MXPA99000499A - Gel sensible a la temperatura para suministro sostenido de medicamentos con proteinas - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas para la administración de proteínas farmacológicamente activas. Las composiciones de la presente invención comprenden una matriz polimérica teniendo propiedades de gelatinización termal en las que se incorpora una discreta de al menos un polipéptido macromolecular biológicamente activo el cual retiene más del 90%de su actividad biológica. Además, la concentración del polipéptido macromolecular es mayor al 0.5%del peso de la composición.

Description

GEL SENSIBLE A LA TEMPERATURA. PARA SUMINISTRO SOSTENIDO DE MEDICAMENTOS CON PROTEINA DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a polímeros sensibles a la temperatura para el suministro sostenido de agentes farmacológicos y, más particularmente, a poloxámeros que comprenden suspensiones de agentes de polipéptidos macromoleculares nativos. Se han observado en años recientes mayores avances en las técnicas de ADN recombinante y consecuentemente la proliferación de muchos farmacéuticos con proteínas disponibles para una variedad de necesidades terapéuticas. En efecto, las proteínas o polipéptidos constituyen la mayor clase de fármacos que están actualmente considerados para aprobación de la FDA. Sin embargo, el potencial terapéutico y comercial de los fármacos con polipéptidos solo será entendido si estos avances estas acompañados por los diseños de formulaciones que lleven a administración y estabilidad efectivos. Las proteínas son moléculas orgánicas grandes o macromoléculas constituidas de residuos de aminoácidos enlazados covalentemente entre sí por enlaces peptídicos en una cadena de polipéptido lineal, no ramificada con la masa molecular relativa en el intervalo de unos miles a millones. Las propiedades útiles de las proteínas como fármacos dependen de que la cadena de polipéptido adopte una conformación doblada tridimensional única, es decir, la estructura terciaria de la proteína. Será reconocido este doblez único que es responsable para que la proteína sea altamente selectiva en las moléculas. Sin embargo, la capacidad para mantener una estructura tridimensional única es precisamente uno de los obstáculos que hace 'al uso de los polipéptidos en enfermedades humanas y de animales lleno de problemas. Tradicionalmente, el método más ampliamente usado para administración de agentes terapéuticos es por la ruta oral. Sin embargo, tal suministro no es factible, en el caso de fármacos macromoleculares, ya que estos son degradados rápidamente y desactivados por enzimas hidrolíticas en el tracto alimentario. Incluso si es estable a la digestión enzimática, sus pesos moleculares son muy altos para absorción a través de la pared intestinal. Consecuentemente, los mismos son usualmente administrados parentalmente; pero, ya que tales fármacos tienen con frecuencia vida media corta in vivo, se requieren inyecciones frecuentes para producir una terapia efectiva. Desafortunadamente, mientras que la ruta parental es el medio más eficiente para introducción del fármaco, esta ruta tiene varias desventajas como que las inyecciones son dolorosas; las mismas pueden llevar a una infección; y pueden llevar a problemas vasculares severos como un resultado de las inyecciones intravenosas repetidas. Por estas razones, han sido consideradas las matrices de polímeros biodegrables como sistemas de suministro de liberación sostenida para una variedad de agentes activos o fármacos. Una vez implantada, la matriz se disuelve lentamente o erosiona, liberando el fármaco. Un procedimiento alternativo es usar bombas implantables pequeñas, las cuales extruyen lentamente el fármaco y componentes de la matriz, los cuales se disuelven después del contacto con fluidos corporales, Con ambos sistemas es crucial que el fármaco permanezca uniformemente distribuido en toda la matriz ya que la distribución heterogénea del fármaco (por ejemplo, la formación de grandes grumos y vacíos) puede llevar a la dosificación errática. Adicionalmente, ambos sistemas requieren polímeros que permanezcan algo fluidos de tal forma que puede? ser fácilmente manipulados antes de la implantación o carga en un dispositivo. Ha sido descrito el uso de los polímeros como implantes sólidos y para uso en bombas pequeñas implantables para el suministro de varios agentes terapéuticos en publicaciones científicas y en la literatura de patente. Véase, por ejemplo, Kent, et al., "In vivo controlled reléase of an LHRH analog from injected polymeric microcapsules" , Contracept, Deliv. Syst . , 3:58 (1982); Sanders, et al., "Controlled reléase of a luteinizing hormone releasing hormone analogue from poly (d, 1-lactide-co-glycolide) -microspheres" , J.Pharmaceut . Sci., 73:1294-1297 (1984); Johnston, T.P., et al., "Sustained delivery of Interleukin-2 from a poloxamer 407 gel matrix following intraperitoneal injection in mice", Pharmaceut. Res., 9(3) : 425-434 (1992); Yolks, et al., "Timed reléase depot for anti-cancer agents II", Acta Pharm. Svec . , 15:382-388 (1978); Krezanoski, "Clear, water-miscible, liquid pharmaceutical vehicles and compositions which gel at body temperature for drug delivery to mucous membranes" , Patente de los Estados Unidos NO. 4,474,752. Sin embargo, los polímeros que tienen el mayor potencial para uso en el suministro de fármacos con proteínas pueden exhibir formación de gel térmica inversa y tienen buenas características de liberación de fármaco . Existe una clase de copolímeros de bloque que pueden ser clasificados generalmente como condensados de polioxietileno polioxipropileno, es decir polioles Pluronic o poloxámeros . Estos son formados por la condensación de óxido de propileno en un núcleo de propilenglicol seguido por la condensación de óxido de etileno en ambos extremos de la base de polioxipropileno. Los grupos hidrofílicos de polioxietileno en los extremos de la molécula están controlados en longitud para constituir en cualquier lado de 10 por ciento a 80 por ciento en peso de la molécula final. Los poloxámeros, los cuales tienen la capacidad de formar un gel como una función de la temperatura y concentración del polímero, pueden estar representados empíricamente por la fórmula: HO(C2H40)b(C2HsO)a(C2H40)bH (I) En donde a y b son números enteros de tal forma que la base hidrófoba representada por (C3HsO)a tiene un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 900 a 4,000, como se determina por el número hidróxilo; y la cadena de polioxietileno que consiste de por lo menos 60 por ciento en peso a 70 por ciento en peso del copolímero, y el copolímero que tiene un peso molecular promedio total de aproximadamente 4,000 a 15,000. La Tabla 1, posterior, hace referencia a las concentraciones mínimas de varios poloxámeros necesarias para formar un gel en agua a temperatura ambiente. Tabla 1 Poloxámero* Peso molecular Concentración mínima Pluronic® F-68 8,400 50%-60% Pluronic® F-88 11,400 40% Pluronic ®F-108 14,600 30% Pluronic® F-127 12,600 20% * Los poloxámeros están comercialmente disponibles bajo las marcas de referencia a través de BASF Corporation, Parsippany, N. J. Los poloxámeros de bajo peso molecular, es decir, debajo de 10,000 PM, no forman geles en cualquier concentración en agua . Mientras los poloxámeros, y más específicamente el Pluronic® F-127 o Poloxámero 407, han sido usados para suministrar fármacos no peptídicos así como también proteínas biológicamente activas, véanse las Patentes de los Estados Unidos No. 4,100,271 y No. 5,457,093, respectivamente, el suministro sostenido de macromoléculas biológicamente activas por semans y meses no ha sido posible por razones que se duplican. Primero, las referencias previas las cuales describen la incorporación de proteínas en una matriz de Pluronic® solo describen soluciones de una proteína, con concentraciones menores de aproximadamente 2 mg/ml y segundo, los procedimientos de formulación usados para incorpor proteínas en sistemas poliméricos resultan con frecuencia en inactivación irreversible de la proteína debido a la presencia de solventes orgánicos, cambios de pH, y efectos térmicos. Consecuentemente, las referencias anteriores las cuales enseñan el uso de poloxámeros como vehículos farmacéuticos para el suministro de proteínas han sufrido dos limitaciones serias; (i) se usan concentraciones iniciales bajas de proteínas, y (ii)un porcentaje inaceptable de la proteína pierde su actividad biológica durante el uso o almacenamiento. Estas dos limitaciones tienen un impacto directo en la capacidad para producir un sistema de suministro de fármaco con polipéptido el cual puede ser estibado por periodos largos de tiempo antes del uso y administración de dosis controladas de proteína por un periodo de semanas o más preferiblemente meses. Adicionalmente, las proteínas degradas pueden tener eficacia reducida como un fármaco, y pueden producir también reacciones adversas, tales como sensibilización y respuesta inmune adversa. Todavía existe una necesidad, por lo tanto, para un dispositivo de suministro de fármaco de polipéptido o composición que tenga altas concentraciones de polipéptidos macromoleculares totalmente nativos los cuales pueden ser liberados regularmente durante un periodo largo de tiempo. Por consiguiente, es un objeto de esta invención proporcionar un sistema de suministro de fármaco de polipéptido . Es un objeto adicional de esta invención proporcionar un dispositivo de suministro de fármaco de polipéptido o composición que tenga concentraciones de proteína o péptido mayores de 5 mg/ml . Es un objeto adicional de la presente invención incorporar estabilizantes de proteína en el dispositivo de suministro del fármaco. Objetos adicionales, ventajas y características novedosas de esta invención podrán ser indicados en parte en la descripción que sigue, y en parte llegarán a ser aparentes a aquellos expertos en la técnica después de la examinación de la siguiente especificación o pueden ser aprendidios por la práctica de la invención. Los objetos y ventajas de la invención pueden ser comprendidos y obtenidos por medios de instrumentos, combinaciones, composiciones, y métodos indicados particularmente en las reivindicaciones anexas. Para lograr lo mencionado anteriormente y otros objetos y de acuerdo con los propósitos de la presente invención, como se ejemplifica y se describe ampliamente en la misma, la composición de la presente invención comprende una matriz polimérica que tiene propiedades de gelatinización térmica en la cual se incorpora una suspensión de por lo menos un polipéptido macromolecular biológicamente activo que tiene una concentración de 0.5 por ciento o más en peso de la composición. DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN El dibujo anexo, el cual se incorpora en y forma parte de la especificación, ilustra las modalidades preparadas de la presente invención, y junto con la descripción sirve para explicar los principios de la invención. En el dibujo: La Figura 1 es una representación gráfica de los efectos que tienen varios aditivos en la temperatura de transición del solución gel (sol gel) de la presente invención, en donde cada aditivo está representado por los siguientes símbolos : - 0.1% de PEG 800, -x- Sacarosa 0.5 M, - - 1.0% de PEG 800, -*- Sacarosa l.OM, - - Pluronic® F-127, - - Sacarosa 1.5 M. El dispositivo farmacéutico o composición de la presente invención proporciona un sistema de suministro para la administración controlada y sostenida de polipéptidos macromoleculares totalmente nativos o agentes terapéuticos a un humano o animal. La matriz biodegradable, biocompatible para el suministro del fármaco se forma suspendiendo partículas solubles e insolubles de polipéptidos macromoleculares totalmente nativos que tienen una concentración de 5 mg/ml o más, y otros componentes estabilizantes de proteínas uniforme y discretamente en todo el vehículo farmacéutico o matriz polimérica que exhibe características de gelatinización térmica inversa. Como con los sistemas previamente conocidos, se liberan las partículas suspendidas y otros componentes a través de la combinación de mecanismos de difusión y disolución en cuanto se hidrata el dispositivo y subsecuentemente ese erosiona o disuelve. Sin embargo, diferente a los sistemas de matriz polimérica conocidos los cuales suministran macromoléculas, la composición de esta invención comprende una suspensión opuesta a una solución de polipéptidos nativos. Consecuentemente, se obtienen las altas concentraciones de polipéptido como un resultado de la suspensión logrando de esta forma la capacidad para administración sostenida del agente terapéutico por un periodo de tiempo de días, semanas o meses opuesto a horas. Adicionalmente, pueden ser incorporados agentes estabilizantes en la composición de la presente invención por lo que se minimiza adicionalmente la degradación de estos fármacos, lo cual impacta directamente en la eficacia del fármaco y la capacidad para almacenar o transportar el dispositivo a mercados mundiales. La composición farmacéutica de la presente invención es un descubrimiento serepndipiti que se hace durante un proyecto de investigación, la meta del cual es simplemente identificar un sistema de suministro de fármaco que es adecuado para estudiar el efecto de las matrices poliméricas en la estructura de la proteína. En ese estudio, se emplea la espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier, ya que esta puede ser usada para analizar la estructura secundaria de proteína en soluciones, suspensiones y sólidos. De las varias matrices de suministro de fármaco con proteína descritas en la literatura, aquellas que emplean el detergente polimérico, Pluronic ® F-127, el cual forma un gel sensible a la temperatura, son las más atractivas para estudios de espectroscopia infrarroja, ya que no parece (en base a las estructuras del póloxámero) que los poloxámeros puedan tener una absorbancia infrarroja que pueda interferir con la señal de absorbancia de proteína, lo cual es necesario para la evaluación estructural. Adicionalmente, se ha establecido previamente que los poloxámeros, en concentraciones suficientes, tienen las características de ser líquidos a temperaturas abajo de la temperatura ambiente pero formarán gel en cuanto se calienten. De esta forma, un objetivo adicional del estudio es determinar que efecto puede tener esta transición del líquido a gel del poloxámero en la estructura de la proteína. Con el fin de estudiar la estructura de la proteína con espectroscopia infrarroja es necesario tener concentraciones de proteína de por lo menos 15-20 mg/ml, de esta forma se prepara una concentración de la proteína de 20 mg/ml en la presencia de suficiente poloxámero para permitir la gelificación durante el calentamiento. La solución de proteína resultante forma una supensión fina, lechosa, la cual es inicialmente muy desagradable, ya que la formación de tales suspensiones indica con frecuencia que un componente de la solución (por ejemplo, el detergente polimérico) provoca que la proteína se desnaturalice y forme agregados de proteína no nativas o inactivas, de esta forma indicando una falla de la prueba. Sin embargo, la espectroscopia infrarroja puede ser usada, afortunadamente, para analizar estructuras de proteína en suspensión, por lo tanto la suspensión se analiza de cualquier forma. Sorpresivamente, cuando se analiza la suspensión de proteína con espectroscopia de infrarrojo con transformada de Fourier, en lugar de encontrar agregados de proteínas no nativas o inactivas esperadas, se encuentra inesperadamente que son totalmente nativas. De acuerdo con la presente invención, la composición farmacéutica de la presente invención comprende un polímero tal como un copolímero de bloque de polioxialquileno de la fórmula: HO (C2H40) b (C2HsO) a (C2H40) bH (I) El cual tiene la única característica, en la modalidad preferida, de ser líquido a temperatura ambiente o temperaturas menores y que existe como gel semisólido a temperaturas corporales de mamíferos en donde a y b son enteros en el intervalo de 20 a 80 y 15 a 60, respectivamente. Un copolímero de bloque de polioxialquileno preferido para uso como el vehículo farmacéutico de esta invención es un copolímero de bloque de polioxipropileno polioxietileno que tiene la siguiente fórmula: HO- (CH2CH20)b- (CH2(CH3)CHO)a- (CH2CH20)b-H (II) En donde a y b son enteros de tal forma que la base hidrófoba representada por (CH2 (CH3) CHO) a tiene un peso molecular de por lo menos aproximadamente 4,000, como se determina por el número hidróxilo; la cadena de polioxietileno que constituye aproximadamente 70 por ciento del número total de unidades monoméricas en la molécula y donde el copolímero tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12,600. El Pluronic® F-127, también conocido como Poloxámero 407, es tal material Son bien concodios los procedimientos usados para preparar soluciones acuosas las cuales forman geles de copolímero de bloque de polioxialquileno. Por ejemplo, puede ser usado ya sea un proceso caliente o frío para formar las soluciones . La técnica fría implica las etapas de disolver el copolímero de bloque de polioxialquileno a una temperatura de aproximadamente 5°C a 10 °C en agua o en un amortiguador, tal como un amortiguador de fosfato. Si se usa el agua, en la formación de la solución acuosa, está preferiblemente purificada, como por destilación, filtración, intercambio de iones o similares. Cuando se completa la solución esta se lleva a temperatura ambiente donde después forma un gel. Si se usa el proceso caliente para formar el gel, se agrega el polímero al agua o un amortiguador y se calienta a una temperatura de aproximadamente 75 °C a 85 °C con agitación lenta hasta que se obtiene la solución homogénea clara, después de enfriar se forma el gel . Puede ser mezclado cualquier polipéptido macromolecular con el vehículo farmacéutico para formar la composición farmacéutica de esta invención en donde la concentración del polipéptido macromolecular está en el intervalo de 0.5 a 50 por ciento en peso de la composición. La elección de los polipéptidos los cuales pueden ser suministrados de acuerdo con la práctica de esta invención está limitada solamente por los requerimientos que sean por lo menos muy ligeramente solubles en un medio fisiológico acuoso tal como plasma, fluido intestinal, y los fluidos intra y extracelulares del espacio subcutáneo y tejidos mucosales. Ejemplos específicos de polipéptidos adecuados para incorporación en el sistema de suministro de la presente invención incluyen las siguientes macromoléculas biológicamente activas: interferones, interleucinas, insulina, inhibidores enzimáticos, factores estimulantes de colonias, activadores de plasminógeno, factores de crecimiento y hormonas de polipéptido Se proporciona la lista de los polipéptidos macromoleculares indicados anteriormente solo para ilustrar los tipos de agentes activos los cuales son adecuados para uso en la práctica de la presente invención, y no se proponen para limitar el alcance de la presente invención. La composición farmacéutica de la presente invención puede ser preparada fácilmente usando cualquier técnica de formación de solución la cual logre la concentración del copolímero de bloque de polioxialquileno necesaria para gelificar. Preferiblemente se preparan el vehículo farmacéutico y mezcla de polipéptido por separado y la mezcla de polipéptido que tiene una concentración de 5 mg/ml o más se agrega al mismo a una temperatura de aproximadamente 0°C a 10 °C. Cuando se combinan la proteína forma una suspensión homogénea de partículas finas en la solución del polímero, la cual entonces tiene una apariencia "lechosa" . Por microscopía de luz las partículas tienen aproximadamente 5-10 micrones en diámetro. El incrementar la temperatura de la muestra arriba del punto de gelificación del poloxámero resulta en una distribución uniforme de partículas de proteína en todo el gel de polímero. Debido a la alta viscosidad de la matriz de gel, las partículas permanecen homogéneamente distribuidas y no "sedimentan" . La transición de líquido a gel es totalmente reversible después del enfriamiento. Adicionalmente, cuando se expone el gel a una solución acuosa, la matriz del gel y las partículas de la proteína se disolverán, liberando la proteína totalmente nativa la cual retiene más del 90% de su actividad biológica . La composición farmacéutica de la presente invención puede ser implantada directamente en el cuerpo inyectándola como un líquido, en donde la composición farmacéutica gelificará una vez que esté dentro del cuerpo. En la forma alternativa, la composición farmacéutica puede ser introducida en una bomba pequeña implantable la cual es introducida entonces en el cuerpo. En otra modalidad, los solutos de estabilizante de proteína, pueden ser incorporados en el dispositivo farmacéutico de la presente invención descrito anteriormente. Inicialmente, se agregan los estabilizantes al dispositivo farmacéutico de la presente invención para incrementar la estabilidad de los polipéptidos macromoleculares ya que tal estabilización puede ser crucial para uso de la presente invención para suministro sostenido de la proteína en el cuerpo. Sin embargo, al hacer esto se descubre que los solutos estabilizantes de proteína, tales como sacarosa, no solo auxilian en la protección y estabilización de la proteína, sino también permiten que el poloxámero forme geles adecuados a concentraciones menores que las necesarias en agua o amortiguador solo. De esta forma, puede ser ampliado el intervalo de trabajo de la concentración del polímero. Como se describe previamente, la concentración del copolímero de bloque de polioxialquileno es un parámetro importante. Se conoce que no se formará un gel cuando la concentración del copolímero de bloque de polioxietileno polioxipropileno en agua o amortiguador diluido esté fuera del intervalo de aproximadamente 20 a 30 por ciento en peso, como se muestra en la Figura 1 y ejemplificado por la línea que tiene triángulos abiertos. Sin embargo, puede ser manipulada la temperatura de transición de gel sol introduciendo solutos de estabilización de protéina al dispositivo farmacéutico de la presente invención, mientras se disminuye la concentración del copolímero de bloque de polioxietileno polioxipropileno el cual es necesario para formar un gel . En una tercera modalidad, pueden ser obtenidas las concentraciones del polipéptido en el extremo final del intervalo de 0.5 a 50 por ciento en peso llevando a centrifugación la composición farmacéutica de la presente invención a temperaturas bajas en el intervalo de -10°C a 10°C, y preferiblemente 0-4°C por un periodo de tiempo suficiente para sedimentar las partículas de la proteína. Por ejemplo, puede ser llevada a centrifugación una muestra de la composición farmacéutica descrita previamente que comprende 20 mg/ml de proteína a 4°C de tal forma que las partículas de proteína insoluble sedimentan. Después puede ser eliminado el sobrenadamente equivalente a la mitad del volumen y se vuelve a suspender el sedimento en el líquido restante. Esto resultará en una suspensión que contiene casi 40 mg/ml. En los ejemplos que siguen se prepara la composición farmacéutica de la presente invención de acuerdo al siguiente procedimiento de preparación. Ya que los polioxialquilenos se disuelven más completamente a temperaturas reducidas, los métodos preferidos de solubilización son para agregar la cantidad requerida del copolímero a la cantidad de agua o amortiguador a ser usado. Generalmente después de humedecer el copolímero por agitación, se tapa la mezcla y se coloca en una cámara fría o en recipiente termostático a aproximadamente 0°C a 10°C con el fin de disolver el copolímero. La mezcla puede ser agitada o mezclada para llegar aproximadamente a una solución más rápida del polímero. Subsecuentemente pueden ser agregados los polipéptidos y varios aditivos tales como estabilizantes y disueltos para formar una suspensión. Los siguientes ejemplos no limitantes proporcionan métodos para preparar polímeros sensibles a la temperatura para el suministro sostenido de agentes farmacéuticos que comprenden altas concentraciones de agentes de polipéptidos macromoleculares totalmente nativos. Todos los términos científicos y técnicos tienen los significados como se entienden por una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Los ejemplos específicos que siguen ilustran los polipéptidos representativos y concentraciones capaces de ser alcanzadas por la presente invención y no son construidos como limitantes de la invención en esfera o alcance. Los métodos pueden ser adaptados a variación con el fin de producir composiciones o dispositivos abarcados por esta invención pero no descritos específicamente. Serán evidentes variaciones de los métodos para producir las mismas composiciones en alguna forma diferente por un experto en la técnica. Se entiende que todas las temperaturas son en centígrados (°C) cuando no se especifique. La descripción espectral infrarroja (IF) se mide en un Espectrómetro Nicolet Magna-IR 550. Se usan químicos comercialmente disponibles sin purificación. En los ejemplos que siguen se prepara la- solución al 27.5 % (p/p) de Pluronic® F-127 en la siguiente forma: se agrega 7.59 g de Pluronic® F-127 seco a un tubo estéril que contiene 20 gramos de un amortiguador de fosfato enfriado en hielo (pH 7.4, 30 mM) . Se tapa el tubo y se agita bien la mezcla antes de ser almacenada durante la noche a 4°C.

EJEMPLO 1 Preparación y caracterización de una suspensión de quimo ripsina en Pluronic F-127 a) Preparación de la suspensión: Cuando se mezclan 50 µl de una suspensión 100 mg/ml de quimotripsina en amortiguador de fosfato 30 mM a pH 7.4 con 200 µl de una solución al 27.5 por ciento (p/p) de Pluronic ® F-127 se forma u inmediatamente na suspensión blanca, uniforme, lechosa. La suspensión contiene 20 mg/ml de proteína y 22 por ciento (p/p) de Pluronic® F-127 y es un líquido viscoso abajo de aproximadamente 18 °C y un gel suave, sólido arriba de aproximadamente 20°C. La porción cristalina de la suspensión líquida sedimenta de la solución cuando se permite reposar por un día o dos a 4°C o cuando se lleva a centrifugación en frío pero puede ser resuspendia fácilmente mezclando mientras esté frió. El hecho que el material suspendido pueda sedimentar y ser resuspendido en un volumen más pequeño que la suspensión original permite la formación de suspensiones de concentraciones significativamente superiores, como se discute previamente . Con el fin de determinar la solubilidad de la quimotripsina en la fase líquida de la suspensión, se ensayan las alícuotas de la suspensión total y del sobrenadante después de la centifugación a 1000-5000 rpm por 5 minutos a 4°C espectrofotométricamente para actividad enzimática. Se muestra la concentración de la quimotripsina que permanece soluble en el Pluronic ® F-127 posteriormente en la Tabla 2. Tabla 2 Enzima Solubilidad (mg/ml) 1 Desv. Est. Quimotripsina 0.132 0.062 1 Determinada dividiendo la actividad medida en el sobrenadante por la actividad calculada por mg de proteína en la suspensión total . 2 n=3. b) Enzima suspendida exhibe estructura secundaria similar a nativa co o se mide por FTIR: Se usan los espectros infrarrojos obtenidos usando un espectrofotómetro Nicolet Magna- IR 550 en una temperatura regulada, se usan células de 6 µM de longitud para examinar y comparar la estructura de la quimotripsina en el amortiguador de fosfato (30 mM, pH 7.4) y en 22 por ciento (p/p) de Pluronic ® F-127 en el mismo amortiguador. La concentración de la proteína en estos estudios es 20 mg/ml. La examinación cuidadosa de los espectros muestra que la estructura secundaria de la quimotripsina no se altera debido a la suspensión de la proteína en el Pluronic® F-127. Examinaciones espectroscópicas de FTIR adicionales de la estructura de la quimotripsina en Pluronic® F-127 a temperaturas abajo y arriba de la transición del gel (aproximadamente 15°C a 18°C) muestra que la formación del gel no altera la estructura. c) Enzima suspendida mantiene su actividad biológica Para este experimento, se prepara una suspensión de quimotripsina en 22 por ciento de Pluronic ® F-127 como se describe anteriormente pero en dos concentraciones diferentes, 20 mg/ml y 2 mg/ml. Se preparan las soluciones con las mismas concentraciones de proteínas usando amortiguador de fosfato (30 mM, pH 7.4) sin Pluronic® F-127. Se diluyen alícuotas de cada una de estas como sea necesario y se ensayan para actividad enzimática como se describe anteriormente. Como puede observarse de la Tabla 3, posterior, la enzima incorporada en los geles puede ser recuperada cuantitativamente y sin pérdida de actividad después de que los geles se disuelven en un amortiguador . Tabla 3 1 Fosfato, 30 mM, pH 7.4 2 22% (p/p) en amortiguador de fosfato 30 mM, pH 7.4 3 expresado como mAU/min a 410 nm 4 n=9 No se daña la actividad biológica por inclusión en el Pluronic® F-127. Se observa un ligero incremento de actividad cuando están presentes bajos niveles del detergente en las mezclas de ensayo de enzima. Es posible que la diferencia en el porcentaje de recuperación observado entre las muestras de 2 mg/ml y 20 mg/ml mostrados en la Tabla 3 se deba a la mayor dilución del gel en la muestra de 20 mg/ml y de esta forma niveles superiores del Pluronic ® F-127 en las muestras de 2 mg/ml . d) Enzima suspendida exhibe estabilidad al almacenamiento incrementada : Con el fin de demostrar que las proteínas suspendidas en 22 por ciento de Pluronic ® F-127 tiene una acción estabilizante, se prepara 20 mg/ml de quimotripsina en ya sea amortiguador de fosfato 30 mM, pH 7.4 o 22 por ciento de Pluronic ® F-127 en este amortiguador como se describe anteriormente. Se diluyen estas diluciones como sea necesario y se ensaya la actividad enzimática. Los resultados mostrados en la Tabla 4 posterior, demuestran que la enzima incubada en la presencia de Pluronic® F-127 retiene más actividad que la enzima incubada en la presencia del amortiguador de fosfato solo . Tabla 4 Tiempo (h) Amorti- Pluronic1 Amortigua Pluronic Amortigua Pluronic 1 fosfato 2 22% (p/p) en amotiguador de fosfato, 30 mM, pH 7.4 3 expresado como un porcentaje de valor de 1 hora 4 valor no disponible De esta forma, el Pluronic® F-127 proporciona un ambiente estabilizante, el cual es más evidente a tiempos prolongados y temperaturas elevadas, en los cuales los fármacos que contienen péptido y proteína pueden ser suspendidos antes a y durante el suministro. Adicionalmente, pueden ser agregados otros agentes estabilizantes de proteínas a la formulación como se describe adicionalmente en el Ejemplo 6 posterior. EJEMPLO 2 Preparación y caracterización de una suspensión de subtilisina en Pluronic® F-127 a) preparación de la suspensión: Se hace una suspensión de subtilisina por el mismo procedimiento descrito en detalle anteriormente para la quimotripsina. Las propiedades físicas son las mismas en términos de formación y comportamiento de la suspensión blanca lechosa y temperatura de transición gel sol. Se examina la solubilidad de la subtilisina en la fase líquida de la suspensión usando el método descrito anteriormente y se encuentra que es diferente como pudiera ser esperado para una proteína diferente. Los resultados se representan en la Tabla 5 posterior. Tabla 5 Enzima Solubilidad (mg/ml)1 Desv. Est. Subtilisina 6.482 l.ll2 1 Determinado dividiendo la actividad medida en el sobrenadante por la actividad calculada por mg de proteína en la suspensión entera. 2 n=2. b) Enzima suspendida exhibe estructura secundaria similar a nativa como se mide por FTIR; Se examinan las suspensiones de subtilisina, como aquellas de la quimotripsina descrita anteriormente, por espectroscopia de FTIR para determinar si la inclusión en el gel ha dejado cualquier efecto en la estructura y si la transición de gel sol influye en la estructura. Como en el caso de la quimotripsina, no hay efecto en la estructura. s) Enzima suspendida mantiene la actividad biológica; En experimentos similares a aquellos descritos anteriormente para la quimotripsina, se preparan las suspensiones de subtilisina en ambos amortiguador de fosfato y 22 por ciento de Pluronic® F-127 en amortiguador de fosfato y después se disuelve por dilución con amortiguador. En estos casos como en el caso de la quimotripsina, se recupera 100 por ciento de actividad de la enzima mostrando que la actividad biológica es estable mientras se incorpore en la suspensión del gel d) Enzima suspendida exhibe estabilidad incrementada en almacenamiento Con el fin de demostrar que la subtilisina suspendida en 22 por ciento de Pluronic F-127 tiene una acción estabilizante similar a aquella demostrada por la quimotripsina, se prepara 20 mg/ml de subtilisina en ya sea amortiguador de fosfato 30 mM, pH 7.4 o 22 por ciento de Pluronic (®F-127 en amortiguador de fosfato como se describe anteriormente. Se incuban estas suspensiones a temperaturas de 8, 25, y 37°C por tiempos de hasta 118 horas, se diluyen los geles o suspensiones como sea necesario y se ensaya la actividad enzimática. Los resultados, mostrados a continuación en la Tabla 6, demuestran que a pesar que la subtilisina se autocataliza y pierde actividad más rápidamente que la quimotripsina, esta todavía retiene más actividad cuando se incuba en la presencia de Pluronic® F-127 que cuando se incuba en la presencia del amortiguador de fosfato solo. Tabla 6 1 fosfato, 30 mM, pH 7.4 2 22% (p/p) en amotiguador de fosfato, 30 mM, pH 7.4 3 expresado como un porcentaje de valor de 0.5 hora EJEMPLO 3 Preparación y caracterización de una suspensión de lactato deshidrogenasa en Pluronic® F-127 a) Preparación de la suspensión: Se hace una suspensión de lactato deshidrogenasa por el mismo procedimiento descrito en detalle anteriormente para la quimotripsina. Las observaciones visuales indican que las propiedades físicas son las mismas en términos de la formación y comportamiento de la suspensión blanca lechosa y temperatura de transición de sol gel. b) Enzima suspendida mantiene la actividad biológica; En experimentos similares a aquellos descritos anteriormente para la quimotripsina, se preparan las suspensiones de lactato deshidrogenasa en ambos amortiguador de fosfato y 22 por ciento de Pluronic® F-127 en amortiguador de fosfato y después se disuelve por dilución con amortiguador. En estos casos como en el caso de la quimotripsina, se recupera 100 por ciento de actividad de la enzima mostrando que la actividad biológica es estable mientras se incorpore en la suspensión del gel . c) Enzima suspendida exhibe estabilidad incrementada en almacenamiento Se realizan experimentos similares a aquellos realizados con la quimotripsina para ilustrar el efecto del Pluronic ® F-127 en la estabilización de la actividad enzimática de la lactato deshidrogenasa durante el almacenamiento a temperaturas elevadas . En este caso se incluye sacarosa 0.5 M en algunas muestras y de esta forma es necesario reducir la concentración del Pluronic ® F-127 a 18 por ciento para mantener la temperatura de transición de gel sol. La Tabla 7 posterior, muestra los resultados obtenidos cuando se almacena la lactato deshidrogenasa por 48 horas a 37°C. Tabla 7 Composición1 de la muestra Actividad Desv. Est. enzimática2 (n=3) 18% de Pluronic 59.3 1.7 18% de pluronic + sacarosa 0.5 M 46.1 2.7 sacarosa 0.5 M 39.1 3.3 amortiguador solo 40.0 1.7 1 amortiguador usado en todas es tris: HCl 30 mM, pH 7.35 con NaN3 0.1%. 2 expresada en unidades arbitrarias EJEMPLO 4 Preparación y caracterización de una suspensión de albúmina de suero bovino en Pluronic ® F-127 a) Preparación dß la suspensión: Se hacen varias mezclas de Pluronic® F-127 y albúmina de suero de bovino en intentos para encontrar una combinación que pudiera ser un gel claro con una concentración de proteína de 15 mg/ml o más a temperatura ambiente. Las concentraciones de Pluronic ® F-127 abajo del 20 por ciento (p/p) pueden no gelificar a 25°C o abajo y las concentraciones del 20 por ciento y arriba resultan en la suspensión lechosa, blanca cuando se agrega la albúmina de suero de bovino a concentraciones de 14 mg/ml y arriba. De esta forma, no se encuentra combinación que puede proporcionar las propiedades deseadas . Estudios subsecuentes de estructura y capacidad en varias proteínas demuestran que no es necesario tener un gel claro para tener una formulación de suministro de fármaco con proteína satisfactoria con el Pluronic® F-127. b) Proteína suspendida exhibe estructura secundaria similar a nativa como se mide por FTIR La examinación espectroscópica de FTIR preliminar de la estructura de una suspensión de 20 mg/ml de albúmina de suero bovino en 22 por ciento del Pluronic® F-127 no muestra diferencias de una suspensión similar de la proteína en amortiguador solo. Este resultado es similar a los resultados de examinaciones más prolongadas de las estructuras de quimotripsina y subtilisina suspendidas en el gel. EJEMPLO 5 Preparación y caracterización de una suspensión insulina en Pluronic ® F-127 a) Preparación de la suspensión: Se hacen una suspensión de insulina por el mismo procedimiento descrito en detalle anteriormente para la quimotripsina. La observación visual indica que las propiedades físicas son las mismas en términos de la formación y comportamiento de la suspensión lechosa blanca y temperatura de transición de gel. b) Proteína suspendida exhibe estructura secundaria similar a nativa como se mide por FTIR Se examinan las suspensiones de insulina, como aquellas de la quimotripsina descritas anteriormente, por espectroscopia de FTIR para determinar si la inclusión en el gel tiene algún efecto en la estructura y si la transición de gel sol influye la estructura. Como en el caso de la quimotripsina, no hay efecto en la estructura. EJEMPLO 6 Agentes estabilizantes de proteína usados para manipular las propiedades de los geles Se incorporan varias concentracines de sacarosa en soluciones de Pluronic® 127 como un ejemplo del uso de agentes estabilizantes de proteína conocidos para manipular las propiedades de los geles. Se muestran los resultados típicos para temperatura de transición de gel sol en la Tabla 8 posterior: Tabla 8 1 p/p, en fosfato 30 mM, pH 7.4 Es claro a partir de la Tabla 8 que la temperatura de transición del gel sol puede ser manipulada en el intervalo debajo de 0°C a aproximadamente 25 °C como se requiere por la presente invención. La descripción mencionada anteriormente se considera como ilustrativa solamente de los principios de la invención. Adicionalmente, ya que fácilmente ocurrirán modificaciones y cambios numerosos por aquellos con experiencia en la técnica, no se desea limitar la invención a la construcción exacta y procesos mostrados como se describe anteriormente. Por consiguiente, todas las modificaciones y equivalentes adecuados pueden caer dentro del alcance de la invención como se define por las reivindicaciones que continúan.

Claims (32)

1. REIVINDICACIONES 1. Una composición farmacéutica para la administración controlada y sostenida de polipéptidos macromoleculares biológicamente activos caracterizada porque comprende una matriz polimérica que tiene propiedades de gelatinización térmicas en la cual se incorporan a la mezcla polimérica las partículas acuosas solubles de por lo menos un polipéptido macromolecular biológicamente activo a una concentración suficiente para formar una suspensión cuando se incorpora en la matriz polimérica.
2. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la matriz polimérica es un copolímero de bloque de polioxialquileno.
3. 3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el copolímero de bloque de polioxialquileno tiene la fórmula: HO (C2H40) b (C2H60) a (C2H40) bH En donde la porción del polioxietileno constituye por lo menos aproximadamente 70 por ciento en peso del copolímero de bloque de polioxialquileno, en donde a y b son números enteros de tal forma que la base hidrófoba representada por (C3HsO)a tiene un peso molecular de por lo menos aproximadamente
4. 4,000, y en donde el copolímero tiene un peso molecular promedio de aproximadamente 12,600. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el copolímero de bloque de polioxialquileno tiene la fórmula: CH3 H(0CH2CH2)b(0CHCH2)s(0CH2CH2)b0H en donde a es 20 a 80 y b es 15 a 60.
5. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada porque a es 67 y b es 49.
6. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las partículas de polipéptidos macromoleculares constituyen más del 0.5 por ciento en peso de la composición.
7. 7. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polipéptido macromolecular incorporado retiene más del 90 por ciento de la actividad biológica la cual el polipéptido posee antes de ser incorporado .
8. 8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque existe la temperatura de transición por lo tanto si la composición se mantiene a una primera temperatura abajo de la temperatura de transición la composición existirá en una fase líquida y si la composición se mantiene a una segunda temperatura arriba de la temperatura de transición la composición existirán en una fase de gelatinización.
9. 9. La composición de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada porque además comprende un soluto que varía la temperatura de transición en la cual la composición existirá en ya sea la fase líquida o gelatinosa
10. 10. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque disminuye la temperatura de transición cuando el soluto es sacarosa.
11. 11. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la sacarosa tiene una concentración molar de 0.5 a 1.5.
12. 12. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la temperatura de transición se incrementa cuando el soluto es polietilenglicol.
13. 13. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la concentración mínima de la matriz polimérica necesaria para gelificar disminuye después de la adición del soluto.
14. 14. Una composición farmacéutica para la administración controlada y sostenida de un polipéptido macromolecular biológicamente activo que comprende una matriz polimérica en la cual se incorpora una suspensión de las partículas de polipéptido macromoleculares acuosas solubles.
15. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el polipéptido retiene más del 90 por ciento de la actividad biológica la cual el polipéptido posee antes de ser incorporado en la matriz polimérica .
16. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la matriz posee propiedades de gelatinización térmica.
17. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la matriz polimérica es un copolímero de bloque de polioxietileno polioxipropileno.
18. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque la concentración de la matriz polimérica necesaria para formar un gel puede ser disminuida con la adición de un soluto.
19. 19. La composición de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el soluto es sacarosa.
20. 20. La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque el soluto es un estabilizante de proteína.
21. 21. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque existe una temperatura de transición en donde la matriz polimérica formará un gel si está en una fase líquida o alternativamente la matriz polimérica formará un líquido si está en una fase gelatinosa.
22. 22. La composición de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la temperatura de transición puede ser variada con la adición de un soluto.
23. 23. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la temperatura de transición disminuye cuando el soluto es sacarosa.
24. 24. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque se incrementa la temperatura de transición cuando el soluto es propilenglicol.
25. 25. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el soluto es un estabilizante de proteína.
26. 26. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el soluto es sacarosa.
27. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque el soluto es propilenglicol .
28. 28. Un método para preparar la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: Preparar una mezcla de una matriz polimérica que tiene propiedades de gelatinización térmicas; y Agregar la mezcla por lo menos un polipéptido macromolecular biológicamente activo soluble.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la matriz polimérica es un copolímero de bloque de polioxialquileno.
30. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el copolímero de bloque de polioxialquileno tiene la fórmula: HO (C2H40) b (C2H60) a (C2H40) bH En donde a es 20 a 80 y b es 15 a 60.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende adicionalmente agregar sacarosa .
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque comprende agregar adicionalmente polietilenglicol .