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CN109125251B - 一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂及其制备方法 - Google Patents

一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂及其制备方法 Download PDF

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CN109125251B
CN109125251B CN201811050341.4A CN201811050341A CN109125251B CN 109125251 B CN109125251 B CN 109125251B CN 201811050341 A CN201811050341 A CN 201811050341A CN 109125251 B CN109125251 B CN 109125251B
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黄丽萍
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Wuhan Baina Likang Biopharmaceutical Co ltd
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Abstract

本发明公开一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂及其制备方法，包括以下步骤：制备两亲性分子水相剂；取蛋白类药物，加水溶解，得蛋白溶液；将水相剂和蛋白溶液混合，混匀得蛋白水相溶液；制备油相剂；将油相剂加入到蛋白水相溶液中，混匀，立即用液氮预冻；将上述预冻好的样品冻干除去水相介质，得蛋白冻干样品；制备油相前体制剂；将油相前体制剂加入到蛋白冻干样品中，振摇溶解，即得澄清透明的液晶凝胶制剂。本发明包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂具有粘度低，可注射性，遇水可凝胶化的特点，且具有优异的缓释作用，能精确调控药物的释放，提高了药物的有效利用率，同时药物稳定性好，活性高。

Description

一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂及其制备方法
技术领域
本发明属于液晶凝胶制剂领域，具体是一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂及其制备方法。
背景技术
蛋白类药物包括多肽、基因工程药物、单克隆抗体、基因工程抗体和重组疫苗等，与以往的小分子药物相比，蛋白类药物具有高活性、特异性强、低毒性、生物功能明确的特点，有利于临床应用。但是，蛋白类药物在活体内的半衰期短且和吸收率低，因此，需要蛋白类药物的缓释制剂，起到蛋白类药物的缓释作用并保留药物生理活性，此外，对于蛋白类药物而言，其蛋白分子存在不稳定性，使得药物制剂的保质期短或易变质。
液晶是介于液态和晶态之间的一种物质状态，既具有液体的流动性又具有晶体的各向异性，溶致液晶是由符合一定结构要求的两种或两种以上化合物和溶剂组成的液晶体系，对于小分子药物、多肽、蛋白质以及核酸具有缓释作用。
中国专利文献CN101123988A公开了蛋白药物的缓释组合物，包含载体基质和掺在载体基质中的蛋白药物的缓释组合物，所述载体基质基本上由透明质酸或其盐、聚烷基氧化物以及氨基酸组成，该组合物允许生理学活性药物持续释放一周或更长。中国专利文献201810219870.6公开了一种盐酸阿霉素光控缓释液晶凝胶制剂及其制备方法，提供了一种生物利用度高、毒副作用小且可光控释放的长效缓释作用的可注射的液晶凝胶制剂，由以下重量百分比的原料制备而成：磷脂15～40％、甘油酯50～70％、助溶剂10～30％、盐酸阿霉素0.01～2％、光敏剂0.001～0.2％。郭偲等人(中国新药杂志2017,26(23),2859-2863)公开了石杉碱甲前体液晶制剂的制备及释放度研究，指出药物溶解后和SPC/GDO制得的混合体系可以吸收一定量的水，自发形成具有独特内部结构的凝胶状物质，同时将药物释放出来达到缓释的目的。以上药物缓释制剂均具有缓释效果，但蛋白类药物的缓释制剂仍存在进一步提升的空间，使其具备对蛋白类药物的优异的缓释作用和最大程度地保留药物生理活性。
中国专利文献200810124800.9针对现有注射胰岛素制剂使用麻烦并容易造成抗药性和口服制剂使用过程中不耐储存、药效被破坏的缺陷，提供了一种新型的胰岛素类似物油相制剂的制备技术，制得的胰岛素类似物油溶液在生物利用度、稳定性等方面均比传统胰岛素口服制剂有明显提高，然而，该方法中具有蛋白冻干的步骤，而在蛋白冻干和复溶的过程中可能会使蛋白的活性降低，进而影响药效。
因此，亟需一种蛋白类药物制剂及其制备方法，既利于药物的保存，又具备优异的缓释效果和药物生理活性。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂。
本发明的另一目的在于提供上述包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备水相剂；
(2)取0.01～2质量份的蛋白类药物，加水溶解，得蛋白溶液；
(3)将水相剂和蛋白溶液混合，混匀得蛋白水相溶液；
(4)称取0.001～0.01质量份的吐温和10～20质量份的甘油酯，混匀，得油相剂；
(5)将油相剂加入到蛋白水相溶液中，混匀，立即用液氮预冻；
(6)将上述预冻好的样品冻干除去水相介质，得蛋白冻干样品；
(7)制备油相前体制剂，将32～40质量份磷脂、60～68质量份甘油酯和0.01～0.1质量份光热剂混合后，在5～10质量份助溶剂的作用下完全溶解，即得油相前体制剂；
(8)将油相前体制剂加入到蛋白冻干样品中，混匀，即得到澄清的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂。
本发明采用液晶凝胶制剂的形式包载蛋白类药物，具有优异的缓释作用，并加入光热剂，能够通过调节外部条件控制药物的释放量，做到根据病人的情况，按需释放药物，提高了药物的有效利用率；同时，本发明首先对蛋白样品进行了冻干去水分处理，能够使蛋白分子稳定，利于药物的保存，水相剂和油相剂用于蛋白冻干样品的前处理步骤，能够起到稳定蛋白的作用，油相剂的加入能够促进蛋白冻干样品溶解于油相前体制剂中。
优选的，步骤(1)所述水相剂通过以下方法制备：取5～15质量份的磷脂，加水溶解，振荡分散成粗分散体，在冰浴条件下超声，离心去大颗粒，加入0～5质量份的聚乙二醇，混匀，得水相剂。磷脂能够促进蛋白的溶解，且与油相剂的相容性好，聚乙二醇的加入，使蛋白在冻干和复溶过程中保持较高活性。
优选的，所述聚乙二醇的质量份为2.5份。
优选的，步骤(7)中所述助溶剂为0～1质量份的聚谷氨酸和5～10质量份的乙醇。聚谷氨酸一种特殊的阴离子自然聚合物，具有优良的水溶性、超强的吸附性和生物可降解性，本发明将其与乙醇混合作为助溶剂，提高了各原料之间的相容性，实验证明，聚谷氨酸的加入提高了所得制剂的药物生物活性。
更优选的，所述聚谷氨酸的质量份为0.5份。
优选的，所述磷脂为大豆磷脂，所述甘油酯为二油酸甘油酯。
优选的，所述光热剂为吲哚菁绿或新吲哚菁绿中的一种或两种。
优选的，步骤(7)中所述磷脂与所述甘油酯的质量份之和为100份。一定范围内，磷脂的比例越高时，所得制剂由固相转变成液相的相转变温度越高，可根据不同蛋白的作用特征对其比例进行调整。
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂，由以上包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法制备而成。
本发明制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂适用于免疫球蛋白G(IgG)、程序性死亡受体1(PD-1)、细胞程式死亡-配体1(PD-L1)、胰岛素等蛋白类药物，可用作注射剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明采用液晶凝胶制剂的形式包载蛋白类药物，具有优异的缓释作用，并加入光热剂，能够通过调节外部条件控制药物的释放量，做到根据病人的情况，按需释放药物，提高了药物的有效利用率。
2、本发明的制备方法，能够使蛋白分子稳定，利于药物的保存，水相剂和油相剂用于蛋白冻干样品的前处理步骤，能够起到稳定蛋白的作用，油相剂的加入能够促进蛋白冻干样品溶解于油相前体制剂中。
3、本发明的水相剂中加入了聚乙二醇，使蛋白在冻干和复溶过程中保持较高活性。
4、本发明将聚谷氨酸与乙醇混合作为助溶剂，提高了各原料之间的相容性，聚谷氨酸的加入提高了所得制剂药物生物活性。
5、本发明所用原料无免疫原性，生物相容性好，部分代谢产物可以作为营养物质参与到体内生命活动，不会引起机体的炎症反应。
附图说明
图1为本发明不同实施例液晶凝胶制剂的凝胶相转变图；
图2为本发明实施例13温敏性液晶凝胶制剂可逆相转变过程；
图3为本发明实施例12温敏性液晶凝胶制剂可逆相转变过程；
图4为本发明实施例11温敏性液晶凝胶制剂可逆相转变过程；
图5为本发明实施例1温敏性液晶凝胶制剂可逆相转变过程；
图6为本发明实施例10温敏性液晶凝胶制剂可逆相转变过程；
图7为本发明实施例9温敏性液晶凝胶制剂可逆相转变过程；
图8为本发明实施例1液晶凝胶制剂光照条件下的lgG累积释放图；
图9为本发明实施例1液晶凝胶制剂不同条件下的状态图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动条件下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)制备水相剂；
(2)取0.01～2质量份的蛋白类药物，加水溶解，得蛋白溶液；
(3)将水相剂和蛋白溶液混合，混匀得蛋白水相溶液；
(4)称取0.001～0.01质量份的吐温和10～20质量份的甘油酯，混匀，得油相剂；
(5)将油相剂加入到蛋白水相溶液中，混匀，立即用液氮预冻；
(6)将上述预冻好的样品冻干除去水相介质，得蛋白冻干样品；
(7)制备油相前体制剂，将32～40质量份磷脂、60～68质量份甘油酯和0.01～0.1质量份光热剂混合后，在5～10质量份助溶剂的作用下完全溶解，即得油相前体制剂；
(8)将油相前体制剂加入到蛋白冻干样品中，混匀，即得到澄清的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂。
优选的，步骤(1)所述水相剂通过以下方法制备：取5～15质量份的磷脂，加水溶解，振荡分散成粗分散体，在冰浴条件下超声，离心去大颗粒，加入0～5质量份的聚乙二醇，混匀，得水相剂。
优选的，步骤(7)中所述助溶剂为0～1质量份的聚谷氨酸和5～10质量份的乙醇。
优选的，所述磷脂为大豆磷脂，所述甘油酯为二油酸甘油酯。
优选的，所述光热剂为吲哚菁绿或新吲哚菁绿中的一种或两种。
优选的，步骤(7)中所述磷脂与所述甘油酯的质量份之和为100份。
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂，由以上包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法制备而成。
实施例1
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取10质量份的大豆磷脂于10ml带塞西林瓶中，加40质量份的水溶解，封口，在摇床上振荡分散成粗分散体，在冰浴条件下探头超声20min，形成乳白色分散体，离心去大颗粒，混匀，得水相剂；
(2)取1质量份的IgG粉末，加30质量份的水溶解，得蛋白溶液；
(3)将水相剂和蛋白溶液混合，混匀得蛋白水相溶液；
(4)称取0.005质量份的吐温和15质量份的二油酸甘油酯，混匀，得油相剂；
(5)将油相剂加入到蛋白水相溶液中，混匀，立即用液氮预冻；
(6)将上述预冻好的样品冻干除去水相介质，得蛋白冻干样品；
(7)制备油相前体制剂，将35质量份大豆磷脂、65质量份二油酸甘油酯和0.05质量份新吲哚菁绿IR820混合后，加入8质量份乙醇，放在45℃的烘箱完全溶解，即得油相前体制剂；
(8)将油相前体制剂加入到蛋白冻干样品中，混匀，即得到澄清的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好。
释放度实验：称取适量的液晶凝胶制剂于洁净干燥的玻璃管，然后加入一定体积的pH7.4磷酸盐缓冲液后，密封，放入恒温摇床中进行振荡释放，恒温摇床参数设置：温度37℃，转速100rpm。分别于不同时间点取样，然后向释放体系中补加取样相同体积的释放介质。取出的释放介质样品放置于-20℃备用，经多功能酶标仪检测释放介质样品中的蛋白含量。本实施例制剂在释放度实验的3h和50h时分别给一次光照，光照条件为：光照时间为2min，辐照功率密度为0.5w/cm2，按照释放度实验对其释放度进行检测。实验结果见图8，可以明显看出，本实施例制剂的缓释效果优异且对光照敏感，因此，通过改变光照条件能够很好地调控药物的释放。
凝胶相转变实验：采用流变仪考察凝胶的弹性模量(G’)与粘性模量(G”)，实验结果见图1和图5，可以看出，本实施例制剂的相转变温度为30℃，结合实施例9～13可以看出，一定范围内，磷脂的比例越高时，所得制剂由固相转变成液相的相转变温度越高，可根据不同蛋白的作用特征对其比例进行调整。
图9为本发明实施例液晶凝胶制剂不同条件下的状态图，可以看出，本发明实施例液晶凝胶制剂具有遇水凝胶化的性能，且具有温度响应型，同时，其温敏性具有可逆性和可恢复性。
取本实施例IgG液晶凝胶制剂释放度实验释放的IgG蛋白用乙醇沉淀，取一定量的IgG蛋白作为样品，采用上海通蔚生物科技有限公司的免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附试验，具体步骤同试剂盒操作说明书，实验结果见表1。
实施例2
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例1的区别在于，步骤(1)为：取10质量份的大豆磷脂于10ml带塞西林瓶中，加40质量份的水溶解，封口，在摇床上振荡分散成粗分散体，在冰浴条件下探头超声20min，形成乳白色分散体，离心去大颗粒，加入2.5质量份的聚乙二醇，混匀，得水相剂。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好。同时，本实施例的缓释度实验结果与实施例1相近，说明本实施例制剂的缓释效果优异。
取本实施例IgG液晶凝胶制剂释放度实验释放的IgG蛋白用乙醇沉淀，取与实施例1等质量的IgG蛋白作为样品，采用上海通蔚生物科技有限公司的免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附试验，具体步骤同试剂盒操作说明书，实验结果见表1。
实施例3
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例2的区别在于，步骤(7)为：制备油相前体制剂，将35质量份大豆磷脂、65质量份二油酸甘油酯和0.05质量份新吲哚菁绿IR820混合后，加入0.5质量份的聚谷氨酸和8质量份的乙醇，放在45℃的烘箱完全溶解，即得油相前体制剂。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好。同时，本实施例的缓释度实验结果与实施例1相近，说明本实施例制剂的缓释效果优异。
取本实施例IgG液晶凝胶制剂释放度实验释放的IgG蛋白用乙醇沉淀，取与实施例1等质量的IgG蛋白作为样品，采用上海通蔚生物科技有限公司的免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附试验，具体步骤同试剂盒操作说明书，实验结果见表1。
实施例4
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例3的区别在于：步骤(1)中加入5质量份的聚乙二醇；步骤(7)中加入1质量份的聚谷氨酸和8质量份乙醇。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好。同时，本实施例的缓释度实验结果与实施例1相近，说明本实施例制剂的缓释效果优异。
取本实施例IgG液晶凝胶制剂释放度实验释放的IgG蛋白用乙醇沉淀，取与实施例1等质量的IgG蛋白作为样品，采用上海通蔚生物科技有限公司的免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附试验，具体步骤同试剂盒操作说明书，实验结果见表1。
实施例5
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例1的区别在于：步骤(2)中，取1质量份的胰岛素，加30质量份的水溶解，得蛋白溶液。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为胰岛素液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好。
将本实施例胰岛素液晶凝胶制剂释放度实验释放的胰岛素用乙醇沉淀，取一定量的胰岛素作为样品，按照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)通则1211胰岛素生物测定法进行测定，实验结果见表2。
实施例6
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例2的区别在于：步骤(2)中，取1质量份的胰岛素，加30质量份的水溶解，得蛋白溶液。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为胰岛素液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好。
将本实施例胰岛素液晶凝胶制剂释放度实验释放的胰岛素用乙醇沉淀，取与实施例5等质量的胰岛素作为样品，按照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)通则1211胰岛素生物测定法进行测定，实验结果见表2。
实施例7
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例3的区别在于：步骤(2)中，取1质量份的胰岛素，加30质量份的水溶解，得蛋白溶液。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为胰岛素液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好。
将本实施例胰岛素液晶凝胶制剂释放度实验释放的胰岛素用乙醇沉淀，取与实施例5等质量的胰岛素作为样品，按照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)通则1211胰岛素生物测定法进行测定，实验结果见表2。
实施例8
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例4的区别在于：步骤(2)中，取1质量份的胰岛素，加30质量份的水溶解，得蛋白溶液。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为胰岛素液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好。
将本实施例胰岛素液晶凝胶制剂释放度实验释放的胰岛素用乙醇沉淀，取与实施例5等质量的胰岛素作为样品，按照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)通则1211胰岛素生物测定法进行测定，实验结果见表2。
实施例9
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例1的区别在于：步骤(7)中，将32质量份大豆磷脂、68质量份二油酸甘油酯和0.05质量份新吲哚菁绿IR820混合。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好；同时，本实施例的缓释度实验结果与实施例1相近，说明本实施例制剂的缓释效果优异。
本实施例凝胶相转变实验结果见图1和图7，可以看出，本实施例制剂的相转变温度为29℃。
实施例10
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例1的区别在于：步骤(7)中，将34质量份大豆磷脂、66质量份二油酸甘油酯和0.05质量份新吲哚菁绿IR820混合。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好；同时，本实施例的缓释度实验结果与实施例1相近，说明本实施例制剂的缓释效果优异。
本实施例凝胶相转变实验结果见图1和图6，可以看出，本实施例制剂的相转变温度为30℃。
实施例11
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例1的区别在于：步骤(7)中，将36质量份大豆磷脂、64质量份二油酸甘油酯和0.05质量份新吲哚菁绿IR820混合。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好；同时，本实施例的缓释度实验结果与实施例1相近，说明本实施例制剂的缓释效果优异。
本实施例凝胶相转变实验结果见图1和图4，可以看出，本实施例制剂的相转变温度为39℃。
实施例12
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例1的区别在于：步骤(7)中，将38质量份大豆磷脂、62质量份二油酸甘油酯和0.05质量份新吲哚菁绿IR820混合。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好；同时，本实施例的缓释度实验结果与实施例1相近，说明本实施例制剂的缓释效果优异。
本实施例凝胶相转变实验结果见图1和图3，可以看出，本实施例制剂的相转变温度为45℃。
实施例13
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，与实施例1的区别在于：步骤(7)中，将40质量份大豆磷脂、60质量份二油酸甘油酯和0.05质量份新吲哚菁绿IR820混合。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好；同时，本实施例的缓释度实验结果与实施例1相近，说明本实施例制剂的缓释效果优异。
本实施例凝胶相转变实验结果见图1和图2，可以看出，本实施例制剂的相转变温度为67℃。
实施例14
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取5质量份的大豆磷脂于10ml带塞西林瓶中，加40质量份的水溶解，封口，在摇床上振荡分散成粗分散体，在冰浴条件下探头超声20min，形成乳白色分散体，离心去大颗粒，混匀，得水相剂；
(2)取0.5质量份的IgG粉末，加30质量份的水溶解，得蛋白溶液；
(3)将水相剂和蛋白溶液混合，混匀得蛋白水相溶液；
(4)称取0.001质量份的吐温和10质量份的二油酸甘油酯，混匀，得油相剂；
(5)将油相剂加入到蛋白水相溶液中，混匀，立即用液氮预冻；
(6)将上述预冻好的样品冻干除去水相介质，得蛋白冻干样品；
(7)制备油相前体制剂，将35质量份大豆磷脂、65质量份二油酸甘油酯和0.01质量份新吲哚菁绿IR820混合后，加入5质量份乙醇，放在45℃的烘箱完全溶解，即得油相前体制剂；
(8)将油相前体制剂加入到蛋白冻干样品中，混匀，即得到澄清的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好；同时，本实施例的缓释度实验结果与实施例1相近，说明本实施例制剂的缓释效果优异。
实施例15
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取15质量份的大豆磷脂于10ml带塞西林瓶中，加40质量份的水溶解，封口，在摇床上振荡分散成粗分散体，在冰浴条件下探头超声20min，形成乳白色分散体，离心去大颗粒，混匀，得水相剂；
(2)取2质量份的IgG粉末，加30质量份的水溶解，得蛋白溶液；
(3)将水相剂和蛋白溶液混合，混匀得蛋白水相溶液；
(4)称取0.01质量份的吐温和20质量份的二油酸甘油酯，混匀，得油相剂；
(5)将油相剂加入到蛋白水相溶液中，混匀，立即用液氮预冻；
(6)将上述预冻好的样品冻干除去水相介质，得蛋白冻干样品；
(7)制备油相前体制剂，将35质量份大豆磷脂、65质量份二油酸甘油酯和0.1质量份吲哚菁绿ICG混合后，加入10质量份乙醇，放在45℃的烘箱完全溶解，即得油相前体制剂；
(8)将油相前体制剂加入到蛋白冻干样品中，混匀，即得到澄清的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂。
本实施例制得的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂为IgG液晶凝胶制剂，本制剂4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，说明制剂存放稳定性好；同时，本实施例的缓释度实验结果与实施例1相近，说明本实施例制剂的缓释效果优异。
对比例1
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：将1质量份的IgG粉末、35质量份磷脂、65质量份二油酸甘油酯和0.05质量份新吲哚菁绿IR820混合后，在8质量份乙醇的作用下完全溶解，即得IgG液晶凝胶制剂。
本对比例制得的IgG液晶凝胶制剂在4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，6个月时无分层现象，9个月和12个月时出现了分层现象，说明本对比例制剂存放的稳定性相比各组实施例制剂要差。
对比例2
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取10质量份的大豆磷脂于10ml带塞西林瓶中，加40质量份的水溶解，封口，在摇床上振荡分散成粗分散体，在冰浴条件下探头超声20min，形成乳白色分散体，离心去大颗粒，混匀，得水相剂；
(2)取1质量份的IgG粉末，加30质量份的水溶解，得蛋白溶液；
(3)将水相剂和蛋白溶液混合，混匀得蛋白水相溶液，立即用液氮预冻；
(4)将上述预冻好的样品冻干除去水相介质，得蛋白冻干样品；
(5)制备油相前体制剂，将65质量份二油酸甘油酯和0.05质量份新吲哚菁绿IR820混合后，加入8质量份乙醇，放在45℃的烘箱完全溶解，即得油相前体制剂；
(6)将油相前体制剂加入到蛋白冻干样品中，混匀，即得到澄清的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂。
本对比例制得的IgG液晶凝胶制剂，在4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，6个月和9个月时无分层现象，12个月时出现了分层现象，说明本对比例制剂存放的稳定性相比各组实施例制剂要差。
取本对比例IgG液晶凝胶制剂释放度实验释放的IgG蛋白用乙醇沉淀，取与实施例1等质量的IgG蛋白作为样品，采用上海通蔚生物科技有限公司的免疫球蛋白G(IgG)ELISA试剂盒进行酶联免疫吸附试验，具体步骤同试剂盒操作说明书，实验结果见表1。
对比例3
一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)取10质量份的大豆磷脂于10ml带塞西林瓶中，加40质量份的水溶解，封口，在摇床上振荡分散成粗分散体，在冰浴条件下探头超声20min，形成乳白色分散体，离心去大颗粒，混匀，得水相剂；
(2)取1质量份的胰岛素，加30质量份的水溶解，得蛋白溶液；
(3)将水相剂和蛋白溶液混合，混匀得蛋白水相溶液，立即用液氮预冻；
(4)将上述预冻好的样品冻干除去水相介质，得蛋白冻干样品；
(5)制备油相前体制剂，将65质量份二油酸甘油酯和0.05质量份新吲哚菁绿IR820混合后，加入8质量份乙醇，放在45℃的烘箱完全溶解，即得油相前体制剂；
(6)将油相前体制剂加入到蛋白冻干样品中，混匀，即得到澄清的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂。
本对比例制得的胰岛素液晶凝胶制剂，在4℃放置6个月、9个月、12个月后，离心处理，均无分层现象，12个月时出现了分层现象，说明本对比例制剂存放的稳定性好，这与蛋白的特征存在一定关系。
将本对比例胰岛素液晶凝胶制剂释放度实验释放的胰岛素用乙醇沉淀，取与实施例5等质量的胰岛素作为样品，按照《中华人民共和国药典》(2015年版四部)通则1211胰岛素生物测定法进行测定，实验结果见表2。
表1不同组别IgG酶联免疫吸附试验结果
组别 实施例1 实施例2 实施例3 实施例4 对比例2
IgG含量(mg/ml) 3.3±0.3 3.5±0.3 3.8±0.2 3.6±0.1 3.1±0.2
从表1可以看出，对于IgG液晶凝胶制剂，本发明实施例制剂释放的具有生物活性的IgG蛋白含量较对比例3高，说明本发明制剂释放的的IgG蛋白结构完整、活性稳定，很可能是由于本发明方法具有对IgG蛋白的保护作用使得IgG蛋白稳定性好，在冻干和复溶过程中减少了IgG蛋白的降解或变性而造成的损失，其中，以实施例3的效果最好，即该实施例方法中的辅料以及配比最佳。
表2不同组别胰岛素生物测定结果
组别 实施例5 实施例6 实施例7 实施例8 对比例3
血糖值(mmol/L) 6.7±1.0 6.5±1.2 6.2±1.1 6.5±0.9 7.1±1.1
从表2可以看出，对于胰岛素液晶凝胶制剂，本发明实施例制剂的降血糖效果较对比例3更优，说明本发明制剂的胰岛素生物活性更高，很可能是由于本发明方法具有对胰岛素的保护作用使得胰岛素稳定性好，在冻干和复溶过程中减少了胰岛素的降解或变性造成的活性损失，其中，以实施例7的效果最好，即该实施例方法中的辅料以及配比最佳。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (5)

1.一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备水相剂，取5～15质量份的磷脂，加水溶解，振荡分散成粗分散体，在冰浴条件下超声，离心去大颗粒，加入0～5质量份的聚乙二醇，混匀，得水相剂；
(2)取0.01～2质量份的蛋白类药物，加水溶解，得蛋白溶液；
(3)将水相剂和蛋白溶液混合，混匀得蛋白水相溶液；
(4)称取0.001～0.01质量份的吐温和10～20质量份的甘油酯，混匀，得油相剂；
(5)将油相剂加入到蛋白水相溶液中，混匀，立即用液氮预冻；
(6)将上述预冻好的样品冻干除去水相介质，得蛋白冻干样品；
(7)制备油相前体制剂，将32～40质量份磷脂、60～68质量份甘油酯和0.01～0.1质量份光热剂混合后，在5～10质量份助溶剂的作用下完全溶解，即得油相前体制剂；
(8)将油相前体制剂加入到蛋白冻干样品中，混匀，即得到澄清的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂；
所述蛋白类药物为免疫球蛋白G或胰岛素中的一种；
所述磷脂为大豆磷脂；
所述甘油酯为二油酸甘油酯；
所述光热剂为吲哚菁绿或新吲哚菁绿中的一种或两种；
所述助溶剂为0～1质量份的聚谷氨酸和5～10质量份的乙醇。
2.根据权利要求1所述的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述聚乙二醇的质量份为2.5份。
3.根据权利要求1所述的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，其特征在于，所述聚谷氨酸的质量份为0.5份。
4.根据权利要求1所述的包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法，其特征在于，步骤(7)中所述磷脂与所述甘油酯的质量份之和为100份。
5.一种包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂，其特征在于，由权利要求1～4任一项所述包载蛋白类药物的温敏性液晶凝胶制剂的制备方法制备而成。
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