NL194693C

NL194693C - Werkwijze voor het bereiden van medicinale preparaten voor het behandelen van diabetes.

Info

Publication number: NL194693C
Application number: NL9420012A
Authority: NL
Inventors: Alexandr Ivanovich Smikodub; Andrey Semenovich Efimov; Alla Vladimirovna Novits Kay
Original assignee: Centr Embryonalnych Tkaney Emc
Priority date: 1993-10-18
Filing date: 1994-10-17
Publication date: 2002-12-03
Also published as: CA2152078A1; WO1995011659A3; NL9420012A; UA27048C2; NL194693B; WO1995011659A2; RU2126260C1

Description

1 194693

Werkwijze voor het bereiden van medicinale preparaten voor het behandelen van diabetes

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van medicinale preparaten voor het behandelen van diabetes omvattende 5 het verkrijgen van een celsuspensie die hemopoëtische lever- en miltcellen van een menselijk embryo bevat, het invriezen van de verkregen celsuspensie, en het ontdooien van de celsuspensie, zodanig dat de lever- en miltcellen van een menselijk embryo levensvatbaar blijven en na toediening aan 10 een patiënt kunnen prolifereren.

In de afgelopen jaren is er een opvallende vooruitgang opgetreden op het gebied van het onderzoek van het toepassen van weefsels uit dode embryo’s. Er is een volledig nieuw therapiegebied ontwikkeld, te weten dat van de celtherapie, waarmee het mogelijk wordt een onvoldoende werking van beschadigde en zieke weefsels op te vullen door toepassing van medicinale preparaten op basis van suspensies van embryo-15 cellen, gemaakt uit foetale weefsels.

Het transplanteren van cellen blijkt een aantrekkelijk alternatief te zijn op het transplanteren van organen en weefsels, embryocellen hebben het voordeel dat ze nog geen uitgesproken antigene afweer opgebouwd hebben, gemakkelijk over te planten zijn en geen afweerreactie van de gastheer veroorzaken. Bovendien zijn die cellen zeer levenskrachtig. Ze vermeerderen zich, differentiëren zich en zijn een bron van een groot 20 aantal biologisch werkzame stoffen. Tegenwoordig worden reeds suspensies toegepast uit hersenen, beendermerg, lever, milt, thymus, pancreas en darmhuid van embryo’s.

De aanvankelijk meest succesvolle pogingen tot het toepassen van suspensies als medicinale preparaten betroffen lever en milt uit menselijke embryo’s. Het is bekend dat 5 tot 16 weken oude levers en milten uit menselijke embryo’s hemopoiese uitvoeren met hoge opbrengsten aan stamcellen.

25 In 1973 werd voor het eerst een medicinaal preparaat op basis van een suspensie van natieve cellen van een embryonale lever na 7 weken dracht aangemaakt; toedienen van dit preparaat leidde tot het herstel van de hemopoiese in een patiënt die aan aplastische anemie leed (E. Kelemen in het tweede J. Gematol. 10 (nr. 4) (1973), blz. 305-308).

In de afgelopen jaren zijn speurwerkers, door het variëren van de methoden bij het bereiden van 30 suspensies en van de procedures voor het toepassen daarvan, erin geslaagd bij het behandelen van primaire en secundaire myelodepressies positieve resultaten te bereiken. De preparaten daarvoor zijn vooral beschreven door T. Izzi, O. Polehi c.s. in ’’Fetal liver transplantation” (onder redactie van Alan R. Liss) van 1985, blz. 237-249.

Een ander gebied van klinische toepassing van de bovengenoemde suspensies betreft immuniteits-35 storingen; hier is de meeste ervaring verzameld door J. Touraine (zie ’’Transplantation Proceedings” 25 (nr. 1) (1993) blz. 1012-1013). Een uitstekend artikel door R. Baechelta c.s. in J. Clin. Invest. §1 (maart 1993) blz. 1067-1078 laat de eindresultaten van het behandelen van patiënten, die aan ernstige gecombineerde immuundeficiëntie leden, zien; hierbij werden niet alleen de immuniteiten van patiënten hersteld, maar ook de beschikbaarheid van gespleten chimeren en het optreden van tolerantie voor antigenen van 40 zowel gastheer als donor aangetoond.

Het is bekend dat de ontwikkeling van op insuline reagerende diabetes auto-immuunschade van de eilandjes van Langerhans inhoudt, veroorzaakt door cellen en circulerende antilichamen. Daarom werd bij de daarna uitgevoerde behandeling van op insuline reagerende diabetes gebruik gemaakt van preparaten, stoffen en weefsels gericht op het onderbreken van de auto-immuunschade van de β-cellen van de 45 pancreas, dus op het corrigeren van de auto-immuniteit. Daartoe werden preparaten zoals isoprinosine, azathioprine, cyclosporine e.d. gebruikt, en in het bijzonder van preparaten uit de thymus.

Tot de stand der techniek behoort dus het preparaat "thymaline”, gemaakt uit de thymussen van kalveren, en de toepassing daarvan ter correctie van de immuniteit voor het behandelen van diabetes (T.G. Koerdanov, B.M. Kaplbieva en G.T. Zakiva in Problemi Cytokrinologii 35 (nr. 6) (1989) 7-9).

50 Een nadeel van de bekende behandelingsmethode is echter het feit dat de dagelijkse behoefte aan insuline slechts met 15 tot 20% af neemt. Een teruggang van de mate van glycemie blijft slechts 5 tot 6 maanden gehandhaafd.

Het is daarom het voornaamste doel van de uitvinding een medicinaal preparaat met de immuniteit corrigerend effect te ontwikkelen op basis van een celsuspensie, waarmee het door een optimale selectie 55 van de samenstelling der cellen mogelijk wordt het mechanisme van de correctie van de immuniteit te intensiveren en positieve resultaten bij het behandelen van diabetes te bereiken.

Volgens de uitvinding wordt dit doel bereikt met een werkwijze voor het bereiden van medicinale 194693 2 preparaten voor het behandelen van diabetes omvattende het verkrijgen van een celsuspensie die hemopoëtische lever- en miltcellen van een menselijk embryo bevat, het invriezen van de verkregen celsuspensie, en 5 het ontdooien van de celsuspensie, zodanig dat de lever- en miltcellen van een menselijk embryo levensvatbaar blijven en na toediening aan een patiënt kunnen prolifereren, met het kenmerk, dat een embryo met een leeftijd van 5-8 weken wordt gebruikt en dat de verkregen celsuspensie voor het invriezen verdeeld wordt door de uit één menselijk embryo bereide 10 celsuspensie in een afzonderlijke reeks houders te gieten om een monsterbank te vormen, bestemd voor toediening aan één patiënt van ten minste de inhoud van één houder na ontdooiing ervan, waarbij de concentratie aan kerndragende cellen van de celsuspensie 5 tot 90-10e/ml is, de concentratie aan kolonievormende eenheden in de granulomonocytische combinatie 20 tot 80.103/ml is, de concentratie aan kolonievormende blastoneenheden 0,5 tot 9-103/ml is en 15 de concentratie aan vroege voorlopers van de hemopoiese CCD34) 1 tot 9-10e/ml is.

Empirisch werd vastgesteld dat de keuze van de bovengenoemde celsamenstelling en de kwantitatieve verhouding tussen de bestanddelen daarvan het mogelijk maken bij de behandeling van diabetes positieve resultaten te bereiken, waarbij de ernstige ziekte inderdaad terugloopt.

De uitvinders menen dat het anti-diabetische effect van het preparaat van de uitvinding te verklaren is 20 door een effect op het mechanisme van de immuuncorrectie, en in het bijzonder het beëindigen van de agressie van T-lymfocyten en immunoglobulinen tegen θ-cellen.

Bij het toepassen van deze uitvinding is het handzaam dat het medicinale preparaat tijdens het invriezen bovendien 3 tot 10% dimethylsulfoxide bevat. De keuze van de ondergrens wordt bepaald door het beste behoud van de cellen, terwijl de bovengrens bepaald wordt door het toxische effect op het preparaat.

25 De anti-diabetische werking komt tot uiting bij diverse klinische proeven van de uitvinders dezes; sommige van die proeven zijn in de nog komende voorbeelden beschreven. Men zag in patiënten aanzienlijke verbeteringen van de immuniteit, met herstel na 3 tot 11 dagen tijd (toename van het aantal T-lymfocyten, verandering van de verhouding tussen de subpopulaties, normalisatie van de humorale immuniteitsindices). De aanvankelijke insulinedosering werd met 40 tot 70% verminderd. Na 3 tot 4 weken 30 was er een teruggang van de ziekte.

Eén aspect van deze uitvinding is dat het handzaam is het medicinale preparaat volgens de uitvinding toe te dienen in een dosis van 0,5 tot 5 ml.

Bovendien is het wenselijk het bovengenoemde preparaat voor en/of na een met cytostatische preparaten uitgevoerde therapie toe te dienen.

35 Het is handzaam het medicinale preparaat uit een gevormde weefselbank van diverse monsters te kiezen, waarbij men met de individuele indices van een patiënt rekening houdt; bovendien moet men bij herhaald toedienen ten minste één gedeelte van hetzelfde monster gebruiken.

Het toedienen van het met de werkwijze volgens de uitvinding bereide preparaat maakt het mogelijk diverse storingen die het verloop van de diabetes bepalen, en in het bijzonder de immuunresistentie, de 40 ontwikkeling van macro- en microangiopathieën, schade aan lever en nieren, ontwikkeling van het anemie-syndroom en thrombocytopenie, enz., te corrigeren door het herstel van de verloren gegane functies van hemopoiese en immuunsystemen.

Een beter begrip van de aard van de uitvinding zal men krijgen uit de volgende gedetailleerde beschrijving van uitvoeringsvormen daarvan, in samenhang met de voorbeelden.

45 De werkwijze voor het bereiden van medicinale preparaten volgens de uitvinding kan met de volgende procedure worden uitgevoerd.

Embryo’s verkrijgbaar door opgewekte aborties van gezonde vrouwen die op de aanwezigheid van virusen bloedinfecties onderzocht waren. Embryo’s met een leeftijd van 5-8 weken worden gebruikt. Uit het oogpunt van het handhaven van de gaafheid van een embryo heeft de vacuümextractie als abortusmethode 50 de voorkeur. Het embryo wordt overgebracht naar een steriel vat dat de oplossing van Hanks en een antibioticum (uit de groep der aminoglycosiden) bevat. Al het volgende werk wordt in een steriele kast uitgevoerd. De embryo’s worden overgebracht naar steriele petri-schalen die oplossing van Hanks en antibioticum bevatten; hier worden, nadat de buikholte voorzichtig geopend is, lever en milt eruit genomen en afzonderlijk voor het aanmaken van suspensies gebruikt.

55 Lever en milt worden in homogenisatoren geplaatst, tot kleine fragmenten versneden en tot een homogene massa vermalen. Met de oplossing van Hanks worden cellen van de wanden van het apparaat in reageerbuizen met maatverdeling afgespoeld, waarbij ze eerst door een voor bloedtransfusie gebruikt filter 3 194693 en dan door injectienaalden met afnemende doorsnede gaan. De aldus bereide suspensies wordt ingevroren.

Dimethylsulfoxide (chemisch zuiver DMSO) wordt als bescherming tegen vorstschade gebruikt. Vöör zijn gebruik gaat het DMSO door een milliporefilter (porie-doorsnede 0,22 pm). Een zelfde volume van 5 DMSO-werkoplossing wordt druppelsgewijs onder zacht roeren aan de suspensie toegevoegd, bij voorkeur tot een concentratie van 5%.

Suspensies van embryocellen worden in polyetheenvaatjes 0,5 tot 2 ml gezonken (afhankelijk van de latere bestemming).

De houders worden in de kamer van een programmeerbaar vriesapparaat gebracht en met vloeibaar 10 stikstof tot -196°C afgekoeld.

Ingevroren suspensies worden onder vloeibare stikstof bij -196°C in de bank van embryoweefsels bewaard.

Nadat de suspensie aangemaakt is, worden er de volgende parameters van bepaald: 1. aantal kerndragende cellen per ml 15 2. aantal kolonievormende eenheden van de granulomonocytische serie (KVE-GM) per ml 3. aantal kolonievormende blastomen (KVE-bl.) per ml 4. aantal vroege voorlopers van de hemopoiese (CD^) per ml.

De suspensies, die in een weefselbank bewaard worden, moeten de volgende parameters vertonen: 1. 5 tot 90-106/ml 20 2. 20 tot 80-103/ml 3. 0,5 tot 9-103/ml 4. 1 tot 9-106/ml

De prenatale diagnose omvat proeven op infecties met syphilis, HIV, HBV en HCV, toxoplasmose en cytomegalovirus. De inhoud van de vaten wordt op bacteriële steriliteit beproefd.

25 De foetale diagnose omvat proeven op infecties met HIV, HBV en HCV, cytomegalovirus, roodvonk, herpes en toxoplasmose.

Afhankelijk van de beoogde klinische behandeling wordt het medicinale preparaat toegediend met een deel of het totaal van het materiaal van een ingevroren monster.

Voorafgaand aan en in bepaalde gevallen ook na het toedienen van het medicinale preparaat van deze 30 uitvinding wordt de behandeling met één of meer cytostatische preparaten uitgevoerd die bedoeld zijn de immunologische reactiviteit van de ontvanger te beperken en de auto-immune agressie te verlagen.

Het effect van de behandeling wordt geëvalueerd aan: - de doorgang van de glycemie, de beperking van de toe te dienen dosis insuline en het optreden van de toestand van hypoglycemie, 35 - veranderingen in de indices van de immuunstatus (gehalten aan T-B-lymfocyten en immunoglobulinen), - aantal erythrocyten die embryonaal hemoglobine bevatten,

Gedetailleerde beschrijving van de toepassing van de onderhavige uitvinding in overeenstemming met de beschikbare klinische praktijk wordt nu gegeven in de Voorbeelden 1 tot en met 7.

40 Voorbeeld 1

Vrouwelijke patiënt, D., in 1946 geboren, werd op 21 augustus 1993 toegelaten tot de diabetes-afdeling van het Oekraïense research-instituut voor endocrinologie en metabolisme, met klachten van uitgesproken zwakte, duizelingen, ademnood bij onbeduidende fysieke belasting, hartkloppingen, slechte eetlust, misselijkheid, jeuk, duizelingen, oedeem aan de voeten en zo nu en dan slecht zicht.

45 Uit de status van de patiënt was bekend dat ze 13 jaar geleden voor insuline gevoelige diabetes vertoond had. Ze kreeg regelmatig insuline en werd zo nu en dan in het ziekenhuis behandeld. In de laatste twee jaren waren de symptomen ernstiger geworden: er verscheen te hoge bloeddruk en de hoofdziekte werd wat labiel; bij onderzoek van de urine vond men er altijd eiwit in. In het laatste jaar verschenen er symptomen zoals zwakte, periodiek oedeem aan de benen en slechte spijsvertering; bovendien vond men in 50 het perifere bloed een te laag gehalte aan erythrocyten en ook hemoglobine. In maart 1993 werd de patiënt op de afdeling Neurologie van het regionale hospitaal van Kiev opgenomen; toen bleken er een chronisch niergebrek en een middelmatig ernstige bloedarmoede. Er werden vier transfusies van erythrocyten toegediend. Na een tijdelijke verbetering was de toestand in september 1993 veel slechter, waarom ze opgenomen werd.

55 Bij opname in het hospitaal was de toestand van de patiënt ernstig. Maar haar bewustzijn was helder. Huid en blootliggende slijmvliezen waren bleek. Perifere lymfknopen waren niet dikker. De pols was 98 slagen per min, in goed ritme en vol en duidelijk. De bloeddruk was 190/120 mmHg. De hartslag was 194693 4 voldoende duidelijk en ritmisch, met daarbovenop een systolische ruis, het accent van het tweede hartgeluid van de aorta. In de longen was aanhaling van de blaasjes geausculteerd. De buik was zacht, matig opgeblazen en gevoelig voor betasting in het gebied van de rechter hypochondrium. Onder de rechter ribbenboog, langs de rechter middensleutelbeenlijn, stak de lever 2 cm uit. De milt was niet groter dan 5 normaal. Stukken van de grote darm waren bij vlagen krampachtig. Haar stoelgang was vier maal per dag, slijmachtig. De dagelijkse diurese tot 1 liter. Oedeem aan gezicht en voeten.

Diagnose: Diabetes type 1, ernstig, in toestand van decompensatie. Diabetische algemene angiopathie (netropathie van de derde graad, chronisch niergebrek van de eerste graad, de vaatvorm van voortwoekerende nierschade, micro-macropijnen in de bloedvaten van de benen van de tweede graad), diabetische 70 polyneuropathie in de benen, ernstige bloedarmoede en symptomatisch hypertensie.

Bij opname vond men de volgende aanwijzingen: bloedsuiker 12,4 mmol/l, in de urine glucose 22 g/l, aceton (++), eiwitten 3,3 g/l, erythrocyten en cilindertjes (5 in het zichtveld), K+, 5,2 mmol/l, ureum 14,42 mmol/l, creatinine 0,220 mmol/l, erythrocyten 2,1-1012/l bloed en hemoglobine 64 g/l.

De volgende behandeling is toen voorgeschreven: dieet en 22 eenheden insuline per dag; ontgiftingsthe-15 rapie (uitspoelen van de darmen, assorbentia in de darmen, hemodese), diuretica, bloeddrukverlagers, anhyaggregantia en anhyobeschermers, correctie van de elektrolyse-balans, ijzer-preparaten en vitamine-therapie.

Na drie weken was de toestand van de patiënt wat beter: het koolhydraat-metabolisme was gecompenseerd en de oedemen waren verdwenen; de bloeddruk was terug naar 170/100-110 mmHg. Maar een 20 stabiel en ernstig bloedarmoedesyndroom was gebleven.

Op 15 september 1993 werd een transplantatie van natieve hemopoietische levercellen van een menselijke embryo uitgevoerd (monster C038N-2I): het embryo was 5 weken oud en de toegediende hoeveelheid cellen was 1,5 ml; aantal kerndragende cellen 25-106/ml, KVE-GM 13,9-103/ml, KVE-bl.

1,3-103/ml en CD^, 2,4-l06/ml. De wijze van toedienen was in de botten (intrasternaal).

25 De patiënt verdroeg de transplantatie goed. Na 8 tot 10 uur zag men het syndroom direct na de transplantatie: hoofdpijn, vermoeidheid en misselijkheid namen af en de eetlust nam toe; de patiënt sliep voor het eerst in enkele maanden rustig. Op de derde dag waren de gehalten aan hemoglobine, erythrocyten en reticulocyten toegenomen en die waren op de tiende dag normaal (zie Tabel 1). In de loop van drie weken tijd werden de urine-analyses aanzienlijk beter (zie Tabel 2). De bloeddruk daalde tot 160/100-90 30 mmHg, waardoor het toedienen van bloeddrukverlagende preparaten omlaag kon.

5 194693 φ ΐ> c © - -ξ cd ιη

Sof5' .1 5 co S' g o c ω cn 0 o Ö) ® | g 5 o E > c

Cc © ® Οτ-icoiio o (λ cc LU © .C .O τ- τ- t- g ·» 0) © o .© Φ Φ

< ZOO

k_ : € ί 1 lo oj l I I l cd a>

CO E CO <* — m CC

i E £ © Φ r-· E o C © ®

A © D > LU O O

C ·ς· 2 Ü®· (O Tf I I I Λ coo oo ιο σ> dj I— X) T- T- OJ CM j?

® „ C

t O Q) O 7- ^- ©

ά c * ιό cm O

£ ® ° -e 2 Ο δ" (Ο -Μ I CM CM CO © © A -n c c c o ^ ? _ © ®

Sc « ο υ © "t « ,®

0 F φ co cl Q <λ c cm Ο O

ΙΩ Ο) I CO CO CM w Q I G CM CM CM CO CO © c ~ ê

:φ Φ C C

'§ E « ^ §, CO op co

t^Tfir^CMCO C Lil G ^ CO CM

C y: (D CD CDCOCO

(0 CH

> ω ° 5 C © -A _ 5ë® !® © H Ί U Qj CO Γγ Φ Φ o 5 J u ~ N > * w © c o °-

T- ^ to © CM C

. m > C I (0 L.

—I X P O -j > Λ) 111 °· Φ TO . lÜrn-èÉ

5 Φ > (Λ o' r r I (Μ (Μ r 0C ©«C CO

< C <‘CC/)OJ 05. 00 t- c *” =

CO © - CD

1 II* S.,„- 1 I , a s c 05 ill "§) CO CO -r-" 3 «I 11

gm^SS I I I I I I j§ : C rt 1- CO

Q. © δ δ δ OA 73 CO 05 τ- τ- τ- Ο 5 c c

ΤΖ Q) λ _1 CO

O k. U L

O 3 3 3 AC ~ X 3 3 3

p. Φ © CL N N N

.y §, > « ï .o i r» i η ·μ· io LI_ js 0s ^ ^ ^ i .©> 0 Έ

A X O .© CD CO CD

3$ co r-- co LJ NI -5-5-5 _Φ 73 O 05 N ® dl O) y .£ r-- o' o’ o' o' o ° .A - 5 i 1 © E S _ m m cm o o -i 2 2? = ij ®P®<cr^OOOCMCMCM r= tz cd i: t X 05 C Ö) τ- τ- τ- τ- y; (/> >. CD C/5 - © c 1 ë *= „ § = o o o

c -ς,™ τ-1-τί φ Ό o OO

c' O O ’“, ’Γ. ’"L °. ’“, o <jj o O N· lil o T- CM CO CO -Μ- ·Μ- Μ- X SI τ- y-y- co co co co co co co co co co 05 05 05 05 05 O) 05050505 E 05 05 05 05 05 Ö E 05 05 05 0 3 O O O O O k— 3 O O O i- <5 co oo ö io oo' o’ © cd oo' có ö

O 7- T- CM CM CM T- Q | O O T- 7- I

194693 6

Voorbeeld 2

De mannelijke patiënt, P., in 1960 geboren, werd op 6 november 1991 toegelaten tot de Diabetes-afdeling van het Oekraïense research-instituut voor endocrinologie en metabolisme, met klachten van algemene zwakte, gewichtsverlies, droge mond, veel drinken en pollakiurie. De patiënt beschouwde zichzelf ziek sinds 5 september 1991, toen die klachten voor het eerst optraden. De patiënt werd nooit eerder onderzocht. Drastische verergering van de toestand van de patiënt maakte dat hij in november 1991 om medische hulp vroeg.

Diagnose: Diabetes type 1, voor het eerst optredende maar in ernstige vorm, in de toestand van decompensatie en met ketoacidose.

10 Bij opname vond men suiker in het bloed 15 mmol/l, glucose in de urine 41,6 g/l en aceton in de urine (+++). De volgende behandeling werd voorgeschreven: insuline 60 eenheden per dag, vitaminetherapie en kalium-preparaten.

Bij het bereiken van de compensatie op 2 december 1991 werd een eerste transplantatie van lever- en miltcellen uit een menselijk embryo uitgevoerd (monster C038N-631L): het embryo was 7 weken oud; 15 toegediend werd 1 ml cellen; aantal kerndragende cellen 36,2-106/ml; KVE-GM, 23,6-106/ml; KVE-bl.

2,5-103/ml en CD34, 1,4-106/ml. De wijze van toedienen was intraveneus. De hoeveelheid cellen ten opzichte van de totale hoeveelheid monster uit de bank van ingevroren weefsel was 66%.

De patiënt verdroeg de transplantatie heel behoorlijk.

Drie weken na de transplantatie trad er hypoglycemie op, wat een geleidelijke afname van de dagelijkse 20 insulinedosis met zich meebracht; de maximale afname werd na 2Vz maand waargenomen (zie Tabel 3).

Normalisatie van de immuuntoestand werd reeds op de elfde dag waargenomen (zie Tabel 4). In de zes maanden na de eerste transplantatie was de patiënt in toestand van compensatie, met een stabiele en betrekkelijk lage insulinedosering.

Tegen het einde van mei 1992 werd de toestand van de patiënt drastisch slechter: er verschenen 25 symptomen van decompensatie van het koolhydraat-metabolisme en de immuuntoestand werd ook slechter (zie Tabel 4). De insulinedosering werd verhoogd tot 32 eenheden per dag.

Op 3 juni 1992 was er weer een transplantatie, nu van ingevroren bewaarde hemopoiese-cellen uit hetzelfde monster (C038C-63HL), er werd 0,5 ml celsuspensie toegediend. De patiënt verdroeg de transfusie heel bevredigend. Het positieve verloop van de dagelijkse insuline-dosering en van de immuun-30 toestand ziet men in de Tabellen 3 en 4.

Het verloop van de hoeveelheid embryonale, hemoglobinebevattende erythrocyten bevestigt het vervangende effect van de getransplanteerde cellen.

TABEL 3 35 Analyses van patiënt P. voor en na transplantatie van hemopoiese-cellen van een embryonale lever (toestand van compensatie) 2 december 1991: 1e transplantatie 3 juni 1992: 2® transplantatie

Datum Indices 01.12.91 23.12.91 17.01.92 23.02.92 07.05.92 03.06.92 06.07.92 17.07.92 21.01.93 40 Voor 21® Na Na Na 5 Na 6 Na 1 Na Na 7½ de dag 1½ 2½ maan- maan- maand 1½ maand trans- maand maand den den maand plant.

45 Insuline, eenheden per dag 48 36 20 20 20 32 24 22 24

Percentage daling v/d insuline-dosis t.o.

50 v. de eerste - 25 40 59 59 34 50 55 50

Erythrocyten die embryonaal hemoglobine bevatten,% 0 18 12 14 8 2 12 18 14 55 -—- 7 194693 TABEL 4

Verloop van de immuniteitsgegevens van patiënt P.

Datum Indices 14.11.91 17.12.91 07.04.92 28.05.92 14.06.92 5 -

Voor de 11e dag Na 4 Na 6 11e dag na transplant. maanden maanden 2e transplant.

T-lymfocyten, % 40 53 50 50 53 10 abs.-109/l 0,7050 0,8904 1,0808 0,7950 0,8480 T-helpcellen, % 37 20 41 37 33 abs.-109/l 0,5328 0,4872 0,7913 0,5883 0,5280 T-onderdrukkers, % 12 24 15 13 20 abs.-109/l 0,1728 0,4032 0,2805 0,2067 0,3200 15 T-helpcellen/- 3,1 1,2 2,7 2,85 1,7 T-onderdrukkers, % B-lymfocyten, % 37 31 18 30 27 abs.109/l 0,5328 0,5208 0,3474 0,4770 0,4320

IgG, g/l 8,75 11,8 9,70 17,6 10,7 20 IgA, g/l 7,9 2,1 1,75 1,6 4,25

IgM, g/l 0,43 1,3 0,86 0,86 1,01

Voorbeeld 3 25 Vrouwelijke patiënt R., geboren in 1961, werd op 1 december 1992 opgenomen op de eerste therapeutische afdeling van het centrale hospitaal van het district Zaliznychni van Kiev, met krachten van uitgesproken zwakte, gewichtsverlies, droge mond ondanks veel drinken, pollakiurie, hoofdpijn en slechte eetlust.

De patiënt beschouwde zichzelf ziek sinds oktober 1991 toen ze zichzelf slecht begon te voelen. De patiënt was nooit eerder onderzocht. Drastische verslechtering van de toestand van de patiënt maakte dat 30 ze eind november 1992 om medische hulp vroeg.

Diagnose: Diabetes type 1, voor het eerst waargenomen maar in ernstige vorm, met toestand van compensatie, en diabetes-ketoacidose. Bij opname was het bloedsuikergehalte 20, 0 mmol/l en in de urine zat 52,4 g/l glucose en veel aceton. De volgende behandeling werd voorgeschreven: 52 eenheden per dag insuline en therapie met vitaminen en kalium-preparaten; om de dag hemodese. Ook werd azathioprine 35 voorgeschreven met een dagelijkse dosering van 2 mg per kg lichaamsgewicht, in twee keer toe te dienen, te beginnen met 25 mg per dag met geleidelijk toenemende dosering onder daagse controle van het perifere bloed. Bij het bereiken van de bovengenoemde therapeutische dosering werd de behandeling onder dagelijkse controle van de aantallen leukocyten, thrombocyten en erythrocyten in het perifere bloed uitgevoerd.

40 Bij bereiken van de subcompensatie van het koolhydraat-metabolisme op de 32® dag na het begin van de behandeling, op 5 januari 1993, werd een transplantatie van ingevroren bewaarde hemopoiese-cellen uit een menselijke embryonale lever uitgevoerd (monster C038N-441L); het embryo was 6 weken oud en er werd 1 ml cellen toegediend; aantal kerndragende cellen 17,5-10e/ml, KVE-GM, 24, 8-103/ml, KVE-bl., 1,7-103/ml en CD^, 2·106/ιτιΙ. De wijze van toedienen was intraveneus. De hoeveelheid getransplanteerde 45 cellen ten opzichte van de totale hoeveelheid weefsel van het uit de bank van ingevroren bewaarde weefsels verstrekte monster was 45%.

De patiënt verdroeg de transplantatie bevredigend.

De behandeling met azathioprine werd gedurende 48 dagen na de transplantatie van de hemopoiese-cellen uit de menselijke lever voortgezet.

50 Twee weken na de transplantatie trad er hypoglycemie op, wat tot een geleidelijke verlaging van de dagelijkse insuline-dosering leidde; de maximale afname werd na 2 maanden bereikt (zie Tabel 5).

Tegen het einde van de tweede week was de immuuntoestand van de patiënt genormaliseerd (zie Tabel 6).

Het verloop van het aantal erythrocyten met embryonaal hemoglobine in het perifere bloed bevestigt het 55 vervangende effect van de getransplanteerde cellen.

Het herstel van de zieke gaat na 9 maanden nog door. Ze blijft onder observatie.

194693 8 TABEL 5

Analyses van vrouwelijke patiënt P. voor en na transplantatie van hemopoiese-cellen uit een embryonale lever (toestand van decompensatie) 5 Datum Indices 04.01.93 09.01.93 19.01.93 04.02.93 05.03.93

Voor de 3e dag 14e dag Na 1 Na 2 transplant. maand maanden 10 Insuline, eenh. per dag 52 44 30 26 16

Percentage daling v/d insulinedosis t.o.v. de eerste - 15,4 42 50 70

Erythrocyten die embryonale hemoglobine bevatten, % 0 14 17 23 26 15 --- TABEL 6

Verloop van de immuniteit bij patiënt R.

Datum Indices 04.01.91 19.01.91 07,04.92 20 _

Voor de 14e dag Na 2 maanden transplant.

T-lymfocyten, % 12 56 42 25 abs.-109/l 0,8016 1,0035 0,8064 T-helpcellen, % 10 38 28 abs.-109/l 0,0136 0,3226 0,2352 T-onderdrukkers, % 2 18 14 abs.-109/l 0,0136 0,3226 0,2352 30 T-helpcellen/- 5,0 2,1 2,0 T-onderdrukkers, % B-lymfocyten, % 16 24 22 abs.-109/l 0,1088 0,4301 0,3996

IgG, g/l 8,1 8,75 9,70 35 IgA, g/l 2,4 1,75 1,6

IgM, g/l 0,38 0,86 0,86

Voorbeeld 4 40 Vrouwelijke patiënt L., geboren in 1991, werd op 15 september op de afdeling Endocrinologie van de gespecialiseerde kinderkliniek van Kiev opgenomen en bleef daar tot 26 september 1993.

Diagnose: Voor insuline gevoelige diabetes in ernstige vorm, labiel verloop, een toestand van sub-compensatie.

De ziekte werd in februari 1993 opgemerkt toen het kind in precomatose toestand voor onderzoek 45 opgenomen werd.

Diagnose: Diabetes type 1, de insuline-therapie werd begonnen met 8 eenheden per dag. In de daarop volgende maanden werd de insuline-dosering tot 6 eenheden per dag verlaagd. De aard van de eigenlijke ziekte was labiel met vaak optreden van hypoglycemische toestanden en ketoacidose. Het kind werd op de afdeling Endocrinologie geplaatst met de bedoeling een transplantatie van embryonale hemopoiese-cellen 50 uit te voeren.

Bij opname varieerde het bloedsuiker van 5,5 tot 12,4 mmol/l; in de urine zat 3,2 g/l glucose maar geen aceton.

Op 12 september 1993 werd een transplantatie van ingevroren bewaarde hemopoiese-cellen uit een embryonale lever uitgevoerd (monster C038N-91H); het embryo was 5 weken oud en er werd 1,5 ml cellen 55 toegediend; aantal kerndragende cellen 25,0-10e/ml, KVE-GM 23,9-103/ml, KVE-bl. 1,8-103/ml en CD34 4-106/ml. De wijze van toedienen was intraveneus.

De patiënt doorstond de transplantatie bevredigend. Volgens haar moeder verbeterde de eetlust van het g 194693 kind reeds de eerste avond na de operatie en haar slaap werd rustig en diep. Op de vierde dag na de transplantatie werd de dagelijkse insuline-dosering tot 5 eenheden verlaagd. Vervolgens bleef hij op dat peil.

In een maand tijd normaliseerde de immuuntoestand van de patiënt (zie Tabel 7).

In de tijd na de transplantatie verbeterde de toestand van het kind bevredigend; de ziekte stabiliseerde 5 en het bloedsuiker-gehalte bleef op het peil van 4,5 tot 7,3 mmol/l, er werden geen episoden van hypoglyce-mie of ketoacidose waargenomen. Prikkelbaarheid en huilen namen af. De psychische en fysieke ontwikkeling van het kind kwam overeen met haar leeftijd. Ze blijft onder observatie.

TABEL 7 10 Verloop van de immuniteit van vrouwelijke patiënt L.

Datum Indices 09.09.93 08.10.93

Voor de transplant. Na 1 maand 15 ------- T-lymfocyten, % 37 51 abs.-109/l 0,3907 0,7020 T-helpcellen, % 29 28 abs.-109/l 0,3062 0,3780 20 T-onderdrukkers, % 8 23 abs.-109/l 0,0845 0,3240 T-helpcellen/T-onderdrukkers, % 3,6 1,22 B-lymfocyten, % 35 27 abs.-109/l 0,3696 0,3645 25 IgG, g/l 8,4 8,2

IgA, g/l 2,25 2,40

IgM, g/l 0,95 1,30 TABEL 8 30 Verloop van de immuniteit van mannelijke patiënt A.

Datum Indices 23.07.93 26.08.93

Voor de transplant. Na 1 maand 35 _ T-lymfocyten, % 38 54 abs.-109/l 0,4545 1,0206 T-helpcellen, % 29 32 abs.-109/l 0,3468 0,6408 40 T-onderdrukkers, % 9 22 abs.-109/l 0,1077 0,4158 T-helpcellen/T-onderdrukkers, % 3,2 1,5 B-lymfocyten, % 32 29 abs.-109/l 0,3827 0,5481 45 IgG, g/l 8,00 8,60

IgA, g/l 1,5 2,00

IgM, g/l 1,23 1,20 50 Voorbeeld 5

De mannelijke patiënt A., geboren in 1969, verbleef van 21 juli tot 12 augustus 1993 op de afdeling Therapie van het centrale hospitaal van het district Zaliznychni in Kiev.

Diagnose: Voor insuline gevoelige diabetes in de ernstige vorm met labiel verloop, toestand van compensatie; algemene diabetes-pijn van de tweede graad, perifere diabetes-polyneuropathie. Chronische 55 cholecystitis die echter terugliep.

De patiënt beschouwde zichzelf ziek sinds 1986, toen zijn toestand na zware psychische en emotionele spanningen slechter werd: vermoeidheid, veel drinken en veel urineren en verlies van lichaamsgewicht. Na 194693 10 2 maanden, toen hij om medische hulp vroeg, werd voor insuline gevoelige diabetes vastgesteld. Compensatie werd bereikt met een dagelijkse dosering van 64 eenheden insuline.

In het laatste jaar had de patiënt pijn in de benen opgemerkt, in het algemeen ’s nachts, brandend en prikkelend en soms gevoeligheid en krampen in de musculi gastrocnemi. De eigenlijke ziekte was labiel 5 geworden: een bevredigende toestand wisselde vaak at met vlagen ketoacidose en hypoglycemie, ook bij kleine veranderingen in voeding en fysieke of emotionele belasting.

De patiënt werd tot de therapeutische afdeling toegelaten met de bedoeling er een transplantatie van hemopoiese-cellen uit een embryonale lever toe te dienen.

Bij opname varieerde het bloedsuiker-gehalte van 4,7 tot 11,4 mmol/l en er zat 22,4 g/l glucose in zijn 10 urine maar geen aceton. Dagelijks werden 58 eenheden insuline toegediend.

Op 28 juli 1993 werd transplantatie van natieve hemopoiese-cellen uit een menselijke embryonale lever uitgevoerd (monster C038N-101H); de leeftijd van het embryo was 6 weken; aantal kerndragende cellen 8,5-106/ml, KVE-GM 23·103/ιύιΙ, toegediende hoeveelheid cellen 2,5 ml; KVE-bl. 2,4-103/ml en CD^ 3, 8-106/ml. De wijze van toedienen was intraveneus.

15 De patiënt doorstond de transplantatie bevredigend.

In de eerste twee weken daarna daalde de dagelijkse insuline-dosering tot 50 eenheden. Algemeen klinisch onderzoek bracht geen belangrijke veranderingen aan het licht (binnen de normale grenzen voor en na de transplantatie). In een maand tijd normaliseerde de immuuntoestand van de patiënt (zie Tabel 8).

Het aantal erythrocyten met embryonaal hemoglobine steeg tot 15%.

20 De observatie werd meer dan 12 maanden voortgezet. De patiënt voelt zich goed en er is een toestand van stabiele compensatie bereikt; er werden geen episoden van ketoacidose gevonden.

De dagelijkse insuline-dosering werd op 50 tot 52 eenheden gehandhaafd. Het peil van erythrocyten met embryonaal hemoglobine bleef tussen 8 en 10%.

25 Voorbeeld 6

De mannelijke patiënt M., geboren in 1931, werd tot de afdeling Chirurgie van het centrale hospitaal van het district Zaliznychni van Kiev toegelaten en bleef daar van 12 april tot 26 mei 1993.

Diagnose: Diabetes type 1, ernstige vorm met toestand subcompensatie, algemene diabetes-pijn: microangiopathie in de vaten van de lagere uitsteeksels van de derde graad, retinopathie, nefropathie van 30 de tweede graad, op zijn rechter grote teen een grote zweer, gezwollen voeten en diabetes-polyneuritis.

Bij opname klaagde de patiënt over algemene vermoeidheid, verhoogde lichaamstemperatuur (tot 38,5°C) toe, stijfheid in de ochtend, opzwellen van de rechter voet, die aanvoelt alsof hij ging barsten, verzwering van de zachte weefsels op de rechter grote teen, sensatie van gevoelloos en prikkelen in de benen en pijn in de benen, zowel bij rust als bij belasting.

35 De patiënt had 22 jaar aan voor insuline gevoelige diabetes geleden. In de afgelopen 5 jaar had hij pijn aan de benen gehad bij het lopen, soms met steken in de benen en soms gevoelloos, in het algemeen 's nachts. Een maand daarvoor was in het gebied van de rechter grote teen een zweer in het zachte weefsel opgetreden.

Extra murale verzorging gaf geen resultaat. Na 1 maand voetbaden trad er ernstig oedeem van de voet 40 op en nam de pijn toe, er verscheen een uitgesproken doorbloeding van de huid en de lichaamstemperatuur steeg tot 38°C.

Direct na opname van de patiënt in het hospitaal werd die opzwelling geopend en werd er chirurgisch ingegrepen.

De volgende behandeling werd voorgeschreven: therapie met antibiotica en met preparaten tegen 45 ontstekingen, alsmede 38 eenheden per dag insuline. De toestand van de patiënt ging er niet op vooruit: hij leed nog steeds aan nachtelijke temperatuursstijgingen (tot 38,6°C toe), algemene vermoeidheid en een maagzweer, waar hij gesneden was kwam er pus uit. Na drie dagen werd de rechter onderiong geausculteerd. Monsters bloed, urine en feces werden onderzocht. Staphylococcus aureus werd in het bloed gevonden. In de loop van drie weken waren er 3 behandelingen met antibiotica (Ampiox, Gentamicine, 50 Rifampicine, Claforam).

Bij bloedtellingen bleek leukocytose met tegen differentiële tellingen een verschuiving naar links, een versnelling van de S.R. en een matige bloedarmoede (zie Tabel 9). Het immunogram liet een drastische afname van het aantal T-lymfocyten zien en een zwakke toename van het aantal f3-lymfocyten (zie Tabel 10).

55 Met het doel de immuunbescherming te verbeteren, werd op 10 mei 1993 een transplantatie met natieve hemopoiese-cellen uit een menselijke embryonale lever uitgevoerd (monster C038N-57H); het embryo was 8 weken oud; aantal kerndragende cellen 37,5-106/ml, toegediende hoeveelheid cellen 2,5 ml; KVE-GM

11 194693 42-l03/ml, KVE-bl. 1,3·103/πιΙ en CD^ 4-l06/ml. De wijze van toedienen was intraveneus.

In de loop van 8 tot 10 dagen werden de bloedbepalingen geleidelijk aan normaal (zie Tabel 9).

De wond en de zweer begonnen vrij van pus en necrotisch weefsel te komen. Op de zevende dag was er een goede granulering en begon de groei van het epitheel. Na twee weken waren wond en maagzweer 5 littekens geworden.

Herstel van de immuuntoestand werd op de 14e dag waargenomen (zie Tabel 10).

Op de vijfde dag werd, omdat hypoglycemie begon op te treden, de dagelijkse insuline-dosering tot 34 eenheden verlaagd.

De patiënt werd in bevredigende toestand uit het hospitaal ontslagen.

10 194693 12 1 * >> 2 λ u „ c ο _ o ra P cn S? έ Ε ^ ° - ς n F αι ,ζ' £ Ε ra .Ε ι cm ι τΐ- τ* LU .2 0) -C -Ω t- τ- τ- . ΧΖ 0C ^ - F co Ν m οο οο co E ^ co r-

έ I

2 o α" O O (D -r- -c o o T}· oo oo in lo

I- Ώ r· t— t— t— OvJ C\J

I > o c 5 ® 0 tr

2 O o? (O N ΙΛ (D (O

£ c E ® >, >, 00 N f N O)

_I O o' T-CMC0C0CVJ

Ó> C C

ra 2 ra n r- ι- te oo W E ^ f ιο ιο lo ιο io S . c ~ J0 0) 5®vo coooointo

e 0) o S' T- τη I

cl o φ ’ ® Ë· ES? ® ® ra - _J i 2 ® ui ra ra -e tg E 2 o co co ι ι ι k ® c ά > § ® w UJ ï= o? OOCMCMt-y- j2.

ra ι < «ra 6 ë S? -11^1 o _ 3 ® <F in ra S; o ooooioto J O T- T- T- , ι c s= o ra

Q) — ÏT

DC O O o? (M IONS

l- X

3 ra lo ra ό o o> o> o) oo .E o" o' o" o' o' . ra 0 c

E £ in s m o V

®°ecOOT-CVICO

1 O) Ol τ- τ- τ- τ- r- 2 -

£ φ N

r Q ra n ra n ra LU o T- ra ra ra ^ ^ ra ra ra ra ra

_ 03 03 03 p O

E LO LO LO’ LO LO’ 3 o o o o o ® O T-· <Ó CO 0C3

O T- T- T- CO CVJ

13 194693 TABEL 10

Verloop van de immuniteit van vrouwelijke patiënt M.

Datum Indices 10.05.93 24.05.93 5 --—-

Voor de transplant. Na 2 maanden T-lymfocyten, % 31 53 abs.-109/l 0,5580 1,0196 10 T-helpcellen, % 24 31 abs.-109/l 0,4320 0,5952 T-onderdrukkers, % 7 22 abs.-109/l 0,1260 0,4244 T-helpcellen/T-onderdrukkers, % 3,43 1,4 15 B-lymfocyten, % 35 28 abs.-109/l 0,6300 0,5376

IgG, g/l 8,04 9,12

IgA, g/l 1,7 1,7

IgM, g/l 0,85 1,05 20---

Voorbeeld 7

Vrouwelijke patiënt B., geboren in 1957, werd op 4 september 1992 tot de diabetes-afdeling van het researchinstituut voor endocrinologie en metabolisme van Kiev toegelaten, met klachten van uitgesproken 25 vermoeidheid, droge mond ondanks veel drinken, pollakiurie, gewichtsverlies, slechte eetlust en hoofdpijn.

De patiënt beschouwde zichzelf al drie maanden ziek, toen haar toestand geleidelijk aan slechter was geworden. Drastische verslechtering van de toestand deed haar om medische hulp vragen.

Diagnose: Diabetes type 1, voor de eerste keer tot uiting gekomen, ernstige vorm met toestand van decompensatie, met diabetes-ketoacidose. Bij opname was het bloedsuiker-gehalte 20,2 mmol/l en in de 30 urine zat 51,2 g/l glucose en veel aceton (++++). De volgende behandeling werd voorgeschreven: 62 eenheden per dag insuline en therapie met vitaminen en kalium-preparaten.

Bij het bereiken van de subcompensatie werd transplantatie van natieve hemopoiesecellen van een embryonale lever uitgevoerd (monster C038N-20IL); het embryo was 7 weken oud; aantal kerndragende cellen 25-106/ml, toegediende hoeveelheid cellen 1 ml; KVE-GM 24, 8-103/ml, KVE-bl. 1,7-103/ml en CD34 35 2-l06/ml. De wijze van toedienen was intraveneus.

De patiënt doorstond de transplantatie bevredigend. Op de eerste dag zag men reeds het symptoom van direct herstel na transplantatie: afname van vermoeidheid en hoofdpijn en betere eetlust en slaap. Vanaf de derde dag na de transplantatie werden, wegens het optreden van hypoglycemie de dagelijkse insuline-dosering geleidelijk aan verlaagd; de maximumafname werd bereikt na 2,5 tot 3 maanden (zie Tabel 11).

40 Het positieve verloop van het aantal erythrocyten dat embryonaal hemoglobine bevatte, is in Tabel 11 getoond.

TABEL 11

Analyse van vrouwelijke patiënt B voor en na transplantatie van hemopoiese-cellen uit een menselijke lever 45 (toestand van compensatie)

Datum Indices 16.09.92 24.09.92 06.10.92 22.10.92 06.12.92 24.12.92 18.02.92 21.09.92

Voor de 3e dag 15e Na 1 Na 2,5 Na 3 Na 5 Na 12 50 trans- dag maand maand maanden maanden maanden plant.

Insuline, een heden per dag 48 38 32 28 20 18 18 18 55 --- 194693 14 TABEL 11 (vervolg)

Analyse van vrouwelijke patiënt B voor en na transplantatie van hemopoiese-cellen uit een menselijke lever (toestand van compensatie) 5 Datum Indices 16.09.92 24.09.92 06.10.92 22.10.92 06.12.92 24.12.92 18.02.92 21.09.92

Voorde 3e dag 15e Na 1 Na 2,5 Na 3 Na 5 Na 12 trans- dag maand maand maanden maanden maanden plant.

10 —-—-----—--

Percentage daling v/d insuline-dosis t.o. v. de eerste - 20,8 33,3 41,7 59 62,5 62,5 62,5 15 Erythrocyten die embryonaal hemoglobine bevatten,% 0 12 16 21 25 23 18 14 20 Tabel 12

Verloop van de immuniteitsgegevens van patiënt P.

Datum Indices 15.09.92 24.09.92 06.10.92 01.12.92 23 Voor de 3e dag Na 15® dag Na 2,5 transplant. maanden T-lymfocyten, % 44 48 28 37 abs.-109/l 0,5605 0,9768 1,5958 0,6327 30 T-helpcellen, % 38 32 21 25 abs.-109/l 0,4841 0,6512 0,4469 0,4469 T-onderdrukkers, % 6 16 7 12 abs.-109/l 0,0764 0,3256 0,1490 0,2052 T-helpcellen/T-onderdrukkers 6,2 2 3 2,1 35 B-lymfocyten, % 32 29 26 34 abs.-109/l 0,4077 0,5902 0,5533 0,5834

IgG, g/l 8,10 11,45 11,45 8,10

IgA, g/l 2,40, 2,55 2,55 2,40

IgM, g/l 0,80 1,40 0,75 1,75 40 _

Het verloop van het aantal erythrocyten met embryonaal hemoglobine laat het vervangende effect van getransplanteerde cellen zien. Het gunstig effect van de bahandeling duurt meer dan 12 maanden.

De met de werkwijze volgens de uitvinding bereide medicinale preparaten maken het dus mogelijk: 45 - de auto-immune agressie tegen de eilandjes van Langerhans te onderbreken, - de insuline-dosering te verminderen doordat de blokkering van de overgebleven β-cellen weggenomen wordt, - de labiliteit van de ziekte weg te nemen, - de immuunresistentie te verhogen, 50 - hemopoiese te herstellen, - de complicaties van diabetes zoals pijn door infecties en micro- en macroangiopathieën en neuropathieën te beperken.

Bovendien kunnen de celsuspensies volgens deze uitvinding in apotheken en banken van ingevroren weefsels bewaard worden, waarbij er op gewezen mag worden dat men de histocompabiliteit niet hoeft te 55 bepalen.

15 194693

Voorbeeld 8

Mannelijke patiënt Kh, geboren in 1924. Diagnose: diabetes mellitus type 2, toestand van compensatie. Diabetische tweedegraads retinopathie. maculodystrofie, diabetische micro (stadium ll)-macro (stadium III) angiopathie van vaten in de benen, diabetische voet, niet-genezende trophische zweer op linker voet, 5 diabetische polyneuropathie. Ischemische hartziekte: atherosclerotische cardiosclerosis, bloedstroom-insufficientie-O, cerebrale atherosclerosis.

Bij opname klaagde de patiënt over pijn in de linkervoet, een niet-genezende tropische zweer op de linker voetzool en problemen met het zien. Insuline onafhankelijke diabetes mellitus was 15 jaar eerder tot uiting gekomen. Een aantal jaren was de patiënt behandeld door middel van een dieet, waarna hij was 10 begonnen met het oraal innemen van suiker verlagende middelen (glibenclamide). Ten tijde van de opname was de dagelijkse dosis glibenclamide 0,005 g. Tijdens de gehele duur van de ziekte was geen intensieve glykemische controle uitgevoerd. Drie jaar voor de opname ging de toestand van de patiënt achteruit: wegens infectie van een wond op de grote teen van de linkervoet en gangreen werd deze teen geamputeerd. Na 18 maanden verscheen een trophische zweer op de linker voetzool, die binnen 14 maanden niet 15 genas. De laatste zes maanden voor de opname leed de patiënt aan achteruitgang van het gezichtsvermogen. De diagnose van de oogarts was tweedegraads diabetische retinopathie en maculodystrofie.

Gedurende het laatste jaar werd de patiënt driemaal opgenomen op de afdelingen chirurgie en endocrinologie van het Donetsk Oblast hospitaal. De behandeling omvatte ontlasting van de aangetaste voet met speciaal schoeisel en verband, antibacteriële therapie, wondbehandeling, middelen voor het verbeteren van 20 de micro-circulatie en anti-stollingsmiddelen. De patiënt kreeg insuline, tweemaal dagelijks 18 eenheden.

Het oppervlak van de zweer werd schoon hoewel de zweer niet genas.

Bij opname in de Celtherapiekliniek bevond de patiënt zich in een toestand van compensatie van het koolhydraatmetabolisme: glykemisch profiel van 5,8-6,6-7,8 mmol/l, aglucosuria.

De behandeling werd uitgevoerd met een medicinaal preparaat op basis van celsuspensies volgens de 25 uitvinding (leeftijd weefsel 7 weken, aantal cellen 37,7 106/ml, KVE-gm, 22 103/ml, KVE-bl 12 103/ml, CD34+ 3,7 10® /ml, totaal volume 4,0 ml). Het preparaat werd druppelsgewijs intraveneus toegediend.

De patiënt doorstond de toediening bevredigend. De patiënt ging door met het dagelijks innemen van 0,005 g glibenclamide. Er werden geen andere middelen voorgeschreven. De patiënt werd ontslagen met de vooraf voorgeschreven hypoglykemische therapie en de aanbeveling van een intensieve glykemische 30 controle.

De trophische zweer genas in 1 maand langzaam zonder verdere medische behandeling. Na 2 maanden met regelmatige controle van glykemie en glucosurie werd de dagelijkse dosis glibenclamide verlaagd tot 0,025 g en na 4 maanden werd de glykemie alleen geregeld met behulp van een dieet.

35 Voorbeeld 9

Vrouwelijke patiënt Kh, geboren in 1944. Diagnose: diabetes mellitus type 2, middelmatige vorm, toestand van subcompensatie, climacterisch syndroom.

Bij opname klaagde de patiënt over zwakte, hoofdpijn, hoogtevrees, abnormaal droog mondslijmvlies, aanwezigheid van hypertensiecrises vergezeld van rillingen, hartkloppingen, zweten, veelvuldig en 40 overvloedig urineren bij het einde van elke aanval.

Bovenstaande klachten werden waargenomen gedurende twee jaar na het optreden van aanwijzingen van verstoringen van de menstruatiecyclus. Gedurende één jaar werd een menopauze vastgesteld. Insuline onafhankelijke diabetes was een jaar voor de opname vastgesteld. Eerst kreeg de patiënt alleen een dieet, later nam zij glycoside in (dagelijkse dosis tot 20 mg); wegens slechte compensatie werd in plaats daarvan 45 glibenclamide voorgeschreven (dagelijkse dosis 10 mg). Gedurende de laatste maand had de patiënt propranolol ingenomen (dagelijkse dosis 60 mg).

Bij de opname was het glykemische profiel 8,4-9,3-11,5-7,4 mmol/l; glucourie 10 g/l. Gebruikelijke klinische testen gaven resultaten binnen de norm. ECG: correct synusritme. Tekenen van middelmatige verandering van het myocardium.

50 De patiënt werd behandeld met het preparaat op basis van celsuspensies volgens de uitvinding (leeftijd weefsel 8 weken, aantal cellen 38,7 10®/ml, KVE-gm, 31 103/ml, KVE-bl 17,3 103/ml, CD34+ 6,2 10® /ml, totaalvolume 2,0 ml). Het preparaat werd druppelsgewijs intraveneus toegediend.

De patiënt doorstond de infusie zonder complicaties. Tijdens de eerste week werd toeneming van glykemie met het verloop van de dag waargenomen. Na 2 weken werd een stabiele toestand van compen-55 satie verkregen met gebruik van de hiervoor beschreven suiker verminderende therapie ((glibenclamide) 10 mg/dag). Na 1 maand werd de dagelijkse dosis met een intensieve glykemische controle verminderd tot 5 mg. Gedurende de volgende 7 maanden observatie werden een stabiele compensatie van het 194693 16 koolhydraatmetabolisme (glykemie gedurende de dag 5,4 -10,3 mmol/l aglucosuria) en normalisatie van vaatdruk zonder toediening van hypoglykemische en hypotensieve middelen vastgesteld. Vegetovasculaire crises traden in feite niet op.

5 Voorbeeld 10

Hier worden de resultaten gegeven van de behandeling van een groep patiënten met insuline afhankelijke diabetes mellitus. De diagnose werd gesteld in overeenstemming met WHO-classificatie.

De groep bestond uit 12 mannen en 8 vrouwen tussen 1 en 35 jaar oud (gemiddelde leeftijd 17,1 +/-2,18 jaar) met klinische diagnose van eerst geopenbaarde diabetes mellitus.

10 De groep kreeg een behandeling door toediening van menselijke cellen. De duur van de ziekte tussen diagnose en behandeling was 1 tot 6 maanden (gemiddeld 2,6 maanden). De tijd tussen het optreden van klassieke symptomen en diagnose was 1 tot 5 maanden (gemiddeld 2,2 maanden). De gegevens met betrekking tot deze groep en de resultaten van de behandeling worden gegeven in de tabellen 13 en 14.

Bij deze groep werd een valide vermindering van de toegediende dosis insuline na 4 tot 6 weken 15 waargenomen, waarna de dosering gedurende 1 jaar na de behandeling stabiel bleef (tabel 15). De tijd van maximale vermindering (gemiddeld 40,8% voor de groep) was 59,0 +/- 4,38 dagen. Vergeleken met de controlegroep was de dosering lager vanaf de derde maand en gedurende de gehele waarnemingsperiode (tabel 15, figuur 1).

20 Voorbeeld 11

De groep van 6 patiënten leed aan ernstige complicaties van insuline afhankelijke diabetes mellitus: algehele diabetische micro/macro-angiopathie, derdegraads diabetische nefropathie, middelmatig ernstige bloedarmoede. De patiënten werden 1 jaar gevolgd.

De behandeling had een gunstig effect op het koolhydraatmetabolisme: de indices van glykemie namen 25 betrouwbaar af en stabiliseerden. De gemiddelde dagelijkse glykemie nam betrouwbaar op de 10e tot de 12® dag af van 9,38 +/- 0,47 mmol/l tot 7,04 +/- 0,32 mmol/l (tabel 16).

Gedurende 2 tot 3 maanden na de behandeling werd de toegediende dosis insuline geleidelijk verminderd, waarna de indices stabiliseerden. Voor de totale groep nam de gemiddelde dagelijkse dosis gedurende het jaar af met 19%, dat wil zeggen van 0,79 +/- 0,09 eenheden/kg tot 0,64 +/- 0,09 eenheden/kg.

30 Bij alle patiënten was het verloop van diabetes mellitus voor de behandeling labiel. De gemiddelde amplitude van de glykemische variaties was 10,27 +/- 1,16 mmol/l. Na de behandeling nam deze index af tot 5,11 +/- 0.72 mmol/l en na 2 weken tot 4,75 +/- 0,54 mmol/l (tabel 16).

De patiënten stelden vervolgens vast dat zij gedurende verscheidene maanden geen toestand van hypoglykemie hadden en dat het verloop van de diabetes relatief stabiel was.

35 Bij alle patiënten werd een hemostimulerend effect waargenomen (tabel 17).

Vanaf de 5e tot de 7e dag namen deze indices toe en zij bereikten na 1 tot 1,5 maand maximale waarden (erythrocyten, 3,84 +/- 0,12 1012/l, hemoglobine 118,8 +/-4,76 g/l). Dit effect kon gedurende 5 tot 11 maanden worden waargenomen. Op de 3® tot 7® dag kon een betrouwbare toeneming van de reticulocyten worden waargenomen met een maximale waarde na 14 tot 28 dagen. Er werd een positieve dynamiek van 40 ECR-veranderingen waargenomen, dat wil zeggen een betrouwbare vermindering na 3 tot 4 weken. De veranderingen van de aantallen leukocyten en trombocyten waren niet significant.

De immunologische indices van patiënten die leden aan diabetische nefropathie, bloedarmoede en eerstegraads chronische nierinsufficiëntie werden 1 maand en 3 maanden na de behandeling bestudeerd.

De resultaten worden gegeven in tabel 18. Bij de T-cel koppeling was de toeneming van het percentage 45 CD3+-lymfocyten statistisch betrouwbaar, terwijl voor de CD4+- en CD8+-lymfocyten de toeneming niet statistisch betrouwbaar was. Absolute indices toonden echter een betrouwbare toeneming aan van zowel totale T-lymfocytenpopulatie (CD3+) als regelende lymfocytensubpopulaties (CD4+ en CD8+) De aanvankelijke verhoging van het percentage CD22+-lymfocyten was niet betrouwbaar. Tijdens het onderzoek naar de dynamiek van de humorale immuniteitsindices werd een niet betrouwbare vermindering van de hoeveelheid 50 IgG en IgA gevonden.

17 194693 coco oo 1- cn ιλ η oi n m ο n in n *-_ in re-_ > cm cJ ο' rt co' co co' co' co’ co’ r» ΐη-Ηΐη-Ηΐη-Ηΐη·Η·Μ·+1

o) S

3 <0

O W ® CMCMt-COCMCOCMOCOOO

0 CU (OncDSi-nNOl^O

2 Om co' cm’ co' re co' CM’ CO* Cm’ CO re'

0) o; ·" m-Hin-Hin-Hin-Hin-H

0) Vi> Ό T- n k.

o 0 .>. CO CD CM T- in f- (O CM co o o T- cm o_ in cd re_ r- cq 3 > TC COt-^’t-l^-’T-COT-'M-i- 1 rö c ^ ® — c E .5-=- io E co

® Φ ® (DCMSOSCOSCONCC

J3 « Φ COCDCDOCOOOCDt-CMCO

o >, -2 N o' ® cm’ N o’ oo' T-’ co’ .5 rs .2 »-·Η»-·Η»-·Ηι-·Η·»-·Η ¾ O Ό T- Φ

® Tf(DNinncO(31'-'-CM

* ·~ ·Μ·_ CM_ CD 00 ΙΟ -re h-_ CD rf CM

re o cd’ re’ co’ co’ r-’ cm’ re·’ in’ >-' in'

£ -5 re-HCM-HCO-Hin-Hre-H

re φ

Φ CD

c CO

re re CM N CO -- OO N CM 00 c re οι n m co o o o o in oi -Sm m' re' re·' co' cd cm' co’ co’ oo' m’

c ^ re-HCM-nm-nre-Hre-H

Ε o Φ SMinsincooosios D) COiMCOi-i-notOffli- 2 = >-' o" o’ cm’ o' cm’ o’ o’

^ -g CM +I-H-H-H-H

-J 3 g> _ a? s Cü » φ Φ

^ W N

w fc m co cm 1- cd oo co in ® 3g i-cMcore-incor^cMcore- * = P cm' o' t-’ o cm’ o’ o’ cm' o'

£ w 0 § 32, nscDcofflcossco £ cMf-inocoooocoo re ® oo' cm' oo' T-' co' cm' 1-' co' co' cm'

re ® T- -H -H CM -H CM -H -H

c ® φ 2 Ό φ ~ tj ^ oo cd re- cn co cm cm

,® = P rrOOlilCMO’-MIBS

° £ ï K cm' n-' >-' co' cm' re·' cm' t-' co' C ,ï® t- -H -H CM Ή *— +1 CM Ή <D U ^ Q.

φ C

£ o co cm oo c c CM CM 1-τη :® ί ® f o.

Φ _ -£ ® ® c E ro o oo cm cm oo C < T- cm ®

JC

Φ £ υ « c 2 Q. = ©

Sc & 9 2 c Φ _ 9 o «o re^Sg® f 2 φ ® φ re 2 g oc ® ra -o 5 c 2 i 8 1 h i > 1 > J. «i, 194693 18

CD CD 00 T- CM CO CO

φ r- -<t CDCOOOOOCDCO

J5 -g CD o' cd' o' cd' o' cd' o' cd' o'

E CM Ή Η Η Η H

g

*" S SS C CD CD CD D N CD in CD CD

0 *- 2 .2 CO TJ- 0 CD n r- (\| cf ® ^ ^ 3 0 E 5 o> 0 a o' a r·' σι d οι r·'

^ Ο .E 2 -E- -r- -H Η Η Η H

CD

X) k_ 8 _ ® w

> CD vP O CM CD ΙΟ N

® T3 CM CD CM CM CD

3 Έ ® Φ £ ® 3 w 2 σ S = cd n ld 2 C & LD I I ID CO cd' cm'

</) LL O Sr 1- CO h- ID CD CD

Φ 0) n

eg D> CO . CO Tt ID CD. N CD

73 a> c 775 © cd T- cd T- 0 a }.*S| ~

£“ t; (0 Ό Φ JS

5 S § i £ ® C 2 2 E 3 .Ω CO CD CD r- 55 φ 5 φ 55 CO c O CM N- «Τ-* 0 0 cvi £ 0- C > .£ C := r- TT in CM ^ ^ ^

CO

<D

c

S O) W I

” I ® 111 " .......

φ "* <0 Ό Φ ® c c F .E c ·£ cocoracoiDNcoao-M· n cm 0 ® -¾ £ = jg ocDNocMffiooinoS'tcocor -* rt ® te w m ? a> if ui co cd' ld' n t~~ cd' 00 ui ai n g, O E > .E C ~ r- LD+1CD+1^+)lD+|CD+|LD+<lD+, O) Φ* '3 m- _ c ra ’-oc cbÏ'E'CM 1 1 1 1 1 I 1 rrj ·~ «ra « © ® LIJ M » c - 0) Ό Ό co ίΤι 3X=E-SiCC IO CD CD CD T-iDO)LDCM*-ffilDr-

<® — ‘5 ® ® ro ca COCDOCMIDNCMCMNID-M-CDNCD

— ~ *- o « m p CM' O' CM' O' CD' O' CM' O' Cm' θ' Cm' θ' CM' O

® h 2 jc b ο Έ T- +1 h η -η η ή h k_

§ (M'tOlDNIDCD'tNCOOOTtcD

> ω COOIOOCOOtOOCOOCOO cd o

c .* SS "Ö> o' o' o' o' o' o' o' o' o o' o' o' O O

re ü O < CM Η Η Η Η Η H -H

10 JC Ό Ό c c Φ 's M- CD CD O ï IDliCD'ctOacDS'ÏNIDOOfflm

TD > = Φ ^ NOCDOCnOCDOCOONONO

=* o M 0) ® o' o' o' o' o' o" o' o' o' o' o' o' o' o' .Ε < .E -2- Ό -r- Η Η Η Η Η H +1 Ό m CDCDCDNCMOOTj-T-T-CD cd cd ld

ö DCM'-'iMOil^CDCOWM·. CD. CMCO

,φ cd' o' co' o' co' o* ld' o' co' o' cd' o' cd' o' s

'•jglco -h-h-h-h-h-h-h I

a c E £ C cores ^COCD'fNOCOCDNO’-OOCM^ rn

re > re o (D^SMCMOOniD'tCDCDlDi-CO -S

> § >, E cd' o' ld' o' co' o' 10' o' N o' cd' o' n' o' O

C*<raE T- -H-H-H-H-H-H-H £ Φ g re C S> c g c (0 05 φ •E O CD D- N cd CM 00 "Sq) 2 CM CM T- T- ® 5 in -° C o »

CD re ~ ω E

° re c p. o c 2 +2 s(D o O 05

3 c o *- c CD

5 re re o cd n 00 cm cm co <3> p 8 E

"Z < CL T- CM T- 1- -gfcao- C O O) <5 φ Φ - £ 1 g re o g. § a> ϋ ° o r c 5 1 s

(0 L- (\J Φ (0 (Q

® o re c .. > « S

cc Φ_·σ ΕΦ® & .E f 5 2 2 o f— φ -^c^c 2 ic o °- re) E .® N ® § W £ S Ö5 re -g1 o ® I Hill 1 1!11 ι·;ί 5 δ I<5!è S list 19 194693 TABEL 15

Verandering dagelijkse insulinedosis (eenheid/kg/dag) bij patiënten die lijden aan recent tot uiting gekomen insulineafhankelijke diabetes mellitus (voorbeeld 10)

5 Tijdstip van waarneming Aantal Gemid- m P

patiënten delde (standaard (eenheid/- afwijking) kg/dag) 10 Periode 1 Voor behandeling > 20 0,76 0,06 2 1-7 20 0,74 0,06 0,85 3 7-14 20 0,68 0,05 0,37 4 Dagen 14-28 20 0,60 0,05 0,06 15 5 na 28-45 20 0,53 0,05 0,01* 6 behandeling 45-60 20 0,46 0,05 0,00* 7 60-90 20 0,45 0,06 0,00* 8 90-180 20 0,47 0,05 0,00* 9 180-270 19 0,51 0,05 0,00* 20 10 270-365 15 0,57 0,05 0,03* 11 Jaren 2 9 0,58 0,03 0,06 * p <0,05 (statistisch significant) 25 ----

Verandering dagelijkse insulinedosis bij patiënten die lijden aan recent tot uiting gekomen insulineafhankelijke diabetes mellitus die wel (gemarkeerd)

30 of niet behandeld (niet gemarkeerd) zijn. I

1 -| eenheden/kg/dag 35 0'9 0,4 -

Periode van waarneming 50 0,3 -I-1-1-1-I-1-1-!-1-1-1-1 01 23456789 10 11 55 FIGUUR 1 (gegevens uit tabel 15) 194693 20 in o_ cl o - 11 f f g

Wo to ji o Φ

TO -A

£ CO '= φ *

O CM co E T5 CD

o 4 ii ω Ö3 <Η >, 1- m 2 Ο ό id ®

5 CM CM

~ O O

£ O O

3 ο. o o'

CO

c φ IIff a 5 2

x; CO Ό cc Ο Ο O

o to

^ ^ CO E *U ^ LO CO

υ T π CD -φ O CO

yj n^-ΖΟό n ^ co *σ

CD

CO

6 ίο

2 O

"to Q. O

Φ 0) Φ Φ I Ό > CO IP C }s ϊγ' π) ^ 2-2 « S 5 c cm

φ £ (fl Ό IS ^ O

CD Ö 5 t— to Q.

_! fi g -O

3 g f * T f| 5 [5 co co Z 0-o co σ> c φ Φ jc 2> i- 2 cd

O <S CM O CM

W Q CO O CM .

Φ H) CL O Ö O

8 c £5 Έ

Ό C

_ TO I T3 .

E C £ rS :?Γ Ο) ^ CM CD

S φ 2 iSlf °° _ « Wocojc o oo S 5

Ό Ο) I

S* Ό 5 Φ ~ CD E Ό COt-^· φ <? m a> -g * r ^ c 0. r- cm Z Ο ό oo into a>

C

:φ t ^ ( TO TO £ φ Φ CD Ü <° $ Q. Ό B (0 £ £ ® =. £ WT3TO1s£ O 1-0 -° £

TO Φ I

Φ o a CD E Ό CO CM CO

S > .E T- 2 O § °* Oco ra £ ? « rag o —· 8 § -5> = Φ C i 8) 1 $ S? 1 R Ο φ j*

^ i « o S’ ^ I

to E xj w -° q to ^ Φ Φ TO ® C Ά O É § E ^ I ε 8 Έ TO =!_ TO =5 § g> Ö t υ 9- o c 2 £ v to>,E>'£-^'2 o.

O ra < ra E Ο E

21 194693 σι σ> ό co σι In 05 «ο ο Ο) ι- β ο ο ο Μ η ο

CL Ο Ο Ο Ο θ' Ö I

ι Ό τ- m ïö 05 ^ ^ co 2 C0 £ ,Ε Ο C0 ο ο βο ^ ο Λ W Ό co jc cm "m Ό 00 Ο Ύ- X ·= φ CM LT5 CO <50 CO 1- xa Έ. ο t 2 co' ιο Τ-* co' co ιο cm'

ο V 4 /¾ 03 Ο CM CM

g Ν Μ· 2 0 Τ5 -Τ- Φ ♦ tn ♦ C C7> CM CO Ο m ^ :φ ΙΟ Ο C0 5? h- ö CM Ο Ν ^ Ο a= α. ο ο ο ο ο' ο' ι 3 05

C

φ - > ρ I Ο CO Ο

£ (Ö CT CM, CM CM CO_ C0_ CM

fe ζ Ό t— CO

-h Λ *“ Q) *- 00 O) in 00 CO CO

m S’ ‘life— co' O o' to |sT T-'

45 “3 , 4 ,® Φ o lO CM

ig g CO CO Z 0 T3 - CM

CO £; O) «0 Φ c «

U5 C CO CM CM T- 05 CO

w φ to co co oo co co ® σ> ιο h- o io s cm

® 2 Q- o' o' o' o' O o' I

—I O

liJ c c

5 § E ' p . CM CO

< ίο ω £β>α --. Ο» r.®.o ® 0 £ -Sro^.c o in ootOTt o

3 (0 (0 Ό CD ^ CO

1 * η Φ * —

Ü *D Ό CO CO

0)0 = φ CO O <D CsJ CO O

Ο 0- T- CM 2 Ο Ό CM

φ T3 CO Ό (S JC CM

0)0 II ® Φ σ> CM CO

Q. > T- Z Ο *O CM

® M

> ® I

* eS I

- 2 05 s Φ £ c x: TO ο „ π

c .£ 2 c ® > c E 05 S

φ XI > 0) c Φ Φ m S. £ fe-S;gE %-<=«= ®.

0D ΙΛ σι Λ 't N

Ο CM CO CM O CM

Ο O -- ^ -T O

Q. Ö O Ö Ö Ö Ö | T3 , CO Γ'- S re T 01 O co o eg CD 00 2 ιβ έ .£ O CM Ο O 05 CO o (/) Ό CJ JC -- to

SS T3 CD CD

Y — 0) CO O ^ CM 05 CO O

O cp t P CO' 00 θ' CO* 00' CM* T-'

00 4 ,¾ ® o O' CM

— T- 05 Z O Ό -- CM

T“ Φ ♦ * ♦ ♦ « ο λ ο n o)

C O »- Tt CO CD C\J

tQ> O O O CD CSJ O

'Ö 0- o o' o' o' o' o' I

c (0 Ό (0 Λ CM

0) .C 0 ( S ® — en S £ et o oo Γη I ® £ 2 co' cm' o' cd't-' ·—' T-"

2 o 4 ,¾ 05 -r- co CM

£ os oo 2 (Do -- cm 0 co *o * ♦ ♦ *

(0 CO ^ r CO S N

(0 O O O CM CO CM

^ O O O lO i“ o

“ £L θ’ o' o' θ' o' Ο* I

e

$ p CM CO TO

«ΐδ?® --(OOtoNinn ^ TO to Z .E o' co' o' o' cm' co' ο

σι to C/) Ό TO CM

ö 2

§ U5 o 1 05 CD CO 00 CO O CO CO

w o ? cp c p co' CD' o' CD* ID co' T-' m 4,¾ <15 V- cm

-- £ M-r^ZCJ-D 1- CM

® E

•So ♦ + *

«Π) Ο Ό- -- CM 05 CM

I- _ Ο Ο O CO Γ- -- ® O O O -- o

y CL o' o' o' ο' ο' ο' I

CO

1 ®

.5 TO C 1 05 ™ ^ -t -}- CM CO

0 c -2 to Z .E o' -r o' o' in co' o' TO (/) Ό ¢0 JC — Ό -Ö ® (0 °C -ό CO o

X5 TO in -= Q5 OO CO 05 ^ TO Ο CD

is ~ t *p £2 co' oo' o' CD" cm' V-' to 2 CM co Z CD -a 1 s

Ss» o ?^ -— -— in 05 F? r* o o o co oo cm = (-1 0000500

TO d) Q- o' o' o' o' o' o' I

c -I

TO E

TO TO > p I h- CO

> E cjjii'o, ocor-cosooco ο. to 3 co Z .E o' in o' o' n co' o' O TO (/) Ό TO JC τ ο 5

.§>§_ -D O CO

> o E TO NOrlDTtrr C- •c V m — co' oo" -- CD* co' co' cm' £ TOTO- 4 ® TO T- r- CM 8 0. T- in Z CD 73 --CM it g) *w

s? I

TO %

lie ill |* I

ssftflt *=· 8 g* = 8 ! a; 8 1 gS % hc.Ö^E-hiSC(e ji

UJXir_J|-llJLU£oD

23 194693 CM CO i- CO CO η 05 τ- CO CVI O) OO’-OCMTi-OO τ- O CO CD co O O O O CM C^ CO O T- O (D o co_ O. Ö Ö O O O O O T- O ö o o ö ]g 05 S CM CO T- CD CD _ t: σ>σ>Μ·οιη·>-Μ·οσ> O OOlDOCMOOOi- O S CD o ^ E O O CO Ö T-‘ O CM* o o o o o o o’ c :Q) 'ü 2= _ to ^ _ 3 O O in(OCMCOCDO)CO*»- o (¾ O) r- N(VJCOSO)lO^^ O to τ; ^ <0 .£ ló i _ r r y“~ C>‘ 0“ O <J> ▼"*** θ’ If) CO O* τ-" £ Tt Z 2 ^ <M t*· c Q) £

O

CO

£ i-btoi-NoocMc^ in co r- σ) oo 2 OOrOO)OtOC\| CO^-IO co x: 0000^-0»“^ TfOlO co co ü Q.ÖÖOÖOOOO o o" o o o" co

O

CO

co O) Q) ft Osj oo σ> _ co _

£ COCOCOCOOCM^COCO

Φ OOCOO^OtM’· O CO co 00 CM

φ E o o' CNJ ö c\T o c\i o o *-’ o' o* o Φ co o a>

CQ O

"co Tt CD CD O CM

0 co mr^cocMOi— ·»— co··- -J ö Μ· T- ST-acOrUWP) T-^-T- CD 00 Ö a> co _ü — t-‘ co' o en' o o t-‘ o cd' co t-" t-" 1 CM Z 2 CO CO CO 1- H O 05 Q> sz o ~ CM S ID N· O)

φ OCDCOM’IOt-^-05CO

λ σ> ^Ot-ocoocO’- o co co co cm ® .E E o' o" T-· o' co o' cm" o o o' o o o T5 φ

C -D

co 5 CO « C φ

α> .Q ID O 05 M" CD

Ό . COOi-OCDCOt-CMI^

S' O τ- i-NifTfCMCODM- T- ID ID f·» OO

m o M _ T-" O 05' O CD* θ’ ID τ'" O t-" CO" Cm" t-" ~> Z 2 LD CO CM T- T- c 05 c •05 ’§ 10 ΜΗ. o 10 i- co

_ C" O CM 00 LD T* CO CO >- ID

'E ^ S ®. cvi T-* o ^ o °- < co" ^ ®.

- g -g ^^cm^idcdcd^- cm ? 9 V V V V

φ Era cMOcomiD'tnv cmiodm^oids .t; o ra SNmnoi'"ó’' o 7 o in cd sin co_ § Z 5 O O CO O CM O CM τ' o" ID T-" o" co" 10 o" o

E

E _ ra § > s CL o) O ‘co 2 ·νΟ x l_ vp O' , o 0) (O vp vP «

> C I I

SSea'S-Sgo &

Oo>Jjro>^o>hr^O»/C O

CO uOO^OSjO^-ÖO^c; C ^ O

CD O c — rOrt>rCCOO) Ö) O) v ü .Q) - c . 0 ü) t ^ .. *· η t5 £ „>* CO _c 95 O W r Ό ^σΤ" fH 3 °" JE JhcOhfflhcOhOCDT-i1 55 ^ *

Claims

194693 24 ·|

1. Werkwijze voor het bereiden van medicinale preparaten voor het behandelen van diabetes omvattende het verkrijgen van een celsuspensie die hemopoëtische lever- en miltcellen van een menselijk embryo 5 bevat, het invriezen van de verkregen celsuspensie, en het ontdooien van de celsuspensie, zodanig dat de lever- en miltcellen van een menselijk embryo levensvatbaar blijven en na toediening aan een patiënt kunnen prolifereren, met het kenmerk, 10 dat een embryo met een leeftijd van 5-8 weken wordt gebruikt en dat de verkregen celsuspensie voor het invriezen verdeeld wordt door de uit één menselijk embryo bereide celsuspensie in een afzonderlijke reeks houders te gieten om een monsterbank te vormen, bestemd voor toediening aan één patiënt van ten minste de inhoud van één houder na ontdooiing ervan, waarbij 15 de concentratie aan kerndragende cellen van de celsuspensie 5 tot 90-106/ml is, de concentratie aan kolonievormende eenheden in de granulomonocytische combinatie 20 tot 80-103/ml is, de concentratie aan kolonievormende blastoneenheden 0,5 tot 9-l03/ml is en de concentratie aan vroege voorlopers van de hemopoiese CCD34) 1 tot 9.106/ml is.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij de inhoud van elke houder 0,5 tot 5 ml is.