NL1010602C2 - Nucleïnezuur coderend voor een zenuwweefselnatriumkanaal-eiwit. - Google Patents

Description

Titel: Nucleïnezuur coderend voor een zenuwweefselnatriumkanaal-eiwit

Deze uitvinding heeft ruwweg betrekking op natrium-kanaal-eiwitten en meer in het bijzonder op een nieuwe nucleïnezuursequentie die voor een zoogdier-a-subeenheid van een bij voorkeur tetrodotoxine-resistent, zenuw-5 weefselnatriumkanaal-eiwit met middels voltage gestuurde doorgang codeert. Deze uitvinding heeft verder betrekking op de productie ervan middels recombinant-technologie.

De basis-eenheid van informatie die van één deel van 10 het zenuwstelsel naar een ander Wordt doorgeseind, is een enkelvoudige actiepotentiaal of zenuwimpuls. De "transmissielijn" voor deze impulsen is de axon, of zenuwvezel. Van de elektrische prikkelbaarheid van de zenuwmembraan is aangetoond dat zij afhankelijk is van 15 de membraan haar voltage-gevoelige ionpermeabiliteit-systeem dat het haar mogelijk maakt in ionconcentratie-gradiënten opgeslagen energie toe te passen. Elektrische activiteit van de zenuw wordt teweeggebracht door een depolarisatie van de membraan die kanalen door de 20 membraan heen opent die zeer selectief zijn voor natrium-ionen, die daarna middels de elektrochemische gradiënt naar binnen toe worden gedreven. Van de vele ionkanalen is het natriumkanaal met middels voltage gestuurde doorgang of voltage-gevoelige natriumkanaal 25 een van de meest bestudeerde. Het is een transmembraan-eiwit dat essentieel is voor de productie van act-ie-potentialen in prikkelbare cellen. Een uitstekend overzicht van natriumkanalen wordt in Catterall, TINS 16(12), 500-506 (1993) gepresenteerd.

30 De cDNA's van verschillende Na'-kanalen zijn gekloneerd en de sequentie ervan bepaald. Numa e.a., Annals of the New York Academy of Sciences 479, 338-355 (1986), beschrijven cDNA uit het elektrische orgaan van de sidderaal en twee andere uit rat-hersenen. Rogart, 35 U.S.-octrooinr. 5,380,836, beschrijft cDNA uit rathart-weefsel. Zie ook Rogart e.a., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 1010602 - 2 - 8170-8174 (1989). De sequentie van PN1 en de orthologons ervan in mensen (hNE) en konijnen (Na+s) zijn gepubliceerd (zie bijvoorbeeld Klugbauer e.a.f EMBOJ 14, 1084-1090 (1995) en Belcher e.a., Proc. Natl. Acad. Sci.

5 U.S.A. 923, 11034-11038 (1995)). De sequentie van uit DRG gekloneerd rat-PNl en de functie-expressie ervan zijn beschreven (zie bijvoorbeeld Sangameswaran e.a., J. Biol. 'Chem. 272, 14805-14809 (1997)). Andere gekloneerde natriumkanalen omvatten rat-hersentypen I en II, Noda ïo e.a., Nature 320, 188-192 (1986), Ha, Auld e.a., Neuron '1, 449-461 (1988) en III, Kayano e.a., FEBS Lett. 228, 187-194 (1988), ratskeletspier [skeletal muscle] (SkMl), Trimmer e.a., Neuron 3, 33-49 (1989), rat-NaCh6,

Schalier e.a., J. Neurosci. 15, 3231-3242 (1995), rat-15 natriumkanaaltype 3 van perifere zenuwen [rat peripheral nerve sodium channel type 3] (rPN3), Sangameswaran e.a.,

J. Biol. Chem. 271, 5953-5956 (1996), ook SNS genoemd, Akopian e.a., Nature 379, 257-262 (1996), rat-atypisch kanaal, Felipe e.a., J. Biol. Chem. 269,-30125-30131 20 (1994) en het ratglia-natriumkanaal, Akopian e.a., FEBS

Lett. 400, 183-187 (1997).

Deze studies hebben aangetoond dat de aminozuur-sequentie van het Na'-kanaal over.een lange evolutionaire periode geconserveerd is,. Deze studies 25 hebben ook geopenbaard dat het kanaal een enkelvoudig polypeptide is dat vier interne herhalingen, of homologe domeinen (domeinen I-IV), met vergelijkbare aminozuur-sequenties bevat. Elk domein vouwt zich in zes voorspelde en spiraalvormige transmembraansegmenten: 30 vijf zijn hydrofobe segmenten en één is sterk geladen met veel positief geladen lysine- en arginine-residuen. Dit sterk geladen segment is het vierde transmembraan-segment in elk domein (het S4-segment) en is waarschijnlijk betrokken bij het middels voltage sturen 35 van de doorgang. De positief geladen zijketens van het S4-segment zijn waarschijnlijk met de negatief geladen 1010602 - 3 - zij ketens op de andere vijf segmenten gepaard zodat membraandepolarisatie de positie van één helix ten opzichte van de andere zou kunnen verschuiven, daardoor het kanaal openend. Bijkomende subeenheden kunnen de 5 functie van het kanaal wijzigen.

Er is in recombinante, aan het DNA van de talrijke natriumkanalen ontleende materialen therapeutische bruikbaarheid ontdekt. U.S.-octrooinr. 5,132,296 door Cherksey openbaart bijvoorbeeld gezuiverde Na+-kanalen ïo die als therapeutische en diagnostische middelen bruikbaar zijn gebleken.

Isovormen van natriumkanalen worden in "subfamilies" verdeeld. De term "isovorm" wordt gebruikt om verschillende maar nauwverwante natriumkanaal-eiwitten 15 mee te bedoelen, i.e. diegene die een aminozuurhomologie van ongeveer 60-80% hebben. Deze vertonen ook sterke homologie in functies. De term "subfamilies" wordt gebruikt om verschillende natriumkanalen mee te bedoelen die een aminozuurhomologie van ongeveer 80-95% hebben.

20 Combinaties van verschillende factoren worden toegepast om de verschillen binnen een subfamilie te bepalen, bijvoorbeeld de snelheid van een kanaal, chromosomale locatie, expressie-data, homologie met andere kanalen binnen een soort en homologie met een kanaal van 25 dezelfde subfamilie óver soorten. Andere beschouwing is een affiniteit voor tetrodotoxine ("TTX"). TTX is een zeer krachtig toxine uit de kogel- of fugu-vis die de geleiding van zenuwimpulsen langs axonen en in prikkelbare membranen van zenuwvezels blokkeert. TTX 30 bindt aan het Na'-kanaal en blokkeert de stroom van natrium-ionen.

Studies die TTX als een probe gebruiken, hebben veel licht op het mechanisme en de structuur van Na"-kanalen geworpen. Er zijn drie Na*-kanaalsubtypen die worden 35 gedefinieerd door de affiniteit voor TTX die kan worden gemeten middels de IC5C-waarden: TTX-gevoelige Na+- ή D 4 o o r\ o - 4 - kanalen (IC50 ~ 1-30 nM) , TTX-ongevoelige Na"-kanalen (ICft0 ~ 1-5 μΜ) en TTX-resistente Na'-kanalen (IC50 z 50 μΜ) .

TTX-ongevoelige actiepotentialen werden voor het eerst 5 in ratskeletspier bestudeerd (Redfern e.a., Acta

Physiol. Scand. 82, 70-78 (1971)). Vervolgens werden deze actiepotentialen in andere zoogdierweefseis beschreven, inclusief skeletspier van pasgeboren zoogdieren, zoogdierhartspier, muisgrensstrengganglion-10 cellen in vitro en in kweek, gekweekte zoogdierskelet-spier en L6-cellen. Zie Rogart, Ann. Rev. Physiol. 43, 711-725 (1980).

Ratgrensstrengganglia-neuronen bezitten zowel TTX-gevoelige (IC=0 ~ 0,3 nM) als TTX-resistente (IC=0 ~ 100 15 μΜ) natriumkanaalstromen, zoals beschreven in Roy e.a., J. Neurosci. 12, 2104-2111 (1992). TTX-resistente natriumstromen zijn ook gemeten in nodeuze en rotsbeen-ganglia van de rat. Zie Ikeda e.a., J. Neurophysiol. 55, 527-539 (1986) en Stea e.a., Neurosci. 47, 727-736 20 (1992). Elektrofysiologen geloven dat nog een ander TTX- resistent natriumkanaal moet worden gedetecteerd.

Hoewel cDNA's uit ratskeletspier, -hart en -hersenen bekend zijn, is identificatie en isolatie van cDNA uit perifeer sensoor zenuwweefsel, zoals grensstrengganglia, 25 belemmerd door de moeilijkheid van het werken met dergelijk weefsel.

SAMENVATTING VAN DE tJTTVTNDTNG

De onderhavige uitvinding verschaft nieuwe gezuiverde 30 en geïsoleerde nucleïnezuursequenties die voor bij voorkeur TTX-resistente, zoogdierzenuwweefselnatrium-kanaal-eiwitten coderen die in volwassen DRG en nodeuze ganglia sterk tot expressie gebracht, in hersenen, ruggenmerg en hogere cervicale ganglia minder sterk tot 35 expressie gebracht en in grote beenzenuw, hart of skeletspier niet tot expressie gebracht worden. In 1010602 - 5 - onderhavige ingediende vormen omvatten nieuwe DNA-sequenties cDNA-sequenties die voor ratzenuwweefsel-natriumkanaal-eiwit coderen. Eén aspect van de onderhavige uitvinding is de α-subeenheid van dit 5 natriumkanaal-eiwit.

Geopenbaard is het aan de nucleïnezuursequenties van de uitvinding ontleende DNA, cDNA en mRNA en het aan het mRNA ontleende cRNA. Specifiek coderen twee cDNA-sequenties samen voor het ratzenuwweefselnatriumkanaal 10 van volledige lengte.

Ook inbegrepen in deze uitvinding zijn alternatieve DNA-vormen, zoals genomisch DNA, middels gedeeltelijke of totale chemische synthese uit nucleotiden bereid DNA en DNA met deleties of mutaties.

15 Nog een ander aspect van de uitvinding is het nieuwe TTX-resistente ratnatriumkanaal-eiwit en fragmenten daarvan, door het DNA van deze uitvinding gecodeerd.

Een ander aspect van de onderhavige uitvinding zijn recombinante polynucleotiden en oligonucleotiden die een 20 aan de DNA-sequentie van deze uitvinding ontleende nucleïnezuursequentie omvatten.

Een ander aspect van de uitvinding is een werkwijze voor het stabiliseren van het cDNA van volledige lengte dat voor de eiwitsequentie van de uitvinding codeert.

25 Verdere aspecten van de uitvinding omvatten expressie-vectoren die het DNA van de uitvinding omvatten, gastheercellen die met deze vectoren getransformeerd of getransfecteerd zijn en een cDNA-bibliotheek van deze gastheercellen.

30 Ook deel van deze uitvinding vormend, is een test voor remmers van het natriumkanaal-eiwit, die het in contact brengen omvat van een verbinding waar van vermoed wordt dat zij een remmer is, met tot expressie gebracht natriumkanaal en het meten van de activiteit van het 35 natriumkanaal.

Verder verschaft is een werkwijze voor het remmen van I010602 - 6 - de activiteit van het TTX-resistente natriumkanaal, die het toedienen omvat van een werkzame hoeveelheid van een verbinding met een IC50 van 10 μΜ of minder.

Verder verschaft zijn werkwijzen voor het gebruiken 5 van het DNA voor het vormen van monoklonale en polyklonale antilichamen, voor toepassing als moleculaire doelwitten voor geneesmiddel-ontdekking, zeer specifieke merkers voor specifieke antigenen, detectormoleculen, diagnostische tests en therapeutische ïo toepassingen, zoals pijnverlichting, een probe voor het PN5-kanaal in ander zoogdierweefsel, het ontwikkelen van therapeutische middelen en het op geschiktheid testen van therapieën.

KORTE BESCHRIJVING VAN DE SEP ID'S EN FIGUREN 15 Figuren 1A-E beelden de natuurlijke cDNA-sequentie van 5908 nucleotiden af die voor het ratnatriumkanaaltype 5 ("PN5")(SEQ ID NO: 1) codeert, ontleend aan twee overlappende cDNA-klonen, 26.2 en 1.18 genoemd.

Figuren 2A-F beelden de afgeleide aminozuursequentie 20 van PN5 (SEQ ID NO: 2, voorgesteld in de aminozuurcode van drie letters) af. Figuren 2G-H, de afgeleide aminozuursequentie van PN5 in aminozuurcode van enkele letter afbeeldend, laten ook de homologe domeinen (I-IV); de veronderstelde transmembraansegmenten (S1-S6); 25 het aminozuur dat resistentie tegen TTX verleent (♦); N-glycosyleringsplaatsen (·); cAMP-afhankelijk proteïne-kinase A (PKA)-fosforyleringsplaats (O); en het terminatie-codon (*) zien.

Figuur 3A beeldt een sequentie van 856 basenparen van 30 het menselijke PN5 (SEQ ID NO: 3) af. Figuur 3B beeldt de aminozuursequentie-vergelijking van het hPN5-fragment met rat-PN5 af.

Figuur 4 beeldt de sequentie van de probe van het nieuwe natriumkanaaldomein IV (SEQ ID NO: 4) af.

35 Figuren 5A-E beelden de voor stabiliteit en expressie gemodificeerde sequentie van 5334 nucleotiden (SEQ ID

1010602 - 7 - NO: 5) af. Nucleotiden 24 tot en met 5318 vertegenwoordigen de regio van 5295 bp die voor een eiwit van 1765 aminozuren codeert.

Figuur 6 beeldt de kloneringskaart van PN5 af.

5 GEDETAILLEERDE RF.SCHRTJVTNG VAN DF, UITVINDING De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een gezuiverde en geïsoleerde nucleïnezuursequentie die voor een nieuw, bij voorkeur TTX-resistent, zoogdiernatrium-10 kanaal-eiwit codeert. De term "gezuiverd en geïsoleerd DNA" verwijst naar DNA dat in hoofdzaak vrij is, i.e. minder dan ongeveer 30%, bij voorkeur minder dan ongeveer 10% en nog meer te prefereren minder dan ongeveer 1% van het DNA bevat waar het DNA van belang 25 van nature mee geassocieerd is. Technieken voor het vaststellen van zuiverheid zijn in het veld welbekend en omvatten bijvoorbeeld restrictie-inkaartbrenging, agarose-gelelektroforese en CsCl-gradiëntcentrifugering. De term "DNA" wordt bedoeld "cDNA", of complementair 20 DNA, te omvatten dat enkelstrengs- of dubbelstrengs-DNA-sequenties is, gemaakt middels omgekeerde transcriptie van mRNA dat uit een donorcel of middels chemische synthese is geïsoleerd. Behandeling van mRNA met een omgekeerd transcriptase zoals omgekeerd transcriptase 25 van AMV of omgekeerd transcriptase van M-MuLV in de aanwezigheid van een oligonucleotide-primer zal bijvoorbeeld een RNA-DNA-duplex verschaffen dat met RNase H, DNA-polymerase en DNA-ligase kan worden behandeld waardoor dubbelstrengs-cDNA wordt 30 geproduceerd. Indien gewenst, kan het dubbelstrengs-cDNA middels conventionele technieken zoals verhitten worden gedenatureerd waardoor enkelstrengs-cDNA wordt geproduceerd. De term "cDNA" omvat cDNA dat een complementaire kopie is van het van nature voorkomende 35 mRNA, evenals complementaire kopieën van varianten van het van nature voorkomende mRNA die dezelfde biologische 1010602 - 8 - activiteit hebben. Varianten zouden bijvoorbeeld inserties, deleties, sequenties met gedegeneerde codons en allelen omvatten.

Met deze uitvinding wordt "cRNA" beschouwd dat met 5 mRNA overeenkomt dat vanaf een DNA-sequentie is getranscribeerd die voor de a-subeenheid van een nieuw, bij voorkeur TTX-resistent, natriumkanaal-eiwit codeert. De term "cRNA" verwijst naar RNA dat een kopie is van het middels een cel getranscribeerde mRNA.

10 Specifiek omvat de uitvinding DNA met de natuurlijke versies van de in Figuren 1A-E (SEQ ID NO: 1} uiteengezette nucleotide-sequenties, hierin als natriumkanaal-type 5 (PN5) aangeduid. Figuren 1A-E beelden het cDNA-construct van 5908 nucleotiden af dat een open leesraam 25 van 5298 basen (het stopcodon meetellend) omvat (SEQ ID NO: 1). Nucleotide-residu 79 vertegenwoordigt de startplaats van translatie en residu 5376 vertegenwoordigt het einde van het stopcodon.

De uitvinding omvat ook gemanipuleerde versies van PN5 20 en specifiek de zoals in Figuren 5A-E uiteengezette versie (SEQ ID NO: 5). Deze SalI-Xbal-kloon van 5334 nucleotiden mist het grootste deel van de ongetransleerde sequenties, het open leesraam van 5298 nucleotiden beginnend bij nucleotide 24 en eindigend bij 25 nucleotide 5321. De start- en stopcodons zijn onderstreept, net als de translationeel stille mutaties op nucleotiden 3932, 3935, 3941, 3944 en 3947 die geïntroduceerd werden om herrangschikking in deze regio tijdens groei in E. coli te blokkeren.

30 De nucleotide-sequentie van SEQ ID NO: 1 (Figuren IA- E) correspondeert met de cDNA's uit de rat. Een homologie-zoektocht stelde vast dat het nauwstverwante natriumkanaal in het rathartkanaal wordt gevonden, met 72,5% homologie. De daarna nauwstverwante kanalen zijn 35 rPNl, met 72% en rat-hersentypen 1 en III, met respectievelijk 71,8 en 71,3%. Homologie met rPN3a, 1 o 1 06 0 2 - 9 - hPN3, rPN4, rPN4a, rat-hersentype II en ratskeletspier is elk ongeveer 70 tot 71%.

Bovendien is uit een "cDNA-bibliotheek" van menselijke grensstrengganglia [dorsal root ganglia] (DRG) een zoals 5 in Figuur 3A getoonde kloon van 856 basenparen (SEQ ID NO: 3) geïsoleerd en is nauw verwant met de rat-PN5-aminozuursequentie met 79% gelijkenis en 86% homologie. De menselijke PN5-sequentie omspant de regio tussen IIIS1 en tussendomein III/IV die de doorgang met snelle ïo inactivering (i.e. IFM) omvat die binnen tussendomein 'III/IV is gelokaliseerd.

De term "cDNA-bibliotheek" verwijst naar een verzameling van klonen, gewoonlijk in een bacteriofaag, of minder algemeen in bacteriële plasmiden, die cDNA-15 kopieën van mRNA-sequenties bevatten die aan een donorcel of -weefsel zijn ontleend.

Men gelooft dat verdere homologons van het hierin beschreven nieuwe TTX-resistente ratnatriumkanaal ook in ander zoogdierweefsel tot expressie worden gebracht.

20 Northern-blot-analyse (Voorbeeld 5) wijst erop dat PN5 door een transcript van ~ 6,5 kb wordt gecodeerd.

De afgeleide aminozuursequentie van PN5, getoond in Figuren 2A-F (SEQ ID NO: 2), vertoont de primaire structurele kenmerken van een α-subeenheid van een TTX-25 resistent natriumkanaal met middels voltage gestuurde doorgang. In Figuren 2G-H getoond zijn de homologe domeinen (I-IV); de veronderstelde transmembraan-segmenten (S1-S6); het aminozuur dat resistentie tegen TTX verleent (♦); N-glycosyleringsplaatsen {·); en cAMP-30 afhankelijk PKA-fosforyleringsplaatsen (O). DNA-sequenties die voor dezelfde of allelvariant- of analogonnatriumkanaal-eiwitpolypeptiden van het zenuwstelsel coderen, worden door middel van toepassing van, ten minste ten dele, gedegenereerde codons met deze 35 uitvinding ook beschouwd.

Een interessant kenmerk van deze afgeleide aminozuur- 1010602 - 10 - sequentie is dat het aminozuur dat het meest verantwoordelijk voor TTX-gevoeligheid is, op plaats 355 is gelokaliseerd en niet aromatisch is. In natrium-kanalen van het rat- en menshersentype, skeletspier-5 kanaal en in PN1 en PN4 is dit aminozuur tyrosine of fenylalanine en deze kanalen zijn alle TTX-gevoelig. In PN3 en PN5 is het aminozuur serine. Aangezien PN3 zeer resistent' tegen TTX is, is de implicatie dat PN5 ook een TTX-resistent kanaal is. Het hartkanaal heeft op deze ïo plaats een cysteine en is "ongevoelig" voor TTX.

Hoewel PN5 al de kenmerken van een natriumkanaal met middels voltage gestuurde doorgang bevat, heeft het unieke structurele kenmerken dat het van andere natrium-kanalen onderscheidt. DIIS4 heeft bijvoorbeeld 5 in alle 15 natriumkanalen geconserveerde basische aminozuren die een significante rol zouden kunnen spelen in de voltage-registrerende aspecten van de kanaalfunctie. In PN5 is het eerste basische aminozuur vervangen door een alanine. Evenzo heeft, in DIIIS4, PN5 5 basische 20 aminozuren in plaats van zes die in andere natrium-kanaalsequenties aanwezig zijn, de laatste arginine vervangen door een glutamine. In DIIIS3 bevat het transmembraansegment slechts 18 aminozuren, in tegenstelling tot 22 aminozuren in andere kanalen. Ook 25 is de korte koppelstuk (4 aminozuren)-lus tussen S3 en S4 in Dill zelfs korter door een "deletie" van 3 aminozuren. Deze verkorting van het S3 en de koppelstuk-lus is bevestigd middels het uit rat-DRG ontwerpen van primers in de geschikte regio van de sequentie voor een 30 RT-PCR-experiment en het bepalen van de sequentie van het vermeerderde DNA-fragment. Een dergelijk experiment is uitgevoerd om de sequentie van een andere regio van PN5, in de DIVS5-S6-lus, te bevestigen waar een deletie van een peptide van 8 aminozuren was.

35 Omgekeerd transcriptase-polymerase-kettingreactie (middels oligonucleotiden op gang gebrachte RT-PCR)- 1 n 1 Dfifl 9 - 11 - weefselverdeling-analyse van RNA uit de centrale en perifere zenuwstelsels van de rat, specifiek uit rat-DRG, werd uitgevoerd. Acht hoofdweefseltypen werden op expressie van de unieke, met plaatsen 5651-5903 van SEQ 5 ID NO: 1 (Figuren 1A-E) corresponderende PN5-genen gescreend. PN5-mRNA was in vijf van de bestudeerde weefsels aanwezig: hersenen, ruggenmerg, DRG, nodeuze ganglia en hogere cervicale ganglia. PN5 was niet aanwezig in de resterende bestudeerde weefsels: grote ίο beenzenuwweefsel, hart of skeletspierweefsel. PN5 bleek 'in DRG en nodeuze ganglia het sterkste te zijn, wat de aanvraagsters ertoe bracht te geloven dat de DRG met PN5 zijn verrijkt. PN5 laat over een reeks van weefsels spectaculaire abondantie-verschillen zien. PN.5 heeft een 15 gradiënt van expressie met hoge expressie in DRG. PN5 heeft een gradiënt van expressie als andere kanalen, maar beperktere verdeling.

De uitvinding omvat niet alleen het volledige eiwit dat door de cDNA-sequenties van SEQ ID NOS: 1, 2 en 3 20 tot expressie wordt gebracht, maar omvat ook eiwit-fragmenten. Deze fragmenten kunnen worden verkregen middels het klieven van de eiwitten van volledige lengte of middels het toepassen van kleinere DNA-sequenties of "polynucleotiden" om het gewenste fragment tot expressie 25 te brengen.

De term "polynucleotide", zoals hierin gebruikt, verwijst naar een polymere vorm van nucleotiden van een willekeurige lengte, danwel ribonucleotiden ofwel desoxyribonucleotiden. Deze term verwijst slechts naar 30 de primaire structuur van het molecuul. Aldus omvat deze term dubbel- en enkelstrengs-DNA, evenals dubbel- en enkelstrengs-RNA. Hij omvat ook gemodificeerde, bijvoorbeeld middels methylering en/of middels capping, en ongemodificeerde vormen van het polynucleotide.

35 Verder wordt de term "polynucleotide" bedoeld een recombinant polynucleotide te omvatten dat van 1 0 1 0602 - 12 - genomische, cDNA-, semisynthetische of synthetische oorsprong is dat ingevolge de oorsprong of manipulatie ervan niet met geheel of een gedeelte van het polynucleotide is geassocieerd waarmee het in de natuur 5 geassocieerd is en/of aan een ander polynucleotide is gekoppeld dan waarmee het in de natuur is gekoppeld.

Dienovereenkomstig omvat de uitvinding ook polynucleotiden die kunnen worden toegepast om polypeptiden van ongeveer 10 tot 1500, bij voorkeur 10 ïo tot 100, aminozuren lang te maken. De isolatie en -zuivering van dergelijke recombinante polypeptiden kan worden bewerkstelligd middels technieken die in het veld welbekend zijn, bijvoorbeeld preparatieve chromatografische scheidingen of affiniteit-15 chromatografie. Bovendien kunnen polypeptiden ook worden gemaakt middels synthetische middelen die in het veld welbekend zijn.

De uitvinding staat de manipulatie van genetische materialen middels recombinanttechnologie toe om 20 polypeptiden te produceren die de structurele en functionele kenmerken van de nieuwe, in sensore zenuwen gevonden, TTX-resistente natriumkanaal-a-subeenheid met middels voltage gestuurde doorgang bezitten. Om dergelijke recombinante polypeptiden te verschaffen, kan 25 plaatsgerichte mutagenese worden toegepast. Om genen te produceren die coderen voor, en een specifieke mutant tot expressie brengen, kunnen bijvoorbeeld in het gedeelte van het gen van belang synthetische oligonucleotiden worden geïnserteerd of gesubstitueerd. 30 Ook kunnen willekeurige gedegenereerde oligonucleotiden worden geïnserteerd en om polypeptiden te identificeren en isoleren die een functionele eigenschap van belang bezitten, kunnen faagdisplay-technieken werden toegepast.

35 Bovendien beschouwt de onderhavige uitvinding recombinante polynucleotiden van ongeveer 15 tot 20 kb, 1010602 - 13 - bij voorkeur 10 tot 15 kb, nucleotiden lang die een nucleïnezuursequentie omvatten die is "ontleend aan" het DNA van de uitvinding.

De term "ontleend aan" een aangeduide sequentie 5 verwijst naar een nucleïnezuursequentie die is samengesteld uit een sequentie van ongeveer ten minste 6 tot 8 nucleotiden, meer te prefereren ten minste 10 tot 12 nucleotiden en, nog meer te prefereren, ten minste 15 tot 20 nucleotiden die corresponderen met, i.e. homoloog ïo of complementair zijn met, een regio van de aangeduide 'sequentie. De ontleende sequentie wordt niet noodzakelijkerwijze fysisch aan de getoonde nucleotide-sequentie ontleend, maar kan op een willekeurige wijze ontleend zijn, inclusief bijvoorbeeld chemische synthese 15 of DNA-replicatie of omgekeerde transcriptie, die gebaseerd zijn op de informatie die wordt verschaft middels de sequenties van basen in de regio('s) waaruit het polynucleotide wordt ontleend.

Met Fll, een fusie-cellijn die werd ontwikkeld uit DRG 20 van neonatale ratten gefuseerd met een muiscellijn, N18TG, van Massachusetts General Hospital, werd een test van neonatale expressie uitgevoerd. Fll reageert op trofische agentia, zoals NGF, middels het uitstrekken van dendrieten. Er werd gevonden dat PN5 in zowel 25 natuurlijke als met NGF behandelde Fll aanwezig was, wat de aanvraagsters ertoe bracht te geloven dat het natriumkanaal van nature in Fll tot expressie wordt gebracht.

In situ-hybridisatie van PN5-mRNA met rat-DRG-weefsel 30 verschaft lokalisatie overheersend in de kleine en gemiddelde neuronen met geen detectie in grote neuronen.

PN5 werd ook op de cytogenetische locatie ervan op muischromosoompreparaten in kaart gebracht. PN5 plaatst zich op hetzelfde chromosoom als het hart kanaal en PN3. 35 In het algemeen omvatten natriumkanalen een a- en twee β-subeenheden. De B-subeenheden kunnen de functie van ι n 1 hr n 9 - 14 - het kanaal moduleren. Aangezien de α-subeenheid echter alles is dat vereist is om het kanaal volledig functioneel te laten zijn, zal expressie van het cDNA in SEQ ID NO: 1 (Figuren 1A-E) een volledig functioneel 5 eiwit verschaffen. Het gen dat codeert voor de β,- subeenheid in perifeer zenuwweefsel, bleek identiek te zijn met dat gevonden in rathart, -hersenen en -skeletspier. Het cDNA van de ftj-subeenheid wordt hierin niet beschreven aangezien het in het veld welbekend is, 10 zie Isom e.a., Neuron 12, 1183-1194 (1994). Het moge echter duidelijk zijn dat middels het combineren van de bekende sequentie van de β,-subeenheid met de hierin beschreven α-subeenheid men bij voorkeur TTX-resistent, volledig PN5-natriumkanaal met middels voltage gestuurde 15 doorgang kan verkrijgen.

De onderhavige uitvinding omvat ook "expressie-vectoren" die het DNA of het boven beschreven cDNA omvatten, met deze expressievectoren getransformeerde gastheercellen die in staat zijn tot het produceren van 20 het natriumkanaal van de uitvinding en cDNA-bibliotheken die dergelijke gastheercellen omvatten.

De term "expressievector" verwijst naar elk genetisch element, bv. een plasmide, een chromosoom, een virus, dat zich danwel als een autonome eenheid van 25 polynucleotide-expressie binnen een cel gedraagt, ofwel capabel gemaakt zijnd tot replicatie middels insertie in een gastheercelchromosoom, een ander polynucleotide-segment eraan gehecht hebbend om de replicatie en/of expressie van het gehechte segment te bewerkstelligen.

30 Dergelijke vectoren omvatten, maar zijn niet beperkt tot, plasmiden, bacteriofagen en cosmiden. Vectoren zullen polynucleotide-sequenties bevatten die noodzakelijk zijn om ligatie of insertie van de vector in een gewenste gastheercel te bewerkstelligen en om de 35 expressie van het gehechte segment te bewerkstelligen. Dergelijke sequenties verschillen afhankelijk van het 1010602 - 15 - gastheer-organisme en zullen promotorsequenties om transcriptie te bewerkstelligen, versterkersequenties om transcriptie te verhogen, ribosomale bindingsplaats-sequenties en transcriptie- en translatie-terminatie-5 sequenties omvatten.

De term "gastheercel" verwijst gewoonlijk naar prokaryotische of eukaryotische organismen en omvat elk transformeerbaar of transfecteerbaar organisme dat in staat is tot het tot expressie brengen van een eiwit en 10 als een ontvanger voor expressievectoren of ander overgebracht DNA kan worden, of is, toegepast. Gastheercellen kunnen er ook toe worden gebracht eiwit tot expressie te brengen middels directe injectie met exogeen cRNA dat in het eiwit van belang transleerbaar is is. Een geprefereerde gastheercel is de Xenopus-oöcyt.

De term "getransformeerd" verwijst naar elke bekende werkwijze voor de insertie van vreemde DNA- of RNA-sequenties in een prokaryotische gastheercel. De term "getransfecteerd" verwijst naar elke bekende werkwijze 20 voor de insertie van vreemde DNA- of RNA-sequenties in een eukaryotische gastheercel. Dergelijke getransformeerde of getransfecteerde cellen omvatten stabiel getransformeerde of getransfecteerde cellen waarin het geïnserteerde DNA capabel is gemaakt tot 25 replicatie in de gastheercel. Ze omvatten ook tijdelijk tot expressie brengende cellen die het geïnserteerde DNA of RNA gedurende beperkte tijdsperioden tot expressie brengen. De transformatie- of transfectie-procedure is afhankelijk van de gastheercel die wordt 30 getransformeerd. Zij kan het inpakken van het polynucleotide in een virus evenals directe opname van het polynucleotide, zoals bijvoorbeeld lipofectie of micro-injectie omvatten. Transformatie en transfectie kunnen resulteren in incorporatie van het geïnserteerde 35 DNA in het genoom van de gastheercel of de handhaving van het geïnserteerde DNA binnen de gastheercel in 1010602 - 16 - plasmide-vorm. Werkwijzen van transformatie zijn in het veld welbekend en omvatten, maar zijn niet beperkt tot, virale infectie, elektroporatie, lipofectie en middels calciumfosfaat tot stand gebrachte directe opname.

5 Het moge duidelijk zijn dat deze uitvinding is bedoeld andere vormen van expressievectoren, gastheercellen en transformatie-technieken te omvatten die equivalente functies dienen en die bekend worden voor het dit betreffende veld.

ïo De uitvinding heeft ook betrekking op een test voor remmers van het nieuwe TTX-resistente natriumkanaal-eiwit, die het in contact brengen omvat van een verbinding waar van vermoed wordt dat zij een remmer is, met tot expressie gebracht natriumkanaal en het meten is van de activiteit van het natriumkanaal. De verbinding kan een in een waterig medium gecombineerd, in hoofdzaak zuivere verbinding van synthetische oorsprong zijn, of de verbinding kan een zodanig van nature voorkomend materiaal zijn dat het testmedium een extract van 20 biologische oorsprong is, zoals bijvoorbeeld een plant-, dier- of microbieel cel-extract. PN5-activiteit kan worden gemeten middels werkwijzen zoals elektro-fysiologie (voltage-clamp met twee elektroden of patch clamp van hele cellen met enkelvoudige elektrode), 25 guanidinium-ionfluxtests en toxine-bindingstests. Een "remmer" wordt gedefinieerd als gewoonlijk die hoeveelheid die resulteert in meer dan 50% afname in PN5-activiteit, bij voorkeur meer dan 70% afname in PN5-activiteit, meer te prefereren meer dan 90% afname in 30 PN5-activiteit. Er bestaan veel toepassingen van de uitvinding, waarvan er een paar beneden worden beschreven: 1. Probe voor zoogdierkanalen.

Zoals boven vermeld, gelooft men dat verdere 35 homologons van het nieuwe hierin beschreven TTX- resistente ratnatriumkanaal ook in zoogdierweefsel, in 1010602 - 17 - het bijzonder menselijk weefsel, tot expressie worden gebracht. De volledige cDNA's van rat-PN5-natriumkanalen van de onderhavige uitvinding kunnen als een probe worden toegepast om te ontdekken of in menselijk weefsel 5 verdere nieuwe, bij voorkeur TTX-resistente PN5- natriumkanalen met middels voltage gestuurde doorgang bestaan en indien ja, om bij het isoleren van de cDNA's van het menselijke eiwit te helpen.

De menselijke homologons van de TTX-resistente ratio PN5-kanalen kunnen worden gekloneerd met gebruikmaking •van een bibliotheek van menselijk DRG-cDNA. Menselijke DRG worden bij autopsie verkregen. Het bevroren weefsel wordt gehomogeniseerd en het RNA met guanidine-isothiocyanaat geëxtraheerd (Chirgwin e.a., Biochemistry 15 18, 5294-5299 (1979)). Het RNA wordt op een sucrose- gradiënt op grootte gefractioneerd om op grote mRNA's te verrijken, omdat de natriumkanaal-a-subeenheden door grote (7-11 kb) transcripten worden gecodeerd. Dubbelstrengs-cDNA wordt bereid met gebruikmaking van de 20 Superscript Choice cDNA-kit (GIBCO BRL) met danwel - oligo(dT) ofwel willekeurige hexameerprimers. Aan het dubbelstrengs-cDNA worden EcoRI-adapters geligeerd dat daarna wordt gefosforyleerd. De cDNA-bibliotheek wordt geconstrueerd middels het ligeren van het dubbelstrengs-25 cDNA in de bacteriofaag lambda ZAP II-vector (Stratagene), gevolgd door inpakken in faagpartikels.

Fagen worden op platen van 150 mm op een veld van XL1-Blue MRF'-bacteriën (Stratagene) uitgeplaat en op Hybond N-nylonmembranen (Amersham) worden plaque-replica'’ s 30 gemaakt. Filters worden middels standaardprocedures met rat-PN5-cDNA-probes gehybridiseerd en middels autoradiografie of chemiluminescent ie gedetecteerd. Het signaal dat wordt geproduceerd middels de rat-PN5-probes die bij hoge stringentie met positieve menselijke klonen 35 hybridiseren, hoort sterker te zijn dan dat verkregen met rat-hersennatriumkanaalprobes die met deze klonen 1010602 - 18 - hybridiseren. Positieve plaques worden middels beperkende verdunning verder gezuiverd en middels hybridisatie of PCR herscreend. Restrictie-inkaartbrenging en polymerase-kettingreactie zullen 5 overlappende klonen identificeren die middels standaardtechnieken in het menselijke homologon van rat-PN5 van volledige lengte kunnen worden geassembleerd. De menselijke kloon kan tot expressie worden gebracht middels het in Xenopus-oöcyten injecteren van cRNA dat 10 in vitro vanaf de cDNA-kloon van volledige lengte is getranscribeerd, of middels het transfecteren van een zoogdiercellijn met een vector die het cDNA gekoppeld aan een geschikte promotor bevat.

2. Antilichamen Tegen PN5.

15 De polypeptiden van de uitvinding zijn zeer bruikbaar voor de ontwikkeling van antilichamen tegen PN5. Dergelijke antilichamen kunnen in affiniteit-chromatografie worden toegepast om recombinante natrium-kanaal-eiwitten of -polypeptiden te zuiveren, of ze 20 kunnen als een onderzoeksmiddel worden toegepast. Aan een reportermolecuul gebonden antilichamen kunnen bijvoorbeeld in histochemische kleuringstechnieken worden toegepast om andere weefsels en celtypen te identificeren waar PN5 aanwezig is, of ze kunnen worden 25 toegepast om epitopische of functionele regio's van het natriumkanaal-eiwit van de uitvinding te identificeren.

De antilichamen kunnen monoklonaal of polyklonaal zijn en kunnen worden bereid middels technieken die in het veld welbekend zijn. Polyklonale antilichamen worden als 30 volgt bereid: om een uitgekozen zoogdier, zoals een muis, konijn, geit, etc. te immuniseren, wordt een immunogeen conjugaat toegepast dat PN5 of een fragment daarvan, optioneel gekoppeld aan een drager-eiwit, omvat. Uit het geïmmuniseerde zoogdier wordt serum 35 verzameld en om de immunoglobuline-fractie te scheiden, volgens bekende procedures behandeld.

1010602 - 19 -

Middels standaard hybridoma-celtechnologie die is gebaseerd op die in Nature 256, 495-497 (1975) door Kohier en Milstein gerapporteerd, worden monoklonale antilichamen bereid. Uit een gastheerdier dat met het 5 PN5-eiwit of een fragment daarvan, optioneel aan een drager gekoppeld, is geïmmuniseerd, worden miltcellen verkregen. Middels het fuseren van deze miltcellen met een geschikte myeloomcellijn worden hybridische cellen gevormd en gekweekt. De door de hybridische cellen ίο geproduceerde antilichamen worden gescreend op hun 'vermogen om aan tot expressie gebrachte PN5-eiwitten te binden.

Er kan een aantal in het veld welbekende werkwijzen worden gebruikt, zoals bijvoorbeeld voorwaartse of 15 omgekeerde enzymgekoppelde immunosorbenstestscreenings-werkwijzen. Daarna worden de hybridische cellen die dergelijke antilichamen produceren, onderworpen aan herklonering en omstandigheden van hoge verdunning ten einde een hybridische cel te selecteren die een homogene 20 populatie van antilichamen afscheidt die specifiek zijn voor een van beide PN5-eiwitten.

Bovendien kunnen antilichamen worden opgewekt middels het kloneren en tot expressie brengen van nucleotide-sequenties of gemutageniseerde versies daarvan die voor 25 ten minste de aminozuursequenties coderen die vereist zijn voor specifieke binding van natuurlijke antilichamen, en deze tot expressie gebrachte eiwitten toegepast als het immunogeen. Antilichamen kunnen het volledige immunoglobuline of een fragment daarvan 30 omvatten. Antilichamen kunnen aan een reportergroep zoals boven met betrekking tot polynucleotiden wordt beschreven, worden gekoppeld.

Voorbeeld 10 illustreert praktijk van het produceren van een antilichaam.

1010602 - 20 - 3. Therapeutische Doelwitten voor Verbindingen om Aandoeningen te Behandelen en Tests Daarvan.

De onderhavige uitvinding omvat ook de toepassing van de nieuwe, bij voorkeur TTX-resistente natriumkanaal-a-5 subeenheid met middels voltage gestuurde doorgang als een therapeutisch doelwit voor verbindingen om aandoeningen van het zenuwstelsel te behandelen, gebaseerd op de RT-PCR-lokalisatie-data. De aandoeningen omvatten, maar zijn niet beperkt tot, epilepsie, ïo beroerte-schade, hersenschade, diabetische neuropathie, •traumatische schade, chronische neuropathische pijn en met AIDS geassocieerde neuropathie.

4. Het Ontwikkelen van Therapeutische Middelen gebaseerd op het Remmen van PN5 en tests daarvan.

15 Deze uitvinding is ook gericht op het remmen van de activiteit van PN5 in hersenen, ruggenmerg, DRG, nodeuze ganglia en hogere cervicale ganglia-weefseis. Het moge echter duidelijk zijn dat verdere studies kunnen openbaren dat PN5 in andere weefsels aanwezig is en als zo zodanig kunnen deze weefsels ook gebieden zijn waarop gericht wordt. De detectie van PN5-mRNA in nodeuze ganglia suggereert bijvoorbeeld dat in deze en andere sensore ganglia van het zenuwstelsel PN5 TTX-resistente natriumstromen kan geleiden.

25 Bovendien is er gevonden dat eiwitten die normaliter in bepaalde weefsels niet tot expressie worden gebracht, in een ziektetoestand tot expressie worden gebracht. Daarom is deze uitvinding bedoeld de remming van PN5 in weefsels en celtypen waar het eiwit normaliter tot 30 expressie wordt gebracht en in die weefsels en celtypen waar het eiwit slechts tijdens een ziektetoestand tot expressie wordt gebracht, te omvatten.

Men gelooft bijvoorbeeld dat TTX-resistente natrium-kanalen een sleutelrol spelen bij het doorseinen van 35 zenuwimpulsen die betrekking hebben op sensore inputs zoals pijn en druk. Deze informatie zal het ontwikkelen 1010602 - 21 - van therapeutische middelen vergemakkelijken die gericht naar een specifiek gebied zoals perifeer zenuwweefsel kunnen worden gebracht.

Het recombinante eiwit van de onderhavige uitvinding 5 kan worden toegepast om op potentiële therapeutische middelen te screenen die het vermogen hebben het natriumkanaal van belang te remmen. In het bijzonder zou het bruikbaar zijn selectief de functie van natrium-kanalen in perifere zenuwweefsels te remmen die 10 verantwoordelijk zijn voor het doorseinen van pijn- en druksignalen zonder tegelijkertijd de functie van natriumkanalen in andere weefsels zoals hart en spier te beïnvloeden. Dergelijke selectiviteit zou de behandeling van pijn zonder bijwerkingen door hart- of 15 neuromusculaire complicaties te veroorzaken, in aanmerking nemen. Daarom zou het nuttig zijn DNA-sequenties te hebben die voor natriumkanalen coderen die selectief in perifeer zenuwweefsel tot expressie worden gebracht.

20 5. Pijnverlichter.

Natriumkanalen in perifeer zenuwweefsel spelen een grote rol bij de transmissie van zenuwimpulsen en zijn daarom behulpzaam bij het begrijpen van neuropathische pijntransmissie. Neuropathische pijn valt in twee 25 componenten uiteen: allodynie, waar een normaliter niet-pijnlijke stimulus pijnlijk wordt en hyperalgesie, waar een gewoonlijk normale pijnlijke stimulus uiterst pijnlijk wordt.

In weefsellokalisatie-studies beperkt PN5-mRNA zich 30 tot kleine en gemiddelde neuronen van DRG. PN5-mRNA is ook aanwezig in hersenen en ruggenmerg. Het remmen van de activiteiten ervan kan helpen kwalen zoals hoofdpij nen en migraines te voorkomen. Het vermogen om de activiteit van deze natriumkanalen te remmen, i.e. de 35 geleiding van zenuwimpulsen te verminderen, zal de zenuw haar vermogen beïnvloeden pijn-impulsen door te seinen.

1010602 - 22 -

Selectieve remming van natriumkanalen in sensore neuronen zoals DRG zal de blokkering van pijn-impulsen mogelijk maken zonder complicerende bijwerkingen die worden veroorzaakt door remming van natriumkanalen in 5 andere weefsels zoals hersenen en hart. Bovendien worden bepaalde aandoeningen door natriumkanalen veroorzaakt die impulsen op een extreem hoge frequentie produceren. Het vermogen om de activiteit van het kanaal te verminderen, kan daarom de aandoening elimineren of 10 verlichten. Dienovereenkomstig kunnen middels in het veld welbekende werkwijzen potentiële therapeutische verbindingen worden gescreend om te ontdekken of ze de activiteit van het recombinante natriumkanaal van de uitvinding kunnen remmen. Barram, M. e.a., Naun-15 Schmiedeberg's Archives of Pharmacology 347, 125-132 (1993) en McNeal, E.T. e.a., J. Med. Chem. 28, 381-388 (1985). Voor vergelijkbare studies met de acetylcholine-receptor, zie Claudio e.a., Science 238, 1688-1694 (1987).

20 Pijn kan bijvoorbeeld verlicht worden middels het remmen van de activiteit van het nieuwe, bij voorkeur TTX-resistente natriumkanaal, dat het toedienen omvat van een therapeutisch werkzame hoeveelheid van een verbinding met een IC;.- die ongeveer 10 μΜ of minder is, 25 bij voorkeur <1 μΜ. Potentiële therapeutische verbindingen worden geïdentificeerd gebaseerd op hun vermogen de activiteit van PN5 te remmen. Daarom kan de voornoemde test worden toegepast om verbindingen met een therapeutisch werkzame IC;c te identificeren.

30 De term "IC=:" verwijst naar de concentratie van een verbinding die vereist is om de activiteit van tot expressie gebracht PN5 met 50% te remmen wanneer activiteit wordt gemeten middels elektrofysiologie, fluxtests en toxine-bindingstests, zoals boven vermeld.

35 6. Diagnostische Tests.

De bij het bewerkstelligen van kenmerken van deze 101060? - 23 - uitvinding gebruikte basistechnieken van de moleculaire biologie, zoals RNA-, DNA- en plasmide-isolatie, restrictie-enzymdigestie, bereiding en hybridiseren van een cDNA-bibliotheek, het sequentiebepalen van klonen, 5 het construeren van expressievectoren, het transformeren van cellen, het aanhouden en groeien van celkweken en andere algemene technieken zijn in het veld welbekend en beschrijvingen van dergelijke technieken kunnen in algemene laboratoriumhandleidingen zoals Molecular 10 Cloning: A Laboratory Manual door Sambrook e.a. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2e editie, 1989) worden gevonden.

De polynucleotiden van de uitvinding kunnen bijvoorbeeld aan een "reportermolecuul" worden gebonden 15 waardoor een polynucleotide-probe wordt gevormd die bruikbaar is voor Northern- en Southern-blot-analyse en in sifcu—hybridisaties.

De term "reportermolecuul" verwijst naar een chemische entiteit die in staat is tot het gedetecteerd worden 20 middels een geschikt detectie-middel, inclusief, maar niet beperkt tot, spectrofotometrische, chemi-luminescente, immunochemische of radiochemische middelen. De polynucleotiden van deze uitvinding kunnen middels in het veld welbekende technieken aan een 25 reportermolecuul worden geconjugeerd. Typisch bevat het reportermolecuul een functionele groep die geschikt is voor hechting aan of incorporatie in het polynucleotide. De functionele groepen die geschikt zijn voor het hechten van de reportergroep zijn gewoonlijk 30 geactiveerde esters of alkylerende agentia. Details van technieken voor het hechten van reportergroepen zijn in het veld welbekend. Zie bijvoorbeeld Matthews, J.A., Batki, A., Hynds, C. en Kricka, L.J., Anal. Biochem.

151, 205-209 (1985) en Engelhard! e.a., Europese 35 octrooiaanvrage nr. 0302175.

ί Π 1 Π n fl 9 -24-

Dienovereenkomstig zijn de volgende Voorbeelden louter illustratief voor de technieken waarmee de uitvinding kan worden uitgevoerd.

Afkortingen 5 De volgende afkortingen worden in de Voorbeelden toegepast en hebben elk van de beneden gedefinieerde respectieve betekenissen.

BSA: bovine serumalbumine

Denhardt's oplossing: 0,02% BSA, 0,02% polyvinyl-10 pyrrolidon, 0,02% Ficoll (0,1 g BSA, 0,1 g Ficoll en 0,1 g polyvinylpyrrolidon per 500 ml) DRG: grensstrengganglia EDTA: Ethyleendiamine-tetra-azijnzuur, tetra-natrium- 15 ZOUt

MEN: 20 mM MOPS, 1 mM EDTA, 5 mM natriumacetaat, pH

7,0 MOPS: 3-(N-morfolino)propaansulfonzuur (Sigma Chemical Company) 20 PN5: natriumkanaal 5 van de perifere zenuw PNS: perifeer zenuwstelsel [peripheral nervous system] SDS: natriumdodecylsulfaat [sodium dodecyl sulphate] SSC: 150 mM NaCl, 15 mM natriumcitraat, pH 7,0 SSPE: 80 mM NaCl, 10 mM natriumfosfaat, 1 mM ethyleen-25 diamine-tetra-acetaat, pH 8,0 TEV: voltage-ciamp met twee elektroden [two electrode voltage clamp] TTX: tetrodotoxine (Sigma Chemical Company)

30 VOORBEELDEN

De volgende Voorbeelden illustreren praktijk van de uitvinding.

Materialen

Het plasmide pBK-CMV werd van Stratagene (La Jolla, 35 CA) verkregen; het plasmide pBSTA wordt beschreven door Goldin e.a., in Methods in Enzymology (Rudy & Iverson, 1010602 - 25 - uitgs.) 207, 279-297; het plasmide pCIneo werd van Promega (Madison, WI) verkregen; en het plasmide pCRII werd van Invitrogen (Carlsbad, CA) verkregen.

Het oöoyt-expressievectorplasmide pBSTAcIIr werd uit 5 pBSTA geconstrueerd middels insertie van een synthetisch oligonucleotide-koppelstuk; plasmide pKK232-8 werd van Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) verkregen; plasmide pCRII.werd van Invitrogen, San Diego, CA verkregen. Competente E. coli-cellijnen STBL2™ en SURE® werden ïo respectievelijk van Gibco/BRL en Stratagene verkregen.

VOORBEELD 1

HET VERKRIJGEN VAN RNA UTT RAT-DRG. -HERSENEN

EN -RUGGENMERG

15 Uit geanestheseerde volwassen Sprague-Dawley-mannetjesratten werden onder een ontleedmicroscoop lumbale DRG Nr. 4 en Nr. 5 (L4 en L5), hersenen en ruggenmerg verwijderd. De weefsels werden in droogijs bevroren en met een Polytron-homogeniseerder 20 gehomogeniseerd; het RNA werd middels de guanidine-isothiocyanaatprocedure (zie Chomczynski e.a., Anal. Biochemistry 162, 156-159 (1987)) geëxtraheerd. Totaal-RNA (5 pg van elk monster) werd in MEN-buffer opgelost die 50% formamide, 6,6% formaldehyde bevatte en 25 gedurende 5-10 min bij 65°C gedenatureerd. Het RNA werd door een 0,8% agarose-gel heen geëlektroforeerd die 8,3% formaldehyde in MEN-buffer bevatte. De elektrode-buffer was MEN-buffer die 3,7% formaldehyde bevatte; de gel werd gedurende 12-18 uur bij 50 V gedraaid.

30 In parallelle lanen van de gel werden grootte-merkers gedraaid, inclusief ribosomaal 18S- en 28S-RNA's en RNA-merkers (GIBCO BRL). Hun posities werden bepaald middels het met ethidiumbromide (0,5 pg/ml) kleuren van de uitgesneden laan gevolgd door fotografie onder UV-licht. 35 Na elektroforese werd de gel in 2xSSC gespoeld en het RNA werd middels capillaire werking met 20xSSC naar een 1 0 1 0602 - 26 -

Duralose-membraan (Stratagene) overgebracht; de membraan werd gedurende 1 uur bij 80°C onder vacuüm gebakken.

VOORBEELD 2 PROBE UIT RAT-HERSEN IIA 5

Met gebruikmaking van pEAF8-matrijs-DNA (Noda e.a., Nature 320, 188-192 (1986)) dat met BstEII was gelineariseerd werd in vitro met T7-RNA-polymerase (Pharmacia) een met 32P gemerkte cRNA-probe io gesynthetiseerd die complementair was met nucleotiden 4637-5868 van de rat-hersen IIA-natriumkanaal-a-subeenheidsequentie.

Protocollen voor elke boven vermelde procedure kunnen worden gevonden in Molecular Cloning: A Laboratory is Manual door Sambrook e.a. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2e editie, 1989).

VOORBEELD 3

HYBRIDISATIE VAN RNA MET PE PROBE UTT RAT-HERSEN IIA

20

De membraan van Voorbeeld 1 werd in 50% formamide, 5xSSC, 50 mM natriumfosfaat, pH 7,1, lx Denhardt's oplossing, 0,5% SDS en gebroken, hitte-gedenatureerd zalmsperma-DNA (1 mg/ml) gedurende 16 uur bij 42°C 25 voorgehybridiseerd. De membraan werd in 50% formamide, 5xSSC, 50 mM natriumfosfaat, pH 7,1, lx Denhardt's oplossing, 0,5% SDS en gebroken, hitte-gedenatureerd zalmsperma-DNA (200 pg/ml) met de in Voorbeeld 2 beschreven, met :':P gemerkte cRNA-probe (ca. l-3xl06 30 cpm/ml) gedurende 18 uur bij 42°C gehybridiseerd.

De membraan werd gedurende 20 min bij kamertemperatuur met 2xSSC, 0,1% SDS gespoeld en daarna opeenvolgend gewassen met: 2xSSC, 0,1% SDS gedurende 30 min bij 55°C, 0,2xSSC, 0,1% SDS gedurende 30 min bij 65°C, 0,2xSSC, 35 0,1% SDS gedurende 30 min bij 70°C en 0,2xSSC, 0,1% SDS, 0,1% natriumpyrofosfaat gedurende 20 min bij 70°C. De 1010602 - 27 - filter werd gedurende tot 2 weken met versterkings-schermen bij -80°C tegen Kodak X-omat AR-film belicht.

De pEAF8-probe hybridiseerde met mRNA's in het DRG-monster met groottes van 11 kb, 9,5 kb, 7,3 kb en 6,5 5 kb, geschat op basis van hun posities ten opzichte van de standaards.

VOORBEELD 4

PROBE VOOR NIEUW NATRIUMKANAALDOMETN TV

10

De probe werd als volgt verkregen: op RNA dat uit rat-DRG was geïsoleerd, werd met gebruikmaking van gedegenereerde oligonucleotide-primers die gebaseerd op de homologieën tussen bekende natriumkanalen in domein 15 IV waren ontworpen, RT-PCR uitgevoerd. De domein IV- producten werden in een plasmide-vector gekloneerd, naar E. coli getransformeerd en enkelvoudige kolonies geïsoleerd. Van de uit verschillende van deze kolonies verkregen, voor domein IV specifieke PCR-producten werd 20 afzonderlijk de sequentie bepaald. Gekloneerde sequentie van nieuw domein IV was als volgt {SEQ ID NO: 4): 25 30 35 1 0 1 060 2 - 28 - »

Deze sequentie werd middels willekeurige priming met 32P gemerkt.

VOORBEELD 5

5 HYRRTDISATTF, VAN RNA MF.T DE PRORF. VOOR NT F,TJW

NATRIUMKANAAL-3’-UTR

Met.10 pg totaal-RNA uit rat-hersenen, -ruggenmerg en -DRG werd een Northern-blot bereid. De blot werd met een 10 cRNA-probe uit de 3'-UTR gehybridiseerd. De 3'-UTR werd in pSP73-vector gekloneerd, het cRNA met gebruikmaking van een Trans Probe T-kit (Pharmacia Biotech) en 32P-UTP getranscribeerd. De blot werd gedurende 2 uur bij 65°C in een oplossing voorgehybridiseerd die 5xSSC, lx 15 Denhardt's oplossing, 0,5% SDS, 50 mM natriumfosfaat, pH 7,1, zalmsperma-DNA (1 mg/ml) en 50% formamide bevatte. Hybridisatie werd gedurende 18 uur bij 45°C in de bovenstaande oplossing uitgevoerd, behalve dat het zalmsperma bij een concentratie van 200 pg/ml werd 20 bijgevoegd en de met 32P gemerkte probe bij 7,5x10' cpm/ml oplossing werd toegevoegd. Vervolgens werd de blot bij kamertemperatuur driemaal bij 2xSSC en 0,1% SDS, eenmaal met 0,2xSSC en 0,1% SDS gedurende 20 min bij 65°C en eenmaal met 0,2xSSC, 0,1% SDS en 0,1% 25 natriumpyrofosfaat gedurende 20 min bij 65°C gewassen.

De blot werd na een belichting van 2 dagen op een Phospholmager (BioRad) geanalyseerd. De resultaten wezen erop dat er in hersenen alleen in de laan die RNA uit DRG bevatte, een bandsignaal van ~6,5 aanwezig was.

30 Vanwege de lagere abondantie van PN5-mRNA, zoals getoond middels het RT-PCR-experiment, was de band van 6,5 kb niet detecteerbaar in hersenen en ruggenmerg.

a n a oc o o - 29 - VOORBEELD 6

CONSTRUCT I F, & SCREENING VAN π DNA-BIBLIOTHEEK UIT RRT-DRG

Uit poly(A)+-RNA van normale volwassen Sprague-Dawley 5 mannetjesratten werd met gebruikmaking van het

Superscript Choice System (GIBCO BRL) een bibliotheek van voor EcoRI aangepast cDNA bereid. Middels sucrose-gradiëntfractionering zoals beschreven door Kieffer,

Gene 109, 115-119 (1991) werd cDNA (>4 kb) uitgekozen. ïo Daarna werd het cDNA in de Zap Express-vector -(Stratagene) geligeerd en met het Gigapack II XL-lambda-inpak-extract (Stratagene) ingepakt. Op vergelijkbare wijze werd een bibliotheek van DRG-cDNA van >2 kb gesynthetiseerd.

15 Middels filterhybridisatie met een met 32P gemerkte probe (rBIIa, basen 4637-5868 als volgt van Auld e.a., Neuron 1, 449-461 (1988)) werden fagen (3,5xl05) gescreend. Filters werden bij 42°C in 50% formamide, 5xSSPE, 5x Denhardt's oplossing, 0,5% SDS, 250 yg 20 gebroken, gedenatureerd zalmsperma-DNA/ml en 50 mM natriumfosfaat gehybridiseerd en bij 50°C in 0,5xSSC/0,l% SDS gewassen.

Southern-blots van met EcoRI gedigereerde plasmiden werden met de met 3~P gemerkte DNA-probe (SEQ ID NO: 4) 25 gehybridiseerd. Daarna werden de filters bij 42°C in 50% formamide, 6xSSC, 5x Denhardt's oplossing, 0,5% SDS en 100 yg gebroken, gedenatureerd zalmsperma-DNA/ml gehybridiseerd en werden bij 65°C in 0,lxSSC/0,l% SDS gewassen.

30 Positieve klonen werden met gebruikmaking van het

ExAssist/XLOLR-systeem (Stratagene) in vivo in pBK-CMV uitgeknipt.

1 01 0602 - 30 - VOORBEELD 7

KLONEN EN NUCT.EOTIDE-ANALYSE

cDNA-klonen 26.2 en 25.1 werden uit de bibliotheek van 5 DRG-cDNA van >4 kb geïsoleerd en kloon 1.18 werd uit de bibliotheek van DRG-cDNA van >2 kb geïsoleerd. Middels sequentie-analyse leek 26.2 een cDNA van volledige lengte te zijn dat voor een nieuw natriumkanaai codeerde en 25.1 strekte zich uit van domein II tot de 3'-UTR. io Elk had echter een deletie die de coderende regio inkortte. Kloon 1.18 had naast de C-terminus van de afgeleide aminozuursequentie van PN5 de 3'-ongetransleerde regio. Het construct in de expressie-vector, pBSTACIIr, bestond uit sequenties uit 26.2 en 15 1.18.

Met gebruikmaking van het GAP/Best Fit (GCG)-programma werd PN5-homologie met andere bekende natriumkanalen verkregen: 20 Kanaal % Vergelijkbaarheid % Gelijkenis PN3a 71 54 hPN3 71 55 PN4 71 53 25 PN4a 71 53 PN1 72 55 rat-hersentype I 72 55 rat-hersentype II 71 54 rat-hersentype III 71 54 30 rathartkanaal 73 56 ratskeletspierkanaal 71 53

Het stabiliseren van het PN5-CDNA van volledige lengte 35 A. Media. E. coli-celliinen en aroeiomstandiaheden: Groei van fragmenten van PN5 kon onder standaardomstandigheden worden bewerkstelligd; groei van plasmiden die constructen van PN5 van volledige lengte 40 bevatten (in pCIneo, pBSTAcIIr en andere vectoren) kon 1010602 - 31 - echter niet worden bewerkstelligd zonder toepassing van speciale groeimedia, omstandigheden en E. coli-stammen. Het volgende protocol bleek optimaal te zijn: (1) toepassing van E. coli STBL2TK voor primaire 5 transformatie na ligatie-reacties en voor grootschalige kweek; (2) vast medium was l/2x FM (zie beneden) plus lx LB (trypton, 1%, gist-extract, 0,5%, NaCl, 0,5%), plus 15 g agar/1, of lx FM plus l/2x LB; (3) vloeibaar medium was optimaal lx FM plus l/2x LB; (4) voor alle media ïo werd carbenicilline, 100 ug/ml, toegepast, aangezien het •minder snel dan ampicilline wordt gemetaboliseerd; (5) temperatuur voor groei hoort niet hoger dan 30°C, gewoonlijk 24-26°C te zijn; dit maakte langere groeiperioden dan normaliter gebruikt nodig, tussen 24 en 72 15 uur.

2x Invriesmedinm [Freezing Medium)(2x FM1 : PLHPCt 12, 6 g

Na;.Citraat 0,9 g

MgSOj · 7H-0 0,18 g 20 (NHJ,S04 1,8 g KH2P04 3,6 g

Glycerol 88 g H20 g.s. tot 1 1 2x FM en de resterende mediumcomponenten worden 25 afzonderlijk bereid, middels autoclaveren gesteriliseerd, naar ten minste 60°C afgekoeld en samengevoegd waardoor het uiteindelijke medium wordt gevormd. Carbenicilline wordt op 25 mg/ml H?0 bereid en middels filtratie gesteriliseerd. 2x FM werd voor het 30 eerst beschreven voor bereiding van ingevroren voorraden van bacteriële cellen (Practical Methods in Molecular Biology, Schleif, R.F. en Wensink, P.C., Springer-Verlag, New York (1981), p. 201-202).

35 B. Expressievecl·oren

Ten einde voor verhoogde stabiliteit van het cDNA van 1010602 - 32 - volledige lengte te zorgen, werd de oöcyt-expressie-vector pBSTAcIIr gemodificeerd om het plasmide-kopie-aantal te verminderen wanneer gegroeid in E. coli en om mogelijke doorleestranscriptie vanaf vectorsequenties te 5 verminderen die in toxische cryptische expressie van PN5-eiwit zou kunnen resulteren, Brosius, J., Gene 27, 151-160 (1984). pBSTAcIIr werd met PvuII gedigereerd.

Het fragment van 755 bp dat de T7-promotor, β-globine-5'-UTR, de multipele kloneringsplaats, ft-globine-3'-UTR io en T3-promotor bevatte, werd met het fragment van 3,6 kb geligeerd dat het replicatie-beginpunt, ampicilline-resistentie-gen, rrnBT;- en rrnBT;T2-transcriptie-terminatoren uit pKK232-8 bevatte, dat volledig met Smal gedigereerd en partieel met PvuII gedigereerd was en met 15 garnaaldarmfosfatase behandeld om zelfligatie te voorkomen. Het resulterende plasmide waarin de oriëntatie van het pBSTA-fragment zodanig is dat de T7-promotor zich proximaal van de rrnBT:-terminator bevindt, werd geïdentificeerd middels restrictie-20 inkaartbrenging en pHQ8 genoemd. Zoals het geval is met pBSTA, is de richting van transcriptie van het ampicilline-resistentie-gen en replicatie-beginpunt van pHQ8 tegengesteld aan die van de gen-expressiecassette en de aanwezigheid van de rrnBT;-promotor hoort enige 25 resterende doorlees vanaf de vector in de middels T7-promotor aangedreven expressiecassette te verminderen.

C. Assemblage van cDNA van volledige lengte voor expressie

Aangezien pBK-CMV.26.2 een deletie van 58 bp had 30 (corresponderend met bp 4346 tot en met 4403 van SEQ ID NO: 1) en de sequentie van pBK-CMV.1.18 op bp 4180 van SEQ ID NO: 1 begint, kon pBK-CMV.1.18 worden toegepast om pBK-CMV.26.2 te "repareren". Er werd een strategie ontwikkeld om in drie delen een cDNA van volledige 35 lengte uit klonen pBK-CMV.26.2 en pBK-CMV.1.18 te assembleren, en passant de 5'- en 3'-UTR's inkortend en 1010602 - 33 - unieke restrictieplaatsen aan de 5’- en 3'-uiteinden introducerend. Het 5'-uiteinde werd middels PCR uit 26.2 geproduceerd, de 5'-UTR inkortend middels het incorporeren van een Sall-plaats net stroomopwaarts van 5 het startcodon. Het centrale deel was een restrictie-fragment uit 26.2. Het 3'-uiteinde werd bereid middels overlap-PCR uit zowel 26.2 als 1.18 en het incorporeren van een Xbal-plaats net stroomafwaarts van het stop-codon. Deze delen werden op unieke restrictieplaatsen ïo gedigereerd en in pBSTAcIIr geassembleerd. Hoewel dit .construct een correcte sequentie leek te hebben, werden na herkloneren als een Sail- tot Xbal-fragment in pCIneo twee typen isolaten gevonden, één met een deletie en één met een insertie van 8 bp. Heronderzoek van de 15 pBSTAcIIr-kloon liet zien dat de sequentie in deze regio "gemengd" was, zodat de kloon zich moet hebben herrangschikt. De insertie van 8 bp werd als een herhaling van één van de leden van een duplicatie van 8 bp in de natuurlijke sequentie gevonden, een drievoudige 20 herhaling van 8 bp in het herrangschikte isolaat vormend. Talrijke kloneringspogingen leidden onvermijdelijk tot deze herrangschikking. Om in één van de herhalingen van 8 bp stille mutaties te introduceren, werd overlap-PCR toegepast en een fragment dat deze 25 regio bevatte, werd bijgevoegd toen de coderende regio van PN5 in HQ8, de versie van pBSTAcIIr van laag kopieaantal, werd geassembleerd ter verkrijging van plasmide HR-1. Deze sequentie bleek stabiel te zijn (zie Figuren 5A-E, SEQ ID NO: 5).

30 Het 5'-uiteinde-fragment werd middels PCR bereid met gebruikmaking van pBK-CMV.26.2-DNA als matrijs en primers 4 999 (CTTGGTCGACTCTAGATCAGGGTGAAGATGGAGGAG; Sall-plaats onderstreept, PN5-homologie cursief gedrukt, corresponderend met bp 58-77 van SEQ ID NO: 1, 35 initiatie-codon dik gedrukt) en 4927 (GGGTTCAATGTGGTTTTATCT, corresponderend met bp 1067 tot 1010602 - 34 - en met 1047 van SEQ ID NO: 1), gevolgd door gel-zuivering, digestie met Sail en Kpnl {KpnI-plaats op bp 1003-1008, SEQ ID NO: 1) en gelzuivering.

Het centrale fragment van 3,1 kb werd bereid middels 5 digestie van pBK-CMV.26.2-DNA met Kpnl en Aatll (Aatll-plaats op 4133-4138), gevolgd door gelzuivering.

Het 3’-uiteinde-fragment werd als volgt bereid: PCR met gebruikmaking van primers 4837 (TCTGGGAAGTTTGGAAG, corresponderend met bp 3613 tot en met 3629 van SEQ ID 10 NO: 1) en 4931 (GACCACGAAGGCTATGTTGAGG, corresponderend met bp 4239 tot en met 4218 van SEQ ID NO: 1) op pBK-CMV.26.2-DNA als matrijs leverde een fragment van 0,6 kb op. PCR met gebruikmaking van primers 4930 (CCTCAACATAGCCTTCGTGGTC, corresponderend met bp 4218 tot 15 en met 4239 van SEQ ID NO: 1) en 4929 (GTCTTCT AGATGAGGGTTCAGTCATTGTG. XbaI-plaatS onderstreept, PN5-homologie cursief gedrukt, corresponderend met bp 5386 tot en met 5365 van SEQ ID NO: 1, stopcodon dik gedrukt) op pBK-CMV.1.18-DNA als 20 matrijs leverde een fragment van 1,2 kb op, 7 bp van het stopcodon een Xbal-plaats introducerend. Aldus complementeert het 3’-uiteinde van het 4837-4931-fragment precies het 5'-uiteinde van het 4930-4929-fragment. Deze twee fragmenten werden middels gel 25 gezuiverd en een fractie van elk als matrijs in een PCR-reactie gecombineerd met gebruikmaking van primers 4928 (CAAGCCTTTGTGTTCGAC, corresponderend met bp 4084 tot en met 4101 van SEQ ID NO: 1) en 4929, ter verkrijging van een fragment van 1,3 kb. Dit fragment werd middels gel 30 gezuiverd, met Aatll en Xbal gedigereerd en het fragment van 1,2 kb middels gel gezuiverd.

Het 3'-uiteinde-fragment werd in met Aatll en Xbal gedigereerd pBSTAcIIr gekloneerd. Eén isolaat werd met Sail en Kpnl gedigereerd en met het 5’-uiteinde-fragment 35 geligeerd. Het resulterende plasmide werd, na sequentie-verificatie, met Kpnl en Aatll gedigereerd en met het 1010602 - 35 - centrale fragment van 3,1 kb geligeerd waardoor pBSTAcIIr. PN5 (kloon 21) werd gevormd. pBSTAdlr. PN5 (kloon 21) werd met Sail en Xbal gedigereerd waardoor het PN5-fragment van 5,3 kb werd vrijgegeven dat in met 5 Sail en Xbal gedigereerd pCIneoII werd gekloneerd. Meervoudige isolaten werden gevonden, waarvan GPII-1, waarvan de volledige sequentie werd bepaald, typisch was en een insertie van 8 bp bevatte. Deze CAGAAGAA, na bp 3994 van SEQ ID NO: 1, veranderde de directe herhaling ïo van deze sequentie op deze locatie in een drievoudige directe herhaling, een verschuiving in het leesraam veroorzakend. In een poging dit defect te repareren, werd pBSTAcIIr.PN5 (kloon 21) met Nhel (bp 2538-2543 SEQ ID NO: 1) en Xhol (bp 4828-4833, SEQ ID NO: 1) is gedigereerd ter verkrijging van een fragment van 6,2 kb en met Aatll en Xhol ter verkrijging van een fragment van 0,7 kb die met het uit digestie van pBK-CMV.26.2 met Aatll en Nhel resulterende fragment van 1,6 kb werden geligeerd. Hoewel geen isolaten werden gevonden die 20 volledig correct waren, had één isolaat, HA-4, slechts een enkelvoudige basenverandering, deletie van de C op bp 4827 (SEQ ID NO: 1) aangrenzend aan de Xhol-plaats.

Ten einde te voorkomen dat de herrangschikking van de insertie van 8 bp optrad, werden in de 5'-herhaling drie 25 stille mutaties geïntroduceerd en twee verdere mutaties in een reeks van T's zouden ook worden geïntroduceerd, zoals beneden getoond (bp 3982 tot en met 4014, SEQ ID NO: 1; mutatie-plaatsen onderstreept, herhalingen van 8 bp in natuurlijke sequenties cursief gedrukt):

30 natuurlijk GAC ATT TTT ATG ACA GAA GAA CAG AAG AAA TAT

Asp lie Phe Met Thr Glu Glu Gin Lys Lys Tyr

mutant GAC ATC TTC ATG ACT GAG GAG CAG AAG AAA TAT

Aangezien isolaat HA-4 de natuurlijke directe 35 herhalingssequentie had (in tegenstelling tot bv.

pBSTAcIIr.PN5 (kloon 21)) en de regio vlakbij het Xhol- 1010602 - 36 - plaatsdefect er niet bij betrokken zou zijn, werd het als matrijs-DNA voor de volgende PCR-reacties toegepast. Primer P5-3716S (CCGAAGCCAATGTAACATTAGTAATTACTCGTG, corresponderend met bp 3684 tot en met 3716, SEQ ID NO:

5 1) werd gepaard met primer P5-3969AS

(GQT CCT CAGT CATGAAGAT GT CTT GGC CAC CTAAC, corresponderend met bp 4003 tot en met 3969, SEQ ID NO: 1, gemuteerde basen.zijn onderstreept) ter verkrijging van een product van 320 bp. Primer P5-4017S 10 (GGCCAAGACATCTTQAT GAC£GAGGAGCAGAAGAAATAT TAC, corresponderend met bp 3976 tot en met 4017, SEQ ID NO: 1; gemuteerde basen zijn onderstreept) werd gepaard met primer P5-4247AS (CTCAAAGCAAAGACTTTGATGAGACACTCTATGG, corresponderend met bp 4280 tot en met 4247, SEQ ID NO: 15 1) ter verkrijging van een product van 305 bp. Het 3'- uiteinde van het fragment van 320 bp heeft aldus een exacte passing van 28 bp met het 5'-uiteinde van het fragment van 305 bp. De twee banden werden middels gel gezuiverd en een fractie van elk in een nieuwe PCR-20 reactie gecombineerd met primers P5-3716S en P5-4247AS ter verkrijging van een product van 597 bp dat middels T/A in vector pCRII werd gekloneerd. Isolaat HO-7 bleek de gewenste sequentie te hebben. Om het gemodificeerde PN5 van volledige lengte te assembleren, werd een 25 vierwegligatie uitgevoerd: de oöcyt-expressievector HQ-8 werd met Sail en Xbal gedigereerd ter verkrijging van een vectorfragment van 4,4 kb; GPII-1 werd met Sail en Mlul gedigereerd ter verkrijging van een fragment van 3,8 kb dat de 5'-helft van PN5 bevatte; HO-7 werd met 30 Mlul (bp 3866 tot en met 3871, SEQ ID NO: 1) en Aatll gedigereerd ter verkrijging van een fragment van 0,3 kb dat de mutante herhalingsregio van 8 bp van PN5 bevatte; GPII-1 werd met Aatll en Xbal gedigereerd ter verkrijging van het resterende 3'-gedeelte van 1,3 kb 35 van PN5. Een gedeelte van de ligatie-reactie werd naar E. coli Stable 2-cellen getransformeerd. Van de isolaten 1010602 - 37 - van 9,6 kb die allevier de fragmenten bevatten, werd van HR-1 de sequentie bepaald en gevonden dat het de gewenste sequentie van 5,4 kb had. Deze isolaten groeiden goed en vertoonden geen neiging zich te 5 herrangschikken. De sequentie van deze gemanipuleerde versie van PN5 wordt in Figuren 5A-E getoond (SEQ ID NO: 5) .

VOORBEELD 8 MENSELIJK PN5 10 • Uit een bibliotheek van menselijk grensstrengganglia (DRG)-cDNA is een kloon van 856 bp (Figuur 3A, SEQ ID NO: 3) geïsoleerd die zeer nauw verwant is met rat-PN5 met 79% gelijkenis voor de aminozuursequentie. De 15 menselijke PNF-sequentie omspant de regio tussen IIIS1 en tussendomein III/IV die de doorgang met snelle inactivering (i.e. IFM) omvat die binnen tussendomein III/IV is gelokaliseerd.

De bibliotheek van menselijk DRG-cDNA werd uit totaal-20 RNA van lumbale DRG 4 en 5 geconstrueerd dat willekeurig geprimed werd. cDNA van de eerste streng werd met Superscript II omgekeerd transcriptase (GIBCO BRL) en de synthese van de tweede streng met T4-DNA-polymerase gesynthetiseerd. Aan de uiteinden van de dubbelstrengs-25 cDNA's werden EcoRI-adapters geligeerd en de fragmenten in de ZAP II-vector (Stratagene) gekloneerd. De bibliotheek werd met probes van met digoxigenine gemerkt rat-PN3, rat-PNl en menselijk hart-hHl gescreend. Van positieve klonen werd de sequentie bepaald en vergeleken 30 met bekende mens- en ratnatriumkanaalsequenties. Alleen de voornoemde kloon werd als menselijke PN5-sequentie geïdentificeerd.

Kanaal % Vergelijkbaarheid % Gelijkenis

Menselijke Hersenen (HBA) 76 69

Menselijk Hart (hHl) 81 74 35 1010602 - 38 -

Menselijk Atypisch Hart 60 52

Menselijke Skeletspier 80 71

Menselijk Neuro-Endocrine 78 71

Menselijk PN3 77 70 5 Rat-PNl 79 72

Rat-PN3 78 71

Rat-PN4 78 70

Rat-PN5 86 79 10 Figuur 3B vergelijkt in de geschikte regio de aminozuursequentie van het hPN5-fragment met de rat-PN5-aminozuursequent ie.

VOORBEELD 9

WEEFSF.T.'VERDELING MTDDELS RT-PCR 15 Uit geanestheseerde, normale volwassen Sprague-Dawley-mannetjesratten werden hersenen, ruggenmerg, DRG, nodeuze ganglia, hogere cervicale ganglia, grote beenzenuw, hart en skeletspierweefsel geïsoleerd en werden bij -80°C bewaard. Uit elk weefsel werd met 20 gebruikmaking van RNAzol (Tel-Test, Ine.) RNA

geïsoleerd. Vanaf 500 ng RNA uit elk weefsel werd omgekeerd willekeurig geprimed cDNA getranscribeerd. De voorwaartse primer (CAGATTGTGTTCTCAGTACATTCC) en de omgekeerde primer (CCAGGTGTCTAACGAATAAATAGG) werden uit 25 de 3'-ongetransleerde regio ontworpen ter verkrijging van een fragment van 252 basenparen. De cyclusparameters waren: 94°C/2 min (denaturatie), 94°C/30 sec, 65°C/30 sec en 72°C/1 min (35 cycli) en 72°C/4 min. De reactie-producten werden op een agarose-gel van 4% geanalyseerd. 30 Een positieve controle en een controle zonder matrijs werden ook bijgevoegd. Om matrijs-uitvoerbaarheid aan te tonen, werd middels PCR ook cDNA uit elk weefsel vermeerderd met gebruikmaking van primers die specifiek waren voor giyceraldehyde-3-fosfaat-dehydrogenase, zoals 35 beschreven door Tso e.a., Nucleic Acid Res. 13, 2485-2502 (1985).

Weefselverdelingprofiel van rPN5 middels analyse van RNA uit gekozen ratweefsels middels RT-PCR was als 1 0 1 0602 - 39 - volgt:

Weefsel RT-PCR (35 cvcli)

Hersenen +

Ruggenmerg + 5 DRG +++

Nodeuze ganglia +++

Hogere cervicale ganglia + • Grote beenzenuw Hart ίο Skeletspier

Fll-onbehandeld +

Fll-behandeld + PN5 werd in dezelfde vijf weefsels als boven ook na slechts 25 cycli (24 + 1) in dezelfde relatieve 15 abondantie gedetecteerd.

VOORBEELD 10 ANTtT.TCHAMF.N

Een synthetisch peptide (26 aminozuren in tussendomein . II en III - residuen 977 tot en met 1002) werd aan KLH 20 geconjugeerd en antilichaam in konijnen opgewekt. Vervolgens werd het antiserum affiniteitgezuiverd.

PN5 vertegenwoordigt een subfamilie van nieuwe natriumkanaalgenen; deze genen zijn verschillend van die detecteerbaar met andere probes (bv. PEAF8- en PN3-25 probes).

Hoewel de voorgaande uitvinding bij wijze van illustratie en voorbeeld voor doeleinden van helderheid en begrip in enig detail is beschreven, zal het duidelijk zijn dat binnen de omvang van de aanhangige 30 conclusies bepaalde veranderingen en modificaties kunnen worden uitgevoerd.

1010602 - 40 -

SEQUENTTE-LIJST

(1) 1) ALGEMENE INFORMATIE: (i) AANVRAAGSTER:

(A) NAAM: F. HOFFMAN-LA ROCHE AG

(b) STRAAT: Grenzacherstrasse 124

(c) STAD: Basel (D) STAAT: BS

(e) LAND: Zwitserland (F) POSTCODE (ZIP): CH-4010 (G) TELEFOON: 061-6884256 (h) TELEFAX: 061-6881395 (i) TELEX: 962292/965542 hlr ch (ii) TITEL VAN UITVINDING: Nucleïnezuur dat voor een Zenuwweefselnatriumkanaal Codeert ( iii) AANTAL SEQUENTIES: 5 (iv) DOOR COMPUTER AFLEESBARE VORM: (A) MEDIUMTYPE: Floppydisk (B) COMPUTER: IBM-PC-compatibel

(C) BESTURINGSSYSTEEM: PC-DOS/MS-DOS

(D) SOFTWARE: Patentln Release # 1.0, Versie # 1.30 (2) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:i: (i) SEQUENTIE-KENMERKEN: (A) LENGTE: 5908 basenparen (B) TYPE: nucleïnezuur (C) STRENGVÓÓRKOMEN: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair

( i i) MOLECUULTY PE: cDNA

(iii) HYPOTHETISCH: NEE

(iv) ANTI-SENSE: NEE

(vi) OORSPRONKELIJKE BRON: (A) ORGANISME: rat (F) WEEFSELTYPE: grensstrengganglia (G) CELTYPE: perifere zenuw 1010602 - 41 - (xi) SEQUENTIE-BESCHRIJVING: SEQ ID NO: 1:

1 GAAGTCACAG GAGTGTCTGT CAGCGAGAGG AAGAAGGGAG AGTTTACTGA

51 GTGTCTTCTG CCCCTCCTCA GGGTGAAGAT GGAGGAGAGG TACTACCCGG 101 TGATCTTCCC GGACGAGCGG AATTTCCGCC CCTTCACTTC CGACTCTCTG

151 GCTGCCATAG AGAAGCGGAT TGCTATCCAA AAGGAGAGGA AGAAGTCCAA

201 AGACAAGGCG GCAGCTGAGC CCCAGCCTCG GCCTCAGCTT GACCTAAAGG

251 CCTCCAGGAA GTTACCTAAG CTTTATGGTG ACATTCCCCC TGAGCTTGTA

301 GCGAAGCCTC TGGAAGACCT GGACCCATTC TACAAAGACC ATAAGACATT

351 CATGGTGTTG AACAAGAAGA GAACAATTTA TCGCTTCAGC.GCCAAGCGGG

401 CCTTGTTCAT TCTGGGGCCT TTTAATCCCC TCAGAAGCTT AATGATTCGT

451 ATCTCTGTCC ATTCAGTCTT TAGCATGTTC ATCATCTGCA CGGTGATCAT

501 CAACTGTATG TTCATGGCGA ATTCTATGGA GAGAAGTTTC GACAACGACA

551 TTCCCGAATA CGTCTTCATT GGGATTTATA TTTTAGAAGC TGTGATTAAA

601 ATATTGGCAA GAGGCTTCAT TGTGGATGAG TTTTCCTTCC TCCGAGATCC

651 GTGGAACTGG CTGGACTTCA TTGTCATTGG AACAGCGATC GCAACTTGTT

701 TTCCGGGCAG CCAAGTCAAT CTTTCAGCTC TTCGTACCTT CCGAGTGTTC

751 AGAGCTCTGA AGGCGATTTC AGTTATCTCA GGTCTGAAGG TCATCGTAGG

801 TGCCCTGCTG CGCTCGGTGA AGAAGCTGGT AGACGTGATG GTCCTCACTC

851 TCTTCTGCCT CAGCATCTTT GCCCTGGTCG GTCAGCAGCT GTTCATGGGA

901 ATTCTGAACC AGAAGTGTAT TAAGCACAAC TGTGGCCCCA ACCCTGCATC

951 CAACAAGGAT TGCTTTGAAA AGGAAAAAGA TAGCGAAGAC TTCATAATGT

1001 GTGGTACCTG GCTCGGCAGC AGACCCTGTC CCAATGGTTC TACGTGCGAT

1051 AAAACCACAT TGAACCCAGA CAATAATTAT ACAAAGTTTG ACAACTTTGG

1101 CTGGTCCTTT CTCGCCATGT TCCGGGTTAT GACTCAAGAC TCCTGGGAGA

1151 GGCTTTACCG ACAGATCCTG CGGACCTCTG GGATCTACTT TGTCTTCTTC

1201 TTCGTGGTGG TCATCTTCCT GGGCTCCTTC TACCTGCTTA ACCTAACCCT

1251 GGCTGTTGTC ACCATGGCTT ATGAAGAACA GAACAGAAAT GTAGCTGCTG

1301 AGACAGAGGC CAAGGAGAAA ATGTTTCAGG AAGCCCAGCA GCTGTTAAGG

1351 GAGGAGAAGG AGGCTCTGGT TGCCATGGGA ATTGACAGAA GTTCCCTTAA

1401 TTCCCTTCAA GCTTCATCCT TTTCCCCGAA GAAGAGGAAG TTTTTCGGTA

1010602 - 42 -

1451 GTAAGACAAG AAAGTCCTTC TTTATGAGAG GGTCCAAGAC GGCCCAAGCC 1501 TCAGCGTCTG ATTCAGAGGA CGATGCCTCT AAAAATCCAC AGCTCCTTGA 1551 GCAGACCAAA CGACTGTCCC AGAACTTGCC AGTGGATCTC TTTGATGAGC 1601 ACGTGGACCC CCTCCACAGG CAGAGAGCGC TGAGCGCTGT CAGTATCTTA 1651 ACCATCACCA TGCAGGAACA AGAAAAATTC CAGGAGCCTT GTTTCCCATG 1701 TGGGAAAAAT TTGGCCTCTA AGTACCTGGT GTGGGACTGT AGCCCTCAGT 1751 GGCTGTGCAT AAAGAAGGTC CTGCGGACCA TCATGACGGA TCCCTTTACT 1801 GAGCTGGCCA TCACCATCTG CATCATCATC AATACCGTTT TCTTAGCCGT 1851 GGAGCACCAC AACATGGATG ACAACTTAAA GACCATACTG AAAATAGGAA 1901 ACTGGGTTTT CACGGGAATT TTCATAGCGG AAATGTGTCT CAAGATCATC 1951 GCGCTCGACC CTTACCACTA CTTCCGGCAC GGCTGGAATG TTTTTGACAG 2001 CATCGTGGCC CTCCTGAGTC TCGCTGATGT GCTCTACAAC ACACTGTCTG 2051 ATAACAATAG GTCTTTCTTG GCTTCCCTCA GAGTGCTGAG GGTCTTCAAG 2101 TTAGCCAAAT CCTGGCCCAC GTTAAACACT CTCATTAAGA TCATCGGCCA 2151 CTCCGTGGGC GCGCTTGGAA ACCTGACTGT GGTCCTGACT ATCGTGGTCT 2201 TCATCTTTTC TGTGGTGGGC ATGCGGCTCT TCGGCACCAA GTTTAACAAG 2251 ACCGCCTACG CCACCCAGGA GCGGCCCAGG CGGCGCTGGC ACATGGATAA 2301 TTTCTACCAC TCCTTCCTGG TGGTGTTCCG CATCCTCTGT GGGGAATGGA 2351 TCGAGAACAT GTGGGGCTGC ATGCAGGATA TGGACGGCTC CCCGTTGTGC 2401 ATCATTGTCT TTGTCCTGAT AATGGTGATC GGGAAGCTTG TGGTGCTTAA 2451 CCTCTTCATT GCCTTGCTGC TCAATTCCTT CAGCAATGAG GAGAAGGATG 2501 GGAGCCTGGA AGGAGAGACC AGGAAAACCA AAGTGCAGCT AGCCCTGGAT 2551 CGGTTCCGCC GGGCCTTCTC CTTCATGCTG CACGCTCTTC AGAGTTTTTG 2601 TTGCAAGAAA TGCAGGAGGA AAAACTCGCC AAAGCCAAAA GAGACAACAG 2651 AAAGCTTTGC TGGTGAGAAT AAAGACTCAA TCCTCCCGGA TGCGAGGCCC 2701 TGGAAGGAGT ATGATACAGA CATGGCTTTG TACACTGGAC AGGCCGGGGC 2751 TCCGCTGGCC CCACTCGCAG AGGTAGAGGA CGATGTGGAA TATTGTGGTG 2801 AAGGCGGTGC CCTACCCACC TCACAACATA GTGCTGGAGT TCAGGCCGGT

1010R02 - 43 -

2851 GACCTCCCTC CAGAGACCAA GCAGCTCACT AGCCCGGATG ACCAAGGGGT 2901 TGAAATGGAA GTATTTTCTG AAGAAGATCT GCATTTAAGC ATACAGAGTC 2951 CTCGAAAGAA GTCTGACGCA GTGAGCATGC TCTCGGAATG CAGCACAATT 3001 GACCTGAATG ATATCTTTAG AAATTTACAG AAAACAGTTT CCCCCAAAAA 3051 GCAGCCAGAT AGATGCTTTC CCAAGGGCCT TAGTTGTCAC TTTCTATGCC 3101 ACAAAACAGA CAAGAGAAAG TCCCCCTGGG TCCTGTGGTG GAACATTCGG 3151 AAAACCTGCT ACCAAATCGT GAAGCACAGC TGGTTTGAGA GTTTCATAAT 3201 CTTTGTTATT CTGCTGAGCA GTGGAGCGCT GATATTTGAA GATGTCAATC 3251 TCCCCAGCCG GCCCCAAGTT GAGAAATTAC TAAGGTGTAC CGATAATATT 3301 TTCACATTTA TTTTCCTCCT GGAAATGATC CTGAAGTGGG TGGCCTTTGG 3351 ATTCCGGAGG TATTTCACCA GTGCCTGGTG CTGGCTTGAT TTCCTCATTG 3401 TGGTGGTGTC TGTGCTCAGT CTCATGAATC TACCAAGCTT GAAGTCCTTC 3451 CGGACTCTGC GGGCCCTGAG ACCTCTGCGG GCGCTGTCCC AGTTTGAAGG 3501 AATGAAGGTT GTCGTCTACG CCCTGATCAG CGCCATACCT GCCATTCTCA 3551 ATGTCTTGCT GGTCTGCCTC ATTTTCTGGC TCGTATTTTG TATCTTGGGA 3601 GTAAATTTAT TTTCTGGGAA GTTTGGAAGG TGCATTAACG GGACAGACAT 3651 AAATATGTAT TTGGATTTTA CCGAAGTTCC GAACCGAAGC CAATGTAACA 3701 TTAGTAATTA CTCGTGGAAG GTCCCGCAGG TCAACTTTGA CAACGTGGGG 3751 AATGCCTATC TCGCCCTGCT GCAAGTGGCA ACCTATAAGG GCTGGCTGGA 3801 AATCATGAAT GCTGCTGTCG ATTCCAGAGA GAAAGACGAG CAGCCGGACT 3851 TTGAGGCGAA CCTCTACGCG TATCTCTACT TTGTGGTTTT TATCATCTTC 3901 GGCTCCTTCT TTACCCTGAA CCTCTTTATC GGTGTTATTA TTGACAACTT 3951 CAATCAGCAG CAGAAAAAGT TAGGTGGCCA AGACATTTTT ATGACAGAAG 4001 AACAGAAGAA ATATTACAAT GCAATGAAAA AGTTAGGAAC CAAGAAACCT 4051 CAAAAGCCCA TCCCAAGGCC CCTGAACAAA TGTCAAGCCT TTGTGTTCGA 4101 CCTGGTCACA AGCCAGGTCT TTGACGTCAT CATTCTGGGT CTTATTGTCT 4151 TAAATATGAT TATCATGATG GCTGAATCTG CCGACCAGCC CAAAGATGTG

1010602 - 44 -

4201 AAGAAAACCT TTGATATCCT CAACATAGCC TTCGTGGTCA TCTTTACCAT 4251 AGAGTGTCTC ATCAAAGTCT TTGCTTTGAG GCAACACTAC TTCACCAATG 4301 GCTGGAACTT ATTTGATTGT GTGGTCGTGG TTCTTTCTAT CATTAGTACC 4351 CTGGTTTCCC GCTTGGAGGA CAGTGACATT TCTTTCCCGC CCACGCTCTT 4401 CAGAGTCGTC CGCTTGGCTC GGATTGGTCG AATCCTCAGG CTGGTCCGGG 4451 CTGCCCGGGG AATCAGGACC CTCCTCTTTG CTTTGATGAT GTCTCTCCCC 4 501 TCTCTCTTCA ACATCGGTCT GCTGCTCTTC CTGGTGATGT' TCATTTACGC 4551 CATCTTTGGG ATGAGCTGGT TTTCCAAAGT GAAGAAGGGC TCCGGGATCG 4601 ACGACATCTT CAACTTCGAG ACCTTTACGG GCAGCATGCT GTGCCTCTTC 4651 CAGATAACCA CTTCGGCTGG CTGGGATACC CTCCTCAACC CCATGCTGGA 4701 GGCAAAAGAA CACTGCAACT CCTCCTCCCA AGACAGCTGT CAGCAGCCGC 4751 AGATAGCCGT CGTCTACTTC GTCAGTTACA TCATCATCTC CTTCCTCATC 4801 GTGGTCAACA TGTACATCGC TGTGATCCTC GAGAACTTCA ACACAGCCAC 4 851 GGAGGAGAGC GAGGACCCTC TGGGAGAGGA CGACTTTGAA ATCTTCTATG 4901 AGGTCTGGGA GAAGTTTGAC CCCGAGGCGT CGCAGTTCAT CCAGTATTCG 4951 GCCCTCTCTG ACTTTGCGGA CGCCCTGCCG GAGCCGTTGC GTGTGGCCAA 5001 GCCGAATAAG TTTCAGTTTC TAGTGATGGA CTTGCCCATG GTGATGGGCG 5051 ACCGCCTCCA TTGCATGGAT GTTCTCTTTG CTTTCACTAC CAGGGTCCTC 5101 GGGGACTCCA GCGGCTTGGA TACCATGAAA ACCATGATGG AGGAGAAGTT 5151 TATGGAGGCC AACCCTTTTA AGAAGCTCTA CGAGCCCATA GTCACCACCA 5201 CCAAGAGGAA GGAGGAGGAG CAAGGCGCCG CCGTCATCCA GAGGGCCTAC 5251 CGGAAACACA TGGAGAAGAT GGTCAAACTG AGGCTGAAGG ACAGGTCAAG 5301 TTCATCGCAC CAGGTGTTTT GCAATGGAGA CTTGTCCAGC TTGGATGTGG 5351 CCAAGGTCAA GGTTCACAAT GACTGAACCC TCATCTCCAC CCCTACCTCA 5401 CTGCCTCACA GCTTAGCCTC CAGCCTCTGG CGAGCAGGCG GCAGACTCAC 5451 TGAACACAGG CCGTTCGATC TGTGTTTTTG GCTGAACGAG GTGACAGGTT 5501 GGCGTCCATT TTTAAATGAC TCTTGGAAAG ATTTCATGTA GAGAGATGTT 5551 AGAAGGGACT GCAAAGGACA CCGACCATAA CGGAAGGCCT GGAGGACAGT

1010602 - 45 -

5601 CCAACTTACA TAAAGATGAG AAACAAGAAG GAAAGATCCC AGGAAAACTT 5651 CAGATTGTGT TCTCAGTACA TCCCCCAATG TGTCTGTTCG GTGTTTTGAG 5701 TATGTGACCT GCCACATGTA GCTCTTTTTT GCATGTACGT CAAAACCCTG 5751 CAGTAAGTTG ATAGCTTGCT ACGGGTGTTC CTACCAGCAT CACAGAATTG 5801 GGTGTATGAC TCAAACCTAA AAGCATGACT CTGACTTGTC AGTCAGCACC 5851 CCGACTTTCA GACGCTCCAA TCTCTGTCCC AGGTGTCTAA CGAATAAATA 5901 GGTAAAAG

(3) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:2: (i) SEQUENTIE-KENMERKEN: (A) LENGTE: 1765 aminzouren (B) TYPE: aminozuur (C) STRENGVÓÓRKOMEN: _ (D) TOPOLOGIE: niet relevant (ii) MOLECUULTYPE: eiwit

(iii) HYPOTHETISCH: JA

(vi) OORSPRONKELIJKE BRON: (A) ORGANISME: rat (F) WEEFSELTYPE: grensstrengganglia (G) CELTYPE: perifere zenuw (xi) SEQUENTIE-BESCHRIJVING: SEQ ID NO:2:

Met Glu Glu Arg Tyr Tyr Pro Val lie Phe Pro Asp Glu Arg Asn Phe 1 5 10 15

Arg Pro Phe Thr Ser Asp Ser Leu Ala Ala He Glu Lys Arg He Ala 20 25 30

He Gin Lys Glu Arg Lys Lys Ser Lys Asp Lys Ala Ala A.la Glu Pro 35 40 45

Gin Pro Arg Pro Gin Leu Asp Leu Lys Ala Ser Arg Lys Leu Pro Lys 50 55 60

Leu Tyr Gly Asp He Pro Pro Glu Leu Val' Ala -Lys Pro Leu Glu Asp 65 70 75 80

Leu Asp Pro Phe Tyr Lys Asp His Lys Thr Phe Met Val Leu Asn Lys 85 90 95

Lys Arg Thr He Tyr Arg Phe Ser Ala Lys Arg Ala Leu Phe He Leu 100 105 110 1010602 - 46 -

Gly Pro Phe Asn Pro Leu Arg Ser Leu Met He Arg lie Ser Val His 115 120 125

Ser Val Phe Ser Met Phe He lie Cys Thr Val He lie Asn Cys Met 130 135 140

Phe Met Ala Asn Ser Met Glu Arg Ser Phe Asp Asn Asp He Pro Glu 145 150 155 160

Tyr Val Phe He Gly He Tyr lie Leu Glu Ala Val He Lys He Leu 165 170 175

Ala Arg Gly Phe He Val Asp Glu Phe Ser Phe Leu Arg Asp Pro Trp 180 185 190

Asn Trp Leu Asp Phe He Val He Gly Thr Ala He Ala Thr Cys Phe 195 200 205

Pro Gly Ser Gin Val Asn Leu Ser Ala Leu Arg Thr Phe Arg Val Phe 210 215 220

Arg Ala Leu Lys Ala He Ser Val He Ser Gly Leu Lys Val He Val 225 230 235 240

Gly Ala Leu Leu Arg Ser Val Lys Lys Leu Val A.sp Val Met Val Leu 245 250 255

Thr Leu Phe Cys Leu Ser He Phe Ala Leu Val Gly Gin Gin Leu Phe 260 265 270

Met Gly lie Leu Asn Gin Lys Cys He Lys His Asn Cys Gly Pro Asn 275 280 285

Pro Ala Ser Asn Lys Asp Cys Phe Glu Lys Glu Lys Asp Ser Glu Asp 290 295 300

Phe He Met Cys Gly Thr Trp Leu Gly Ser Arg Pro Cys Pro Asn Gly 305 310 315 320

Ser Thr Cys Asp Lys Thr Thr Leu Asn Pro Asp Asn Asn Tyr Thr Lys 325 330 335

Phe Asp Asn Phe Gly Trp Ser Phe Leu Ala Met Phe Arg Val Met Thr 340 345 350

Gin Asp Ser Trp Glu Arg Leu Tyr Arg Gin He Leu Arg Thr Ser Gly 355 360 365

He Tyr Phe Val Phe Phe Phe Val Val Val He Phe Leu Gly Ser Phe 370 375 380

Tyr Leu Leu Asn Leu Thr Leu Ala Val Val Thr Met A.la Tyr Glu Glu 385 390 395 400

Gin Asn Arg Asn Val Ala Ala Glu Thr Glu Ala Lys Glu Lys Met Phe 1 n 1 Π6 0 2 - 47 - 405 410 415

Gin Glu Ala Gin Gin Leu Leu Arg Glu Glu Lys Glu Ala Leu Val Ala 420 425 430

Met Gly lie Asp Arg Ser Ser Leu Asn Ser Leu Gin Ala Ser Ser Phe 435 440 445

Ser Pro Lys Lys Arg Lys Phe Phe Gly Ser Lys Thr Arg Lys Ser Phe 450 455 460

Phe Met Arg Gly Ser Lys Thr Ala Gin Ala Ser Ala Ser Asp Ser Glu 465 470 475 480

Asp Asp Ala Ser Lys Asn Pro Gin Leu Leu Glu Gin Thr Lys Arg Leu 485 490 495

Ser Gin Asn Leu Pro Val Asp Leu Phe Asp Glu His Val Asp Pro Leu 500 505 510

His Arg Gin Arg Ala Leu Ser Ala Val Ser He Leu Thr lie Thr Met 515 520 525

Gin Glu Gin Glu Lys Phe Gin Glu Pro Cys Phe Pro Cys Gly Lys Asn 530 535 540

Leu Ala Ser Lys Tyr Leu Val Trp Asp Cys Ser Pro Gin Trp Leu Cys 545 550 555 560

He Lys Lys Val Leu Arg Thr lie Met Thr Asp Pro Phe Thr Glu Leu 565 570 575

Ala He Thr He Cys He lie He Asn Thr Val Phe Leu Ala Val Glu 580 585 590

His His Asn Met Asp Asp Asn Leu Lys Thr He Leu Lys He Gly Asn 595 600 605

Trp Val Phe Thr Gly He Phe He Ala Glu Met Cys Leu Lys He lie 610 615 620

Ala Leu Asp Pro Tyr His Tyr Phe Arg His Gly Trp Asn Val Phe Asp 625 630 635 640

Ser He Val Ala Leu Leu Ser Leu A.la Asp Val Leu Tyr Asn Thr Leu 645 650 655

Ser Asp Asn A.sn Arg Ser Phe Leu A.la Ser Leu Arg Val Leu Arg Val 660 665 670

Phe Lys Leu Ala Lys Ser Trp Pro Thr Leu Asn Thr Leu He Lys He 675 680 685

He Gly His Ser Val Gly Ala Leu Gly Asn Leu Thr Val Val Leu Thr 690 695 700 1 m 06 G 2 - 48 - lie Val Val Phe lie Phe Ser Val Val Gly Met Arg Leu Phe Gly Thr 705 710 715 720

Lys Phe Asn Lys Thr Ala Tyr Ala Thr Gin Glu Arg Pro Arg Arg Arg 725 730 735

Trp His Met Asp Asn Phe Tyr His Ser Phe Leu Val Val Phe Arg lie 740 745 750

Leu Cys Gly Glu Trp lie Glu Asn Met Trp Gly Cys Met Gin Asp Met 755 760 765

Asp Gly Ser Pro Leu Cys He lie Val Phe Val Leu He Met Val He 770 775 780

Gly Lys Leu Val Val Leu Asn Leu Phe He Ala Leu Leu Leu Asn Ser 785 790 795 800

Phe Ser Asn Glu Glu Lys Asp Gly Ser Leu Glu Gly Glu Thr Arg Lys 805 810 815

Thr Lys Val Gin Leu Ala Leu Asp Arg Phe Arg Arg Ala Phe Ser Phe 820 825 830

Met Leu His Ala Leu Gin Ser Phe Cys Cys Lys Lys Cys Arg Arg Lys 835 840 845

Asn Ser Pro Lys Pro Lys Glu Thr Thr Glu Ser Phe Ala Gly Glu Asn 850 855 860

Lys Asp Ser lie Leu Pro Asp Ala Arg Pro Trp Lys Glu Tyr Asp Thr 865 870 875 880

Asp Met Ala Leu Tyr Thr Gly Gin Ala Gly Ala Pro Leu Ala Pro Leu 885 890 895

Ala Glu Val Glu Asp Asp Val Glu Tyr Cys Gly Glu Gly Gly Ala Leu 900 905 910

Pro Thr Ser Gin His Ser Ala Gly Val Gin Ala Gly Asp Leu Pro Pro 915 920 925

Glu Thr Lys Gin Leu Thr Ser Pro Asp Asp Gin Gly Val Glu Met Glu 930 935 940

Val Phe Ser Glu Glu Asp Leu His Leu Ser lie Gin Ser Pro Arg Lys 945 950 955 960

Lys Ser Asp Ala Val Ser Met Leu Ser Glu Cys Ser Thr He Asp Leu 965 970 975

Asn Asp He Phe Arg Asn Leu Gin Lys Thr Val Ser Pro Lys Lys Gin 980 985 990

Pro Asp Arg Cys Phe Pro Lys Gly Leu Ser Cys His Phe Leu Cys His 1010602 - 49 - 995 1000 1005

Lys Thr Asp Lys Arg Lys Ser Pro Trp Val Leu Trp Trp Asn lie Arg 1010 1015 1020

Lys Thr Cys Tyr Gin lie Val Lys His Ser Trp Phe Glu Ser Phe lie 1025 1030 1035 1040 lie Phe Val lie Leu Leu Ser Ser Gly Ala Leu lie Phe Glu Asp Val 1045 1050 1055

Asn Leu Pro Ser Arg Pro Gin Val Glu Lys Leu Leu Arg Cys Thr Asp 1060 1065 1070.

Asn lie Phe Thr Phe He Phe Leu Leu Glu Met lie Leu Lys Trp Val 1075 1080 1085

Ala Phe Gly Phe Arg Arg Tyr Phe Thr Ser Ala Trp Cys Trp Leu Asp 1090 1095 1100

Phe Leu He Val Val Val Ser Val Leu Ser Leu Met Asn Leu Pro Ser 1105 1110 1115 1120

Leu Lys Ser Phe Arg Thr Leu Arg Ala Leu Arg Pro Leu Arg Ala Leu 1125 1130 1135

Ser Gin Phe Glu Gly Met Lys Val Val Val Tyr Ala Leu He Ser Ala 1140 1145 1150

He Pro Ala lie Leu Asn Val Leu Leu Val Cys Leu He Phe Trp Leu 1155 1160 1165

Val Phe Cys He Leu Gly Val Asn Leu Phe Ser Gly Lys Phe Gly Arg 1170 1175 1180

Cys He Asn Gly Thr Asp He Asn Met Tyr Leu Asp Phe Thr Glu Val 1185 1190 1195 1200

Pro Asn Arg Ser Gin Cys Asn He Ser Asn Tyr Ser Trp Lys Val Pro 1205 1210 1215

Gin Val Asn Phe Asp Asn Val Gly Asn Ala Tyr Leu Ala Leu Leu Gin 1220 1225 1230

Val Ala Thr Tyr Lys Gly Trp Leu Glu He Met Asn A.la Ala Val Asp 1235 1240 1245

Ser Arg Glu Lys Asp Glu Gin Pro Asp Phe Glu A.la Asn Leu Tyr A.la 1250 1255 1260

Tyr Leu Tyr Phe Val Val Phe He lie Phe Gly Ser Phe Phe Thr Leu 1265 1270 1275 1280

Asn Leu Phe He Gly Val He He Asp Asn Phe Asn Gin Gin Gin Lys 1285 1290 1295 1 n 1 nfio? - 50 -

Lys Leu Gly Gly Gin Asp lie Phe Met Thr Glu Glu Gin Lys Lys Tyr 1300 . 1305 1310

Tyr Asn Ala Met Lys Lys Leu Gly Thr Lys Lys Pro Gin Lys Pro lie 1315 1320 1325

Pro Arg Pro Leu Asn Lys Cys Gin Ala Phe Val Phe Asp Leu Val Thr 1330 1335 1340

Ser Gin Val Phe Asp Val He lie Leu Gly Leu He Val Leu Asn Met 1345 1350 1355 1360

He lie Met Met Ala Glu Ser Ala Asp Gin Pro Lys Asp Val Lys Lys 1365 1370 1375

Thr Phe Asp He Leu Asn lie Ala Phe Val Val He Phe Thr He Glu 1380 1385 1390

Cys Leu He Lys Val Phe Ala Leu Arg Gin His Tyr Phe Thr Asn Gly 1395 1400 1405

Trp Asn Leu Phe Asp Cys Val Val Val Val Leu Ser He He Ser Thr 1410 1415 1420

Leu Val Ser Arg Leu Glu Asp Ser Asp He Ser Phe Pro Pro Thr Leu 1425 1430 1435 1440

Phe Arg Val Val Arg Leu Ala Arg lie Gly Arg He Leu Arg Leu Val 1445 1450 1455

Arg Ala Ala Arg Gly He Arg Thr Leu Leu Phe Ala Leu Met Met Ser 1460 1465 1470

Leu Pro Ser Leu Phe Asn He Gly Leu Leu Leu Phe Leu Val Met Phe 1475 1480 1485

He Tyr Ala He Phe Gly Met Ser Trp Phe Ser Lys Val Lys Lys Gly 1490 1495 1500

Ser Gly He Asp Asp He Phe Asn Phe Glu Thr Phe Thr Gly Ser Met 1505 1510 1515 1520

Leu Cys Leu Phe Gin He Thr Thr Ser Ala Gly Trp Asp Thr Leu Leu 1525 1530 1535

Asn Pro Met Leu Glu Ala Lys Glu His Cys Asn Ser Ser Ser Gin Asp 1540 1545 1550

Ser Cys Gin Gin Pro Gin He Ala Val Val Tyr Phe Val Ser Tyr He 1555 1560 1565

He He Ser Phe Leu lie Val Val A.sn Met Tyr lie Ala Val He Leu 1570 1575 1580

Glu Asn Phe Asn Thr Ala Thr Glu Glu Ser Glu Asp Pro Leu Gly Glu 1010602 - 51 - 1585 1590 1595 1600

Asp Asp Phe Glu lie Phe Tyr Glu Val Trp Glu Lys Phe Asp Pro Glu 1605 1610 1615

Ala Ser Gin Phe He Gin Tyr Ser Ala Leu Ser Asp Phe Ala Asp Ala 1620 1625 1630

Leu Pro Glu Pro Leu Arg Val Ala Lys Pro Asn Lys Phe Gin Phe Leu 1635 1640 1645

Val Met Asp Leu Pro Met Val Met Gly Asp Arg Leu His Cys Met Asp 1650 1655 1660

Val Leu Phe Ala Phe Thr Thr Arg Val Leu Gly Asp Ser Ser Gly Leu 1665 1670 1675 1680

Asp Thr Met Lys Thr Met Met Glu Glu Lys Phe Met Glu Ala Asn Pro 1685 1690 1695

Phe Lys Lys Leu Tyr Glu Pro lie Val Thr Thr Thr Lys Arg Lys Glu 1700 1705 1710

Glu Glu Gin Gly Ala Ala Val He Gin Arg Ala Tyr Arg Lys His Met 1715 1720 1725

Glu Lys Met Val Lys Leu Arg Leu Lys Asp Arg Ser Ser Ser Ser His 1730 1735 1740

Gin Val Phe Cys Asn Gly Asp Leu Ser Ser Leu Asp Val Ala Lys Val 1745 1750 1755 1760

Lys Val His Asn Asp 1765 (4) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:3: (i) SEQUENTIE-KENMERKEN: (A) LENGTE: 856 basenparen (B) TYPE: nucleïnezuur (C) STRENGVÓÓRKOMEN: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair

(ii) MOLECUULTYPE: cDNA

(iii) HYPOTHETISCH: NEE

(iv) ANTI-SENSE: NEE

(vi) OORSPRONKELIJKE BRON: (A) ORGANISME: mens (F) WEEFSELTYPE: grensstrengganglia (G) CELTYPE: perifere zenuw (xi) SEQUENTIE-BESCHRIJVING: SEQ ID NO:3: 1 0 1 06 0 2 - 52 -

1 GCTGAGCAGT GGGGCACTGA TATTTGAAGA TGTTCACCTT GAGAACCAAC 51 CCAAAATCCA AGAATTACTA AATTGTACTG ACATTATTTT TACACATATT

101 TTTATCCTGG AGATGGTACT AAAATGGGTA GCCTTCGGAT TTGGAAAGTA

151 TTTCACCAGT GCCTGGTGCT GCCTTGATTT CATCATTGTG ATTGTCTCTG

201 TGACCACCCT CATTAACTTA ATGGAATTGA AGTCCTTCCG GACTCTACGA

251 GCACTGAGGC CTCTTCGTGC GCTGTCCCAG TTTGAAGGAA TGAAGGTGGT

301 GGTCAATGCT CTCATAGGTG CCATACCTGC CATTCTGAAT GTTTTGCTTG

351 TCTGCCTCAT TTTCTGGCTC GTATTTTGTA TTCTGGGAGT ATACTTCTTT

401 TCTGGAAAAT TTGGGAAATG CATTAATGGA ACAGACTCAG TTATAAATTA

451 TACCATCATT ACAAATAAAA GTCAATGTGA AAGTGGCAAT TTCTCTTGGA

501 TCAACCAGAA AGTCAACTTT GACAATGTGG GAAATGCTTA CCTCGCTCTG

551 CTGCAAGTGG CAACATTTAA GGGCTGGATG GATATTATAT ATGCAGCTGT

601 TGATTCCACA GAGAAAGAAC AACAGCCAGA GTTTGAGAGC AATTCACTCG

651 GTTACATTTA CTTCGTAGTC TTTATCATCT TTGGCTCATT CTTCACTCTG

701 AATCTCTTCA TTGGCGTTAT CATTGACAAC TTCAACCAAC AGCAGAAAAA

751 GTTAGGTGGC CAAGACATTT TTATGACAGA AGAACAGAAG AAATACTATA

801 ATGCAATGAA AAAATTAGGA TCCAAAAAAC CTCAAAAACC CATTCCACGG

851 CCCGTT

1 0 1 060 2 - 53 - (5) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:4: (i) SEQUENTIE-KENMERKEN: (A) LENGTE: 702 basenparen (B) TYPE: nucleïnezuur (C) STRENGVÓÓRKOMEN: enkelvoudig (D) TOPOLOGIE: lineair

(ii) MOLECUULTYPE: RT-PCR

(A) BESCHRIJVING:/desc = "DNA-probe/domein IV"

(iii) HYPOTHETISCH: NEE

(iv) ANTI-SENSE: NEE

(vi) OORSPRONKELIJKE BRON: (A) ORGANISME: rat (F) WEEFSELTYPE: grensstrengganglia (G) CELTYPE: perifere zenuw (xi) SEQUENTIE-BESCHRIJVING: SEQ ID NO:4:

1 CTCAACATGG TTACGATGAT GGTGGAGACC GACGAGCAGG' GCGAGGAGAA 51 GACGAAGGTT CTGGGCAGAA TCAACCAGTT CTTTGTGGCC GTCTTCACGG 101 GCGAGTGTGT GATGAAGATG TTCGCCCTGC GACAGTACTA TTTCACCAAC 151 GGCTGGAACG TGTTCGACTT CATAGTGGTG ATCCTGTCCA TTGGGAGTCT

2 01 GCTGTTTCT GCAATCCTTA AGTCACTGGA AAACTACTTC TCCCCGACGC 251 TCTTCCGGGT CATCCGTCTG GCCAGGATCG GCCGCATCCT CAGGCTGATC

3 01 CGAGCAGCCA AGGGGATTCG CACGCTGCTC TTCGCCCTCA TGATGTCCCT

3 51 GCCCGCCCTC TTCAACATCG GCCTCCTCCT CTTCCTCGTC ATGTTCATCT

4 01 ACTCCATCTT CGGCATGGCC AGCTTCGCTA ACGTCGTGGA CGAGGCCGGC 451 ATCGACGACA TGTTCAACTT CAAGACCTTT GGCAACAGCA TGCTGTGCCT 501 GTTCCAGATC ACCACCTCGG CCGGCTGGGA CGGCCTCCTC AGCCCCATCC 551 TCAACACGGG GCCTCCCTAC TGCGACCCCA ACCTGCCCAA CAGCAACGGC

6 01 TCCCGGGGGA ACTGCGGGAG CCCGGCGGTG GGCATCATCT TCTTCACCAC 651 CTACATCATC ATCTCCTTCC TCATCGTGGT CAACATGTAT ATCGCAGTCA

7 01 TC

(5) INFORMATIE VOOR SEQ ID NO:5: (i) SEQUENTIE-KENMERKEN: (A) LENGTE: 5334 basenparen (B) TYPE: nucleïnezuur (C) STRENGVÓÓRKOMEN: enkelvoudig 101060? - 54 -

(D) TOPOLOGIE: lineair (ii) MOLECUÜLTYPE: RT-PCR

(A) BESCHRIJVING: cDNA ( iii) HYPOTHETISCH: NEE

(iv) ANTI-SENSE: NEE

(vi) OORSPRONKELIJKE BRON: (A) ORGANISME: (F) WEEFSELTYPE: (G) CELTYPE: (XX) SEQUENTIE-BESCHRIJVING: SEQ ID NO:5:

1 GTCGACTCTA GATCAGGGTG AAGATGGAGG AGAGGTACTA CCCGGTGATC 51 TTCCCGGACG AGCGGAATTT CCGCCCCTTC ACTTCCGACT CTCTGGCTGC 101 CATAGAGAAG CGGATTGCTA TCCAAAAGGA GAGGAAGAAG TCCAAAGACA 151 AGGCGGCAGC TGAGCCCCAG CCTCGGCCTC AGCTTGACCT AAAGGCCTCC 201 AGGAAGTTAC CTAAGCTTTA TGGTGACATT CCCCCTGAGC TTGTAGCGAA 251 GCCTCTGGAA GACCTGGACC CATTCTACAA AGACCATAAG ACATTCATGG 301 TGTTGAACAA GAAGAGAACA ATTTATCGCT TCAGCGCCAA GCGGGCCTTG 351 TTCATTCTGG GGCCTTTTAA TCCCCTCAGA AGCTTAATGA TTCGTATCTC 401 TGTCCATTCA GTCTTTAGCA TGTTCATCAT CTGCACGGTG ATCATCAACT 451 GTATGTTCAT GGCGAATTCT ATGGAGAGAA GTTTCGACAA CGACATTCCC 501 GAATACGTCT TCATTGGGAT TTATATTTTA GAAGCTGTGA TTAAAATATT 551 GGCAAGAGGC TTCATTGTGG ATGAGTTTTC CTTCCTCCGA GATCCGTGGA 601 ACTGGCTGGA CTTCATTGTC ATTGGAACAG CGATCGCAAC TTGTTTTCCG 651 GGCAGCCAAG TCAATCTTTC AGCTCTTCGT ACCTTCCGAG TGTTCAGAGC 701 TCTGAAGGCG ATTTCAGTTA TCTCAGGTCT GAAGGTCATC GTAGGTGCCC 751 TGCTGCGCTC GGTGAAGAAG CTGGTAGACG TGATGGTCCT CACTCTCTTC 801 TGCCTCAGCA TCTTTGCCCT GGTCGGTCAG CAGCTGTTCA TGGGAATTCT 851 GAACCAGAAG TGTATTAAGC ACAACTGTGG CCCCAACCCT GCATCCAACA 901 AGGATTGCTT TGAAAAGGAA AAAGATAGCG AAGACTTCAT AATGTGTGGT 951 ACCTGGCTCG GCAGCAGACC CTGTCCCAAT GGTTCTACGT GCGATAAAAC

'i c 'i -ί rs γί ('t n - 55 -

1001 CACATTGAAC CCAGACAATA ATTATACAAA GTTTGACAAC TTTGGCTGGT 1051 CCTTTCTCGC CATGTTCCGG GTTATGACTC AAGACTCCTG GGAGAGGCTT 1101 TACCGACAGA TCCTGCGGAC CTCTGGGATO TACTTTGTCT TCTTCTTCGT 1151 GGTGGTCATC TTCCTGGGCT CCTTCTACCT GCTTAACCTA ACCCTGGCTG 1201 TTGTCACCAT GGCTTATGAA GAACAGAACA GAAATGTAGC TGCTGAGACA 1251 GAGGCCAAGG AGAAAATGTT TCAGGAAGCC CAGCAGCTGT TAAGGGAGGA 1301 GAAGGAGGCT CTGGTTGCCA TGGGAATTGA CAGAAGTTGC CTTAATTCCC 1351 TTCAAGCTTC ATCCTTTTCC CCGAAGAAGA GGAAGTTTTT CGGTAGTAAG 1401 ACAAGAAAGT CCTTCTTTAT GAGAGGGTCC AAGACGGCCC AAGCCTCAGC 1451 GTCTGATTCA GAGGACGATG CCTCTAAAAA TCCACAGCTC CTTGAGCAGA 1501 CCAAACGACT GTCCCAGAAC TTGCCAGTGG ATCTCTTTGA TGAGCACGTG 1551 GACCCCCTCC ACAGGCAGAG AGCGCTGAGC GCTGTCAGTA TCTTAACCAT 1601 CACCATGCAG GAACAAGAAA AATTCCAGGA GCCTTGTTTC CCATGTGGGA 1651 AAAATTTGGC CTCTAAGTAC CTGGTGTGGG ACTGTAGCCC TCAGTGGCTG 1701 TGCATAAAGA AGGTCCTGCG GACCATCATG ACGGATCCCT TTACTGAGCT 1751 GGCCATCACC ATCTGCATCA TCATCAATAC CGTTTTCTTA GCCGTGGAGC 1801 ACCACAACAT GGATGACAAC TTAAAGACCA TACTGAAAAT AGGAAACTGG 1851 GTTTTCACGG GAATTTTCAT AGCGGAAATG TGTCTCAAGA TCATCGCGCT 1901 CGACCCTTAC CACTACTTCC GGCACGGCTG GAATGTTTTT GACAGCATCG 1951 TGGCCCTCCT GAGTCTCGCT GATGTGCTCT ACAACACACT GTCTGATAAC 2001 AATAGGTCTT TCTTGGCTTC CCTCAGAGTG CTGAGGGTCT TCAAGTTAGC 2051 CAAATCCTGG CCCACGTTAA ACACTCTCAT TAAGATCATC GGCCACTCCG 2101 TGGGCGCGCT TGGAAACCTG ACTGTGGTCC TGACTATCGT GGTCTTCATC 2151 TTTTCTGTGG TGGGCATGCG GCTCTTCGGC ACCAAGTTTA ACAAGACCGC 2201 CTACGCCACC CAGGAGCGGC CCAGGCGGCG CTGGCACATG GATAATTTCT 2251 ACCACTCCTT CCTGGTGGTG TTCCGCATCC TCTGTGGGGA ATGGATCGAG 2301 AACATGTGGG GCTGCATGCA GGATATGGAC GGCTCCCCGT TGTGCATCAT 2351 TGTCTTTGTC CTGATAATGG TGATCGGGAA GCTTGTGGTG CTTAACCTCT

1 G1 06 0 2 - 56 -

2401 TCATTGCCTT GCTGCTCAAT TCCTTCAGCA ATGAGGAGAA GGATGGGAGC 2451 CTGGAAGGAG AGACCAGGAA AACCAAAGTG CAGCTAGCCC TGGATCGGTT 2501 CCGCCGGGCC TTCTCCTTCA TGCTGCACGC TCTTCAGAGT TTTTGTTGCA 2551 AGAAATGCAG GAGGAAAAAC TCGCCAAAGC CAAAAGAGAC AACAGAAAGC 2601 TTTGCTGGTG AGAATAAAGA CTCAATCCTC CCGGATGCGA GGCCCTGGAA 2651 GGAGTATGAT ACAGACATGG CTTTGTACAC TGGACAGGCC GGGGCTCCGC 2701 TGGCCCCACT CGCAGAGGTA GAGGACGATG TGGAATATTG TGGTGAAGGC 2751 GGTGCCCTAC CCACCTCACA ACATAGTGCT GGAGTTCAGG CCGGTGACCT 2801 CCCTCCAGAG ACCAAGCAGC TCACTAGCCC GGATGACCAA GGGGTTGAAA 2851 TGGAAGTATT TTCTGAAGAA GATCTGCATT TAAGCATACA GAGTCCTCGA 2901 AAGAAGTCTG ACGCAGTGAG CATGCTCTCG GAATGCAGCA CAATTGACCT 2951 GAATGATATC TTTAGAAATT TACAGAAAAC AGTTTCCCCC AAAAAGCAGC 3001 CAGATAGATG CTTTCCCAAG GGCCTTAGTT GTCACTTTCT ATGCCACAAA 3051 ACAGACAAGA GAAAGTCCCC CTGGGTCCTG TGGTGGAACA TTCGGAAAAC 3101 CTGCTACCAA ATCGTGAAGC ACAGCTGGTT TGAGAGTTTC ATAATCTTTG 3151 TTATTCTGCT GAGCAGTGGA GCGCTGATAT TTGAAGATGT CAATCTCCCC 3201 AGCCGGCCCC AAGTTGAGAA ATTACTAAGG TGTACCGATA ATATTTTCAC 3251 ATTTATTTTC CTCCTGGAAA TGATCCTGAA GTGGGTGGCC TTTGGATTCC 3301 GGAGGTATTT CACCAGTGCC TGGTGCTGGC TTGATTTCCT CATTGTGGTG 2251 GTGTCTGTGC TCAGTCTCAT GAATCTACCA AGCTTGAAGT CCTTCCGGAC 3401 TCTGCGGGCC CTGAGACCTC TGCGGGCGCT GTCCCAGTTT GAAGGAATGA 3451 AGGTTGTCGT CTACGCCCTG ATCAGCGCCA TACCTGCCAT TCTCAATGTC 3501 TTGCTGGTCT GCCTCATTTT CTGGCTCGTA TTTTGTATCT TGGGAGTAAA 3551 TTTATTTTCT GGGAAGTTTG GAAGGTGCAT TAACGGGACA GACATAAATA 3601 TGTATTTGGA TTTTACCGAA GTTCCGAACC GAAGCCAATG TAACATTAGT 3651 AATTACTCGT GGAAGGTCCC GCAGGTCAAC TTTGACAACG TGGGGAATGC 3701 CTATCTCGCC CTGCTGCAAG TGGCAACCTA TAAGGGCTGG CTGGAAATCA 3751 TGAATGCTGC TGTCGATTCC AGAGAGAAAG ACGAGCAGCC GGACTTTGAG

1 0 1 06 n ? - 57 -

3801 GCGAACCTCT ACGCGTATCT CTACTTTGTG GTTTTTATCA TCTTCGGCTC 3851 CTTCTTTACC CTGAACCTCT TTATCGGTGT TATTATTGAC AACTTCAATC 3901 AGCAGCAGAA AAAGTTAGGT GGCCAAGACA T£TT£ATGAC £GAGGA£CAG 3951 AAGAAATATT ACAATGCAAT GAAAAAGTTA GGAACCAAGA AACCTCAAAA 4001 GCCCATCCCA AGGCCCCTGA ACAAATGTCA AGCCTTTGTG TTCGACCTGG 4051 TCACAAGCCA GGTCTTTGAC GTCATCATTC TGGGTCTTAT TGTCTTAAAT 4101 ATGATTATCA TGATGGCTGA ATCTGCCGAC CAGCCCAAAG ATGTGAAGAA 4151 AACCTTTGAT ATCCTCAACA TAGCCTTCGT GGTCATCTTT ACCATAGAGT 4201 GTCTCATCAA AGTCTTTGCT TTGAGGCAAC ACTACTTCAC CAATGGCTGG 4251 AACTTATTTG ATTGTGTGGT CGTGGTTCTT TCTATCATTA GTACCCTGGT 4301 TTCCCGCTTG GAGGACAGTG ACATTTCTTT CCCGCCCACG CTCTTCAGAG 4351 TCGTCCGCTT GGCTCGGATT GGTCGAATCC TCAGGCTGGT CCGGGCTGCC 4401 CGGGGAATCA GGACCCTCCT CTTTGCTTTG ATGATGTCTC TCCCCTCTCT 4451 CTTCAACATC GGTCTGCTGC TCTTCCTGGT GATGTTCATT TACGCCATCT 4501 TTGGGATGAG CTGGTTTTCC AAAGTGAAGA AGGGCTCCGG GATCGACGAC 4551 ATCTTCAACT TCGAGACCTT TACGGGCAGC ATGCTGTGCC TCTTCCAGAT 4601 AACCACTTCG GCTGGCTGGG ATACCCTCCT CAACCCCATG CTGGAGGCAA 4651 AAGAACACTG CAACTCCTCC TCCCAAGACA GCTGTCAGCA GCCGCAGATA 4701 GCCGTCGTCT ACTTCGTCAG TTACATCATC ATCTCCTTCC TCATCGTGGT 4751 CAACATGTAC ATCGCTGTGA TCCTCGAGAA CTTCAACACA GCCACGGAGG 4801 AGAGCGAGGA CCCTCTGGGA GAGGACGACT TTGAAATCTT CTATGAGGTC 4851 TGGGAGAAGT TTGACCCCGA GGCGTCGCAG TTCATCCAGT ATTCGGCCCT 4901 CTCTGACTTT GCGGACGCCC TGCCGGAGCC GTTGCGTGTG GCCAAGCCGA 4951 ATAAGTTTCA GTTTCTAGTG ATGGACTTGC CCATGGTGAT GGGCGACCGC 5001 CTCCATTGCA TGGATGTTCT CTTTGCTTTC ACTACCAGGG TCCTCGGGGA 5051 CTCCAGCGGC TTGGATACCA TGAAAACCAT GATGGAGGAG AAGTTTATGG 5101 AGGCCAACCC TTTTAAGAAG CTCTACGAGC CCATAGTCAC CACCACCAAG 5151 AGGAAGGAGG AGGAGCAAGG CGCCGCCGTC ATCCAGAGGG CCTACCGGAA

1 0 1 Ofifi ? - 58 -

5201 ACACATGGAG AAGATGGTCA AACTGAGGCT GAAGGACAGG TCAAGTTCAT 5251 CGCACCAGGT GTTTTGCAAT GGAGACTTGT CCAGCTTGGA TGTGGCCAAG 5301 GTCAAGGTTC ACAATGACTG AACCCTCATC TAGA

1010602

Claims (22)

1. Een geïsoleerde DNA-sequentie die de in SEQ ID NO:l OF SEQ ID NO:3 uiteengezette nucleotide- 5 sequentie omvat.

2. Het DNA van conclusie 1 waarin genoemde DNA-sequentie voor een natriumkanaal-eiwit of fragment daarvan codeert.

3. Het DNA van conclusie 2 waarin genoemd natrium- ïo kanaal-eiwit de α-subeenheid of fragment daarvan is.

4. Het DNA van conclusie 3 waarin genoemd natriumkanaal-eiwit tetrodotoxine-resistent is.

5. Het DNA van conclusie 3 of 4 waarin genoemd 15 natriumkanaal-eiwit in zoogdieren wordt gevonden.

6. Het DNA van conclusie 3 of 4 waarin genoemd natriumkanaal-eiwit in de rat wordt gevonden.

7. Het DNA van conclusie 3 of 4 waarin genoemd natriumkanaal-eiwit in de mens wordt gevonden.

8. Het DNA van conclusie 1 waarin genoemd DNA cDNA is.

9. Het DNA van conclusie 1 waarin genoemd DNA synthetisch DNA is.

10. Expressievectoren die het DNA van conclusie 8 25 omvatten.

11. Expressievectoren die het synthetische DNA van conclusie 9 omvatten.

12. Gastheercellen die met de expressievectoren van conclusie 10 zijn getransformeerd.

13. Gastheercellen die met de expressievectoren van conclusie 11 zijn getransformeerd.

14. Een recombinant polynucleotide dat een aan de DNA-sequentie van conclusie 1 ontleende nucleïnezuur-sequentie omvat.

15. Een natriumkanaal-eiwit dat door een DNA van conclusies 1 tot en met 9 of allelvarianten 1 01 0602 - 60 - daarvan wordt gecodeerd.

16. Een tetrodotoxine-resistent natriumkanaal-eiwit dat door een DNA van conclusies 1 tot en met 9 of allelvarianten daarvan wordt gecodeerd.

17. Het eiwit van conclusie 16 met de in SEQ ID NO:2 uiteengezette aminozuursequentie.

18. Een werkwijze voor het identificeren van remmers van'tetrodotoxine-resistent natriumkanaal-eiwit, die het in contact brengen omvat van een 10 verbinding waar van vermoed wordt dat zij genoemde remmer is, met natriumkanaal-eiwit van conclusie 16 en het meten van de activiteit van genoemd tot expressie gebracht natriumkanaal-eiwit.

19. Poly- en/of monoklonale antilichamen die zijn 15 opgewekt tegen een tetrodotoxine-resistent natriumkanaal-eiwit dat door een DNA van conclusies 1 tot en met 9 of allelvarianten daarvan wordt gecodeerd.

20. Een diagnostische kit die een polynucleotide van 20 conclusie 14 omvat dat in staat is tot het specifiek hybridiseren met een tetrodotoxine-resistent natriumkanaal-eiwit of fragment daarvan.

21. De toepassing van een geïsoleerde DNA-sequentie van conclusies 1 tot en met 9 voor het 25 identificeren van een verbinding waar van vermoed wordt dat zij een remmer van tetrodotoxine-resistent natriumkanaal-eiwit is.

22. De uitvinding in hoofdzaak zoals hierboven beschreven, in het bijzonder met betrekking tot de 30 voorgaande voorbeelden. 1010602 Fig· 1A: SEQ Π) N0:1