NL2005116C2 - Overbrenging van een monsterdrager in de correlatieve elektronenmicroscopie. - Google Patents

Description

Titel: Overbrenging van een monsterdrager in de correlatieve elektronenmicroscopie

De uitvinding heeft betrekking op een vasthoudinrichting voor het vasthouden van een monsterdrager voor elektronenmicroscopie en voor de overbrenging van de monsterdrager van een Hchtmicroscoop naar een cryopreparatie-inrichting voor het cryoprepareren van monsters voor 5 elektronenmicroscopie.

Verder heeft de uitvinding betrekking op een werkwijze voor het overbrengen van een monsterdrager voor elektronenmicroscopie van een lichtmicroscoop naar een cryopreparatie-inrichting voor het cryoprepareren van monsters voor elektronenmicroscopie.

10 De cryo-elektronenmicroscopie heeft aangetoond bijzonder geschikt te zijn voor structuurbiologische onderzoeken. Bij deze technologie wordt een waterhoudend monster gecryofixeerd, dat wil zeggen dat deze zeer snel en onder vermijding van de vorming van ijskristallen wordt afgekoeld. De te onderzoeken objecten, bijvoorbeeld cellen, enzymen, virussen of lipide lagen, 15 worden daardoor in een dunne verglaasde ijslaag ingebed. Het grote voordeel van de cryofixatie is dat de biologische structuren in hun natuurlijke toestand bewaard kunnen worden en in hun fysiologische omgeving onderzocht kunnen worden. Onder andere kan een biologisch proces op elk gewenst moment door cryofixatie gestopt worden en in deze 20 verglaasde toestand in een elektronenmicroscoop onderzocht worden.

Om het goede moment van de cryofixatie precies te bepalen, is de correlatieve methode tussen lichtmicroscoop en elektronenmicroscoop, ook aangeduid met CLEM (“correlative light-electron microscopy”), van groot voordeel. De correlatieve methode tussen lichtmicroscoop en 25 elektronenmicroscoop staat toe om het biologisch monster eerst net zo lang in een hchtmicrsoscoop te observeren, tot de gewenste toestand wordt bereikt. Vervolgens wordt het monster naar een cryopreparatie-inrichting 2 overgebracht en gecryofixeerd voor de observatie met een electro nenmicroscoop.

Als monsters worden dikwijls celculturen gebruikt. Dikwijls groeien deze direct op de monsterdrager. CLEM maakt het mogelijk om de 5 cellen in de levende toestand eerst in een lichtmicroscoop te onderzoeken, bepaalde cellen te selecteren respectievelijk een toestand van een cel af te wachten en deze toestand door snel invriezen vast te houden.

Bij een andere correlatieve methode vindt het onderzoek met een lichtmicroscoop plaats op het reeds gecryofixeerde monster. Deze methode 10 heeft in vergelijking met de hiervoor beschreven CLEM-methode echter het nadeel, dat het biologische monster respectievelijk de cellen niet in de levende toestand onderzocht kunnen worden.

Onafhankelijk van de aard van de mónsterpreparatie is het voor een met een transmissie-elektronenmicroscoop verkregen afbeelding met 15 een hoge resolutie volstrekt noodzakelijk, dat het monster dun genoeg is.

Monsters voor transmissie-elektronenmicroscopie zijn gewoonlijk 30-100 nm dik en bij voorkeur 50-80 nm dik. Bij andere methoden met een transmissie-elektronenmicroscoop (bijvoorbeeld Intermediate Voltage Transmission Electron Microscopy (IVEM)) kunnen de monsters daarentegen ook 20 beduidend dikker zijn. Monsters met een bepaalde dikte kunnen verkregen worden door te snijden met behulp van een ultramicrotoom, waarbij een gecryofixeerd monster (cryosnede) in zeer dunne schijven wordt gesneden. Een andere preparatiemethode heeft betrekking op het aanbrengen van dunne vloeistoffilms op een drager voor elektronenmicroscopie. Hierbij 25 wordt een dunne vloeistoffilm zeer snel ingevroren, waarbij ijskristalvorming wordt vermeden. Daarvoor wordt een drager voor elektronenmicroscopie (“netwerk”, “grid”) in een het monster bevattende vloeistof gedompeld respectievelijk wordt de monstervloeistof door middel van een pipet op de dager aangebracht, de overvloedige vloeistof wordt 30 bijvoorbeeld met behulp van een filtreerpapier verwijderd, en de op de 3 drager achterblijvende vloeistoffilm wordt gecryofixeerd door onderdompeling in een bad van bijvoorbeeld vloeibaar ethaan. Gecryofixeerde monsters kunnen direct in bevroren toestand in een cryo-elektronenmicroscoop onderzocht worden, doordat zij bestand zijn tegen het 5 in de elektronenmicroscoop heersende hoogvacuüm. Bij de vriessubstitutie, welke bijvoorbeeld in octrooischrift EP 1 267 164 BI beschreven is, wordt het water in een gecryofixeerd monster uitgewisseld met een polymeer en wordt het monster, na het uitharden van de polimeer, met de ultramicrotoom op kamertemperatuur in schijven gesneden; het onderzoek 10 met een elektronenmicroscoop vindt eveneens plaats op kamertemperatuur.

Automatische en semiautomatische cryopreparatie-inrichtingen voor het cryofixeren zijn uit de stand van de techniek bekend. Octrooischrift WO 02/077612 Al (zie ook EP 1 370 846 BI en US 020040157284) beschrijft een dergelijk inrichting, waarmee de cryopreparatie nagenoeg automatisch 15 uitgevoerd kan worden. Deze inrichting is onder de handelsnaam Vitrobot™ op de markt. Bij dit apparaat wordt de monsterdrager in een vasthoudinrichting gefixeerd. Overtollige monstervloeistof op de drager wordt, indien nodig, met behulp van filtreerpapier afgeleid (“blotting”-proces). Aansluitend wordt het monster verglaasd door de drager snel in een 20 koelmiddel (ethaan) onder te dompelen. Een ander apparaat van de firma Gatan (www.gatan.at) met de handelsnaam Cryoplunge™ is simpeler geconstrueerd en niet volautomatisch.

Omdat biologische processen vaak zeer snel aflopen, is het bij de hierboven beschreven correlatieve methode tussen lichtmicroscoop en 25 elektronenmicroscoop (CLEM) gewenst een snelle overbrenging van de monsterdrager van de lichtmicroscoop naar een elektronenmicroscoop te realiseren.

De overbrenging van een monsterdrager van een lichtmicroscoop naar een hierboven genoemde cryopreparatie-inrichting is echter verbonden 30 met een aanzienlijke investering van tijd. Voor deze apparaten is er ook 4 geen speciale overbrenging van de monsterdrager van de lichtmicroscoop naar de cryopreparatie-inrichting beschikbaar. Derhalve is de overbrengtijd, welke veroorzaakt wordt door het handmatig oppakken van de monsterdrager van een lichtmicroscoop, bijvoorbeeld door middel van een 5 pincet, voor vele onderzoeken te lang.

Het is daarom een doel van de uitvinding, de nadelen uit de stand van de techniek tegen te gaan en een snelle overbrenging van de monsterdrager van de lichtmicroscoop naar de cryopreparatie-inrichting met inbegrip van het invriezen van het monster mogelijk te maken.

10 Dit doel wordt bereikt met een hierboven genoemde vasthoudinrichting, welke overeenkomstig de uitvinding een insluitelement omvat, waarbij het insluitelement in een aan de lichtmicroscoop en een aan de cryopreparatie-inrichting gerangschikte insluitinrichting losneembaar insluitbaar is.

15 Verder wordt dit doel bereikt met een hierboven genoemde werkwijze, welke overeenkomstig de uitvinding de volgende stappen omvat: - het bevestigen van de monsterdrager in een vasthoudinrichting, - het losneembaar insluiten van de vasthoudinrichting met de daarin vastgehouden monsterdrager door middel van een op de 20 vasthoudinrichting gerangschikt insluitelement in een eerste insluitinrichting van de lichtmicroscoop en het met een lichtmicroscoop onderzoeken van een zich op de monsterdrager bevindend monster, - het losnemen van de vasthoudinrichting met de daarin 25 vastgehouden monsterdrager van de insluitinrichting van de lichtmicroscoop en het overbrengen van de vasthoudinrichting naar de cryopreparatie-inrichting, en - het losneembaar insluiten van de vasthoudinrichting met de daarin vastgehouden monsterdrager door middel van het op de 30 vasthoudinrichting gerangschikte insluitelement in een tweede 5 insluitinrichting van de cryopreparatie-inrichting en het cryoprepareren van het monster.

Doordat de monsterdrager reeds gedurende het onderzoek met de lichtmicroscoop in de vasthoudinrichting is bevestigd en daarmee het 5 oppakken van de monsterdrager tussen de beide observatiemethoden vervalt, kan de overbrengtijd dankzij de uitvinding aanzienlijk verkort worden. Na het onderzoek met de lichtmicroscoop kan de in de vasthoudinrichting bevestigde monsterdrager met het monster snel worden weggenomen door het losnemen van de insluitverbinding tussen het 10 insluitelement en de insluitinrichting van de lichtmicroscoop, snel worden overgebracht, gefixeerd worden in de insluitinrichting van de cryopreparatie-inrichting door insluiten van de vasthoudinrichting, en ten slotte gecryofixeerd worden. De monsterdrager met het monster blijft dus de hele tijd in de vasthoudinrichting bevestigd, beginnende met het onderzoek 15 met de lichtmicroscoop, gedurende de overbrenging van de lichtmicroscoop naar de cryopreparatie-inrichting, tot en met het invriezen in cryogeen. Dankzij de uitvinding is het mogelijk, reproduceerbaar in de lichtmicroscoop en in de cryopreparatie-inrichting te positioneren.

De overbrengtijd zelf kan zeer kort worden gehouden en kan -20 afhankelijk van de afstand van de lichtmicroscoop tot de cryopreparatie-inrichting - slechts een paar seconden bedragen.

Het begrip “monsterdrager” heeft betrekking op alle voor de elektronenmicroscopie en voor de monsterpreparatie voor elektronenmicroscopie geschikte dragers. In het bijzonder heeft het begrip 25 “monsterdrager” betrekking op de reeds boven vermelde grids (“netdrager”, “netwerk”, “net”), waarbij de grids verschillend gevormde gaten (raten, spleten, etc.) of door een raster bepaald aantal mazen omvatten en/of van een laag film zijn voorzien (bijvoorbeeld van een laag voorziene grids van de firma Quantifoil) en/of opgedampt zijn met koolstof. Andere dragers, welke 30 evenwel bij de cryopreparatie van monsters voor elektronenmicroscopie 6 ingezet kunnen worden, zijn bijvoorbeeld saffierschijven zoals in octrooischrift EP 1 267 164 BI beschreven.

De vasthoudinrichting is zo uitgevoerd, dat de gewoonlijk zeer verfijnde en kleine monsterdrager, in het bijzonder een grid (diameter 2-3 5 mm), zeker gefixeerd wordt. Gewoonlijk wordt een grid in zijn randgebied door een pincetgreep gefixeerd. Zeer voordelig zijn ook grids met lippen.

Deze speciale soort monsterdragers (ook met “grid with tab”, “tabbed grid” of “handle grid” aangeduid) heeft aanvullend op de buitenste rand naast de standaard gridradius een lip, waaraan men bijvoorbeeld met een pincet kan 10 aangrijpen.

Voor een lichte hantering van de vasthoudinrichting, in het bijzonder gedurende de overbrenging, welke gewoonlijk handmatig plaatsvindt, is het voordelig, wanneer de vasthoudinrichting in hoofdzaak langwerpig is uitgevoerd. Bij voorkeur is de vasthoudinrichting 15 pincetvormig uitgevoerd.

Bij een voorkeursuitvoering heeft het insluitelement een eerste gebied voor het fixeren van de vasthoudinrichting in de desbetreffende insluitinrichting van de fichtmicroscoop respectievelijk de cryopreparatie-inrichting en een tweede gebied voor het inspannen bijvoorbeeld van een 20 pincet met een zeer fijne punt. De monsterdrager wordt door middel van het pincet vastgehouden. Het pincet kan indien nodig, bijvoorbeeld bij slijtage van de pincetpunt, eenvoudig worden omgewisseld. Hoewel de hiervoor genoemde uitvoeringsvorm de voorkeur heeft, kan de vasthoudinrichting ook eendelig zijn uitgevoerd.

25 De uitvinding is in het bijzonder geschikt voor de overbrenging en voor de cryopreparatie van monsters met cellen, in het bijzonder een celcultuur.

Voor monsters, welke celculturen omvatten, worden meestal inverse microscopen gebruikt. De monsterdrager bevindt zich gewoonlijk in 30 een doorzichtige cultuurhouder, bijvoorbeeld een celcultuurschaal of een 7 petrischaal, met een dekglas als bodem. Het objectief is onder het dekglas respectievelijk de cultuurhouder gerangschikt. De rand van de cultuurhouder brengt met zich mee dat de vasthoudinrichting zich niet horizontaal uitstrekt, maar zich in een hoek tot in de cultuurhouder 5 uitstrekt. Dit veroorzaakt problemen bij een gebruikelijke monsterdrager, doordat het oppervlak van de monsterdrager parallel en in contact met het dekglas gerangschikt moet zijn. Het is daarom bijzonder voordelig, wanneer het oppervlak van de monsterdrager in een hoek met de in hoofdzaak langwerpige vasthoudinrichting richtbaar is. Als bijzonder doelmatig voor 10 deze uitvoeringsvorm heeft zich het gebruik van een monsterdrager met lip, in het bijzonder een grid met lip zoals boven beschreven, bewezen. Deze lip kan ofwel elastisch ofwel plastisch worden gebogen, zodat een parallelle positie van nagenoeg het gehele gridoppervlak tot het dekglas bereikt kan worden. Na het onderzoek met de lichtmicroscoop kan de vasthoudinrichting 15 snel van de lichtmicroscoop verwijderd worden en naar de cryopreparatie-inrichting overgebracht worden. Na het invriezen kan de lip bijvoorbeeld door middel van een scalpel, scheermes of microschaar van het grid verwijderd worden en kan het grid in bevroren toestand in een monsterdrager voor de elektronenmicroscopie worden gemonteerd.

20 Om de monsterdrager in de lichtmicroscoop gericht en gecontroleerd het dekglas te laten benaderen, is het voordelig, wanneer de vasthoudinrichting voor het positioneren van de monsterdrager door middel van een aan de insluitinrichting van de lichtmicroscoop gerangschikte afstelinrichting in de gewenste positie bewogen wordt.

25 Wanneer de vasthoudinrichting in de cryopreparatie-inrichting gefixeerd is, is het gunstig als de vasthoudinrichting draaibaar is gelagerd om zijn lengteas, om het “blotten” van de gewenste kant van het net mogelijk te maken.

Opdat de vasthoudinrichting snel en met herhaalbare precisie door 30 middel van het insluitelement in de desbetreffende insluitinrichting 8 bevestigd kan worden en er weer uit verwijderd kan worden, hebben de volgende koppelingsmechanismen zich in de praktijk als gunstig bewezen: Bij een eerste voordelige uitvoeringsvorm wordt het insluitelement door middel van een kogelinsluitkoppeling in de insluitinrichting ingesloten.

5 Bij een subuitvoeringsvorm omvat het insluitelement een insluitgroef, waarin een in de betreffende insluitinrichting van de lichtmicroscoop respectievelijk de cryopreparatie-inrichting gerangschikt, geveerd koppelingsdeel (kogelinsluiting) ingesloten kan worden. Er zijn veel mogelijkheden voor de uitvoering van de opname, zoals bijvoorbeeld een 10 zwaluwstaart- of T-vorm. Een L-vorm heeft bewezen bijzonder voordelig te zijn, omdat daarmee een montage in twee posities (180°-symmetrie) vermeden kan worden en een eenduidige positionering van de monsterdrager mogelijk wordt gemaakt. De L-vorm laat de montage maar in één positie toe. Dit heeft het voordeel, dat altijd de goede positie van de 15 monsterdrager in acht kan worden genomen, omdat de monsterdrager zowel bij het onderzoek met de lichtmicroscoop als ook bij het “blotten” een bepaalde positie moet innemen en niet over 180° verdraaid zal worden. Fouten kunnen op deze manier worden vermeden.

Bij een andere voordelige uitvoeringsvorm kan het insluitelement 20 door middel van een magnetische koppeling in de insluitinrichting bevestigd worden. De uitvoeringsvorm met de kogelinsluitkoppeling wordt echter op grond van de nog hogere precisie geprefereerd.

Hieronder wordt de uitvinding met inbegrip van andere voordelen aan de hand van een niet beperkend uitvoeringsvoorbeeld, dat in de 25 bijgevoegde tekening is weergegeven, nader toegelicht. In de tekening toont: Fig. 1 een perspectivisch aanzicht van een vasthoudinrichting voor een monsterdrager voor elektronenmicroscopie, welke op een tafel van een lichtmicroscoop gefixeerd is,

Fig. 2 een cryopreparatie-inrichting in perspectivisch aanzicht met 30 de in de cryopreparatie-inrichting gefixeerde vasthoudinrichting van Fig. 1, 9

Fig. 3A een perspectivisch aanzicht van een vasthoudinrichting overeenkomstig de uitvinding,

Fig. 3B een perspectivisch aanzicht van de insluitinrichting, waarin de vasthoudinrichting van Fig. 3A volgens het kogelinsluitprincipe 5 insluitbaar is, en

Fig. 4 een doorsnee van de vasthoudinrichting van Fig. 3A en de insluitinrichting van Fig. 3B in een ineengesloten toestand.

Fig. 1 toont een perspectivisch aanzicht van een vasthoudinrichting 100 voor het vasthouden en onderzoeken van een voor de 10 cryoelektronenmicroscopie bestemd monster in een lichtmicroscoop. In het getoonde voorbeeld betreft het een celcultuurmonster. Hiervoor worden de cellen onder steriele condities in weefselcultuurhouders op monsterdragers voor elektronenmicroscopen gecultiveerd. De cellen groeien als monolaag op de monsterdragers. Voor het onderzoek met een lichtmicroscoop wordt een 15 monsterdrager, in het getoonde voorbeeld een grid 101, weggenomen en in een op de lichtmicroscoop bevestigbare vasthoudinrichting 103 gefixeerd. Met behulp van de vasthoudinrichting 103 wordt een snellere overbrenging van het grid 101 van de lichtmicroscoop naar een cryopreparatie-inrichting (zie Fig. 2) mogelijk gemaakt. Bij het getoonde voorbeeld betreft het een 20 inverse lichtmicroscoop.

Voor een lichtere hantering is de vasthoudinrichting 103 in hoofdzaak langwerpig is uitgevoerd. De vasthoudinrichting 103 in dit uitvoeringsvoorbeeld is tweedelig uitgevoerd en omvat zowel een pincet 103a voor het fixeren van het grid 101 als een insluitelement 103b, welk 25 enerzijds het pincet 103a opneemt en anderzijds de vasthoudinrichting 103 fixeert aan een insluitinrichting 104, welke op een tafel 108 van de lichtmicroscoop is gerangschikt. Een koppelingsmechanisme tussen het insluitelement 103 en de insluitinrichting 104 volgens het kogelinsluitprincipe is hieronder voorts weergegeven in Fig. 3A, 3B en 4.

10

Zoals in Fig. 1 getoond, omvat het grid 101 op zijn buitenste rand naast de standaard gridradius een lip 107, waaraan het pincet 103a kan aangrijpen. De vasthoudinrichting 103 wordt nu zodanig in de lichtmicroscoop bevestigd, dat het pincet 103a met het grid 101 zich in een 5 zich op de tafel 108 bevindende celcultuurschaal 102 naar binnen toe uitstrekt. De rand 106 van de celcultuurschaal 102 brengt met zich mee dat de vasthoudinrichting 103 zich niet horizontaal uitstrekt, maar zich onder een hoek α (Griekse letter alfa) uitstrekt tot in de cultuurschaal 102. Het grid 101 ligt voor het onderzoek op een dekglas 102a. Het dekglas 102a 10 vormt de bodem van de celcultuurschaal 102. Celcultuurschalen van deze soort zijn in de handel verkrijgbaar (bijvoorbeeld Fluorodish Cell Culture Dish 35 mm, glas 23 mm doorsnede, 0,17 mm dikte van de firma World Precision Instruments Ine.). De cellen op het grid 101 zijn daarbij naar het dekglas gekeerd. Het objectief (niet getoond) is onder het dekglas 102a 15 respectievelijk de celcultuurschaal 102 gerangschikt. Om de voor het onderzoek met een lichtmicroscoop noodzakelijke parallelle positie nagenoeg van het gehele gridoppervlak tot het dekglas 102a te bereiken, wordt de door het pincet 103a vastgehouden lip 107 bijvoorkeur elastisch ten opzichte van het gridoppervlak verbogen. Voor het onderzoek met de lichtmicroscoop 20 is het gridoppervlak dientengevolge onder een hoek ten opzichte van de lengteas (L) van de vasthoudinrichting 103 georiënteerd. Een plastische verbuiging van de lip 107 is ook denkbaar, echter wordt een elastische verbuiging geprefereerd, omdat het oppervlak van het grid 101 voor de aansluitende cryopreparatie weer in hoofdzaak parallel aan de lengteas (L) 25 van de vasthoudinrichting 103 georiënteerd moet zijn.

Om het grid 101 in de lichtmicroscoop gericht en gecontroleerd het dekglas 102a te laten benaderen en te positioneren, kunnen de vasthoudinrichting 103 en het daarin bevestigde grid 101 door middel van een op de insluitinrichting 104 van de lichtmicroscoop gerangschikte 11 afstelinrichting 105 worden bewogen en in de gewenste positie worden gebracht.

Na het onderzoek met de lichtmicroscoop, bijvoorbeeld wanneer een gewenste biologische toestand van het monster is bereikt, kan de 5 vasthoudinrichting snel van de lichtmicroscoop worden verwijderd door het losnemen van het insluitelement 103 van de insluitinrichting 104 en naar de cryopreparatie-inrichting overgebracht worden en gecryofixeerd worden (zie voor een gedetailleerde beschrijving Fig. 2). Na het invriezen wordt de lip 107 door middel van een scalpel, scheermes of microschaar van het grid 10 101 verwijderd en het grid 101 met inbegrip van het zich daarop bevindende monster in bevroren toestand in een monsterhouder voor de elektronenmicroscopie gemonteerd.

Doordat de gebruiker het grid 101 makkelijk buiten de preparatiekamer met het pincet 103 kan aangrijpen, kan de 15 vasthoudinrichting 103 handmatig snel en met herhaalbare precisie zowel op de tafel 108 van de lichtmicroscoop als ook in de cryopreparatie-inrichting bevestigd en weer verwijderd worden. Een geschikt koppelingsmechanisme volgens het kogelinsluitprincipe is hieronder uitvoeriger weergegeven in Fig. 3A, 3B en 4. Het pincet 103a kan indien 20 nodig eveneens eenvoudig verwisseld worden.

Fig. 2 toont een perspectivisch aanzicht van een geautomatiseerde cryopreparatie-inrichting 200 voor het prepareren van monsters voor een elektronenmicroscoop. De inrichting 200 omvat als wezenlijke componenten een klimatiseerbare preparatiekamer 201 en een koelinrichting 202, waarin 25 zich een houder met een cryogeen bevindt. In het behuisde rugdeel 203 van de inrichting 200 zijn diverse stappenmotoren alsook een sturing ondergebracht, welke hier niet nader zijn weergegeven. In Fig. 2 bevindt zich de preparatiekamer 201 in zijn bovenste positie, waarin de vasthoudinrichting 103 met het daarin bevestigde grid 101 door middel van 30 het insluitelement 103b in een insluitinrichting 204 in de cryopreparatie- 12 inrichting 200 gefixeerd kan worden. Het mechanisme van het insluiten van het insluitelement 103 in de insluitinrichting 204 is dezelfde als die voor de lichtmicroscoop (zie Fig. 1). Na het fixeren van de vasthoudinrichting 103 wordt de preparatiekamer 201 met behulp van een stappenmotor naar 5 beneden bewogen in de richting van de koelinrichting 202. De vasthoudinrichting 103 met het monster bevindt zich nu in de preparatiekamer 201. Overvloedige monstervloeistof kan - zoals hiervoor reeds beschreven - van het gridoppervlak worden verwijderd door middel van “blotten” met filtreerpapier. De vasthoudinrichting 103 is in beide 10 richtingen 180° draaibaar om zijn lengteas L’, om het “blotten” van beide kanten toe te staan. Na het “blotting”-proces wordt het grid 101 door middel van het verticaal bewegen van de vasthoudinrichting 103 zeer snel naar beneden verplaatst in de zich onder de preparatiekamer 201 bevindende cryogeenhouder (niet weergegeven) van de koelinrichting 202, waardoor het 15 zich op het grid lOlbevindende biologische monster (cellen) verglaasd wordt.

Na het invriezen wordt het grid met het bevroren monster voor microscopie in een elektronenmicroscoop uit de vasthoudinrichting 103 losgenomen. De houder met het cryogeen is uit de inrichting 200 verwijderbaar, om het verglaasde monster in een monsterhouder voor een 20 cryo-elektronenmicroscoop te kunnen plaatsen. Na het invriezen wordt de vasthoudinrichting opgehesen tot net boven de cryogeenhouder. In dit gebied bedraagt de gastemperatuur ongeveer -160°C. Handmatig wordt de vasthoudinrichting 103 uit het insluitmechanisme verwijderd en het grid 101 in een overbrenghouder, welke door middel van vloeibare stikstof is 25 gekoeld en zich bij voorkeur naast de cryogeenhouder bevindt, afgelegd.

Deze overbrenghouder wordt weer naar een laadstation voor cryo-elektronenmicroscoophouders (firma Gatan: www.gatan.com) getransporteerd.

Fig. 3A toont een perspectivisch aanzicht van de 30 vasthoudinrichting 103. De vasthoudinrichting 103 is, zoals boven reeds 13 uiteengezet, tweedelig geconstrueerd en omvat een pincet 103a voor het fixeren van het grid 101 (met lip 107) en ook een insluitelement 103b, welk enerzijds het pincet 103a opneemt en anderzijds in een insluitinrichting 104 van de lichtmicroscoop en ook in een insluitinrichting 204 van de 5 cryopreparatie-inrichting 200 is in te sluiten. De insluitinrichting 104 is in " Fig. 3B weergegven; de insluitinrichting 204 van de cryopreparatie- inrichting is gelijksoortig vormgegeven.

De montage van de vasthoudinrichting 103 in de insluitinrichting vindt plaats door het horizontaal inschuiven van het insluitelement 103b 10 van de vasthoudinrichting 103 in de insluitinrichting 104 (montagerichting weergegeven door middel van de peil 109). In Fig. 3A is aan de onderkant van het insluitelement 103b een hellend vlak 110 (bijvoorbeeld onder 45° afgeschuind) te zien, welk een V-vormige insliiitgroef 111 omvat. De insluitgroef 111 dient als insluiting voor een in de insluitinrichting 104 15 gerangschikt, geveerd koppelingsdeel 112 (kogelinsluiting 112). Deze is aanschouwelijk gemaakt in Fig. 4, welke de vasthoudinrichting 103 van Fig 3A en de insluitinrichting 104 in een ineengesloten toestand toont. De kogelinsluiting 112 bevindt zich in de insluitgroef 111.

Er zijn veel mogelijkheden voor de uitvoering van de opname, zoals 20 bijvoorbeeld een zwaluwstaart- of T-vorm. In het getoonde voorbeeld is voor een L-vorm 114 gekozen, om een montage in twee posities (180°-symmetrie) te vermijden en een eenduidige positionering van het grid 101 mogelijk te maken. De L-vorm 114 laat de montage maar in één positie plaatsvinden.

De L-vorm 114 heeft het voordeel, dat altijd de goede positie van het grid 25 101 in acht kan worden genomen, omdat het grid 101 zowel bij het onderzoek met de lichtmicroscoop als ook bij het “blotten” een bepaalde positie moet innemen en niet over 180° zal worden verdraaid. Fouten kunnen op deze manier worden vermeden.

In plaats van de geveerde kogelinsluiting kan als koppelingsstuk 30 112 ook een magnetische koppeling worden toegepast.

14

De hierboven beschreven uitvoeringsvorm is slechts één van de vele voorbeelden en bijgevolg niet als beperkend te beschouwen.

Claims (11)

1. Vasthoudinrichting (103) voor het vasthouden van een monsterdrager voor elektronenmicroscopie (101) en voor de overbrenging van de monsterdrager (101) van een lichtmicroscoop naar een cryopreparatie-inrichting (200) voor 5 het cryoprepareren van monsters voor een elektronenmicroscoop, daardoor gekenmerkt dat de vasthoudinrichting (103) een insluitelement (103b) omvat, waarbij het insluitelement (103b) in een elk aan de lichtmicroscoop en aan de cryopreparatie-inrichting (200) 10 gerangschikte insluitinrichting (104, 204) losneembaar insluitbaar is.

2. Vasthoudinrichting volgens conclusie 1, daardoor gekenmerkt, dat de vasthoudinrichting (103) in hoofdzaak langwerpig vervaardigd is.

3. Vasthoudinrichting volgens conclusie 2, daardoor gekenmerkt, dat het oppervlak van de monsterdrager (101) onder een hoek ten opzichte van de hoofdzakelijk langwerpige vasthoudinrichting (103) richtbaar is.

4. Vasthoudinrichting volgens één van de conclusies 1 tot 3, daardoor 20 gekenmerkt, dat de vasthoudinrichting (103) voor het vasthouden van een monsterdrager met lip (107) is ingericht.

5. Vasthoudinrichting volgens één van de conclusies 1 tot 4, daardoor gekenmerkt, dat de vasthoudinrichting (103) in de cryopreparatie-inrichting (200) draaibaar is gelagerd om een 25 lengteas (L’).

6. Vasthoudinrichting volgens één van de conclusies 1 tot 5, daardoor gekenmerkt, dat het insluitelement (103b) door middel van een kogelinsluitkoppeling (111, 112) in de insluitinrichting (104, 204) insluitbaar is.

7. Vasthoudinrichting volgens één van de conclusies 1 tot 5, daardoor gekenmerkt, dat het insluitelement door middel van een 5 magnetische koppeling in de insluitinrichting insluitbaar is.

8. Werkwijze voor het van een monsterdrager voor elektronenmicroscopie (101) van een lichtmicroscoop overbrengen naar een cryopreparatie-inrichting (200) voor het cryoprepareren van monsters voor een elektronenmicroscoop, 10 gekenmerkt door de stappen van: - het bevestigen van de monsterdrager (101) in een vasthoudinrichting (103); - het losneembaar insluiten van de vasthoudinrichting (103) met de daarin vastgehouden monsterdrager (101) door middel van 15 een op de vasthoudinrichting (103) gerangschikt insluitelement (103b) in een eerste insluitinrichting (104) van de lichtmicroscoop en het met een lichtmicroscoop onderzoeken van een zich op de monsterdrager bevindend monster; - het losnemen van de vasthoudinrichting (103) met de daarin 20 vastgehouden monsterdrager (101) van de insluitinrichting (104) van de lichtmicroscoop en het overbrengen van de vasthoudinrichting (103) naar de cryopreparatie-inrichting (200); en - het losneembaar insluiten van de vasthoudinrichting (103) met 25 de daarin vastgehouden monsterdrager (101) door middel van het op de vasthoudinrichting (103) gerangschikte insluitelement (103b) in een tweede insluitinrichting (204) van de cryopreparatie-inrichting (200) en het cryoprepareren van het monster.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, daardoor gekenmerkt, dat als monsterdrager (101) een monsterdrager met verbindingstukken (107) wordt gebruikt.

10. Werkwijze volgens conclusie 8 of 9, daardoor gekenmerkt, dat de 5 vasthoudinrichting (103) voor het positioneren van de monsterdrager (101) door middel van een aan de insluitinrichting (104) van de lichtmicroscoop gerangschikte afstelinrichting (105) bewogen wordt.

11. Gebruik van een vasthoudinrichting volgens één van de conclusies 10. tot 7 voor het overbrengen en voor het cryoprepareren van monsters met cellen, in het bijzonder een celcultuur.