgelost in 15 80 g (92 ml) ethylbenzeen. Het katalysatorvat werd in de reaktor gewassen met een aanvullende 20,0 ml ethylbenzeen. De reaktor werd gesloten en druk werd 2x met etheen bij kamertemperatuur afgelaten om lucht in het systeem te verdringen. Daarna werd de temperatuur op 70°C gebracht en daarop gehouden bij een etheen 20 toevoerdruk van 1k kg/cm gedurende de duur van de polymerisatie.

o 2

Ia 3 uur polymerisatie bij 70°C en een etheendruk van l4]g/cm werden 9Λ g (0,039 mol) benzoylperoxyde in 60 g (70 ml)ethylbenzeen toegevoegd door de katalysator toevoegleiding, gevolgd door een wassing van deze toevoer met 20 ml ethylbenzeen.

25 Het roeren onder verwarmen op 70°C bij 1^ kg/cnT etheentoevoer werd daarna voortgezet gedurende nog 1k uur teneinde de polymerisatie te voltooien. Aan het einde van de loop werd de reaktor gekoeld en afgelaten en de inhoud bestond uit een ethylbenzeen brij van produkt-etheen/maleïnezuuranhydride (EMA) copolymeer 30 en een kleine hoeveelheid produkt EMA dat verglaasd was op de roerder, koelspiralen en reaktoroppervlakken. Deze brij werd afgefiltreerdna combinatie met het door afschrappen verwijderde verglaasde materiaal en de omzetting van maleïnezuuranhydride werd bepaald aan het filtraat door NaOH titratie tot een 35 fenolfthaline eindpunt.

8000334 1¾

De totale EMA produktopwerking bestond uit filtreren, brij-extractie 3x(ieder 1 uur) met 2 1 xyleen bij kamertemperatuur gevolgd door 3 extracties (ieder 1 uur) met 2 1 hexaan en eindfiltratie. Tussen alle extractietrappen wordt 5 filtratie gebruikt. Het EMA eindprodukt werd een nacht lang onder vacuum gedroogd onder volledig oliepompvacuum bij 55-60°C, Het aldus gedroogde EMA produkt werd verpoederd in een Waring menger gedurende 5 min. teneinde de ondergeschikte hoeveelheid verglaasd materiaal te verkleinen tot poederconsistentie. Tabel A geeft een 10 samenvatting van de verkregen resultaten voor zeven dergelijke opeenvolgende EMA polymerisaties.

8000334 .2 15 <υ 00 £ d— 1e > LPv 0\ O «- VD IA h •Η· »»»»*·* +* β > COO\00\0»-0 ·« σ*δ m on -=f n J J -=f +* Ο M ^^T-^r-T-r- w 0) ft +3 r« <U 4) ou s -g LPv d is £ w o " «U;^ w +3 43 4 (Ο 0Ί VO (Ο ^ ·ί ·Η g

φίη 5 S MD U3 VO VO VO > S

ii Ofc ooooooo o I, w § »»»««*** _ ·*

Sag ooooooo H"ë 8ί* I · ra a o *4 * £

4 r 1A 4 OV 4 1Λ «{ O

«W (Π Γ- <" W 00 *- O 'ö

Jj «.««A*** O

o h oo 03 « t— 00 CO Λ 3

^ 0¾¾ ΙΑ ΙΑ 1Λ ΙΛ ΙΑ 1Λ ΙΑ +> H

H ^ & " *r *° ί «ς P3g

Sw co en o p- o cm *- ia.ho o c^ot-o»-’-’- cm ,¾ o

Jj H Λ ft Λ * ·* Λ I *p S

β}%* -4 ΙΛ 1Λ 0\ ΙΛ in 1Λ P j5> s g §s

3 II

g . p g i β tC C ö rrl In «C g, S ^ “

gS2 CD Μ) n h OV 4 C M OJ -P

s * a co cn cm cm d *ri S ® |o o ^ « 2 S2SS g, 1 S w 5 Μ,ν» ST S c i? p +J H -r) i, —< ia t— on o\ on in 4 5SÏÏ

n| CO CM CM *- CM CM CM 4) Ë! S JJ

® j§ ttf) »— CM CM CM CM CM CM SScH

43 Jh VID ft

4) \0 O

J § 0 -P <u

Ó }> <U M

β <D 60 5 ® *r! 1--3-3 I 1 »| ,η^η ia \o m on o\ o\ vu *j » g g >1 I] AAA*»»» 3 O ‘H ? pj 4 )) »— CO CO 00 C— C— 00 Ö

jrt β g Ov ft ® OV OV OV ON J> * S

3 S 8 g SP δ S

0 a 0 6

Oh Cj ,Ο O <ti 4) 4n 60 r-CMCn PC w w ^ 8000334' 16

De mol.gew. parameters werden bepaald aan het produkt EMA met behulp van bovengenoemd preparaat f als een karakteristiek produkt. Het materiaal werd 2h uur bij 100°C onder oliepompvacuum gedroogd. De parameters werden bepaald in 5 droog dimethylformamide (DMF). Voor preparaat f werd het numeriek gemiddeld mol.gew. (Mft) bepaald op 852 met behulp van dampdruk-osmometrie in DMF bij 120°C met gebruikmaking van een Knauer VP osmometer. Het gemiddeld mol.gew. op gewichtsbasis (M^) werd bepaald op 5730 met behulp van een kleine hoek laserstraal-10 verstoring, ook weer in DMF, met gebruikmaking van een Chromatix KMX-6 instrument. De intrinsieke viskositeit in DMF bij 25°C werd gemeten door capillaire viskométrie met behulp van een Cannon Ubbelhode verdunningsviscosiemeter (maat 75) door extrapoleren van 4 verschillende concentraties tot nulconcentratie.

15 De intrinsieke viskositeit van preparaat f bleek 0,0607 dl/g te bedragen.

Dergelijke bepalingen van Mq1 M^ en de intrinsieke viskositeit werden uitgevoerd op overeenkomstige wijze met gebruikmaking van een EMA preparaat met een hogere soorte-20 lijke viskositeit (0,11, 1 DMF, 25°C). Indit geval bleek de intrinsieke viskositeit 0,1227 dl/g te bedragen, Mq bedroeg 2 2ékm My bedroeg 12 970.

Met gebruikmaking van de bovenstaande waarden voor twee EMA produkten met verschillende soortelijke viskositeit 25 werden de constanten K en α in de standaardvergelijking bepaald, die een verband legt tussen de intrinsieke viskositeit (/“Vi7) « · met het mol.gew., /"η7 * KM0! Het gevonden verband voldeed aan: /Vgï?o = ^,71 x ίο-1* Mn 0,72 en 30 /"n72^ = 3,51 x 10”5 My 0,86

De uitdrukking ” gemiddeld mol.gew.” als hierin gebruikt met betrekking tot de beschreven copolymeren volgens de uitvinding, heeft betrekking op het gemiddelde numerieke gemiddelde mol.gew.

8000334

IT

Identificatie van functionele groepen De identificatie van de verschillende functionele groepen voor alle polymeerderivaatvoorbeelden, zowel kwalitatief als kwantitatief, geschieden met infrarood analyse met behulp 5 van een Beekman IR-12 spectrofotometer. Mönsterbereiding, absorptieftrequentie toekenning en methoden voor het bepalen van de verhouding van imidegroepen tot amidegroepen geschiedde volgens methoden als beschreven in hetzij "The Infra-red Spectra of Complex Molecules", Bellamy, John Wiley and Sons, 1960, of "Practical 10 Infra-red Spectroscopy", Cross, Butterworth, 196¾. Monster-bereiding maakte in alle gevallen gebruik van samengeperste schijven van 2 mg polymeer per 250 mg droog KBr samenstelling met 70 mg gemengd polymeer/KBr per schijf. De plaatsen van de absorptiebanden zijn vermeld in golfgetal-eenheden, die worden 15 uitgedrukt in reciproke cm (cm"1), gewoonlijk aangeduid als bandfrequenties.

Voor kwalitatieve "vingerafdrukken" van produkt-samenstellingen, zoals de aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde groepen, worden de volgende bandfrequentietoekenningen aanvaard 20 en deze werden ook gebruikt: 8000334 18

Golfgetal (cm"1) funktie 1. 5-ring zuuranhydride

Doublet: 1870-1830 minor C*0 rek I8QO-I76O major 2. Ongedissocieerd alifatisch zuur (COOH): 1725-1700 C-0 rek 3. Polymere imide, 5-ring

Doublet: 1715 major C=0 rek 1770 minor U. Polymere primair amide:

Amide-I band 1670 major C»0 rek 1620 minor NH deformatie en C-N rek 5. Carboxyl ion CO” 1560-1570 asymmetrische rek 6. Methyleen -CH^- 1U70—1U50 C-H deformatie 7. Ammonium (NH^ ) zout

Tan carboxyl 1U05-1^00 symmetrische ”(intensiteit hangt af rek van de aard van het kation) 8. Polymeren met een hoge concentratie aan imide groepen (meer dan 60 %) 1180-1200 major C-N rek bevatten ook een doublet: 1370-1350 minor naast de in 3 hierboven genoemde.

Voor kwantitatieve schatting van het imide/amide-gehalte van een polymeer dat beide groepen bevat naast ammonium carboxylfunktie, werd een verhouding van de absorptie intensiteit van de hoofdimideband bij 1715 cm”1 tot de hoofd primaire amide-band bij 1670 cm”1 bepaald. Het imidegehalte werd bepaald door de gemeten verhouding van imide/amide (hierboven) te vergelijken met een standaardkromme van procent imide tegen imide/amide-absorptie-verhouding die gemaakt is uit een reeks infrarood bepalingen die verkregen zijn door toenemende hoeveelheden zuiver (ongeveer 100 %) imide (beschreven in voorbeeld V) te vermengen met polymeer dat geen imide of ongeioniseerde COOH groepen bevat, maar met alleen maar amide en geïoniseerde carboxylgroepen 8000334 19 (beschreven in voorbeeld II).

Voor deze laatste proef van de imide/amide-verhouding werd er voor gezorgd dat men er zeker van kon zijn dat niet geïoniseerde carboxylgroepen niet aanwezig waren bij 5 1715 crn”^ door eerst het monster op te lossen in water, de pH

in te stellen op 10,0 met ammoniumhydride en te vriesdrogen teneinde eventueel niét geïoniseerd C00H om te zetten in ammoniumcarboxylaat. Dergelijke methoden verhogen de intensiteit van de carboxylbanden bij 1560 en 1U00 cm-1 maar verzekeren dat IQ de overblijvende band bij 1715 ca” inderdaad van imide-oorsprong is.

In alle onderstaande voorbeelden berusten verwijzingen naar de aanwezigheid of afwezigheid van funktionele groepen en naar het imidegehalte van imidebevattende polymeren 15 op de basis van de aanwezigheid of afwezigheid van de bovengenoemde funktionele bandtoekenningen en de bovenstaande methode voor het schatten van de kwantitatieve imide/amideband intensiteit verhoudingen.

Voorbeeld II

20 Bereiding van half-amide - half-ammonium C00" zout van EMA (AEMA).

Eerdere methoden voor het ammoniëren van EMA polymeren (beschreven in Amerikaans octrooischrift 3.157.595 en Canadees octrooischrift 66U.326) volgens ëên van de volgende 25 drie methoden: (1) droog ammoniëren met ammoniakgas bij gewone temperatuur door ammoniak door te leiden in krachtig geroerd droog EMA poeder (2) inleiden van ammoniak in een geroerde brij van EMA poeder in benzeen of hexaan, of (3) door direkt toevoegen van vast EMA poeder aan een geroerde overmaat vloeibare ammoniak 30 teneinde het half-amide - half-ammoniumcarboxylaatzout van EMA te verschaffen, zijn voor het beoogde doel ongeschikt gebleken.

Deze tekortkomingen houden verband met een aanmerkelijke tijd-diffusiewerking van ammoniak in de binnenste kern van zelfs fijn gemalen EMA deeltjes. Zelfs bij verlengde reaktieduur bevatten 35 de aldus bereide amide-ammoniumzoutprodukten altijd resthoeveel- 8000334 20 heden niet gereageerd zuuranhydride, omstreeks 5 gew.$, zoals blijkt uit de aanwezigheid van zuuranhydride absorptiebanden bij de frequenties van 1780 en 1850 cm“1.

De onderstaande voorkeursmethode werd ontwikkeld 5 om lange reaktieduur en slechte temperatuurregeling bij de vorming van produkten die geen zuuranhydridegroepen bevatten te vermijden.

(a) EMA polymeer uit voorbeeld 1(f) (80 g) werd opgelost in 800 ml aceton (AR-kwaliteit) en deze oplossing werd in een tijdbestek van 20 min. toegevoegd aan een geroerde 10 oplossing van 100 ml vloeibare ammoniak in 3 1 aceton bij -70°C (droog ijs-acetonbad). Na de toevoegduur van 20 min. liet men het totale mengsel geleidelijk opwarmen tot kamertemperatuur (U uur) in welke periode het neergeslagen produkt van kleur veranderde van een oorspronkelijk geel tot wit. Het produkt werd 15 afgefiltreerd en achtereenvolgens 2x tot een brij opgeslagen met 2 1 aceton gevolgd door 2x brijvorming met 1,51 50/50 aceton/fiexaan. Alle brijvormingstrappen vergden ieder 30 min.

Het eindprodukt werd afgefiltreerd en een nacht lang bij H5°C en onder een vacuum van 20-25 mm Hg gedroogd. Het gedroogde 20 produkt werd opgelost in 900 mlmter, gefiltreerd door 0,^5 jim filter en gevriesdroogd waardoor 98,7 g, 100 % opbrengst) werden verkregen aan half-amide - half-ammoniumcarboxylzout.

(b) Methode (a) werd als volgt herhaald met gebruikmaking van EMA polymeer uit voorbeeld l(f) maar met 25 water aan de oorspronkelijke EMA oplossing in aceton toegevoegd.

Het EMA (60 g) werd opgelost in 500 ml aceton plus 2,32 g water en de oplossing werd 2 uur onder terugvloeien verwarmd.

De afgekoelde acetonoplossing van EMA werd onder roeren in een tijdbestek van 10 min. toegevoegd aan 2 1 aceton waarin 3 mol 30 vloeibare ammoniak bij -60°C. Zoals hierboven liet men de reaktie-brij opwarmen tot kamertemperatuur en werkt op zoals hierboven beschrevenet2x brijvorming in 1,5 1 aceton en 1x brijvorming met 1 1 hexaan, gevolgd door affiltreren en een nacht lang bij een vacuum van 20-25 mm Hg drogen bij kO°C. Het aldus verkregen 35 gedroogde produkt bestond uit 8U g (hetgeen meer was dan 100 % 8000334 21 opbrengst.

(c) Een derde bereiding naakte gebruik van EMA. polymeer uit voorbeeld 1(g), 100 g (0,71U mol) EMA. werd onder terugvloeiing gedurende 2 uur in 700 ml aceton waarin 3,85 g 5 water, verwarmd. De gekoelde acetonoplossing werd in een tijd bestek van 10 min* toegevoegd aan een geroerde oplossing van 3,3 1 aceton waarin 60 ml vloeibare ammoniak bij -50°C. Ha 1 uur tij -50°C werd de reaktiebrij opwarmen tot kamertemperatuur (2 uur). Het gefiltreerde produkt werd 2x tot een brij opgeslagen 10 in 2 1 aceton (iedere keer 30 min.) en 2x in 2 1 hexaan (ieder 30 min.), afgefiltreerd en een nacht lang bij 50°C onder volledig oliepompvacuum gedroogd. De verkregen hoeveelheid droog half-amide-half-ammoniumcarboxylzout bedroeg 115,6 g, 93 % opbrengst.

Analyse van de hierboven beschreven drie 15 bereidingswijzen wordt samengevat in tabel B.

Tabel B

Bereiding a b c

Stikstof. % (Gem. van 2) 13,^0 1U,18 1U,19

Funktionele samenstelling uit infrarood 20 anhydride geen geen geen ongedissocieerd C00H " ” " imide " " " primair amide hoofd hoofd hoofd geïoniseerd C00" ” " '* 25 methyleen -CHg- ja ja ja -C00”NH^+ hoofd hoofd hoofd

Voorbeeld III

Bereiding van partiele imidederivaten in xyleen

Een monster van 10 g van het half-amide-half-30 ammoniumcarboxylzout uit voorbeeld Ila werd tot een brij opgeslagen in 250 ml xyleen in een 1 1 kolf voorzien van roerder, thermometer, waterafvoerval en een gasinleidingverdeler voor ammoniak. De brij werd onder terugvloeien verwarmd gedurende 12 uur terwijl een constante stroom ammoniak door de gastoevoer- 8000334 22 verspreider werd gehandhaafd. Monsters van de produktbrij werden verwijderd op verschillende tijdstippen (zie tabel C) om de omzetting in imide ten opzichte van de tijd te analyseren.

Ieder klein monster werd opgewerkt met drie opeenvolgende brijvormingen in 100 ml hexaan, gefiltreerd en bij een vacuum van 20-25 mm Hg bij 50°C gedroogd. De pH van 2 %-ige waterige oplossingen werd zowel voor als na verdere oplossing in water gemeten, de pH werd ingesteld op 10,0 (NH^OH) en er werd gevriesdroogd. Het infraroodspectrum werd bij alle monsters gemaakt om imide tot amideverhoudingen vast te stellen en aldus het percentage imidegehalte. De resultaten zijn vastgelegd in tabel C.

Tabel C

duur van terugvloeiing in xyleen ten tijde / \ // \ van monstertrekking pH-1va' pH-2'0/ I/A verh. imideva' __ 15 min. 6,26 7,20 0,723 13,8 30 min. 6,00 5,86 0,858 18,5 1+5 min. 5,91 5,76 0,999 23,3 1 uur 5,78 5,53 1,113 27, h 1.5 uur 5,U3 5,^3 1,398 36,8 2 uur 5,27 5,76 1,501 U0,2 3 uur 5,72 1,821 50,0 h uur ^,78 5,38 — — 6 uur U,73 5,76 — — 7.5 uur 1*,73 5,60 12 uur --- --- —- — (a) pH van 2 35—ig waterige oplossing voor instelling van de pH.

(b) pH van 2 #-ige waterige oplossing, ingesteld op pH 10 en gevriesdroogd.

(c) verhouding van IR band absorptie intensiteit bij golfgetal 1715 cm-1/1670 cm 1.

(d) verkregen uit standaardkromme van samenstelling tegen I/A verhouding.

8000334 23

Een verder stel van negen afzonderlijke proeven werd uitgevoerd, waarbij half-amide-half-ammoniumcarboxylzout uit voorbeeld II (b) werd gebruikt. Iedere afzonderlijke loop werd onder terugvloeiing verwarmd in een xyleenbrij gedurende 5 de aangegeven tijdsduur (tabel D) en volledig opgewerkt. De droge produkten na hexaanwassing werden afzonderlijk opgelost in 150 ml water, de pH werd ingesteld op 10,0 met NH^OH, daarna werd af gefiltreerd door een 0,20 jm fiter en direkt gevriesdroogd in steriele serumflessen voor in vivo dierlijke beoordeling.

10 De opbrengsten en analyses van de verschillende lopen zijn beschreven in tabel D.

8000334 2k (U *0 u £4 · >S O 'ö ,_i va aanaa"*·** Q 00 a lAt-'-MD O -4 CO -4 o > o •h ^-«-ojojcuoniA p o

<U W

03 bo DO ® ö Ή I °. £ 9 H 2 a w43 ^riA^C— onO’-oooo u «·«*****·* a · o via ooooo’-’-'-'- -p 5P a L_J K rH M * H ? ·Η ·Η Ο +> 3 Η * >Μ h Η Ο 3 ,η Φ ι- <d ο a +> _ Ο U) μ W Vi (U Ö ft ft · ο η ή ·Ρ X t— co οο cm t— *- ο t— cm — & .5? w ; ra CMCM-sfcOVOt-ΟΟΟ ΐΛ · W° 1 1 ΐ IJV» «*»·***** bO Ρι Ορ'ΟΛ •H 444(nfO(Ofnmw , g O p | .·, 1— t— t— r— t T— ΓΟ h H O h Ό g « o a u ft o “ .4 O -P >3 > o n D ft a a a 60 +» bo ω ·η o «β \q (3 B U O 60

ü ooncvi-4-ONO\Cjor* ‘d *d 'H Si} S

<M ooN’-t-o'ivoojoco P “ 'S p Λ I λφφφλλλλλ ^ Μ Μ Μ Η w ώ t-vot-vovovovovotA,Q ο « a -d _ι α, a η &ο a ·η η 3 ^ » ft β a h « S Ο ·Η H P· *rt 2 cm to a a μ £ a w -P 60 > ^ _ *> 60 ο η I a d . *r) h a o 60 JÜ coir\cocMO\00t-co -¾ f! & S< 5P , , t- o co 4 ia Οι M) t'-cnm w^jaoöH »

«*·»«*·»*>»* <!·η·ρ tH a CJ

sè !Λ4-44ίη-ί444 Ψ g <5, * ,

a, 60 d !* 60 ft a H

p< ^ ·η +> a o a a u ft _ λ « to bo a o c a m ·Η -P ·η +> *3 bo I a -p a >λ > a

,- m +> o WOW

wfi ^ w Si h w w ft -π co 60 β 43 Z d ^ a ·η 3-p-p tj 42 r^JU\rr-[-4OO\ hdtJ I ΦΟΟ ij to ft *>*··*«»*,,* >2 ® — 2 2

SdO OCMO*-OCM<nCM«- a W fi β β fi Ίο ^o\ocooo«co<oco μ p a cv a -p -p n^w »- > ΰ a ο o U'S. inCMt-COtAOOlAO „ W p H ^ S o to 4σ\«αι--οηρο^ο\ ft -p ft ► $ ..».·.·.·>«·>«*> ora ^uaa ·* m t- co \o co vo w la o a aw a ·η ·η p -d ft i> N « h S.5 *- a w o w a w a to .,

fii jj d a····· MM

•Η -Η β «Αβββββ PP

I STS δ ΐ a '8 '8 '3 a I * * « β H >. CM -4 O Ο O **» U O > X r W CO 4 r r- ιη §\ ^ ö r·' w ή 4 in vo t- a o\ 8000334 t - 25

Voorbeeld IV

Bereiding van partiële imidederivaten in tolueen

Partiele imiden van half-amide-half-ammonium-carboxylzout van EMA. polymeer werden in vezen bereid zoals 5 beschreven in voorbeeld III, behoudens dat de imidevormings- snelheid gevarieerd werd door te werken bij tolueenterug-vloeiing (110°C) in tolueenbrij in plaats van xyleen, zoals in voorbeeld III.

Het gebruikte EMA was uit voorbeeld 1(f) en de 10 gebruikte methode voor de bereiding van het half-amide-half- ammoniumzout was dezelfde als in voorbeeld 11(a), zonder toegevoegd water. Dit produkt vertoonde hoofd infrarood absorptiebanden voor primair amide, geïoniseerde carboxyl en ammoniumcarboxylaat met geen aanduiding van zuuranhydride of imide. 28 g van dit 15 amide ammoniumzout werden tot een brij opgeslagen in 1 1 tolueen en onder terugvloeiing verwarmd. Drie monsters werden verwijderd na resp. 2 uur, 3s uur en 5 uur terugvloeiduur (einde van de loop).

De produkten werden door filtratie geïsoleerd, en 3 brijen in 150 ml tolueen en 3 brijen in petroleumether bereid waarna 20 gedurende 17 uur bij kamertemperatuur en een druk van 25 mm Hg vacuum gedroogd werd. De droge produkten werden daarna opgelost in 100 ml water, de pH werd ingesteld op 9,0 met HH^OH, waarna werd afgefiltreerd door een 0,20 ^un filter en onmiddellgk werd gevriesdroogd in steriele serumflessen voor in vivo dieren- 25 proeven. De verkregen resultaten waren als volgt: terugvloeiing /, x in tolueen produkt stikstof I/A / v imide' } duur in uur g % verh. % 2 6,15 13,78 0,531 6,5 30 3,5 7,73 13,U1 0,600 9,5 5 9,2U 13,82 0,61+7 11,0 (a) zie voetnoot (c) in tabel C - gevriesdroogd produkt.

(b) zie voetnoot (d) tabel C - gevriesdroogd produkt.

8000334 26

Voorbeeld V

Bereiding van volledig imide van EMA, EMA sp.

vise. * 0,061

Het volledige imide van EMA werd bereid door 5 20 g van het produkt uit voorbeeld Ha onder terugvloeiing te verwarmen in 250 ml xyleenbrij gedurende 18,5 uur onder een constante ammoniakstroom en door verwijdering van reaktiewater in een Dean-Stark val. Een totaal van 2,7 mlwater werd in de val verwijderd. Het produkt werd gefiltreerd, 3x met hexaan tot 10 brij opgeslagen en een nacht lang gedroogd bij kamertemperatuur onder een vacuum van 25 mm Hg. Het droge produkt woog 13*5 g, opbrengst 8^,3 %· 3 g van het produkt werden in 150 ml water een nacht lang geroerd, vervolgens afgefiltreerd, gewassen met water en gevriesdroogd. Het produkt bezat een stikstofgehalte van 15 9,53 % en een ZR aftaster vertoonde absorptiebanden bij alleen maar de golfgetallen 1190, 1360, 1715 en 1770 cm , karakteristiek - voor imidefunktionaliteit. Er werden amide, anhydride, geïoniseerde carboxyl of ammoniumcarboxylaatabsorptiebanden waargenomen.

Het bovengenoemde volledige imideprodukt werd 20 in verschillende mengsels met het niet-amide bevattende half-amide-half-ammoniumcarboxylaatzout uit voorbeeld Ha vermengd om een moeder imide/amide infraroodsamenstellingkromme vast te leggen zoals eerder beschreven na voorbeeld I en wel op de volgende wijze: de vast-gelegde hoeveelheden, gewogen op een 25 analytische balans, werden vermengd in roestvrij stalen mengers met behulp van een Wigglebug menger. Infrarood aftastingen werden uitgevoerd aan geperste schijven van bovengenoemde mengsels met droge KBr met gebruikmaking van 2 mg polymeermengsel op 250 mg KBr. De pil bestond uit 70 mg polymeer/KBr meng-sel per 30 schijf. De totale moederkromme werd uit de volgende gemengde samenstellingen vervaardigd: 8000334 27

Gev. volledig Gev. van 0 % imide/amide imide uit imide uit absorptie voorbeeld V voorbeeld Ila verb, mg mg 3 97 0,1*27 6 9¾ 0,509 10 90 0,621 20 80 0,81*3 30 70 1,161 1*0 60 1,519 50 50 1,871 60 1*0 2,099 70 30 2,561* 80 20 3,008

Voorbeeld V-A

Bereiding van volledig imide van EMA, EMA sp.

vise. * 0.66

Het volledige imide van EMA. met hoger mol. gev. dan gebruikt in voorbeeld V werd bereid met gebruikmaking van EMA met een specifieke viskositeit van 0,66 (1 %9 DMF, 25°C) overeenkomende met een mol.gev. van 20-30.000. In dit geval verd het geammonieerde EMA bereid zoals in voorbeeld VI(a) door droog ammoniakgas door te leiden door een geroerd poeder EMA bij een temperatuur beneden 70°C. Het verkregen half-amide-half-ammoniumcarboxylzout van EMA (sp. vise = 0,66) poeder verd verder vervarmd bij verhoogde temperatuur om het half-amide om te zetten in het imide door vater uit te drijven.

525 g van het van 0,66 sp. vise. EMA afgeleide half-amide-half-ammoniumcarboxylzout verden krachtig geroerd in een 11,1* 1 ketel, voorzien van een vaterafname en onder een continue stroom ammoniakgas. De temperatuur verd verhoogd tot 122°C vaarbij een begin verd gemaakt met het vangen van vater in de vaterval. Na 1 uur bereikte de temperatuur 152°C en varen 2l* ml vater vervijderd. Het vervarmen onder roeren onder een ammoniakstroom verd 5 uur voortgezet (in totaal 6 uur) 8000334 28 waarbij een totaal van5*» ml water werd verkregen. Na afkoelen was het produkt een wit, melig poeder. Het stikstofpercentage bedroeg 11,11 tegen een theoretisch gehalte van 11,20.

Dit EMA 100 % imide met hoog mol.gew. werd 5 onderzocht op tumorgroeiverhindering in een onafhankelijk onder- zoeklaboratorium in 1958 en vertoonde geen werking (zie voorbeeld XXII).

Voorbeeld VI

Bereiding van half-amide - half-ammonium C00" 10 zout van EMA volgens uit de stand van de techniek bekende methoden met en zonder water._ (a) Een 500 ml vierhalskolf werd voorzien met Teflonroerder, thermometer, gastoevoerverdeler en gasafvoer-borrelaar.Het ingeleide ammoniakgas werd door een stroommeter 15 gevoerd teneinde de stroomsnelheid alleen maar op kwalitatieve basis te volgen. In de kolf werden 25 g EMA uit voorbeeld l(d) gebracht en het poeder werd met een snelheid van 500 rpm geroerd. De ammoniaktoevoerstroom werd op een zodanige snelheid gehouden dat een temperatuur van 70°C werd bereikt uitgaande 20 van kamertemperatuur zonder een verwarmingsmantel te gebruiken.

Na 9 min. had de poeder temperatuur 70°C bereikt en werd de ammoniakstroom vertraagd teneinde deze temperatuur te handhaven. Een temperatuur van 70°C werd 1s uur gehandhaafd, waarna de ammoniakstroom werd afgesloten en het reaktiemengsel onder 25 stikstof werd afgekoeld. De opbrengst aan droog geammonieerd EMA als half-amide-half-ammoniumcarboxylaat bedroeg 30,8 g, opbrengst 98,8 Jf. Het stikstofpercentage bedroeg 1U,01, 1U, 18 en een 2 $-ige waterige oplossing bezat een pH van 6,07.

IE aftastingen gaven absorptiebanden voor 30 8000334 29 niet gereageerd anhydride hij 1780 en 1850 (minder dan 5 % geschat) primair amide hij 1670 en 1620 (hoofd) carhoxylaat ion hij 1565 ( ” ) 5 NH^ carhoxylaat hij 1^05 ( ” ) imiden geen (h) een tveede ammoniëring van EMA uit voor» heeld I (d) werd uitgevoerd zoals hierboven onder (a) behoudens dat het EMA eerst behandeld werd met water zoals hierboven 10 beschreven om de reaktie met ammoniak te verbeteren en het anhydridebestanddeel in het produkt te verlagen. 25 g EMA werden bij 500 rpm en H0°C (verwarmingsmantel) gedurende 6 uur geroerd in aanwezigheid van 0,53 g (17 mol.if) water dat druppelsgewijze over de eerste 20 min. werd toegevoegd uit een 1,0 ml injektie- 15 spuit. Na 6 uur werd het poeder gekoeld tot kamertemperatuur en werd het ammoniëren uitgevoerd zoals hierboven onder (a), waarbij men de temperatuur liet oplopen tot 70°C in 10 min. De totale ammoniëringstijd bij 70°C bedroeg 1 uur en het produkt werd gekoeld onder stikstof. De opbrengst bedroeg 31Λ g, opbrengst 20 100,8 $, het stikstofpercentage bedroeg 1U,02, 13,9^, en de 2 ί-ige waterige oplossing bezat een pH van 6,2*5, Infrarood- aftastingingen gaven de volgende absorptiebanden: niet gereageerd anhydride - aanwezig maar veel minder dan bij (a) primair amide hoofd, zoals onder (a) 25 φ φ carboxylion met NH^ NH^ carhoxylaat verhoogd carhoxylaat boven (a)* imide afwezig.

Voorbeeld VII

Kenmerking van eerder in wezen volgens voorbeeld VI bereide produkten Gedurende de periode van juli 1956 t/m februari i960 werden de half-amide-half-ammonimacarboxylaatzout-derivaten van verschillende viskositeitsgraad (verschillend mol.gew.) van EMA bereid en beoordeeld. De viskositeitsgraad, 35 uitgedrukt in specifieke viskositeit bij 1,0 gev.% in DMF bij 8000334 30 25°C, was verspreid over het trajekt van 1,19; 0,60; 0,11 tot 0,060. De geschatte mol.gew. (Mfl) overeenkomstige vaarden varen 50-60 000j 20-30 000j 2-3000 en 1000. De eerste drie, d.w.z. waarin gebruik; gemaakt vordt van EMA van 0,11j 0,60 of 1,19, 5 werden geammonieerd in een grote proeffabriekinstaUatie die produkthoeveelheden levert van 2T0-360 kg. Het lagere viskositeit (θ,θ6θ) EMA werd geammonieerd in een kleine laboratoriumapparaat met gebruikmaking van 200-300 g EMA. De methoden worden hieronder beschreven, gevolgd door kenmerken van het op dat tijdstip 10 verkregen produkt.

Samenvatting van de proeffabriekmethode (voor 1,19; 0,60 en 0,11 sp. vise. EMA): het "ammoniërings" vat dat gebruikt werd vas een ommanteld roestvrij stalen Stokes roterende droger, model 59AB voorzien van geschikte organen 15 voor het inleiden van droge stoom en watervrije ammoniak boven de oppervlakte van de inhoud, een roerder die werkt met een snelheid van 5,7 rpa en een draaibaar ventiel voor het afdichten van de bodem en het aflaten van het eindprodukt. Het "volle”

O

volume van de eenheid bedroeg 1,08 m , het "werkzaam" volume 3 2 20 bedroeg 0,73 m en het ommantelde oppervlak bedroeg 5,67 m .

In een karakteristieke loop werd het ammonieerapparaat aan de bodem gesloten en 225-270 kg van het EMA met de geschikte viskositeit werden met lopende roerder ingebracht. Het EMA werd verwarmd op 55°C waarna het voorgehydrolyseerd werd tot een 25 hoeveelheid van 0,15-0,20 mol water per mol EMA door "boven het oppervlak" toevoegen van droge stoom met een snelheid van 0,007 kg stoom per kg EMA gedurende 3 uur. In deze periode werd de temperatuur in het trajekt van 55-70°C gehouden door gebruik te maken van koelwater in de mantel. Watervrije gasvormige 30 ammoniak wordt daarna in de reaktor gebracht (boven het oppervlak van het partieel gehydrolyseerd EMA) met een zodanige snelheid dat de temperatuur in het trajekt van 60-70°C werd gehouden (ongeveer 2,25-3,6 kg/uur) tot 2,0 mol ammoniak per mol EMA waren toegevoegd. Nadat alle ammoniak wa3 toegevoegd 35 werd het produkt afgekoeld tot beneden 50°C en in opslagvaten 8000334 31 gesmoord.

Laboratoriummethode voor 0,06 sp. vise. EMA: het uitgangs EMA werd bereid op overeenkomstige wijze als beschreven in voorbeeld I, behoudens dat de reaktorvulling 5 bestond uit 267 mg maleïnezuuranhydride, 20Ö9 ml ethylbenzeen, 45,8 ml n-butyraldehyde en 13,20 g benzoylperoxyde die allen aan het begin werden toegevoegd. De etheendruk werd gedurende 2b uur op 1^ kg/cm bij 70°C gehouden. De opbrengst aan opgewerkt eindprodukt EMA bedroeg 279 g, opbrengst 73,3 %» 10 en de specifieke viskositeitproef 0,060 bij 1 % in DMF bij 25°C. In een 5 1 vierhalskolf werden 2^9 g van het EMA vaste poeder met Q,060 sp. vise, gebracht en dit werd krachtig geroerd gedurende 6 uur bij H5-55°C na de oorspronkelijke druppelsgewijze toevoeging van 5,3 g water (15 mol.i, betrokken 15 op EMA) om partiele hydrolyse te bewerkstelligen. Ammoniëren werd begonnen met gebruikmaking van droog watervrij ammoniakgas dat in het krachtig geroerde vaste EMA poeder werd versproeid en de temperatuur werd 18 uur op 31-32°C gehouden. In deze periode werd een langzame maar geleidelijke opname van ammoniak 20 waargenomen. Het eindprodukt woog 320 g, opbrengst 103,3 %.

Produktkenmerking van alle bovengenoemde produkten wordt beschreven in tabel E.

8000334 * 32 ö ο ρ φ W) ο Μ ·Η «Ö ο * Ο *rl Ν \0 ϊ 00 VO Ν Φ ö ο ο οοο -·» Φ § ·Η

(J * \0 t- VO * 1A>S'=Ö=S

Ο Ο 00 ΟΝ 00 S 21 r- 00 «» «- f— C0 β ö •Η

hO

•I-S

•Η Ρ ca • Ρ ft to Μ * to ·Η $ 0\ ·Η N * τ- ο νο ο in Ν a) ® ,ο Γ· ο η ιλ ο ^ φ . > 'g • οο m ο\ « co > = I = ο = = ο

Cd § 3 I

<υ Λ * ο ο -9 » ο «λ g ·η ο σ\ to “Η C0 ϊί • ΙΛ ·Η Μ rf -Ρ οο νο "% Μ . Φ & 2

vooo_s-t“00 cvi Φ I > 2S

ο « I fa IA · CVI > S = ti S Ϊ > o Ο O 00 ON NO ^-¾ 3 ·*

CVI r— τ— ΙΛ d Co QfH

1 p o # u ° H ** H jj % ' 1 *8 So o ® no

C3\ · Jt t— ΓΟ .... P ON

«- o cu ia «ο I I I ! *“ iri « νο iov* t I i I I f ! 2 ICQr-iTv I I I I I I I 2." o »- .¾ Sj Μ Φ

* I

p o .. Ο ·Η Φ Ο ΟΡΌ ,Η ΙΛ O w « «

o S3 *H

~ p _ fe -g 5

w. ο I ο λ S

o cvi o g w .· ο P w Pc p ·· C5 d Φ ® c S·· ö *-» wSt-ow

^ φ Φ W H

• P <d rrl AS Q w a w op Vi O OX»» 3 MO U Μ Φ Ο Φ -H O w * i 2 * * 1 i « w 5 ij 5 3 | Ü *g g 5 f S 1 3 δ •HP!* ·Η β Vc O <0 M Ö ‘j 5

ViAiS fidO 0,-90 3 O Ö ·η·η«50 g?p 9¾ £??«§? 2 pp i “ e®'e9^*r,bi ü U ' SVtAS >i®ö3OV»«§

ο .ο H aS-H «SdO'HftoS

•ϋΦΟΦΦΡΡ ë M to S to ·|“5 Μ Μ ·Η 8000334 33

Monsters van de half-amide-half-ammonituncarboxy-laatzouten van EMA bereid in 1957 - 1960 en in die tijd gekenmerkt zoals beschreven in tabel E werden bewaard in glazen potten met gewone schroefdeksels (niet onder stikstof noch op 5 enigerlei wijze afgedicht) tot begin 1977 in een pakhuis voor algemene doeleinden. Op dat tijdstip (1977) werden ze verwijderd voor voortgezette beoordeling (zie voorbeelden IX en X).

Voor hernieuwd gebruik werden de materialen opnieuw gekenmerkt met de resultaten als vermeld in tabel F.

10 Het blijkt, dat de onderzochte polymeerprodukten uit 1959-1960 (voorbeeld VIII), die geen imide bevatten op dat tijdstip, zowel ammoniak als water hadden verloren en daardoor waren omgezet in imidebevattende polymeerprodukten gedurende de lange opslagduur. Deze omgezette produkten, zoals nader onder-15 zocht in de voorbeelden IX en X leverden onverwachte afwijkende resultaten in vergelijking met de eerdere resultaten.

20 8000334 3k

bO

ta ·η •Η Μ CM Ν β> Ο t-^vo t- δ - - - oo d « t— pt ~ ös»« o\r- οο 0J ο\ w 3 " * " * 3 ° w Μ 60 ·γ» •Η Ν Λ (Ο Ν ® Ο u\ t— 41 !* co 00 » t- > s ΰ = - = ^ co ,α cm o\w g · " co «- *“ <e o *“ ^ 60 Μ ·ι-Ι

•Η N

vo Μ d CM

4 CO (D δ... .

j· * t— t* r q r = = on t“ oo <p cm o\ ^ g " " oo *” >—e} a ο o ft w

rH

o 3

ÊH

to tD *H _

•Η N O

CVJ Μ V ON

Jt Ö t- « > _ COLA

CM tJ * t- > = brss " *

I -4* On Ή § O ON

cq «- t- a) a τ ι P to O Ö «3

V

Λ > ω I d CM ·Η Η O +> +> +> O C O d ft

jd .. jQ d ^ --- COH

3 # b w η o

<otJ+> k o SbS

o o ® o o 5 O « i Ο β ·Η O d Q, to fl w Ό 43 ® ·Η ® , ·Η -P H « •d ·π +» 44 . „ b k -P JJ H g ® d 3«0*d d d g ti p *β P . H g g **· moo *> o -p ·η n h S p at •Η ·Η M Vi O d M Ö *H X ·Η \ «

SjVtCOkTi'pOddOg « 0 0·Η«ΡΙ+>&43'βΒ^9 ** *3 s 43 o « · é b *d ,r* b S ‘d ‘d

ieh^higefibei ö S

3 d d ·Η Vl s ® Ο ·Η ft O d ·Η *rl β t) ί ί fi Ο Η Ο CO Μ 8000334 35

Produktbeoordelingsvoorbeelden VIII - XXI

Voorbeeld VIII

3 versies van EMA, half-amide-half-ammonium-carboxylaatderivaten met verschillend mol.gew. (die geen 5 imidefunktie bevatten) als geïdentificeerd in voorbeeld VII: tabel E, a, b, en c werden beoordeeld in een onafhankelijk onderzoeklaboratorium gedurende 1959 en I960 met gebruikmaking van officiële methoden voor vast Sarcoma-180 tranplantaties zoals gespecificeerd door het Cancer Chemotherapy National 10 Service Center (CCNSC) en verkregen van de National Institutes of Health. De methode hield als toxiciteitsgrens 2 doden per zes dieren aan. Proef T/C verhoudingen werden berekend als de verhouding van het gemiddelde tumorgewicht Tan behandelde dieren tot het gemiddelde tumorgewicht van controledieren. De T/C 15 waarden werden berekend voor een reeks van 3 proeven van de voorafgaande proef met aanvaardbare grenzen. Het materiaal was aanvaardbaar wanneer(T/Cx (T/C)2 x (T/C)^ minder dan 0,08 bedraagt na de laatste proef. Proeven werden voortgezet wanneer (T/C)^ minder dan 0,5^bedroeg en wanneer (T/C)^ x (T/C)2 20 minder dan 0,20 bedroeg. De gebruikte dieren waren gespecificeer de Zwitserse muizen (CCNSC, specificatie XIV), de geneesmiddel-weg was intraperitonaal (specificatie III) en de dosisbepaling volgens specificatie XII. De samengevatte gegevens zijn vermeld in tabel G.

25 8000334 36 ö <o λ α> ο tb m *> Η « «5 p α» Α4 -* <ΰ η ω νο τ) Ρ \ •S ON - σ\ ν voo-s-hO a> om co ο 'vOltno ω o^.tno d -w a ο »Κ «ί3 VOWOOP Ο Ο £ -¾ ο

<= ^ - ° £ 8 S § R

g g * c Η3

2 I

1 "~ λ3 -Ρ Ο m <5 <1> Ti Ü 4η Μ t—» N ΟΝΓΟΝ SÜSrl

<-m co<l> ia la oj ia o w a O

,0- 0 iAt-<n«eiAt--OMJA^-Og U

^ «S t— >*. « -p t— ^ * " -p ^ <2 — o o cn o o ^ m «- o o μ οη — οοβ τ) B o S - 5* ^ ^ ^ >d 3 8 jjj p 43 ® Ί * t, <5 TJ ® & O CO t3 m £j 4^ I^Sovo^SovoSi-figio^®. 1 g * Λ e - o* § R o o | R > o o | | ζ ^ O O 4h Ο Ι 2 > -is,.

ra >

Ei Q) ·— p «Ti —«

0 ü Q> O

rrl O W *>» 1, 1 | S £ £ *i ! ü § ^ $ I Mill Mi!! 1 M g lillACMObO lllll lllll §£0 0“ £3 y i o vo ® 3 Ö N \ 0 fi — m +> fi a» —- <u ω η η o λ a s _.

">» r* o H

EH to H d w 0} O $·< Co +» * * * s $ « Λ~ -s 5 * < -¾ 0 ^ - c S o o töH bOr-i ε-ί jo h . J, i ^ 5 ~ Μ M d H * d ^ ö ί S wb D>-P-ö

MS 5 x S w 3 «I* S

Hi> g o 43 a o -PBO +2 * * 0 +i p +3 w ^ s « 4? j- e Ιό*! .htjob ·η 'ö o o a ‘d ί ii P 1

Bj O μ m O 'v. S W O ^ S W O v** B

S-.H'b O O En O O o bh H o O O &h Bh O

H_i o nj *β o >ö 'ö v_* ·*** o Ti Ti s—' o

60 ·η O

a o 3 »1 - w n .2 ra >d *H ^

1 £ 8 g S S

s 65 ft fi Ü Ü > 8000334 37

Hieruit verd de gevolgtrekking gemaakt, dat ofschoon de toxiciteit beter verd naarmate het mol.gev. kleiner verd, de aktiviteit verloren ging als de grootte afnam naar de inaktieve monomere groep voor deze reeks derivaten. Er verden geen 5 overeenkomstige derivaten met de partiële imidefunktie bereid of beoordeeld volgens CCNSC methoden, of enige andere methode in het bovengenoemde tijdsbestek (1959-1960). Alle drie de polymeren (a, b en c als boven vermeld) verden af gekeurd bij beoordeling volgens CCNSC methoden tegen Carcinoma 755 en Leukemia 10 1210.

Voorbeeld IX

De polymeersamenstellingen (a, b, d) als beschreven in voorbeeld VII, tabel P, bereid uit drie EMA grondstoffen met verschillende specifieke viskositeit en derhalve drie sterk 15 verschillende mol.gev., verden toegediend aan BALB/c muizen met gebruikmaking van drie doseringsschemafs (a) voor (dagen -9 en -1) of (b) na (dagen 1 en 9) tumorinoculatie met SVl+0 getransformeerde (aangeduid als mKSA-TU5) tumorcellen, of (c) zowel voor (dagen -9 en -1) als na (dagen 1 en 9) de tumoruitcLaging.

20 De verbinding verd intraperitonaal (IP) toegediend in 3 doses van 62,5i 125,0 en 250,0 mg/kg. Tumorcellen verden subcutaan (SC) k . ~ gemoculeerd m een hoeveelheid van 1 x 10 cellen m een groep dieren en subcutaan in een hoeveelheid van 1 x 10 cellen in een andere groep dieren. De groei van tumoren in de behandelde muizen 25 ten opzichte van normale niet-behandelde controlemuizen verd daarna beoordeeld. De data zijn samengevat in de tabellen Ha, Hb en Hd.

Uit tabel Ha vaarin polymeer uit voorbeeld VII - tabel P-a is gebruikt met gebruikmaking van een doseringsschema (a), bleven W % (17/36) van met tumoruitgedaagde muizen gezond en vrij van 30 tumor gedurende de 58 dagen durende observatieperiode. Op de 61 dag verden de dieren die vrij varen van tumor opnieuv uitgedaagd met levensvatbare tumorcellen (MKBA-TU5 met 1 x 10** cellen SC) en 82 % (1U/17) bleef tumorvrij (d.v.z. immuun) gedurende 7 dagen na deze uitdaging.

35 Met gebruikmaking van doseringsschema(b) vaarin 8000334 38 polymeer uit voorbeeld VII, tabel P-a werd toegediend na tumor-uitdaging, bleven k2 % (15/36) resistent tegen tumor na 58 dagen observatie. Na hernieuwde uitdaging (6lste dag) met 1 ,χ Ίο^ levensvatbare tumorcellen, bleven 80 % (12/15) tumorvrij gedurende 5 37 dagen na de hernieuwde uitdaging.

Dieren in doseringsschema (c) waarin polymeer uit voorbeeld VII, tabel F-a werd toegediend zowel voor als na de tumoruitdaging waren voor 28 % resistent (10/36) gedurende 58 dagen en al deze tumorvrije dieren waren immuun tegen de 10 secundaire tumoruitdaging.

800033$ 39

•O

•Η " ^ CO β i^Sóo o w j m j w tn w w o ia j· w on o >- 3 a$ cd +> a τ) β

CD

"ë ö

•H 0) CD

a> ·η μ 0 ft Λ feu* VO ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^ ^

Shu^vo ^ ^ w r- w Ji η j J vo ^ cvi mvo ia 1 C cd +3 -H Ö 8) r- <J\ ON · + 5 i + i + ö β H β β β β « ® «. o,«a>a> o ca eg I CA s = T= = ^Τ=:: ! |sr+s =

Ja ! + 1 + lag ww § s | is? - « S I « -s I *ϋ Ό w « ‘O; ^ ^ ^

Sïïv I oir. o 1Λ W* o IA W* I o in « O in N

^54 S GJ = ° ai S ÏA CM VO I LA CU vo IA« vo ^ O |j I CM ^ OJ *- CM - I W «“ CM <“

H

I M

I 5 S ö Η ίί Ö *.S 2 af I........$ S3 | - - - = = 2Öo«ho o £3 o S> 8 ?» ft og-PP.

ë ·§ > j>43 8 8 IA Λ <2 D +Λ ...... »_.+0 - - : : %u 2 .........2

p X H

8000334

Ho c <u

•rs bO

•rl aJ Jl 10 C CO O r- cvi

0 LA

§ a) -P Ö a <0 S a

•H <3 <D

4) ·Η M η ag|

E ·Η rö VO VO VO

tC U V X \ μ (U CO VO LA -sf

Q P LA

§ ö d P'H fi M * r-N 60 r- ·— bO β 1 +

I—I "H

2 3 § § a> g i o\ o\ >3 3 I + 5 s —· >C Λ <u o a d fp o) ® I (30 w « Ό

H

a> s

LA

ra bO *

•rf O IA CVJ

W \ LA CVI VO

O bO CVI «- a to u a « •rl a

*3 S

Vi fi £» ® ·Η H = = O Ο Ρ U P<

Pk g) >

O

w la m D +_ g-l O s t L P *“ < Q ..

si *

^ -P r- - E

8 0 0 0 3 3 4 1+1 ö α> •ο Μ •Η <β g ΙΑ «- Ο ΓΠ >- >- οι ^ τ-ο Ρ α) -μ ö § Ρ Ö •Η β> β> <u <η to S-H-Ö VO v^VOVOVOVOVO νονο dO O "v \ N "s N > Λ> k α> i- ir\ vo m ia ia 4 la irvvo

Q h tA

I «3

•μ ·Η C

A

I *“ Ox *7 O' w I + I + a ö a p ö .¾ S <u Φ <u w o\ T-^T--

Tl ¢4 I 1== + =- 1+-- ? § 1 } Ö P e W Λ Λ ο ί) ο ο ο w $ρ η η η js J3 J3 ο «ö <ö ·ο

S

Μ ΙΑ ΙΑ ΙΑ ΙΟ Μ * * * •Η id I Ο ΙΑ CM Ο ΙΑ CM Ο ΙΑ 04

w \ I ΙΑ CM VO ΙΑ CM VO ΙΑ CM VO

I CM *“ CM *- CM »”

tJ

ϊ « 1 >. I

3 3 B δ I

. a h I....... *? φ p β τι i*« h *d

Oh OH O 3 +4 4) Ο © H Pi pL, > © 0 +? £ «5 *d O +> fi ;>

S

a j· on

g *θ = = r = = = = = = O

i fc I I bC X * 8000334 1*2 a Φ • r-3 60 •rl CÖ g-0

U VO

o ai o o «- o o o«- ooo § a p fi a φ β β •H ® Φ ο ·η Μ 0 ft ή £&‘d10 vo vovovovovovo vo vo vo β ®VO X “N. N \ V X \ "N "N ^ ohcnvo vo ia vo vo vo ia vo vo vo § β a} -P ·Η β 1 * m «— 0\ »— Ov S I + I + •Η β β β β η φ φ ® ® φ >d ϋ (d σ\ = ~ »- c = σ\ <— = = I β g I + I +

W Φ Φ I

Η β) a ! β» ® « β) Ρ 03 60 Μ 60 Ρ β β Λ c3 <ϋ *ϋ <& ΕΗ •η Μ I ΙΑ Ο ΙΑ ΙΑ O LA ΙΛ Ο 1Λ

I t— ΙΑ CM C— UTS CV1 6— ΙΑ CM

SI? 1 60 Η β Η •rt ® >t) h TJ Η I Φ β Ο *β Φ <Η <Η β Η S _ _ _ Φ ρ -μ φη?3= = = = = = = = Ο ίπ β ο S η U Φ ο ρ ρ ο Οι É» υ k β ft Γ ΙΑ J· Ο ρ + Μ _____ ^ ο *= = = = = ' ' - || χ 8000334 U3 § •ι-j 60 •η a o M o O CM — Ο O CM O T-J- |I at +» e §

Is fi •h « ©

<U ·Η bO

2 .H VO VO VO VO VO VO VO vp VO VO

M ¢1 S, \ ''S ^ ^ V, ^ ^

j7 Svo \0 VO -=T IA VO VO -? VO ITvCVJ

q hm pea) +» ·Η fi

rH

§ Γ t «· *" <* On © to I + 1 + * a fi fi C fi .3 δα»©® d ©_ ^==^==^-== I d d , I + 1 +

W I i ί fi fi S

Η Λ Λ 1 © ft &

© « o sp $ BP

p p to d “ 5 ^ d d d ε-ι

•Η JlF I 1Λ Ο ΙΑ ΙΛ O (A IA O (A

Jj 1 t— ITv CM t— Lf\ CM 6— ITvCM

0 «0 I

d a 60 β © H .

•Η Η M d d P > I fi g.s I 2^1........

£·£ § 6........

I ° 2% 3 U -P ft o 2

lA CO

S + O

!H OCQ = = = = = = = = “ Q9 * .........

a +> «“ =------ - - 8000334 fi ^ < o 44

Polymeer uit voorbeeld VII tabel P-b verd alleen maar onderzocht bij muizen die ingeent varen met 1x10** levensvatbare mKSA-TU5 cellen (SC) (zie tabel H-b). Met gebruikmaking van doseringsschema (a) bleven 22 % {U—18) van de 5 muizen tumorvrij gedurende 51 dagen observatie. Met schema (b) bleef 22 % (4/18) van de met tumor uitgedaagde muizen eveneens vrij van tumor na 51 dagen* In groep (c) bleven slechts 2/18 (11 %) tumorvrij gedurende 51 dagen. Op de 54ste dag kregen allen bovengenoemde tumorvrije muizen (10/5*0 opnieuw een uitda-10 ging met 1x10 levensvatbare mKSA-TU5 cellen SC en na 37 dagen varen alle 10 tumorvrij gebleven (d.v.z. immuun) tegen de hernieuwde tumoruitdaging.

Polymeer uit voorbeeld VII - tabel F-d werd onderzocht op twee tumoruitdagingsniveau’s zoals voor polymeer 15 VII-tabel F-a hierboven (zie tabel H-d). Omdat polymeer uit voorbeeld VlI-d een veel hoger mol.gew. heeft dan de polymeer uit voorbeeld Vila of voorbeeld VlI-b, werd de toegediende (iP)dosis vastgesteld op 75« 50 en 25 mg/kg. Met behandelings-schema (a) bleven 11 % (4/36) van met tumor uitgedaagde muizen 20 tumorvrij na 36 dagen waarneming. Van deze muizen bleven 75 % (3/4) tumorvrij na 37 dagen secundairehernieuwde tumoruitdaging. In schema (b) bleef 8 % (3/36) tumorvrij na 36 dagen primaire tumoruitdaging en slechts een daarvan was immuun tegen secundaire hernieuwde tumoruitdaging. In schema (c) waarin polymeer uit 25 voorbeeld VII, tabel F-d werd toegediend zowel voor aLs na de tumor, bleven 14 % (5/36) tumorvrij gedurende 36 dagen en 4 van deze 5 (80 %) bleken immuun tegen secundaire hernieuwde tumoruitdaging.

Het totale aantal tumorvrije dieren in de tabel-30 len Ha, Hb en Hd aan het einde van de respectieve observatieperioden, verkregen uit twee bronnen, (a) die welke tumorvrij waren gedurende de gehele observatieperiode en (b) degenen die meetbare tumoren ontwikkelden tijdens de observatieperiode en die vervolgens afnamen en verdwenen voorafgaande aan het einde 35 van de observatieperiode.

8000334

Een onderverdeling van teruggelopen tumoren ten opzichte van degenen die tumorvrij "bleven gedurende de gehele periode zonder regressie gaf zovel een afhankelijkheid van tumorbelasting en van het gebruikte polymeer aan, De 5 samenvatting van de onderverdeling van teruggelopen tumoren uit het totale aantal tumorvrije dieren is weergegeven in tabel H-e.

8000334 H6 ©

TJ

0 0) ·Η M ® m , ft m VO Ol - ÊHOO OO t- © LA Ol CO 0 O 0\ 0| t- ·Η

U P

* U

O

CO

H . . « CO-sH CM IH O O O CU CM © 45 r- cul J· Ϊ5 H *“ I *” 'Ö ° 1 i § w > ra ® ® u ηύ CM WJ fl

W ® -H

0) ® a £5 « « to ® , . . ft % m ti ! I I uJ Λη u o 0 41 j EH σ\ ον o cm| cm m _

to i 1- CM CO S3 I I . S

® 3 · 5 -p © >0 β o ® H ft β ® O'-' S 'Jj

I r— ft H

« .3 3»

® t I S

gj <11 Λ I W Οι Π coo CO EH 1-j *- oo o rag ® 3 I a ^ ^ £ 0 b0+> I I 0 ^ ® o H 45 ® Λ ® ® ·Η Μ Mo C CO J- CO -4 CO J· _ 45 •H OO H OOH ΟΟΗ © β Λ

e. jj t— t— Co t— Co r- r- m Ό u) U

Q m m flj Cd W ö Ê4 O

1"S X X 5 XX* Η Η β ® § £

I S3 --5 -- 5 --5 SIS

55 ^ ϊ * %

bO ® O

I I 'ö 1 ·<-5 Η 43 Η Η Η ·Η © Ο Η Η W U 44 ·Η > d > ,ο Ρ ö S <d ft tift *3 ft 2¾11

® Η Η Η § +J

ö ®Η ©Η «Η 3 Ο Η C © © Ο© ©© +5 Ο ^

Ο μ d U © 3" CT

ft Ο45 Ο45 Ο45 CM OO

ο Ο ρ '— — '— > > > Η ra © β Γ0 © d ο 43 Μ*> d & *0 & β W ώ « 8000334

Voorbeeld X

ut

De polymeersamenstelling uit voorbeeld VII -tabel P-a werd opnieuw onderzocht zoals in voorbeeld IX, behoudens dat 10 muizen ge-bruikt werden per onderzoekgroep 5 en alleen de behandelingsschema's (a) en (b) werden gebruikt.

De gegevens zijn samengevat in tabel J.

Gebruikmakende van doseringsschema (a) waarin polymeer werden toegediend op dag 9 en dag 1 voorafgaande aan de tumoruitdaging, bleven 37 % (22/60) van de met tumor uit-10 gedaagde muizen tumorvrij gedurende een 61 dagen durende observatieperiode. Op dag 62 werden 21 van de tumorvrije dieren opnieuw uitgedaagd met 1 x 10 mKSA-TU5 tumorcellen (SC) en na nog 30 dagen war·* 90 % (19/21) van de muizen tumorvrij (immuun).

15 In de tweede doseringsschema (b), waarin polymeer werd toegediend op dag 1 en dag 9 na de tumoruitdaging, bleven 1+7 % (28/60) van de muizen tumorvrij gedurende de 61 dagen durende observatieperiode. Van de 28 tumorvrije muizen (na 61 dagen) bleef 64 % (18/28) immuun gedurende nog 30 opvolgende 20 dagen na secundaire hernieuwde uitdaging met tumor.

8000334 1*8

G

o

•o bO •Η V

g-d O'S O w O M 4 01 ΙΛ n ^ CO 01 ΙΛ o\ I eö

•P G

a v

ö ö •Η V V

a> *h bc S-H-dO OOOOOOO oooooo g)M r— r- r- «— t— »- r- ï— T-t-f— t- «—

1,11)1- \ Ή» \ \ X X S. \ \ N V V ''I· V

0 ttVO o 00 O t- MO MO t- LA o- 4 C\l t- 1Λ r 1 ö (d "" ^ -P ·Η Ö <- On »- C\ I I + I + 3) d ö a g a v v o o h Ch= = *-== C\ Z Z r- Z * <a i + i +

rr) aJ I I

Cg Ö G ld G

S § v v iv v Λ Λ Μ Μ Μ “

V ο aJ ο d V

^ ρ tn >d <d *0 "ύ Η

V

S

ΕΗ ΙΑ ια ια ια m Μ ·> » * *

•Η ϋ I Ο ΙΑ 04 Ο ΙΑ CM I Ο LA CM Ο ΙΑ CM

W I ΙΑ CM MO ΙΑ CM VO I LA CM VO IA CM VO

t|) I CM 1- CM «- I CM»- CM»“ » »

Η H

bO H .

ö > d > d >r< V I h V I *4

>d H 'd £, V

Ö Ο Η V Ο Η V

4π·Η d V H S _ _ U V H §.....

vp +3«(us=s = = = ί S Ϊ5 : : : : ·

0 U ÖPPH G P P H

g,p s s5 a § asa % ?

o U

LA CO _ CO

to J- 64 O rsssrso sssss- t U *"

1 § * M

é1 -P ,- ssrsrrr- srrsss 8000334 1*9

Voorbeeld XII

De polymeersamenstelling uit voorbeeld Vla, vaste fase gasvormig geammonieerd EMA. zonder toegevoegd water, werd toegediend aan BALB/c muizen met gebruikmaking van de 5 doseringsgehalten en behandelingsschema’s van voorbeeld X met 10 muizen per onderzoekgroep. De verkregen gegevens na een observatie van 61 dagen zijn samengevat in tabel K. Met gebruikmaking van behandelingsschema (a) waarbij polymeer uit voorbeeld Vla wordt toegediend op dag 9 en dag 1 voorafgaande aan de uitdaging 10 met tumor met mKSA-TU5 tumorcellen, bleven 1*0 % (2U/Ê0) van de muizen tumorvrij na 61 dagen.

Bij gebruikmaking van behandelingsschema (b) waarbij het polymeer uit voorbeeld Vla werd toegediend op dag 1 en dag 9 na tumorinenting, bleven 32 % (19/60) van de met tumor 15 uitgedaagde muizen tumorvrij na 6l dagen. Van het totaal aantal van 1*3 tumorvrije muizen uit de groepen (a) + (b) na 61 dagen, bleven 36 (of 87 %) immuun tegen secundaire hernieuwde uitdaging ' met levensvatbare tumor (1 x 10 cellen) gedurende een tijdbestek van 30 dagen.

8000334 50 ö o bo ^ i- r- CVI »” «“ fO s r- 04 CO 1Λ h ΙΊ 1Λ

0 O

1 al -P «

C

a> -p

ö c •H « <u β·Η M

£ ·Η*χί O o o o o o o o o o o o o o

Bi f) I— r- 1— ^ t— «— r- ^ t— t— f— f— »— t— J. tl) ’— --- X \ \ \ \ "X \ \ v, --- \ "N \ 0 j*\o C\ co on o\ t— \o o\ co c\) ia n t— c- ia

1 β aJ

P ·Η β t- σ\ *“ C\ I l + I +

Si s c β β c © © β» α> •rt _ pj o\ ï s T- r s σ\ s c r- r z 0 1 + 11 + ε ! e a 1 0 c

* ΑΛ $ S5 SP $P

H 0) O © © «J O

Q) n xj Ό Ό Ό s 01 tf)

>ri Μ I ο 1Λ W Ο ΙΑ N 1 O IA OJ © 1A CM

w \ I 1Λ OJ U) ΙΛ C\l VD I IA CVI VO IA OJ VO

bj) I CVI»- CM»- I CVJi- OJ *-

β oS

Μ Η W

β > > •Η © _ U ® _ j·} tJ H *0 ® H tS «

fl Ο H 0) OHO

<Ρ·Η h ® e . . . h 8 I.....

O h fi P H g f1 H

s b i § a £ ? to p- 0 no _ E-( OCQSSSESrem = = = = = =

Lh II X x 8000334

Voorbeeld XII

51

De polymeersamenstelling van voorbeeld VIb, vaste fase gasvormig geammonieerde EMA. met toegevoegd water, werd toegediend aan BALB/c muizen met gebruikmaking van doserings-5 gehalten en behandelingsschema's volgens voorbeeld X met 10 muizen per proef groep. De verkregen gegevens na 61 dagen observatie zijn samengevat in tabel L? Met behandelingsschema (a) waarin polymeer uit voorbeeld VIb- werd toegediend op dag 9 en dag 1 voorafgaande aan de tumoruitdaging met mKSA-TU5 tumorcellen, 10 bleven 30 % (18/60) van de muizen tumorvrij na 61 dagen. Met behandelingsschema (b)waarin polymeer volgens voorbeeld VIb werd toegediend op dag 1 en dag 9 na tumorinenting, bleven 17 % (10/60) van de met tumor uitgedaagde muizen tumorvrij na 61 dagen. Van het totaal van 28 tumorvrije muizen uit de groepen (a) + (b) 15 na 61 dagen bleven 23 (of 82 %) tumorvrij gedurende 30 dagen na een secundaire hernieuwde uitdaging met 1 x 10 tumorcellen.

8000334 52 α> ïïg1 Μ τί fcr- Ο W r- (η (VI (η Ο VO W VO 4 ΟΙ Ο (*1 Ο \ο I a

+s CS

§ la c

•Η (ΜΙ Μ ·Η K

Ο ft a) Ο οοοοοοο ο ο ο ο ο ο ί ·Η r- r- t— τ- <— 1— «— 1— ^-r-r-i-T-r- Μϋ ·Ν N N N N N X N N \ N N. \ S.

JL, qj r— O CO C\ t— CO t~ O J- CO 4 \fl 00 O S

0 fcvo

1 CS eJ

-μ ·η S3 -- 0\ r- 0\ i i + i + 5 ö ö q sa S3 O V 0)0) h o\ s s — s s j q\s=^-=s 0) i + i · +

ij xi aj I

q g t q q q cs H 3 § I O V β> 0) O Λ Λ I M w bp bp & o> o ai aj <g o CÖ P IQ Ό Ό Ό Ό

•Η Μ I O LA CM O LA CM I O LA CM O LA CM

M'v. | ΙΑ ΟΙ Μ) IA CM VO I LA CM VO LA CM VO

O tfl I CM «— CM «“ I CM ·— CM«— >ö a

rQ

ta & i

C *l H

•3 « H h « > Jj <t) H > 0) H 0) S3 Ο V O "Ö 4) *H ·Η h ^ § --- - fc'dl- - - -- OP -PH>,S = = = = -p 5? = = ~ ~ -

0 U G <U H q«H

14 (D o as o 0 0 ft > υ ,α ft oqp,

h O

O P

2 * 6 jj- on H oose==ssoo=sssss 1 u »- M *“ ω

I | « K

8000334

Voorbeeld XIII

53

De beoordelingrals beschreven in voorbeelden IX-XII verden uitgebreid tot een tweede tumormodelsysteem dat bestond uit een transplanteerbaar Fis-her (F^j^) stam rat 5 3-methylcholanthreen veroorzaakte blaascarcinon. Wanneer deze tumor getransplanteerd werd in normale Fis-;her-ratten,groeit hij op de primaire plaats en vindt spontane metastase naarde longen plaats. Bovendien wordt altijd terugkerende kanker waargenomen na chirurgische verwijdering van de primaire tumor* 10 Het eerste onderzoek werd ontworpen om de invloed van polymeer uit voorbeeld VII - tabel F-a te bepalen op de overleving van ratten die een tumor hebben en het vermogen van de verbinding om vorming van meta3tasen te voorkomen.

Fis*her-stam-ratten met ieder een gewicht van 1^ ongeveer 250 g werden subcutaan geïmplanteerd (trochar) met een 2 x 2 mm sectie van de tumor. Na 5,12 en 18 dagen na de tumor-implantatie, werden de tumordragende ratten behandeld met polymeer in een dosis van 62 mg/kg door injektie in de peri-tonale holte. In totaal werden 6 dieren op deze manier behandeld.

20 ^ dieren met geïmplanteerde tumor bleven onbehandeld endienden als controles Alle controledieren stierven aan ziekte binnen 3 weken of een gemiddelde van 15 dagen na tumorimplantatie. twee van de behandelde dieren stierven na 37 dagen. De vier overige dieren werden op de U2s^e dag na de implantatie .afgemaakt.

25 Grondig onderzoek toonde aan dat ze duidelijke primaire tumor-groei bezaten maar geen metastatische longziekte.

Voorbeeld XIV

Een tweede onderzoek werd uitgevoerd om voorbeeld XIII te herhalen en de invloed vast te leggen van een 30 lagere dosis en verlaagde frequentie van de behandeling.

Fis-her-stam-ratten kregen hetzelfde tumorimplantatie en 8 dagen na de implantatie verden tumordragende ratten behandeld met polymeer uit voorbeeld VII, tabel F-a in een hoeveelheid van 65 mg/kg of 30 mg/kg door een I.P. injektie (U ratten per 35 groep). 16 dagen na de implantatie kreeg de lagere dosisgroep 8000334 5** een booster van 30 mg/kg. Overleving verd waargenomen gedurende een periode van 6 veken. Na 6 weken werden de overlevenden onderzocht op aanwezigheid van metastatische ziekte in hun longen. 5 dieren met geïmplanteerde tumor bleven onbehandeld 5 als controles. Alle controledieren stierven aan ziekte en hadden een gemiddelde overlevingsduur van 23 dagen na tumor» implantatie. De groep van 1* dieren met êên enkele dosis van 65 mg/kg geneesmiddel was na 1*0 dagen in leven en verd afgemaakt. Uit onderzoek bleken geen metastasen. Van de groep die een 10 een 30 mg/kg booster na 16 dagen ontving, stierven twee op de 3jjste respt 36ste dag en de overige twee werden na 1+0 dagen afgemaakt. Opnieuw bleek bij onderzoek geen metastase te zi£n opgetreden. Verlengde overleving ten opzichte van controledieren in beide behandelde groepen spreekt natuurlijk vanzelf.

15 Voorbeeld XV

Een derde onderzoek werd ontworpen om het vermogen van polymeer uit voorbeeld VII - tabel F-a te beoordelen voor het verhinderen van terugkeer van tumor bij Fis~her-ratten waarvan de primaire tumor chirurgisch is verwijderd. Fiswher-20 stam-ratten kregen een trochar implantatie van een 2 x 2 m sectie van tumor zoals in de voorbeelden XIII en XIV. De tumor liet men daarna groeien tot een afmeting van 2-3 cm middellijn.

In dit stadium (8 dagen na implantatie) werd de tumor chirurgisch verwijderd en tegelijkertijd werd de rat behandeld met êên 25 enkele dosis polymeer in hoeveelheden van 65 mg/kg of 30 mg/kg door een I.P. injektie bij twee groepen van ieder 1+ ratten. Overleven en terugkeer van tumor werden beoordeeld gedurende een periode van 7 weken. Van de groep die 30 xag/kg polymeer ontving bij tumorresectie, waren alle 4 nog in leven na 1*7 dagen zonder 30 enige verschijnsel van terugkeer van tumor. Van de groep die 65 mg/kg kreeg als êên enkele dosis ten tijde van de resectie, stierf êên op de l6e dag na terugkeer van tumor terwijl de andere drie in leven waren na 1*7 dagen zonder enig verschijnsel van tumor-terugkeer.

35 8000334

Voorbeeld XVI

55

Een tweede studie voor het voorkomen van terugkeer van tumor werd uitgevoerd met Fis-her-ratten overeenkomstig als in voorbeeld XV, behoudens dat drie polymeren met verschillend 5 imidegehalte werden gebruikt. De imidegehalten bedroegen resp.

0, 5 en 21,7 %· Bij deze studie geschiedde trocharimplantatie van tumor op de wijze als beschreven in de voorbeelden XIII, XIV en XV. Excisie van alle tumoren geschiedde 1U dagen na implantatie.

IQ Eén groep van vier ratten werd gebruikt als controle en kreeg geen behandeling ten tijde van de excissie. Tumorterugkeer bedroeg 100 % op resp. 21, 33, Uo en UU dagen na excissie met een gemiddelde terugkeerduur van 3b dagen. Van deze controlegroep stierven twee ratten op de kb dag en 15 twee waren nog in leven en werden op dat 'tijdstip afgemaakt.

Alle vier bleken verschijnselen van metastase te vertonen.

Een tweede groep van 5 ratten ontving een enkele I.F. dosis van 30 mg/kg van het polymeer uit voorbeeld Ha (0 % imide) ten tijde van de tumorresectie. Van deze groep 20 trad tumor hernieuwd op bij twee ratten op de 33 dag na resectie en bij een derde op de 40 dag. Na 55 dagen vertoonden 3 van de 5 ratten {60 %) teruggekeerde tumor. Een derde groep van 6 ratten kregen enkele I.P. dosis van 30 mg/kg van het polymeer uit voorbeeld III, tabel D-1, die 5 % imidefunktionali-25 teit bevat, tentijde van de tumorresectie. Er werd geen terugkeer van tumor waargenomen bij een van de dieren gedurende 55 dagen. Op de 55 dag stierven twee van deze ratten (zonder tumor) en bij onderzoek werden geen blijken van metastase gevonden.

30 Een vierde groep van 6 ratten kregen enkele 1. P. dosis van 30 mg/kg van het polymeer uit voorbeeld VII, tabel F-a, dat 21,7 % imide bevat, ten tijde van de tumorresectie. Bij deze groep vertoonde êén dier terugkeer van tumor op de 21SÏe dag en een tweede op de 1+3s^e dag. Allen waren na 55 dagen 35 nog in leven. Derhalve vertoonden slechts twee van de zes terug- 8000334 56 keer of een gemiddelde van 33 %·

Voorbeeld XVII

Dierproeven als beschreven in de voorbeelden XIII - XVI maakten gebruik van polymeren die varen toegediend 5 door injektie in de peritonale holte. Dit voorbeeldJaat de bruikbaarheid van een imidebevattende samenstelling zien bij orale toediening ten tijde van tumorresectie teneinde terugkeer van tumor te voorkomen of te vertragen. In voorbeeld XVI werd vastgesteld, dat controledieren die geen geneesmiddel verkregen 10 ten tijde van de tumorresectie een gemiddelde tijdsduur voor de terugkeer van tumor vertoonden van 3^ dagen.

In dit voorbeeld kreeg een groep van 10 Fis-.her ratten trochar implantatie van tumor net als in voorbeeld XIII.

De ontwikkelde tumoren werden chirurgisch verwijderd op de 13e 15 dag na implantatie en gelijktijdig werd iedere rat geincubeerd met 1 ml steriel water waarin 30 mg/kg van het imidebevattende polymeer uit voorbeeld VII, tabel F-a (21,7 % imide). Het weer optreden van tumor werd daarna gedurende een periode van 10 weken geobserveerd. Een rat stierf ten tijde van de chirurgische 20 tumorverwijdering. Van de overige negen ratten werd terugkeer van kleine tumoren waargenomen bij zeven dieren op resp. de dagen 1*2, k29 k23 k3, 46, 50 en 59 na tumorexci^sie. Twee ratten waren vrij van terugkeer van tumor na 70 dagen.

Voorbeeld XVIII

25 Het doel van deze proef was om te bepalen of blootstelling van tumorcellen aan polymeer uit voorbeeld VII, tabel F-a hun antigeniciteit wijzigde en/of een direkte cytotoxische werking bezat op de tumorcellen.

Tumorcellen werden bereid uit de BLCa tumor 30 als beschreven in voorbeeld XIII door een subcutane tumormassa uit te snijden. De cellen werden daarna in suspensies gebracht door de cellen uit de tumor te lokken met aanvullende voorzichtige trypsinisering van de tumorstukken. De afgescheiden cellen werden 3x gewassen in een uitgebalanceerde zoutoplossing (BSS) en geteld 35 om de verhouding levens/dood te bepalen. Een celpopulatie van 8000334 57 90 - 95 % werd op dit punt verkregen.

Tumorcellen in een concentratie van 1 x 10^ cellen per ml in Eagles minimum wezenlijk medium in Earl's BSS, + 10 % kalverfoetusserum werden geincubeerd met 30 mg/ml polymeer uit voorbeeld VII, tabel P-a, Incubatie werd uitgevoerd gedurende 90 min. bij 37°C, waarna de cellen uit de suspensie werden gehaald door centrifugeren bij 300 g gedurende 6 min. De cellen werden opnieuw onderzocht op levensvatbaarheid, die niet veranderd was ten opzichte van het niveau voor incubatie. De methode werd herhaald bij drie afzonderlijke gelegenheden.

Cellen uit deze proef werden geinjekteerd in mannelijke Fisher-ratten en wel subcutaan in een dosis van 6 1 x 10 cellen. Vijf dieren worden geinjekteerd met cellen die met polymeer waren behandeld en vergeleken met vijf dieren die tumorcellen kregen en behandeld werden als hierboven beschreven maar zonder toegevoegd polymeer. De resultaten zijn samengevat in tabel M.

Tabel M

controles^ proefdieren dagen om 2-3 cm dagen om 2-3 cm rat nr. tumor te ontwikkelen tumor te ontwikkelen 1 11 11 2 11 11 3 13 13 h 11 11 5 13 11 ' ' c I ^ ~ (1) 1 x 10 Tumorcellen niet geincubeerd met met polymeer geënt S.C.

(2) 1 x 10^ Tumorcellen vooraf geincubeerd met met polymeer uit voorbeeld VII, tabel F-a geënt S.C.

Er bestond geen verschil tussen deze dieren ten tijde van de tumorontwikkeling. Verder was het groeipatroon van de tumor daarna vergelijkbaar tussen de twee groepen.De gevolgtrekking uit deze proeven is dat in de gebruikte dosis polymeer uit voorbeeld VII - tabel F-a (21,7 % imide) geen direkte cytotoxische werking bezat op BLCa tumorcellen. Bovendien wijzigt de preincubatie 8000334 58 van polymeer met de tumorcel niet de antigeniciteit van de tumorcellen.

Voorbeeld XIX

De direkte toxiciteit van imidebevattend 5 polymeer uit voorbeeld VII - tabel P-a werd bepaald aan normale mannelijke Fis*herratten. Zowel I.P. als I.V, injektie van polymeer bestond uit ongeveer 1 ml fysiologische zoutoplossing die de geschikte hoeveelheid polymeer bevatte. Om de toxiciteit te bepalen werd het polymeer in dosis van 100 mg/kg met oplopende 10 toevoegingen van 100 mg/kg tot aan 1000 mg/kg aan 5 dieren in iedere dosisgroep toegediend. Het polymeer werd zowel intraperi-tonaal als intraveneus toegediend. Er werd geen giftigheid of dood van dieren waargenomen bij dieren die behandeld werden langs intraperitonale weg tot na 30 dagen waarneming op een totaal van 15 50 ratten. Giftigheid werd echter waargenomen wanneer het polymeer werd toegediend in een dosis van 800 mg/kg (I.V. weg) en meer.

Eên van de vijf dieren bij 800 mg/kg, twee van de vijf dieren bij 900 mg/kg en vier van de vijf dieren bij 1000 mg/kg bleken krampen te ontwikkelen bij intraveneuze toediening van polymeer 20 en stierven. Er werd geen giftigheid of doden waargenomen bij dieren die I.V. dosis kregen toegediend van 700 mg/kg of minder gedurende de 30 dagen durende observatieperiode (35 dieren).

Na de 30 dagen durende observatieperiode werden de 85 overlevende ratten afgemaakt en de hersenen, longen, hart, 25 lever, nier en milt van iedere rat werden onderworpen aan grove en microscopische pathologie. Er werden geen met geneesmiddel verband houdende afwerkingen waargenomen in een van de orgaan-weefsels.

Bij een ander onderzoek werd de giftigheid van 30 het hierboven genoemde I.P. toegediende polymeer vergeleken met het oraal toegediende. Het polymeer uit voorbeeld VII-tabel F-a werd toegediend in doses van 100 mg/kg, 500 mg/kg en 1000 mg/kg hetzij door injektie ( I.P.), of door toediening (P.0.) aan elk van vijf Fisvher-ratten per dosisgroep. De ratten 35 werden geobserveerd gedurende 1H dagen en er traden geen doden 8000334 59 of toxische verschijnselen op. Na 1U dagen verden alle dieren af gemaakt, zovel die met I.P, als met P.O. geneesmiddeltoediening en de hersenen, longen, hart, lever, nier en milt van ieder dier verden aan grove en microscopische pathologie ondervorpen, 5 Ook hier verden veer geen afverkingen waargenomen in een van de organische weefsels.

Voorbeeld XX

Polymeren volgens de uitvinding, zoals beschreven in de voorbeelden III en IV verden beoordeeld bij normale Lewis-10 ratten op hun vermogen om immuunresponsen te verhogen uitgedrukt in verhoogde 19-S (igM) antilichaamvormende cellen voor hetero-loge erythrocyten (rode bloedcellen van schapen, SRBC) door de standaard Jerne Plaque proefmethode. Zie: “Textbook of Immunology1', J.T. Barrett, C.V. Mosby Company, 1978 en “Immunology'', H,N. Eisen, 15 Medical Department, Harper and Row Publishers Inc., 197^. In een karakteristieke proef wordt een dier, in dit geval een Levisrat, geïmmuniseerd met 1 ml van een 1:5 verdunning van gewassen SRBC in fysiologische zoutoplossing via de staarteder. Tegelijkertijd kregen de dieren I.P. injekties van het aangegeven polymeer 20 in 1 ml fysiologische zoutoplossing. Na ^ dagen worden milt-cellen van de geïmmuniseerde dieren afgezet op platen in een agarose weefselcultuursysteem met SRBC. Het veefselcultuur-medium bevordert de groei en afscheiding van antilichaam door de antilichaamvormende cellen. Deze anti-lichamen diffunderen van 25 de vormende cel en hechten zich aan nabij gelegen erythrocyten.

Aanvullend serum (normaal cavia-serum) wordt toegevoegd om lysis te bevorderen van het RBC, dat bedekt is geraakt met anti-lichaam, waardoor een schone ruimte of plak wordt gevormd rond de antilichaamvormende cel. Dergelijke plakken (PFC) worden geteld en uit-30 gedrukt als aantal PFC per 1 x 10^ miltcellen. De resultaten zijn samengevat in tabel N. Alle polymeersamenstellingen in tabel N werden onderzocht hij 30 mg/kg.

35 8000334 60 o o #k r“

bO

Ö II

•H

Vc Λ)

4) H oiA-d'OMDCMCOVOOv^-fnf’OOO

r-4 X O o t— ΙΛ VQ 00 »“ CM —f LTS CM C\ VO

gtö+i t-cvjcjcjcvjmononooooajoj’- •h ö β p ·η o ta o β ®

H

VO H

O 4J

o oo J- \o co o o vo co -=r w tn j· vo

•S +» VOVOJ-t-CMi-VOVOCOOVVOVOCVJ

s o x Η !ΛΙΛ4-ίν0Ι-(Ο0Ν0\0\ίΜ\0α\ (50 pr, ·Η T-1-1-1-T— r-T-T-^r-T~

H Ph »— S

a

H

<D 0) ,Ο rö

cd H

&4 Φ Η Η β "d (d (d β) Ό

5 p ^ ·Η VOOOVOOOVOOVOOVÖOO

Ρβ®8»-’_ t-τ- *- r- r-T- O «S -H 0)

p m Ό M

(U

Ό

•H

§ bO +>>*. fl •Η <U >H CnmiAirvO»--tfC\lVOt-«“

H iri iri I

,J 3 |OlAVOT-\OVO-a--ÏCOC\JJ*0 JJ δ O I r-r-r-OJC\JC\JOnCnir\ "d ·Η Λ ΐΑ ·Η h

S « <U

•Η IH ^

V

• H (Ί -i _ β U O I » » ^

O β *4 Q P Q I

H _ -P (=> μ p h o θ·9 °9 * O ·Η « o ö d«J I l I -2 «> β ·> w P PP O O Q ®

&P -P

L d * * » · · · I

r4 O S «J Μ HH O Λ & H

o O

P) > 60HHHHH I P I E-t l IH H 1 8000334

Η H

Η Μ H

Η H W

H

Voorbeeld XX-a 61

In een verder stel proeven verden de invloeden van polymeer uit voorbeeld VII- tabel F-a op IgM antilichaam-respons op SRBC antigeen (veer met gebruilanaking van de Jerne 5 plak proefmethode zoals in voorbeeld XX) beoordeeld (1) in normale Levis-ratten met polymeer dat hetzij I.F. of oraal is toegediend en (2) in Levis-ratten als een vervanging voor thymisfunktie, ook veer met polymeer dat hetzij I.F. of oraal is toegediend. In geval (1) verd de methode van voorbeeld XX 10 gevolgd.

In geval (2) verd de normale thymisfunktie ver-vijderd door volvassen thymectomie (Tx), die chirurgisch verd uitgevoerd op een leeftijd van 8-12 veken en hoge doses totale lichaamsbestraling (TBI), gevolgd door beenmergcel repopulatie 15 (BM). Thymectomie, totale lichaamsbestraling en beenmergcel- repopulatie geschieden allen volgens standaardmethoden als beschreven door R.E. Falk c.s., Surgery, oktober (1978), R.E. Falk c.s., Abstract, Can. Soc. for Clinical Investigation, 2k-27 januari, 1978, Vancouver en R.E. Falk c.s., Abstract, 20 Royal College of Physicians and Surgeons, 25-28 januari, 1978, Vancouver.

Bij deze methoden verden TBI en BM repopulatie uitgevoerd de dag na de chirurgische thymectomie. Voor TBI verden de dieren bestraald met gebruikmaking van een cesium-25 bron (Atomic Energy of Canada). De bestralingsdosis in deze machine is gecalibreerd door de leverantier en er vordt op gelijkmatige vijze over het gehele lichaamoppervlak van dieren die in de houder zijn geplaatst aangebracht. Voor Bi repopulatie verden enkelvoudige celsuspensies van beenmergcellen bereid door 30 de lange beenderen van de femur en tibia bij de rat te vassen met een evenwichtige zoutoplossing (BSS) bij U°C. De cellen verden 3x gewassen in BSS en geteld in een hemocytometer om de levensvatbaarheid en geschikte celverdunning te bepalen. Cellen verden I.V.toegediend met gebruikmaking van preparaten 35 met meer dan 90 % levensvatbaarheid. BM repopulatie voor iedere 8000334 62

Q

rat vergde 1 x 10° cellen.

De mortaliteitverhouding van dieren voor de totale Tx + TBI + BM methode bedroeg minder dan 10 %. Deze dieren lieten daarna zich herstellen gedurende 6 weken vooraf-5 gaande aan het doorlopen van de IgM antilichaamrespons op SRBC.

Na de herstelperiode werden het polymeer van voorbeeld VII. tabel F-a en het SRBC toegediend zoals in voorbeeld XX. De resultaten van de totale proeven zijn weergegeven in tabel N-a.

8000334 63 o σ * to a η •Η

® Η 00 NO OW

HO I t- ON I -=*

ύ X U I “ 1 o NO

Ö ® +» Jt Λ O NO

•H -3 fa " •pao a ·η o ra a a o o

ft NO H

® S ® cvi o no no j· o ^ r! j. WO ·> » * · * * >5

© ” t— l Jt NO U\ PO o M

+> · s ^ -Pt— CO NO i— t* tr ® +> S tb O H «- co CO t~ j· « £

P W F4 B

H H H £{ .2 . ej · a g ö d, 3 fu jj s I 2 » digi B g ra 4 to | *o *0 I o O « g s on# i m m icon £| k Η Ό S £ ΐ ra o ω «o· -2 S >0 Ό

^ S m U

eh a o s o ra , _, ® § © g d S rp o a u $ u o o o o o o § -g .£ I I 8 ^ ^ - « o-η

5 3 si HM

O O Ό Ö C

<g © © O

O 4» H O

aj a O

H „ 4i 43 t.

** ,2 H O O © S M 3 g 'g 43 60 · Λ .5 ,2 * o o q ui ~ Jj % c I k -p 3 k

Sa 1E s «s'*! § ,2.2 § 1 ΐ ® g g © «*<e - * Heen ,Ο H P50K« O „ „ „

<U O H r-\ O H O O bOHMH

U H k «J CÖ ΙΛ O IA IA U

.2 g£ I I CTN OV « * w 1 10 S O o o m o w* £ s o q c eh o eh è m *

I I I

Η Μ Η H

Η Η H ö > © > «, > a ^ ai

<ti I Ό I tJ I *0 J

h rlfa Hh «J ^ m

© © © β O

O ® H OH o h « h

a ra o d V Η O Η O

f, a ij ïfl g fc-g H o o al O ai O O ra O ra p, & £ ** }> ** & g.43 £** 8000334

Voorbeeld XXI

6k

Negen polymeren met verschillend imidegehalte (0 t/m 35 %) en identiek met vele als beschreven in voorbeeld XX, tabel N, werden beoordeeld in Fis».her-r atten op hun vergelijk-5 baar gedrag als een funktie van het percentage imide voor het voorkomen van het terugkeren van primair BLCa tumor na tumor-resectie. De experimentele methode is overeenkomstig die als beschreven in de voorbeelden XV, XVI en XVII, behoudens dat in dit geval 10 ratten gebruikt werden voor alle doserings-10 groepen en controlegroepen en de verschillende imidepreparaten gedoseerd werden zowel bij 30 mg/kg en 15 mg/kg door I.P. injektie in 1 ml zoutoplossing. Controledieren kregen alleen maar 1 ml zoutoplossing I.P. Een groep van 10 dieren kreeg 30 mg/kg oraal polymeer uit voorbeeld VII-tabel F-a (21,7 % 15 imide) zoals aangegeven. Alle tumoren werden chirurgisch ver wijderd 11 dagen na trochar-implantatie en geneesmiddelen werden toegediend in een enkelvoudige dosis zoals boven vermeld één dag na de tumorexci*sie. De resultaten zijn samengevat in tabel 0, Van belang is, dat het gemiddelde aantal dagen voor het 20 weer optreden van tumoren voor de 10 controles 32,3 bedroeg hetgeen gunstig vergelijken is met het controlegemiddelde van 31* dagen {k ratten) in voorbeeld XVI.

8000334 65 α> Ο 1 if\ ¢- on on 04 Lf\ Ο 01 4 «“ CVI on \Q VO Pt *“ 1 Ö <u

-P

i.a-MDOJOJ'— lAOCJ-a-’-cvi’-vovOvorooo P

• o Ö CO ,^vor-ojomocMW»-cvjovoLr\j-cnm ω

I O

b 2 0) U) a twtcoiAT-ojofnoCJ’-’-’-oiAirNcnnm

Μ ' I H

? S H

P ·ι-ι <

« -P

43 ovo otnir\r-ojo(nocyot-r-oiAinmcom · u to t- .

0 JJ h g k PM β ^iiTiiAtnmocviooJOWOi-oocnincvjcvjcu g

+> 3 S

1 -P -Ö j; β_4- pOCirOOC'JO’— O'—OOOO’-OO’-OJ»— § «> - <0

M ¢5 pH

S S H

'rd'S^OiOJOJOWOOOOOOOOOr-OO- d ° .3 * £ 0¾ 04-00000000000000000 e θ 5 10 aj <$ 0) B W) e> ΪΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟΟ o X ^ •d i£ p

.ÏÏ j? ΙΟΙΛΟΙΛΟΙΛΟΙΛΟΟΙΛΟΙΛΟΙΛΟΙΛ· O

Ο Μ I

•d a ’£ m ΟΟΙΛΙΛΙ-’--^™^* 2 jo uC VO* VO - ^ ® £ ! «

,rl M W

O O Ο Ό r- J· CÓ VO t- I iii I °9

•ο n p p, ο Ω A

t* H w

φοο ,g »9 »2 »5 'm A

eg n -j qJ cödtö ώ »2 isi i. - * ** , * 5 &ί ί 1 Η Η > Β Β Β 1 η η

ο Η Η Η > Η HW

• * η 8 cvj cn -3- ιτν \ο ί— βο σ\ — 8000334

Voorbeeld XXII

66

Het 100 % imide van EMA (sp. vise. * 0,66) uit voorbeeld V-a werd beoordeeld op tumorgroeiverhindering in een onafhankelijk onderzoekingslaboratorium waarbij de volgende 5 methode werd gebruikt.

Vast Sarcoma 180 werd geïmplanteerd door trochar (2 mm middellijn) in de flank van mannelijke Zwitserse muizen.

Het polymeer uit voorbeeld Va werd toegediend door I.P. injektie in de dosering als geïndiceerd in 0,5 ml zoutoplossing op 6 opeen-10 volgende dagen beginnende met de eerste dag na de tumorimplantatie. Groepen van 5 muizen kregen dosis van 25,50 en 100 mg/kgaLs beschreven. Hogere doses; 200, U00 en 800 mg/kg, bleken giftig te zijn zoals aangegeven. Op de dag volgende op de laatste I.P. geneesmiddelinjektie werden de dieren afgemaakt en de tumor werd 15 verwijderd door uitsnijden en wegen. Tumorverhindering werd berekend als percentage van het tumorgewicht van de behandelde dieren gedeeld door het tumorgewicht van de couteroledieren.

'Bfe resultaten zijn vermeld in tabel P en geven aan dat het volledig 100 % imide van EMA geen werking vertoonde.

8000334 , 3 67 a ö ί 1 φ Β Φ φ φ οι Η α, to

60 Ο ο U

CS fctA ^ ^ (β hid ^ ^ ~ 3 ^ β 14: ïlSiïlBIBIM & § •Η <iH Φ >d ·Η f g b es ο

Ct Ο 0) φ J> b *d ·η · > Pt^ ui ο Φ ·Η 60 -Ρ Φ Φ _ Ο +> 8 [d >d · ra Η φ Ö δ ί 4 4 4 « '00 οο J· *d' & .

Sas g ê s « £ g § § § ! -s e 5

3™β"οθΝϊ-σχΐΛ»Λ ΐΛ (Λ , § S

S-HI g § §> o 3 ® « Ö ® S ö -$·$·$ I 0 3

60 « “ * 8 S3 S

g § § § 5 *S *a „ - ·* w„ °. °i °. '’Z s ” δ w· Ö Λ ο φ .

η .Η φ δ fn^^vrntnm'em-eon'di >g1g*3 Φ Φ 60 60 φφφ Ο +> 60 -Ρ 3 5 5 * ® g φ *3

* - S g S to S a X

<-» > b» ^ r·! -Ρ O

S · S d 4s es o ^ a vo φ q, η o « vo « vo § tr\ η Φ 11 i &&^&«δδ85&§ & io5| ,α 60 60 § cs d H Pt Φ on to cs h Pt « » Φ · Ό 60 . m H cS Φ CS +ϊ φ Jï Φ Φ «H CS 60 •H C ΙΑΙΛΙΛΙΛΙΛΙΛ<ΜΙΑΓΟ·ΛΟΙΛ £ ® H £ d "rt ej t» φ

S Φ φ <8 AS

AS 60 Φ •ο φ aj Ct •H >d Ό Φ H C! P Φ Φ Φ d _ C 60 ’d -p Φ p$ g φ .m’m (ΛΙΛΙΛΙΛΙΑΙΛΙΛΙΑΙΑΙΑΙΑΙΛ | O ft ·Η d φ fl .o —. ~

r- CM

H

Φ »d .¾ Λ « ·» « «> «> *5

H —. pi H pH H H

SC oooooo

S.S» ia^o-po-po-po-poS

11¾ ^ r § 2 § s § s s S^a So«“°0 8000334

Voorbeeld XXIII

68

Een voorkeurspolymeer volgens de uitvinding werd beoordeeld in normale mannelijke Levis-ratten op mogelijke aktiviteit voor het verhogen van het aantal peritonale macrofage 5 en hun aktiviteit om polystyreenlatexdeeltjes fagociet te maken, hetgeen is aangetoond voor een aantal immuunsysteemmodula-toren, zoals Bacillus Calmette-Guerin (BCG), pyrancopolymeer en andere dergelijke middelen.

Vier groepen van zes jonge volwassen (2-4 maanden 10 oude)normale mannelijke Levis-ratten kregen geneesmiddel of zoutoplossing (als controle) als volgt toegediend. Groep 1 kreeg 1 ml zoutoplossing l.F. toegediend; Groep 2 kreeg het polymeer van voorbeeld VII, tabel P-a in 30 mg/kg in 1 ml zoutoplossing l.F. toegediend; Groep 3 kreeg het polymeer van voorbeeld VII, 15 tabel F-a als 30 mg/kg in 1 ml zoutoplossing oraal toegediend en groep 4 kreeg 0,1 mg BCG in 1 ml zoutoplossing l.F. toegediend.

De eerste, derde en vijfde dag na de bovengenoemde toediening werden van elk van de vier bovengenoemde groepen 2 dieren afgemaakt en de peritonale holtecellen werden geoogst.

20 Het oogsten geschiedde volgens onderstaande methode. 100 ml gekoeld RFMI 1640 medium werd I.P. geinjekteerd en na voorzichtig masseren werd de totale peritonale vloeistof afgelaten en de cellen van iedere afzonderlijke peritonale holte werden gescheiden door centrifugeren bij 1000 rpm. Deze cellen werden gekeurd 25 met USE (niet specifiek esterase) kleurstof en 3x gewassen met gekoeld (4°C) medium. Tenslotte werden de cellen van iedere afzonderlijke holte gesuspendeerd in 10 ml medium en dit bleek bij tellen een gemiddeld aantal cellen te bevatten dat bij 80-95 % bestaat uit macrofagen verkregen uit iedere peritonale 30 holte als een funktie van het bovengenoemde behandelingsgroeptype en de tijd (dagen) na behandeling.

De latexdeeltjes fagocytose aktiviteit van ieder stel peritonale holtecellen werd als volgt bepaald. Een suspensie van de bovengenoemde cellen werd bereid in een concentratie van 35 40-50 miljoen cellen per ml 50 % kalverfoetusserum plus RPMI

8000334 69 medium in een 5 ml buis. Aan de suspensie werden 100 labda polystyreenlatex (10 ^ vaste stof, deeltjesmiddellijn = 1 yum, Dow Diagnostics) toegevoegd en het mengsel werd 1 uur bij 37°C geincubeerd. De cellen werden daarna gecentrifugeerd, 5 3x gewassen met RPMI medium en tenslotte gesuspendeerd in 0,5 ml zoutoplossing. Er werdenpLaten van de celsuspensies bereid en microscopisch onderzocht om demate van latexdeeltjes fagocytose in de macrofage cel te bepalen. De cellen die 10 of meer latexdeeltjes bevatten werden positief geacht een totale 10 aantal aan dergelijke cellen (die met 10 of meer latexdeeltjes) werd uitgedrukt als percentage vanhet totale aantal cellen in de suspensie.

De gegevens van deze proeven zijn vermeld in tabel Q voor duplicaatproeven.

15 De gegevens in tabel Q tonen sluitend, dat het voorkeurspolymeer volgens de uitvinding peritonale macrofage nier verhoogt ten opzichte van controlewaarden bij toediening hetzij langs I,P, of orale weg en verder wordt delatex fagocytose aktiviteit van dergelijke peritonale macrofagen niet verhoogd 20 ten opzichte van normale macrofage aktiviteit. In tegenstelling daartoe verhogen andere immune systeemmodulatoren, zoals aangetoond door gegevens met BCG, het aantal peritonale macrofage sterk en dergelijke macrofagebezitten sterk verhoogde 25 latex fagocytose aktiviteit. Deze hoge aktiviteit neemt af tot normale waarden na 3 dagen en meer.

In tegenstelling tot de bovengenoemde resultaten, die erop duiden, dat de polymeren volgens de uitvinding de macrofage werking niet aktiveren, blijkt uit de resultaten 30 van de voorbeelden XX en XXa, dat deze polymeren desondanks fungeren als B-cel modulatoren bij normale dieren en B-cel antilichaamrespons stimuleren bij toediening hetzij I.P. of oraal. Verder wordt deze werking vastgesteld zelfs in afwezigheid van thymisfunktie, hetgeen er op duidt, dat de polymeren volgens de 35 uitvinding werken als thymisfunktievervanging bij de aktivering van B-cellen voor verhoogde antilichaamvorming.

8000334 70 01

Ο -Ρ O

i αι ο ·ο 3 S'-p « Η

P fi β O

0 H >S On «“ O IA OlAO-4- O IA O A t-O

X Η X cvj (M CO CM OJ T- ON co CU »- POt- T-t- Φ Φ U Φ

-P o Q> -P

CVJ d O d H %%. 8 H

Φ £ β ^ φ

H

Η Φ O P --

U Φ NO

_i m 2 CO PO r- CO 4 vo VO CO IA J- COCO covo

3.HOM - - CU CU

-P +> w β P H

d o o 3 P<43 a o -p o •rsH 8 O O ·>-9 •Η Η B 8 «“ +> ^ 8 p β g o

•tnirt ^ H <Ö ·§ LA «- t— t— l— '— t— C— CO»“ ^*CO O CO

OH X Η X CVJ CO CU CU CU CO On On »- »“ CM

•p o ΦΟΡΟ

•HO -P O O -P

>43 B O d

•HP H 8 H

-P O

a Z „ h a e u «

O O ·Η O H

fQ P H O

Β rj β ft OP

E-ι O O o O —

ëo HO O CO AON t- NO c- co ANO CO NO AA

dp d ·Η O »- »“»" CM CO

3 5 -p . -p x O β P H +-* M 10 3 O Q „ „ do 3 p)Λ Λ d d*

d d H 1* » H

ΖΆ » Ά pis » ** *5 sc «15 5 . 5 . * d $ Λ * ώ Η «η β Ο 60 60 · 8 Ο 60 60 d Η ·Η Ο Η *Χ *Μ Η Η “Λ 3θ Η * Ρι Μ I-1 ® S* Μ Ü ^3ί

Srrt 0»~0 Η 60 Η 60 ·* "Ο Η 60 Η 60 §β I -I >η » 3¾ >ïï >s •hJ Soo >d o -d o o 30 go

PO 43 Η N H co HCO »- OM HCO H CO

OP OO O o “ H o O

Δ U O O O O i) 3> * ^ +J p p p .? f o 8 S ο β o o U O O 00 o o Ö > > pq o > > 0 H 60

g fi H

1 ·η o •Η β 3 d o Ό •Η ·Η fi <d 8 „ don >00 4J <Ü r— 60 fi

d d O

<ö β 60 8000334 71 .p (Ο / (1) <Β Ο Φ m ιο I S <0 Η I 111 £ $1 -1- ”2 s: 8 S Us 8 “ »rti 0 © ft a> a o p -P ° ® +2 « λ m

0 0 0 0 0 H S H Ö +s M

CVl 0 I P

. Pi H W

„ Ο H 0 n « ö > > 0 0 x

ft H Cm -3 P

PL, H 0 1 ιΗ·Η 0ft 5* 0 0 · O 0 Λ H 0 P 3 H1 *-*- ^ ^ W h 0 ·Η 0 ’“t ηο·Η-ρ P P X 3 Ο P 0

SjLS~ (L^flö

W ft Λ ,3 p H

p ·Η 0 0 3 w ft ·» OP

p 5 Sg£g

•OH 0 0 O *7 .H 0 Ο O

•HHÖÖ’-P SSO

3 § § s ·5μ 32 i3*3*p«si *&$«.

.¾¾ I S|| -¾¾¾3 --^> 0 0 0 0 ÖHÖ Μ ·Η ,Ω H W. Ö H i30

Η P ft ft B-H W

o .¾ o *- 0000 >®P«- 0 ft H ft ft-^^iS .3 0 ft ,* 0 3 0 0 030ft > 0 3 0 H ft ^ 60 0 ^ r)’H £ « 2 Λ P -3 ·Η > °1 £ g OO cu IAVO cucomvo ® ® § ^

H 3 > H 0 „ r\ yti'r;S

0 0 0 0 *r) 0 X 0 ·Η H

-0 0¾ P ίί "" BiPH

ί „Λ 3 H 000 EH 60 0 2 Ϊ 2 -3,030 0 ra 0 Pi.3 ft 0 0 0 ·£ 0 0 H 0

Μ * H 3 ·Η Η X

P 0" . 0 0 „ ·3 0 ft®? I 1 Q. | 0 3 >·Η

OH A &,.3ift 0 3 0 H

0 0 ^ ^ Η Ο H 0 60 0

S ., λ φ · H uD

.JS ί^β,Ο^,Ο* ί) Φ Jj Jj H ö . .H a tc flS to · Ο ·Η τί «

Sh „ ft dg ^ * Ο^Β* II .! -5 o5 „*» hï h. |Λ 11 il g » £& So Pa j Jig 8 1 ! - s a .31 as I 0 a I 2 0 §«.Sft o t: £ 0 0 llsi

Is a a %*»*** ο ja ·η 0 «30 0 0-3 «Η ·Η § 0 η ία > Ο 0 Ρ 0 αΡ 0 0 -3 3 60 8000334 72

Verschillende andere voorbeelden die ter nadere toelichting van de uitvinding kunnen dienen, kunnen worden uitgevoerd door gebruik van andere in wezen gelijkwaardige materialen voor de specifieke materialen als vermeld in de 5 voorgaande voorbeelden.

Zo kan propeen worden gebruikt in plaats van een gelijkwaardige hoeveelheid etheen in de voorgaande voorbeelden als voorbeeld van de genoemde ethylenisch onverzadigde monomeren met in wezen overeenkomstige resultaten.

1q Zo kan ook citraconzuuranhydride worden gebruikt in plaats van een equivalente hoeveelheid maleïnezuuranhydride in de voorgaande voorbeelden als voorbeeld van de bepaalde polycarbonzuuranhydriden met in wezen overeenkomstige resultaten.

1^ Polymeren met nog lager gemiddeld mol.gew.

kunnen worden bereid door oplosmiddel-niet-oplosmiddelfraktio-nering van het in voorbeeld I bereide EMA polymeer. Dit polymeer met lage mol.gew. kan dan worden gebruikt in plaats van een gelijkwaardige hoeveelheid van het polymeer uit voorbeeld I 2o in de bovenstaande voorbeelden met in wezen overeenkomstige resultaten.

Andere farmaceutisch aanvaardbare zouten van imiden volgens de uitvinding kunnen worden bereid door de ammonium-zoutderivaten om te zetten in andere zouten, zoals b.v. natrium 25 of kaliumzouten. Het ammoniumzoutderivaat uit voorbeeld III, tabel D,k, kan b.v. worden omgezet in het half-amide, half-vrije carboxylderivaat door doorgang van een 5 %-ige waterige oplossing van het ammoniumzout rdoor een zwakke base-kation-uitwisselingskolom, b.v. Amberlite ERC-84 (handelsmerk voor een 2q verknoopt acrylcopolymeer). De verkregen oplossing in de vrije carboxylvorm kan dan worden geneutraliseerd met ofwel NaOH of KOH en de geneutraliseerde oplossing kan dan worden gevriesdroogd teneinde de overeenkomstige natrium en kali umz outder i vat en te verkrijgen.

25 Het EMA polymeer met laag mol.gew. uit voor- 8000334 73 beeld I kan ook worden omgezet in het half-monomethyl secundaire amide, half-monomethylaminecarboxylaatzout volgens de methode van voorbeeld II(a) door de oplossing van EMA en aceton te laten reageren met een oplossing van methylamine in aceton 5 in plaats van ammoniak in aceton. Het produkt kan dan onder terug vloeien worden verwarmd in xyleen teneinde een partieel N-methyl gesubstitueerd imidederivaat te verkrijgen, dat een imidefunktie heeft alsmede de aanwezigheid van secundair methylamide, geïoniseerd C00” en aminecarboxylaatfunkties.

10 Ter nadere toelichting van de methoden voor het uitvoeren van de bovengenoemde alternatieven dienen de onderstaande voorbeelden met de daarin vermelde resultaten.

Voorbeeld XXIV

Een copolymeer met laag mol.gew. van propeen en 15 maleïnezuuranhydride werd bereid op overeenkomstige wijze als beschreven in voorbeeld I. In de reaktor werden 196 g maleïnezuuranhydride, opgelost in 1600 ml ethylbenzeen met daarin 7,30 g benzoylperoxyde, gebracht. De temperatuur werd op 80°C gebracht en de druk werd ingesteld op 10,8 kg/cm door toevoeging van 20 ^2 g propeen uit een propeencylinder die op een weegschaal was 2 opgesteld. Daarna werd de propeendruk gehandhaafd op 2,8 kg/cm gedurende 19 uur bij de reaktietemperatuur van 80°C. Aan het einde van de loop werd de bom afgekoeld en afgelaten en de brij van propeen/maleïnezuuranhydridecopolymeer in ethylbenzeen werd 25 opgewerkt op de wijze als beschreven in voorbeeld I door drie xyleenbrijextracties gevolgd door drie hexaanbrijextracties, filtreren en drogen onder volledig oliepampvacuum bij 60°C.

Het eindprodukt bestond uit 269 g, opbrengst 87,3 %» en 1,0 % oplossing in DMF bij 25°C bezat een specifieke viskositeit van 30 0,0590.

Het propeen/maleïnezuuranhydridecopolymeer (PMA) produkt met lage viskositeit zoals hierboven bereid werd omgezet in het half primair amide-half-ammoniumcarboxylaatzout volgens precies dezelfde methode als beschreven (voor EMA) in 35 voorbeeld Ha. Uit 26,0 g PMA werden 36,3 g (opbrengst 115,5 %) 8000334 7^ verkregen aan oven gedroogd (35°C, 20-25 mm Hg vacuum) produkt. De funktionele samenstelling volgens infTaroodanalyses van het produkt gaf alleen maar de aanwezigheid aan van primair amide, geïoniseerde carboxyl en ammoniumcarboxylaatgroepen. Er was geen 5 imidefunktie aanwezig.

Het half-amide - half-ammoniumcarboxylaatzout bereid uit PMA met een kleine sp. vise, van 0,059 werd omgezet in een partieelimide bevattende samenstelling volgens de methode als beschreven in voorbeeld III. Een monster van 20 g van het 10 amide-ammoniumzout werd tot een brij opgeslagen in ^00 ml xyleen en de brij werd net als in voorbeeld III onder terugvloeiing verwarmd. De brij werd 33 min. onder terugvloeien verwarmd met als eindtemperatuur 139°C waarbij 1,1 ml water werd verzameld en het produkt werd opgewerkt op de wijze als beschreven 15 waardoor 15,3 g (opbrengst 79,6 %) eindprodukt werden verkregen. Infraroodanalyse van het produkt gaf aan dat het monster na 33 min. 19,0 % imide bevatte naast amide en ammoniumcarboxylaat-funktionaliteit. Het percentage imide werd in dit geval bepaald aan de hand van de standaardimide/amideabsorptieverhouding-20 samenstellingkromme voor EMA, zoals beschreven in voorbeeld V.

De pH van een 2 %-ige waterige oplossing bedroeg 5,^3 voor instelling en lyofiliserèn. Na instelling op pH 9,5, filtreren en lyofiliseren was de pH 5,50, het stikstofpercentage bedroeg 10,26 en het imidegehalte bedroeg 19,0 gew.$, bepaald met 25 infrarood.

Het bovengenoemde imidebevattend derivaat van de PMA. werd beoordeeld in mannelijke Fis^her-ratten met gebruikmaking van BLCa tumor op antimetastase-eigenschappen en het niet terugkeren van tumor na resectie, zoals beschreven in 30 de voorbeelden XIII en XV. In de controlegroep zaten 10 dieren die geen geneesmiddel kregen na tumorexcisie (10 dagen na implantatie) en 10 dieren, die een enkelvoudige 30 mg/kg dosis I.P. kregen ten tijde van de tumorexci**sie. De resultaten zijn samengevat in onderstaande tabel.

8000334 75 § β ό ο β x ο ο t> > 3 Η VO Ο t— β *- α> > 3 o e *U 'T· 3 £} 0) 4)

0) ,¾ V

Sm x · 3 3 3> " +> β p 'rj β ra _ o ® 0 3 ί* p 2 1 -ë 8 o £ | •SS10 q ^ 2

o β ’r> o «- Q

ggs " | s ^ ► 8 β 3 Ö 3 β β 43 w V 4) 4) Ό •Η Μ β 60 M fl b0 3 3 « ί Μ « i ft

j3 tfl >3 3 bQ Ό O

o cd β 3 Η +3 -3 θ\ Ο Ό vo · 3 w in p vo ft 43 O t— ' o ·

Li r VO (*1 t· ί H

o -v. 1 a ^ 1 a fi O 00 O PO >— 3 " H M vo bO w •rt

W

€ c ti

L» 0) 0) O

o 3> m «> ,¾ s u S'0 ^ β M Ο 3 3 _

4)3 bOt- bot- PP

g h 03*03 · £ ® O 3 r fl C\1 >- Ό £ Η β ,^43 \ po ^ po ««

5 00 co 00 M -H

Ofi »- in · po · β Ό 03 I δ I δ o > > CO 3 0 3 Η * «— 60 PO tO * 3 bO ρ * 9 |> 3 β ο ο η Ύ— Τ— Ο ΡΟ β 1« β 3

U

• •Η Ό 2 \ ρ 3 β Ο

δ A

8000334 76

Voorbeeld XXV

Een copolymeer van etheen en citraconzuuranhydri de met laag mol.gew. werd op overeenkomstige wijze als beschreven in voorbeeld I bereid. In dit geval bestond de vulling aan reaktor-j materialen uit 228,0 g citraconzuuranhydride in plaats van maleïnezuuranhydride, 187¾ ml ethylbenzeen en 15,6 g benzoyl- Λ peroxyde in 161 ml ethylbenzeen. De etheendruk werd op 1¾ kg/cm gehouden en de reaktie werd bij 70°C gedurende in totaal 27£ uur uitgevoerd. Verdere katalysatortoevoegingen werden uitgevoerd 10 na 3 uur en na 202 uur en bestonden ieder uit 10,¾ g benzoyl- peroxyde in 108 ml ethylbenzeen. Het etheen/citraconzuuranhydride copolymeerprodukt, opgewerkt op de wijze als in voorbeeld I, vormde 73,5 g of een opbrengst van 23,¾ %· Deze specifieke viskositeit (1,0 % in DMF, 25°C) van het copolymeer bedroeg 1 0,0¾2.

Het etheen/citraconzuuranhydridecopolymeer met lage viskositeit (29,5 g, 0,21 mol) werd omgezet in een half-amide-half-ammoniumcarboxylaatzout volgens de methode als beschreven in voorbeeld Ila waarbij 37,0 g (opbrengst 103,0 %) vacuum-20 gedroogd produkt werden verkregen. Uit infraroodanalyse bleek de aanwezigheid van amide, geïoniseerde carboxyl en ammoniumcarboxy-laatgroepen, maar geen imidefunktionaliteit. Een partieel imide van het amide-ammoniumcarboxylaatderivaat werd bereid met gebruikmaking van de methode van voorbeeld III door een xyleen 25 U00 ml) brij van 20 g van het bovengenoemde amidezout gedurende 30 min. onder terugvloeiing te verwannen. De opbrengst aan produkt bedroeg 15,7 g (opbrengst 83,6 %) en de I/A absorptie (infrarood)verhouding bedroeg 1,21, hetgeen overeenkomt met 31,0 % imide bij vergelijking met de standaardkromme voor EMA 30 zoals beschreven in voorbeeld V. Het stikstofpercentage bedroeg 9,2¾ % en een 5 %-ige oplossing in water bezat een pH van 5,31.

Bovengenoemd imide bevat een produkt van ge-ammonieerd etheen/citraconzuuranhydridecopolymeer werd beoordeeld in mannelijke Fis-her-ratten met gebruikmaking van BLCa tumor op 35 overleven, niet terugkeren en antimetastase-eigenschappen na 8000334 77 tumorresectie op de wijze als beschreven in voorbeeld XIII en voorbeeld XV. De resultaten zijn samengevat in onderstaande tabel: 8000334 7'8 § e 'S m β β > >

β O IA

H VO h r-V

> β o β 7« ^ v a> fc ra o <u aj M « bO * βω 3 tb « δ β tS fc 3 -h a +s o o h « o <u o +> ® ·η ^ a -a w -p s

C* O '— 7S

O fl-r* - « P β ·Η \ > £<

i> > fi o o I

P

β β § > ω β οι U) * 4j >d (DO) β to v •h w b tfl .x e u β -rj

β β β β Μ β Tl -P

+3 β 60 ^ 3 60 tA β

•H Ο β U β « ft -P

Η +ϊχ>σ\βΌΟ 0 3 oj w IA +3 t- » β

43 O t- ^ CO · H

U ft & ο I a I a · b a o co e J· *” o w-h

i- J- W) VO to *H

* Q

α I

ω +> · β Ο β t, β <β β *Η β t0 β β Μ ή) β β β ·γ4 Μ β -β β (0 tO β Ο

Ö Η) β ββ ·Η Ο X

β3 bOt— Μ'β >Ö ÖJ β β U β* β 3 β Ét

Οβ Ο Ό CM *υ Ο ptJQ

α3 *- ΟΠ 00 ? Ββ u \ Ο ΟΝ Η Ο 3 β οβ ο ία · σ\ on * β «- ρ h on *- ι Β ·ν. ι fi «x ® >> « 8 J θ\ δ ββ·0·Η «- to «-to β ·Η ·Η 'Ö ω Ο * ·Η Η bo υ ν ύ * Μ X Ρ * ^ β Q g ö ο σν % g 10 § §β β η

on 43 W

β * f β

β X

>4 « *Η >0 β

8 V

β ο § ϋ 8000334 79

Voorbeeld XXVI

Dit voorbeeld beschrijft de bereiding van een EMA samenstelling met zeer laag mol.gew., verkregen door oplosmiddel niet-oplosmiddelfraktionering van EMA polymeren als 5 beschreven in voorbeeld I. Uit acht afzonderlijke EMA preparaten werden 1284 g EMA bijeengebracht na een nacht lang drogen bij 80°C onder volledig oliepompvacuum. Deze acht EMA produkten variëren in specifieke viskositeit (1 %, DMF, 25°C) van 0,051 tot 0,058 (gemiddeld 0,053) en hun equivalentgewichten variëren van 13^ tot T0 1^2 voorafgaande aan oplosmiddelfraktionering. Ieder van de acht lopen (160 g) werd opgelost in 500 ml aceton en neergeslagen in 2,5 1 tolueen in een tijdbestek van 10 min. in een ^ 1 beker die krachtig werd geroerd met een Lightning roerder. Het neergeslagen EMA werd gefiltreerd ( Alle acht primaire moederloogfiltraten werden bewaard T5 voor latere opwerking van oplosbaar polymeer (zie onder) en de vaste stoffen werden 1x tot een brij opgeslagen in 2 1 tolueen en 2x in 2 1 hexaan, afgefiltreerd en een nacht lang bij 50°C onder volledig oliepompvacuum gedroogd. Uit de acht afzonderlijke lopen werd een totaal van 1143 g van het in oplosmiddel onoplosbaar 20 EMA verkregen, dat een gemiddelde specifieke viskositeit bezat van 0,057 (de acht met oplosmiddel neergeslagen afzonderlijke lopen varieerden in specifieke viskositeit van 0,053 tot 0,060),

De aceton-tolueenoplosbare polymeerfraktie in de gecombineerde primaire moederloogfiltraten als boven vermeld 25 werd geconcentreerd tot een zware olie door verdampen van alle oplosmiddelen in een Rotavap (merknaam voor een verdampingsapparaat) op een kokend waterbad bij 25-30 mm Hg vacuum. Het residu werd opgelost in 200 ml aceton en neergeslagen in 1 1 tolueen bij kamertemperatuur waardoor een olieachtige papperige vaste stof 30 werd verkregen. De bovenstaande vloeistof werd gedecanteerd en het neerslag werd opnieuw opgelost in 200 ml aceton en weer neergeslagen in 1,2 1 xyleen bij 0°C waardoor een vast wit neerslag werd verkregen. Dit produkt werd afgefiltreerd, 2x gewassen met 1*00 ml xyleen en 2x met 300 ml hexaan en een nacht 35 lang gedroogd bij 50°C onder volledig oliepompvacuum. Er werden 8000334 80 59 g verkregen van een produkt met een specifieke viskositeit (1 ¢, DMF, 25°C) van 0,031, een berekend numeriek gemiddeld mol.gev. van 3^2 en een equivalentgewicht titreren van 172,0.

Het percentage koolstof bedroeg 60,92; 60,61 en het percentage 5 waterstof bedroeg 6,03; 6,12.

5 g van de bovengenoemde EMA fraktie met specifieke viskositeit 0,031 en equivalentgelwicht 172 werden omgezet in het half-amide-half-carboxylammoniumzout volgens de methode van voorbeeld Ha waardoor 5,^ g ovengedroogd (50°C, 10 pompvacuum)produkt werden verkregen. 5 g van dit half-amide-half-carboxylaramoniumzout werden omgezet in het partiële imide volgens de methode van voorbeeld III door 1 uur onder terugvloeien te verwarmen in xyleen. Het uiteindelijke droge produkt (50°C, pompvacuum) vormde 3*8 g. Dit werd opgelost in 70 g water (pH 15 H,87) en ingesteld op een pH van 9,^ met NH^OH, afgefiltreerd door een 0,2 yam filter en gevriesdroogd. Het uiteindelijke gelyofiliseerde produkt had een 2 % vaterige pH van 5*1» een totaal stikstofgehalte van 12,27 en een imidegehalte van 25,0 gew.55.

Het produkt werd beoordeeld in Fischer 3¼¼ 20 ratten met gebruikmaking van FBCa tumor op overleven, niet terugkeren en anti-metastase na tumorresectie op de wijze als beschreven in de voorbeelden XIII en XV.

8000334 81 « a rö 0) δ ω δ * Η CM Ο -3 U CM ® > a ο ö U 'Τ' ® ® ra ® ® aj ja ® CM 3 60 ..

® 03 t3 M 3 ,S

§ -s 8 5 Ö o i a O S‘rt N g > > & O - g

J

ö s ^ s § O) M ® 60 · >

Jj ,ij «ij ® ö ti ® •H tb C T3 ^ ‘dS? 2 ti tt) t— pat— ca ό h +> Ί3 ® ^ g & Ö w ΙΛ +> CM 30 x3 o -a* o ^3 ^ gi *

§ o' Λ § vo S § ·Η PU

- ^ “ -* 00 8 Η ^ ft +3 ca

*H

a η fi Ö o ti e ® *e ® « $p «- _ 0) 60 Λ »“ ® 8 cJ ö C TJ _ Μ ö üo ® »0 ® SP id «3 fco 6p r— ® 'ö e u eSt— cd * *& 5

o® o Ό * 'ö σ\ Q,S

P4+9 *“ σ\ Λ _ CO g* r

h ^ i- CM O O O H

oö O (O . I- VO · ® o aJ r- I fi. "v. I S ® j» > ft-Svo*-® ·η c ^ ^ CM 60 CM 60 ca® O 60 * Λ « *->.

« o o | if ^ *” 1 o 43 oo

*0 * I

® tl •d 8 «o m

«I

H J*

g "L

-P «

e O

g fi 8000334 82

Het produkt werd ook beoordeeld op hun vermogen om immuunresponsen te stimuleren uitgedrukt in het verhogen van

IgM antilichaamvormende cellen op rode bloedcellen van schapen

(antigeen)stimulering op de wijze als beschreven in voorbeeld XX

5 met ds volgende resultaten: aantal ratten IgM-PFC/ Index in groep 1l10« ^ controle · 1,0 cellen controle 2 63^ 1,00 10 proef* k 1173 1,85 *30 mg/kg, I.P.

Voorbeeld XXVII

De bereiding en bruikbaarheid van natrium en kaliumzouten van amiden volgens de uitvinding werd als volgt 15 aangetoond. De ammoniumzoutderivaten werden bereid met methoden als beschreven in de voorbeelden I, Ha en III, tabel D-5 en vertonen de volgende analyse van het gevriesdroogd produkt: totaal % stikstof - 1^,15; 13,99 % stikstof in NH^+ - 6,165 6,09 20 pH - 2 % waterig - 6,28 gew.£ imide volgens I.R. - 20,5

Meq. NHu+/g met NH, elektrode - U,31

De overeenkomstige natrium en kaliumzouten van het bovengenoemde imide volgens de uitvinding werden bereid door 25 gebruikelijke ionenuitwisselmgstechnieken met gebruikmaking van IRC-120 (handelsnaam) in ofwel de natriumvorm of de kaliumvorm.

Deze kolommen werden bereid door 1+00 ml IRC-120 (H vorm) in een geschikte kolom te brengen en de Na* hars te aktiveren door behandeling met 3,8 1 1,0 molair NaCl (of 1,0 molair KC1 in het 30 geval van kalium) gevolgd door Η 1 water. Oplossingen van het bovengenoemde NH^+ zout van het imide bevattende polymeer werden bereid met gebruikmaking van 5,0 g polymeer opgelost in 200 ml water. Deze oplossingen werden daarna ingesteld op pH van 8,0 met verdund NaOH (of Κ0Η in het geval van kalium). Deze pH 35 8000334 ' ί 83 ingestelde oplossingen werden door de respectieve Na of K kolom gevoerd met een stroomsnelheid van 15 ml/min,, gevolgd door water tot 500 ml uitstomende vloeistof verzameld was in ieder van de gevallen. Deze uitgestoomde vloeistoffen werden ingesteld op 5 6,8-7»0 met HC1 en gevriesdroogd. De uiteindelijke gevriesdroogde zouten "bezaten de volgende eigenschappen: zoutvorm: NH^+ Na+ K+ opbrengst, g* — 5,Vf 5,80 stikstof % totaal 11+,07 7,77 7,00 10 meq. NH.+/g U,31 0,03fc 0,036 + NH. omgezet m zout, % — 99,3 99,3 chloor, % — 1,25 1,22

Na of K, % — 10,U5 17,08

15 *uit 5,00 g ΝΗ^+ zout, bevat NaCl of KC1 door pH

instelling met HC1

De verschillende hierboven genoemde zouten worden onderworpen aan twee biologische beoordelingen zoals hieronder beschreven: 20 (a) Het NH]++ moeder zout werd beoordeeld in

Fisher 3½ ratten met gebruikmaking van FBCa tumor op overleving, niet terugkeren en antimetastase na tumorresectie, zoals beschreven in de voorbeelden XIII en XV, met de volgende resultaten: 25 8000334

8U

§ c -d O

a m <U © > !* H On O t-

ST

> a o c la Λ © <u Jj _ 3 0 © <0

^ « *H

p tfc .& 3

Cnd to *h

© a) >d h j? H

a p ο © * ο « ο p ® ©

M Β Ό w -P

Q β "-3 >- § O 3 ·Η "•x ^ 3 }» > ,Ο O *- +» s > l, β © t0 4) φ h © *rl a} 0 to ο to p Ό 43 CÖ 0) CÖ © •h ujd'dJriö'ö -P ft η a « to a) e o 4¾ £ t0 <- 3 ω O 3 •H © aJ ** h a) * H " H ^ Hj 4 ® T) 1Λ & * d O t- p t- B Pm p o IfN w VO ·Η ·

ij ^ 0O * 0Π CO · H

ο I a ^ I s h a o on © oo no οι ο " r· in M ir\t0 g w f3 Ή P n o aJ >d

C

d β © 0 0 c— to t, 10 tO ·Η 0 a) al to <d 0 β Ό S'0 iS 2 vj 0 0) <d o βω to m ωοο _ > 03 a * © » Pi H _ a u d t— «o o\ o«e O 0 PT -4f M <u ij p o NO O On OJfifcj

Li t- VO . I- IA · ·Η 0 0) o β 'v.iö'^l S « *h o 3 o o 0 en o Φ ·η * *ο t»> t— on to on to u to ? ? X Λ rj © \ o

¾ g> -P

O Β β β o o p on ^ * 31 β * * 3 O «j.

”8 o 8 Ü 8000334 85 (b) de bovengenoemde zouten worden beoordeeld op hun vermogen om immuunresponsen te stimuleren uitgedrukt in het verhogen van IgM antilichaamvormende cellen ten opzichte van heterologe erythrocyten (SRBC, rode bloedcellen van schapen), 5 zoals beschreven in voorbeeld XX, met de volgende resultaten: polymeerbron- aantal ratten IgM-PFC/ Index 1x10® zout t3r?e_i° groep controle. 1,0 controle 2 500 1,00 1q ammonium (NH^+) U 1052 2,10 controle b 531* 1,00 natrium(Na+)* U 970 1,82 kalium(K+)* b 1098 2,06 controle 2 538 1,00

Ij natrium (Na+)* 2 1373 2,55 kalium (K+)x 2 996 1,85 natrium (Na+)** 3 1523 2,83 kalium (K+)** 3 1058 1,97 controle 6 5^1 1,00 20 natrium (Na+)K 5 125^ 2,32 kalium (K+)* 5 10l* 1,93 .'natrium (Na+)** 6 1607 2,97 kalium (K+)** 6 1003 1,85

30 mg/kg I.P. toegediend XX

25 30 mg/kg oraal toegediend

Voorbeeld XXVIII

EMA met laag mol.gew. uit voorbeeld I-e (specifieke viskositeit = 0,063) werd omgezet in het half-mono-methyl secundair amide-half monomethyl aminecarboxylaatzout 30 met de volgende methode. Een oplossing van ^3,9 g (0,312 mol) EMA. in UUO ml reagens aceton werd gekoeld tot -78°C in droog ijs-aceton. Aan deze oplossing werden 71 ml (51* g, 1,7^ mol) gecondenseerd methylamine en 100 ml aanvullend aceton toegevoegd om doelmatig roeren van de neergeslagen produktbrij mogelijk te 35 maken, Nadat de brij van methylamide-aminezout was opgewarmd 8000334 86 tot kamertemperatuur (2 uur) werd deze een nacht lang geroerd, afgefiltreerd en vrij van overmaat amine gewassen met 3x brij-vorming met aceton (iedere keer 500 ml) en een nacht lang bij een vacuum van 20-25 mm Hg en een temperatuur van 35°C gedroogd 5 waardoor 78)3 g (opbrengst 123,9 1) van het half-methyl secundair amide-half methyl aminezout van EMA. werden verkregen. Dit methyl-amide-aminezout (20,0 g) werd tot een brij opgeslagen en 1*00 ml xyleen en onder roeren gedurende 5 min. onder terugvloeien verwarmd met waterafvoer en met een stroom methylamine die door de 10 brij werd geleid waardoor 0,75 ml water werden verwijderd.

Het onoplosbare produkt werd afgefiltreerd, 1x tot een brij opgeslagen met 1*00 ml xyleen gevolgd door 3x met 1*00 ml hexaan, gefiltreerd en gedroogd bij 1*0°C en een vacuum van 20-25 mm Hg waardoor 16,1* g (opbrengst 85,2 %) werden verkregen van het 15 partiele N-methyl gesubstitueerde imidederivaat. Het itfra-rood-spectrum van het produkt geeft imidefunktionaliteit aan bij 1700 cm”1 alsmede de aanwezigheid van secundair methylamide bij 161*5 cm”1 en geïoniseerd C00” en aminecarboxylaatfunkties. Het imidegehalte werd bepaald op 17,0 % zoalsafgelezen uit de 20 standaard I/A absorptiekromme voor ongesubstitueerd imide-primair amidesamenstelling zoals beschreven in voorbeeld V. Het stikstof-percentage bedroeg 11,1*1 en een 2 %-ige waterige oplossing bezat een pH van 8,70.

Het bovenstaande N-methylimide bevattende 25 produkt werd beoordeeld in Fisher 3l*l* mannelijke ratten met gebruikmaking van FBCa tumor op overleving, niet terugkeren en anti-metastase-eigenschappen na tumorexcisie zoals beschreven in de voorbeelden XIII en XV, met de onderstaande resultaten: 8000334 87 § c ϋ φ α as δί jü <u Η VO Ο t- Φ ^ sa Ίί 'Γ

φ U

ö ω φ * S w φ α> § lh μ ·η ^ ο Μ Ρ β Φ h Ρ Κ Ο Μ Γΰ Φ h £ S Φ Ο Ρ β 5 δ Ρ Ο W Ρ « ΑΙ ω τ) w Η Μ Φ ° _ Η

Ο Ρ Ό r- CO Q

Ο Φ ·Η > § > S -α Ο Ο Ρ Φ £ "5 Us $3 .μ φ ö at 5Ρ ·β *i •Η jd φ Ai Φ Φ S 60 β 60 60 β τ) ft Ρ oj «3 Φ Φ Ρ Φ Ο β •Η ί μ 'β f-ι to c— 3 Η ΦΦ Φ Φ * · Η φ +) υ ο; -Ρ 10 gj, &

Jj Ν_μ LTV W t— * θ L Ο t- 6“ Η ·Η Ο «— \0 · fO t— · Jh

δ I β »**. I g « O

c Οοοφ on co φ ta g vo ω ·η 3 n ρ ο τ3 Φ β Φ

60 C

β ·Η Φ C φ ·φ 60 3 Μ Ρ Ρ S φ Ο >3 ^ PJ β *β ^ a u φβ 3 Η Ο β φφ «ΪΦ 60 on δ'"? g φ φ 60 Φ * ΑΦ ο ,Μ χίΦ Ό 6— βΦΦ Μ ω -ö „ οο « ·η ·η ΐ 3 ο Ο ΟΟ ΒΐΌ ο Jj r— ΙΓν t~ τ— J· · * *rl ΟΦ -^1- -- I e 60 Ο Η &jS Ο co 04 on LTV Φ Ai X Φ «- <- on onto *-«· e> -g . 60 h β B B S 3

01 H O

tc 0 3 on p ll X β ö o o T—' ** 3 8 \ p Φ β o s & 8000334 88

Proeffabriekbereiding van EMA grondstof

Bereiding van EMA grondstof op het daarvan afgeleide prodükt volgens de uitvinding op grote schaal geschiedde overeenkomstig de onderstaande tvee voorbeelden.

5 Voorbeeld XXIX

Bereiding van EMA

De gewenste grondstof etheen/malelnezuuranhydride (EMA) copolymeer werd bereid in een 570 1 roestvrij stalen autoclaaf voorzien van een 1*5,6 1 vulbom voor startertoevoeging, 10 een met glas beklede geroerde reaktor die geschikt is afgedicht voor doorspoelen met N^, waarin de reaktiedeelnemers werden vermengd, een turbine-roerder, een 7»6 cm bodemaflaatventiel en ommanteld voor hetzij verwarmen of koelen. Alle drie de vaten werden 3x doorgespoeld met voordat enige reaktiedeelnemer 15 werd ingebracht. In de met glas beklede reaktiedeelnemermenger werden 2^1,2 kg ethylbenzeen en 29,7 kg maleinzuuranhydride (MA) gebracht. Het mengsel werd op 50°C verwarmd tot een volledige oplossing was verkregen. Aan deze oplossing van MA in ethylbenzeen werd een oplossing toegevoegd van 23^0 g benzoylperoxyde 2° in 20,8 kg ethylbenzeen, die in een afzonderlijk vat was bereid.

De bovengenoemde ethylbenzeenoplossing van reaktiedeelnemers werd daarna toegevoegd aan de ammantelde 570 1 roestvrij stalen autoclaaf bij Uo°C onder handhaving van een geringe etheendoorspoeling. De roerder werd ingesteld pp ^5 125 rpm. Na toevoeging werd de inhoud van het reaktievat uit gespoeld in de autoclaaf met 2,25 kg ethylbenzeen, afgekoppeld en de toevoerleiding werd afgesloten. Na het vullen werd de autoclaafaflaat gesloten en de autoclaaf werd tot een druk van 5,2 kg/cm met etheen onder druk gebracht en 5 min. daarop 3° gehouden. De afdichtdrukken worden ingesteld op 1,75-3,5 kg/cm2 boven de reaktordruk. De mass atemperatuur werd op 75°C gebracht door de mantel in te stellen op 95°C gedurende U5 min., waarna de reaktor met etheen op een druk werd gebracht van 15 kg/cm . Als nulstarttijdstip werd genomen het tijdstip ^ waarop de reaktorinhoud 75°C bereikte.

8000334 89

Een oplossing van 1560 g benzoylperoxyde in 27»95 kg ethylbenzeen werd bereid en in de 35,6 1 katalysator toevoegbcm gebracht. Na 3 uur reaktie van de bovengenoemde massa bij 75 C en een druk van 15 kg/cm etheen werd de tweede toevoeging van starter uitgevoerd aan de autoclaaf en de toevoeg-bom werd uitgespoeld met 1,8 kg ethylbenzeen. Na de tweede toevoeging van benzoylperoxyde werd de reaktor op 75°C en een Λ etheendruk van 15 kg/cm gehouden gedurende nog 1^ uur, in totaal 17 uur. Na het totaal van 17 uur werd de reaktie-inhoud afgekoeld tot 25°C, de etheendruk werd afgelaten en de reaktor werd 3x uitgespoeld met stikstof.

De reaktor EMAbrij in ethylbenzeen werd afgelaten door het bodemaflaatventiel in een stenen Khutsche vacuumfilter voorzien van een linnentype katoenfilterdoek. Het filter werd afgedekt met een kunststofdeken en met stikstof doorgespoeld.

De gefiltreerde natte koek werd opnieuw tot een brij opgeslagen in 135 kg xyleen, 15 min. geroerd en opnieuw gefiltreerd. Deze vorming van nieuwe brij met xyleen werd 3x herhaald, gevolgd door 3x opnieuw slurrie vormen en filtreren met gebruikmaking van 101,3 kg hexaan. De laatste hexaan natte koek van EMA werd uitgespreid in roestvrij stalen platen en bij 50°C vacuumgedroogd in een Devine vacuumplaatdroger gedurende U8-72 uur tot geen xyleen-geurmeer aanwezig was. Het uiteindelijke gedroogde produkt bedroeg 35,1 kg (opbrengst 82,8 %). In totaal werd een reeks van k lopen van verschillende grootten als volgt uitgevoerd. Het bovenstaande beschrijft loopnr. 3 uit de tabel.

Loopnr. temperatuur opbrengst Spec. vise.

Oc kg 1 5S-DMF-25°C

1 70 11,25 0,0é3 2 75 22,5 0,053 3 75 35,1 0,051 1* 75 11,25 0,052 8000334 90

Voorbeeld XXX

Bereiding van partieel imide van geammonieerd MA._

Ammoniëren en imidiseren van MA. (produkt van 5 voorbeeld XXIX) werd uitgevoerd in een 378 1 met glas beklede

Pfaudlerreaktor voorzien van een teruglopende bladroerder en een keerschotsysteem eneen roestvrij stalen destillatielus en koeler, die de mogelijkheid bood om het condensaat volledig te verwijderen of een willekeurige fraktie van het destillaat 10 naar de reaktor terug te voeren. Het systeem was voorzien van twee onafhankelijke toevoerleidingen, één voor ammoniak en de andere voor vloeistof, beiden zodanig uitgevoerd dat ze uitmonden beneden het oppervlak van het geroerde reaktie-mengsel. Iedere leiding was voorzien van een in de leiding 15 opgenomen filterpatroon en een rotameter om de stroomsnelheden te volgen en te regelen. De reaktormantel was voorzien van zowel stoom onder druk verwarming al3 koeling naar behoefte.

De toevoerleiding voor vloeistoffen was verbonden met een 95 1 met glas beklede Pfaudler, waarin de MA. grondstof werd 20 opgelost in aceton voorafgaande aan toevoeging aan de 95 1 ammoniëringsreaktor. Eindprodukten uit de 95 1 reaktor werden teruggewonnen door aflaten door een bodemventiel op een afgedekt roestvrij stalen Knutszch-type vacuumfilter.

Een karakteristieke ammoniëring en partiële 25 imidiseringreeks wordt hieronder beschreven,

De 95 1 reaktor werd gevuld met 133 1 (101,25 kg) gefiltreede aceton en het 95 1 oplossingvat werd gevuld met 81,7 1 aceton (62,1 kg) gefiltreerde aceton, beide onder een stikstof deken. Aan de 81,7 1 aceton in het oplossingsvat werden 30 21,15 kg EMA. copolymeer (bereid zoals in voorbeeld XXIX, loop U) toegevoegd en het roeren werd bij 20-30°C voortgezet tot een volledige oplossing was verkregen. Gelijktijdig werd watervrije ammoniak toegevoegd beneden het oppervlak van de aceton in de 378 1 reaktor met een snelheid van 0,16 kg/min. gedurende 5 min.

35 Daarna werd de bovengenoemde EMA-acetonoplossing onder druk 8000334 91 toegevoegd via het in de leiding opgestelde filter hij een lineaire stroomsnelheid over een tijdbestek van Uo min. van 2,1 kg/min.) uitstromende in de geroerde aceton-NH^ oplossing in de 378 1 reaktor beneden het vloeistofoppervlak. De ammoniak-5 stroom in de 378 1 reaktor werd gehandhaafd op de 0,16 kg/min.

snelheid gedurende de gehele EMA toevoegduur. Gedurende deze periode liet men de temperatuur van het reaktiemengsel oplopen tot UU-55°C door geen enkele uitwendige koeling toe te passen.

De ammoniakstroom werd 13 min. met een snelheid van 0,16 kg/min.

10 voortgezet na de EMA toevoeging. De brij van neergeslagen geammoni- eerd EMA werd daarna gekoeld tot 25°C en afgelaten op het vacuum-filter voor het terugwinnen van het vaste geammonieerde produkt.

Het gefiltreerde geammonieerde produkt, half-amide-half-ammoniumcarboxylaatzout, werd verder behandeld door 15 achtereenvolgens weer tot een brij opslaan (20 min.) en wel 3x in 178 1 aceton met filtreren tussen iedere keer bereiding van de brij entenslotte 2x in 178 1 hexaan, gevolgd door filtreren, waardoor een hexaan natte cake van het prpdukt werd verkregen.

Een monster van deze natte cake werd gedroogd bij analyse en 20 bleek geen anhydride te bevatten volgens IR analyse, maar alleen amide en ammoniumcarboxylaatzoutgroepen. De waterige oplossing ervan heeft een pH van 5,88 bij 2,0 % concentratie.

In totaal werden vijf dergelijke ammoniëringen uitgevoerd met behulp van verschillende hoeveelheden EMA zoals 25 aangegeven in onderstaande tabel, De hierboven vermelde be schrijving heeft betrekking op loop nr. 5.

30 8000334 92 o 43 _4 ir\ T- 1— cn to Vfl 1Λ 1Λ CO 0\

M A A A A A

•H C\J CM on m cn ^ -P r- 1- ^ r- r- 10 to ^6¾ *H _ fc J (- CO t- 00

(M <U (O CM J· (- CO

1> A A A A o a d ΙΑ Ό ΙΛ 1Λ ft £ 0)

CO

* 4? 1 2 3 « 0 > = = = = a n 0 1 1

2 <D bO

Pi TS ·Π

•ri M

w 1 <u _ o g I = 5 - - a a

<D

.2 u d *s I I= = = =

§ S

<u

-P

-p

aS bO

Ö ^4 [- VO

I }|| Μ A

Ö « Ο 1- O £

(d « B ΛΙ 1Λ ON R

<β K a> « 0 .

** 3 § &

P

p bO

je) 44 +3

•H 4- C\ 03 CO W V

£ A A A #1 Λ *» ·Η

lirf ΙΛ VO ΙΛ 1A <- C

PS T- CM

ftW ‘

1,0 fU

g * U/ a •rl :« · •pi h

ö ö i- (M fn 4 1A

Q Pi g O 1 0

8 H

8000334 93

De bovenstaande hexaan natte koeken van geammo-nieerd EMA werden direkt gebruikt in deimidiseringstrap van hetderivaatvormingsproces op de volgende wijze, waarin de imidisering van ammoniëringsloop 5 wordt beschreven.

5 De hexaannatte filterkoek uit loop 5 werd in de 378 1 reaktor gebracht, die 1UU 1 (123,8 kg) tolueen en 72,2 1 (62,8 kg xyleen bevatte. Deze brij van geammonieerde EMA in gemengd hexaan-tolueen-xyleen oplosmiddel werd tot koken verwarmd onder voortdurend doorleiden van watervrije ammoniak 10 met een snelheid van 0,02 kg/min. Het terugvloeien begon bij 82°C en al het aanwezige water werd azeotropisch verwijderd gevolgd door verwijdering van hexaan tot de temperatuur van het reaktiemengsel op 115°C kwam. De reaktietemperatuur werd daarna op 115-11é°C gehouden door naar behoefte aanvullende hoeveel-15 heden toe te voegen van een tolueen/xyleenmengsel in een 2:1 volumeverhouding tijdens de verwijdering van het door imidi-seren bij deze temperatuur gevormde water. Het verwarmen onder terugvloeiing werd 75 uur voortgezet onder azeotropische verwijdering van water en met voortgezette ammoniak-doorleiding met 20 een snelheid van 0,02 kg/min. tot de gewenste omzetting tot imide was verkregen, zoals werd bepaald door infraroodanalyse (zie onderstaande tabel).

Vanneer de gewenste omzetting tot imide was verkregen werd het reaktiebrijmengsel afgekoeld, gefiltreerd 25 op de boven beschreven wijze en het afgescheiden imide- bevattende produkt werd behandeld zoals boven beschreven door 3x tot een brij opslaan met behulpτβη tolueen (153,5 kg, 20 min.) tenslotte gevolgd door 2x tot een brij opslaan in hexaan (118,U kg, 20 min.). De uiteindelijke gefiltreerde 30 hexaan natte koek werd gedroogd in roestvrij stalen platen onder vacuum (oliepomp) bij 50°C gedurende 72 uur of tot de vacuumovendruk gedaald was tot beneden 3 torr bij 50°C.

In totaal werden vier lopen uitgevoerd overeenkomende met de lopen 1, 2, U en 5 van de bovengenoemde geammo-35 nieerde EMA reeks. De betreffende gegevens voor deze lopen zijn hieronder samèngevat: 8000334 9k .μ t- cvj -S'

to + r- CM O ON

« * * " • rl W l/\ lf\ IT\ -S'

-P B

m o

<£ +J H NO CO CM NO

2 CO CÖ CM Π r- CM

W Λ! ΈΛ <8 * " * " •h +> oo co 00 cn >0 4> O T- *- r- *- u ω +> 0) Q)

•H

G

i *> a me ·

S bO*Ht* O _ „ VO

0) ·Η CO g Π J (Ί w bQ h 10 CM O " ** * “

So Ο ΙΛ ΙΛ ΙΛ 1Λ •Ö -pH* G gj ft® 0) Is O ft $

I B

i 8 « ° B M „ 0) 0¾¾ 00

rrt £3 CO

•HOC ΙΑ ΙΑ O IA U .

a m <u (u * * * * 0 •5 L nj a O r- «- O 0 3 · rt H cm cm cm cm ia d dJ g 0 w

“ >-< ► O X

§ si S _ Λ » #*—s #·—% *ri >3 H NO t- CO ON >0)

flj A A A ft O IQ

S i- c- o\ Jt 00 2

δ -P G vot-ooco G

S.H wwww * * >d·* 0 cm 0 0 212 O Is bo Jf J- o NO p n L A) id * * ·» " Μ a bo j no ^ - -s §

bO U

& G ft

2> O

I Η O « 43 CO Bj * ΛΙ co bO cd •Η H C"· ·Η G ti 3 μ *u *>

& < -p -P

« S ·Η <fl bOW G g ft

0 «- CM Λ IA

O

8000334 95

Waterige oplossingen van de bovengenoemde in een oven gedroogde produkten werden ingesteld op pH 9,5 met ammonium-hydroxyde, steriel gefiltreerd door 0,2 jan filter in serumflacons en gelyofiliseerd voor eindgebruik. De eindanalyses voor deze 5 vier lopen waren als volgt. De resultaten verschillen van de bovengenoemde als gevolg van hernieuwde ammoniëring van carboxylgroepen, die ammoniak verloren hebben tijdens het drogen in de oven.

% imide 2 % waterige % ! stik|tof 10 Loop met I.R. oplossing pH stikstof in NH^ 1 13,0 5,96 13,78 5,95 2 20,8 6,00 13,96 5,7^ k 18,5 6,69 1U.5U 6,23 5 20,0 6,U6 1U,20 6,13

15 Voorbeeld XXXI

Laboratoriumsynthese van imidebevattend geammo-nieerd EMA met gebruikmaking van AEMA-hexaan-natte cake direkt in xyleen dat onder terugvloei ing wordt verwarmd zonder drogen.

20 Laboratoriumschaalbereidingen werden uitgevoerd, waarbij het EMA, opgelost in aceton, werd toegevoegd om gedurende verschillende tijdsduren aan een oplossing van aceton waaraan gasvoraige ammoniak werd toegevoegd bij verschillende stroomsnelheden, en waarbij men de temperatuur lietoplopen 25 van kamertemperatuur (23-25°C) tot 50-53°C, Het neergeslagen geammonieerde EMA werd afgefiltreerd en de brij werd gewassen met aceton, gevolgd door wassen van de brij met hexaan en affiltreren. De hexaan natte cake met geammonieerde EMA werd daarna opnieuw tot een brij opgeslagen in xyleen en de totale 30 brij werd verwarmd: teneinde water in twee trappen te verwijderen (1) azeotropische verwijdering van water in een temperatuur-trajekt van 75-102°C, dat het gevolg is van de reaktie van NH^ en aceton, gevolgd door (2) water dat gevormd is tijdens de partiële imidisering van het geammonieerde EMA bij een verhoogde 35 temperatuur (122-132°C) na verwijdering van hexaan. Het uiteinde- 8000334 96 lijk gevormde partiele imide werd verkregen door filtratie, gevolgd door wassen van de brij met xyleen en hexaan. Twaalf dergelijke lopen werden uitgevoerd zoals samengevat in de eerste hieronder volgende tabel. De hieronder volgende beschrijving geeft een ^ samenvattingverloop nr. 10 van die tabel.

EMA uit voorbeeld XXIX, loop 1, (2Ö0 g; 2,0 mol) werd opgelost in 1,1 1 aceton en gefiltreerd door filtreerpapier. Deze EMA-acetonoplossing werd toegevoegd in een tijdbestek van !*5 min. aan 2,1* 1 aceton in een geroerde 5 1 kolf voorzien van 10 een terugvloeikoeler voor azeotropische verwijdering, een toevoegkolf en een toevoerversproeier voor ammoniak. De toevoeren voor de ammoniakversproeier en de EMA-acetonoplossing lagen beneden het vloeistofniveau in de 5 1 kolf. Gedurende de 1*5 min.

EMA toevoegingsperiode en gedurende 10 min. daarna werd ammoniak 15 doorgeleid in de reaktiebrij met een snelheid van 0,081 mol/min. tot een totale hoeveelheid van 1*,1*1* mol ammoniak. De EMA toevoeging werd begonnen bij kamertemperatuur (23°C) en de reaktie-temperatuur liet men oplopen zonder enige koeling gedurende de gehele 1*5 min. De eindtemperatuur van de geammonieerde EMA brij 20 in aceton bedroeg 53,5°C. Het geammonieerde produkt werd afgefil-treerd, 2x opnieuw tot een brij opgeslagen in 2 1 aceton (steeds 30 min.) gevolgd door 2x in 2 1 hexaan (steeds 30 min.) en afgefiltreerd. De hexaannatte koek werd daarna opnieuw tot een brij opgeslagen zonder drogen in 2,7 1 xyleen ter verwijdering van 25 water en partiële imidisering. Deze hexaan-xyleenbrij van geammonieerd EMA werd tot terugvloeitemperatuur verwarmd teneinde water te verwijderen door azeotropische destillatie in twee trappen. Tijdens deze gehele behandeling werd continu ammoniakgas door de brij gevoerd met een snelheid van 0,030 mol/min.

30 De eerste waterverwijdering begon bij 88°C in een tijdbestek van 60 min. steeg de temperatuur tot 101°C en er werden 9»1 ml water verkregen. Het verwarmen werd voortgezet met hexaanver-wijdering tot water dat ontstaat bij de imidevorming voor het eerst werd verkregen bij 125°C. Het water -van de imidisering 35 werd azeotropisch verwijderd in een tijdbestek van 60 min. bij 8000334 91 een temperatuur in een trajekt van 125-132°C, vaartij 6,9 ml vater werden verkregen. Na imidiseren werd de brij gekoeld tot 100°C, afgefiltreerd, gewassen door opnieuw opslaan tot een brij gedurende 30 min. in 2 1 xyleen, gevolgd door twee wassingen 5 is nieuw gevormde brij (steeds 30 mis.) in 2 1 hexaan en afgefil treerd. Het afgefiltreerde produkt werd 15 uur bij 50°C gedroogd, onder een oliepompvacuum van 3 mm Hg. De opbrengst aan oven-gedroogd produkt bedroeg 31b g (9^,5 % opbrengst). De samenvatting van 12 dergelijke lopen is weergegeven in de eerstvolgende tabel.

10 Voor eindgebruik werd het ovengedroogde produkt opgelost in water (2-5 %) en de pH werd ingesteld op 9,5 met NH^OH, waarna werd afgefiltreerd door een 0,2 jm. filter en gelyofiliseerd in serum-flessen. De eigenschappen van de ovengedroogde en gelyofiliseerde eindprodukten zijn vermeld in de tweede hierna volgende tabel.

15 8000334 98 s

-P

M

I 60 ft C

o © u & rjj tjQ t— τ- (Π ?- 0\ -3· CO CO CM LA VO o hn *»«in**·***** o « on m cm Q43 (J\(3\0\0\0\0\0\0\OnO\0\0\ TJ 60 8) © ΜΟ\ΙΛι-1Λΐη!<1(ΛΟ\4ΙΑΜ rjtj r-00«“ O’-'— ©5 mcnmoncncncnononmcnon > S< Η I 0 0 X © ’ I Ό ^ H'dSH VQCMt— '-lA'-OcOt— O\00t— ft

fli «ΓΜρ4 d Λ*·»·******»·4** O

S ·Η VO CO t-twC-t-C-VOVOVOVOVO O

P > +J H

δ δ a i J* g * * ^ * . 0

O C *ra 3 fi lAVAlAlPvt— ΆΟΟηίΛΟ CO. ITS X

M OJ.H .H 3 -H CO CTnONCO t- f- VO VO VO VO ΙΑ ΙΛ X

ö « h 4>u a -, © 2 3 8 © 0 1 «- J- ΙΛ 4 VO C7\ «“ (>* ΓΠ " VO VO ©

S #r~ 4 _J *«t«t***M***** fQ

.J U E -d- VO 1Λ W -i CM OOOCO ON Ov b-

d Je 3 CM CM CM CM »“ *“ »“ O

9 Ss * . S · o s > .g ,g h . +> ou °cn Ο E ·γ4 3 B ΟΟΙΑΙΑΙΑΙΑΙΛΟΟΟΟΟ ·η cm on •H OJ © .Η 3·Η CJ\ CM CM ·— COCO [- \ϋ VO Ό Ό SO«- 1¾ Βΐ 43« a ,-,-,- <**”0 5 m © +:. u Ö d Π IA lAOnOJ’J’-B’-Si'^i· η ο ο

0 d © Q -d ChlAOCOVOJ-i-iJJ OO CM

tfl hr 4j —I «»»*·*····***· S O CM

U COO νθ\ΟΙΛΙΛΙΑΛ^4·44Λ-ΐ' COt- .s *0 43 s ° d d Λ © CM 0 0» 3 ο β w w © > ..η o^tvoo\CMiAt—»-»-t~’-r: S22

Li © et Ö VO VO VQ VO t-t— b-COCOaOCOCO ©SC

© O U \ OOOOOOOOOOOO -P +> -P

S>0 OOOOOOOOOOOO '3©© 1 " ηδ

s 0 S "S "S

1 H S do© d n-j OOOOOtAO ΙΛ ίΛ ΙΛ 1Λ ΙΛ © ft ft

43 .¾ OOONCOt-VOVOlAlALAlAlA ft 6 E

7 .-1 T- t- OOO

£ .p H +> -P

© © ©

H cH H

*. d 9 3

Id u Ul IM

© 60Ή * $ S

Ofi S * 5 ** *3)^d OOOOirvlAlAiriLfNlAlAin <3; © .i-j

2 P'H W ► -P

&

r-CMCn-sflAOl-COONOi-CM

8000334 99

Eigenschappen van produkten nit voorbeeld XXXI

ovengedroogd produkt gelyofiliseerd produkt

Loop 2 % waterig, pH gew.É imide* 2 % waterig, gew.£ imide* -pH- 1 5,28 21,5 6,20 17,9 2 fc,89 23,2 6,12 21,6 3 k,92 25,2 6,09 22,2 b U,98 23,2 6,23 19,9 5 5,01 22,8 6,16 21,5 6 5,10 23,5 6,22 20,8 7 5,02 23,0 6,25 19,5 8 5,12 2U,0 6,1¾. 19,3 9 5,12 23,5 6,18 19,0 10 5,07 22,5 6,o6 18,8 11 kt99 22,2 6,18 19,0 12 U,96 23,2 6,10 19 $ *Door infra-rood analyse.

Het totale mengsel van alle bovengenoemde porties (omstreeks i+OOO g) bezat de volgende analyse:

Ovengedroogd: 2 % waterig pH: 5,02 gew.Jï imide: 23,5

Gelyofiliseerd: 2 % waterig pH: 6,00 gew.# imide: 19,5

Twee porties van ieder 2000 g werden in pH afgesteld op 9,5 met NH^OH ,steriel gefiltreerd en gelyofiliseerd in serumflessen die 0,5 g per fles bevatten voor eindgebruik in hetzij menselijke of dierlijke proeven zodat een totaal wordt verkregen van 8000 dergelijke flacons. De analyse van deze grote hoeveelheid voor bottelen gebruikt materiaal was: pH ,2 % waterige oplossing - 6,27 imide/amide absorptieverh. met infrarood - 0,888 gew.JÈ imide - 19,3 totaal stikstof, % - 1b,b9 % stikstof als NH^+ - 6,27 8000334 100

De uiteindelijke grote massa produkt als hierboven beschreven werd beoordeeld in Pisher 3^ mannelijke ratten met gebruikmaking van FBCa tumor op overleving,niet terugkeer en anti-metastase-eigenschappen na tumorexcisie zoals beschreven 5 in de voorbeelden XIII en XV met de volgende resultaten: 8000334 101 Ö '''“*** « fi s Τ) ί) 0) fi Μ 64 tl* <U „

H VO (MO O

U*- 1-O «“

> flj W

o fi 'n «

(1) *rH

0) (0 S3 4 o g 9 fi ® ® g o» m tJ -p 2 S fi o —' g o -p o ? ,M o o +> u Qj r» O -P > _ ö O ® O O 0 > a »- >

• W

« Ö

-H tJ

<υ c -Η „ (1) O (OP) Μ 60 -go +j μ ö e •H 3 Ö -Ö 3 Q) N ® H ·

-p 0) 60 oO p) P-I

•Η -P fi * Ö

H w Ό MD *r) H

fi g x> O ir\ Q * N *- C\ · O I β O -o, | g «- P ·Η

g O «“ ® ^ -PO

«- 1Λ 60 O O

cd <ü fi 0)

fi fi M

® ® ·Η Ü 60 60 3 w fi fi g > fi η ·ν o ® r»

fi fi 60 pf t- H

o) o> cd » Q) g O Ό ΙΛ ® M fi o M -a· *h fi a>

tb o t- W ® P

L 3 r— t— · O ·Η ®

On ^IgT- g * o ® o co ® v Ü Μ ti ^ -p i— >— 60 O ® ^

N 60 fi Q S -P

I o s eh <n fi o o * * fi fi »- * * * «

n W

U

% O

.•8 £ 8000334 102

Voorbeeld XXXII

Dit voorbeeld maakt gebruik van de methode als beschreven in voorbeeld XX om een normale Levis-ratten te beoordelen op hun vermogen om immuunresponsen te stimuleren uitgedrukt 5 in toename van IgM antilichaamvormende cellen tot heterologe erythrocyten (rode bloedcellen van schapen, SRBC) behoudens dat in dit geval het imidepreparaat volgens de uitvinding werd toegediend door intraveneuze dosering via de staartader als 1 ml fysiologische zoutoplossing die de aangegeven doseringshoeveel-10 heid bevat. Alle andere bij zonderheden wren dezelfde als in voorbeeld XX. De onderstaande gegevens verden verkregen in twee proeven.

8000334 r 103 ir\ a 4

•P

•

Η I

M t0 *~

H bO

β H rtf ·Η H Φ β) Φ Η

φ Η Ο OONVOrnr-t-T- (Ό VO

Λ 3 X L, OVOJ-OJVOm'-lAOx U g <η 4-> »»*·»**** ο *3 τί c i-CMCMcnmcMCMm*- ο -ρ ö ο > Μ ·Η ϋ Ρ «Η 3 Β 5 '“οί Φ »“ Η g ϋ 8 ΐ

,3 ">>.+> CM VO CM -3- CM CO Ο -S’ CM

0 SO H CMOCOOOCOCnO-^CM

Q tbb'H lTV-=fCMVOCOCM»-COO

Η P-, S

A

co 11 *P fel *

Η I

Μ Μ f*

H bO

> C H

ti 'u φ 2? & Η Φ Η Φ Φ

ΦΗ O Q «- CM VO O J- CJ\ t- OO

®3Xin Ono«-*-ocMOco £ k

n 6 Ο) -p ·*·«····· MOO

1 -HDa -WWWNCMNN- S -p a o fc ^

o « ·η o S S

> A A

+i C C

•H C g g 3 VO φ k At P Ο H « « Φ X Φ X A « 0) T- Ο (ΜβΟΙΛΦ-ί^ΙΊ^

C >s»-p MD Q\ pr) »— in ^ CM LfNCM

£ SO H IAW>-W<-r.Wr-0

H ·Η ρ-^,-Ρ-τ-^r-t- X

Ο Η PM β * * Ρ4 Μ ^ Μ « Φ “>. Η Η 60 Ο S* £ Φ Ö ο f > ·Η Ο ' ti ^ ^ Q) ΙΑ τ— I) (Q Λ Λ

ö Ο WV0«-iN<-OO

•π >5 ο cn τ- 8000334 104

Voorbeeld XXXIII

Een voorkeursvoorbeeld van de uitvinding dat een copolymeer van etheen en maleïnezuuranhydride met een mol.gew. van ongeveer 850 bevat en waarvan een derivaat is gevormd dat 5 half-amide, half-ammoniumzoutgroepen en imidegroepen bevat waarin de imidegroepen ongeveer 20 gew.% uitmaken van deze groepen (nagenoeg overeenkomstig als het voorbeeld toegelicht door fig. 1) is onderzocht bij mensen. Over een periode van verscheidene maanden in een fase I klinisch onderzoek van tot 10 72 patiënten met maagdarmkanker (met inbegrip van maag, pancreas, dikke darm en rectale kankerpatiënten), werd geen significante toxiciteit gevonden voor het geneesmiddel voor de intraperitonale, orale of intraveneuze wijze van toediening en er werd geen versneld patroon van de voortschreiding van de ziekte gevonden 15 nadat de geneesmiddelbehandeling had plaats gevonden.

Voorbeeld XXXIV

Wanneer isobuteen wordt gebruikt in plaats van een equivalente hoeveelheid van het propeen in voorbeeld XXIV worden vrijwel dezelfde resultaten verkregen.

20 Voorbeeld XXXV

Wanneer dimethylmaleïnezuuranhydride wordt gebruikt in plaats van een equivalente hoeveelheid citraconzuur-anhydride in voorbeeld XXV worden vrijwel dezelfde resultaten verkregen.

25 Voorbeeld XXXVI

Wanneer EMA met een berekend numeriek gemiddeld mol.gew. van 300 gebruikt wordt in plaats van het EMA met een berekend numeriek gemiddeld mol.gew. van 342 in voorbeeld XXVI, worden vrijwel dezelfde resultaten verkregen.

30 Voorbeeld XXXVII

Wanneer EMA met een berekend numeriek gemiddeld mol.gew. van 1500 gebruikt wordt in plaats van het EMA met een berekend numeriek gemiddeld mol.gew. van 342 in voorbeeld XXVI wordt gebruikt, worden vrijwel dezelfde resultaten verkregen.

35 8000334

Claims (16)

1. Werkwijze voor het bereiden van een immuno-regulerend derivaat van copolymeer van een ethylenisch onverzadigd monomeer met 2-k koolstofatomen en α,β-onverzadigde polycarbon- 5 zuuranhydride met U-6 koolstofatomen, met het kenmerk, dat men een half-amide, half-ammoniumzoutderivaat van dat copolymeer, waarin het copolymeer een mol.gev. heeft van 300-1500, laat reageren met ammoniak om een verder derivaat van dat copolymeer te bereiden, zodat dit zovel (a) half-amide, half-ammoniumzoutgroepen als 10 (b) imidegroepen bevat, waarin de imidegroepen 5-^0 gev.% uitmaken van de derivaatgroepen en desgewenst de half-ammonium-zoutgroep omzet in een andere farmaceutisch aanvaardbare zout-groep.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 13 dat men de reaktie uitvoert in een organisch oplosmiddel als medium bij terugvloeitemperatuur.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat men als organisch oplosmiddel xyleen of tolueen gebruikt. k. Werkwijze volgens een of meer van de voor- 20 gaande conclusies, met het kenmerk, dat men als ethylenisch onverzadigd monomeer etheen gebruikt. 5. 'Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men als polycarbonzuur-anhydride maleïnezuuranhydride gebruikt.

6. Werkwijze volgens één of meer van de voor gaande conclusies, met het kenmerk, dat mensen derivaat bereidt met een gemiddeld mol.gew. van 850.

7. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat men een verbinding 30 bereidt waarin de half-amide, half-carboxylaatzoutgroep de half-amide, half-ammoniumzoutgroep is.

8. Werkwijze volgens één of meer van de voorgaande conclusies, waarin de imidegroep 10-25 % uitmaakt van de derivaatgroepen. 35 9· Werkwijze volgens één of meer van de voor- 8000334 gaande conclusies, met het kenmerk, dat men de reaktie uitvoert bij een temperatuur van 50-200°C.

10. Werkwijze volgens conclusie 9» dat men de reaktie uitvoert bij een temperatuur van 60-150°C.

11. Werkwijze volgens conclusie 10, met het ken merk, dat men de reaktie uitvoert bij een temperatuur van 100-150°C.

12. Nieuwe samenstelling, met het kenmerk, dat deze gevormd is uit copolymeren van ethylenisch onverzadigde IQ monomeren met 2-b koolstofatomen en a,3-onverzadigd polycarbon-zuuranhydriden met b-6 koolstofatomen, met een gemiddeld mol.gev. van 300-1500, waarvan de derivaten zijn gevormd zodat deze zowel half-amide, half-carboxylaatzoutgroepen als imidegroepen bevatten, waarin de imidegroepen 5-^0 % uitmaken van de derivaatgroepen.

13. Samenstelling volgens conclusie 12, met het kenmerk, dat het ethylenisch onverzadigde monomeer etheen is. 1½. Samenstelling volgens conclusie 12 of 13, met het kenmerk, dat het polycarbonzuuranhydride maleïnezuur-2o anhydride is.

15. Samenstelling volgens éên of meer van de conclusies 12-1met het kenmerk, dat de samenstelling een gemiddeld mol.gew. van S50 heeft.

16. Samenstelling volgens één of meer van de 25 conclusies 12-15, met het kenmerk, dat de half-amide, half-carboxy-laatzoutgroep de half-amide, half-ammoniumzoutgroep is.

17. Samenstelling volgens één of meer van de conclusies 12-16, met het kenmerk, dat de Mdegroep 10-25 % uitmaakt van de derivaatgroepen.

18. Werkwijze voor het bereiden van een immuno- regulerend middel, met het kenmerk, dat men een derivaat van een copolymeer van een ethylenisch onverzadigd monomeer met 2-b koolstofatomen en 0,8-onverzadigd polycarbonzuuranhydride met b-6 koolstofatomen met een gemiddeld mol.gew. van 300-500, dat 35 zowel half-amide, half-carboxylaatzoutgroepen als imidegroepen 8000334 bevat, en waarin de imidegroepen 5-^0 % uitmaken van de derivaat-groepen, opgelost in een fysiologische zoutoplossing.

19· Farmaceutisch preparaat, met het kenmerk, dat dit een derivaat van een copolymeer van een ethylenisch 5/ onverzadigd monomeer met 2-k koolstofatomen en een α,β-onverzadigd polycarbonzuuranhydride met U-6 koolstofatomen, met een gemiddeld mol.gew. van 300-1500, dat zowel half-amide, half-carboxylaat-zoutgroepen als imidegroepen bevat, waarbij deze imidegroepen 5-^0 % uitmaken van de derivaatgroepen, in voor toediening 10 geschikte vorm bevat.

20. Werkwijze voor het bereiden van een immuno-regulerend derivaat van een copolymeer, zoals hierin beschreven. ',·/ 8 0 0 0 3 3 4 ^'f