MXPA99001462A

MXPA99001462A - Inmunoglobulina humanizada reactiva con (alfa4beta7) integrina

Info

Publication number: MXPA99001462A
Application number: MXPA/A/1999/001462A
Authority: MX
Inventors: Paul D Ponath; Douglas J Ringler; S Tarran Jones; Walter Newman; Jose Saldanha; Mary M Bendig
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-08-15
Filing date: 1999-02-11
Publication date: 1999-07-06

Abstract

La presente invención se refiere a inmunoglobulinas humanizadas que tienen especificidad de unión por la integrina alfa4beta7, consistentes en una región de unión a antígeno de origen no humano (por ejemplo, de roedor) y al menos una porción de una inmunoglobulina de origen humano (por ejemplo, una región de marco humana, una región constante humana). En una realización, la inmunoglobulina humanizada puede competir con Act-1 murino por la unión a la integrina alfa4beta7 humana. En una realización preferida, la región de unión a antígeno de lainmunoglobulina humanizada consiste en cada una de las regiones determinantes de complementariedad de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo Act-1 murino. La presente invención se relaciona también con una cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, conácidos nucleicos aislados consistentes en una secuencia que codifica para una inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina humanizada de la presente invención (por ejemplo, un anticuerpo de una sola cadena), con constructos consistentes en unácido nucleico de la presente invención y con células huésped que contienen unácido nucleico de la presente invenciónútiles en un método de preparación de una inmunoglobulina humanizada. Las inmunoglobulinas humanizadas pueden ser usadas en aplicaciones diagnosticas y terapéuticas en humanos, por ejemplo para controlar la infiltración (incluyendo el reclutamiento y/o la acumulación) linfocitaria del tejido mucosal.

Description

INMI OGLOBULINA HUMANIZADA REACTIVA CON 0c4ß7 INTEGRINA Antecedentes Los receptores de integrina son importantes para regular tanto la recirculación de linfocitos como su reclutamiento a sitios de inflamación (Carlos, T.M. y Harían, J.M. , Blood, 84:2068-2101 (1994)). La integrina a4ß7 humana tiene varios ligandos, uno de los cuales es la adresina vascular de mucosas MAdCAM-1 (Berlin, C. y col., Cell 74:185-195 (1993); Erle, D.J. y col. J. Immunol . 153:517-528 (1994)), expresada en vénulas altamente endoteliales de los nodulos linfáticos mesentéricos y en las placas de Peyer (Streeter, P.R. y col., Nature 331:41-46 (1988)). Como tal, la integrina a4ß7 actúa como receptor de guía que media en la migración de linfocitos al tejido linfoide de la mucosa intestinal (Schweighoffer, T. y col., J". Immunol . 151 : 111-129 (1993)). Además, la integrina a4ß7 interacciona con la fibronectina y la molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1) . La enfermedad inflamatoria del intestino (EII) , tal como la colitis ulcerativa y la enfermedad de Crohn, por ejemplo, puede ser una enfermedad debilitante y progresiva que implique inflamación del tracto gastrointestinal. Afectando a una cantidad estimada de dos millones de personas tan sólo en los Estados Unidos, los síntomas incluyen dolor abdominal, cala bres, diarrea y hemorragia rectal. Los tratamientos para la EII han incluido fármacos antiinflamatorios (tales como corticosteroides y sulfasala-zina) , fármacos inmunosupresores (tales como 6-mercaptopu-riña, ciclosporina y azatioprina) y cirugía (tal como colectomía) . Podolsky, New Eng 1 . J. Med. , 325 : 928 - 931 (1991) y Podolsky, New Engl . J. Med. , 325:1008-1016 (1991).

Los anticuerpos frente a la integrina a4ß7 humana, tales como el anticuerpo monoclonal murino (Acm Act-1) , interfieren con la integrina a4ß7 que se une a la molécula de adhesión celular de adresina mucosal-1 (MAdCAM-1) presente en las vénulas altamente endoteliales en los nodulos linfáticos de las mucosas. Act-1 fue originalmente aislado por Lazarovits, A.l. y col., J". Im unol . 133:1857-1862 (1984) , de ratones inmunizados con linfocitos T humanos específicos para el toxoide del tétanos y se dijo que era un anticuerpo IgGl/? de ratón. Un análisis más reciente del anticuerpo por Schweighoffer, T. y col., J". Im unol . 151 : 111 -129 (1993), demostró que puede unirse a un subgrupo de linfocitos T CD4+ de memoria humanos, que expresan selectivamente la integrina a4ß7. Sin embargo, un grave problema con la utilización de anticuerpos murinos para aplicaciones terapéuticas en humanos es que son altamente inmunogénicos en humanos e inducen rápidamente una respuesta de anticuerpos humanos anti-murinos (AHAM) , que reduce la eficacia del anticuerpo de ratón en pacientes y puede impedir una administración continuada. La respuesta AHAM da lugar a un rápido aclaramiento del anticuerpo muri-no, limitando gravemente cualquier beneficio terapéutico. Por lo tanto, se necesitan mejores aproximaciones terapéuticas a las enfermedades inflamatorias del intestino. Compendio de la Invención La presente invención se relaciona con una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7, cuya inmunoglobulina consiste en una región de unión a antígeno de origen no humano (por ejemplo, de roedor) y al menos una porción de una inmunoglobulina de origen humano (por ejemplo, una región de marco humano, una región constante humana del tipo gamma) . En una realización, la inmunoglobulina humanizada aquí descrita puede competir con Act-1 murino o LDP-02 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4) por la unión a la integrina a4ß7. En una realización preferida, la región de unión al antígeno de la inmunoglobulina humanizada deriva de anticuerpo monoclonal Act-1 (por ejemplo, LDP-02, una inmunoglobulina consistente en las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas mostradas en la Figura 11 (SEC ID N° : 19) y en la Figura 12 (SEC ID N° : 21) , respectivamente) . Por ejemplo, la inmunoglobulina humanizada puede consistir en una región de unión a antígeno consistente en una región determinante de complementariedad (RDC) de origen no humano y una región de marco (RM) derivada de una región de marco humano. En un aspecto, la inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7 consiste en una cadena ligera, que contiene una RDC derivada de un anticuerpo de origen no humano que se une a a4ß7 y una RM derivada de una cadena ligera de origen humano (por ejemplo, GM607'CL), y una cadena pesada, consistente en una RDC derivada de un anticuerpo de origen no humano que se une a a4ß7 y una RM derivada de una cadena pesada de origen humano (por ejemplo, 21/28'CL) . En otro aspecto, la cadena ligera consiste en tres RDC derivadas de la cadena ligera del anticuerpo Act-1 y la cadena pesada consiste en tres RDC derivadas de la cadena pesada del anticuerpo Act-1. La presente invención se relaciona también con cadenas ligeras de inmunoglobulinas humanizadas (por ejemplo, consistentes en RDC1, RDC2 y RCD3 de la cadena ligera del anticuerpo Act-1 y una RM de cadena ligera humana) y con cadenas pesadas de inmunoglobulinas humanizadas (por ejemplo, consistentes en RDC1, RDC2 y RDC3 de la cadena pesada del anticuerpo Act-1 y una RM de cadena pesada humana) . En una realización preferida, la invención se relaciona con cadenas pesadas y ligeras humanizadas aquí descritas (por ejemplo, una cadena ligera humanizada consistente la región variable de la cadena ligera mostrada en la Figura 7 (SEC ID N° : 12), una cadena pesada humanizada consistente en la región variable de la cadena pesada mostrada en la Figura 9 (SEC ID N° : 15) , una cadena ligera humanizada consistente en la región variable de la cadena ligera mostrada en la Figura 12 (SEC ID N° : 21) , una cadena pesada humanizada consistente en la región variable de la cadena pesada mostrada en la Figura 11 (SEC ID N° : 19)). También se incluyen inmunoglobulinas humanizadas consistentes en una o más cadenas ligeras y/o pesadas humanizadas. La invención se relaciona además con ácidos nucleicos aislados consistentes en una secuencia que codifica para una inmunoglobulina humanizada de la presente invención (por ejemplo, un anticuerpo de una sola cadena) , así como con ácidos nucleicos aislados consistentes en una secuencia que codifica para una cadena ligera (por ejemplo, SEC ID N° : 20) o una cadena pesada (por ejemplo, SEC ID M° : 18) de una inmunoglobulina humanizada de la presente invención. Por ejemplo, la presente invención proporciona un gen fusionado codificante de una cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina humanizada, consistente en una primera secuencia de ácido nucleico, codificante de una región de unión a antígeno derivada del anticuerpo monoclonal murino Act-1, y una segunda secuencia de ácido nucleico, codificante de al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina de origen humano.

La presente invención se relaciona también con un constructo, consistente en un ácido nucleico que codifica para una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7 o una cadena de dicha inmunoglobulina. Por ejemplo, se facilita un vector de expresión consistente en un gen fusionado codificante de una cadena ligera de una inmunoglobulina humanizada, consistente en una secuencia nucleotídica codificante de una RDC derivada de una cadena ligera de un anticuerpo no humano, que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7, y una región de marco derivada de una cadena ligera de origen humano. Un vector de expresión consistente en un gen fusionado codificante de una cadena pesada de una inmunoglobulina humanizada, consistente en una secuencia nucleotídica codificante de una RDC derivada de una cadena pesada de un anticuerpo no humano, que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7, y una región de marco derivada de una cadena pesada de origen humano, es otro ejemplo de dicho constructo. La presente invención se relaciona también con una célula huésped que tiene un ácido nucleico de la presente invención, que incluye uno o más constructos consistentes en un ácido nucleico de la presente invención. En una realización, la invención se relaciona con una célula huésped que tiene un primer ácido nucleico recombinante, codificante de una cadena ligera de una inmunoglobulina humanizada, y un segundo ácido nucleico recombinante, codificante de una cadena pesada de una inmunoglobulina humanizada, cuyo primer ácido nucleico consiste en una secuencia nucleotídica codificante de una RDC derivada de la cadena ligera del anticuerpo murino Act-1 y una región de marco derivada de una cadena ligera de origen humano, y cuyo segundo ácido nucleico consiste en una secuencia nucleotídica codificante de una RDC derivada de la cadena pesada del anticuerpo murino Act-1 y una región de marco derivada de una cadena pesada de origen humano . La presente invención proporciona también un método de preparación de una inmunoglobulina humanizada, consistente en mantener una célula huésped de la presente invención en condiciones apropiadas para la expresión de una inmunoglobulina humanizada, mediante lo cual se expresa una cadena (s) de una inmunoglobulina humanizada y se produce una inmunoglobulina humanizada. El método puede constar también de la etapa de aislamiento de la inmunoglobulina humanizada. Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención pueden ser menos inmunogénicas que sus contrapartidas murinas u otras no humanas. Por lo tanto, las inmunoglobulinas humanizadas aquí descritas pueden ser usadas como agentes terapéuticos en humanos, por ejemplo para controlar la direccionalización de linfocitos al tejido linfoide de las mucosas, reduciendo así las respuestas inflamatorias en el intestino. La invención se relaciona además con una inmunoglobulina humanizada de la presente invención para uso en diagnóstico o terapia (incluida la profilaxis) . En una realización, la invención se relaciona con una ' inmuno-globulina humanizada de la presente invención para uso en el tratamiento de enfermedades asociadas con la infiltración leucocitaria en los tejidos, por ejemplo en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, incluidas enfermedades que se asocian a la infiltración leucocitaria del tracto gastrointestinal (incluyendo el endotelio asociado al intestino), de otros tejidos mucosales o de tejidos que expresan la molécula MAdCAM-1. En una realización particularmente preferida, la invención se relaciona con una inmunoglobulina humanizada de la presente invención para uso en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) , tal como la colitis ulcerativa o la enfermedad de Crohn. En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de una inmunoglobulina humanizada de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas a la infiltración leucocitaria de tejidos, por ejemplo en el tratamiento de enfermedades inflamatorias, incluidas las enfermedades que se asocian a la infiltración leucocitaria del tracto intestinal, de otros tejidos mucosales o de tejidos que expresan la molécula MAdCAM-1. En una realización particularmente preferida, la invención se relaciona con el uso de una inmunoglobulina humanizada de la presente invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal (ElI) , tal como la colitis ulcerativa o la enfermedad de Crohn. Breve descripción de las figuras La Figura 1 es una ilustración de una secuencia de ADN consenso (SEC ID N° : 1) y de la secuencia deducida de aminoácidos (SEC ID N° : 2), consistente en la región variable determinada a partir de varios clones independientes de la región variable de la cadena pesada de ratón. La Figura 2 es una ilustración de una secuencia de nucleótidos (SEC ID N° : 3) y de la secuencia deducida de aminoácidos (SEC ID N° : 4) , consistente en una porción de la secuencia de la región variable determinada a partir de un clon independiente de la región variable de la cadena pesada de ratón denominado H2B#34.

La Figura 3 es una ilustración de una secuencia nucleotídica (SEC ID N° : 5) y de la secuencia deducida de aminoácidos (SEC ID N° : ß) , consistente en la región variable de varios clones independientes de la región variable de la cadena ligera de ratón. Se indica la posición de dos mutaciones hechas para introducir un sitio KasI para clonación. La Figura 4A es un gráfico de fluorescencia que ilustra la capacidad del Acm Act-1 murino y de un anticuerpo control irrelevante de ratón de isotipo parejo (MOPC 21, IgGl, kappa) para teñir células HuT 78 que expresan la integrina a4ß7. La Figura 4B es un gráfico de fluorescencia que ilustra la capacidad de (i) anticuerpo Act-1 quimérico, (ii) un anticuerpo control irrelevante humano de isotipo parejo (IgGl, kappa) y (iii) un sobrenadante de células COS-7 para teñir células HuT 78 que expresan la integrina a4ß7. La Figura 5 es una alineación de las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del Act-1 de ratón ("Act-l.vl") (SEC ID N° : 7) y de la región variable de la cadena ligera GM 607' CL humana (SEC ID N° : 8) . Los aminoácidos idénticos están indicados por una línea vertical y los aminoácidos similares están indicados por cuatro o dos puntos, dependiendo del grado de similitud. Las RDC están entre paréntesis y marcadas y los residuos están numerados secuencialmente . La Figura 6 es una alineación de las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del Act-1 de ratón ("Act-l.vh") (SEC ID N° : 9) y de la región variable de la cadena pesada 21/28' CL humana (SEC ID N° : 10) . Los aminoácidos idénticos están indicados por una línea vertical y los aminoácidos similares están indicados por cuatro o dos puntos, dependiendo del grado de similitud. Las RDC están entre paréntesis y marcadas y los residuos están numerados secuencialmente . La Figura 7 es una ilustración de la secuencia de nucleótidos (SEC ID N° : 11) y de la secuencia deducida de aminoácidos (S?C ID N° : 12) de la región variable de la cadena ligera del Act-1 de ratón unida a la secuencia del péptido señal de la cadena ligera del Act-1 de ratón. La Figura 8 es una ilustración de la secuencia de nucleótidos (SEC ID N° : 13) y de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N° : 8) de la región variable de la cadena ligera kappa del anticuerpo humano GM607'CL maduro. La figura 9 es una ilustración de la secuencia de nucleótidos y de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo Act-1 de ratón. La secuencia de nucleótidos de la región variable se une a una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia deducida del péptido señal de la cadena pesada del Act-1 de ratón, para obtener una secuencia compuesta (SEC ID N° : 14 y 15) . (La identidad del cebador que amplificaba la región de la cadena pesada fue deducida de la secuencia degenerada y se derivó una secuencia de aminoácidos para el péptido señal del cebador, secuencia corriente abajo y secuencias de otros péptidos señal. El péptido señal mostrado puede no ser idéntico al del hibridoma Act-1) . La Figura 10 es una ilustración de la secuencia de nucleótidos y de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo 21/28' CL humano. La secuencia de nucleótidos codificante de la región variable se une a una secuencia de nucleótidos que codifica para una secuencia de péptido señal derivada de la VH del anticuerpo humano HG3 ' CL (Rechavi, G. y col., Proc . Nati . Acad. Sci . , USA 80:855-859 (1983)), para obtener una secuencia compuesta (SEC ID N° : 16 y 17) . La Figura 11 es una ilustración de la secuencia de nucleótidos (SEC ID N° : 18) y de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N° : 19) de una porción de la caden pesada de un anticuerpo Act-1 humanizado (LDP-02) con un péptido señal de cadena pesada. La Figura 12 es una ilustración de la secuencia de nucleótidos (SEC ID N° : 20) y de la secuencia de aminoácidos (SEC ID N° : 21) de una porción de la cadena ligera de un anticuerpo Act-1 humanizado (LDP-02) con un péptido señal de cadena ligera. La Figura 13 es una ilustración de las secuen-cias de nucleótidos de oligonucleótidos complementarios solapantes, denominados L1-L6 (SEC ID N° : 22-27), que fueron usados para hacer la cadena ligera de una inmunoglobulina Act-1 humanizada (LDP-02) , y las secuencias de nucleótidos de oligonucleótidos complementarios solapantes, denominados H1-H10 (SEC ID N° : 28-37), que fueron usados para hacer la cadena pesada de la inmunoglobulina Act-1 humanizada. La Figura 14 es un gráfico de fluorescencia que ilustra la tinción de células HuT 78 usando una inmunoglobulina quimérica Act-1 murina-humana, una inmunoglobulina Act-1 humanizada o un anticuerpo control irrelevante que se corresponde al isotipo humano (IgGl, kappa) . La Figura 15 es un gráfico que ilustra los resultados de una titulación de Act-1 murino y Act-1 humanizado (LDP-02/3A9/LOTE#1, Ejemplo 4) biotinilados, llevada a cabo por citometría de flujo en células Hut-78. La Figura 16 es un gráfico que ilustra la inhibición competitiva de la unión de Act-1 murino biotini- lado por Act-1 murino o una inmunoglobulina Act-1 humanizada (LDP-02/3A9/LOTE#1, Ejemplo 4) , en comparación con IgGl murina control o IgGl . La Figura 17 es un gráfico que ilustra los resultados de un ensayo de liberación de 51cromo para la lisis celular mediada por complemento de células mononucleares de sangre periférica humana en presencia de (a) CAMPATH-1H, (b) CAMPATH-1G, (c) IgGl humana, (d) LDP-02/3A9/Lote#l (Ejemplo 4) o (e) LDP-01 (anti-CD18 humanízado, mutado en Fc) a concentraciones de 50, 25, 5, 2,5 y 0,5 µg/ml . Las Figuras 18A-18B son gráficos que ilustran los resultados de un ensayo de adhesión que monitoriza la inhibición de la adhesión por Act-1 murino (Figura 18A) , IgGl murina (Figura 18A) , LDP-02/3A9/Lote#l (Figura 18B) o IgGl humana (Figura 18B) de células portadoras de a4ß7 (RPMI 8866) y una quimera MAdCAM-1-Ig humana (inmunoadhesina) . La Figura 19 es un gráfico que muestra la tinción de células HuT 78 usando (a) LDP-02 (mutado en Fc) , (b) un derivado de LDP-02 (mutado en Fc) que tiene una mutación en la cadena ligera (MV4) más una doble mutación en la cadena pesada (R38K, A40R) , o (c) un anticuerpo control irrelevante que se corresponde al isotipo humano (IgGl, kappa) . Descripción detallada La presente invención se relaciona con una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7, consistente en una' región de unión a antígeno de origen no humano y al menos una porción de una inmunoglobulina de origen humano. Preferiblemente, las inmunoglobulinas humanizadas pueden unirse a la integrina a4ß7 con una afinidad de al menos aproximadamente 107 M"1, preferiblemente de al menos aproximadamente 108 M"1 y, más preferiblemente, de al menos aproximadamente 109 M"1. En una realización, la inmunoglobulina humanizada incluye una región de unión a antígeno de origen no humano que se une a la integrina a4ß7 y una región constante derivada de una región constante humana. En otra realización, la inmunoglobulina humanizada que se une a a4ß7 consiste en una región determinante de la complementariedad de origen no humano y una región de marco variable de origen humano y, eventualmente, una región constante de origen humano. Por ejemplo, la inmunoglobulina humanizada puede consistir en una cadena pesada y una cadena ligera, donde la cadena ligera incluye una región determinante de la complemen-tariedad derivada de un anticuerpo de origen no humano, que se une a la integrina a4ß7, y una región de marco derivada de una cadena ligera de origen humano, y la cadena pesada incluye una región determinante de la complementariedad derivada de un anticuerpo de origen no humano que se une a la integrina a4ß7 y una región de marco derivada de una cadena pesada de origen humano . La presente invención se relaciona también con una cadena ligera de una inmunoglobulina humanizada o una cadena pesada de una inmunoglobulina humanizada. En una realización, la invención se relaciona con una cadena ligera humanizada que incluye una RDC de cadena ligera (es decir, una o más RDC) de origen no humano y una región de marco de cadena ligera humana. En otra realización, la presente invención se relaciona con una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada que incluye una RDC de cadena pesada (es decir, una o más RDC) de origen no humano y una región de marco de cadena pesada humana. Las RDC pueden derivar de una inmunoglobulina no humana. Las inmunoglobulinas de origen natural tienen una estructura nuclear común en la que dos cadenas ligeras idénticas (aproximadamente 24 kD) y dos cadenas pesadas idénticas (aproximadamente 55 ó 70 kD) forman un tetrámero. La porción amino-terminal de cada cadena es conocida como la región variable (V) y puede ser distinguida de las regiones constante (C) más conservadas del resto de cada cadena. En la región variable de la cadena ligera hay una porción C-terminal conocida como la región J. Dentro de la región variable de la cadena pesada, hay una región D, además de la región J. La mayor parte de la variación de la secuencia de aminoácidos en las inmunoglobulinas está confinada a tres localizaciones separadas en las regiones V, conocidas como regiones hipervariables o regiones determinantes de la complementariedad (RDC) , que están directamente implicadas en la unión a antígeno. Procediendo desde el extremo amino, estas regiones son denominadas RDC1, RDC2 y RDC3 , respectivamente. Las RDC son mantenidas en su sitio por regiones de marco (RM) más conservadas . Procediendo desde el extremo amino, estas regiones son denominadas RM1, RM2 , RM3 y RM4, respectivamente. Kabat y col. han definido las localizaciones de las regiones RDC y RM y un sistema de numeración (Kabat, E.A. y col., Sequences of proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU. , Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991) ; véanse también las Tablas 3 y 4) . Se puede dividir a las inmunoglobulinas humanas en clases y subclases, dependiendo del isotipo de la cadena pesada. Las clases incluyen IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, en donde las cadenas pesadas son del tipo gamma (?) , mu (µ) , alfa (a) , delta (d) o épsilon (e) , respectivamente. Las subclases incluyen IgGl, IgG2 , IgG3 , IgG4, IgAl e IgA2 , en donde las cadenas pesadas son del tipo ?l, ?2 , ?3 , ?4, al y a2 , respectivamente. Las moléculas de inmunoglobulinas humanas de una clase o subclase seleccionadas pueden contener una cadena ligera kappa (K) O lambda (?) . Véanse, por ejemplo, Cellular and Molecular I munology, onsiewicz, M.J., Ed. , Capítulo 45, pp. 41-50, W.B. Saunders Co., Philadelphia, PA (1991); Nisonoff, A., Introduction to Molecular Immunolog?, 2a Ed. , Capítulo 4, pp. 45-65, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1984). El término "inmunoglobulina", tal se utiliza aquí, incluye anticuerpos completos y fragmentos biológica-mente funcionales de los mismos. Dichos fragmentos biológicamente funcionales retienen al menos una función de unión a antígeno de un correspondiente anticuerpo de longitud total (por ejemplo, especificidad para a4ß7 del anticuerpo Act-1) y, preferiblemente, retienen la capacidad de inhibir la interacción de a4ß7 con uno o más de sus ligandos (por ejemplo, MAdCAM-1, fibronectina) . En una realización particularmente preferida, los fragmentos biológicamente funcionales pueden inhibir la unión de a4ß7 a la adresina de mucosas (MAdCAM-1) . Como ejemplos de fragmentos de anticuerpos biológicamente funcionales que pueden ser utilizados se incluyen fragmentos capaces de unirse a una integrina a4ß7, tales como anticuerpos de una sola cadena, fragmentos Fv, Fab, Fab ' y F(ab')2. Dichos fragmentos pueden ser producidos por excisión enzimática o por técnicas recombinantes. Por ejemplo, se puede usar la excisión con papaína o pepsina para generar fragmentos Fab o F(ab')2, respectivamente. También se pueden producir anticuerpos en una variedad de formas truncadas, utilizando genes de anticuerpos en los que se han introducido uno o más codones de parada corriente arriba del sitio de parada natural. Por ejemplo, se puede diseñar un gen quimérico codificante de la cadena pesada de un fragmento F(ab')2 de forma que incluya secuencias de ADN codificantes del dominio CHX y de la región bisagra de la cadena pesada. El término "inmunoglobulina humanizada", tal como se utiliza aquí, se refiere a una inmunoglobulina que contiene porciones de inmunoglobulinas de diferente origen, donde al menos una porción es de origen humano. Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede consistir en porciones derivadas de una inmunoglobulina de origen no humano, con la necesaria especificidad, tal como un ratón, y de secuencias de inmunoglobulina de origen humano (por ejemplo, inmunoglobulina quimérica) , unidas entre sí químicamente por técnicas convencionales (por ejemplo, sintéticas) o preparadas como polipéptido contiguo usando técnicas de ingeniería genética (por ejemplo, se puede expresar ADN codificante de las porciones proteicas del anticuerpo quimérico para producir una cadena de polipéptido continuo) . Otro ejemplo de inmunoglobulina humanizada de la presente invención es una inmunoglobulina que contiene una o más cadenas de inmunoglobulina que incluyen una RDC derivada de un anticuerpo de origen no humano y una región de marco derivada de una cadena ligera y/o pesada de origen humano (por ejemplo, anticuerpos con injertos de RDC, con o sin cambios de marco) . Los anticuerpos de una sola cadena quiméricos o con injertos de RDC están también incluidos en el término inmunoglobulina humanizada. Véanse, por ejemplo, Cabilly y col., Patente EE.UU. N° 4.816.567; Cabilly y col., Patente Europea N° 0.125.023 Bl; Boss y col., Patente EE.UU. N° 4.816.397; Boss y col., Patente Europea N° 0.120.694 Bl; Neuberger, M.S. y col., WO 86/01533; Neuberger, M.S. y col., Patente Europea N° 0.194.276 Bl; Winter, Patente EE.UU. N° 5.225.539; Winter, Patente Europea N° 0.239.400 Bl; Padlan, E.A. y col., Solicitud de Patente Europea N° 0.519.596 Al. Véanse también Ladner y col., Patente EE.UU. N° 4.946.778; Huston, Patente EE.UU. N° 5.476.786, y Bird, R.E. y col., Science, 242:423-426 (1988) , en cuanto a anticuerpos de una sola cadena. La región de unión a antígeno de la inmunoglobulina humanizada (la porción no humana) puede derivar de una inmunoglobulina de origen no humano (a la que se hace referencia como inmunoglobulina donante) que tiene especificad de unión por la integrina a4ß7. Por ejemplo, una región adecuada de unión a antígeno puede derivar del anticuerpo monoclonal murino Act-1 (Lazarovits, A.l. y col., J. Immunol . , 133 (4) : 1857-1862 (1984); véanse, por ejemplo, los Ejemplos 1-3) . Otras fuentes incluyen anticuerpos específicos para la integrina a4ß7 obtenidos de fuentes no humanas, tales como roedor (por ejemplo, ratón, rata) , conejo, cerdo, cabra o primate no humano. Se pueden preparar otros anticuerpos policlonales o monoclonales, tales como anticuerpos que se unen al mismo epitopo o similar que el anticuerpo Act-1 (por ejemplo, Kohler y col., Nature, 256:495-4:91 (1975); Harlow y col., 1988; Antibodies: A laboratory Manual (Cold Spring Harbor, NY) , y Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, Verano de 1994), Ausubel y col., Eds. (John Wiley & Sons: New York, NY) , Capítulo 11 (1991)).

Por ejemplo, se pueden producir anticuerpos frente a un inmunógeno apropiado en un mamífero adecuado (por ejemplo, un ratón, rata, conejo u oveja) . Células portadoras de a4ß7, fracciones de membrana que contienen a4ß7, fragmentos inmunogénicos a4ß7, un péptido ß7 conjugado a un vehículo adecuado, son ejemplos de inmunógenos adecuados. Se pueden aislar células productoras de anticuerpo (por ejemplo, un linfocito) de, por ejemplo, los nodulos linfáticos o el bazo de un animal inmunizado. Las células pueden ser entonces fusionadas a una célula inmortalizada adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma) , formando así un hibridoma. Las células fusionadas pueden ser aisladas empleando técnicas de cultivo selectivo. Las células que producen anticuerpos con la especificidad deseada pueden ser seleccionadas por medio de un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA) . Las inmunoglobulinas de origen no humano que tienen especificidad de unión por la integrina a4ß7 pueden ser también obtenidas de librerías de anticuerpos (por ejemplo, una librería de fagos que contiene moléculas de Fab no humano) . En una realización, la región de unión a antígeno de la inmunoglobulina humanizada consiste en una RDC de origen no humano. En esta realización, la inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7 contiene al menos una RDC de origen no humano. Por ejemplo, las RDC pueden derivar de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulinas de origen no humano, de tal manera que una inmunoglobulina humanizada incluye substancialmente RDC1, RDC2 y/o RDC3 de cadena pesada y RDC1, RDC2 y/o RDC3 de cadena ligera, de una o más inmunoglobulinas de origen no humano y la inmunoglobulina humanizada resultante tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7. Preferiblemente, las tres RDC de una cadena seleccionada son substancialmente las mismas que las RDC de la cadena correspondiente de un donante y, más preferiblemente, las tres RDC de las cadenas ligeras y pesadas son substancialmente las mismas que las RDC de la cadena donante correspondiente . La porción de la inmunoglobulina humanizada o la cadena de inmunoglobulina que tiene origen humano (la porción humana) puede derivar de cualquier inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina humana adecuada. Por ejemplo, una región constante humana o porción de la misma, si está presente, puede derivar de las cadenas ligeras K o ? y/o las cadenas pesadas ? (por ejemplo, ?l, ?2, ?3 , ?4) , µ, a (por ejemplo, al, a2) , d o e de anticuerpos humanos, incluyendo las variantes alélicas . Se puede seleccionar una región constante particular (por ejemplo, IgGl) , variante o porciones de la misma con objeto de adaptar la función efectora. Por ejemplo, se puede incorporar una región constante mutada (variante) a una proteína de fusión para minimizar la unión a los receptores Fc y/o la capacidad para fijar el complemento (véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 ; véanse también Winter y col., GB 2.209.757 B; Morrison y col., WO 89/07142; Morgan y col., WO 94/29351, 22 de Diciembre de 1994) . Si están presentes, las regiones de marco humanas (por ejemplo, de la región variable de la cadena ligera) derivan preferiblemente de una región variable de anticuerpo humano que tiene similitud de secuencia con la región análoga o equivalente (por ejemplo, región variable de cadena ligera) del donante de la región de unión a antígeno. Otras fuentes de regiones de marco para porciones de origen humano de una inmunoglobulina humanizada incluyen las secuencias consenso variables humanas (véase, por ejemplo, el Ejemplo 2; véanse también Kettleborough, C.A. y col., Protein Engineering 4:773-783 (1991); Cárter y col., WO 94/04679, publicada el 3 de Marzo de 1994) . Por ejemplo, la secuencia del anticuerpo o región variable usada para obtener la porción no humana puede ser comparada con secuencias humanas, según se describe en Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991). En una realización particularmente preferida, las regiones de marco de una cadena de inmunoglobulina humanizada derivan de una región variable humana que tiene al menos aproximadamente un 65% de identidad global de secuencia y, preferiblemente, al menos aproximadamente un 70% de identidad global de secuencia, con la región variable del donante no humano (por ejemplo, anticuerpo Act-1 de ratón). Una porción humana puede también derivar de un anticuerpo humano que tiene al menos aproximadamente un 65% de identidad de secuencia y, preferiblemente, al menos aproximadamente un 70% de identidad de secuencia, dentro de la porción particular (por ejemplo, RM) que se esté utilizando, cuando se compara con la porción equivalente (por ejemplo, RM) del donante no humano. Por ejemplo, tal como se describe en el Ejemplo 2, la identidad global de secuencia entre las regiones variables de las cadenas ligeras de Act-1 de ratón y GM607'CL humano era de un 71,4% y la identidad global de secuencia entre las regiones variables de las cadenas pesadas de Act-1 de ratón y 21/28 'CL humano era de un 68,1%. En una realización, la inmunoglobulina hu ani- zada consiste en al menos una de las regiones de marco (RM) derivadas de una o más cadenas de un anticuerpo de origen humano. Por lo tanto, la RM puede incluir una RM1 y/o RM2 y/o RM3 y/o RM4 derivadas de uno o más anticuerpos de origen humano. Preferiblemente, la porción humana de una cadena humanizada seleccionada incluye RM1, RM2 , RM3 y RM4 derivadas de una región variable de origen humano (por ejemplo, de una cadena de inmunoglobulina humana, de una secuencia consenso humana) . Las porciones de inmunoglobulina de origen no humano y humano para uso en la presente invención tienen secuencias idénticas a las inmunoglobulinas o porciones de inmunoglobulinas de las que derivan o a variantes de las mismas. Dichas variantes incluyen mutantes que difieren por adición, supresión o substitución de uno o más residuos. Tal como se ha indicado antes, las RDC de origen no humano son substancialmente las mismas que en el donante no humano y, preferiblemente, son idénticas a las RDC del donante no humano. Tal como se describe en el Ejemplo 2, se pueden hacer cambios en la región de marco, tales como los que substituyen a un residuo de la región de marco de origen humano con un residuo de la posición correspondiente del donante . Se pueden hacer una o más mutaciones en la región de marco, incluyendo supresiones, inserciones y substitu-ciones de uno o más aminoácidos. Se describen varias de tales substituciones en el diseño de un anticuerpo Act-1 humanizado en el Ejemplo 2. Para un anticuerpo o cadena humanizados seleccionados, se pueden diseñar mutaciones de marco como se describe aquí. Preferiblemente, las inmuno-globulinas humanizadas pueden unirse a la integrina a4ß7 con una afinidad similar a, o mejor que, la del donante no humano. Se pueden producir variantes por una variedad de métodos adecuados, incluyendo la mutagénesis de cadenas donantes no humanas o humanas aceptoras . Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención tienen especificidad de unión por la integrina a4ß7 e incluyen inmunoglobulinas humanizadas (incluidos fragmentos) que pueden unirse a determinantes de las cadenas a4 y/o ß7 del heterodímero. En una realización preferida, la inmunoglobulina humanizada de la presente invención tiene al menos una función característica del anticuerpo Act-1 murino, tal como la función de unión (por ejemplo, con especificidad por la integrina a4ß7, con la misma o similar especificidad epitópica) y/o la función inhibitoria (por ejemplo, la capacidad de inhibir la adhesión dependiente de a4ß7 in vi tro y/o in vivo, tal como la capacidad de inhibir la unión de la integrina a4ß7 a MAdCAM-1 in vi tro y/o in vivo, o la capacidad de inhibir la unión de una célula portadora de la integrina a4ß7 a un ligando de la misma (por ejemplo, una célula portadora de MAdCAM-1) ) . Así, las inmunoglobulinas humanizadas preferidas pueden tener la especificidad de unión del anticuerpo Act-1 murino, la especificidad epitópica del anticuerpo Act-1 murino (por ejemplo, puede competir con el Act-1 murino, un anticuerpo Act-1 quimérico (véase, por ejemplo, el Ejemplo 1) o un Act- 1 humanizado (por ejemplo, LDP-02) por la unión a a4ß7 (por ejemplo, sobre una célula portadora de la integrina a4ß7) ) y/o función inhibitoria. La función de unión de una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7 puede ser detectada por métodos inmunológicos estándar, por ejemplo utilizando ensayos que monitorizan la formación de un complejo entre la inmunoglobulina humanizada y la integrina a4ß7 (por ejemplo, una fracción de membrana que contiene la integrina a4ß7, sobre una célula portadora de la integrina a4ß7, tal como un linfocito humano (por ejemplo, un linfocito del subgrupo CD4+a4lu ßl1°) , una línea celular de linfocitos humanos o una célula huésped recombinante que contiene ácido nucleico codificante de a4 y/o ß7, que expresa la integrina a4ß7) . Se pueden emplear ensayos de unión y/o adhesión u otros métodos adecuados en los procedimientos para la identificación y/o aislamiento de inmunoglobulinas humanizadas (por ejemplo, a partir de una librería) con la especificidad requerida (por ejemplo, un ensayo que monitorice la adhesión entre una célula portadora de una integrina a4ß7 y un ligando de la misma (por ejemplo, una segunda célula que expresa MAdCAM, una quimera MAdCAM-Ig (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4) u otros métodos adecuados) . Las porciones de inmunoglobulinas de origen no humano y humano para uso en la presente invención incluyen cadenas ligeras, cadenas pesadas y porciones de cadenas ligeras y pesadas. Estas porciones de inmunoglobulinas pueden ser obtenidas o derivar de inmunoglobulinas (por ejemplo, por síntesis de novo de una porción) , o se pueden producir y expresar ácidos nucleicos codificantes de una inmunoglobulina o cadena de la misma que tiene la propiedad deseada (por ejemplo, que se une a la integrina a4ß7, que tiene similitud de secuencia) . Se pueden producir inmuno-globulinas humanizadas que contiene las porciones deseadas (por ejemplo, región de unión a antígeno, RDC, RM, región C) de origen humano y no humano usando ácidos nucleicos sintéticos y/o recombinantes para preparar genes (por ejemplo, ADNc) codificantes de la cadena humanizada deseada. Para preparar una porción de una cadena, se pueden introducir uno o más codones de parada en la posición deseada. Por ejemplo, se pueden construir secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) codificantes de regiones variables humanizadas de nuevo diseño, usando métodos de mutagénesis por RCP para alterar las secuencias existentes de ADN (véase, por ejemplo, Kamman, M. y col., Nucí . Acids Res . 17:5404 (1989)). Se pueden hibridar cebadores de RCP codificantes de las nuevas RDC a una plantilla de ADN de una región variable previamente humanizada que se basa en la misma región variable humana, o muy similar (Sato, K. y col., Cáncer Research 53:851-856 (1993)). Si no se dispone de una secuencia de ADN similar para uso como plantilla, se puede construir un ácido nucleico consistente en una secuencia codificante de una secuencia de región variable a partir de oligonucleótidos sintéticos (véase, por ejemplo, Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)). También se puede incorporar una secuencia codificante de un péptido señal al ácido nucleico (por ejemplo, en la síntesis, en la inserción en un vector) . Si no se dispone de la secuencia del péptido señal natural, se puede usar una secuencia de péptido señal de otro anticuerpo (véase, por ejemplo, Kettleborough, C.A. , protein Engineering 4:773-783 (1991)). Utilizando estos métodos, los métodos aquí descritos u otros métodos adecuados, se pueden producir fácilmente variantes (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5) . En una realización, se pueden mutagenizar regiones variables clonadas (por ejemplo, de LDP-02) y se pueden seleccionar secuencias codificantes de variantes con la especificidad deseada (por ejemplo, a partir de una librería de fago; véase, por ejemplo, Krebber y col, EE.UU. 5.514.548; Hoogenboom y col., WO 93/06213, publicada el 1 de Abril de 1993) ) . Ácidos nucleicos y constructos que los contienen La presente invención se relaciona también con ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes (incluyendo, por ejemplo, esencialmente puros) que contienen secuencias que codifican para una inmunoglobulina humanizada o una cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina humanizada de la presente invención. Los ácidos nucleicos a los que se hace aquí referencia como "aislados" son ácidos nucleicos que han sido separados de los ácidos nucleicos del ADN genómico o del ARN celular de su fuente de origen (por ejemplo, tal como existe en las células o en una mezcla de ácidos nucleicos, tal como una librería) e incluyen ácidos nucleicos obtenidos por los métodos aquí descritos o por otros métodos adecuados, incluyendo ácidos nucleicos esencialmente puros, ácidos nucleicos producidos por síntesis química, por combinaciones de métodos biológicos y químicos y ácidos nucleicos recombinantes aislados (véanse, por ejemplo, Daugherty, B.L. y col., Nucleic Acids Res . 19 (9) : 2471-2476 (1991); Lewis, A.P. y J.S. Crowe, Gene, 101:297-302 (1991)). Los ácidos nucleicos a los que se hace aquí referencia como "recombinantes" son ácidos nucleicos que han sido producidos por metodología de ADN recombinante, incluyendo aquellos ácidos nucleicos que son generados por procedimientos que se basan en un método de recombinación artificial, tales como la reacción en cadena de polimerasa (RCP) y/o clonación en un vector usando enzimas de restricción. Los ácidos nucleicos "recombinantes" son también aquéllos que resultan de sucesos de recombinación que se producen a través de los mecanismos naturales de las células, pero que son seleccionados después de la introducción en las células de ácidos nucleicos diseñados para permitir y hacer probable un suceso recombinatorio deseado. La presente invención se relaciona también más específicamente con ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes consistentes en una secuencia de nucleótidos que codifica - para una inmunoglobulina Act-1 humanizada (es decir, una inmunoglobulina humanizada de la presente invención en la que la porción no humana deriva del anticuerpo monoclonal murino Act-1) o cadena de la misma. En una realización, la cadena ligera consiste en tres regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena ligera del anticuerpo Act-1 y la cadena pesada consiste en tres regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena pesada del anticuerpo Act-1. Dichos ácidos nucleicos incluyen, por ejemplo, (a) un ácido nucleico consistente en una secuencia que codifica para un polipéptido consistente en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada de una inmunoglobulina Act-1 humanizada (por ejemplo, la región variable de cadena pesada de la Figura 11 (SEC ID N° : 19) , la región variable de cadena pesada de la Figura 9 (SEC ID N° : 15)), (b) un ácido nucleico consistente en una secuencia que codifica para un polipéptido consistente en la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera de una inmunoglobulina Act-1 humanizada (por ejemplo, la región variable de cadena ligera de la figura 12 (SEC ID N° : 21) , la región variable de cadena ligera de la Figura 7 (SEC ID N° : 12)), (c) un ácido nucleico consistente en una secuencia que codifica para al menos una porción funcional de la región variable de la cadena ligera o pesada de una inmunoglobulina Act-1 humanizada (por ejemplo, una porción suficiente para la unión a antígeno de una inmunoglobulina humanizada que contiene dicha cadena) . Debido a la degeneración del código genético, se puede hacer una variedad de ácidos nucleicos que codifiquen para un polipéptido seleccionado. En una realización, el ácido nucleico consiste en la secuencia de nucleótidos de la región variable que se indica, o substancialmente como se indica, en la Figura 11 (SEC ID N° : 18), o que se indica, o substancialmente como se indica, en la figura 12 (SEC ID N° : ) , incluyendo polinucleótidos de hebra doble o sencilla.

(Aunque varias figuras pueden ilustrar polipéptidos que son mayores que la región variable (es decir, que incluyen una secuencia codificante de péptido señal o una porción de una secuencia codificante de región constante) , la referencia a la región variable de una figura particular pretende incluir la porción de región variable de la secuencia mostrada) . Los ácidos nucleicos aislados y/o recombinantes que cumplen estos criterios pueden incluir ácidos nucleicos codificantes de secuencias idénticas a las secuencias del anticuerpo Act-1 humanizado o variantes de las mismas según se ha discutido con anterioridad. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser usados en la producción de inmunoglobulinas humanizadas que tengan especificidad de unión por la integrina a4ß7. Por ejemplo, se puede incorporar un ácido nucleico (por ejemplo, ADN) , codificante de una inmunoglobulina humanizada de la presente invención a un constructo adecuado (por ejemplo, un vector) para posterior manipulación de secuencias o para la producción del polipéptido codificado en células huésped adecuadas.

Método de producción de inmunoglobulinas humanizadas que tienen especificidad por la integrina a4ß7 Otro aspecto de la invención se relaciona con un método de preparación de una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7. La inmunoglobulina humanizada puede ser obtenida, por ejemplo, por expresión de uno o más ácidos nucleicos recombinantes codificantes de una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7, en una célula huésped adecuada, por ejemplo. También se proporcionan constructos o vectores de expresión adecuados para la expresión de una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7. Los constructos pueden ser introducidos en una célula huésped adecuada y se pueden producir y mantener en cultivo células que expresan una inmunoglobulina humanizada de la presente invención. Las células huésped adecuadas pueden ser procarióticas, incluyendo células bacterianas, tales como E. coli , B. subtilis y/o otras bacterias adecuadas, o eucarióticas, tales como células fúngicas o de levaduras (por ejemplo, Pichia pastoris, especies de Aspergillus, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) u otras células eucarióticas inferiores, y células de eucariotas superiores, tales como las de insectos (por ejemplo, células Sf9 de insecto (WO, 94/26087, O'Connor, publicada el 24 de Noviembre de 1994)) o de mamíferos (por ejemplo, células COS, células NSO, SP2/0, células de ovario de hámster Chino (CHO) , células HuT 78, células 293) . (Véase, por ejemplo, Ausubel, F.M. y col., eds. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, Inc. (1993) ) . Se pueden producir células huésped que producen una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7 como sigue. Por ejemplo, se puede insertar un ácido nucleico codificante de toda o de una parte de la secuencia codificante para la inmunoglobulina humanizada deseada en un vector de ácido nucleico, por ejemplo un vector de ADN, tal como un plásmido, virus u otro replicón adecuado para expresión. Se dispone de una variedad de vectores, incluyendo vectores que se mantienen en copia simple o copia múltiple, o que se integran en el cromosoma de la célula huésped. Los vectores adecuados de expresión pueden contener una serie de componentes, incluyendo, aunque sin limitación, uno o más de los siguientes: un origen de replicación; un gen marcador seleccionable; uno o más elementos de control de la expresión, tales como un elemento de control transcripcional (por ejemplo, un promotor, un potenciador, un finalizador) y/o una o más señales de traducción; una secuencia de señal o secuencia líder para la direccíonalización a membrana o la secreción. En un constructo, se puede disponer de una secuencia de señal por el vector u otra fuente. Por ejemplo, se pueden usar las señales de transcripción y/o traducción de una inmunoglobulina para dirigir la expresión. Se puede facilitar un promotor para expresión en una célula huésped adecuada. Los promotores pueden ser constitutivos o inducibles. Por ejemplo, se puede unir de forma operable un promotor a un ácido nucleico codificante de una inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina humanizada, de tal modo que dirija la expresión del polipéptido codificado. Se dispone de una variedad de promotores adecuados para hospedadores procarióticos (por ejemplo, promotores lac, tac, T3 , T7 para E. coli) y eucarióticos (por ejemplo, alcohol deshidrogenasa de levadura (ADH1) , SV40, CMV) . Además, los vectores de expresión contienen típicamente un marcador seleccionable para selección de células huésped portadoras del vector y, en el caso de un vector de expresión replicable, un origen de replicación. Los genes codificantes de productos que confieren resisten-cia a antibióticos o a fármacos son marcadores selecciona-bles comunes y pueden ser usados en células procarióticas (por ejemplo, gen ß-lactamasa (resistencia a ampicilina), gen Tet para resistencia a tetraciclina) y eucarióticas (por ejemplo, genes de resistencia a neomicina (G418 o geneticina) , gpt (ácido micofenólico) , ampicilina o higromicina) . Los genes marcadores de la dihidrofolato reductasa permiten la selección con metotrexato en una variedad de hospedadores. Los genes codificantes del producto génico de marcadores auxotróficos del huésped (por ejemplo, LEU2 , URA3 , HIS3) son frecuentemente empleados como marcadores seleccionables en levaduras . Se contempla también el uso de vectores víricos (por ejemplo, baculovirus) o de fago y los vectores que son capaces de integrarse en el genoma de la célula huésped, tales como los vectores retrovíricos . La presente invención se relaciona también con células portadoras de estos vectores de expresión. Por ejemplo, se puede introducir un ácido nucleico (es decir, uno o más ácidos nucleicos) codificante de las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7, o un constructo (es decir, uno o más constructos) que contenga dicho (s) ácido (s) nucleico (s) en una célula huésped adecuada mediante un método apropiado para la célula huésped seleccionada (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, infección) , de tal forma que el (los) ácido (s) nucleico (s) se una (n) operablemente a uno o más elementos de control de la expresión (por ejemplo, en un vector, en un constructo creado por los procesos celulares, integrado en el genoma de la célula huésped) . Las células huésped pueden ser mantenidas en condiciones adecuadas para la expresión (por ejemplo, en presencia de inductor, medios adecuados suplementados con sales apropiadas, factores de crecimiento, antibiótico, suplementos nutricionales, etc.), mediante las cuales se produce (n) el (los) polipéptido (s) codificado (s) . Si se desea, se puede aislar la proteína codificada (por ejemplo, anticuerpo Act-1 humanizado) (por ejemplo, de las células huésped, del medio, de la leche) . Este procedimiento incluye la expresión en una célula huésped de un animal transgénico (véase, por ejemplo, WO 92/03918, GenPharm International, publicada el 19 de Marzo de 1992) . Se pueden producir proteínas de fusión en las que una inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina humanizada se une a un resto no inmunoglobulina (es decir, un resto que no aparece en las inmunoglobulinas tal como se encuentran en la naturaleza) en una localización N-terminal, en una localización C-terminal o interna a la proteína de fusión. Por ejemplo, se pueden producir algunas realizaciones por inserción de un ácido nucleico codificante de secuencias de inmunoglobulinas en un vector de expresión adecuado, tal como un vector pET (por ejemplo, pET-15b, Novagen), un vector de fago (por ejemplo, pCANTAB 5 E, Pharmacia) u otro vector (por ejemplo, vector de fusión pRIT2T Proteína A, Pharmacia) . El constructo resultante puede ser introducido en una célula huésped adecuada para expresión. Después de la expresión, se pueden aislar o purificar algunas proteínas de fusión de un lisado celular por medio de una matriz de afinidad adecuada (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F.M. y col., eds., Vol. 2, Supl . 26, pp. 16.4.1-16.7.8 (1991) ) . Métodos y composiciones terapéuticos La presente invención proporciona inmunoglobulinas humanizadas que (1) se pueden unir a la integrina a4ß7 in vi tro y/o in vivo y/o que (2) pueden modular una actividad o función de la integrina a4ß7, tal como (a) la función de unión (por ejemplo, la capacidad de la integrina a4ß7 para unirse a MAdCAM-1, fibronectina y/o VCAM-1) y/o (b) la función de infiltración leucocitaria, incluyendo el reclutamiento y/o la acumulación de leucocitos en los tejidos (por ejemplo, la capacidad de inhibir la migración linfocitaria al tejido de la mucosa intestinal). Preferi-blemente, las inmunoglobulinas humanizadas son capaces de unirse selectivamente a a4ß7 in vi tro y/o in vivo y de inhibir las interacciones mediadas por a4ß7. En una realización, una inmunoglobulina humanizada puede unirse a una integrina a4ß7 y puede inhibir la unión de la integrina a4ß7 a uno o más de sus ligandos (por ejemplo, MAdCAM-1, VCAM-l, fibronectina) , inhibiendo así la infiltración leucocitaria de los tejidos (incluyendo el reclutamiento y/o la acumulación de leucocitos en los tejidos), preferiblemente de forma selectiva. Dichas inmunoglobulinas humanizadas pueden inhibir la adhesión celular de las células portadoras de una integrina a4ß7 a las células endoteliales vasculares en los tejidos mucosales, incluyendo los tejidos asociados al intestino, los órganos linfoides o los leucocitos (especialmente linfocitos tales como las células T o B) in vi tro y/o in vivo. En una realización particularmente preferida, una inmunoglobulina humanizada (por ejemplo, Act-1) puede inhibir la interacción de a4ß7 con MAdCAM-1 y/o fibronectina. Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención son útiles en una variedad de procedimientos con aplicaciones en investigación, diagnóstico y terapia. Por ejemplo, pueden ser usadas para detectar, aislar y/o purificar la integrina a4ß7 o sus variantes (por ejemplo, por purificación por afinidad u otros métodos adecuados) y para estudiar la estructura (por ejemplo, la conformación) y la función de la integrina a4ß7. Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención pueden ser también usadas en aplicaciones diagnósticas (por ejemplo, in vi tro, ex vivo) o para modular la función de la integrina a4ß7 en aplicaciones terapéuticas (incluyendo las profilácticas) . Por ejemplo, las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención pueden ser usadas para detectar y/o medir el nivel de integrina a4ß7 en una muestra (por ejemplo, tejidos o fluidos corporales, tales como un exudado inflamatorio, sangre, suero, fluido intestinal, sobre células portadoras de una integrina a4ß7) . Por ejemplo, se puede obtener una muestra (por ejemplo, tejido y/o fluido corporal) de un individuo y se puede usar un método inmunológico adecuado para detectar y/o medir la expresión de integrina a4ß7, incluyendo métodos tales como ensayos inmunosorbentes ligados a enzimas (ELISA) , incluyendo ensayos de quimioluminiscencia, radioinmunoensayo e inmunohistología. En una realización, se proporciona un método de detección de una integrina a4ß7 seleccionada en una muestra, consistente en poner en contacto una muestra con una inmunoglobulina humanizada de la presente invención en condiciones adecuadas para la unión específica de la inmunoglobulina humanizada a la integrina a4ß7 y la detección de los complejos anticuerpo-integrina a4ß7 formados. En una aplicación del método, se pueden usar inmunoglobulinas humanizadas para analizar tejidos normales frente a tejidos inflamados (por ejemplo, de un humano) en cuanto a la reactividad y/o la expresión de integrinas a4ß7 (por ejemplo, inmunohistológicamente) , para detectar asociaciones entre ElI u otras condiciones y una mayor expresión de a4ß7 (por ejemplo, en tejidos afectados) . Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención permiten métodos inmunológicos de valoración de la presencia de integrina a4ß7 en tejidos normales frente a tejidos inflamados, a través de los cuales se puede valorar la presencia de la enfermedad, el progreso de la enfermedad y/o la eficacia de la terapia anti-integrina a4ß7 en la enfermedad inflamatoria. Las inmunoglobulinas humanizadas de la presente invención pueden ser también usadas para modular (por ejemplo, inhibir (reducir o prevenir) ) la función de unión y/o la función de infiltración leucocitaria (por ejemplo, linfocitaria, monocitaria) de la integrina a4ß7. Por ejemplo, se pueden administrar inmunoglobulinas humanizadas que inhiben la unión de la integrina a4ß7 a un ligando (es decir, uno o más ligandos) según el método en el tratamiento de enfermedades asociadas a la infiltración leucocitaria (por ejemplo, linfocitaria, monocitaria) de los tejidos (incluyendo el reclutamiento y/o la acumulación de leucocitos en los tejidos), particularmente de tejidos que expresan la molécula MAdCAM. Se administra una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la presente invención (es decir, una o más) a un individuo (por ejemplo, un mamífero, tal como un humano u otro primate) con objeto de tratar dicha enfermedad. Por ejemplo, se pueden tratar enfermedades inflamatorias, incluidas las enfermedades que se asocian a la infiltración leucocitaria del tracto gastrointestinal (incluyendo el endotelio asociado al intestino) , otros tej idos mucosales o tej idos que expresan la molécula MAdCAM-1 (por ejemplo, tejidos asociados al intestino, tales como vénulas de la lámina propia del intestino delgado y grueso, y glándula mamaria (por ejemplo, glándula mamaria en lactación) , según el presente método. De forma similar, un individuo que tiene una enfermedad asociada a la infiltración leucocitaria de tejidos como resultado de la unión de leucocitos a células (por ejemplo, células endoteliales) que expresan MAdCAM-1, puede ser tratado según la presente invención. En una realización particularmente preferida, como enfermedades que pueden ser tratadas de acuerdo con esto se incluyen la enfermedad inflamatoria del intestino (ElI) , tal como colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn, ileítis, enfermedad celíaca, esprúe no tropical, enteropatía asociada a artropatías seronegativas, colitis microscópica o colagenosa, gastroenteritis eosinofílica o saculitis producida tras proctocolectomía y anastomosis ileoanal .

La pancreatitis y la diabetes mellitus insulino-dependiente y otras enfermedades pueden ser tratadas usando el presente método. Se ha descrito que la MAdCAM-1 es expresada por algunos vasos en el páncreas exocrino de ratones DNO (diabéticos no obesos) , así como de ratones BALB/c y SJL. Se ha descrito que la expresión de MAdCAM-1 era inducida en el endotelio de los islotes inflamados del páncreas del ratón DNO y la MAdCAM-1 era la adresina predominante expresada por el endotelio de islotes DNO en las etapas tempranas de la insulitis (Hanninen, A. y col., ". Clin . Invest . , 92:2509-2515 (1993)). Además, se observó la acumulación de linfocitos que expresan a4ß7 en los islotes y se implicó a la MAdCAM-1 en la unión de células de linfoma a través de a4ß7 a los vasos de los islotes inflamados (Hanninen, A. y col., J. Clin. Invest . , 92 : 2509-2515 (1993) ) . Como ejemplos de enfermedades inflamatorias asociadas a tejidos mucosales que pueden ser tratadas según el presente método se incluyen mastitis (glándula mamaria) , colecistitis, colangitis o pericolangitis (conducto biliar y tejido circundante del hígado), bronquitis crónica, sinusitis crónica, asma y enfermedad del injerto frente al huésped (por ejemplo, en el tracto gastrointestinal) . Tal como se observa en la enfermedad de Crohn, la inflamación se extiende frecuentemente más allá de la superficie de la mucosa, por lo que se pueden tratar las enfermedades inflamatorias crónicas del pulmón que dan lugar a fibrosis intersticial, tales como la pneumonitis por hipersensibili-dad, las enfermedades del colágeno, la sarcoidosis y otras condiciones idiopáticas. La inmunoglobulina humanizada es administrada en una cantidad efectiva que inhibe la unión de la integrina a4ß7 a un ligando de la misma. Para la terapia, una cantidad efectiva será suficiente para conseguir el efecto terapéutico deseado (incluido el profiláctico) (tal como una cantidad suficiente para reducir o evitar la unión y/o la señalización mediadas por la integrina a4ß7, inhibiendo así la adhesión e infiltración leucocitaria y/o las respuestas celulares asociadas) . La inmunoglobulina humanizada puede ser administrada en una sola dosis o en dosis múltiples. La dosificación puede ser determinada por métodos conocidos en la técnica y puede depender, por ejemplo, de la edad del individuo, de la sensibilidad, de la tolerancia y del estado general. Las dosificaciones adecuadas para los anticuerpos pueden ser de aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 10,0 mg/kg peso corporal por tratamiento. Según el método, se puede administrar la inmunoglobulina humanizada a un individuo (por ejemplo, un humano) sola o junto con otro agente. Se puede administrar una inmunoglobulina humanizada antes, junto con o a continuación de la administración del agente adicional. En una realización, se administra más de una inmunoglobulina humanizada que inhibe la unión de integrina a4ß7 a sus ligandos. En otra realización, se administra un anticuerpo monoclonal, tal como un anticuerpo anti-MAdCAM-1, anti-VCAM-l o antí-ICAM-1, que inhibe la unión de leucocitos a un ligando endotelial, además de una inmunoglobulina humanizada de la presente invención. En aún otra realización, se puede administrar un componente adicional farmacológicamente activo (por ejemplo, un compuesto antiinflamatorio, tal como sulfasalazina, otro compuesto antiinflamatorio no esteroideo o un compuesto antiinflamatorio esteroideo) junto con una inmunoglobulina humanizada de la presente invención. Son posibles una variedad de vías de administración, incluyendo, aunque sin limitarse necesariamente a ellas, la parenteral (por ejemplo, inyección intravenosa, intraarterial, intramuscular, subcutánea), la oral (por ejemplo, dietética), la tópica, la inhalatoria (por ejemplo, inhalación intrabronquial, intranasal u oral, gotas intranasales) o la rectal, dependiendo de la enfermedad o de la condición que haya que tratar. La administración parenteral es un modo preferido de administración. La formulación variará según la vía de administración seleccionada (por ejemplo, solución, emulsión) . Se puede preparar una composición apropiada, que contiene el anticuerpo humanizado que ha de ser administrado, en un vehículo o portador fisiológicamente aceptable. Para soluciones o emulsiones, como vehículos adecuados se incluyen, por ejemplo, soluciones, emulsiones o suspensiones acuosas o alcohólicas/acuosas, incluida la solución salina y los medios tamponados. Como vehículos parenterales se pueden incluir solución de cloruro de sodio, Ringer dextrosa, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactato o aceites fijos. Como vehículos intravenosos se pueden incluir varios aditivos, conservantes o reponedores de fluidos, nutrientes o electrolitos (véase, en general, Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 17a Edición, Mack Publishing Co., PA, 1985) . Para inhalación, el compuesto puede ser solubilizado y cargado en un dispensador adecuado para administración (por ejemplo, un atomizador, nebulizador o dispensador de aerosol presurizado) . Ejemplificación La presente invención será ahora ilustrada mediante los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes en modo alguno. Tal como se describe en el Ejemplo 1, se purificó el anticuerpo murino Act-1 y se realizó el análisis de secuencia del anticuerpo. Se clonaron por RCP y secuenciaron los ADNc codificantes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas. La secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera kappa (VL) de Act-1 fue también determinada por secuenciación de proteínas y se vio que se correspondía exactamente con la secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de ADN del gen VL. La mayor parte de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (VH) ha sido determinada por la secuencia proteica y esta secuencia se corresponde también con la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN del gen VH. Estos resultados indican que las regiones variables correctas del Act-1 de ratón eran clonadas por la linea celular de hibridoma. Se produjeron anticuerpos Act-1 quiméricos funcionales que confirmaron que se habían clonado las secuencias correctas. Concretamente, se unieron los ADN codificantes de las regiones variables de las cadenas ligeras y pesadas del Act-1 de ratón a ADN codificantes de las regiones constantes de la cadena ligera kappa humana y de las cadenas pesadas gamma-1 o gamma-4 humanas, respectivamente. También se utilizó el anticuerpo quimérico en un análisis comparativo con un Acm Act-1 humanizado (Acm Act-1 LDP-02 reformado) . Para crear un anticuerpo Act-1 humanizado que se una bien a la integrina a4ß7, se diseñaron regiones variables humanas reformadas (Ejemplo 2) . Con objeto de ayudar en el procedimiento de diseño, se construyó un modelo molecular de las regiones variables del Act-1 de ratón. Las regiones del anticuerpo Act-1 murino directamente implicadas en la unión al antígeno, las regiones determinantes de complementariedad o RDC, fueron injertadas en regiones variables humanas seleccionadas . Se hicieron unos pocos cambios de aminoácidos en posiciones dentro de las regiones de marco (RM) de las regiones variables humanas . Las regiones variables reformadas del Act-1 humano incluían un único cambio de aminoácido en las RM de la región variable de la cadena ligera humana seleccionada y cinco cambios de aminoácidos en las RM de la región variable de la cadena pesada humana seleccionada, cada uno de los cuales cambiaba el residuo humano original en el correspondiente residuo murino . Tal como se describe en el Ejemplo 3, se construyeron secuencias de ADN codificantes de estas regiones variables del Act-1 humano reformadas y se unieron a secuencias de ADN codificantes de regiones constantes humanas y se utilizaron los ácidos nucleicos resultantes para producir inmunoglobulina Act-1 humanizada. El anticuerpo Act-l humanizado fue expresado en células de mamífero (Ejemplo 3) y estudiado en cuanto a la unión a la integrina a4ß7 humana en comparación con el anticuerpo Act-l de ratón (Ejemplo 4) . Tal como se muestra en la Tabla 5, el anticuerpo Act-l humanizado retenía especificidad por el epitopo reconocido por el Act-l murino y mostraba una afinidad de unión inesperadamente mejor en comparación con el anticuerpo murino nativo. Se identificaron varias variantes del anticuerpo Act-l humanizado en el procedimiento de diseño (Ejemplos 2 y 5) . Por ejemplo, se hicieron cambios adicionales en una o más de las siguientes posiciones: mutante de cadena ligera M4V (mutación Met — > Val en la posición 4) , mutante de cadena pesada R38K (mutación Arg -> Lys en la posición 38) , mutante de cadena pesada A40R (Ala —» Arg en la posición 40) . Además, se encontró un mutante de cadena pesada I73T (retromutación lie -» Thr en la posición 73) , que restauraba la posición 73 al residuo de treonina humano, en esta posición en la región de marco humana. Se puede llevar a cabo la introducción de uno o más de estos cambios en una sola cadena o varias combinaciones de estos cambios en más de una cadena . Ejemplo 1: Clonación de las regiones V„ y V¿ de Act-l y construcción y expresión de una inmunoglobulina quimérica Act-l murina-humana Clonación de las regiones VH y VL de Act-l Se obtuvo ARN de células de hibridoma producto-ras de anticuerpo monoclonal Act-l (Lazarovits, A.l. y col., J. Immunol . , 133 (4) : 1857-1862 (1984); suministradas por A.l. Lazarovits y R.B Colvin) ) usando Reactivo TRIzol (Gibco/BRL) , siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante . Se amplificaron las regiones variables de cadena pesada y ligera transcritas por reacción en cadena de polimerasa (RCP) usando un kit Ig-Prime (Novagen) según el protocolo sugerido por el fabricante. Para explicarlo brevemente, se hizo una transcripción inversa de 1,5 µg de ARN total a ADNc en una reacción que contenía 2,0 µl de tampón 5X MMLV (5X = Tris-HCl 250 mM, pH 8 , 3 , a 25°C, KCl 375 mM, MgCl2 15 mM) , 1,0 µl de DTT (ditiotreitol) 100 mM, 0,5 µl de mezcla de dNTP 10 mM (10 M de cada de dATP, dCTP, dTTP, dGTP), 0,5 µl de oligo dT (1 µg/µl) , 0,25 µl de SAB acetilada (4 mg/ml), 1,0 µl de cebador Ig-3 ' apropiado (10 pmol/µl) , 0,5 µl de Transcriptasa Inversa MMLV (200 unidades/µl) y agua libre de ARNasa añadida hasta un volumen total de 10 µl . Se incubó la mezcla durante 5 minutos a 37°C, 30 minutos a 42°C y 5 minutos a 99°C. Se utilizó cada cebador Ig-3 ' en una reacción aparte. Se amplificaron las regiones variables a partir del material inversamente transcrito según el protocolo del fabricante. Para resumir, se mezclaron 8 µl del material inversamente transcrito con 4 µl de dNTP 2 , 5 mM, 5 µl de tampón de reacción 10X (10X = Tris-HCl 100 mM, pH 8,8, a °C, KCl 500 mM, MgCl2 15 mM, Tritón X-100 1%), 2,5 µl de cebador líder Ig-5 ' (10 pmol/µl) (cada cebador líder Ig-5' fue usado en una reacción RCP aparte), 0,25 µl (1,25 unidades) de ADN polimerasa AmpliTaq® (Perkin-Elmer) y agua hasta un volumen total de 50 µl . Para las amplificaciones con los cebadores 5 ' MuIgVH5'-A, MuIgVH5'-B, MuIg?VL5 ' -A y MuIg?VL5'-B, los parámetros de ciclo eran 35 ciclos de 1 minuto, 94°C; 1 minuto, 50°C; 2 minutos, 72°C; seguido de una extensión final de 6 minutos a 72°C. Se utilizaron las mismas condiciones de reacción para los demás cebadores 5 ' , excepto por la temperatura de recocido, que se elevó a 60°C. La región variable de cadena pesada fue exitosamente amplificada usando MuIgGVH3 ' -2 o MuIgMVH3 ' -1 como cebador 3 ' y MuIgVH5 ' -B o MuIgVH5 ' -E como cebadores 5 ' . La región variable de cadena ligera fue exitosamente amplificada usando MuIg?VL3'-l como cebador 3' y MuIg?VL5 ' -G como cebador 5 ' . Las secuencias de estos cebadores son como se indica a continuación: MuIgGVH3'-2 (SEC ID N° : 56) : 5' -CCC AAG CTT CCA GGG RCC ARK GGA TAR ACI GRT GG MuIgMVH3'-l (SEC ID N° : 57) : 5 ' -CCC AAG CTT ACG AGG GGG AAG ACÁ TTT GGG AA MuIgVH5'-B (SEC ID N° : 58) : 5 ' -GGG AAT TCA TGR AAT GSA SCT GGG TYW TYC TCT T MuIgVH5 ' -E (SEC ID N° : 59) : 5 ' -ACT AGT CGA CAT GAA GWT GTG GBT RAA CTG GRT MuIg?VL3'-l (SEC ID N° : 60) : 5' -CCC AAG CTT ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA MuIg?VL5'-G (SEC ID N° : 61) : 5 ' -ACT AGT CGA CAT GGA TTT WCA RGT GCA GAT TWT CAG CTT Los fragmentos amplificados fueron purificados por gel de agarosa y ligados en el vector pT7Blue T (Novagen) suministrado con el kit Ig-Prime y se utilizó la mezcla de ligadura para transformar células competentes NovaBlue facilitadas con el kit, según el protocolo del f bricante. Se secuenciaron las colonias blancas que contenían insertos del tamaño apropiado usando cebador del promotor T7 y cebador U-19mero, que recuecen en lados opuestos del inserto, justo por fuera del sitio de policio-nación del vector pT7Blue. Se realizó la secuenciación sobre ADN miniprep usando un kit de ADN polimerasa T7 Sequenase (USB/Amersham Life Science) , según el protocolo recomendado por el fabricante. En la Figura 1 se muestra la secuencia de ADN consenso (SEC ID N° : 1) de varias clones de región variable de cadena pesada independientes y la secuencia deducida de aminoácidos (SEC ID N° : 2) . Los cebadores degenerados dieron lugar a alguna degeneración en la secuencia. El codon de iniciación es la Met codificada por los nucleótidos 13-15, el sitio predicho de excisión por peptidasa del líder está entre la Ser codificada por los nucleótidos 67-69 y la Gln codificada por los nucleótidos 70-72 (codificando los nucleótidos 13-69 para el péptido líder) . Se muestra una porción de la región constante murina, que empieza en la alanina codificada por los residuos 433-435. En la Figura 3 se muestra la secuencia de ADN (SEC ID N° : 5) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID N° : 6) de varios clones de región variable de cadena ligera independientes. A diferencia de la región variable de la cadena pesada, las secuencias amplificadas no eran degeneradas, probablemente debido a que los cebadores utilizados no eran muy degenerados y a que la región variable fue amplificada a partir de sólo un único par de cebadores. Construcción de un gen quimérico de cadena pesada Se produjo un gen codificante de un gen quimérico de cadena pesada murino-humano. La fuente de la región constante de cadena pesada humana era un clon que contenía una región constante gamma uno (?l) humana de tipo salvaje (obtenida del Dr. Hermán Waldmann (Universidad de Oxford) ; un constructo denominado 3818 consistente en el gen de cadena pesada anti-CD18 humanizado en un vector de expresión pEE6 (Celltech) ) . La región constante se corresponde a la del gen de cadena pesada CD18 humanizado clonado en pEE6.hCMV según describen Sims, M.J. y col., J. Immunol . , 151 (4) -. 2296-2308 (1993), y WO 93/02191, publicada el 4 de Febrero de 1993, cuyas enseñanzas son aquí cada una incorporada a modo de referencia en su totalidad. Las secuencias codificantes de la región variable y constante de la cadena pesada (gamma uno de tipo salvaje) del anticuerpo anti-CD18 humanizado fueron liberadas del vector de expresión por digestión con HindIII y EcoRI . El fragmento de 1.421 pares de bases que contenía el gen de cadena pesada fue recuperado y subclonado en los sitios HindIII y EcoRI de pCR-Script™ (Stratagene) para obtener un plásmido denominado pCR-CD18H. Un sitio de restricción Spe I se localiza en la unión entre la región variable y la región constante en el gen de cadena pesada anti-CD18. pCR-CD18H fue digerido por restricción con HindIII y Spe I para liberar la región variable de cadena pesada. Se substituyó esta región variable por la región variable del Act-l de ratón generado como sigue. Se sintetizaron dos cebadores para incorporar nuevos sitios de restricción. Estos cebadores eran: Cebador 5' (SEC ID N° : 41) : Hind III 5 ' -T [AA GCT T] CC GCC ATG GGA TGG AGC Cebador 3' (SEC ID N° : 42) : Spe I 5 ' -GGT GAC [ACT AGT] GCC TTG ACC CCA G El tipo negrilla indica nucleótidos en los cebadores que difieren de la secuencia de la plantilla. Se utilizó un clon independiente de cadena pesada del Act-l de ratón denominado H2B#34, con la secuencia nucleotídica (SEC ID N° : 3) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID N° : 4) presentadas en la Figura 2, como plantilla con los anteriores cebadores 5' y 3 ' para amplificar una región variable de ratón introduciendo concomitantemente un sitio Hind III 5' del codon de iniciación y un sitio Spe I justo 3' de la región J. Se subclonó directamente el fragmento de RCP en pCR- Script™, dando lugar al plásmido pCR-mACTIHV, y se confirmó la secuencia correcta. Se liberó entonces el fragmento de pCR-mACTIHV por digestión con HindIII y Spe I y se insertó en los sitios HindIII y Spe I de pCR-CD18H en lugar de la región variable anti-CD18, para obtener pCR-mhACTIHchi . Se liberó entonces el gen quimérico de cadena pesada (variable de Act-l de ratón más constante de gamma uno humana) de pCR-mhACTlHchi con HindIII y EcoRI y se retroclonó en el vector pEE6hCMV-B, que contenía el promotor hCMV, para obtener un constructo denominado pEE6mhACTlHchi . Construcción de un gen quimérico de cadena ligera Se construyó un gen de cadena ligera murino-humano de una forma similar a la cadena pesada. Sin embargo, en el caso de la cadena ligera quimérica, se incluyó por ingeniería un nuevo sitio de restricción, Kas I, en el constructo por amplificación por RCP de un fragmento de región variable, utilizando uno de los clones de región variable de cadena ligera del Act-l de ratón, denominado KG#87, como plantilla, y por amplificación por RCP de una región constante de cadena ligera kappa usando un constructo que contenía un gen de cadena ligera kappa anti-CD18 humanizada como plantilla (obtenido del Dr. Hermán Waldmann (Universidad de Oxford) ; constructo denominado 3819, que contiene una cadena ligera anti-CD18 humanizada en el vector de expresión pEE12) . La región constante corresponde a la del gen de cadena ligera CD18 humanizada clonado en pEE12, según se describe en Sims, M.J. y col., J". Immunol . , 151 (4) . - 2296-2308 (1993 ) y WO 93/02191, publicada el 4 de Febrero de 1993. Los cebadores para la región variable eran: Cebador 5' (SEC ID N° : 43) : HindIII ' -T [AA GCT T] CC GCC ATG AAG TTG CCT Cebador 3' (SEC ID N° : 44) : Kas I 5 ' - [GGC GCC] GCA TCA GCC CGT TTT El tipo negrilla indica nucleótidos en el cebador que difieren de los de la plantilla. Los dos cambios de nucleótidos en la región codificante, T —• G en la posición 423 y A —» G en la posición 426 en la Figura 3, para crear el sitio Kas I, son silenciosas y no cambian la secuencia de aminoácidos . Los cebadores para la región constante kappa eran: Cebador 5' (SEC ID N° : 45) : Kas I 5'-C[GG CGC C]AT CTG TCT TCA TC Cebador 3 ' (SEC ID N° : 46) : HindIII 5 ' - [AAG CTT] CTA ACÁ CTC TCC Las regiones variables y constantes de la cadena ligera fueron amplificadas por separado con respectivas plantillas y cebadores y los productos de RCP fueron individualmente subclonados en pCR-Script™ para confirmar la secuencia. Cada fragmento fue entonces liberado del vector por digestión con HindIII y KasI, purificado por gel y triplemente ligado en el sitio HindIII del vector de expresión 3819 pEE12 , del que se había separado el gen de cadena ligera anti-CD18 humanizado por digestión con HindIII. El constructo resultante se denomina pEE12mhACTlLchi . Expresión de una inmunoglobulina quimérica Para la construcción de un vector de expresión que contiene genes de cadenas quiméricas tanto pesadas como ligeras, se liberó todo el gen de cadena pesada más el promotor CMV del vector de expresión pEE6 (pEE6mhACTlHchi) por digestión con BglII y BamHI . Este fragmento fue entonces ligado en el sitio BamHI del vector de expresión del gen de cadena ligera pEE12 (pEE12mhACTlLchi) , dando lugar a un plásmido simple denominado pEE12mhLHchi , que contiene tanto el gen de cadena ligera quimérica como el gen de cadena pesada quimérica, cada uno bajo el control de transcripción de un promotor CMV independiente . Los vectores de expresión pEE6hCMV-B y pEE12 y el sistema de amplificación génica de la glutamina sintetasa Celltech han sido descritos previamente (véanse, por ejemplo, WO 86/05807 (Celltech), WO 87/04462 (Celltech), WO 89/01036 (Celltech) , EP 0 323 997 Bl (Celltech) y WO 89/10404 (Celltech) , cuyas enseñanzas son cada una aquí incorporadas a modo de referencia en su totalidad. Para la expresión transitoria del anticuerpo quimérico, se transfectaron 20 µg de pEE12mhLHchi en células COS-7 (American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852) por electroporación, como se indica a continuación. Se recogieron células COS-7 que crecían en fase log de matraces de cultivo de tejidos por tratamiento con tripsina-EDTA. Las células fueron lavadas una vez en solución salina tamponada con fosfatos ("PBS") y una vez con solución de sales equilibrada de Hank ("HBSS") y resuspendidas a una concentración de 1,5 x 107 células por mi de HBSS. Se mezclaron 1,2 x 107 células en 0,8 mi de HBSS con 20 µg del ADN plasmídico y se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. Se transfirió entonces la mezcla de ADN/células a una cubeta de electroporación de 0,4 cm y se aplicó corriente a 250 V, 960 µF, con un GenePulser Bio-Rad. Después de una incubación post-electroporación de minutos a temperatura ambiente, se transfirieron las células a 20 mi de medio de cultivo (medio de Eagle modificado de Dulbecco ("DMEM") más un 10% de SFT) y se cultivaron en un matraz de cultivo de tejidos de 162 cm2 (Costar) . Al cabo de 5 días, se recogió el sobrenadante del cultivo de células y se estudió en cuanto a la capacidad para teñir células HuT 78, que expresan la integrina a4ß7. Las células HuT 78 (una línea de linfoma de células T humanas) pueden ser obtenidas de la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, N° de Acceso ATCC TIB 161. Se incubaron 100 µl de sobrenadante de cultivo de células COS-7 transitoriamente transfectadas, sobrenadante de células COS-7 con simulacro de transfección, anticuerpo Act-l murino purificado (10 µg/ml) o los anticuerpos control irrelevantes de isotipo parejo purificados respectivos para ratón (IgGl de ratón, Kappa (MPPCV21) , 10 µg/ml, de Sigma) y para humano (IgGl, Kappa, µg/ml, de Sigma) con 1 x 105 células HuT 78 sobre hielo durante 30 minutos. Se lavaron las células dos veces con tampón enfriado en hielo, consistente en PBS que contenía un 2% de suero fetal de ternera (SFT) y un 0,01% de azida sódica (tampón FACS) . Las células fueron entonces incubadas durante 30 minutos en hielo con el anticuerpo secundario fluorescente apropiado (bien el fragmento F(ab')2 de IgG(H+L) de cabra anti-ratón AffiniPure conjugado a fluoresceína (FITC) (Jackson ImmunoResearch) , bien el fragmento F(ab')2 de IgG(H+L) de cabra anti-humano AffiniPure conjugado a fluoresceína (FITC) ) . Después de 30 minutos sobre hielo, las células fueron lavadas dos veces con tampón FACS, resuspendidas en 300 mi del mismo tampón y analizadas por citometría de flujo en un FACscan Becton Dickinson. La Figura 4A muestra la tinción del Acm Act-l murino en comparación con un anticuerpo control irrelevante de ratón de isotipo parejo, MOPC 21 (IgGl, kappa) . La figura 4B muestra la tinción con anticuerpo Act-l quimérico de células HuT 78 en comparación con un anticuerpo control irrelevante humano de isotipo parejo (IgGl, kappa) y el sobrenadante de células COS-7 con simulacro de transfección. De este modo, en comparación con la tinción producida por el anticuerpo Act-l murino, el anticuerpo quimérico teñía las células HuT 78 de forma similar. En conjunto, estos datos demuestran que las secuencias apropiadas para las regiones variables del Act-l de ratón eran clonadas y expresadas con éxito. Análisis de la secuencia de aminoácidos Se llevó a cabo el análisis de la secuencia de aminoácidos sobre cadenas pesadas y ligeras de Act-l murino purificado para confirmar las identidades de los ADNc para las regiones variables de cadena ligera y pesada aisladas del hibridoma. Se llevó a cabo para la cadena ligera como sigue: Se redujo Act-l murino (5 mg/ml) con DTT 2 mM durante 2 horas a 37°C en borato de sodio 0,3 M, cloruro de sodio 0,15 M bajo nitrógeno. Se hizo entonces la solución 10 mM en yodoacetamida y se incubó durante 4 h a temperatura ambiente. El análisis de "SDS-PAGE" en condiciones no desnaturalizantes confirmó que las proteínas eran reducidas cuantitativamente. La solución de proteínas fue entonces dializada de forma extensiva en PBS y se aplicó una alícuota a una columna Superdex 75 (16/60, Pharmacia) (vuelta 1) . La cadena pesada y la ligera coeluyeron de esta columna con un volumen de elución correspondiente al del volumen de exclusión, lo que indica que las dos cadenas aún se mantenían juntas. Se hizo entonces otra alícuota 8 M en urea y se llevó a una columna Superdex 75 en condiciones desnaturalizantes (urea 6 M) (vuelta 2) . Ambas cadenas coeluyeron una vez más en el volumen de vacío, probablemente debido a desplegamiento. El análisis de SDS-PAGE confirmó la presencia de ambas cadenas en las dos muestras eluidas de las 2 vueltas de filtración por el gel . Estas muestras fueron sometidas a análisis de secuencia N-terminal (Commonwealth Biotechnologies, Inc.), con el siguiente resultado: Muestra 2: DVWTQTPLSLPVSFDGQV (SEC ID N° : 47) Muestra 1: DVWTQTPLSL (SEC ID N° : 48) La secuencia que se obtuvo corresponde al extremo N de la cadena ligera madura deducida de la secuencia de ADN. Éste y otros intentos de obtener la secuencia de la cadena pesada indicaron que su extremo N estaba probablemente bloqueado. Por lo tanto, el análisis de la secuencia de aminoácidos de los fragmentos peptídicos internos fue realizado sobre la cadena pesada. Para simplificar la secuenciación de aminoácidos internos, se produjeron fragmentos F(ab) ' 2 del anticuerpo por excisión con pepsina. Se excindió el Act-l murino con pepsina a una razón de anticuerpo:pepsina de 1:200 durante 2 h a 37°C, en citrato de sodio 0,1 M, pH 3 , 0. La reacción se completó, según se valoró por análisis de SDS-PAGE. La proteína fue entonces purificada a través de columnas de proteína G y proteína A. Se redujo entonces la muestra y se alquiló como se ha descrito antes y se separó el fragmento de la cadena pesada de la cadena ligera por SDS-PAGE preparatoria (15%) . Se excindió el fragmento de la cadena pesada y se electroeluyó en 1 mi de SDS 0,1% haciendo correr el tampón durante 2 horas . Se excindió esta muestra con 2 ng de endoproteinasa Asp-N durante 30 minutos y se separaron los fragmentos por SDS-PAGE (17,5%) . Los productos de la digestión fueron pasivamente eluidos en Hepes 0,1 M, pH 8,0, SDS 0,1% durante la noche y sometidos a análisis de secuencia N-terminal (Commonwealth Biotechnologies, Inc.). La secuencia obtenida de un fragmento de 17 KDa era DYAIDYWG (SEC ID N° : 49) , que estaba presente en el clon para la cadena pesada (Figura 1; la secuencia AIDY corresponde al comienzo de la región JH4) . Ej emplo 2 Modelación molecular de las regiones variables del Act-l de ratón Con objeto de ayudar en el diseño de las regiones variables injertadas con RDC, se produjo un modelo molecular de las regiones variables del Act-l de ratón. La modelación de las estructuras de las familias de proteínas bien caracterizadas con inmunoglobulinas fue realizada usando los métodos establecidos para modelación por homología. La modelación molecular fue llevada a cabo usando una estación de trabajo IRIS 4D de Silicon Graphics, que funcionaba bajo el sistema operativo UNIX, el paquete de modelación molecular QUANTA (Polygen Corp., Waltham, MA) y la base de datos cristalográficos Brookhaven de estructuras proteicas resueltas. Como primera etapa, se modelaron las regiones de marco (RM) de las nuevas regiones variables en RM de regiones variables de inmunoglobulinas similares estructuralmente resueltas . Mientras que las cadenas laterales de aminoácidos idénticas fueron mantenidas en su orientación original, las cadenas laterales mutadas fueron substituidas usando el procedimiento de máximo solapamiento para mantener los ángulos chi como en el anticuerpo Act-l de ratón original . La mayor parte de las RDC de las nuevas regiones variables fueron modeladas en base a las estructuras canónicas para RDC (Chothia, C. y A.M. Lesk, J. Mol . Biol . 196: 901 -911 (1987); Chothia, C. y col., Nature 342:877-883 (1989); Tramontano, A. y col., ". Mol . Biol . 215 : 115 -182 (1990); Chothia, C. y col., J". Mol . Biol . 227:799-817 (1992)). En casos tales como RDC3 de la región variable de cadena pesada, donde no existen estructuras canónicas conocidas, se modeló el bucle RDC en base a la estructura similar de bucle presente en cualquier proteína estructuralmente resuelta. Finalmente, con objeto de eliminar los contactos atómicos no favorables y de optimizar las interacciones de Van der Waals y electrostáticas, se sometió el modelo a minimización de energía usando el potencial CHARMm (Brooks, B.R., J. Comp . Chem. 4:187-217 (1983)) ejecutado en QUANTA. Para las regiones variables del Act-l de ratón, las RM de la región variable de cadena ligera fueron modeladas sobre las RM del fragmento Fab del anticuerpo monoclonal de ratón 4-4-20 (Herrón, J.N. y col., Proteins, Structure, Function and Genetics 5:271-280 (1989)). Las RM de la región variable de cadena pesada fueron modelados sobre las RM del fragmento Fab del anticuerpo monoclonal de ratón D11.15 (Chitarra, V. y col., Proc. Nati . Acad. Sci . , USA 90 : 1111-1115 (1993 ) ) . Aquellas cadenas laterales de aminoácidos que diferían entre el anticuerpo Act-l de ratón y las regiones variables sobre las que se basó el modelo estaban substituidas. La cadena ligera del Fab del anticuerpo 4-4-20 fue entonces superpuesta a la cadena ligera de D11.15 alineando en el espacio los residuos 35-39, 43-47, 84-88 y 98-102 (según definen Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991) ) , con objeto de poner las dos regiones variables heterólogas (es decir, la región variable de cadena ligera kappa basada en 4-4-20 y la región variable pesada basada en D11.15) en la orientación correcta con respecto la una de la otra. RDCl (Ll) de la región variable de cadena ligera del Acm Act-l se ajustaba al subgrupo canónico Ll 4, según propusieron Chothia, C. y col., Nature 342:877-883 (1989). El bucle Ll del Fab 4-4-20 de ratón (véase lo anterior) era idéntico en cuanto a longitud de aminoácidos, similar en cuanto a secuencia de aminoácidos y también se ajustaba al subgrupo canónico 4. En consecuencia, el bucle Ll fue modelado sobre el bucle Ll de Fab 4-4-20. De forma similar, RDC2 (L2) y RDC3 (L3) de la región variable de cadena ligera del Acm Act-l se correspondía tanto a sus respectivas estructuras de bucle del subgrupo canónico 1 como a las correspondientes RDC de Fab 4-4-20. En consecuencia, los bucles L2 y L3 de la región variable de cadena ligera kappa de Act-l fueron modelados sobre las RDC L2 y L3 de Fab 4-4-20. RDCl (Hl) de la región variable de cadena pesada del Acm Act-l se ajustaba al subgrupo canónico Hl 1, definido por Chothia, C. y col., Nature 342:877-883 (1989), al igual que el correspondiente bucle Hl del Acm D11.15 de ratón (véase lo anterior) . Más aún, el bucle de la RDCl del Acm Dll.15 era idéntico en cuanto a longitud y muy similar en cuanto a secuencia de aminoácidos a Hl del Acm Act-l. En consecuencia, como con la cadena ligera, este bucle fue modelado sobre el bucle RDCl de la región variable pesada en la que se basaba este modelo. La RDC2 de la región variable de cadena pesada (H2) era más difícil de definir, pero parecía corresponder al subgrupo canónico H2 2. Una vez más, el bucle H2 del anticuerpo D11.15 se correspondía también al mismo subgrupo canónico y era muy similar en secuencia de aminoácidos y, por lo tanto, el bucle H2 del Acm Act-l fue modelado sobre el bucle H2 de D11.15. Tal como se ha discutido anteriormente, las RDC3 de las regiones variables de cadena pesada son altamente variables y no pueden dividirse en grupos estructurales identificables . Para modelar los bucles H3 , se identifican bucles de idéntica longitud y similar secuencia de aminoácidos -preferiblemente de otro anticuerpo- y se usan como base para el bucle modelado. Hubo tres bucles, todos bucles H3 de tres anticuerpos, que se correspondían a la RDC3 de Act-l en cuanto al tamaño de bucle. Después de estudiar las tres estructuras de bucle en cuanto a discordancias esféricas en el modelo, el bucle H3 del anticuerpo humano Pot (Fan, Z.C. y col., J". Mol . Biol . 228 : 188-201 (1992)) fue elegido para modelar el bucle H3 del Acm Act-l. Después de ajustar todo el modelo en cuanto a discordancias esféricas obvias, fue sometido a minimización de energía, ejecutada en QUANTA. Diseño de las regiones variables injertadas con RDC La primera etapa en el diseño de regiones variables injertadas con RDC es la selección de las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas humanas que servirán como base de las regiones variables humanizadas. Se estudiaron y compararon dos aproximaciones para seleccionar las regiones variables humanas. En una aproximación, las regiones variables humanas fueron seleccionadas entre las secuencias consenso para los diferentes subgrupos de regiones variables humanas (Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteíns of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991)). Se compararon las regiones variables de cadena ligera y pesada de roedores con las secuencias consenso humanas y se seleccionaron las secuencias consenso de cadena ligera y pesada humanas más similares de entre los seis subgrupos de regiones variables de cadena ligera lambda humanas, los cuatro subgrupos de regiones variables de cadena ligera kappa humanas y los tres subgrupos de regiones variables de cadena pesada humana (véase Kettleborough, C.A., Protein Engineering 4:773-783 (1991) ) . En otra aproximación, las regiones variables humanas fueron seleccionadas entre todas las secuencias publicadas para regiones variables humanas (Kabat, E.A. y col . , Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991)). Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena ligera y pesada de roedores fueron comparadas con secuencias humanas y se seleccionaron las regiones variables humanas con un grado alto de similitud con las regiones variables de roedores . Se pueden usar las regiones variables de cadena ligera y pesada humanas del mismo anticuerpo humano para asegurar que las dos regiones variables se ensamblen apropiadamente (Queen, C. y col., Proc. Nati . Acad. Sci . USA 86:10029-10033 (1989)). Sin embargo, tal como se describe aquí, las regiones variables de cadena ligera y pesada humanas seleccionadas como plantillas derivaban de dos diferentes anticuerpos humanos. De este modo, era posible seleccionar regiones variables humanas con un mayor grado de similitud con las regiones variables de roedores. Hay muchos ejemplos exitosos de anticuerpos injertados con RDC basados regiones variables derivadas de dos diferentes anticuerpos humanos. Uno de los ejemplos mejor estudiados es el anticuerpo CAMPATH-1 humano reformado (Riechmann, L. y col., Nature 332:323-327 (1988)). Para diseñar regiones variables de ACT-1 humano reformado, se compararon las regiones variables del ACT-1 de ratón con las secuencias consenso para todos los subgrupos de regiones variables de ratón y humanas (Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU, (1991)). Los resultados están resumidos en las Tablas 1 y 2. La región variable de la cadena ligera del Act-l de ratón era muy similar a la secuencia consenso para el subgrupo II de cadena ligera kappa de ratón, con una identidad global del 83,9% y una identidad del 87,5% en las RM solamente (Tabla 1) . Con respecto a las secuencias del anticuerpo humano, la región variable de la cadena ligera del Act-l de ratón era muy similar a la secuencia consenso para el subgrupo II de la cadena ligera kappa humana, con una identidad global del 72,3% y una identidad del 78,8% en las RM solamente (Tabla 1) . Tabla 1. Comparación de la región variable de la cadena ligera kappa del Act-l de ratón con las secuencias consenso para los subgrupos de las regiones variables de la cadena ligera kappa de ratón y humanas. Se comparó la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera kappa del Act-l de ratón, con y son las secuencias de las RDC, con las secuencias consenso de los diferentes subgrupos de regiones variables de cadena ligera kappa de ratón y humanas, con y sin las secuencias de las RDC. Se dan los porcentajes de similitud y de identidad con los subgrupos de ratón y humanos más similares .

La región variable de la cadena pesada del Act-l de ratón era muy similar a la secuencia consenso para el subgrupo Ilb de la cadena pesada de ratón, con una identidad global del 83,5% y una identidad del 94,3% en las RM solamente (Tabla 2) . Con respecto a las secuencias del anticuerpo humano, la región variable de la cadena pesada del Act-l de ratón era muy similar a la secuencia consenso para el subgrupo I de cadena pesada humana, con una identi-dad global del 68,6% y una identidad del 75,9% en las RM solamente (Tabla 2) . Estos resultados confirman que las regiones variables del Act-l de ratón parecen ser típicas de las regiones variables de ratón. Los resultados también indican los subgrupos de las regiones variables humanas que pueden servir como buenas fuentes de plantillas de región variable humana o aceptores para injertación de RDC. Tabla 2. Comparación de la región variable de la cadena pesada del Act-l de ratón con las secuencias consenso para los subgrupos de regiones variables de cadena pesada de ratón y humanas. Se comparó la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del Act-l de ratón, con y sin las secuencias de las RDC, con las secuencias consenso de los diferentes subgrupos de regiones variables de cadena pesada de ratón y humanas, con y sin las secuen- cias de las RDC. Se dan los porcentajes de similitud y de identidad con los subgrupos más similares de ratón y humanos .

También se compararon las regiones variables del Act-l de ratón con las secuencias individuales de todos los ejemplos registrados de regiones variables de ratón y humanas (Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of I munological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU. Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991) ; paquete UW GCG (Universidad de Wisconsin) ) . Con respecto a las secuencias de anticuerpos humanos, la región variable de cadena ligera del Act-l de ratón era muy similar a la secuencia para la región variable de la cadena ligera kappa humana del anticuerpo humano GM607'CL (Klobeck, H.-G. y col., Nature 309 : 13 -16 (1984)). La Figura 5 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del Act-l de ratón (SEC ID N° : 7) y de la región variable de la cadena ligera del GM607'CL humano (SEC ID N° : 8). Tal como se esperaba, la región variable de cadena ligera del GM607'CL humano es un miembro del subgrupo II de las regiones variables de cadena ligera kappa humanas. La identidad global de secuencia entre las regiones variables de cadena ligera de Act-l de ratón y GM607'CL humano se calculó como del 71,4%. La región variable de la cadena pesada del Act-l de ratón era muy similar a la secuencia para la región variable de la cadena pesada humana del anticuerpo humano 21/28 'CL (Dersimonian, H. y col., J". Immunol . 139 : 2496-2501 (1981) ) . La Figura 6 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada del Act-l de ratón (SEC ID N° : 9) y de la región variable de la cadena pesada del 21/28'CL humano (SEC ID N° : 10). Tal como se esperaba, la región variable de la cadena pesada del 21/28'CL humano es un miembro del subgrupo I de regiones variables de cadena pesada humana. La identidad global de secuencia entre las regiones variables de cadena pesada de Act-l de ratón y 21/28'CL humano se calculó como del 68,1%. En base a estas comparaciones, se seleccionó la región variable de cadena ligera del GM607'CL humano como plantilla humana para el diseño de la región variable de la cadena ligera del Act-l humano reformado y se seleccionó la región variable de la cadena pesada del 21/28'CL humano como plantilla para el diseño de la región variable de la cadena pesada del Act-l humano reformado. La segunda etapa en el procedimiento de diseño era insertar las RDC de roedores en las regiones variables de cadena ligera y pesada humanas seleccionadas. Se unieron las RDC completas de roedores, según definen Kabat, E.A. y col . , Sequences of Proteins of Immunological ínteres t, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991)) a las RM humanas para crear un injerto RDC simple. En algunos casos, un anticuerpo de roedores humanizado en un injerto RDC simple mostrará poca o ninguna unión a antígeno. Es importante estudiar las secuencias de aminoácidos de las RM humanas para determinar si alguno de estos residuos de aminoácidos tiene probabilidad de influir de manera adversa sobre la unión al antígeno, ya sea directamente a través de interacciones con el antígeno, o indirectamente, alterando el posicionamiento de los bucles RDC. En la tercera etapa, se tomaron decisiones en cuanto a qué residuos de aminoácido en las RM humanas tendrían que ser alteradas para conseguir una buena unión al antígeno. En esta etapa, el modelo de las regiones variables de roedores resulta de lo más útil en el procedimiento de diseño. También son útiles las estructuras canónicas para las RDC, según definen Chothia, C. y col., Nature 342 : 811-883 (1989) . Es importante conservar en las regiones variables humanizadas cualquiera de los residuos de aminoácido de roedores que son parte de las estructuras canónicas. Es útil comparar la secuencia del anticuerpo de roedores que ha de ser humanizada con secuencias similares de otros anticuerpos de roedores para determinar si los aminoácidos en determinadas posiciones son poco habituales o raros . Esto podría indicar que el aminoácido de roedor en esa posición tiene un papel importante en la unión a antígeno. Estudiando el modelo de las regiones variables de roedores, es posible predecir si los aminoácidos en posiciones particulares podrían o no influir en la unión a antígeno. Cuando se están usando regiones variables humanas de anticuerpos humanos individuales como base del diseño, entonces es aconsejable comparar la secuencia humana individual con la secuencia consenso para ese subgrupo de regiones variables humanas. Hay que observar cualquier aminoácido que sea particularmente inusual. En la mayoría de los casos, se identifican unos cuantos aminoácidos en las RM humanas que deberían ser cambiados del aminoácido presente en esa posición en la región variable humana al aminoácido presente en esa posición en la región variable de roedores . Las Tablas 3 y 4 resumen cómo fueron diseñadas las regiones variables del Act-l humano reformado. La Tabla 3 es una alineación de secuencias de aminoácidos usadas en el diseño de regiones VL del Acm humano reformado Act-I y da la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera del Act-l de ratón que ha de ser humanizada (SEC ID N° : 7) en la columna 4, la secuencia consenso para el subgrupo de regiones variables de ratón al que pertenece la región variable del Act-l de ratón (SEC ID N° : 50) en la columna 5 (?-II de ratón) , la secuencia consenso para el subgrupo de regiones variables humanas al que es más similar la variable del Act-l de ratón (SEC ID N° : 51) en la columna 6 (?-II humana) , la secuencia de aminoácidos de la región variable humana que sirve como plantilla (es decir, GM607'CL) (SEC ID N° : 8) en la columna 7 y la secuencia de aminoácidos de la región variable del Act-l humano reformado (SEC ID N° : 52) diseñada en la columna 8 (RHVK de Act-l) . La Tabla 4 es la alineación de las secuencias de aminoácidos usadas en el diseño de las regiones VH del Acm humano Act-l reformado y da la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada del Act-l de ratón que ha de ser humanizada (SEC ID N° 9) en la columna 4, la secuencia consenso para el subgrupo de las regiones variables de ratón al que pertenece la región variable del Act-l de ratón (SEC ID N° : 53) en la columna 5 (IIB de ratón) , la secuencia consenso para el subgrupo de regiones variables humanas al que el Act-l de ratón es más similar (SEC ID N° : 54) en la columna 6 (I humana) , la secuencia de aminoácidos de la región variable humana que sirve como plantilla (es decir, 21/28' CL) (SEC ID N° : 10) en la columna 7 y la secuencia de aminoácidos de la región variable del Act-l reformado (SEC ID N° : 55) diseñada en la columna 8 (RHVH de Act-l) . La penúltima columna en las Tablas 3 y 4 indica la posición (superficial o enterrada) de los residuos en las RM que difieren entre las RM del Act-l de ratón y las humanas seleccionadas . La columna final en las Tablas 3 y 4 da comentarios relevantes en cuanto a esa posición en la región variable. En la Tabla 3, se utilizan los siguientes símbolos: (*) residuos invariantes definidos por las secuencias consenso de Kabat, es decir, una aparición del 95% o más en el subgrupo de kabat (Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991)) (en el caso de las columnas 5 y 6) , o como parte de la estructura canónica para los bucles RDC (en el caso de las columnas 5 y 6) o como parte de la estructura canónica para los bucles RDC (en el caso de la columna 8) , según definen Chothia, C. y col., Nature 342:877-883 (1989); (NEGRILLA) posiciones en las RM y RDC en las que el residuo de aminoácido humano fue substituido por el correspondiente residuo de ratón; (SUBRAYADO) posiciones en las RM en las que el residuo humano difiere del número de residuos de ratón análogos; (?) numeración de los cambios en las RM humanas; (Ac Act-l de ratón) secuencia de aminoácidos de la región VL del anticuerpo Act-l de ratón; (?-II de ratón) secuencia consenso de las regiones VL kappa de ratón del subgrupo II (Kabat, E.A. y col., antes citado); (?-II humana) secuencia consenso de las regiones VL humanas del subgrupo II (Kabat, E.A. y col., antes citado); (GM607'CL) secuencia de aminoácidos del anticuerpo GM607'CL humano (Klobeck, H.-G. y col., Nature 309 : 13 -16 (1984)); (superficial o enterrado) posición de aminoácido en relación al resto de los residuos en ambas cadenas de las regiones variables del anticuerpo; (RH V? de Act-l) secuencia de aminoácidos de la región VL del Acm Act-l humano reformado.

Tabla 3. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VL del Acm Act-l humano reformado.

Tabla 3. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VL del Acm Act-l humano reformado (Cont.).

Tabla 3. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VL del Acm Act-l humano reformado (Cont . ) . el Duele L2 Tapia . Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseno de las regiones VL del Acm Act-l humano reformado (Cont . ) .

Tabla 3. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VL del Acm Act-l humano reformado (Cont . ) .

Tabla 3. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VL del Acm Act-l humano reformado (Cont . ) . mas común. Tabla 3. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VL del Acm Act-l humano reformado (Cont.).

En la Tabla 4, se usan los siguientes símbolos: (*) residuos invariantes definidos por las secuencias consenso de Kabat, es decir, un 95% o más de aparición en el subgrupo de Kabat (Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991)) (en el caso de las columnas 5 y 6) o como parte de la estructura canónica para los bucles RDC (en el caso de la columna 8) según definen Chothia, C. y col., Nature 342 : 811- 883 (1989) ; (NEGRILLA) posiciones en las RM y en las RDC en las que el residuo de aminoácido humano fue substituido por el correspondiente residuo de ratón; (SUBRAYADO) posiciones en las RM en las que el residuo humano difiere del número de residuos de ratón análogos; (?) numeración de los cambios en las RM humanas; (Ac Act-l de ratón) secuencia de aminoácidos de la región VH del anticuerpo Act-l de ratón; (IIB de ratón) secuencia consenso de las regiones VH de ratón del subgrupo Ilb (Kabat, E.A. y col., antes citado) ; (I humana) secuencia consenso de las regiones VH humanas del subgrupo I (Kabat, E.A. y col., antes citado); (21/28'CL humana) secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano 21/28'CL (Dersimonian, H. y col., J. I munol . 139: 2496-2501 (1987)); (Superficial o enterrado) posición de aminoácido en relación al resto de los residuos en ambas cadenas de las regiones variables del anticuerpo; (RH VH de Act-l) secuencia de aminoácidos de la región VH del Acm Act-l humano reformado.

Tabla 4. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VH del Acm Act-l humano reformado .

Tabla 4. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VH del Acm Act-l humano reformado (Cont.).

Tabla 4. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VH del Acm Act-l humano reformado (Cont . ) .

I humana. J I I L Tapia 4. Alineación de las secuencias üe aminoácido usadas en el diseño de las regiones VH del Acm Act-l humano reformado (Cont.).

Tabla 4. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VH del Acm Act-l humano reformado (Cont.). 102 110 RDC3 Tabla 4. Alineación de las secuencias de aminoácido usadas en el diseño de las regiones VH del Acm Act-l humano reformado (Cont.).

Con respecto al diseño de la región variable de la cadena ligera del Act-l humano reformado (Tabla 3) , se cambió un residuo en las RM humanas del aminoácido presente en las RM humanas al aminoácido presente en las RM de ratón originales. Este cambio estaba en la posición 2 en RM1 (según definen Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991)). Concretamente, la isoleucina encontrada en la región variable de la cadena ligera del GM607'CL humano fue cambiada a valina, tal como se encuentra en la región variable de la cadena ligera del Act-l de ratón. Esta posición en la región variable de la cadena ligera kappa ha sido identificada por Chothia, C. y col., Nature 342 : 811-883 (1989) como una de las localizaciones críticas para la correcta orientación y estructura del bucle Ll y, como tal, se conoce como uno de los "aminoácidos canónicos". Debido a su importante papel en la confor-mación de bucles, dichos residuos de marco de ratón se conservan generalmente siempre en la región variable reformada. En la posición 4 de RM1, existe una valina en la secuencia de ratón y una metionina en la secuencia humana. Un cambio de una valina a una metionina no es un cambio drástico en sí mismo, ya que ambos aminoácidos son residuos hidrofóbicos, no polares, por lo que la metionina presente en la secuencia humana fue usada en la región variable del Act-l humano reformado. Sin embargo, el modelo indica que la valina está enterrada entre los bucles Ll y L2 y el volumen medio de valina cuando está enterrada en las proteínas es 142A3, mientras que la metionina ocupa aproximadamente 171A3 de espacio. El residuo mayor de metionina podría causar un cambio en la conformación de cualquiera de los bucles Ll y L2 o de ambos. La unión a antígeno del Act-l humano reformado puede mejorar por medio de un cambio adicional en la posición 4 de metionina a valina en la región variable de cadena ligera del Act-l humano reformado. Con respecto al diseño de la región variable de cadena pesada del Act-l humano reformado (Tabla 4) , había cinco residuos en las RM humanas que fueron cambiados de los aminoácidos presentes en las RM humanas a los aminoácidos presentes en las RM de ratón originales . En las posiciones 24 de RMl y 71 de RM3 (según definen Kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of I munological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991)), los residuos de aminoácido presentes en la secuencia de ratón fueron retenidos en la región variable de cadena pesada del Act-l humano reformado, ya que estas posiciones son parte de las estructuras canónicas para los bucles Hl y H2 , respectivamente (Chothia, C. y col., Nature 342 : 811-883 (1989)). Dado que cualquier cambio de aminoácidos en estas posiciones podría alterar el empaquetamiento y las estructuras finales de los bucles Hl y H2 , los residuos de ratón en estas localizaciones críticas son rutinariamente conservados en la región variable de cadena pesada humanizada. En la posición 48 de RM2 , la metionina en la secuencia humana fue cambiada a una isoleucina, tal como está presente en la secuencia del Act-l de ratón. La substitución de una metionina por una isoleucina es inusual. Lo que es más importante, el modelo muestra que el residuo de isoleucina está enterrado por debajo del bucle H2. Como resultado de ello, los cambios en esta posición enterrada pueden haber influido en la estructura del bucle H2 y, por lo tanto, haber interferido con la unión a antígeno. En la posición 69 de RM3 , la isoleucina en la secuencia humana fue cambiada a una leucina tal como está presente en la secuencia del Act-l de ratón. Aunque la substitución con una leucina de una isoleucina no es inusual, el modelo muestra que la leucina está enterrada bajo el bucle H2. En consecuencia, como el residuo en posición 48, los cambios en esta posición podrían influir en la conformación del bucle H2 y de este modo alterar la unión a antígeno. Finalmente, en la posición 73 de RM3 , la treonina en la secuencia humana fue cambiada a una isoleucina, tal como está presente en la secuencia de ratón. Una isoleucina en esta posición en RM3 no ha sido nunca vista con anterioridad en el subgrupo IIB de ratón o el subgrupo I humano (según definen kabat, E.A. y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, Departamento de Salud y Servicios Humanos de los EE.UU., Imprenta del Gobierno de los EE.UU. (1991)), lo que sugiere que la isoleucina en esta localización puede tener un importante papel en la unión a antígeno. En el modelo, la leucina en la posición 73 aparece en la superficie cerca del límite del sitio de unión y, dependiendo del tamaño y orientación del epitopo sobre la integrina a4ß7, puede posiblemente tomar parte directa en la unión a antígeno. Sin embargo, como posición de residuo superficial, el anticuerpo en conjunto tendría menos potencial inmunogénico si no estuviera presente el aminoácido de ratón en el anticuerpo humano reformado. La isoleucina podría ser substituida con el residuo de treonina humano en derivados del anticuerpo reformado y el nuevo constructo podría ser re-estudiado para determinar si la segunda versión mantiene un nivel similar de unión a antígeno . Además de los cinco cambios en las RM humanas hechos en el diseño original de la región variable de cadena pesada del Act-l humano reformado, se podrían hacer otros dos cambios que pueden mejorar la unión a antígeno. El modelo sugiere que los residuos 38 Lys y 40 Arg en la región variable pesada del Acm Act-l de ratón están posicionados por debajo del bucle H2 y en próximo empaquetamiento a 63Phe en RDC2 (numeración como en la Tabla 4) . Sin embargo, estos residuos se localizan también en el núcleo de la región variable de la cadena pesada y pueden tener otros efectos, posiblemente perjudiciales, si se usan para substituir a sus correspondientes aminoácidos humanos (38 Arg y 40 Ala, respectivamente) . Por lo tanto, los cambios a las posiciones 38 y 40 en RM2 no fueron incorporados a la región variable pesada humana reformada del Acm Act-l. Sin embargo, se pueden usar cualquiera de las modificaciones, o ambas, de la cadena pesada reformada en derivados para mejorar la unión a antígeno. Conclusiones Se construyó un modelo de las regiones variables del Act-l de ratón en base, principalmente, a las estructuras resueltas de otras regiones variables de anticuerpos. El modelo fue utilizado en el diseño de regiones variables de Act-l humanizado. Se puso un énfasis particular en el mantenimiento de la estructura del sitio de unión a antígeno en las regiones variables humanas reformadas . Se diseñaron una región variable de cadena ligera del Act-l humano reformado y regiones variables de cadena pesada del Act-l humano reformado (Tablas 3 y 4) . La región variable de cadena ligera del Act-l humano reformado estaba basada en las RDC de la región variable de la cadena ligera del Act-l de ratón y en las RM de la región variable de la cadena ligera del anticuerpo GM607'CL humano. Se hizo un cambio de aminoácido en las RM humanas en la posición 2. La región variable de la cadena pesada del Act-l humano reformado estaba basada en las RDC de la región variable de la cadena pesada del Act-l de ratón y en las RM de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo humano 21/28 'CL. Se hicieron cinco cambios de aminoácidos en las RM humanas, en las posiciones 24, 48, 69 , 71 y 73. Además, se observaron un único sitio en la posición 4 de RMl de la cadena ligera kappa y dos sitios en las posiciones 38 y 40 en RM2 en la cadena pesada que podrían ser considerados en el diseño de versiones adicio-nales de las regiones variables del Act-l humano reformado. Además, también se identificó un único residuo en la posición 73 de RM3 de la cadena pesada como candidato para la retromutación del aminoácido de ratón al humano, en vista de su localización sobre la superficie del anticuerpo. Ejemplo 3 Construcción de ácidos nucleicos codificantes de regiones variables reformadas Después de confirmar que se habían clonado las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera correctas bioquímica (secuencia parcial de aminoácidos) y funcionalmente (tinción con anticuerpos quiméricos de células HuT 78) , se diseñó una secuencia reformada de aminoácidos como se ha descrito antes. A continuación, se diseñaron y prepararon genes codificantes de las cadenas de anticuerpo reformadas. Diseño, construcción y expresión de ACT-1 humanizado Después de determinar la secuencia primaria de aminoácidos del anticuerpo humanizado según se describe en el Ejemplo 2, se hizo una traducción inversa de la secuencia a una secuencia degenerada de ácido nucleico y se analizó en cuanto a sitios de enzimas de restricción potenciales usando la versión 4.5.3 de MacVector (Kodak, Scientific Imaging Systems) . Se seleccionó entonces una secuencia de ácido nucleico que incorporaba sitios de excisión por enzimas de restricción, pero que conservaba la secuencia primaria de aminoácidos. En la Figura 11 se muestran la secuencia de ácido nucleico de la cadena pesada (SEC ID N° : 18) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID N° : 19) y en la Figura 12 se muestran la secuencia nucleica de la cadena ligera (SEC ID N° : 20) y la secuencia de aminoácidos (SEC ID N° : 21) , con indicación de los sitios de enzimas de restricción que fueron utilizados en la subclonación. Se construyeron los genes de las regiones variables de cadena pesada y ligera del Act-l humanizado como sigue. Se sintetizaron oligonucleótidos complementarios solapantes, denominados L1-L6 (SEC ID N° : 22-27, respectivamente) para la cadena ligera y H1-H10 (SEC ID N° : 28-37, respectivamente) para la cadena pesada usando un Sintetizador de ADN de Applied Biosystems, Modelo 392 (Figura 13) . Después de desprotección durante la noche a 55°C, los oligos fueron secados en un Speed-Vac, resuspendidos en 100 mi de agua y desalados sobre columnas Bio-Spin 6 (Bio-Rad) . Se determinó la concentración de oligos midiendo la absorbancia a 260 nm y se purificaron los oligos por electroforesis en gel de poliacrilamida desnaturalizante . Se mezclaron 100 µg de cada oligo con 2 volúmenes de colorante de carga (formamida 95%, EDTA 20 mM, azul bromofenol 0,05%, xileno cianol FF 0,05%), se calentó durante 2 minutos a 65°C y se hizo correr en TBE IX durante aproximadamente 3 horas a 250 V. Se tiñó el gel con bromuro de etidio y se observó con luz ultravioleta. Se sacaron del gel los oligos de longitud correcta, se pusieron en tubos de diálisis con agua y se electroeluyeron. Se extrajeron dos veces los oligos con volúmenes iguales de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1 v/v) (Gibco/BRL) y se precipitaron añadiendo 0,1 volúmenes de acetato de potasio 3,0 M (pH 6) y 2 volúmenes de etanol frío. Después de la centrifugación, se lavaron las pellas una vez con etanol 70%, se secaron a vacío y se resuspendieron en 50 µl de agua. Se recocieron oligos complementarios mezclando cantidades molares iguales (aproximadamente 100 µg en 50 µl de agua) de oligo purificado con un volumen igual (100 µl) de tampón de recocido 2X (2X = NaCl 1 M, Tris-HCl 40 mM a pH 7,5, EDTA 2 mM) . Los oligos fueron desnaturalizados calentando a 95°C durante 10 minutos, seguido de una incubación de 8 horas a 65°C. Los oligos recocidos fueron entonces precipitados con etanol según se ha descrito previamente y resuspendidos en 40 µl de agua. La extensión de los oligos recocidos fue realizada por adición de 2 µl de Fragmento Grande de ADN Polimerasa I (Kleno ) , 5 µl de dNTP 2 , 5 mM y 5 µl de Tampón 10X (10X = Tris-HCl 10 mM, MgCl2 10 mM, DTT 1 mM, pH 7,9 a 25°C) , llevando el volumen final a 52 µl . Se incubó la mezcla durante una hora a temperatura ambiente. Se añadieron 1 µl de dNTP y 1 µl de Klenow adicionales, con una incubación de media hora a 37°C. Obsérvese que el fragmento A de cadena pesada no tuvo que ser extendido. Los fragmentos recocidos y extendidos fueron purificados a partir de un material no recocido, de una sola hebra, por electroforesis a través de un gel de poliacrilamida nativo al 12%. El gel fue teñido con bromuro de etidio y observado con luz ultravioleta. Se sacaron los fragmentos de longitud correcta y se recuperaron por electroelución en tubos de diálisis como se ha descrito antes . Los fragmentos fueron lavados dos veces con volúmenes iguales de fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, precipitados con etanol y resuspendidos en 10 µl de agua . Los tres fragmentos de cadena ligera (LA, LB y LC) y cinco fragmentos de cadena pesada (denominados HA-HE) fueron independientemente ligados en pCR-Script™ y transformados, excepto por lo que se describe a continuación, en Células Supercompetentes XL-1 Blue usando un kit pCR-Script (Stratagene) según el protocolo recomendado por el fabricante. Los fragmentos pCR-LA y pCR-LB fueron transformados en células competentes DM1 (Gibco/BRL) para evitar la Dem metilasa, que bloquearía la digestión con la enzima de restricción Msc I. Se recogieron las colonias blancas y se secuenció el ADN miniprep usando un kit de ADN polimerasa T7 Sequenase según el protocolo recomendado por el fabricante . Se usaron cebadores T3 y T7, que se recuecen en lados opuestos del inserto, para la secuenciación. La subclonación de recopilación de los fragmentos de la región variable de cadena pesada y de la región variable de cadena ligera humanizadas fue llevada a cabo usando sitios de restricción específicos incorporados a la secuencia durante la síntesis. Los fragmentos de cadena pesada HA-HD incluyen un sitio adicional de restricción Age I al final de cada secuencia, que permite la subclonación secuencial de los fragmentos como se describe a continuación. Se digirió ADN miniprep de pCR-HA y pCR-HB con enzimas de restricción Spe I y Age I . El ADN fue sometido a electroforesis en un gel de agarosa 1%. El fragmento de 141 pb HB fue recuperado del gel y ligado en pCR-HA en los sitios Spe I y Age I, dando lugar a pCR-HAB. A continuación, se liberó el fragmento HC de 112 pb de pCR-HC usando Xba I y Age I y se ligó en los sitios Xba I y Age I en pCR-HAB, dando lugar al plásmido pCR-AC. Los fragmentos HD (141 pb) y HC (130 pb) fueron ligados de la misma forma secuencial usando sitios de restricción Nhe I y Age I para el Fragmento HD y Bst E II y Age I para el fragmento E. El plásmido final que contenía los cinco fragmentos de la región variable de cadena pesada en pCR-script fue denominado pCR-HAE. Todos los digestos fueron realizados usando ADN miniprep con incubaciones a 37°C durante al menos dos horas, excepto por aquéllos que utilizaron BstE II, que tiene una temperatura óptima de incubación de 65°C. Las ligaduras fueron hechas por la noche a 16°C, usando ADN ligasa T4, con una razón vector a inserto de 1:10, y se transformaron al día siguiente en células competentes en cuanto a eficacia de subclonación DH5 (Gibco/BRL) siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante. La región variable de cadena pesada humanizada de Act-l en pCR-Script™ fue liberada por digestión de pCR-HAE con HindIII y age I. Se utilizó este fragmento de 411 bp para substituir las secuencias de la región variable de ratón de pEE6mhACTlHchi (Ejemplo 1) que habían sido digeridas con HindIII y Age I, generando el gen de cadena pesada ACT-1 humanizada en pEE6hCMV-B. El plásmido resultante es denominado pEE6hACTlH. Se determinó la secuencia correcta de ADN por secuenciación. El fragmento A de cadena ligera en pCR- Script™ fue digerido con BspE I y Mscl . Este fragmento de 153 pb fue luego utilizado para substituir la porción de ratón de BspE I a Mscl de la cadena ligera variable de ratón en pCR-script™. Este plásmido es denominado pCR-LhAmBC. El fragmento B de cadena ligera, digerido con Msc I y Nru I, y el fragmento C de cadena ligera, digerido con Nru I y Kas I, fueron triplemente ligados en los sitios Mscl y Kas I de pCR-LhAmBC, substituyendo al resto de la secuencia de ratón. Las digestiones, ligaduras y transformaciones utilizaron los mismos procedimientos que los previamente indicados, excepto por la utilización de células competentes DM1 en todas las transformaciones, excepto en la final . La región variable de cadena ligera humanizada en pCR-Script™ y el plásmido pEE12mhACTlLchi (Ejemplo 1) fueron digeridos con Hind III y Kas I. El fragmento de la región variable de cadena ligera de 360 pb y la región constante de cadena ligera de 315 pb fueron purificados por gel y triplemente ligados en el sitio de restricción Hind III de pEE12, para obtener pEE12hACTlL. Se realizó secuenciación para confirmar la orientación y la secuencia de ácido nucleico correctas. Se construyó un vector de expresión que contenía tanto los genes humanizados de cadena pesada como los de cadena ligera usando el mismo método que el descrito para el anticuerpo quimérico (véase el Ejemplo 1, Expresión de una inmunoglobulina quimérica) , con la siguiente excepción. Debido a un sitio adicional de restricción Bgl II en la región de cadena pesada variable humanizada, se usó un digesto parcial al cortar con Bgl II para obtener el fragmento correcto. El vector que contenía los genes humanizados de cadena pesada y ligera es denominado pEE12hACTlLH. Se llevó a cabo la expresión transitoria de todos los constructos de anticuerpos humanizados y la tinción de células usando los mismos protocolos que los empleados para el anticuerpo quimérico (véase el Ejemplo 1, Expresión de una inmunoglobulina quimérica) . La Figura 14 muestra los resultados de la tinción de HuT 78 usando el anticuerpo Act-l quimérico murino-humano o el anticuerpo Act-l humanizado en comparación con un anticuerpo control irrelevante de isotipo parejo (IgGl, kappa) . Se obtuvieron transfectantes estables de células NSO, una línea de células de mieloma (Methods in Enzymol . 73 (B) -. 3 -46 (1981); European Collection of Animal Cell Cultures, PHLS CAMR Portón Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, U.K., ECACC N° 85110503) por electroporación de células NSO con pEE12hACTlLH. Expresión estable en células NSO Se linealizaron 40 µg de pEE12hACTlLH para transfección estable por digestión con la enzima de restricción Salí, que corta en la porción plasmídica bacteriana del constructo. Se precipitó el ADN linealizado de la solución usando dos volúmenes de etanol más 1/10 de volumen de acetato de sodio, se lavó en etanol 70%, se secó y se resuspendió en agua estéril. Se mantuvieron células NSO de crecimiento exponencial en medio no selectivo (medio de Eagle modificado de Dulbecco (alto en glucosa) , con L-glutamina 2 mM, sin piruvato de sodio, con 4500 mg/L de glucosa y con tampón HEPES 25 mM (GIBCO/BRL, N° de Catálogo 12430-021) , más un 10% de suero bovino fetal (Gibco/BRL, N° de Catálogo 16000-044) ) . Se centrifugaron las células NSO, se lavaron y se resuspendieron en PBS frío, de tal forma que, después de añadir el ADN, las células estuvieran a una concentración de 107 células/ml. Se añadió el ADN plasmídico linealizado (40 µg) a 107 células en una cubeta de electroporación sobre hielo. Se mezclaron suavemente las células y el ADN para evitar la generación de burbujas y se dejó la mezcla sobre hielo durante 10 minutos. Se secó el exterior de la cubeta y se dieron dos pulsos consecutivos de 1500 V, 3 µF, usando un Pulsador Génico (Bio-Rad) . Se devolvió la cubeta al hielo durante 10 minutos . Se transfirieron las células transfectadas a placas de 96 pocilios, a densidades de 3 x 105, 7,5 x 10* y 1,5 x 104 células/ml, en 5"0 µl de medio no selectivo y se incubó a 37°C durante 24 horas. A continuación, se añadieron a todos los pocilios 150 µl de medio selectivo (medio de Eagle modificado de Dulbecco libre de glutamina, con 4500 mg/L de glucosa, con 4 mg/L de piridoxina HCl, con 110 mg/L de piruvato de sodio, sin nitrato férrico, sin L-glutamina (JRH BioSciences, N° de Catálogo 51435-78P) , más Suplemento GS IX (Suplemento GS 50X obtenido de JRH Bioscience, N° de Catálogo 58672-77P) , más un 10% de suero bovino fetal dializado (Gibco/BRL, N° de Catálogo 26300-061)). Las placas fueron devueltas a la incubadora hasta que se hubiera producido la muerte substancial de las células y hubieran aparecido colonias supervivientes discretas. Una vez se pudieron ver las colonias de trans-fectantes glutamina-independientes, se seleccionaron los pocilios con colonias simples y se recogieron y estudiaron los sobrenadantes gastados del cultivo de tejidos en cuanto a secreción de IgG humana por ELISA, según se describe a continuación. Se obtuvo un clon productor de anticuerpo, denominado 3A9, que fue usado en posteriores estudios, de este modo. Se realizó una segunda transfección como se ha descrito antes, excepto por el hecho de que se realizó la selección en presencia de L-metionina sulfoximina (MSX, un inhibidor de la glutamina sintetasa) . Las colonias positivas fueron estudiadas por ELISA en cuanto a secreción de IgG humana como sigue. Se revistieron placas de ELISA (NUNC Maxisorp) durante la noche a 4°C con 100 µl de fragmento F(ab')2 AffiniPure de IgG de burro anti-humana (H+L) (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a 2,5 µg/ml en tampón carbonato, pH 9,5. Se lavaron las placas cuatro veces con PBS Tween 20 y se bloquearon durante 2 h a 37°C con 200 µl de PBS, 1% de SAB. Las placas fueron lavadas e incubadas durante 15 min a 37°C con 100 µl de sobrenadante de NSO transfectadas estable. Se usó IgGl humana kappa a 1 mg/ml en PBS, 1% SAB, como patrón. Se usó medio NSO fresco (DME + suplemento GS) como control negativo. Las placas fueron lavadas e incubadas 15 min a 37°c con 100 µl de fragmento F(ab')2 Affinipure de IgG de burro anti-humana (H+L) conjugado a peroxidasa (Jackson ImmunoResearch Laboratories) a 0,05 µg/ml en PBS (sin Ca2+/Mg2+) . Se disolvió una tableta de 5 mg de diclorhidrato de 0-fenilendiamina (DOF) (Sigma) en 12 mi de tampón citrato (0,1 M, pH 5,0) y se añadieron 12 µl de peróxido de hidrógeno 30% después de disolverse la tableta. Después de lavar para separar el anticuerpo secundario, se añadieron 100 µl de substrato DOF disuelto. Se detuvo la reacción con ácido sulfúrico 12,5% y se leyeron las placas en un Lector de Placas Dynatech a 490 nm. Se clonaron los pocilios positivos por dilución limitante a 2, 1 y 0,5 células por pocilio. Cuando todos los pocilios de un solo clon dieron positivo para la producción de anticuerpo por ELISA, se consideró la línea como clonada. La purificación de anticuerpo ACT-1 humanizado de los sobrenadante de cultivo celular de cultivos de transfectantes celulares transitorios o estables fue llevada a cabo por cromatografía de afinidad con Proteína A (Poros A/M 4,6/100 mm, 5 ml/min, usando una estación de trabajo Bio-Cad (Perseptive Biosystems, Inc.). Se equilibró la columna con PBS, seguido de aplicación del sobrenadante del cultivo celular, que había sido previamente filtrado a través de filtros de 0,2 mieras. El volumen de sobrenadante de cultivo celular aplicado por vuelta variaba según la concentración de anticuerpo. Normalmente, no se aplicaron más de 15 mg de anticuerpo a la columna en una vuelta dada. La velocidad de flujo era de 5 ml/min a través de todo el procedimiento de purificación. Después de la unión, la columna fue lavada primero extensamente con PBS hasta que la DO280 nm = 0. La columna fue entonces lavada de nuevo con un mínimo de 50 volúmenes de columna. La columna fue posteriormente lavada con acetato de sodio 0,1 M, pH 5,0. La elución fue llevada a cabo por lavado con Na citrato 0,1 M, pH 3,5. El eluato fue recogido en fracciones de 5 mi y el pH neutralizado por adición de 200 µl de Na2C03 1,5 M, pH 12. Se reunieron entonces las fracciones que contenían anticuerpo y se concentraron a la concentración deseada por ultracentrifugación (centricon, corte a los 30.000 KDa, Amicon) . Construcción de una variante mutada en Fc Se construyó también una versión de unión no Fc (mutada en Fc) del anticuerpo Act-l humanizado. Este anticuerpo tiene las mismas regiones variables que el anticuerpo Act-l humanizado (Figura 11 y Figura 12) y una región constante de IgGl humana idéntica, con la excepción de dos substituciones de aminoácidos en la región constante de cadena pesada de la IgGl, diseñada para abolir el reconocimiento FcR y eliminar la unión de Fc (es decir, una substitución Leu235 — Ala235 y una substitución Gly237 - Ala237) . El ácido nucleico codificante de la cadena pesada del derivado mutado en Fc fue construido como sigue. Se digirió un constructo denominado 3678 (obtenido del Dr. Hermán Waldmann, Universidad de Oxford) , que codifica para la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo anti-CD18 humanizado (WO 93/02191 (publicada el 4 de Febrero de 1993); Sims, M.J. y col., J". Immunol . 151 (4) . - 2296-2308 (1993)) en un vector de expresión pEE12, pero en el que se introdujeron dos substituciones de aminoácido en la región constante de la cadena pesada de la IgGl por mutagénesis dirigida a sitio (Leu235 — > Ala235 y Gly237 -» Ala237) , con Age I y EcoRI para liberar un fragmento de 900 pb que contenía el mutante de la región constante gamma. Este fragmento fue usado entonces para substituir la región constante gamma de tipo salvaje de cadena pesada en los sitios Agel/EcoRI en pEE6hACTlH, dando lugar a pEE6hACTlH/FCmut . De una forma análoga a la descrita anteriormente para otros constructos que contienen ambas cadenas, se preparó un solo constructo (pEE12hACTlLH/FCmut) que contiene el gen de cadena ligera reformado y el gen de cadena pesada reformado mutado en Fc. Ejemplo 4 Caracterización de LDP-02, un anticuerpo ACT-1 humanizado Se llevaron a cabo estudios de caracterización inicial usando anticuerpo producido a partir de células COS-7 transitoriamente transfectadas con pEE12hACTlLH/-FCmut . Esta preparación de anticuerpo fue producida y purificada como se ha descrito antes y se hace referencia a ella a continuación como "1°HUM ACT-1", seguido del número de lote apropiado. Se realizaron ensayos adicionales usando anticuerpo producido a partir de un transfectante estable de la línea celular murina NSO según se ha descrito anteriormente (transfectada con pEE12hACTlLH/FCmut linealizado) . Se hace a continuación referencia a esta preparación de anticuerpo como "LDP-02/3A9/Lote 1". Se utilizó el anticuerpo "LDP-02/3A9/Lote #1" en los siguientes estudios descritos a continuación: SDS-PAGE, análisis de "Western blot", enfoque isoeléctrico, análisis de la composición de aminoácidos, reactividad cruzada de especie, titulación, ensayos de lisis mediada por complemento, ensayos ADCC y ensayos de inhibición de la unión. Se utilizó "1°HUM ACT-1 Lote #7" en los ensayos de afinidad #1-2, se utilizó 1°HUM ACT-1 Lote #8/9 en los ensayos de afinidad #3-5 y se utilizó 1°HUM ACT-1 Lote #8/9 en los ensayos de unión a Clq. A. Propiedades fisicoquímicas 1 . SDS-PAGE Con objeto de ayudar a establecer la identidad, a caracterizar la primera preparación y a valorar la pureza, se sometió LDP-02/3A9/Lote#l a electroforesis en dodeciisulfato de sodio gel de poliacrilamida ("SDS-PAGE") en condiciones no reductoras y reductoras y se tiñó con azul Coomassie coloidal. Se añadieron 80 µl de LDP-02/3A9/Lote#l a una concentración nominal de 0,82 mg/ml a un microconcentrador. Se cambió el tampón citrato, en el que estaba disuelto el anticuerpo, tres veces con 160 µl de tampón Tris (0,5 mM, pH 8,8) . El volumen final de la muestra después del cambio de tampón era de 135 µl, dando una concentración de proteína de 0,486 mg/ml. Esta solución fue diluida dos veces con tampones no reductores y reductores para obtener una concentración de 0,243 mg/ml . Se cargó una alícuota de 13 µl de la solución de 0,243 mg/ml, que contenía 3,16 µg de proteína, en las bandas de muestras designadas del gel SDS. Se llevó a cabo la SDS-PAGE y los artículos control incluían patrones de peso molecular Mark 12 (Novex, #LC5677) . En condiciones no reductoras, estaba presente una banda mayor con un peso molecular aparente ligeramente inferior a 200.000 Daltons en LDP-02/3A9/Lote#l . Se observaron varios componentes menores entre 116.300 y 200.000 Daltons. Se observaron también tres componentes menores adicionales con pesos moleculares aproximados de 97.400 Daltons, ligeramente mayor de 55.400 Daltons y menos de 31.000 Daltons. El barrido del gel usando una densitometría de láser permitió el análisis cuantitativo de las bandas teñidas de polipéptido y luego el cálculo del porcentaje de área asociada a cada banda visible (Tabla 5) . Los datos obtenidos del análisis cuantitativo indican que el componente mayor observado a aproximadamente 200.000 Daltons representaba un 84,4% de las bandas teñidas totales en la banda de la muestra de ensayo. Esta banda mayor representaba el anticuerpo intacto, mientras que las otras bandas a 55.000 y 31.000 Daltons representaban cadenas pesadas y ligeras simples, respectivamente . En condiciones reductoras, se observaron dos componentes mayores en el gel de electroforesis . El peso molecular de uno de los componentes era de aproximadamente 55.400 Daltons y representaba un 68,6% de las bandas teñidas totales visualizadas en la banda del gel, mientras que el segundo componente correspondiente a ligeramente menos de 31.000 Daltons, representaba un 30,5% de las bandas teñidas totales (Tabla 5) . Los pesos moleculares de estos dos componentes están de acuerdo con los pesos moleculares esperados de las cadenas pesadas y ligeras de una inmunoglobulina G. Estos datos indican que aproximadamente un 99% de la preparación consistía en anticuerpo intacto o en cadenas simples de inmunoglobulinas de cadena pesada o ligera. Además de los dos componentes mayores, se observó también un componente menor a ligeramente menos de 66.300 Daltons. A partir de estos análisis, una especie de alto peso molecular, consistente con la de la inmunoglobulina G intacta, está presente como banda mayor en LDP-02/3A9/Lote#l . También están presentes varias bandas menores en LDP-02/3A9/Lote#l . Después de la reducción, se observaron dos bandas mayores que muestran migraciones electroforéticas consistentes con las de las cadenas pesadas y ligeras de una molécula de inmunoglobulina G.

TABLA 5 RESUMEN DE LOS DATOS DE PUREZA AZUL COOMASSIE COLOIDAL, CONDICIONES NO REDUCTORAS RESUMEN DE LOS DATOS DE PUREZA AZUL COOMASSIE COLOIDAL, CONDICIONES REDUCTORAS 2. Análisis de Western blot Se analizaron las muestras y los patrones por SDS-PAGE como se ha descrito anteriormente. Resumiendo, se analizaron muestras no reducidas y reducidas en un gel de Tris-glicina 4-20%. Se hicieron correr también por el gel patrones de peso molecular Novex Mark 12. Se cargaron volúmenes de alícuotas de 2,1 µl y 4,5 µl de la solución de 0,2143 mg/ml, dando 0,51 y 1,09 µg de proteína, respectivamente, en las bandas designadas para muestras del gel SDS. Después de la SDS-PAGE, se transfirieron las proteínas de la muestra del gel a nitrocelulosa, según las instrucciones del aparato de transferencia Novex Western. El tampón de transferencia usada era tampón Tris-glicina IX en metanol 20%. Después de aproximadamente 2 horas, se retiró la mancha de nitrocelulosa del aparato de transfe-rencia y se lavó con agua DDI . Se bloqueó entonces la mancha de nitrocelulosa a 37°C durante 35 minutos en tampón Tris (20 mM) , que contenía un 3% de gelatina y un 0,1% de Tween 20. Se retiró la mancha de la solución bloqueante y se lavó dos veces con tampón Tris . Se añadió solución de IgG de cabra anti-ratón, que fue preparada diluyendo solución madre de anticuerpo IgG anti-ratón 1000 veces con solución Tris 20 mM-SAB 3%, a la mancha y se incubó a 2-8°C durante la noche. Después de la incubación, se lavó la mancha con cuatro cambios de tampón Tris durante 5 minutos cada uno. Se añadió solución de conjugado de IgG anti-cabra y fosfatasa alcalina, preparada por dilución de conjugado de IgG anti-cabra y fosfatasa alcalina 5000 veces con solución Tris 20 mM-SAB 3%, a la mancha y se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas. Después de la incubación, se lavó la mancha con cuatro cambios de tampón Tris durante 5 minutos cada uno. Se añadió substrato de FBCI/NAT (sal de p-toluidina de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3 ' -indolilo/cloruro de nitro-azul tetrazolio) , 10 mi de una vez, a la mancha. Se reveló la mancha a temperatura ambiente con agitación. Se detuvo la reacción lavando la mancha con tampón Tris. Se repitió entonces el anterior procedimiento usando IgG de cabra anti-humana en lugar de IgG de cabra anti-ratón. Tanto en condiciones no reductoras como reductoras, usando el reactivo IgG anti-ratón, las muestras de IgG de 0,51 µg y 1,09 µg fueron claramente detectadas en la mancha de nitrocelulosa. La intensidad de las bandas aumentó al aumentar la concentración. En condiciones no reductoras, se detectó una banda mayor, que migraba ligeramente más rápido que el marcador de 200.000 Daltons. Se detectaron también varias bandas más pálidas. Dos de estas bandas migraban más lentamente que la banda mayor y aproximadamente otras tres bandas migraban más rápido. En condiciones reductoras, se detectaron dos bandas, características de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina G. Usando el reactivo IgG anti-humano tanto en condiciones no reductoras como reductoras, las muestras de IgG de 0,51 µg y 1,09 µg eran claramente detectadas en la mancha de nitrocelulosa. La intensidad de las bandas aumentaba al aumentar la concentración. En condiciones no reductoras, se detectó una banda mayor, correspondiente a una especie con un marcador de peso molecular aparente ligeramente inferior a 200.000 Daltons. Las bandas más pálidas observadas en la mancha, detectadas con IgG antiratón, fueron también detectadas. La intensidad de la inmunotinción era mayor para todas las bandas cuando se detectaron con IgG anti-humana. Se detectaron varias bandas adicionales, no observadas en la otra mancha. Es probable que estas bandas correspondan a fragmentos de IgG que carecen de epitopos reconocidos por la IgG anti-ratón. En condiciones reductoras, se detectó una banda característica de la cadena pesada de una inmunoglobulina G. Como el anticuerpo era específico para la porción Fc de la IgG humana, no se detectó la cadena ligera. Se observaron varias bandas menores, no observadas en la mancha revelada con la IgG anti-ratón, cuando la detección fue llevada a cabo con la IgG anti-humana. Esta diferencia entre las dos manchas puede ser el resultado de la presencia de fragmentos de IgG que carecen de epitopos para la unión a IgG anti-ratón. 3. Enfoque isoeléctrico Se sometió LDP-02/3A9/Lote#l a enfoque isoeléctrico (EIE) y se tiñó con azul Coomassie coloidal. Se compararon los resultados obtenidos para LDP-02/3A9/Lote#l con patrones para EIE que fueron enfocados sobre el mismo gel. Se añadieron 80 µl de LDP-02/3A9/Lote#l, a una concentración nominal de 0,82 mg/ml, a un microconcentrador. Se cambió el tampón citrato, en el que estaba el anticuerpo, tres veces con 160 µl de tampón Tris (0,5 mM, pH 8,8) . El volumen final de la muestra era de 135 µl. Se calculó que la concentración final era de 0,486 mg/ml . Esta solución fue diluida dos veces con tampón para muestras de EIE 2X para obtener una concentración de 0,243 mg/ml. Se cargó una alícuota de 13 µl de la solución de 0,243 mg/ml, dando 3,16 µg de proteína, sobre la muestra designada del gel EIE. Los artículos de control incluían patrones de EIE de p( 3,6-9,3 (Sigma, Cat. #1-3018). Se generó un gráfico patrón haciendo un gráfico de la media de la migración de distancia relativa de ocho patrones de EIE frente al pl conocido para cada una de estas proteínas patrón. El ajuste de regresión lineal de estos datos dio una pendiente negativa de 0,03459 y una interceptación de 8,91857. La R2 del ajuste era igual a 0,99206. La Tabla 6 contiene las distancias medias a las que emigraron los seis patrones de EIE y el LDP- 02/3A9/Lote#l . En esta tabla también se muestran los pl calculados para LDP-02/3A9/Lote#l . Utilizando los parámetros de regresión lineal del gráfico patrón, se calculó que los pl aproximados de las cinco bandas para LDP-02/3A9/Lote#l eran 7,88, 7,95, 8,09, 8,26 y 8,43, con el pico predominante representado por un pl de 8,09 (Tabla 6) . El pl de este pico mayor se compara favorablemente con un pl predicho de 7,91, en base a la secuencia primaria de aminoácidos .

TABLA 6 * Media 1 En base a la curva patrón (pl frente a distancia migratoria) donde : pl de la muestra = Interceptación - Pendiente (distancia migratoria de la muestra) . 4. Análisis de la composición de aminoácidos Se realizó el análisis de la composición de aminoácidos para determinar el contenido proteico y la composición de aminoácidos de LDP-02/3A9/Lote#l y confirmar la identidad.

Se retiraron primeramente alícuotas de 45 µl por triplicado para hidrólisis. Se realizó la hidrólisis a 165°C durante 60 minutos usando vapores de HCl 6 N. Como control, el recipiente de hidrólisis contenía una proteína patrón, que fue hidrolizada simultáneamente con el LDP-02/3A9/Lote#l . También se cromatografiaron patrones de aminoácidos antes y después del análisis del LDP-02/3A9/Lote#l . Los artículos control incluían seroalbúmina bovina (solución control Tektagen:310 : 197A) como proteína patrón y mezcla de hidrolizado de aminoácidos (solución control Tektagen: 310 : 199A) como patrón de aminoácidos. El método de ensayo empleaba el análisis del hidrolizado de proteína resuspendido o solución de aminoácidos libres por "HPLC" de intercambio iónico con reacción de ninhidrina post-columna y monitorización de la absorbancia a dos longitudes de onda. Se cuantificó la absorbancia a ambas longitudes de onda por comparación con una tabla de calibración obtenida analizando patrones de aminoácidos por triplicado. En la Tabla 7 se presenta la composición de aminoácidos. La concentración proteica del LDP-02/3A9/LO-te#l fue determinada como de 0,709 mg/ml. Al corregir en cuanto a la falta de cuantificación de W y C, se revisó la concentración de proteína a 0,740 mg/ml. Los datos y los cálculos pertinentes están resumidos en la Tabla 8. Para LDP-02/3A9/Lote#l, se hizo un solo punto temporal de hidrólisis (60 min) a 165°C, usando vapores de HCl 6 N. Se aplicaron factores de corrección, que habían sido derivados de la proteína patrón (SAB) , a las determinaciones del contenido proteico (Tabla 8) . En las condiciones de este método, los valores del porcentaje molar obtenidos para la prolina (Tabla 7) pueden estar ligeramente elevados, debido a la presencia de un pico coeluyente de cisteína. En consecuencia, la exactitud de la cuantificación de la prolina es dependiente de la muestra, en base a la cantidad de cisteína presente en los hidrolizados de la muestra. Para este análisis, el contenido de prolina ha sido corregido usando un factor de corrección derivado de SAB (Tabla 8) . La exactitud de esta corrección es dependiente de la muestra, en base a las cantidades relativas de cisteína en la SAB (6,0%) y en la muestra. La composición predicha de aminoácidos de LDP-02 como porcentaje relativo (frecuencia o porcentaje molar) en base a la secuencia nucleotídica de las cadenas pesadas y ligeras (% predicho) y los resultados reales del análisis de aminoácidos (% real) se presentan en la Tabla 9. La comparación de los valores predichos frente a los reales muestra una buena correlación, excepto para la prolina, que, como se ha descrito previamente, es probablemente artificialmente alta debido a un pico coeluyente de cisteína. 1 El factor de correlación es 0 , 958 , basado en el contenido en W y C del 1 , 8% y 2 , 4% , respectivamente . TABLA 8 Determinación del contenido proteico Cantidad total inyectada en la columna (ng) : 7250 Volumen de reconstitución (µl) : 220 3Cantidad total hidrolizada (ng) 31900 Cantidad total hidrolizada (µg) : 31,9 Volumen de muestra original (µl) : 45 Volumen de muestra diluida (µl) : 45 Valor de alícuota para hidrólisis (µl) : 45 Concentración de proteína (mg/ml) : 0,709 Concentración de proteína (mg/ml) después de la corrección para /C: 0,740 1E1 contenido proteico no está corregido para cisteína y triptófano. 2El factor de corrección derivado de SAB ha sido aplicado a cada aminoácido detectado. 3ng totales hidrolizados = (ng totales inyectados x volumen de reconstitución) /volumen de inyección (50 µl) .

TABLA 9 Composición de aminoácidos . Análisis de EM MALDI-TOF Se analizó el LDP-02/3A9/Lote#l por EM MALDI-TOF para determinar el peso molecular. Se detectó un pico principal con una masa centrada en 149.808 Da. El pico centrado en 74.927 Da representaba al ion 2+ de la especie encontrada en el pico principal . Habría que observar que la masa del ion 2+ no es exactamente la mitad del ion M+H; esta ligera disparidad se debe probablemente a la impreci-sión experimental, que está dentro de +/-0,2% del valor medido . En base a la secuencia primaria predicha del anticuerpo, la masa molecular esperada debería ser de 147.154 Da. La diferencia de masa de 2.654 Da entre la masa molecular de la IgG observada y la predicha, con la mayor probabilidad, puede ser atribuida a glicosilación de la molécula. Esta diferencia observada representaría un nivel de glicosilación de aproximadamente 1,8%. B. Afinidad En primer lugar, se realizó la titulación del LDP-02/3A9/Lote#l y del ACT-1 murino (Lote#2) usando citometría de flujo en células HUT-78 derivadas de humano. Para explicarlo brevemente, se suspendieron 1,0 x 106 células HUT 78 en un volumen de 100 µl de ACT-1 murino biotinilado (Lote#2) , IgGl murina biotinilada (Lote#l, preparado en Leukosite, Inc.), LDP-02/3A9/Lote#l biotinilado o IgG humana biotinilada (Jackson ImmunoResearch, Avondale, PA; Lote 25794) durante 20 minutos a 4°C, después de lo cual se retiraron los anticuerpos. A menos que se indique algo diferente, todos los reactivos fueron diluidos en PBS 0,15 M/SFT 1,0%/azida sódica 0,1%. Las concentraciones variables para ambos anticuerpos incluían 30 µg/ml (ACT-1 murino sólo) , 15 µg/ml, 7,5 µg/ml y consiguientes diluciones 1:10 de cada una. Después de separar los anticuerpos primarios, las células fueron entonces suspendidas en 100 µl de estreptavidina ficoeritrina Dako Corp., Carpintería, CA) diluidas 1:200. Después de lavar en 200 µl de PBS, las células fueron resuspendidas en 0,5 mi de PBS/formalina 1% y refrigeradas hasta su análisis . Las muestras fueron analizadas en un FACScan (Becton Dickinson Corp., San José, CA) , usando un láser de 488 nm para excitar a la ficoeritrina. Para cada muestra, se analizó un mínimo de 10.000 células y se calculó la fluorescencia media de canal (FMC) medio-máxima. Todas las muestras fueron realizadas por duplicado. Estos estudios de titulación indicaron que, a concentraciones de aproximadamente 1,0 µg/ml, se aproximaba a la fluorescencia máxima usando tanto ACT-1 murino como LDP-02/3A9/Lote#l (Figura 15) . Se consiguió la fluorescencia media de canal medio-máxima a concentraciones inferiores de LDP-02 que para el ACT-1 murino (0,1 µg/ml para ACT-1 murino biotinilado Lote#2 y 0,02 µg/ml para LDP-02/3A9/Lote#, respectivamente). Las valoraciones relativas de afinidad (y especificidad) fueron realizadas usando citometría de flujo y unión competitiva cruzada de LDP-02 y el anticuerpo Act-l murino y vice-versa en células HuT-78 derivadas de humano. Para explicarlo brevemente, se suspendieron 1,0 x 106 células HuT-78 en 100 µl de Act-l murino biotinilado (Lote#2) a 0,1 µg/ml con concentraciones variables de 1°HUM ACT-1 no conjugado o Act-l murino no conjugado, durante 20 minutos a 4°C, después de lo cual se retiraron los anticuerpos. En un experimento aparte, se usaron 100 µl de LDP-02/3A9/Lote#l biotinilado a 0,02 µg/ml con concentraciones variables de ACT-1 murino no conjugado (Lote#2) y LDP-02/3A9/Lote#l no conjugado. La concentración de anticuerpos biotinilados mantenidas constantes eran las concentraciones que daban lugar a fluorescencia media de canal (FMC) medio-máxima en células HUT-78 teñidas en idénticas condiciones, tal como se ha demostrado anteriormente . A menos que se indique algo diferente, todos los reactivos fueron diluidos en PBS 0,15 M/SFT 1,0%/azida sódica 0,1%. Las concentraciones variables para ambos anticuerpos variaban en incrementos medio log entre 2,0 x 10"6 M y 5,0 x 10"11 M. Después de separar los anticuerpos primarios, las células fueron entonces suspendidas en 100 µl de estreptavidina ficoeritrina (Dako Corp., Carpintería, CA) diluidas 1:200. Después de lavar en 200 µl de PBS, las células fueron resuspendidas en 0,5 mi de PBS/formalina 1% y refrigeradas hasta su análisis. Las muestras fueron analizadas en un FACScan (Becton Dickinson Corp., San José, CA) usando un láser de 488 nm para excitar a la ficoeritrina. Para cada muestra, se analizó un mínimo de 10.000 células y se calculó la FMC. Todas las muestras fueron realizadas por duplicado. Se determinó la CI50 como la concentración de anticuerpo no conjugado que producía una reducción del 50% en la FMC del anticuerpo homólogo biotinilado. Se realizaron estimaciones de afinidad en cinco experimentos independientes competitivos cruzados entre LDP-02 (1°HUM ACT-1) y ACT-1 murino. Cuando se usó Act-l murino biotinilado como anticuerpo mantenido constante en el ensayo, los valores de CIS0 (± 1 SEM) para LDP-02 (5,43 ± 0,86 nM) eran estadísticamente inferiores a los del ACT-1 murino (7,94 ± 1,17 nM; p=0,02, prueba t de dos colas: parejas de dos muestras para las medias), mientras que la IgGl humana o la IgGl murina irrelevantes no tenían ningún efecto competitivo (todos los experimentos están resumidos en la Tabla 10; un experimento mostrado en la Figura 16) . De forma similar, cuando el LDP-02/3A9/Lote#l biotinilado era el anticuerpo mantenido constante en el ensayo, se necesitaba una mayor concentración de Act-l murino no conjugado que de LDP-02/3A9/Lote#l para competir con LDP-02 y expulsarlo de las membranas de las células HuT-78 (CIS0 = 6,3 nM frente a 4,3 nM, respectivamente). En cada experimento, LDP-02 tenía una CI50 menor que el Act-l murino. Estos resultados demuestran que LDP-02 era específico para el epitopo reconocido por el Act-l murino y que su afinidad de unión era mejor que la del anticuerpo murino.

TABLA 10 ACT-1 murino y ACT-1 humanizado (LDP-02) Valoración de afinidad p = 0, 02 Prueba t de dos colas: Parejas de dos muestras para las medias C. Reactividad cruzada de especie Se utilizó citometría de flujo para evaluar la reactividad cruzada de especie. Se añadieron 100 µl de sangre anticoagulada con EDTA extraída de un humano, perro, gato, cobaya o rata a tubos FACS. Se separó el plasma y se resuspendieron entonces las pellas de sangre en 100 µl de LDP-02/3A9/LOTE#1 biotinilado, IgG humana biotinilada irrelevante (Jackson ImmunoResearch, Avondale, PA) , Act-l muríno biotinilado Lote#2 o IgG murina biotinilada irrelevante (Dako Corp., Carpintería, CA) , a una concentración de 15 µg/ml . A menos que se indique algo diferente, todos los reactivos fueron diluidos en PBS 0,15 M/SFT 1,0%/azida sódica 0,1%. Las muestras fueron incubadas con anticuerpos durante 20 minutos a 4°C, después de lo cual los anticuerpos fueron eliminados por lavado. Se incubaron entonces las células con 100 µl de estreptavidina ficoeritrina diluidas 1:200 (Southern Biotechnology Associates, Inc., Birmingham, AL) durante 20 minutos a 4°C. Se lisaron entonces las células rojas de la sangre usando un reactivo de lisis comercial (solución de lisis FACS, Becton Dickinson, San José, CA) según el protocolo del fabricante. Después de lavar en PBS, las células fueron resuspendidas en 0,5 mi de PBS/formalina 1% y refrigeradas hasta su análisis. Las muestras fueron analizadas en un FACScan (Becton Dickinson Corp., San José, CA) usando un láser de 488 nm para excitar a la ficoeritrina. Se ajustó la puerta de adquisición de linfocitos con parámetros de dispersión de la luz hacia adelante y a 90 grados. Para cada muestra, se analizaron 10.000 células. El LDP-02/3A9/Lote#l biotinilado reconocía a una subpoblación de linfocitos humanos con un patrón heterogéneo de tinción, similar al producido con el Act-l murino y distinto del patrón producido por tinción con controles emparejados en cuanto a isotipo humanos o murinos. Además, cuando se examinaron en linfocitos de perro o de gato, tanto el LDP-02/3A9/Lote#l como el Act-l murino producían un patrón de tinción heterogéneo similar al derivado usando linfocitos humanos. El LDP-02/3A9/Lote#l o el ACT-1 murino no reconocían a los linfocitos de rata o de cobaya en estas condiciones. D. Unión a Clq Se utilizó citometría de flujo para valorar el potencial de LPD-02 para unirse al componente Clq del complemento humano, utilizando una técnica previamente descrita (Sims, M.J. y col., J. I munol . 151 : 2296-2308 (1993) ) . Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humana por separación por densidad de Ficoll estándar. Se bloquearon primeramente 375.000 células con suero normal de conejo 10%/PBS durante 10 minutos a 4°C. Después de la eliminación por lavado, las células fueron incubadas con 100 µl de (a) CAMPATH-1H (Therapeutic Antibody Center, Cambridge, U.K.), (b) IgGl humana (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) , (c) LDP-01 (un derivado del anticuerpo anti-CD18 descrito en WO 93/02191 (publicada el 4 de Febrero de 1993) y Sims, M.J. y col., J. Immunol . 141 (4) : 2296-2308 (1993), que contiene dos substituciones de aminoácidos en la región constante de cadena pesada de la IgGl (Leu235 ? Ala235 y Gly237 ? Ala237) , también denominado "FcRmut CD18", Therapeutic Antibody Center, Cambridge, U.K.), o (d) LDP-02 (1°C hum ACT-1 Lote#8/9) , a 10 µg/ml, durante 20 minutos a 4°C. CAMPATH-1H sirvió como anticuerpo control positivo, mientras que LDP-01 y la IgGl humana fueron utilizados como anticuerpos control negativos. Todos los reactivos fueron diluidos en SAB 2%/PBS. Como control negativo adicional, se añadió también SAB 2%/PBS solo. Se eliminó entonces el anticuerpo por lavado y las células fueron resuspendidas en 50 µl de componente Clq del complemento humano (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) , a 10 µg/ml, durante 30 minutos a 4°C. Las células fueron entonces lavadas y resuspendidas en 100 µl de anticuerpo anti-Clq humano de conejo conjugado a FITC (Dako Corp., Carpintería, CA) a 20 µg/ml, durante 20 minutos a 4°C. Después de lavar en 200 µl de PBS, las células fueron resuspendidas en 0,5 mi de PBS/formalina 1% y refrigeradas hasta su análisis. Las muestras fueron analizadas en un FACScan (Becton Dickinson Corp., San José, CA) usando un láser de 488 nm para excitar al FITC.

Para cada muestra, se analizó un mínimo de 10.000 células y se calculó la fluorescencia media de canal (FMC) . Las CMSP humanas incubadas con CAMPATH-lh se unieron al Clq humano, dando lugar a una significativa desviación en la FMC, mientras que los patrones de tinción provocados por incubación de las CMSP con LDP-01, SAB o IgGl humana eran todos similares y se caracterizaban por una tinción de fondo relativamente baja. El patrón de tinción producido por la preincubación de CMSP con LDP-02 era idéntico al producido en estas muestras control negativo, lo que demuestra que LDP-02 no se une a Clq en estas condiciones . E. Lisis mediada por complemento Se examinó la capacidad de LDP-02/3A9/Lote#l para participar en la lisis celular mediada por complemento usando un protocolo previamente descrito por Bindon, C.l. y col. ( Transplantation , 40:538-544 (1985)). Se extrajo sangre humana heparinizada asépticamente y se recogió el plasma y se puso inmediatamente sobre hielo. Se aislaron las células mononucleares de sangre periférica (CMSP) por centrifugación durante 15 minutos sobre una capa de Ficoll-Hypaque, densidad 1,077 g/ml, y se lavaron dos veces en medio completo consistente en RPMI 1640/SFT %/100 U/ml penicilina/100 µg/ml estreptomicina/L-glutamina 2,0 mM. Se incubaron entonces 25 millones de células a 37°C durante 1 h en 150 µCi de 51cromato de sodio en solución salina estéril (E.I. du Pont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE) . Las células fueron lavadas dos veces en medio y resuspendidas a 106/ml. Se añadieron entonces 50 µl de la suspensión (5,0 x 104 células) a los pocilios de una placa de microtitulación de fundo en U, que contenía 100 µl de (a) CAMPATH-1H (Therapeutic Center, Cambridge, U.K.), (b) CAMPATH-1G (Therapeutic Center, Cambridge, U.K.), (c) IgGl humana (Sigma Chemical Co., St .

Louis, MO) , (d) LDP-02/3A9/Lote#l, o (e) LDP-01 (FcRmut CD18, Therapeutic Antibody Center, Cambridge, U.K. (véase lo anterior)), a concentraciones de 50, 25, 5, 2,5 y 0,5 µg/ml en medio. Los anticuerpos CAMPATH-1 fueron utilizados como anticuerpos control positivo en el ensayo, mientras que la IgGl humana y el LDP-01 fueron usados como controles negativos. Los pocilios adicionales contenían células suspendidas en 100 µl de Triton-X-100 0,1% (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) en medio completo. Las células incubadas con Triton-X-100 fueron usadas para medir la liberación total, mientras que los pocilios control sin anticuerpo fueron usados para medir la liberación espontánea. Después de incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente, se añadieron 50 µl de plasma autólogo como fuente de complemento a cada pocilio, hasta una concentración final del 20%. Las células fueron incubadas durante 45 minutos a 37°C y luego centrifugadas a 100 g durante 2 minutos y se recogieron 100 µl de los sobrenadantes. Se midió el slCr liberado en un contador gamma Cobra II (Packard Instruments, Downers Grove, IL) . Todas las muestras fueron hechas por duplicado. El porcentaje de liberación específica de 51Cr fue calculado usando la fórmula: (ensayo-espontáneo) xl00% Liberación específica = total-espontáneo Tal como han descrito previamente Bindon y col. ( Transplantation, 40:538-544 (1985)), tanto CAMPATH-1H como CAMPATH-1G inducían hasta un 35% de lisis mediada por complemento de las CMSP humanas de una forma dosis-dependiente. Además, según era de esperar, los controles de IgGl humana y LDP-01 (Fc-mut CD18) no indujeron ninguna lisis celular detectable. LDP-02 no medió en la lisis celular a ninguna de las concentraciones examinadas, hasta, inclusive, 25 µg/ml (Figura 17) . F. Ci totoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA) Se utilizaron blastos CD3+ humanos como células diana para valorar la capacidad de LDP-02 para participar en la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (CCDA) . Se generaron blastos CD3+ en placas de 24 pocilios revestidas con el anticuerpo anti-CD3 RT66, a una concentración de 5 µg/ml diluido en PBS. Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) humanas por centrifugación durante 15 minutos sobre una capa de Ficoll-Hypaque, densidad de 1,077 g/ml, se lavaron y se resuspendieron en medio completo, según se describe en la sección anterior. Se añadieron entonces 2 millones de células a cada pocilio de la placa de 24 pocilios y se incubaron a 37°C, 5% de C02, durante 4 días. Las células fueron entonces transferidas a un matraz de cultivo e incubadas a 37°C, 5% de C02, en medio con IL-2 recombinante humana (Genzyme Corp., Cambridge, MA) , a una concentración de 10 unidades/ml. Al cabo de tres días en cultivo, se incubaron entonces 10,0 x 106 blastos CD3 a 37°C durante 45 minutos en 150 µCi de 51cromato de sodio en solución salina estéril (E.I. du Pont de Nemours & Co., Inc., Wilmington, DE; Lote#95M682) . Después de dos lavados en medio completo, las células fueron resuspendidas a 2 x 10s células/ml y se añadieron 50 µl (10.000 células) de la suspensión a los pocilios de una placa de microtitulación de 96 pocilios de fondo en U. Los pocilios contenían 50 µl de CAMPATH-1H (Therapeutic Antibody Center, Cambridge, U.K.) o LDP-02/3A9/Lote#l, a concentraciones finales de 50, 5, 2,5, 0,5, 0,25 ó 0,05 µg/ml en medio. Las células fueron incubadas con anticuerpos durante 30 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual se añadieron 0,5 x 106 CMSP recién aisladas (gradiente de Ficoll-Hypaque, 2 lavados en medio completo a 37°C) de un donante diferente a cada pocilio como células efectoras (razón efector :diana de 50:1). A los pocilios adicionales, se añadieron 100 µl de Triton-X-100 5% en medio (Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) . Las células incubadas con Triton-X-100 fueron usadas para medir la liberación total, mientras que se incluyeron controles sin anticuerpo y células efectoras para medir la liberación espontánea de radioactividad. Las células fueron centrifugadas a 100 g durante 2 minutos a temperatura ambiente e incubadas durante 20 horas a 37°C, 5% de C02, después de lo cual las células fueron transferidas a una placa de 96 pocilios de fondo en V y centrifugadas a temperatura ambiente. Se recogieron 100 µl de sobrenadantes y se midió la radioactividad liberada en un contador gamma Cobra II (Packard Instruments, Downers Grove, IL) . Todas las muestras fueron realizadas por duplicado. Se calculó el porcentaje de liberación específica de 51Cr usando la fórmula: (ensayo-espontaneo) xl00% Liberación específica = total-espontáneo Como demostraron previamente Sims, M.J. y col., J". Immunol . 151 (4) -.2296-2308 (1993), CAMPATH-1H participaba en la CCDA de una forma dosis-dependiente, provocando hasta aproximadamente un 30% de liberación específica de 51Cr a concentraciones > 5,0 µg/ml. No se detectó ninguna liberación específica en los pocilios que contenían LDP-02 a ninguna de las concentraciones examinadas . G. Inhibición de la adhesión a MAdCAM-1 Se valoró la capacidad de LDP-02 para inhibir la unión de a4ß7 a MAdCAM-1 usando células RPMI 8866 a4ß7+ (un linfoma humano de células B) marcadas fluorescentemente y una quimera MAdCAM-1 consistente en todo el dominio extracelular de la MAdCAM-1 humana fusionada a la región Fc de una IgGl humana (una región constante derivada del mismo constructo utilizado para hacer la región constante de LDP-02 mutado en Fc) . 1 . Construcción de la quimera MAdCAM-IgG Se usó un clon MAdCAM-1 humano denominado pcDhuMAd4 (ADNc del clon 4 en pCDNA3 ; Shyjan, A.M. y col., J. Immunol , 156: 2851-2851 (1996) , cuyas enseñanzas son aquí incorporadas a modo de referencia en su totalidad) como plantilla para amplificación por RCP de las regiones extracelulares de la MAdCAM-1 humana que habían de ser fusionadas a la región constante de la IgGl humana, según se describe en la Solicitud Internacional N° PCT/US96/02153 (WO 96/24673) , presentada el 12 de Febrero de 1996, que es una continuación en parte de EE.UU. N° de Serie 08/523.004, presentada el 1 de Septiembre de 1995, que es una continuación en parte de EE.UU. N° de Serie 08/386.857, presentada el 10 de Febrero de 1995. Para construir la quimera MAdCAM-IgG, se sintetizó el cebador HUMADIG4/2 (SEC ID N° : 62), que contiene el extremo 5' de la secuencia codificante de la MAdCAM-1 humana (codon ATG, negrilla) : HindIII 5 ' -GGAAGCTTCCACCATGGATTTCGGACTGGCCC-3 ' Este cebador 5' fue usado junto con un cebador 3' denominado HUMADIG3 para amplificar una región codificante de todo el dominio extracelular de la MAdCAM-1 humana. El cebador 3' HUMADIG3 (SEC ID N°63) tiene la siguiente secuencia: Spel 5 ' -GGACTAGTGGTTTGGACGAGCCTGTTG- ' Los cebadores fueron diseñados con un sitio 5' HindIII o sitios 3' Spel según se indica. Estos cebadores fueron usados para amplificar por RCP un fragmento de MAdCAM usando un kit optimizador de RCP de Invitrogen (San Diego, CA) . Los productos de RCP fueron digeridos con las enzimas HindIII y Spel para generar extremos para la clonación y fueron purificados por electroforesis en gel usando el sistema de aislamiento de ADN Glassmax (Gibco, Bethesda, MD) . Se cortó un fragmento de ~1 kb que abarcaba las regiones CH1, H (bisagra), CH2 y CH3 , por digestión con Spel y EcoRI de un constructo codificante de una cadena pesada ?l de inmunoglobulina humana que tenía una región constante humana mutada en Fc. La región constante humana en este constructo corresponde a la obtenida por amplificación por RCP de la cadena pesada de CAMPATH-1H (Reichmann, LL. y col., Nature, 322 : 323 -321 (1988)), según describen Sims, M.J. y col., (J. I munol . 151 : 2296 -2308 (1993)) y Waldmann y col., (WO 93/02191, 4 de Febrero de 1993 (página 23)), cuyas enseñanzas son aquí incorporadas como referencia en su totalidad. Las mutaciones en la región constante de este constructo (Leu235 -» Ala235 y Gly237 —» Ala237) fueron diseñadas para reducir la unión a los receptores Fc? humanos y fueron producidas por mutagénesis dirigida a oligonucleótidos. Así, la fusión MAdCAM-Ig producida contiene el fragmento de región constante Spel-EcoRI descrito por Sims y col., (J. Immunol . , 152:2296-2308 (1993)) y Waldmann y col., (WO 93/02191), excepto por la introducción de mutaciones Leu235 -> Ala235 y Gly237 -Ala237. Se aisló el fragmento Spel-EcoRI de 1 kb codificante de la región constante de IgGl mutada en Fc por electroforesis en gel usando el sistema de aislamiento de ADN Glassmax (Gibco, Bethesda, MD) . Este fragmento de región constante y el fragmento HindIII-Spel que contenía todo el dominio extracelular de MAdCAM fueron ligados en una ligadura de tres vías al vector pEE12 (Stephens, P.L. y M.L. Cockett, Nucle . Acids Res . , 17:7110 (1989) y Bebbington, C.R. y C.C.G. Hentschel, 1987, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells (Academic Press, N.Y.), que había sido digerido con HindIII y EcoRI . Se obtuvieron transformantes de la cepa bacteriana DH10B. Se hizo crecer a las colonias y se analizaron las preps miniplásmido por mapas de restricción. Se secuenció un constructo, que codifica para una proteína de fusión que contiene todo el dominio extracelular de MAdCAM-1 (constructo HuMAdIg21) fusionado a la región constante de IgGl mutada en Fc, a través de toda la porción MAdCAM-1, confirmando la apropiada fusión de segmentos y la ausencia de mutaciones inducidas por RCP. Se produjo la quimera en células NSO y se purificó por cromatografía de afinidad por Proteína A estándar. 2. Ensayo de adhesión Se revistió una placa de 96 pocilios de fondo plano y de alta unión (Costar) durante 1 h a 37°C con 50 µl de quimera MAdCAM-1 diluida a 2,5 µg/ml en tampón carbonato, pH 9,5. Se lavaron entonces los pocilios una vez con tampón de lavado (Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,14 M, MnCl2 1 mM, pH 7,2) utilizando una autolavadora de microplacas (Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) y se bloquearon durante 1,4 h a 37°C con lOOµl de FBS 10% diluido en PBS . Se lavaron primeramente células RPMI 8866 (una línea humana de linfoma de células B que expresa a4ß7 (y no a4ßl) (Erle, D.J. y col., J. Immunol . , 153 : 511 (1994); un regalo de D. Erle) ) en 20 mi de PBS (4°C) y se resuspendieron a 4,0 x 10s células/ml en PBS. Se reconstituyó BCECF (2 ' , 7 ' -bis (2-carboxietil) -5- (y 6) -carboxifluoresceína, éster acetoximetílico; Molecular Probes, Inc., Eugene, OR) a 50 µl/ml en DMSO y se añadió a la suspensión celular a una dilución final de 1:500. Después de incubar durante 30 minutos a 37°C, las células fueron entonces lavadas en tampón de ensayo (HBSS con 2% de suero bovino fetal, HEPES 25 mM, penicilina/estreptomicina, pH 7,2) y se añadieron 50.000 células a cada pocilio de una placa de 96 pocilios de fondo en V. Las células fueron entonces resuspendidas en 100 µl de (a) Act-l murino, (b) IgGl murina (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) , (c) LDP-02/3A9/Lote#l o (d) IgGl humana (Sigma Chemical Co., St . Louis, MO) a concentraciones de desde 15,0 hasta 0,00075 µg/ml en tampón de ensayo, durante 10 minutos a temperatura ambiente . Se lavó la placa revestida con la quimera MAdCAM-1 para eliminar el tampón bloqueante y se transfirieron entonces estas células RPMI 8866 marcadas fluorescentemente a cada pocilio. Se puso la placa en un agitador de plataforma (New Brunswick Scientific Co., Inc., Edison, NJ) a 40 RPM, durante 30 minutos a temperatura ambiente, envuelta en una lámina de aluminio. Se eliminaron las células no unidas por una simple etapa de lavado y se midió a continuación la fluorescencia (se excita a 485 nm, se lee a 535 nm) con un analizador concentrador de fluorescencia (IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, ME) antes y después del lavado. Se calculó el porcentaje de células unidas por cada pocilio a partir de las unidades relativas de fluorescencia (URF) usando la fórmula: URF antes del lavado % Células unidas = x 100 URF después del lavado Tanto LDP-02 como el Act-l murino inhibían la adhesión de las células RPMI 8866 a MAdCAM humana de una forma dosis-dependiente (Figuras 18A-18B) . Las concentra- ciones que inhibían la adhesión en un 50% (CI50) eran relativamente similares para el Act-l murino (0,0018 µg/ml) y para LDP-02 (0,0014 µg/ml). Por lo tanto, LDP-02 inhibía funcionalmente la adhesión mediada por a4ß7 a MAdCAM-1 al menos tan eficazmente como el Act-l murino. Ejemplo 5 Anticuerpos humanizados adicionales Como se ha descrito anteriormente, se pueden hacer varias variaciones del anticuerpo reformado diseñado en el Ejemplo 2 para mejorar la afinidad y/o reducir la antigenicidad del anticuerpo reformado. Dichos constructos incluyen, aunque sin limitación, los que tienen una o más de las siguientes mutaciones: mutación M4V en la cadena ligera, mutación R38K en la cadena pesada, mutación A40R en la cadena pesada y retromutación 173T en la cadena pesada. Los mutantes pueden ser producidos individualmente (por ejemplo, una mutación en una cadena) o en varias combinaciones . Por ejemplo, la Figura 19 muestra los resultados de la tinción HuT 78 usando el anticuerpo reformado (diseñado en el Ejemplo 2) o un derivado que tiene una mutación adicional en la cadena ligera (MV4) y dos mutaciones adicionales en la cadena pesada (R38K, A40R) . Estos dos anticuerpos muestran patrones similares de tinción sobre células HuT 78 (Figura 19) . Las mutaciones fueron realizadas cambiando la secuencia de ácido nucleico mediante el uso de un kit transformador de mutagénesis dirigida a sitio (Clontech) según el protocolo sugerido por el fabricante. Se hicieron mutaciones tanto de las regiones variables de cadena pesada como de las de cadena ligera con fragmentos variables clonados en pCR- Script™. Se usó el trans oligo Sea I/Stu I (Clontech) para el trans oligo. Las secuencias de los oligos mutagénicos (SEC ID N° : 38-40) eran las siguientes: H/R38K (SEC ID N° : 38) : ' -C TGG CCA ACG H/I73T (SEC ID N° : 39): 5' -CAC ATT GAC TGT AGA CAC TTC CGC TAG CAC AGC C L/M4V (SEC ID N° : 40) : 5 ' -CCG GAG GTG ATG TTG TGG TGA CTC Todas las demás manipulaciones, incluyendo la subclonación en los vectores de expresión pEE6hCMV-B y pEE12 y la construcción de plásmidos de expresión que contienen genes tanto de cadena pesada como de ligera, fueron como se describe para el anticuerpo reformado primario. EQUIVALENTES Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar usando no más que la experimentación rutinaria, muchos equivalentes de las realizaciones específicas de la invención aquí descrita específicamente. Dichos equivalentes pretenden quedar incluidos en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

LISTA DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: LeukoSite, Inc. (A) NOMBRE: (B) CALLE: 215 First Street (C) CIUDAD: Cambridge (D) ESTADO/PROVINCIA: Massachusetts (E) PAÍS: EE.UU. (F) CÓDIGO POSTAL/ZIP: 02142 (G) TELÉFONO : (781) 621-9350 (I) TELEFAX: (781) 621-9349 (ii) TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INMUNOGLOBULINA HUMANIZADA REACTIVA CON INTEGRINA a4ß7 (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 63 (iv) DIRECCIÓN PARA LA CORRESPONDENCIA: (A) DESTINATARIO: Hamilton, Brook, Smith & Reynolds , P.C. (B) CALLE: Two Militia Drive (C) CIUDAD: Lexington (D) ESTADO: Massachusetts (E) PAÍS: EE.UU. (F) ZIP: 02173 (v) FORMA LEÍBLE DEL ORDENADOR: (A) TIPO DE MEDIO: Disco flotante (B) ORDENADOR: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA: PatentIn Reléase #1.0, Versión #1.30 (vi) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: (A) NUMERO DE SOLICITUD: PCT/US97/13884 (B) FECHA DE SOLICITUD: 06-AGOSTO-1997 (viii) INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE: (A) NOMBRE: Brook, David E.

(B) NUMERO DE REGISTRO: 22,592 (C) NUMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO : LKS95-10 (ix) INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES: (A) TELÉFONO: (781) 861-6240 (B) TELEFAX: (781) 861-9540 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 494 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 13..444 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID N° : 1: TTACKRG MK CATGRRATG SASCTRKRTC ATYYTCTTCT TGGTATCAAC AGCTACAAGT 60 GTCCACTCCC AGGTCCAACT GCAGCAGCCT GGGGCTGAGC TTGTGAAGCC TGGGACTTCA 120 GTGAAGCTGT CCTGCAAGGG TTATGGCTAC ACCTTCACCA GCTACTGGAT GCACTGGGTG 180 AAGCAGAGGC CTGGACAAGG CCTTGAGTGG ATCGGAGAGA TTGATCCTTC TGAGAGTAAT 240 ACTAACTACA ATCAAAAATT CAAGGGCAAG GCCACATTGA CTGTAGACAT TTCCTCCAGC 300 ACAGCCTACA TGCAGCTCAG CAGCCTGACA TCTGAGGACT CTGCGGTCTA CTATTGTGCA 360 AGAGGGGGTT ACGACGGATG GGACTATGCT ATTGACTACT GGGGTCAAGG CACCTCAGTC 420 ACCGTCTCCT CAGCCAAAAC GACACCRYCN CSYKTMTMYC YYSBDNNCCC YKGRWSCYTG 480 GNGAAGCTT GGGA 494 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 144 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido acid (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 2 : Met Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa lie Xaa Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr Ser 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp lie Gly Glu He Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp lie Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala He Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr 130 135 140 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID F : 3 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 428 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA : lineal (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 18 . .428 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 3 : TTACTTGACG ACTCGGG ATG GGA TGG AGC TAT ATC ATC TTC TTC TTG GTA 50 Met Gly Trp Ser Tyr He He Phe Phe Leu Val 1 5 10 TCA ACÁ GCT ACÁ AGT GTC CAC TCC CAG GTC CAÁ CTG CAG CAG CCT GGG 98 Ser Thr Ala Thr Ser Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly 15 20 25 GCT GAG CTT GTG AAG CCT GGG ACT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GGT 146 Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly 35 40 TAT GGC TAC ACC TTC ACC AGC TAC TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG 194 Tyr Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg 45 50 55 CCT GGA CAÁ GGC CTT GAG TGG ATC GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAG AGT 242 Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp He Gly Glu He Asp Pro Ser Glu Ser 60 65 70 75 AAT ACT AAC TAC AAT CAÁ AAA TTC AAG GGC AAG GCC ACÁ TTG ACT GTA 290 Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val 80 85 90 GAC ATT TCC TCC AGC AC GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGC CTG ACÁ TCT 338 Asp He Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser 95 100 105 GAG GAC TCT GCG GTC TAC TAT TGT GCA AGA GGG GGT TAC GAC GGA TGG 386 Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp 110 115 120 GAC TAT GCT ATT GAC TAC TGG GGT CAÁ GGC ACÁ TCA GTC ACC 428 Asp Tyr Ala He Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 125 130 135 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N°:4: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 137 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 4 : Met Gly Trp Ser Tyr He He Phe Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr Ser 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp He Gly Glu He Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp He Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala He Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr 130 135 ( 2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 5 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 535 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN: 16..435 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 5: CGATTACTAG TCGAC ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTT CTG TTG 51 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Leu Leu. 140 145 TTC TGG ATT CCT GTT TCC GGA GGT GAT GTT GTG GTG ACT CA ACT CCA 99 Phe Trp He Pro Val Ser Gly Gly Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro 150 155 160 165 CTC TCC CTG CCT GTC AGC TTT GGA GAT CAÁ GTT TCT ATC TCT TGC AGG 147 Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly Asp Gln Val Ser He Ser Cys Arg 170 175 180 TCT AGT CAG AGT CTT GCA AAG AGT TAT GGG AAC ACC TAT TTG TCT TGG 195 Ser Ser Gln Ser Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp 185 190 195 TAC CTG CAC AAG CCT GGC CAG TCT CCA CAG CTC CTC ATC TAT GGG ATT 243 Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu He Tyr Gly He 200 205 210 TCC AAC AGA TTT TCT GGG GTG CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGT TCA 291 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser 215 220 225 GGG ACÁ GAT TTC AC CTC AAG ATC AGC ACÁ ATA AAG CCT GAG GAC TTG 339 Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He Ser Thr He Lys Pro Glu Asp Leu 230 235 240 245 GGA ATG TAT TAC TGC TTA CAÁ GGT ACÁ CAT CAG CCG TAC ACG TTC GGA 387 Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly 250 255 260 GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCT GCA CCA ACT GTA 435 Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 265 270 275 TCCATCTTCC CACCATCCAG TAAGCTTGGG AATCCATATG ACTAGTAGAT CCTCTAGAGT 495 CGACCTGCAG GCATGCAAGC TTCCCTATAG TGAGTCGTAT 535 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 6 : ( i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 140 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 6 : Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp He Pro 1 5 10 15 Val Ser Gly Gly Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Ser Phe Gly Asp Gln Val Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu He Tyr Gly He Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys He Ser Thr He Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr 100 105 110 Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu He Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val 130 135 140 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 7 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 112 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (C) TIPO DE HEBRA : (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 7 : Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Gly 1 5 10 15 Asp Gln Val Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Lys Ser 20 25 30 Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu He Tyr Gly He Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80 Ser Thr He Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly 85 90 95 Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He Lys 100 105 110 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 112 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 8: Asp He Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu He Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala 85 90 95 Leu Gln Thr Pro Gln Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 110 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 9 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 121 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (C) TIPO DE HEBRA : (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 9 : Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp He 40 45 Gly Glu He Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp He Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala He Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 10 : ( i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 119 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (C) TIPO DE HEBRA : (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 10 : Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp He Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr He Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 396 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..396 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 11: ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTT CTG TTG TTC TGG ATT CCT 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp He Pro 145 150 155 GTT TCC GGA GGT GAT GTT GTG GTG ACT CAÁ ACT CCA CTC TCC CTG CCT 96 Val Ser Gly Gly Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 160 165 170 GTC AGC TTT GGA GAT CAÁ GTT TCT ATC TCT TGC AGG TCT AGT CAG AGT 144 Val Ser Phe Gly Asp Gln Val Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 175 180 185 CTT GCA AAG AGT TAT GGG AAC ACC TAT TTG TCT TGG TAC CTG CAC AAG 192 Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys 190 195 200 CCT GGC CAG TCT CCA CAG CTC CTC ATC TAT GGG ATT TCC AAC AGA TTT 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu He Tyr Gly He Ser Asn Arg Phe 205 210 215 220 TCT GGG GTG CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGT TCA GGG ACÁ GAT TTC 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 225 230 235 ACÁ CTC AAG ATC AGC ACÁ ATA AAG CCT GAG GAC TTG GGA ATG TAT TAC 336 Thr Leu Lys He Ser Thr He Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr 240 245 250 TGC TTA CAÁ GGT ACÁ CAT CAG CCG TAC ACG TTC GGA GGG GGG ACC AAG 384 Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 255 260 265 CTG GAA ATA AAA 396 Leu Glu He Lys 270 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 132 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (D) TOPOLOGÍA : lineal ( ii ) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 12 : Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp He Pro 1 5 10 15 Val Ser Gly Gly Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Ser Phe Gly Asp Gln Val Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu He Tyr Gly He Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys He Ser Thr He Lys Pro Glu Asp Leu Gly Met Tyr Tyr 100 105 110 Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys 115 120 125 Leu Glu He Lys 130 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 13 : ( i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 336 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA : doble (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 13 : GATATTGTGA TGACTCAGTC TCCACTCTCC CTGCCCGTCA CCCCTGGAGA GCCGGCCTCC 60 ATCTCCTGCA GGTCTAGTCA GAGCCTCCTC CATAGTAATG GATCAAACTA TTTGGATTGG 120 TACCTGCAGA AGCCAGGGCA GTCTCCACAG CTCCTGATCT ATTTGGGTTC TAATCGGGCC 180 TCCGGGGTCC CTGACAGGTT CAGTGGCAGT GGATCAGGCA CAGATTTTAC ACTGAAAATC 240 AGCAGAGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGGTT TATTACTGCA TGCAAGCTCT ACCAACTCCT 300 CAGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAA 336 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 14 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 420 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA : doble (D) TOPOLOGÍA : lineal ( ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE : CDS (B) LOCALIZACIÓN : 1 . . 420 (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 14 : ATG GGA TGG AGC TGT ATC ATC CTC TTC TTG GTA TCA ACÁ GCT ACÁ AGT 48 Met Gly Trp Ser Cys He He Leu Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr Ser 135 140 145 GTC CAC TCC CAG GTC CAÁ CTG CAG CAG CCT GGG GCT GAG CTT GTG AAG 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 150 155 160 CCT GGG ACT TCA GTG AAG CTG TCC TGC AAG GGT TAT GGC TAC ACC TTC 144 Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe 165 170 175 180 ACC AGC TAC TGG ATG CAC TGG GTG AAG CAG AGG CCT GGA CAÁ GGC CTT 192 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 185 190 195 GAG TGG ATC GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAG AGT AAT ACT AAC TAC AAT 240 Glu Trp He Gly Glu He Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn 200 205 210 CAÁ AAA TTC AAG GGC AAG GCC ACÁ TTG ACT GTA GAC ATT TCC TCC AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp He Ser Ser Ser 215 220 225 ACÁ GCC TAC ATG CAG CTC AGC AGC CTG AC TCT GAG GAC TCT GCG GTC 336 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 230 235 240 TAC TAT TGT GCA AGA GGG GGT TAC GAC GGA TGG GAC TAT GCT ATT GAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala He Asp 245 250 255 260 TAC TGG GGT CAÁ GGC ACC TCA GTC ACC GTC TCC TCA 420 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 265 270 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 140 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 15 : Met Gly Trp Ser Cys He He Leu Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr Ser 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys 20 25 30 Pro Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Gly Tyr Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu 50 55 60 Glu Trp He Gly Glu He Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp He Ser Ser Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala He Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 414 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..414 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 16: ATG GAG TTT GGG CTG AGC TGG CTT TTT CTT GTG GCT ATT TTA AAA GGT 48 Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala He Leu Lys Gly 145 150 155 GTC CAG TGT CAG GTG CAG CTT GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 160 165 170 CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCT TCT GGA TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 175 180 185 ACT AGC TAT GCT ATG CAT TGG GTG CGC CAG GCC CCC GGA CAÁ AGG CTT 192 Thr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 190 195 200 GAG TGG ATG GGA TGG ATC AAC GCT GGC AAT GGT AAC ACÁ AAA TAT TCA 240 Glu Trp Met Gly Trp He Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser 205 210 215 220 CAG AAG TTC CAG GGC AGA GTC ACC ATT ACC AGG GAC ACÁ TCC GCG AGC 288 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr He Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser 225 230 235 ACÁ GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAA GAC ACG GCT GTG 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 240 245 250 TAT TAC TGT GCG AGA GGA GGT TAC TAT GGT TCG GGG AGC AAC TAC TGG 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp 255 260 265 GGC CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA 414 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 270 275 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 138 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 17: Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala He Leu Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 50 55 60 Glu Trp Met Gly Trp He Asn Ala Gly Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Ser 65 70 75 80 Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr He Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Ser Asn Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 130 135 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 540 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..540 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 18: ATG AAA TGC ACC TGG GTC ATT CTC TTC TTG GTA TCA ACÁ GCT ACÁ AGT 48 Met Lys Cys Thr Trp Val He Leu Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr Ser 140 145 150 GTC CAC TCC CAG GTC CAÁ CTA GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTT AAG AAG 96 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 155 160 165 170 CCT GGG GCT TCA GTG AAG GTG TCC TGC AAG GGT TCT GGC TAC ACC TTC 144 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 175 180 185 ACC AGC TAC TGG ATG CAT TGG GTG AGG CAG GCG CCT GGC CAÁ CGT CTA 192 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 190 195 200 GAG TGG ATC GGA GAG ATT GAT CCT TCT GAG AGT AAT ACT AAC TAC AAT 240 Glu Trp He Gly Glu He Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn 205 210 215 CAÁ AAA TTC AAG GGA CGC GTC ACÁ TTG ACT GTA GAC ATT TCC GCT AGC 288 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp He Ser Ala Ser 220 225 230 ACÁ GCC TAC ATG GAG CTC AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACT GCG GTC 336 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 235 240 245 250 TAC TAT TGT GCA AGA GGG GGT TAC GAC GGA TGG GAC TAT GCT ATT GAC 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala He Asp 255 260 265 TAC TGG GGT CAÁ GGC ACC CTG GTC ACC GTC TCC TCA GCC TCC ACC AAG 432 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 270 275 280 GGC CCA TCG GTC TTC CCC CTG GCA CCC TCC TCC AAG AGC ACC TCT GGG 480 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 285 290 295 GGC AC GCG GCC CTG GGC TGC CTG GTC AAG GAC TAC TTC CCC GAA CCG 528 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 300 305 310 GTG ACG GTG TCG 540 Val Thr Val Ser 315 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 180 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido i (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 19 Met Lys Cys Thr Trp Val He Leu Phe Leu Val Ser Thr Ala Thr Ser 1 5 10 15 Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 25 30 Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu 50 55 60 Glu Trp He Gly Glu He Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn 65 70 75 80 Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp He Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala He Asp 115 120 125 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys 130 135 140 Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly 145 150 155 160 Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro 165 170 175 Val Thr Val Ser 180 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 413 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: doble (D) TOPOLOGÍA: lineal (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) LOCALIZACIÓN: 1..413 (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 20: ATG AAG TTG CCT GTT AGG CTG TTG GTG CTT CTG TTG TTC TGG ATT CCT 48 Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp He Pro 185 190 195 GTT TCC GGA GGT GAT GTT GTG ATG ACT CAÁ AGT CCA CTC TCC CTG CCT 96 Val Ser Gly Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 200 205 210 GTC ACC CCT GGA GAA CCA GCT TCT ATC TCT TGC AGG TCT AGT CAG AGT 144 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 215 220 225 CTT GCA AAG AGT TAT GGG AAC ACC TAT TTG TCT TGG TAC CTG CAG AAG 192 Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys 230 235 240 CCT GGC CAG TCT CCA CAG CTC CTC ATC TAT GGG ATT TCC AAC AGA TTT 240 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu He Tyr Gly He Ser Asn Arg Phe 245 250 255 260 TCT GGG GTG CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGT TCA GGG ACÁ GAT TTC 288 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 265 270 275 ACÁ CTC AAG ATC TCG CGA GTA GAG GCT GAG GAC GTG GGA GTG TAT TAC 336 Thr Leu Lys He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 280 285 290 TGC TTA CAÁ GGT ACÁ CAT CAG CCG TAC ACG TTC GGA CAG GGG ACC AAG 384 Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 295 300 305 GTG GAA ATA AAA CGG GCT GAT GCG GCG CC 413 Val Glu He Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 310 315 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 21 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 138 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (D) TOPOLOGÍA : lineal (ii ) TIPO DE MOLÉCULA : proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 21 : Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu Val Leu Leu Leu Phe Trp He Pro 1 5 10 15 Val Ser Gly Gly Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro 20 25 30 Val Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser 35 40 45 Leu Ala Lys Ser Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys 50 55 60 Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu He Tyr Gly He Ser Asn Arg Phe 65 70 75 80 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 85 90 95 Thr Leu Lys He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr 100 105 110 Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys 115 120 125 Val Glu He Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro 130 135 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 22 : (i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 94 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 22: TTTCCGGAGG TGATGTTGTG ATGACTCAAA GTCCACTCTC CCTGCCTGTC ACCCCTGGAG 60 AACCAGCTTC TATCTCTTGC AGGTCTAGTC AGAG 94 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 94 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 23 : ACTGGCCAGG CTTCTGCAGG TACCAAGACA AATAGGTGTT CCCATAACTC TTTGCAAGAC 60 TCTGACTAGA CCTGCAAGAG ATAGAAGCTG GTTC 94 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 24 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 83 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 24: CCTGGCCAGT CTCCACAGCT CCTCATCTAT GGGATTTCCA ACAGATTTTC TGGGGTGCCA 60 GACAGGTTCA GTGGCAGTGG TTC 83 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 84 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 25: ACTCGCGAGA TCTTGAGTGT GAAATCTGTC CCTGAACCAC TGCCACTGAA CCTGTCTGGC 60 ACCCCAGAAA ATCTGTTGGA AATC 84 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 67 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA : sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 26 : TCTCGCGAGT AGAGGCTGAG GACGTGGGAG TGTATTACTG CTTACAAGGT ACACATCAGC 60 CGTACAC 67 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 86 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 27: ATGGCGCCGC ATCAGCCCGT TTTATTTCCA CCTTGGTCCC CTGTCCGAAC GTGTACGGCT 60 GATGTGTACC TTGTAAGCAG TAATAC 86 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 93 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA : sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 28 : ATAAGCTTCG CCATGAAATG CACCTGGGTC ATTCTCTTCT TGGTATCAAC AGCTACAAGT 60 GTCCACTCCC AGGTCCAACT AGTGCACCGG TTA 93 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 93 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 29: TAACCGGTGC ACTAGTTGGA CCTGGGAGTG GACACTTGTA GCTGTTGATA CCAAGAAGAG 60 AATGACCCAG GTGCATTTCA TGGCGAAGCT TAT 93 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 87 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 30: CAACTAGTGC AGTCTGGGGC TGAGGTTAAG AAGCCTGGGG CTTCAGTGAA GGTGTCCTGC 60 AAGGGTTCTG GCTACACCTT CACCAGC 87 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 88 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 31: TAACCGGTAC TCTAGACGTT GGCCAGGCGC CTGCCTCACC CAATGCATCC AGTAGCTGGT 60 GAAGGTGTAG CCAGAACCCT TGCAGGAC 88 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 76 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 32: CGTCTAGAGT GGATCGGAGA GATTGATCCT TCTGAGAGTA ATACTAACTA CAATCAAAAA 60 TTCAAGGGAC GCGTCA 76 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 76 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 33 : TAACCGGTGT GCTAGCGGAA ATGTCTACAG TCAATGTGAC GCGTCCCTTG AATTTTTGAT 60 TGTAGTTAGT ATTACT 76 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 34 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 88 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 34: CCGCTAGCAC AGCCTACATG GAGCTCAGCA GCCTGAGATC TGAGGACACT GCGGTCTACT 60 ATTGTGCAAG AGGGGGTTAC GACGGATG 88 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 88 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA : sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 35 : TCACCGGTGC GGTGACCAGG GTGCCTTGAC CCCAGTAGTC AATAGCATAG TCCCATCCGT 60 CGTAACCCCC TCTTGCACAA TAGTAGAC 88 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 85 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 36 : CTGGTCACCG TCTCCTCAGC CTCCACCAAG GGCCCATCGG TCTTCCCCCT GGCACCCTCC 60 TCCAAGAGCA CCTCTGGGGG CACAG 85 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 85 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 37: TCACCGGTTC GGGGAAGTAG TCCTTGACCA GGCAGCCCAG GGCCGCTGTG CCCCCAGAGG 60 TGCTCTTGGA GGAGGGTGCC AGGGG 85 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 38: CTGGCCAACG 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 39: CACATTGACT GTAGACACTT CCGCTAGCAC AGCC 34 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 40 CCGGAGGTGA TGTTGTGGTG ACTC 24 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 41: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 41 TAAGCTTCCG CCATGGGATG GAGC 24 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 42: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 42 : GGTGACACTA GTGCCTTGAC CCCAG 25 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 43 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 43: TAAGCTTCCG CCATGAAGTT GCCT 24 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 44: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DECRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 44: GGCGCCGCAT CAGCCCGTTT T 21 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 45: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 45 : CGGCGCCATC TGTCTTCATC 20 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 46: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 18 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 46: AAGCTTCTAA CACTCTCC 18 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 47: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA : l ineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 47 : Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Phe Asp 1 5 10 15 Gly Gln Val (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 48: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 11 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA : (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 48 : Asp Val Val Val Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 49: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 8 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 49: Asp Tyr Ala He Asp Tyr Trp Gly 1 5 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 50: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 113 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 50 : Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gln Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 40 45 Pro Lys Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu He 100 105 110 Lys (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 51 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 114 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido - (C) TIPO DE HEBRA : (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 51 : Asp He Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Xaa Asp Gly Asn Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln 40 45 Ser Pro Gln Leu Leu He Tyr Leu Val Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val 50 55 60 Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 65 70 75 80 He Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln 85 90 95 Ala Leu Gln Xaa Pro Arg Xaa Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu 100 105 110 He Lys (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 52: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 112 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 52: Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser He Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Ala Lys Ser 20 25 30 Tyr Gly Asn Thr Tyr Leu Ser Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 40 45 Pro Gln Leu Leu He Tyr Gly He Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Gly 85 90 95 Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 110 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 53: ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 127 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (C) TIPO DE HEBRA : (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 53 : Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp He 40 45 Gly Arg He Asp Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Ser Xaa Xaa Val Tyr Xaa Tyr Trp 100 105 110 Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 54 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD : 129 aminoácidos (B) TIPO : aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 54: Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Ala He Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 40 45 Gly Trp He Asn Pro Tyr Gly Asn Gly Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys 50 55 60 Phe Gln Gly Arg Val Thr He Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala 65 70 75 80 Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Ala Pro Gly Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Cys Tyr Arg Gly 100 105 110 Asp Tyr Xaa Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 115 120 125 Ser (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 55: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 121 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE HEBRA: (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 55 : Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp He 40 45 Gly Glu He Asp Pro Ser Glu Ser Asn Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe 50 55 60 t Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Val Asp He Ser Ala Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Trp Asp Tyr Ala He Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 56 : ( i ) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA : (A) LONGITUD : 35 pares de bases (B) TIPO : ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA : sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal ( ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE / CLAVE : base__modif icada (B) LOCALIZACIÓN : 30 (D) OTRA INFORMACIÓN/base_mod= i (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 56 : CCCAAGCTTC CAGGGRCCAR KGGATARACN GRTGG 35 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 57: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 57: CCCAAGCTTA CGAGGGGGAA GACATTTGGG AA 32 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 58: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 34 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 58: GGGAATTCAT GRAATGSASC TGGGTY TYC TCTT 34' (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 59: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 59 ACTAGTCGAC ATGAAG TGT GGBTRAACTG GRT 33 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 60: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 60: CCCAAGCTTA CTGGATGGTG GGAAGATGGA 30 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 61: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 39 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA : lineal (xi ) DECRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 61 : ACTAGTCGAC ATGGATTTWC ARGTGCAGAT TWTCAGCTT 39 (2 ) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 62 : (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID N° : 62: GGAAGCTTCC ACCATGGATT TCGGACTGGC CC 32 (2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID N° : 63: (i) CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIAS (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE HEBRA: sencilla (D) TOPOLOGÍA: lineal (xi ) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA : SEC ID N° : 63 GGACTAGTGG TTTGGACGAG CCTGTTG 27

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7, cuya inmuno-globulina consiste en una región de unión a antígeno de origen no humano y al menos una porción de una inmunoglobulina de origen humano.
2. La inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1, donde la porción de una inmunoglobulina de origen humano deriva de una región constante humana.
3. La inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 2 , donde la región constante humana es del tipo gamma .
4. La inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 2, donde la región de unión a antígeno es de origen de roedor.
5. La inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 2, donde la región de unión a antígeno deriva del anticuerpo monoclonal Act-l.
6. La inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1, donde la región de unión a antígeno incluye una región determinante de complementariedad de origen de roedor y la porción de una inmunoglobulina de origen humano deriva de una región de marco humana .
7. La inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 6, donde la región determinante de complementariedad deriva del anticuerpo monoclonal Act-l.
8. Una inmunoglobulina humanizada que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7, consistente en una cadena pesada y una cadena ligera, cuya cadena ligera consiste en una región determinante de complementariedad derivada de un anticuerpo de origen no humano que se une aa4ß7 y una región de marco derivada de una cadena ligera de origen humano y cuya cadena pesada consiste en una región determinante de complementariedad derivada de un anticuerpo de origen no humano que se une aa4ß7 y una región de marco derivada de una cadena pesada de origen humano.
9. La inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 8, donde dicha inmunoglobulina puede competir con el Act-l murino por la unión a a4ß7.
10. La inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 8, donde la cadena ligera consiste en tres regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena ligera del anticuerpo Act-l y la cadena pesada consiste en tres regiones determinantes de complementariedad derivadas de la cadena pesada del anticuerpo Act-l.
11. La inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 8, donde la cadena ligera de origen humano es la cadena ligera del anticuerpo GM607'CL.
12. La inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 8, donde la cadena pesada de origen humano es la cadena pesada del anticuerpo 21/28' CL humano.
13. Una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada consistente en RDCl, RDC2 y RDC3 de la cadena ligera del anticuerpo Act-l murino y una región de marco de cadena ligera humana.
14. La cadena ligera de inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 13, donde la región de marco humana deriva de la cadena ligera del anticuerpo GM607 'CL.
15. La cadena ligera de inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 14, que incluye la región variable de la SEC ID N° : 21.
16. Un ácido nucleico aislado codificante de la cadena ligera de inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 15.
17. El ácido nucleico aislado de la reivindicación 16, que incluye la secuencia codificante de la región variable de la SEC ID N° : 20.
18. Una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada consistente en RDCl, RDC2 y RDC3 de la cadena pesada del anticuerpo Act-l y una región de marco de cadena pesada humana.
19. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 18, donde la región de marco humana deriva de la cadena pesada del anticuerpo 21/28'CL humano.
20. La cadena pesada de inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 19, consistente en la región variable de la SEC ID N° : 19.
21. Un ácido nucleico aislado codificante de la cadena pesada de la inmunoglobulina humanizada de Reivindicación 20.
22. El ácido nucleico aislado de la Reivindicación 21, que incluye la secuencia codificante de la región variable de la SEC ID N° : 18.
23. Una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, cuya cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos consistente en al menos una porción funcional de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la Figura 7 (SEC ID N° : 12) .
24. Una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 23, cuya cadena ligera tiene una secuencia de aminoácidos consistente en la secuencia del péptido señal mostrada en la Figura 7 (SEC ID N° : 12) y al menos una porción funcional de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena ligera mostrada en la Figura 7 (SEC ID N° : 12) .
25. Un ácido nucleico aislado consistente en una secuencia codificante de una cadena ligera de inmuno-globulina humanizada de la Reivindicación 23.
26. El ácido nucleico aislado de la Reivindicación 25, consistente en la secuencia codificante de la región variable de la SEC ID N° : 11.
27. Una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, cuya cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos consistente en al menos una porción funcional de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en la Figura 9 (SEC ID N° : 15) .
28. Una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 27, cuya cadena pesada tiene una secuencia de aminoácidos consistente en la secuencia del péptido señal mostrada en la Figura 9 (SEC ID N° : 15) y al menos una porción funcional de la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada mostrada en la Figura 9 (SEC ID N° : 15) .
29. Un ácido nucleico aislado codificante de la cadena pesada de inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 27.
30. El ácido nucleico aislado de la Reivindicación 29, consistente en la secuencia codificante de la región variable de la SEC ID N° : 14.
31. Un vector de expresión consistente en un gen fusionado que codifica para una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada, cuyo gen consiste en una secuencia de nucleótidos codificante de una RDC derivada de una cadena ligera de un anticuerpo no humano, que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7, y una región de marco derivada de una cadena ligera de origen humano.
32. El vector de expresión de la Reivindicación 31, donde el anticuerpo no humano es anticuerpo Act-l murino.
33. Una célula huésped que contiene el vector de expresión de la Reivindicación 31.
34. Un vector de expresión consistente en un gen fusionado codificante de una cadena pesada de inmuno-globulina humanizada, cuyo gen consiste en una secuencia de nucleótidos codificante de una RDC derivada de una cadena pesada de un anticuerpo no humano que tiene especificidad de unión por la integrina a4ß7 y una región de marco derivada de una cadena pesada de origen humano .
35. El vector de expresión de la Reivindicación 34, donde el anticuerpo no humano es anticuerpo Act-l murino.
36. Una célula huésped que contiene el vector de expresión de la Reivindicación 34.
37. Una célula huésped que contiene un primer ácido nucleico recombinante codificante de una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada y un segundo ácido nucleico recombinante codificante de una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, cuyo primer ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos codificante de una RDC derivada de la cadena ligera del anticuerpo Act-l murino y una región de marco derivada de una cadena ligera de origen humano y cuyo segundo ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos codificante de una RDC derivada de la cadena pesada del anticuerpo Act-l murino y una región de marco derivada de una cadena pesada de origen humano .
38. Un método de preparación de una inmunoglobulina humanizada, consistente en mantener una célula huésped de la Reivindicación 37 en condiciones apropiadas para la expresión de una inmunoglobulina humanizada, mediante lo cual se expresan las cadenas de inmunoglobulina humanizada y se produce una inmunoglobulina humanizada.
39. El método de la Reivindicación 38, que además incluye la etapa de aislamiento de la inmunoglobulina humanizada.
40. Un gen fusionado codificante de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humanizada, consistente en: a) una primera secuencia de ácido nucleico codificante de una región de unión a antígeno derivada de anticuerpo monoclonal murino Act- 1 Y b) una segunda secuencia de ácido nucleico codificante de al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina de origen humano .
41. Un método de inhibición de la interacción de una primera célula portadora de a4ß7 con una segunda célula portadora de un ligando de la misma, consistente en poner en contacto dicha primera célula con una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1.
42. Un método de inhibición de la infiltración leucocitaria del tejido mucosal, consistente en administrar a un paciente una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1.
43. Un método de terapia de una enfermedad asociada a la infiltración leucocitaria de tejidos que expresan la molécula MAdCAM- 1, consistente en administrar a un paciente una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1.
44. El método de la Reivindicación 43, donde la enfermedad es una enfermedad asociada a la infiltración leucocitaria de tejidos como resultado de la unión de leucocitos al endotelio asociado a intestino que expresa la molécula MAdCAM.
45. Un método de tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal en un paciente, consistente en administrar al paciente una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1.
46. Una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 para uso en terapia o diagnóstico.
47. Una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 para uso en el tratamiento de una enfermedad asociada a la infiltración leucocitaria de tejidos (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria) .
48. Una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 para uso en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal.
49. Uso de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada a la infiltración leucocitaria de tejidos (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria) .
50. Uso de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal .
51. Una composición farmacéutica consistente en una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 y un vehículo adecuado. RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con inmunoglobulinas humanizadas que tienen especificidad de unión por la integrina a4ß7, consistentes en una región de unión a antígeno de origen no humano (por ejemplo, de roedor) y al menos una porción de una inmunoglobulina de origen humano (por ejemplo, una región de marco humana, una región constante humana) . En una realización, la inmunoglobulina humanizada puede competir con Act-l murino por la unión a la integrina a4ß7 humana. En una realización preferida, la región de unión a antígeno de la inmunoglobulina humanizada consiste en cada una de las regiones determinantes de complementariedad de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo Act-l murino. La presente invención se relaciona también con una cadena ligera o cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, con ácidos nucleicos aislados consistentes en una secuencia que codifica para una inmunoglobulina o cadena de inmunoglobulina humanizada de la presente invención (por ejemplo, un anticuerpo de una sola cadena), con constructos consistentes en un ácido nucleico de la presente invención y con células huésped que contienen un ácido nucleico de la presente invención útiles en un método de preparación de una inmunoglobulina humanizada. Las inmunoglobulinas humanizadas pueden ser usadas en aplicaciones diagnósticas y terapéuticas en humanos, por ejemplo para controlar la infiltración (incluyendo el reclutamiento y/o la acumulación) linfocitaria del tejido mucosal . 173 gen fusionado codificante de una cadena pesada de inmuno-globulina humanizada, cuyo gen consiste en una secuencia de nucleótidos codificante de una RDC derivada de una cadena pesada de un anticuerpo no humano que tiene especificidad de unión por la integrina 4ß7 y una región de marco derivada de una cadena pesada de origen humano. 35. El vector de expresión de la Reivindicación 34, donde el anticuerpo no humano es anticuerpo Act-l murino. 36. Una célula huésped que contiene el vector de expresión de la Reivindicación 34. 37. Una célula huésped que contiene un primer ácido nucleico recombinante codificante de una cadena ligera de inmunoglobulina humanizada y un segundo ácido nucleico recombinante codificante de una cadena pesada de inmunoglobulina humanizada, cuyo primer ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos codificante de una RDC derivada de la cadena ligera del anticuerpo Act-l murino y una región de marco derivada de una cadena ligera de origen humano y cuyo segundo ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos codificante de una RDC derivada de la cadena pesada del anticuerpo Act-l murino y una región de marco derivada de una cadena pesada de origen humano . 38. Un método de preparación de una inmunoglobulina humanizada, consistente en mantener una célula huésped de la Reivindicación 37 en condiciones apropiadas para la expresión de una inmunoglobulina humanizada, mediante lo cual se expresan las cadenas de inmunoglobulina humanizada y se produce una 174 inmunoglobulina humanizada . 39. El método de la Reivindicación 38, que además incluye la etapa de aislamiento de la inmunoglobulina humanizada. 40. Un gen fusionado codificante de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humanizada, consistente en: a) una primera secuencia de ácido nucleico codificante de una región de unión a antígeno derivada de anticuerpo monoclonal murino Act- i y b) una segunda secuencia de ácido nucleico codificante de al menos una porción de una región constante de una inmunoglobulina de origen humano . 41. Un método de inhibición de la interacción de una primera célula portadora de a4ß7 con una segunda célula portadora de un ligando de la misma, consistente en poner en contacto dicha primera célula con una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1. 42. Un método de inhibición de la infiltración leucocitaria del tejido mucosal, consistente en administrar a un paciente una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1. 43. Un método de terapia de una enfermedad asociada a la infiltración leucocitaria de tejidos que expresan la molécula MAdCAM-1, consistente en administrar a un paciente una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1. 44. El método de la Reivindicación 43, donde la enfermedad es una enfermedad asociada a la infiltración leucocitaria de tejidos como resultado de la unión de leucocitos al endotelio asociado a intestino que expresa 175 la molécula MAdCAM. 45. Un método de tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal en un paciente, consistente en administrar al paciente una cantidad efectiva de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1. 46. Una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 para uso en terapia o diagnóstico. 47. Una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 para uso en el tratamiento de una enfermedad asociada a la infiltración leucocitaria de tejidos (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria). 48. Una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 para uso en el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal . 49. Uso de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad asociada a la infiltración leucocitaria de tejidos (por ejemplo, una enfermedad inflamatoria) . 50. Uso de una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal . 51. Una composición farmacéutica consistente en una inmunoglobulina humanizada de la Reivindicación 1 y un vehículo adecuado.