MXPA06014069A

MXPA06014069A - Metodo para tratar esclerosis multiple.

Info

Publication number: MXPA06014069A
Application number: MXPA06014069A
Authority: MX
Inventors: Paul A Frohna
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 2004-06-04
Filing date: 2005-06-02
Publication date: 2007-04-25
Also published as: IL219285A; AU2005249566A1; CN102512675A; CN106075435A; RU2384345C2; RU2006147253A; EP1753455A2; NO20070052L; ZA200610158B; US20060051345A1; KR20150092374A; KR20130099228A; NZ604082A; CA2566979A1; IL179139A0; KR20070029733A; US20120199516A1; IL219285A0; MY194883A; BRPI0510915A

Abstract

Se describen metodos para tratar esclerosis multiple (MS = multiple sclerosis) con un anticuerpo CD20 utilizando regimenes y protocolos de dosificacion especiales. Tambien se describen articulos de manufactura para utilizar en estos metodos.

Description

MÉTODO PARA TRATAR ESCLEROSIS MÚLTIPLE Campo de la Invención La presente invención se refiere a métodos para tratar esclerosis múltiple (MS) en un sujeto utilizando regimenes y protocolos de dosis especiales, y un artículo de manufactura con instrucciones para este uso. Antecedente de la Invención Esclerosis Múltiple La esclerosis múltiple (MS = Múltiple Sclerosis) es una enfermedad degenerativa inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central humano (CNS = central nervous system) . Es una enfermedad mundial que afecta aproximadamente a 300,000 personas en los E.U.A.; es una enfermedad de adultos jóvenes, con 70%-80% que tiene inicio entre 20 y 40 años de edad (Anderson et al. Ann Neurology 31(3):333-6 (1992); Noonan et al. Neurology 58:136-8 (2002)). MS es un desorden heterogéneo con base en el curso clínico, evaluación de exploración por formación de imagen de resonancia magnética (MRI = Magnetic Resonance Imaging) de curso clínico, y análisis de patología de material de biopsia y autopsia (Lucchinetti et al. Ann Neurol 47: 707-17 (2000)). La enfermedad se manifiesta por sí misma en un número grande de combinaciones posibles de déficit, incluyendo médula espinal, tallo cerebral, nervio craneal, síndromes cereberal, cerebral y cognoscitivo. Incapacidad progresiva es la fatalidad de la mayoría de los pacientes con MS, especialmente cuando se incluye una perspectiva de 25 años. La mitad de los pacientes de MS requieren un bastón para caminar dentro de los 15 años del inicio de la enfermedad. MS es una causa principal de incapacidad neurológica en adultos jóvenes y de edad media, y hasta la última década no se había tenido tratamientos benéficos conocidos. MS es difícil de diagnosticar debido a los hallazgos clínicos no específicos, que llevan al desarrollo de criterios de diagnóstico altamente estructurados, que incluyen varios avances tecnológicos, que consisten de exploraciones MRI, potenciales evocados y estudios del fluido cerebroespinal (CSF = cerebrospinal fluid) . Todos los criterios de diagnóstico se basan en los principios generales de lesiones dispersas en la materia blanca central que ocurren en diferentes tiempos y que no se explican por otras etiologías tales como infección, desorden vascular, o desorden autoinmune (McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001) ) . MS tiene cuatro patrones de enfermedad: MS de relapso-remisión (RRMS = relapsing-remitting MS; 80%-85% de los casos al inicio) , MS progresiva primaria (PPMS = primary progressive MS; 10%- 15% al inicio) , MS de relapso progresivo (PRMS = progressive relapsing MS; 5% al inicio) ; y MS progresiva secundaria (SPMS = secondary progressive MS) (Kremenchutzky et al. Brain 122 (PtlO) :1941-50 (1999); Confavreux et al. N Engl J Med 343 (20) : 1430-8 (2000)). Un 50% estimado de los pacientes con RRMS desarrollarán SPMS en 10 años, y hasta 90% de los pacientes RRMS eventualmente desarrollarán SPMS ( einshenker et al. Brain 112 (Ptl) : 133@6 (1989)). Actualmente, en los E.U.A. están aprobadas seis drogas en cuatro clases para el tratamiento de RRMS, mientras que no se han aprobado drogas para PPMS . Los tratamientos de RRMS incluyen los siguientes: clase interferona, IFN-beta-la (REBIF® y AVONEX®) e IFN-beta-lb (BETASERON®) ; acetato de glatiramer (COPAXONE®, un polipéptido; natalizumab (TYSABRI®) ; y mitoxantrona (NOVANTRONE®, un agente citotóxico) . Otras drogas se han empleado con grados variantes de éxito, incluyendo corticoestiroides, metotrexato, ciclofosfamida, azatioprina e inmunoglobulina intravenosa (IV) . Los beneficios de los tratamientos actualmente aprobados son relativamente modestos (apr. 30%) para la tasa de relapso y prevención de incapacidad en RRMS, como se sugiere por dos meta-análisis recientes (Filippini et al. Lancet 361:545-52 (2003) ) . Otros estudios clínicos evalúan otros agentes inmunomodulatorios en MS, incluyendo inhibidores de factor alfa de necrosis de tumor, y ligandos péptidos alterados, que agravan en vez de mejoran MS (Lenercept Múltiple Sclerosis Study Group and the University of British Columbia MS/MRI Neurology 53: 457-65 (1999); Bielekova et al. Na t Med 2000; 6:1167-75 (2000), aparecen erratas en Na t Med 6:1412 (2000)). La visión predominante de la patofisiología de MS ha sostenido que la inflamación está principalmente mediada por células CD4+ Thl T. Enfoques terapéuticos con base en esa teoría tales como IFN-beta y acetato de glatiramer disminuyen, pero no evitan completamente la ocurrencia de exacerbaciones o acumulación de incapacidad. La existencia de un componente humoral en MS humano ha sido implícitamente reconocida por décadas, como se evidencia por inclusión de bandas oligoclonales CSF y síntesis IgG intratecal incrementada en criterios de diagnóstico para MS (Siden A. J Neurol 221:39-51(1979); McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001); Andersson et al. EurJNeurol 9:243-51 (2002); O'Connor, P. Neurology 59:Sl-33- (2002)). La presencia de bandas oligoclonales, aumenta cadenas ligeras libres y aumenta la síntesis IgM intratecal se correlaciona con la actividad de la enfermedad MS y puede ser un pronosticador de resultados más severos (Rudick et al.

Mul t Scler 1:150-5 (1995); Zeman et al. Acta Cytol 45:51-9 (2001); Izquierdo et al. Acta Neurol Scand 105:158-63 (2002); olinsky J. JNeurol Sci 206:145-52 (2003); Villar et al. Ann Neurol 53:222-6 (2003)). Anticuerpos de antimielina (proteína básica mielina MBP = myelin basic protein) y glicoproteína de oligodendrocito de mielina (MOG = myelin oligodendrocyte glycoprotein) ) se han detectado en el suero de pacientes con formas progresivas y de relapso de MS (Reindl et al. Brain 122: 2047-56 (1999); Egg et al. Mul t Scler 7(5) :285-9 (2001) ) . Anticuerpos de anti-mielina también se han detectado en CSF de pacientes de MS (Reindl et al. Brain 122:2047-56 (1999); Egg et al. Mul t Scler 7 (5):285-9 (2001); Andersson et al. EurJ Neurol 9: 243-51 (2002)). Tipos adicionales de anticuerpos tales como anticuerpos anti-gangliósido o anticuerpos anti-neurofilamentos se han observado en pacientes con MS (Mata et al. Mul t Scler 5: 379-88 (1999); Sadatipour et al. Ann Neural 44: 980-3 (1998) ) . Un reporte reciente indica que la presencia de anticuerpos anti-MOG y anti-MBP en suero fue un fuerte pronosticador de avance de un evento desmielinizante clínicamente aislado, para definir RRMS (Berger et al. NEngl JMed 349:139-45 (2003)). La proporción de riesgo ajustado para experimentar una exacerbación fue 76.5 para pacientes quienes fueron seropositivos para tanto anticuerpos como 31.6 para pacientes quienes eran seropositivos sólo para anti-MOG. Un consorcio de patología internacional encontró que anticuerpos ligados a mielina están presentes en la mayoría de pacientes con MS, con células de plasma y células B que se encuentran también en lesiones de MS, proporcionando evidencia adicional de un papel humoral en MS (Prineas and Wright, Lab Invest 38:409-21 (1978); Esiri M. Neuropa thol Appl Neurobiol 6: 9-21 (1980); Genain et al. Na t Med 5:170-5 (1999); Lucchinetti et al. Ann Neurol 47: 707-17 (2000); Wingerchuk et al. Lab Invest 81:263-81 (2001)). Células B son detectables en CSF de pacientes con MS y la presencia de una proporción relativamente alta de células B puede ser pronóstico de progreso de incapacidad más severo (Cepok et al. Brain 124 (Pt 11) : 2169-76 (2001) ) . En sujetos con RRMS o síndrome opsoclonus-mioclonus, Rituximab reportó el agotamiento de células B periféricas en todos los sujetos y disminuyó el número de células CSF B en algunos pacientes (Pranzatelli et al. Neurology 60 (Suppll) P05.128:A395 (2003); Cross et al. "Preliminary Results from a Phase II Trial of Rituximab in MS" (abstract) Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Múltiple Sclerosis ACTRIMS 20-1 (October, 2003)). Ver también Cree et al. "Tolerability and Effects of Rituximab "Anti-CD20 Antibody" in Neuromyelitis Óptica and Rapidly Worsening Múltiple Sclerosis" Meeting of the Am. Acad. Neurol. (April, 2004) . Anticuerpos CD20 y su terapia Los linfocitos son uno de muchos tipos de glóbulos blancos que se producen en la médula ósea durante el proceso de hematopoyesis. Hay dos poblaciones principales de linfocitos: linfocitos B (células B) y linfocitos T (células T) . Los linfocitos de interés particular son las células B. Las células B maduran dentro de la médula ósea y dejan a la médula expresando un anticuerpo de enlace de antígeno en su superficie celular. Cuando una célula B virgen primero encuentra el antígeno para el cual es específico su anticuerpo ligado a membrana, la célula empieza a dividirse rápidamente y su progenie se diferencia en células B de memoria y células efectoras denominadas "células de plasma". Las células B de memoria tienen una más larga duración de vida y continúan expresando anticuerpo ligado a membrana con la misma especificidad que la célula padre original. Células de plasma no producen anticuerpo ligado a membrana sino por el contrario producen el anticuerpo en una forma que pueda ser secretada. Anticuerpos secretados son la molécula efectora principal de inmunidad humoral. El antígeno CD20 (también denominado antígeno de diferenciación restringido con linfocito B humano, Bp35) es una proteína transmembrana hidrofóbica con un peso molecular de aproximadamente 35 kD ubicada en linfocitos pre-B y B maduros (Valentine et al. J. Biol . Chem . 264 (19) : 11282-11287 (1989); y Einfeld et al. EMBOJ. 7 (3):711-717 (1988)). El antígeno también se expresa en más de 90% de linfomas no- Hodgkin de célula B (NHL) (Anderson et al. Blood 63 (6) : 1424-1433 (1984)), pero no se encuentra en células madre hematopoyéticas, células pro-B, células de plasma normal u otros tejidos normales (Tedder et al. J. Im unol . 135 (2): 973-979 (1985)). CD20 regula una o varias etapas previas en el proceso de activación para inicio y diferenciación de ciclo celular (Tedder et al., supra) y posiblemente funciona como un canal de ion calcio (Tedder et al. J. Cell . Biochem . 14D:195 (1990) ) . Dada la expresión de CD20 en linfoma de célula B, este antígeno puede servir como un candidato para "hacer diana" en estos linfomas. En esencia, este blanco puede generalizarse como sigue: anticuerpos específicos al antígeno de superficie de CD20 de las células B se administran a un paciente. Estos anticuerpos anti-CD20 ligan específicamente al antígeno CD20 de (ostensiblemente) tanto células B normales como malignas; el anticuerpo ligado al antígeno de superficie CD20 puede llevar a la destrucción y agotamiento de células B neoplásticas. Adicionalmente, agentes químicos o etiquetas radioactivas que tienen el potencial por destruir el tumor, pueden conjugarse el anticuerpo anti-CD20, de manera tal que el agente se "suministre" específicamente a las células B neoplásticas. Independientemente del enfoque, una meta primaria es destruir el tumor, el enfoque específico puede determinarse por el anticuerpo anti-CD20 particular que se utiliza y de esta manera los enfoques disponibles a hacer diana al antígeno CD20, pueden variar considerablemente. El anticuerpo Rituximab (RITUXAN®) es un anticuerpo monoclonal humano-murino quimérico de ingeniería genética dirigido contra el antígeno CD20. Rituximab es el anticuerpo denominado "C2B8" en la patente de los E.U.A. Número 5,736,137 otorgada en abril 7,1998 (Anderson et al . ) . RITUXAN® es indicado para tratamiento de pacientes con linfoma no-Hodgkin de células B, CD20-positivo, de relapso o de bajo grado refractario o folicular. Estudios del mecanismo de acción in vi tro ha demostrado que RITUXAN® liga el complemento humano y lisa las líneas de células B linfoides a través de citotoxicidad dependiente de complemento (CDC complement-dependent cytotoxicity) (Reff et al. Blood 83 (2) :435-445 (1994)). Adicionalmente, tiene una actividad significante en ensayos para citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC = antibody-dependent cellular cytotoxicity) . Más recientemente, RITUXAN® ha mostrado que tiene efectos antiproliferativos en ensayos de incorporación de timidina tritiada y para inducir apoptosis directamente, mientras que otros anticuerpos anti-CD19 y CD20 no (Maloney et al. Blood 88(10) :637a (1996)). La sinergia entre RITUXAN® y quimioterapias citoxinas también se ha observado experimentalmente. En particular, RITUXAN® sensibiliza líneas celulares de linfoma de célula B humana resistente a droga a los efectos citotóxicos de doxorubicina, CDDP, VP-16, toxina difteria y ricina (Demidem et al. Cáncer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12 (3) : 177-186 (1997)). Estudios preclínicos in vivo han mostrado que RITUXAN® agota células B de la sangre periférica, nodos linfáticos y médula ósea de monos cinomolgus, supuestamente a través de procesos mediados por células y complemento (Reff et al. Blood 83 (2):435-445 (1994)). Rituximab se aprobó en los E.U.A. en noviembre de 1997 para el tratamiento de pacientes con linfoma no-Hodgkin (NHL) de célula B CD20+ folicular o de bajo grado refractario o de relapso, en una dosis de 375 mg/m2 semanalmente por cuatro dosis. En abril 2001, la Administración de Drogas y Alimentos (FDA = Food and Drug Administration) aprobó reivindicaciones adicionales para el tratamiento de NHL de bajo grado: re-tratamiento (semanalmente por cuatro dosis) y un régimen de dosis adicional (semanalmente por ocho dosis) . Ha habido más de 300,000 exposiciones de pacientes a Rituximab ya sea como monoterapia o en combinación con drogas inmunosupresoras o quimioterapéuticas. También se han tratado pacientes con Rituximab como terapia de mantenimiento por hasta 2 años (Hainsworth et al. J Clin Oncol 21:1746-51 (2003); Hainsworth et al. J Clin Oncol 20: 4261-7 (2002)). Rituximab también se ha estudiado en una variedad de desórdenes autoinmunes no malignos, en donde células B y auto-anticuerpos parecen jugar un papel en la patofisiología de la enfermedad (Edwards et al. Biochem Soc Trans 30:824-8 (2002)). Rituximab se ha reportado que alivia potencialmente signos y síntomas de artritis reumatoide (RA) (Leandro et al. Ann Rheum Dis . 61:883-8 (2002); Emery et. al. Arthri tis Rheum 48 (9):S439 (2003)), lupus R. Arthri tis Res Ther 5:157-9 (2003); Leandro et al. Arthri tis Rheum 46: 2673-7 (2002)), trombocitopenia inmune (D 'Arena et al. Leuk Lymphoma 44:561-2 (2003)), anemia autoinmune (Zaja et al. Haema tologica 87:189-95 (2002) (errata aparece en Haema tologica 87: 336 (2002)), neuropatía autoinmune (Pestronk et al. JNeurol Neurosurg Psychia try 74:485-9 (2003)), síndrome opsoclonus-mioclonus paraneoplásico (Pranzatelli et al. Neurology 60(Suppll) P05.128:A395 (2003)), y esclerosis múltiple de remisión-relapso (RRMS) (Cross et al. (abstract) Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Múltiple Sclerosis 20-1 (2003)). Un estudio de fase II (WA16291) se ha realizado en pacientes con artritis reumatoide (RA) , proporcionando datos de seguimiento de 48 semanas respecto a la seguridad y eficacia de Rituximab (Emery et al. Arthritis Rheum 48(9):S439 (2003); Szczepanski et al. Arthri tis Rheum 4.8(9) :S121 (2003)). Un total de 161 pacientes se distribuyeron aleatoriamente de manera uniforme a cuatro ramificaciones de tratamiento: metotrexato, Rituximab solo, Rituximab más metotrexato, Rituximab más ciclofosfamida (CTX) . El régimen de tratamiento de Rituximab fue 1 g administrado intravenosamente los días 1 y 15. Infusiones de Rituximab en la mayoría de los pacientes con RA fueron bien toleradas por la mayoría de los pacientes, con 36% de pacientes que experimentan al menos un evento adverso durante la primera infusión (en comparación con 30% de pacientes que reciben placebo) . En total, la mayoría de eventos adversos se consideraron ligeros a moderados en severidad y fueron bien balanceados a través de todos los grupos de tratamiento. Hubo un total de 19 eventos adversos serios a través de las cuatro ramificaciones durante las 48 semanas, que fueron ligeramente más frecuentes en el grupo de Rituximab/CTX. La incidencia de infecciones fue bien balanceada a través de todos los grupos. La tasa promedio de infección seria en esta población de pacientes de RA fue 4.66 por 100 pacientes-año, que es menor que la tasa de infecciones que requieren admisión a hospital en pacientes de RA (9.57 por 100 pacientes-años) reportado en un estudio epidemiológico basado en comunidad (Doran et al. Arthri tis Rheum 46:2287-93 (2002) ) . El perfil de seguridad reportado de Rituximab en una pequeña cantidad de pacientes con desordenes neurológicos, incluyendo neuropatía autoinmune (Pestronk et al. J Neurol Neurosurg Psychia try 74: 485- 9 (2003)), síndrome opsoclonus/mioclonus (Pranzatelli et al. Neurology 60(Suppll) P05.128:A395 (2003)), y RRMS (Cross et al. Preliminary results from a phase II trial of Rituximab in MS (abstract) Eighth Annual Meeting of the Americas Committees for Research and Treatment in Múltiple Sclerosis 20-1 (2003)), fue similar al reportado en oncológica o RA. En una prueba en proceso auspiciada por investigador (IST = investigator-sponsored trial) de Rituximab en combinación con beta interferona (IFN-beta) o acetato de glatiramer en sujetos con RRMS (Cross et al., supra), 1 de 10 sujetos tratados fue admitido en el hospital para observación durante la noche después de experimentar moderada fiebre y rigores después de la primer infusión de Rituximab, mientras que los otros 9 sujetos completaron el régimen de 4 infusiones sin ningunos eventos adversos reportados . Patentes y publicaciones de patentes referentes a anticuerpos CD20 incluyen las Patentes de los E.U.A. Nos . 5,776,456, 5,736,137, 5,843,439, 6,399,061, y 6,682,734, así como US 2002/0197255, US 2003/0021781, US 2003/0082172, US 2003/0095963, US 2003/0147885 (Anderson et al.); Patente de los E.U.A. No. 6,455,043, US 2003/0026804, Y WO 2000/09160 (Grillo-Lopez , A.); WO 2000/27428 (Grillo-Lopez and White) ; WO 2000/27433 y US 2004/0213784 (Grillo-Lopez and Leonard) ; WO 2000/44788 (Braslawsky et al.); WO 2001/10462 (Rastetter, W.); WO01/10461 (Rastetter and White) ; WO 2001/10460 (White and Grillo-Lopez) ; US 2001/0018041, US 2003/0180292, WO 2001/34194 (Hanna and Hariharan) ; US 2002/0006404 y WO 2002/04021 (Hanna and Hariharan) ; US 2002/0012665 y WO 2001/74388 (Hanna, N. ) ; US 2002/0058029 (Hanna, N. ); US I 2003/0103971 (Hariharan and Hanna) ; US 2002/0009444 WO 2001/80884 (Grillo-Lopez , A.); WO 2001/97858 (White, C. ) ; US 2002/0128488 and WO 2002/34790 (Reff, M. ) ; WO 2002/060955 (Braslawsky et al.); WO 2002/096948 (Braslawsky et al.);WO 2002/079255 (Reff and Davies) ; Patente de los E.U.A. No. 6,171,586 y WO 1998/56418 (Lam et al.); WO 1998/58964 (Raju, S J ; WO 1999/22764 (Raju, S J ; WO 1999/51642, Patente de los E.U.A. No. 6,194,551, Patente de los E.U.A. No. 6,242,195 Patente de los E.U.A.

No. 6,528,624 y Patente de los E.U.A. No. 6,538,124 (Idusogie et al.); WO 2000/42072 (Presta, L.); WO 2000/67796 (Curd et al.); WO 2001/03734 (Grillo-Lopez et al.); US 2002/0004587 y WO 2001/77342 (Miller and Presta) ,- US 2002/0197256 (Grewal,l.); US 2003/0157108 (Presta, L. ) ; WO 04/056312 (Lowman et al.); US 2004/0202658 y WO 2004/091657 (Benyunes, K. ) ; WO 2005/000351 (Chan, A. ) ; US2005/0032130A1 (Beresini et al.); US 2005/0053602A1 (Brunetta, P.); Patente de los E.U.A Nos. 6,565,827,6,090,365, 6,287,537,6,015,542, 5,843,398, and 5,595,721, (Kaminski et al.); Patente de los E.U.A. Nos. 5,500,362,5,677,180, 5,721,108,6,120,767, Y 6,652,852 (Robinson et al.); Patente de los E.U.A. No. 6,410,391 (Raubitschek et al.); Patente de los E.U.A. No. 6,224,866 y WOOO/20864 (Barbera-Guillem, E.); WO 2001/13945 (Barbera-Guillem, E.); US2005/0079174A1 (Barbera-Guillem et al.); WO 2000/67795 (Goldenberg) ; US 2003/0133930 y WO 2000/74718 (Goldenberg and Hansen) ; US 2003/0219433 y WO 2003/68821 (Hansen et al. ) ; W02004/058298 (Goldenberg and Hansen) ; WO 2000/76542 (Golay et al.);WO 2001/72333 (Wolin and Rosenblatt) ; Patente de los E.U.A. No. 6,368,596 (Ghetie et al.); Patente de los E.U.A. No. 6,306,393 y US 2002/0041847 (Goldenberg, D . ) ; US 2003/0026801 (Weiner and Hartmann) ; WO 2002/102312 (Engleman, E.); US 2003/0068664 (Albitar et al.); WO 2003/002607 (Leung, S. ); WO 2003/049694, US2002/0009427 , y US 2003/0185796 (Wolin et . al.); WO 2003/061694 (Sing and Siegall) ; US 2003/0219818 (Bohen et al.); US 2003/0219433 y WO 2003/068821 (Hansen et al.); US 2003/0219818 (Bohen et al. ); US2002/0136719 (Shenoy et al.); WO 2004/032828 (Wahlet al.); y WO 2002/56910 (Hayden-Ledbetter) . Ver también Patente de los E.U.A. No. 5,849,898 y EP 330,191 (Seed et al.); EP332,865A2 (Meyer and Weiss) ; US Patent No. 4,861,579 (Meyer et al.); US2001/0056066 (Bugelski et al.); WO 1995/03770 (Bhat et al.); US 2003/0219433 Al (Hansen et al.); WO 2004/035607 (Teeling et al.); US 2004/0093621 (Shitara et al.); WO 2004/103404 (Watkins et al.); WO 2005/000901 (Tedder et al.); US 2005/0025764 (Watkins et al.); W02005/016969 y US 2005/0069545 Al (Carr et al.); WO 2005/014618 (Chang et al . ) . Ciertos de estos incluyen entre otros, tratamientos de esclerosis múltiple. Publicaciones concernientes a terapia con Rituximab incluyen: Perotta and Abuel "Response of chronic relapsing ITP of 10 years duration to Rituximab" Abstract # 3360 Blood 10(1) (parte 1-2): p. 88B (1998); Stashi et al. "Rituximab chimeric anti-CD20 monoclonal antibody treatment for adults with chronic idopathic thrombocytopenic purpura" Blood 98 (4):952-957 (2001) Matthews, R. "Medical Heretics" New Scientist (7 April, 2001 ) ; Leandro et al. "Clinical outcome in 22 patients with rheumatoid arthritis treated with B lymphocyte depletion" Ann Rheum Dis 61:833-888 (2002); Leandro et al. "Lymphocyte depletion in rheumatoid arthritis: early evidence for safety, efficacy anddose response. Arthri tis and Rheuma tism 44 (9): S370(2001); Leandro et al . "An open study of B lymphocyte depletion in systemic lupus erythematosus ", Arthri tis & Rheuma tism 46 (1) :2673-2677 (2002); Edwards and Cambridge "Sustained improvement in rheumatoid arthritis following a protocol designed to deplete B lymphocytes" Rhema tology 40: 205-211 (2001); Edwards et al. "B-lymphocyte depletion therapy in rheumatoid arthritis and other autoimmune disorders" Biochem . Soc . Trans . 30 (4) : 824-828 (2002); Edwards et al. "Efficacy and safety of Rituximab, a B-cell targeted chimeric monoclonal antibody: A randomized, placebo controlled trial in patients with rheumatoid arthritis. Arthri tis and Rheuma tism 46 (9): (2002); Levine and Pestronk "IgM antibody-related polyneuropathies : B-cell depletion chemotherapy using Rituximab" Neurology 52: 1701-1704 (1999); DeVita et al. "Efficacy of selective B cell blockade in the treatment of rheumatoid arthritis" Arthri tis & Rheum 46: 2029-2033 (2002) ; Hidashida et al. "Treatmentof DMARD-Refractory rheumatoid arthritis with Rituximab. " Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College of Rheumatology; Oct 24-29; New Orieans, LA 2002; Tuscano, J. "Successful treatment of Infliximab- refractory rheumatoid arthritis with Rituximab" Presented at the Annual Scientific Meeting of the American College ofRheumatology; Oct 24-29; New Orieans, LA 2002; Specks et al. "Response of Wegener's granulomatosis to anti-CD20 chimeric monoclonal antibody therapy" Arthri tis & Rheuma tism 44 (12) : 2836-2840 Anolik et al. , "B lympocyte Depletion in the Treatment of Systemic Lupus (SLE) : Phase I/II Trial of Rituximab (RITUXAN®) in SLE" Arthri tis And Rheuma tism, 46(9), S289-S289 Abstract 717 (October, 2002), and Albert et al., "A Phase I Trial of Rituximab (Anti-CD20) for Treatment of Systemic Lupus Erythematosus" Arthri tis And Rheuma tism , 48 (12) : 3659-3659, Abstract LB9 (December, 2003) ; Martin and Chan "Pathogenic Roles of B cells in Human Autoimmunity: Insights from the Clinic" Immuni ty 20:517-527 (2004). Compendio de la Invención La presente invención involucra al menos en parte la selección de una dosis para un anticuerpo CD20 que proporciona un régimen de tratamiento seguro y activo en sujetos con esclerosis múltiples tales como PPMS o RRMS . De acuerdo con esto, la invención se refiere a un método para tratar esclerosis múltiple en un sujeto, que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo CD20 al sujeto, para proporcionar una exposición inicial de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos seguido por una segunda exposición de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos, la segunda exposición no se proporciona hasta de aproximadamente 16 a 60 semanas a partir de la exposición inicial y cada una de las exposiciones de anticuerpos se proporciona al sujeto como una o dos dosis de anticuerpo. Además, la invención se refiere a un artículo de manufactura que comprende: (a) un recipiente que comprende un anticuerpo CD20; y (b) un inserto de empaque con instrucciones para tratar esclerosis múltiple en un sujeto, en donde las instrucciones indican que una cantidad del anticuerpo se administre al sujeto que es efectiva para proporcionar una exposición inicial de anticuerpo de aproximadamente 0.50 a 4 gramos, seguido por una segunda exposición de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos, la segunda exposición no se administra desde aproximadamente 16 a 60 semanas a partir de la exposición inicial y cada una de las exposiciones de anticuerpo se proporciona al sujeto como una o dos dosis de anticuerpo. Breve Descripción de los Dibujo La FIG. ÍA es un alineamiento de secuencias, que compara las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena ligera (VL) de cada uno de variante murina 2H7 (SEQ ID NO:l), humanizada 2H7.vl6 (SEQ ID NO: 2), y el subgrupo de cadena ligera kappa humana I (SEQID NO: 3) . Los CDRs de VL de 2H7 y hu2H7.vl6 son como sigue: CDRl (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO : 5), y CDR3 (SEQ ID NO: 6) . La FIG. IB es un alineamiento de secuencias, que compara las secuencias de aminoácidos del dominio variable de cadena pesada (VH) de cada uno de 2H7 murina (SEQ ID N0:7), variante 2H7.V16 humanizada (SEQ ID NO:8), y la secuencia consenso humana del subgrupo de cadena pesada III (SEQ ID NO: 9). Los CDRs de VH de 2H7 y hu2H7.vl6 son como sigue: CDRl (SEQID NO:10), CDR2 (SEQ ID NO-11), y CDR3 (SEQID NO-12). En la FIG. ÍA y en la FIG. IB, el CDRl, CDR2 y CDR3 en cada cadena están circunscritos en (cuadrados) , flanqueados por las regiones de marco, FR1-FR4, como se indica. 2H7 se refiera al anticuerpo 2H7 murino. Los asteriscos entre dos hileras de secuencias indican las posiciones que son diferentes entre las dos secuencias. Numeración de residuos de acuerdo con Kabat et al. Sequences of Immunological In terest , 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991), con inserciones mostradas como a, b, c, d, y e . La FIG. 2 muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera 2H7.vl6 madura (SEQ ID NO: 13) . La FIG. 3 muestra la secuencia aminoácidos de la cadena pesada 2H7.V16 madura (SEQ ID NO: 14) . La FIG. 4 muestra la secuencia aminoácidos de la cadena pesada 2H7.v31 madura (SEQ ID NO: 15) . La cadena L de 2H7.v31 es la misma que para 2H7.vl6. La FIG. 5 muestra un alineamiento de las cadenas ligeras 2H7.V16 y 2H7.V511 maduras (SEQ ID NOS. 13 y 16, respectivamente), con la numeración de variable residuo de dominio variable Kabat y la numeración de residuo de dominio constante Eu. La FIG. 6 muestra un alineamiento de las cadenas pesadas 2H7.vl6 y 2H7.v511 maduras (SEQ ID NOS. 14 y 17, respectivamente), con la numeración de residuo de dominio variable Kabat y la numeración de residuo de dominio constante Eu. Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas I . Definiciones Una "célula B" es un linfocito que madura dentro de la medula ósea, e incluye una célula B virgen, célula de memoria B o célula efectora B (células de plasma) . La célula B aquí puede ser una célula B normal o no maligna. Una "marcador de superficie de célula B" o "antígeno de superficie de célula B" aquí es un antígeno expresado en la superficie de una célula B que puede hacerse blanco con un anticuerpo que lo liga. Marcadores de superficie de células B ejemplares incluyen los marcadores de superficie de leucocitos CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD40, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85 y CD86 (para descripciones ver The Leukocyte Antigen Facts Book, 2nd Edition. 1997, ed. Barclay et al. Academic Press, Harcourt Brace & Co. , New York) . Otros marcadores de superficie de célula B incluyen CR2 , CCR6 , P2X5 , HLA-DOB, CXCR5 , FCER2 , BR3 , Btig, NAG14, SLGC16270,FcRHl, IRTA2 , ATWD578, FcRH3 , IRTAI, FcRH6, BCMA, y 239287. El marcador de superficie de célula B de interés particular aquí, se expresa preferencialmente en células B en comparación con otros tejidos de célula no-B de un mamífero y puede expresarse tanto en células precursoras B como en células B maduras. El marcador de superficie de célula B preferido aquí es CD20. El antígeno "CD20", o "CD20", es una fosfoproteína-no glicosilada de aproximadamente 35 -kDa, que se encuentra en la superficie de más del 90% de la células B de sangre periférica u órganos linfoides. CD20 está presente tanto en células B normales así como en células B malignas, pero no se expresa en células madre.* Otros nombres para CD20 en la literatura incluyen "antígeno restringido de linfocito B" y "Bp35" .

El antígeno CD20 se describe en Clark et al. Proc . Na ti . Acad. Sci . (USA)82:1766 (1985), por ejemplo. Un "antagonista de anticuerpo" aquí, es un anticuerpo que, al ligar a un marcador de superficie de célula B en células B, destruye o agota células B en un mamífero y/o interfiere con una o más funciones de célula B, por ejemplo al reducir o evitar una respuesta humoral producida por células B. El antagonista de anticuerpo de preferencia es capaz de agotar celular B (es decir reducir niveles de células B en circulación) en un mamífero tratado con él. Este agotamiento puede ligarse por diversos mecanismos tales como citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpos (ADCC = antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) y/o citotoxicidad dependiente de complemento (CDC = complement dependent cytotoxicity) , inhibición de proliferación de célula B y/o inducción de muerte de célula B (por ejemplo mediante apoptosis) . "Citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo" y "ADCC" se refieren a una reacción mediada por células en donde células citotóxicas no específicas que expresan receptores Fc (FcRs) (por ejemplo, células Destructoras Naturales (NK = Natural Killer) neutrófilos y macrófagos) reconocen anticuerpo ligado en una célula diana y subsecuentemente provocan lisis de la célula diana. Las células primarias para mediar ADCC, células NK, expresan Fc^RIII solamente, mientras que monocitos expresan Fc/RI, Fc^RII y Fc^RIII. Expresión FcR en células hematopoyéticas se resume en la tabla 3 en la página 464 de Ravetch and Kinet , Annu . Rev. Immunol 9: 457-92 (1991). Para estimar actividad ADCC de una molécula de interés, puede realizarse un ensayo ADCC in vi tro tal como el descrito en las Patentes de los E.U.A. Nos. 5,500,362 o 5,821,337. Células efectoras útiles para estos ensayos incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC = Peripheral Blood Mononuclear Cells) y células Destructoras Naturales (NK) . En forma alterna o adicionalmente, puede estimarse la actividad ADCC de la molécula de interés in vivo, por ejemplo en un modelo de animal tal como el descrito por Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998) . "Células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcRs y realizan funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos Fc^RIII y llevan a cabo función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células destructoras naturales (NK) , monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; con células PBMCs y células NK que se prefieren. Los términos "receptor Fc" o "FcR" se emplean para describir un receptor que liga a la región Fc de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Aún más, un FcR preferido es aquel que liga un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases Fc/RI, Fc y RXX , y Fc^RIII incluyendo variantes alélicas y formas combinadas en forma alterna de estos receptores. Receptores Fc/RII incluyen Fc^RIIA (un "receptor de activación") y Fc^RIIB (un "receptor de inhibición"), que tiene similares secuencias de aminoácido que difieren primordialmente en sus dominios citoplásmicos. Receptor de activación Fc^RIIA contiene un motivo de activación basado en tirosina de inmuno receptora (ITAM igual a immunoreceptor tyrosine-based activation motif) en su dominio citoplásmico. Fc^RIIB de receptor de inhibición contiene un motivo de inhibición basado en tirosina de inmunoreceptor (ITIM = immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) en su dominio citoplásmico. (ver Daeron, Annu . Rev. Immunol . 15: 203-234 (1997)). FcRs se revisan por Ravetch y Kinet, Annu . Rev. Immunol 9:457-92 (1991) ; Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab . Clin . Med. 126:330-41 (1995).

Otros FcRs, incluyendo aquellos a identificarse en el futuro, se abarcan por el término "FcR" presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, que es responsable por la transferencia de IgGs maternales al feto (Guyer et al., J. Immunol . 117: 587 (1976) and Kim et al., J. Immunol . 24: 249 (1994)). "Citotoxicidad Dependiente de Complemento" o "CDC" se refiere a la capacidad de una molécula para lisar una diana en la presencia de complementos. La ruta de activación de complementos se inicia por el enlace del primer componente del sistema de complemento (Clq) a una molécula (por ejemplo, un anticuerpo) complejada con un antígeno con conato. Para estimar activación de complemento, un ensayo CDC, por ejemplo como se describe por Gazzano- Santoro et al . , J. Immunol . Methods 202:163 (1996), puede realizarse. Anticuerpos "inhibitorios de crecimiento" son aquellos que evitan o reducen la proliferación de una célula que expresa un antígeno al cual se liga el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede evitar o reducir la proliferación de células B in vi tro y/o in vivo . Anticuerpos que "inducen apoptosis" son aquellos que inducen muerte celular programada, por ejemplo de una célula B, como se determina por ensayos de apoptosis estándar, tales como el enlace de anexina V, fragmentación de DNA, encogimiento de célula, dilatación de retículo endoplásmico, fragmentación de célula y/o formación de vesículas de membrana (denominados cuerpos apoptósicos) . El término "anticuerpo" aquí se emplea en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos) formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos, y fragmentos de anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada. "Fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, de preferencia que comprende su región de enlace de antígenos. Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos Fab, Fab' , F(ab')2, Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos . Para los presentes propósitos, un "anticuerpo intacto" es aquel que comprende dominios variables pesados y ligeros así como una región Fc . "Anticuerpos nativos" usualmente son glicoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera esta enlazada a una cadena pesada por un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isótopos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro intracadena espaciados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Residuos amino ácido particulares se considera que forman una interfase entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre anticuerpos y se emplean en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de anticuerpos . Se concentra en tres segmentos denominados regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera como de cadena pesada. Las porciones más altamente conservadas de dominios variables se denominan las regiones marco (FRs) . Los dominios variables de cadenas pesadas y ligeras nativas comprenden cada uno cuatro FRs, que adoptan substancialmente una configuración de hoja ß , conectada por tres regiones hipervariables, que forman bucles que conectan y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß . Las regiones hipervariables en cada cadena se mantienen unidas en proximidad inmediata por los FRs y con las regiones hipervariables de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de anticuerpos (ver Kabat et al., Secuencies of Proteins of Immunological Interest , 5th Ed. Public Health Service, Nacional Institutes de Health, Bethesda, MD . (1991) ) . Los dominios constantes no están involucrados directamente para enlazar un anticuerpo con el antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras tales como, participación del anticuerpo en citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . La digestión con papaína de anticuerpos produces dos fragmentos de enlace de antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", cada uno con un solo sitio de enlace de antígeno, y un fragmento "Fc" residual, cuyo nombre refleja si habilidad para cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de enlace de antígeno y todavía es capaz de entrelazar el antígeno. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene un sitio de enlace de antígeno y reconocimiento de antígeno completo. Esta región consiste de un dímero un dominio variable de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, en asociación no covalente, íntima. Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv comprende solo tres regiones hipervariables específicas para el antígeno) , tienen la capacidad por reconocer y enlazar el antígeno, aunque a una menor afinidad que todo el sitio de enlace. El fragmento Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Fragmentos Fab1 difieren de fragmentos Fab por la adición de unos cuantos residuos en el extremo de carboxi del dominio de CH1 de cadena pesada incluyendo una o más cisteínas de la región bisagra de anticuerpo. Fab'-SH es la designación aquí para Fab' en donde el o los residuos cisteína de los dominios constantes contienen al menos un grupo tiol libre. Fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab1 que tienen cisteínas bisagra entre ellos. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos se conocen también.

Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie vertebrada, pueden asignarse a uno de dos tipos claramente distintos, denominada ( K ) y ( ? ) , con base en las secuencias de amino ácidos de sus dominios constantes. Dependiendo de la secuencia de amino ácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, pueden asignarse anticuerpos a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varias de estas pueden además estar divididas en subclases (isotipos) , por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4 , IgA, y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a los diferentes clases de anticuerpos, se denominan a , d , e , ? , y µ , respectivamente. Las estructuras de subunidad y configuraciones tri-dimensionales de diferentes clases de inmunoglobulina, son bien conocidas. Fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, en donde estos dominios están presentes en una sola cadena polipéptido. De preferencia, el polipéptido Fv además comprende un enlazador polipéptido entre los dominios V y VL que permiten a scFv formar la estructura deseada para enlace de antígeno. Para una revisión de scFv ver Pluckthun en "The Pharmacology of Monoclonal Antibodies", vol. 113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994) . El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace de antígeno, estos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena polipéptido (VH -V) . Al utilizar un enlazador que es muy corto para permitir apareado entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios se forzan para formar pares con los dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de enlace de antígeno. Diacuerpos se describen más completamente por ejemplo en EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 90: 6444-6448 (1993) . El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene a partir de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos y/o ligan el mismo epítope, excepto por variantes posibles que pueden surgir durante producción del anticuerpo monoclonal, estas variantes en general están presentes en cantidades menores. En contraste con preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra una sola determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos ya que están sin contaminar por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido a partir de una población substancialmente homogénea de anticuerpos, y no habrá de considerarse que requiere producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por el método de hibridoma primero descrito por Kohier et al., Na ture, 256:495 (1975), o pueden elaborarse por métodos de DNA recombinante (ver, por ejemplo, la patente de los E.U.A. Número 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpo fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Na ture, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol . Biol . , 222: 581-597 (1991), por ejemplo. Los anticuerpos monoclonales aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en donde una a porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenece a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico con u homólogo con secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (Patente de los E.U.A. Número 4,816,567; Morrison et al., Proc. Na ti . Acad. Sci . USA, 81:6851-6855 (1984)). Anticuerpos quiméricos de interés aquí incluyen anticuerpos "primatizados" que comprende secuencias de enlace de antígeno de dominio variable derivadas de un primate no humano (por ejemplo monos del viejo mundo, tales como mandriles, rhesus o cinomolgus) y secuencias de región constante humanas (Patente de los E.U.A. Número 5,693,780) . Formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinas) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo recipiente) , en donde residuos de una región hipervariable del recipiente se reemplaza por residuos de una región hipervariable de una especies no humanas (anticuerpo donador) tales como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene las deseadas especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos de región marco (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo de recipiente o en el anticuerpo de donador. Estas modificaciones se realizan para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpos. En general el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todo de al menos uno y típicamente dos dominios variables, en donde todo o substancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o substancialmente todo los FRs son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana, excepto por la o las substituciones FR como se notó anteriormente. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles, ver Jones et al., Na ture 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Na ture 332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op . Struct . Biol . 2: 593-596 (1992). El término "región hipervariable" cuando se emplea aquí, se refiere a los residuos amino ácido de un anticuerpo que son responsables por enlace de antígeno.

La región hipervariable comprende residuos amino ácido de una "región de determinación complementariedad" o "CDR" (por ejemplo los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes de Health, Bethesda, MD. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Chothia and Lesk J. Mol . Biol . 196: 901-917 (1987)). Residuos de "Marco" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable diferentes a los residuos de región hipervariable, cono aquí se define. Un "anticuerpo desnudo" es un anticuerpo (como se define aquí) que no está conjugado a con una molécula heteróloga, tal como una porción citotóxica o radioetiqueta. Ejemplos de anticuerpos que ligan al antígeno CD20 incluyen: "C2B8," que ahora se denomina "Rituximab11 ("RITUXAN®") (Patente de los E.U.A. Número 5,736,137); el anticuerpo murino 2b8 etiquetado con itrio- [90] designado "Y2B8" o "Ibritumomab Tiuxetan" (ZEVALIN®) comercialmente disponible de IDEC Pharmaceuticals, Inc. (Patente de los E.U.A. Número 5,736,137; 2B8 depositado con ATCC bajo el número de acceso HB11388 en Junio 22, 1993) ; IgG2a murino "Bl" también denominado "Tositumomab, " opcionalmente etiquetado con 131I para generar el anticuerpo "131i" o "yodo 131I tositumomab" (BEXXARMR) comercialmente disponible de Corixa (ver también, La patente de los E.U.A. Número 5,595,721); anticuerpo monoclonal murino "1F5" (Press et al., Blood 69 (2): 584-591 (1987) y su variante incluyendo "marco parchado" o 1F5 humanizado (WO 03/002607, Leung, S.; ATCC depósito HB-96450) ; anticuerpo 2H7 mirino y 2H7 quimérico (Patente de los E.U.A. Número 5,677,180); 2H7 humanizado; huMax-CD20 (Genmab, Dinamarca, WO 2004/035607) ; AME-133 (Applied Molecular Evolution) ; anticuerpo A20 o sus variantes tales como anticuerpo A20 quimérico o humanizado (cA20, hA20, respectivamente) o IMMU-106 (US 2003/0219433, Immunomedics) ; anticuerpos de enlace CD20, incluyendo Leu- 16 agotado de epítope, 1H4 o 2B8 opcionalmente conjugado con IL-2, como en US 2005/0069545 Al y WO 2005/16969 (Carr et al.); anticuerpo biespecífico que liga CD22 y CD20, por ejemplo, hLL2xhA20 (WO 2005/14618, Chang et al.); anticuerpos monoclonales L27, G28-2, 93-1B3 , B-Cl o NU-B2 disponibles de International Leukocyte Typing Workshop (Valentine et al., en: Leukocyte Typing III (McMichael, Ed. , P. 440, Oxford University Press (1978)); 1H4 (Haisma et al . Blood 92:184 (1998)); conjugado auristatina E anti-CD20 (Seattle Genetics) ; anti-CD20-IL2 (EMD/Biovation/City de Hope) ; anti-CD20 MAb terapia (epiCyte) ; y anticuerpo anti-CD20 TRU 015 (Trubion) . Los términos "Rituximab" o "RITUXAN®" aquí se refieren al anticuerpo monoclonal humano/murino quimérico de ingeniería genética, dirigido contra el antígeno CD20 y el "C2B8" designado en la Patente de los E.U.A. Número 5,736,137, incluyendo sus fragmentos que retienen la capacidad para ligar CD20. Rituximab está comercialmente disponible de Genentech. Solo para los presentes propósitos y a menos de que se indique de otra forma, "2H7 humanizado" se refiere a un anticuerpo humanizado que liga CD20 humano, o su fragmento de enlace de antígeno, en donde el anticuerpo es efectivo para agotar células B de primate B in vivo, el anticuerpo comprende en la región variable de cadena H (VH) al menos una secuencia CDR H3 de SEQ ID NO: 12 (Figura IB) de un anticuerpo CD20 anti-humano y substancialmente los residuos de marco de lectura (FR) de consenso humano del subgrupo III de cadena pesada humana (VHIH) . En una modalidad preferida, este anticuerpo además comprende la secuencia CDR Hl de cadena H de SEQ ID NO: 10 y la secuencia CDR H2 de SEQ ID NO: 11, y más preferiblemente además comprende la secuencia de CDR Ll de cadena L SEQ ID NO: 4, la secuencia CDR L2 de SEQ ID NO: 5, la secuencia CDR L3 de SEQ ID NO: 6 y substancialmente los residuos marco (FR) de consenso humano del subgrupo I de cadena ligera humana (VI) , en donde la región VH puede unirse a una región constante de cadena IgG humana, en donde la región puede ser por ejemplo, IgGl o IgG3. En un modalidad preferida, este anticuerpo comprende la secuencia VH de SEQ ID NO: 8 (vl6, como se muestra en la Figura IB) , opcionalmente también comprende la secuencia VL de SEQ ID NO: 2 (vl6, como se muestra en la Figura ÍA) , que puede tener las substituciones de amino ácidos de D56A y N100A en la cadena H y S92A en la cadena L (v96) . De preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo intacto que comprende las secuencias de amino ácidos de cadena ligera y pesada de SEQ ID NOS: 13 y 14 respectivamente, como se muestra en las Figuras 2 y 3. Otra modalidad preferida es cuando el anticuerpo es 2H7.V31 que comprende las secuencias de amino ácidos de cadena ligera y pesada de SEQID NOS: 13 y 15, respectivamente, como se muestra en las Figuras 2 y 4. Aquí el anticuerpo puede además comprender al menos una substitución de amino ácidos en la región Fc, que mejora la actividad ADCC y/o CDC, tal como cuando las substituciones de amino ácidos son S298A/E333A/K334A, más preferiblemente 2H7.v31 que tienen la secuencia de amino ácidos de cadena pesada de SEQID NO: 15 (como se muestra en la Figura 4) . Cualquiera de estos anticuerpos además puede comprender al menos una substitución de amino ácidos en la región Fc que disminuye la actividad CDC, por ejemplo, que comprende al menos la substitución K322A. Ver la patente de los E.U.A. Número 6,528,624 Bl (Idusogie et al . ) . Un 2H7 humanizado preferido es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo intacto que comprende la secuencia de cadena ligera variable: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV PSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWSFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 2) ; y la secuencia de cadena pesada variable: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGD TSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQ GTLVTV SS (SEQ ID NO : 8 ) . Cuando el anticuerpo 2H7 humanizado es un anticuerpo intacto, de preferencia comprende la secuencia de amino ácidos de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAP PLIYAPSNLASGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYVCQQWSFNPPTFGQGTKVEllCRTVAAPSVF PPSDEQLKSG TASWCLLNNFVPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYS SSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQG SSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 13); Y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGG VQPGGSLR SCAASGYTFTSYNMHVWRQAPGKGLEvrYGAJYPGNGDTSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLY QMNSLRAEDTAVYVCARVVYYSNSYWYFDVWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVS NSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYlCNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF FPPKPKDT MISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS . LTCLVKGFVPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLS SPGK ( SEQ ID NO : 14 ) o la secuencia de aminoácidos de cadena pesada: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAJYPGNGDTSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNS RAEDTAVYYCARWYVSNSYWYFDV GQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC VKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNATYRV VSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTC VKGFVPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPGK ( SEQ ID NO : 15 ) . En una modalidad preferida de la invención, la región variable de variantes con base en la versión 2H7 16 tendrá las secuencias de aminoácidos de V16 excepto en las posiciones de sustituciones de aminoácido que se indican en la siguiente tabla. A menos que se indique de otra forma, las variantes 2H7 tendrán la misma cadena ligera que vl6.

Un anticuerpo "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que interferirán con usos de diagnóstico o terapéutico para el anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso de anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y más preferiblemente más de 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácido N-terminal o interna por el uso de un secuenciador de copa de centrifugado, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomasie o preferiblemente, tinción con plata. Anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo anticuerpo aislado se preparará por al menos una etapa de purificación. Un "sujeto" aquí es un sujeto humano. En general el sujeto es elegible para tratamiento de esclerosis múltiple. Para los presentes propósitos, este sujeto elegible es aquel que experimenta, ha experimentado o es probable que experimente uno o más signos, síntomas u otros indicadores de esclerosis múltiple; se ha diagnosticado con esclerosis múltiple, si, por ejemplo recientemente diagnosticado (con MS de "inicio nuevo"), previamente diagnosticado con un nuevo relapso o exacerbación, previamente diagnosticado y en remisión, etc.; y/o está en riesgo de desarrollar esclerosis múltiple. Una persona que sufre de o tiene riesgo de sufrir esclerosis múltiple, opcionalmente puede identificarse como aquel que se ha monitoreado por niveles elevados de células B CD20-positivas en suero, fluido cerebro-espinal (CSF) y/o una o varias lesiones de MS y/o supervisado o monitoreado para utilizar un ensayo para detectar auto-anticuerpos, estimado cualitativamente y de preferencia cuantitativamente. En forma ejemplar, estos auto-anticuerpos asociados con esclerosis múltiple incluyen proteína básica anti-mielina (MBP) , glicoproteína oligodendrocítica anti-mielina (MOG) , anti-gangliósido y/o anticuerpos anti-neurofilamentarios . Estos auto-anticuerpos pueden detectarse en el suero del sujeto, fluido cerebroespinal (CSF) y/o lesión de MS . Por "elevados" niveles de célula B o auto-anticuerpo, aquí se entienden niveles de estos anticuerpos o células B que exceden significativamente el o los niveles en un individuo sin MS . "Tratamiento" de un sujeto aquí se refiere tanto a tratamiento terapéutico como medidas profilácticas o preventivas. Aquellos que requieren tratamiento incluyen aquellos que ya tienen esclerosis múltiple así como aquellos en donde se va a evitar esclerosis múltiple. Por tanto, al sujeto se le puede haber diagnosticado que tiene esclerosis múltiple o puede estar predipuesto o susceptible a esclerosis múltiple. Un "síntoma" de MS es cualquier fenómeno mórbido o separación de lo normal en estructura, función o sensación, experimentado por el sujeto e indicativo de MS. "Esclerosis múltiple" se refiere a la enfermedad crónica y a menudo incapacitante del sistema nervioso central caracterizada por la destrucción progresiva de la mielina. Hay 4 formas internacionalmente reconocidas de MS, es decir, esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS = primarily progressive múltiple sclerosis) , esclerosis múltiple de relapso-remisión (RRMS = relapsing-remitting múltiple sclerosis) , esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS = secondary progressive múltiple sclerosis) y esclerosis múltiple de relapso progresiva (PRMS = progressive relapsing múltiple sclerosis) . "Esclerosis múltiple progresiva primaria" o "PPMS" se caracteriza por un avance gradual de la enfermedad desde su inicio sin relapsos y remisiones superpuestos completamente. Puede haber periodos de nivelación de actividad de la enfermedad y puede haber días o semanas buenos o malos. PPMS difiere de RRMS y SPMS en que el inicio típicamente es a final de los años 30 o a principios de los 40, es probable igualmente que la desarrollen hombres como mujeres, y la actividad de enfermedad inicial a menudo es en la médula espinal y no en el cerebro. PPMS a menudo migra al cerebro, pero es menos probable que dañe áreas del cerebro que RRMS o SPMS; por ejemplo, personas con PPMS es menos probable que desarrollen problemas cognoscitivos. PPMS es el subtipo de MS que es menos probable que muestre lesiones inflamatorias (mejora de gadolinio) en exploraciones de MRI . La forma progresiva primaria de la enfermedad afecta entre 10 y 15% de todas las personas con esclerosis múltiple. PPMS puede definirse de acuerdo con los criterios en McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001). El sujeto con PPMS aquí tratado usualmente aquí es aquel con diagnóstico probable o definitivo de PPMS. "Esclerosis múltiple de relapso-remisión" o "RPMS", se caracteriza por relapsos (también conocidos como exacerbaciones) durante cuyo tiempo pueden surgir nuevos síntomas y volver a la superficie o empeorar viejos síntomas. Los relapsos son seguidos por periodos de remisión, durante ese tiempo la persona se recupera completa o parcialmente de los déficits adquiridos durante el relapso. Los relapsos pueden durar días, semanas o meses y la recuperación puede ser lenta y gradual o casi instantánea. La basta mayoría de las personas que presentan MS primero se les diagnostica RRMS. Esto es típico cuando se encuentran en sus años 20' s o 30' s, aunque son conocidos diagnósticos muy anteriores o posteriores. El doble de mujeres que hombres presentan este subtipo de MS . Durante relapsos, mielina, un forro aislante protector alrededor de las fibras de nervios (neuronas) en la región de materia blanca del sistema nervioso central (CNS = Central Nervous System) puede dañarse en una respuesta inflamatoria por el propio sistema inmune del cuerpo. Esto provoca una amplia variedad de síntomas neurológicos que varían considerablemente, dependiendo de que áreas del CNS están dañadas. Inmediatamente después de un relapso, la respuesta inflamatoria se apaga y un tipo especial de célula glial en el CNS (denominada oligodendrocito) auspicia la remielinación - un proceso con el que puede repararse el forro de mielina alrededor del axon. Es esta remielinación que puede ser responsable por la remisión. Aproximadamente 50% de los pacientes con RRMS se convierten a SPMS en 10 años a partir del inicio de la enfermedad. Después de los 30 años esta cifra sube a 90%. En cualquier tiempo, la forma de relapso-remisión de la enfermedad, representa alrededor del 55% de todas las personas con MS .

"Esclerosis múltiple progresiva secundaria" o "SPMS" se caracteriza por avance uniforme de daños neurológicos químicos con o sin relapsos superpuestos y menores remisiones mesetas. Personas que desarrollan SPMS previamente habrán experimentado un periodo de RRMS que puede haber durado desde 2 hasta 40 años o más. Cualesquiera relapsos y remisiones superpuestos que hay, tienden a disminuir o calmarse gradualmente con el tiempo. Desde el inicio de la fase progresiva secundaria de la enfermedad, la incapacidad empieza a avanzar mucho más rápido que durante RRMS aunque el avance aún puede ser bastante lento en ciertos individuos. Después de 10 años, 50% de la gente con RRMS habrá desarrollado SPMS. A los 25 a 30 años, esa cifra habrá aumentado a 90%. SPMS tiende a estar asociada con menores niveles de formación de lesión inflamatoria que en RRMS, pero la carga total de la enfermedad continua avanzando. En cualquier tiempo, SPMS representa alrededor del 30% de todas las personas con esclerosis múltiple. "Esclerosis múltiple de relapso progresivo" se refiere a "PRMS", se caracteriza por un avance uniforme de daño neurológico clínico, con relapsos y remisiones superpuestas. Hay recuperación significante inmediatamente después de un relapso pero entre relapsos hay un empeoramiento gradual de los síntomas. PRMS afecta alrededor del 5% de toda la gente con esclerosis múltiple. Algunos neurólogos creen que PRMS es una variante de PPMS . La expresión "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad del anticuerpo (u otra droga) que es efectivo para evitar, mejorar o tratar esclerosis múltiple. Esta cantidad efectiva generalmente resultará en una mejora en los signos síntomas u otros indicadores de MS, tal como reducir la velocidad de relapso, evitar incapacidad, reducir número y/o volumen de lesiones MRI del cerebro, mejorar la caminata cronometrada de 7.6 metros (25 pies) , extender el tiempo para el avance de la enfermedad (por ejemplo, utilizando la escala de estado de incapacidad expandida, EDSS = Expanded Disability Status Scale), etc. "Exposición de anticuerpo" se refiere al contacto o exposición con el anticuerpo en una o más dosis administradas durante un periodo de tiempo de aproximadamente 1 a 20 días. La dosis puede suministrarse en un tiempo o a intervalos de tiempo fijos o irregulares sobre este periodo de tiempo de exposición. Exposiciones de anticuerpos iniciales y posteriores (segunda o tercera) están separadas en tiempo entre si como se describe aquí en detalle.

El término "agente inmunosupresor" como se emplea aquí para terapia auxiliar, se refiere a substancias que actúan para suprimir o enmascarar el sistema inmune del mamífero que se trata aquí. Esto incluirá substancias que suprimen producción de citocina, regulación descendente o supresión de expresión de auto-antígeno, o enmascarar los antígenos MHC. Ejemplos de estos agentes incluyen pirimidinas 2 -amino- 6-aril-5 substituidas (ver patente de los E.U.A. Número 4,665,077); drogas anti-inflamatorias no esteroirdales (NSAIDs = non steroidal anti-inflamatory drugs) ; ganciclovir, tacrolimus, glucocorticoides tales como cortisol o aldosterona, agentes anti-inflamatorios tales como inhibidor de ciclooxigenasa, un inhibidor de 5-lipooxigenasa o un antagonista receptor de leucotrieno; antagonistas de purina tales como azatioprina o micofenolato mofetil (MMF) ,- agentes alquilantes tales como ciclofosfamida; bromocriptina; danazol; dapsone; glutaraldeido (que enmascara los antígenos MHC, como se describe en la patente de los E.U.A. Número 4,120,649); anticuerpos anti-idiotípicos para antígenos MHC y fragmentos MHC; ciclosporina A; esteroides tales como corticoesteroides o gluco-corticoesteroides o análogos de glucocorticoides, por ejemplo prednisona, metilprednisolona y dexametasona; inhibidores de dihidrofolato reductasa tales como metotrexato (oral o subcutánea) ; hidrociclocloroquina, sulfasalacina; leflunomida; citoquina o antagonistas de receptor de citoquina incluyendo anticuerpos de anti-interferona-alfa, -beta o -gama, anticuerpos de factor-alfa de necrosis anti-tumor (infliximab o adalimumab) , inmunoadhesina anti-TNF alfa (etanercept) , anticuerpos de factor beta de necrosis anti-tumor, anticuerpos de anti-interleucina-2 y anticuerpos de receptor anti-IL-2; anticuerpos anti-LFA-1, incluyendo anticuerpos anti-CD 18 y anti-CD lia; anticuerpos anti-L3T4; globulina anti-linfocítica heteróloga; anticuerpos pan-T, de preferencia anticuerpos anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; péptidos solubles que contienen un dominio de enlace LFA-3 (WO 90/08187 publicado 7/26/90) ; estreptoquinasa; TGF-beta, estreptodornasa; RNA o DNA del anfitrión; FK506; RS-61443; dexoispergualina,- rapamicina; receptor de células T (Cohén et al., Patente de los E.U.A. No. 5,114,721); fragmentos de receptor de células T (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Na ture, 341: 482 (1989) ; y WO 91/01133); y anticuerpos receptores de células T (EP 340,109) tal como T10B9. El término "agente citotóxico" como se emplea aquí, se refiere a una substancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca destrucción de células. El término se pretende que incluya isótopos radioactivos (por ejemplo At211, I131, I125, Y90, Re18S, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fungal, de plantas, o de animales, o sus fragmentos . Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa, ciclofosfamida, CITOXAN0; alquilsulfonatos tales como busulfan, improsulfan y tiposulfán; aziridinas tales como benzodopa, carbocuona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyen altetramina, trietilen melamina, trietilen fosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilol melamina; acetogrninas en (especial bullatacina y bullatacinona) ; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan) ; brioestatina; calistatina; CC-1065 incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficinas (particularmente criptoficina 1 y criptoficina 8) ; dolastatina; duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos KW-2189 y CB1-TM1) ; eleuterubina; pancristatina; una sarcodictina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como cloroambucil, clornofacina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, hidrocloruro óxido de mecloretamina, melfalan, novembicina, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozoticina, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimustina; anticuerpos tales como los antibióticos enediina (por ejemplo calicheamicina, en especial calicheamicina gama II y calicheamicina omega II (ver por ejemplo (see, e. g., Agnew, Chem Intl . Ed. Engl . , 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos tales como clodronato; una esperamicina; así como el cromóforo neocarzinostatina y los cromóforos antibióticos relacionados con enediina cromoproteína) , aclacinomicinas, actinomisina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminocicina, carzinofilina, cromomicinas, dactinomicina, daunorobicina, detorubicina, 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, doxorubicina ADRIAMICINR (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina) epirubicina, esorubicina, idarubucuna, marcellomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico, nogalamicina olivomicinas, peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; antimetabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos de pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostañolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolebulínico eniluracilo; amsacrina; bestrabucil ; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio, una epotilona; etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinan; lonidainina; maitansinoides tales como maitansina y ansamitocinas; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol ; nitraerina; pentoestatina; fenamet; pirarubicina; losoxantrona; ácido podofilínico; 2-etilhidrazida; procarbazma; complejo polisacarido PSK (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxana; rizoxina; sizofiran; espirogermanio; ácido tenuazónico triazicuona; 2 , 2 ' , 2" -triclorotrietilamina; tricotenos (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol ; mitolactol; popibromano; gacitocina; arabinósido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo paclitaxel TAXOL (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N. J J , formulación de nanopartículas de ingeniería-albúmina libre de Cremofor ABRAXANEMR de paclitaxel (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois) , doxetaxel TAXOTERE® (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucil ,-GEMZAR gemcitabma; 6-t?oguanma; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino, tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etopósido (VP-16) ; ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; vinorelbina NAVELBINE®; novantrona; tenipósido; edatrexato daunomicina; aminopterina; xeloda; ibandronato; CPT-11 inhibidor de topoisomerasa RFS 2000 difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinóico; capecitabina; y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores . También en esta definición se incluyen agentes anti-hormonales, que actúan para regular o inhibir acción hormonal en tumores tales como anti-estrógenos y moduladores de receptores de estrógenos selectivos (SERMs = selective estrogen receptor modulators) , incluyendo por ejemplo tamoxifen (incluyendo tamoxifen NOLVADEX®) , raloxifen, droloxifen, 4-hidroxitamoxifen, trioxifen, keoxifen, LY117018, onapristona, y toremifen FARESTON; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales tales como por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimida, megestrol acetato MEGASE®, exemestano AROMASIN®, formestani, fadrozol, vorozol RIVISOR®, letrozol FEMARA®, y anastrozol ARIMIDEX®; y antiandrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida, y goserelina; así como troxacitabina (un análogo 1, 3 -dioxolano nucleósido citocina) ; oligonucleótidos anti-sentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de células aberrantes tales como por ejemplo PKC-alfa, Ralf y H-Ras ,-vacunas tales como vacunas para terapia de genes, por ejemplo la vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN®, y vacuna VAXID®; PROLEUKIN® rIL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® y sales, ácidos o derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores. El término "citocina" es un término genérico para proteínas liberadas por una población celular que actúa en otras células como mediadores intercelulares. Ejemplos de esta citocina son linfocinas, monosinas; interleucinas (ILs) tales como IL-1, IL-1 [alfa] , IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11,IL-12, IL- 15; un factor de necrosis de tumor tal como TNF- o o TNF- ß ; y otros factores de polipéptido incluyendo LIF y ligando de equipo (KL) . Como se emplea aquí, el término citocina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia nativa, incluyendo entidades de molécula pequeña producidas sintéticamente y sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables. El término "hormona" se refiere a hormonas de polipéptido que en general se secretan por órganos glandulares con ductos. Entre las hormonas se incluyen por ejemplo hormona de crecimiento tal como hormona de crecimiento humano, hormona de crecimiento humano N-metionil, y hormona de crecimiento bovino; hormona paratiroides; tiroxina; insulina; proinsulina; relaxina; pro-relaxina; hormonas de glicoproteína tales como hormona de estímulo de folículos (FSH = follicle stimulating hormone) , hormona de estímulo de tiroides (TSH = thyroid stimulating hormone) , y hormona luteinizante (LH = luteinizing hormone) ; prolactina, lactógeno placentario, péptido asociado a gonadotropina de ratón, inhibina; activina; sustancia inhibitoria muleriana; y trombopoyetina. Como se emplea aquí, el término hormona incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de la hormona de secuencia nativa, incluyendo entidades de pequeñas moléculas producidas sintéticamente y sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables . El término "factor de crecimiento" se refiere a proteínas que promueven el crecimiento, e incluyen por ejemplo factor de crecimiento hepático; factor de crecimiento de fibroblastos; factor de crecimiento vascular endotelial; factores de crecimiento de nervios tales como NGF- ?; factor de crecimiento derivado de plaquetas; factor de crecimiento de transformación (TGFs) tales como TGF- o: y TGF- ?; factor de crecimiento tipo insulina I y II; eritropoyetina (EPO) ; factores osteoinductivos; interferonas tales como interferona- a , -beta ;y -gamma; y factores de estímulo de colonias (CSFs) tales como CSF-macrófago (M-CSF) ; CSF granulocito-macrófago (GM-CSF) ; y CSF-granulocito (G-CSF) . Como se emplea aquí, el término factor de crecimiento incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos del factor de crecimiento de secuencia nativa, incluyendo entidades de moléculas pequeñas producidas sintéticamente y sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables. El término "integrina" se refiere a una proteína receptora que permite a las células tanto ligar con y como responder a la matriz extracelular y está involucrado en una variedad de funciones celulares tales como sanado de heridas, diferenciación celular, asentamiento de células de tumor y apoptosis . Son parte de una gran familia de receptores de adhesión celular involucrados en interacciones de matriz extracelular-célula y célula-célula. Integrinas funcionales consisten de dos subunidades de glicoproteína transmembrana, denominadas alfa y beta, que no están ligadas covalentemente. Las subunidades alfa todas comparten algo de homología entre sí, al igual que las subunidades beta. Los receptores siempre contienen una cadena alfa y una cadena beta. Ejemplos incluyen alfadbetal, alfa3betal, alfa7betal, LFA-1, alfa4 integrina, etc. Como se emplea aquí, el término integrina incluye proteínas de fuentes naturales o de cultivo celular recombinante y equivalentes biológicamente activos de la integrina de secuencia nativa, incluyendo entidades de molécula pequeña producidas sintéticamente y sus derivados y sales farmacéuticamente aceptables .

Ejemplos de "anticuerpos o antagonistas de integrina" aquí, incluyen un anticuerpo LFA-1 tal como Efalizumab (RAPTIVA®) comercialmente disponible de Genentech; un anticuerpo de alfa 4 integrina tal como natalizumab (TYSABRI®) disponible de Biogen; derivados fenilalanina diazacíclicos (WO 2003/89410) ; derivados fenilalanina (WO 2003/70709, WO 2002/28830, WO 2002/16329 y WO 2003/53926) ; derivados de ácido fenilpropiónico (WO 2003/10135) ; derivados de enamina (WO 2001/79173) ; derivados de ácido propanoico (WO 2000/37444); derivados de ácido alcanoico (WO 2000/32575) ; derivados de fenilo sustituido (patentes de los E.U.A. números 6,677,339 y 6,348,463); derivados de amina aromática (patente de los E.U.A. Número 6,369,229); y polipéptido de dominio ADAM desintegrina (US2002/0042368) , anticuerpos de alfavbeta3 integrina (EP 633945) ; derivados de aminoácido bicíclico aza-puenteado (WO 2002/02556) etc. Para los presentes propósitos, "factor alfa de necrosis de tumor (TNF-alfa) ", se refiere a una molécula TNF-alfa humana que comprende la secuencia de aminoácidos como se describen en Pennica et al., Na ture, 312: 721 (1984) o Aggarwal et al., JBC, 260: 2345 (1985). Un "inhibidor de TNF-alfa" aquí es un agente que inhibe en cierta medida, una función biológica de TNF-alfa, en general a través de enlace a TNF-alfa y neutralizar su actividad. Ejemplos de inhibidores TNF específicamente contemplados aquí son Etanercept (ENBREL®) , Infliximab (REMICADE®) y Adalimumab (HUMIRA™) . Ejemplos de "drogas anti-reumáticas que modifican la enfermedad" o "DMARDs" (= disease-modifying anti-rheumatic drugs) incluyen hidroxicloroquina, sulfasalazina, metotrexato, leflunomida, etanercept, infliximab (plus oral y metrotrexato subcutáneo) , azatioprina, D-penicilamina, oro (oral) , oro (intramuscular) , minociclina, ciclosporina, inmunoadsorción de proteína de estafilococo A, incluyendo sus sales y derivados, etc. Ejemplos de "drogas anti-inflamatorias no esteroidales" o "NSAIDs" son ácido acetilsalicílico, ibuprofen, naproxen, indometacina, sulindac, tolmetina, incluyendo sus sales y derivados, etc. "Corticosteroide" se refiere a cualquiera de varias sustancias sintéticas o de origen natural con la estructura química general de esteroides que imitan o aumentan los efectos de los corticosteroides de origen natural. Ejemplos de corticosteroides sintéticos incluyen prednisona, prednisolona (incluyendo metilprednisolona) , dexametasona, glucocorticoide y betametasona. Un "inserto de paquete" se emplea para referirse a instrucciones usualmente incluidas en empaques comerciales de productos terapéuticos que contienen información respecto a las indicaciones, uso, dosis, administración, contraindicaciones, otros productos terapéuticos a combinarse con el producto empacado y/o advertencias referentes al uso de estos productos terapéuticos, etc. II. Terapia La presente invención proporciona un método para tratar a un sujeto que tiene esclerosis múltiple, que comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo que liga a un marcador de superficie célula B (de preferencia un anticuerpo CD20) , al sujeto. La MS a tratar aquí incluye esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS) , esclerosis múltiple de relapso-remisión (RRMS) , esclerosis múltiple progresiva secundaria (SPMS) , y esclerosis múltiple de relapso progresiva (PRMS) , pero terapia de cualquiera de PPMS o RRMS son las modalidades preferidas aquí . De acuerdo con un protocolo de dosificación preferido, el método comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo CD20 al sujeto de MS para proporcionar una exposición inicial de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos (de preferencia aproximadamente 1.5 a 2.5 gramos) seguido por una segunda exposición a anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos (de preferencia aproximadamente 1.5 a 2.5 gramos), la segunda exposición de anticuerpo no se proporciona hasta de aproximadamente 16 a 60 semanas de la exposición inicial de anticuerpos. Para los propósitos de esta invención, la segunda exposición de anticuerpo es la siguiente vez que el sujeto se trata con anticuerpo CD20 después de la exposición inicial de anticuerpo, no habiendo tratamiento o exposición de anticuerpo CD20 intermedio entre las exposiciones inicial y segunda. El intervalo entre las exposiciones a anticuerpos iniciales y segunda o subsecuente puede medirse ya sea a partir de la primera o segunda dosis de la exposición de anticuerpo inicial, pero de preferencia a partir de la primer dosis de la exposición inicial de anticuerpo. En las presentes modalidades preferidas, las exposiciones de anticuerpo están separadas aproximadamente 24 semanas o 6 meses; o aproximadamente 48 semanas o 12 meses. En una modalidad, la segunda exposición de anticuerpo no se proporciona hasta aproximadamente 20 a 30 semanas a partir de la exposición inicial, opcionalmente seguido por una tercera exposición de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos (de preferencia aproximadamente 1.5 a 2.5 gramos), la tercera exposición no se administra hasta aproximadamente 46 a 60 semanas (de preferencia aproximadamente 46 a 54 semanas) a partir de exposición inicial y después de preferencia, no se proporciona adicional exposición de anticuerpo hasta al menos aproximadamente 70-75 semanas a partir de la exposición inicial. En una modalidad alterna, la segunda exposición de anticuerpo no se proporciona hasta aproximadamente 46 a 60 semanas a partir de la exposición inicial y subsecuentes exposiciones de anticuerpo, de haber, no se proporcionan hasta aproximadamente 46 a 60 semanas a partir de la previa exposición de anticuerpo. Cualquiera una o más de las exposiciones de anticuerpo presentes pueden proporcionarse al sujeto como una sola dosis de anticuerpo o como dos dosis separadas de anticuerpo (es decir que constituyen una primera y segunda dosis) . El número particular de dosis (ya sea uno o dos) empleado para cada exposición de anticuerpo depende por ejemplo del tipo de MS tratada, el tipo de anticuerpo empleado, si y qué tipo de segundo medicamento se emplea y el método y frecuencia de administración. Cuando se administran dos dosis separadas, la segunda dosis de preferencia se administra de aproximadamente 3 a 17 días, más preferible de 6 a 16 días y más preferiblemente de 13 a 16 días, a partir del tiempo en el que se administró la primer dosis. Cuando dos dosis separadas se administra, la primer y segunda dosis del anticuerpo de preferencia son aproximadamente de 0.5 a 1.5 gramos, más preferible de aproximadamente 0.75 a 1.3 gramos . En una modalidad, al sujeto se proporciona con al menos tres, o al menos cuatro exposiciones del anticuerpo, por ejemplo de aproximadamente 3 a 60 exposiciones y más particularmente aproximadamente 3 a 40 exposiciones, más particularmente 3 a 20 exposiciones. De preferencia, estas exposiciones se administran a intervalos cada uno de aproximadamente 24 semanas o 6 meses, o 48 semanas o 12 meses. En una modalidad, cada exposición de anticuerpos se proporciona como una sola dosis del anticuerpo. En una modalidad alterna, cada exposición de anticuerpo se proporciona como dos dosis separadas del anticuerpo. Sin embargo, no toda exposición de anticuerpo requiere proporcionarse como una sola dosis o como dos dosis separadas. El anticuerpo puede ser un anticuerpo desnudo o puede conjugarse con otra molécula tal como un agente citotóxico, tal como un compuesto radioactivo. El anticuerpo preferido aquí es Rituximab, 2H7 humanizado (por ejemplo que comprende las secuencias de dominio variable en SEQ ID NOS. 2 y 8) o 2H7 humanizado que comprende las secuencias de dominio variable en SEQ ID NOS. 23 y 24, o huMax-CD20 (Genmab) . En una modalidad, el sujeto nunca ha sido tratado previamente con droga (s) tal como uno o varios agentes inmunosupresivos, para tratar esclerosis múltiple y/o nunca ha sido tratado previamente con un anticuerpo a un marcador de superficie de célula B (por ejemplo nunca ha sido tratado previamente con un anticuerpo CD20) . El anticuerpo se administra por cualquier medio conveniente, incluyendo administración parenteral, tópica, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal y/o intralesión. Infusiones parenterales incluyen administración intramuscular, intravenosa, intraarterial, intraperitoneal o subcutánea. Administración intratecal también se contempla (ver por ejemplo la solicitud de patente de los E.U.A. Número 2002/0009444, Grillo-Lopez, A referente a suministro intratecal de un anticuerpo CD20) . Además, el anticuerpo puede administrarse convenientemente por infusión de pulso, por ejemplo con dosis decrecientes del anticuerpo. De preferencia, la dosis se suministra en forma intravenosa, subcutánea o intratecal, más preferiblemente por una o varias infusiones intravenosas. Mientras que el anticuerpo CD20 puede ser la única droga administrada al sujeto para tratar esclerosis múltiple, se puede administrar opcionalmente un segundo medicamento, tal como un agente citotóxico, agente quimioterapéutico, agente inmunosupresor, citocina, antagonista de citocina o anticuerpo, factor de crecimiento, hormona, integrina, antagonista o anticuerpo de integrina (por ejemplo un anticuerpo LFA-1 tal como efalizumab (RAPTIVA®) comercialmente disponible de Genentech, o un anticuerpo alfa 4 integrina tal como natalizumab (TYSABRI®) disponible de Biogen) etc., con el anticuerpo que liga un marcador de superficie de célula B (por ejemplo con el anticuerpo CD20) . En la modalidad preferida de terapia de combinación, el anticuerpo se combina con una droga de clase interferona tal como IFN-beta-la (REBIF®) y AVONEX®) o IFN-beta-lb (BETASERON®) ; un oligopéptido tal como acetato de glatiramer (COPAXONE®) ; un agente citotóxico tal como mitoxantrona (NOVANTRONE®) , metotrexato, ciclofosfamida, clorambucil, azatioprina; inmunoglobulina intravenosa (gamma globulina) ; terapia de agotamiento de linfocitos (por ejemplo mitoxantrona, ciclofosfamida, Campath, anti-CD4, cladribina, irradiación total de anticuerpo, transplante de médula ósea) ; corticosteroide (por ejemplo metilprednisolona, prednisona, dexametasona, o glucorticoide) , incluyendo terapia corticosteroide sistémica; terapia inmunosupresora sin agotamiento de linfocitos (por ejemplo micofenolato mofetil (MMF) o ciclosporina) ; droga que reduce el colesterol de la clase "estatina" que incluye cerivastatina (BAYCOL®) , fluvastatina (LESCOL®) , atorvastatina (LIPITOR®) , lovastatina (MEVACOR®) , pravastatina (PRAVACHOL®) , Simvastatina (ZOCOR®) ; estradiol; testosterona (opcionalmente a dosis elevadas Stuve et al. Neurology 8:290-301 (2002)); terapia de reemplazo de hormonas; terapia para síntomas secundarios o relacionados a MS (por ejemplo espasticidad, incontinencia, dolor, fatiga) ; un inhibidor de TNF; droga anti-reumática que modifica enfermedad (DMARD = disease-modifying anti-rheumatic drug) ; droga antiinflamatoria no esteroidal (NSAID = non-steroidal anti-inflammatory drug) ; plasmaferesis; levotiroxina; ciclosporina A; análogo de somatostatina; citocina o antagonista de receptor de citocina; anti-metabolito; agente inmunosupresor; cirugía rehabilitante; radioyodo; tiroidectomía; otro antagonista/anticuerpo de superficie de célula B; etc. El segundo medicamento se administra con la exposición inicial y/o exposiciones posteriores del anticuerpo CD20, esta administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica sencilla, y administración consecutiva en cualquier orden, en donde de preferencia hay un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas . Además de la administración de anticuerpos al sujeto, la presente solicitud contempla administración de anticuerpos por terapia de genes. Esta administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo se abarca por la expresión administrar una "cantidad efectiva" de un anticuerpo. Ver por ejemplo W096/07321 publicada en marzo 14,1996 referente al uso de terapia de genes para generar anticuerpos intracelulares. Hay dos enfoques principales para llevar el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) a las células del sujeto; in vivo y ex vivo . Para suministro in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente al sujeto, usualmente en el sitio en donde se requiere el anticuerpo. Para tratamiento ex vivo, las células del sujeto se retiran, el ácido nucleico se introduce en estas células aisladas y las células modificadas se administran al sujeto, ya sea directamente o por ejemplo encapsuladas dentro de membranas porosas que se implantan en el sujeto (ver por ejemplo las patentes de los E.U.A. Números 4,892,538 y 5,283,187). Hay una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere en células cultivadas in vi tro, o in vivo en las células del anfitrión pretendido. Técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico en células de mamífero in vi tro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación de fosfato de calcio, etc. Un vector comúnmente empleado para suministro ex vivo del gen es un retrovirus . Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de herpes simplex I, o virus adenoasociado) , y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para transferencia mediada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . En algunas situaciones, es conveniente el proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que hace blanco en las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, proteínas que ligan a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis, pueden emplearse para hacer diana y/o facilitar absorción, por ejemplo proteínas cápsido o sus fragmentos trópicos para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que se someten a internalización en ciclado, y proteínas que hacen diana para localización intracelular y mejoran la vida media intracelular. La técnica de endocitósis mediada por receptor se describe, por ejemplo por Wu et al., J. Biol . Chem . 262: 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Na ti . Acad . Sci . USA 87: 3410-3414 (1990) . Para revisar los protocolos de terapia de genes y marcado de genes actualmente conocidos ver Anderson et al., Science 256:808-813 (1992). Ver también WO 93/25673 y las referencias ahí citadas. III. Producción de Anticuerpos Los métodos y artículos de fabricación de la presente invención utilizan o incorporan un anticuerpo que liga a un marcador de superficie de célula B, especialmente uno que liga a CD20. De acuerdo con esto, métodos para generar estos anticuerpos se describirán aquí . El marcador de superficie de célula B a utilizarse para producción de, o supervisión de anticuerpos puede ser, por ejemplo una forma soluble del marcador o una porción del mismo, que contiene el epítope deseado. De forma alterna o adicionalmente, células que expresan el marcador en su superficie celular pueden emplearse para generar, o supervisar anticuerpos. Otras formas del marcador de superficie de célula B útiles para generar anticuerpos serán aparentes para aquellos con destreza en la técnica. A continuación se dará una descripción de técnicas ejemplares para la producción de los anticuerpos empleados de acuerdo con la presente invención. (i) Anticuerpos policlonales Anticuerpos policlonales de preferencia se desarrollan en animales por inyecciones múltiples subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno relevante y un adyuvante. Pueden emplearse para conjugar el antígeno relevante a una proteína que es inmunogénica en las especies a inmunizar, por ejemplo hemocianina de erizo de mar, albúmina de suero, tiroglobulina bovina, o inhibidor de tripsina de soya utilizando un agente bifuncional o derivatizante, por ejemplo maleimidobenzoil sulfosuccinimida éster (conjugación a través de residuo cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuo lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, SOCl2, o R1N=C=NR, en donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Los animales se inmunizan contra el antígeno, conjugados inmunogénicos o derivados al combinar por ejemplo 100 //g o 50 /.g de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales son reforzados con 1/5 o 1/10 de la cantidad original de péptido conjugado en adyuvante completo de Freund por inyección subcutánea en múltiples sitios. 7 a 14 días después, los animales son sangrados y el suero se ensaya para título de anticuerpo. Se refuerzan animales hasta que el título alcanza una meseta. De preferencia, el animal es reforzado con el conjugado del mismo antígeno, pero se conjuga a una proteína diferente y/o a través de un reactivo de entrelazamiento diferente. También pueden elaborarse conjugados en cultivo celular recombinante como fusiones de proteínas. También, agentes de agregación tales como alumbre, se emplean convenientemente para mejorar la respuesta inmune. (ii) Anticuerpos monoclonales Se obtienen anticuerpos monoclonales a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir los anticuerpos individuales que comprenden la población, son idénticos y/o ligan el mismo epítope excepto por variantes posibles que surgen durante producción del anticuerpo monoclonal, estas variables en general están presentes en cantidades menores . De esta manera, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que no es una mezcla de anticuerpos discretos o policlonales. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden elaborarse utilizando el método de hibridoma primero descrito por Kohier et al., Na ture, 256: 495 (1975) , o pueden elaborarse por métodos de ADN (DNA) recombinante (patente de los E.U.A. Número 4,816,567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal anfitrión apropiado tal como un hámster, se inmuniza como se describió previamente para producir linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que liguen específicamente a la proteína empleada para inmunización. En forma alterna, linfocitos pueden ser inmunizados in vi tro . Después se fusionan linfocitos con células de mieloma, utilizando un agente de fusión conveniente, tal como polietilen glicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) . Las células de hibridoma de esta manera preparadas se siembran y desarrollan en medio de cultivo conveniente que de preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células de mieloma padre no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma padre carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina, y timidina (medio HAT) , estas sustancias evitan el crecimiento de células deficientes en HGPRT. Células de mieloma preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan producción a alto nivel estable de anticuerpo por células productoras de anticuerpo selectas, y son sensibles a un medio tal como medio HAT. Entre éstas, líneas celulares de mieloma preferidas son líneas de mieloma murino, tales como aquellas derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-21 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA. Líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de ratón-humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133: 3001(1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) . El medio de cultivo donde se crecen células de hibridoma se ensaya para producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. De preferencia, la especificidad de enlace de anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma, se determina por inmunoprecipitación o pos un ensayo de enlace in Vi tro tal como radioinmunoensayo (RÍA) o ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzima (ELIZA) . La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal puede ser por ejemplo determinada por el análisis Scatchard de Munson et al., Anal . Biochem . , 107: 220 (1980) . Después de que se identifican células de hibridoma que producen anticuerpos de las deseadas especificidad, afinidad y/o actividad, los ciónos pueden ser subclonados por procedimientos de dilución limitante y desarrollados por métodos estándar (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Medio de cultivo conveniente para este propósito incluye por ejemplo medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como tumores ascitos en un animal. Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclonos se separan convenientemente del medio de cultivo, fluido, ascitos o suero, por procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencional tales como por ejemplo proteína A-Sepharose, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. DNA que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y secuencia utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo al utilizar sondas oligonucleótido que son capaces de enlazar específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos) . Las células de hibridoma sirven como una fuente preferida de este DNA. Una vez aislado, el DNA puede colocarse en vectores de expresión, que después se transfectan en células anfitrionas tales como células de E . coli , células COS de simio, células de ovario de hámster chino (CHO = Chínese Hámster Ovary) o células de mieloma que de otra forma no producen proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células anfitrionas recombinantes. Artículos de revisión de expresión recombinante en bacterias DNA que codifica el anticuerpo incluyen Skerra et al., Curr. Opinión in Immunol . , 5: 256-262 (1993) y en Pluckthun, Immunol . Revs . , 130: 151-188 (1992). En una modalidad adicional, anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibliotecas fago de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty et al., Na ture, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Na ture, 352: 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol . Biol . , 222: 581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos respectivamente utilizando bibliotecas fago. Publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango nM) por entremezclado de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir muy grandes bibliotecas fago ((Waterhouse et al., Nuc . Acids . Res . , 21: 2265-2266 (1993)). De esta manera, estas técnicas son alternativas viables a técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal para aislamiento de anticuerpos monoclonales . El DNA también puede modificarse, por ejemplo al sustituir la secuencia de codificación para dominios constantes de cadena pesada y ligera humana en lugar de las secuencias murina homologas (patente de los E.U.A. Número 4,816,567; Morrison, et al., Proc . Na ti Acad. Sci . USA, 81:6851(1984)), o por unión covalente con la secuencia de codificación de inmunoglobulina todo o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido sin-inmunoglobulina . Típicamente, estos polipéptidos no-inmunoglobulina están substituidos por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo, para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno y otro sitio de combinación de antígeno que tiene especificidad para un antígeno diferente. ( iii ) An ticuerpos Humanizados . Métodos para humanizar anticuerpos no humanos se han descrito en la especialidad. De preferencia, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos aminoácido introducidos en él desde una fuente que no es humana. Estos residuos aminoácido no humanos a menudo se refieren como residuos de "importación" que típicamente se toman de un dominio variable de "importación". La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Na ture, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Na ture, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988)), al sustituir secuencias de región hipervariable por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. De acuerdo con esto, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de los E.U.A. Número 4,816,567) en donde substancialmente menos que un dominio variable humano intacto se ha substituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en donde algunos residuos de región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR se substituyen por residuos de sitios análogos en anticuerpos roedores. La selección de dominios variables humanos tanto ligeros como pesados, a utilizarse para producir los anticuerpos humanizados es muy importante para reducir la antigenicidad. De acuerdo con el así denominado, método de "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo roedor se supervisa contra la biblioteca completa de secuencias de dominio variable humano conocidas. La secuencia humana que es más cercana a la del roedor se acepta como la región marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol . , 151: 2296 (1993) ; Chothia et al., J. Mol . Biol . , 196: 901 (1987)). Otro método utiliza una región marco de lectura particular derivado de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de regiones variables de cadena ligera o pesada. El mismo marco de lectura puede emplearse para varios anticuerpos humanizados diferentes (Cárter et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 89: 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol . , 151:2623 (1993)).

Además es importante que se humanicen anticuerpos con retención de alta afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr esta meta, de acuerdo con un método preferido, se preparan anticuerpos humanizados por un proceso de análisis de las secuencias padres y diversos productos humanizados conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias padres y humanizadas. Modelos de inmunoglobulina tridimensionales son comúnmente disponibles y son familiares para aquellos con destreza en la técnica. Programas de computadora están disponibles que ilustran y exhiben estructuras de conformación tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidata selecta. Inspección de estas exhibiciones permite análisis del papel probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir el análisis de residuos que influencian la capacidad de la inmunoglobulina candidato para ligar su antígeno. De esta manera, residuos FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias de recipiente e importación, de manera tal que la característica deseada de anticuerpo tal como afinidad incrementada al o los antígenos diana, se logre. En general, los residuos de región hipervariable están involucrados directa y más sustancialmente para influenciar enlace de antígeno. ( iv) Anticuerpos humanos Como una alternativa a humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo ratones) que son capaces, ante inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en la ausencia de producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que eliminación homozigota del gen de región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones mutantes de línea germinal y quiméricos resulta en inhibición completa de producción de anticuerpo endógeno. Transferencia del conjunto de genes de inmunoglobulina de línea germinal humana en estos ratones mutantes de línea germinal, resultará en la producción de anticuerpos humanos ante ataque con antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc .

Na ti . Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Na ture, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno . , 7: 33 (1993); y las patentes de los E.U.A.

Números 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. En forma alterna, tecnología de exhibición fago (McCafferty et al., Na ture 348:552-553 (1990)) puede emplearse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo in Vi tro, de repertorios de gen de dominio variable de inmunoglobulina (V) de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, genes de dominio de anticuerpo V se clonan en marco en cualquiera de un gen de proteína de revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd, y exhiben como fragmentos de anticuerpo funcionales en la superficie de la partícula de fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de DNA de una sola hebra del genoma fago, selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo, también resultan en la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La exhibición fago puede realizarse en una variedad de formatos; para su revisión ver, por ejemplo Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. , Currept Opinión in Structural Biology 3: 564-571 (1993). Varias fuentes de segmento de gen V pueden emplearse para exhibición fago. Clackson et al., Na ture, 352:624-628 (1991) aislaron un conjunto diverso de anticuerpos de anti-oxazolona de una biblioteca combinatoria aleatoria pequeña de genes V derivada de los bazos de ratones inmunizados. Un repertorio de genes V de donadores humanos sin inmunizar, puede construirse y anticuerpos para un conjunto diverso de antígenos (incluyendo auto-antígenos) pueden aislarse esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks et al., J. Mol . Biol . 222:581-597 (1991), o Griffith et al., EMBO J 12:725-734 (1993). Ver también las patentes de los E.U.A. Números 5,565,332 y 5,573,905. Anticuerpos humanos también pueden generarse por células B activadas in Vi tro (ver patentes de los E.U.A. Números 5,567,610 y 5,229,275). (v) Fragmentos de An ticuerpo Diversas técnicas se han desarrollado para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente, estos fragmentos se derivaron mediante digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver por ejemplo Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) and Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden producirse directamente por células anfitrionas recombinantes. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden aislarse de las bibliotecas de fago de anticuerpo discutidas anteriormente. En forma alterna, fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E . coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F (ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, pueden aislarse fragmentos F(ab')2 directamente de cultivo de célula anfitriona recombinante. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para el practicante con destreza en la especialidad. En otras modalidades, el anticuerpo de selección es un fragmento Fv de cadena sencilla (scFv) . Ver WO 93/16185; patente de los E.U.A. Número 5,571,894; y patente de los E.U.A. Número 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", por ejemplo como se describe en la patente de los E.U.A. Número 5,641,870. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos. (vi) Anticuerpos biespecíficos Anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para cuando menos dos epítopes diferentes. Anticuerpos biespecíficos ejemplares pueden ligar a dos diferentes epítopes del marcador de superficie de célula B. Otros de estos anticuerpos pueden ligar el marcador de superficie de célula B y además ligar un segundo marcador de superficie de célula B diferente. En forma alterna, un brazo de enlace a marcador de superficie de célula anti-B puede combinarse con un brazo que liga a una molécula activadora en un leucocito tal como una molécula receptora de célula T (por ejemplo CD2 o CD3) o receptores Fc para IgG (FcgammaR) tal como FcgammaRI (CD64) , FcgammaRII (CD32) 7 FcgammaRIII (CD16) para enfocar mecanismos de defensa celular a la célula B. Anticuerpos biespecíficos también pueden emplearse para localizar agentes citotóxicos en la célula B. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace de marcador de superficie de célula B y un brazo que liga el agente citotóxico (por ejemplo saponina, anti-interferona- a , vinca alcaloide, cadena ricina A, metotrexato o apteno isótopo radioactivo) . Anticuerpos biespecíficos pueden prepararse como anticuerpos de longitud íntegra o fragmentos de anticuerpo (por ejemplo anticuerpos biespecíficos F (ab')2). Métodos para producir anticuerpos biespecíficos se conocen en la técnica. Producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud integral se basa en la co-expresión de dos pares de cadena ligera-cadena pesada de inmunoglobulina en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades ( (Millstein et al., Na ture, 305:537-539 (1983)). Debido al surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. Purificación de la molécula correcta, que usualmente se realiza por etapas de cromatografía de afinidad, es más bien problemática, y los rendimientos de productos son bajos. Similares procedimientos se describen en WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J. , 10: 3655-3659 (1991) . De acuerdo con un enfoque diferente, dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpo-antígeno) se fusionan a secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión de preferencia es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, regiones CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contenga el sitio necesario para enlace de cadena ligera, presente en al menos una de las fusiones. DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y si se desea la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se co-transfectan en un organismo anfitrión conveniente. Esto permite gran flexibilidad para ajustar las proporciones mutuas de los tres fragmentos polipéptido en modalidades en donde proporciones diferentes de las tres cadenas polipéptido empleadas en la construcción, proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo es posible insertar las secuencias de codificación para dos o todas las tres cadenas polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipéptido en proporciones iguales, resulta en alto rendimientos o cuando las proporciones no son de significancia particular. En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están compuestos de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo, y un par de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina híbrido (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se encontró que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de combinaciones de cadena inmunoglobulina indeseadas, como la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad de la molécula biespecífica permite la forma fácil de separación. Este enfoque se describe en WO 94/04690. Para mayores detalles para generar anticuerpos bioespecíficos, ver por ejemplo Suresh et al., Methods in Enzymology, 121: 210 (1986). De acuerdo con otro enfoque descrito en la patente de los E.U.A. Número 5,731,168, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo puede someterse a ingeniería, para llevar a máximo el por ciento de heterodímeros que se recuperan de cultivo celular recombinante. La interfase preferida comprende cuando menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más pequeñas cadenas laterales de aminoácido de la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptofano) . "Cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la o las cadenas laterales grandes se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo, al reemplazar cadenas laterales de aminoácidos con más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero frente a otros productos finales indeseados tales como homodímeros . Anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos entrelazados o "heteroconjugados". Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse con avidina, el otro con biotina. Estos anticuerpos por ejemplo se han propuesto para hacer diana en células del sistema inmune a células indeseadas (patente de los E.U.A. Número 4,676,980), y para el tratamiento de infección HIV (WO 91/00360, WO 92/200373, y EP 03089). Anticuerpos heteroconjugados pueden elaborarse utilizando cualesquiera métodos de entrelazamiento conveniente. Agentes de entrelazamiento conveniente son bien conocidos en la técnica y se describen en la patente de los E.U.A.

Número 4,676,980, junto con una cantidad de técnicas de entrelazamiento . Técnicas para generar anticuerpos bioespecíficos para fragmentos de anticuerpo, también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, anticuerpos bioespecíficos pueden prepararse utilizando enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en donde anticuerpos intactos se escinden proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente complejante ditiol arsenito de sodio para estabilizar ditioles vecinales y evitar formación de bisulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados después se convierten en derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab' -TNB se reconvierte entonces al Fab1 -tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos biespecíficos producidos pueden emplearse como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Diversas técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de cultivo celular recombinante, también se han descrito. Por ejemplo, anticuerpos biespecíficos se han producido utilizando cremalleras leucina. Kostelny et al., J.

Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun, se enlazaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes por fusión de genes. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron en la región bisagra, para formar monómeros y luego re-oxidaron para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método también puede utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 90: 6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alterno para producir fragmentos de anticuerpo biespecífico. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (V) por un enlazador, que es muy corto para permitir formar pares entre los dos dominios en la misma cadena. De acuerdo con esto, los dominios VH y VL de un fragmento se forman para aparear con los dominios complementarios VL y VH de otro fragmento, formando de esta manera dos sitios de enlace de antígeno. Otra estrategia para producir fragmentos de anticuerpo biespecíficos por el uso de dímeros FV de cadena sencilla (sFv) también se ha reportado. Ver Gruber et al., J.

Immunol . , 152: 5368 (1994).

Anticuerpos con más de dos valencias se contemplan. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos tri-específicos . Tutt et al. J. Immunol . 147: 60 (1991). IV. Conjugados y otras modificaciones del anticuerpo El anticuerpo empleado en los métodos o incluido en los artículos de manufactura aquí se conjuga opcionalmente con un agente citotóxico. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con una droga como se describe en W02004/032828. Agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de estos conjugados de agente citotóxico-anticuerpo, se han descrito anteriormente. Conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, tales como calicheamicina o maitansina (patente de los E.U.A. Número 5,208,020), un tricoteno y CC1065, también aquí se contemplan. En una modalidad de la invención, el anticuerpo se conjuga con una o más moléculas de maitansina (por ejemplo aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de anticuerpo) . La maitansina puede por ejemplo convertirse en May-SS-Me, que puede reducirse en May-SH3 y reaccionar con anticuerpo modificado (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131(1992)) para generar un conjugado de anticuerpo-maitansinoide . En forma alterna, el anticuerpo se conjuga con una o más moléculas de calicheamicina. La familia de calicheamicina de antibióticos son capaces de producir interrupciones de DNA de doble hebra a concentraciones sub-picomolar . Análogos estructurales de caliqueamicina que pueden emplearse incluyen pero o están limitados a, / J1 OC 21 , cc 3t , N-acetil- ? i1, PSAG y ? X (Hinman et al. Cáncer Research 53: 3336-3342 (1993) y Lode et al. Cáncer Research 58: 2925-2928(1998)). Toxinas enzimáticamente activas y sus fragmentos que pueden emplearse incluyen cadena difteria A, fragmentos activos sin enlace de toxina difteria, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa ) , cadena ricina A, cadena abrina A, cadena modeccina A, alfa-sarcina, proteínas Aleuri tes fordii , proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotenos. Ver por ejemplo WO 93/21232 publicada en octubre 28, 1993. La presente invención además contempla anticuerpo conjugado con un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una DNA endonucleasa tal como deoxiribonucleasa; DNasa) . Una variedad de isótopos radioactivos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados . Ejemplos incluyen At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153 , Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu. Conjugados del anticuerpo y agente citotóxico pueden elaborarse utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional tales como N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) propionato (SPDP), succinimidil-4- (N-maleimidometil) ciciohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como dimetil adipimidato HCl) , esteres activos (tales como disuccinimidil suberato) , aldehidos (tales como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (tales como bis (p-azidobenzoil) hexandiamina) , derivados bis-diazonio (tales como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tales como toluen 2 , 6-diisocianato) , y compuestos de flúor bis-activos (tales como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenzeno) . Por ejemplo, una resina inmunotoxina puede prepararse como se describe en Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987). Ácido l-isotiocianatobenzil-3-metildietilen triaminpentaacético (MX-DTPA) etiquetado con carbono 14, es un agente quelante ejemplar para conjugar radionúclido al anticuerpo. Ver W094/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindible" que facilita la liberación de la droga citotóxica en la célula. Ver por ejemplo un enlazador ácido lábil, enlazador sensible a peptidasa, enlazador dimetilo o enlazador que contiene disulfuro (Chari et al. Cáncer Research 52: 127-131 (1992)) puede emplearse . En forma alterna, una proteína de fusión que comprende el anticuerpo y agente citotóxico, puede elaborarse por ejemplo por técnicas recombinantes o síntesis de péptido. Todavía en otra modalidad, el anticuerpo puede ser conjugado a un "receptor" (tal como estreptavidina) para utilización en pre-diana de tumor en donde el conjugado anticuerpo-receptor se administra al sujeto, seguido por remoción de conjugado no ligado de la circulación utilizando un agente de liberación y luego administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) que es conjugado a un agente citotóxico (por ejemplo radionucleótido) . Los anticuerpos de la presente invención también pueden conjugarse con una enzima de activación de prodroga que convierte una prodroga (por ejemplo un agente peptidil quimioterapéutico, ver W081/01145) a una droga anti-cáncer activa. Ver por ejemplo WO 88/07378 y la patente de los E.U.A. Número 4,975,278. El componente de enzima de estos conjugados incluye cualquier enzima capaz de actuar en una prodroga, de manera tal que la convierta en su forma citotóxica más activa. Enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen pero no están limitadas a fosfatasa alcalina útil para convertir prodrogas que contienen fosfato en drogas libres; arilsulfatasa, útil para convertir prodrogas que contienen sulfato en drogas libres; citocina diaminasa útil para convertir 5-fluorocitocina no tóxica en la droga anti-cáncer 5-fluorouracilo; proteasas, tales como proteasa serratia, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir prodrogas que contienen péptido en drogas libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir prodrogas que contienen sustituyentes D-aminoácido; enzimas de escisión de carbohidratos tales como ß -galactosidas y neuraminidasa útiles para convertir prodrogas glicosiladas en drogas libres; /?-lactamasa útil para convertir drogas derivatizadas de ß - lactamas en drogas libres; y penicilina amidasas, tales como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir drogas derivatizadas en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo, respectivamente, en drogas libres. En forma alterna, anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en la técnica como "aczimas" pueden utilizarse para convertir las prodrogas de la invención en drogas activas libres (ver por ejemplo Massey, Na ture 328: 457-458 (1987)). Conjugados de anticuerpo-aczima pueden prepararse como se describe aquí, para suministro de la aczima en una población de células de tumor. Las enzimas de esta invención pueden ligarse covalentemente al anticuerpo por técnicas bien conocidas en la especialidad tales como el uso de los reactivos de entrelazamiento heterobifuncionales discutidos anteriormente. En forma alterna, proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace de antígeno de un anticuerpo de la invención enlazada a cuando menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención, pueden construirse utilizando técnicas de DNA recombinante bien conocidas en la especialidad (ver por ejemplo Neuberger et al., Na ture, 312: 604-608 (1984)). Otras modificaciones del anticuerpo aquí se contemplan. Por ejemplo, el anticuerpo puede enlazarse a uno de una variedad de polímeros no proteináceos, por ejemplo polietilen glicol (PEG) , polipropilen glicol, polioxialquilenos, o copolímeros de polietilen glicol y polipropilen glicol. Fragmentos de anticuerpo tales como Fab' enlazados con una o más moléculas de PEG son una modalidad especialmente preferida de la invención. Los anticuerpos aquí descritos también pueden formularse como liposomas. Liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la especialidad tal como se describe en Epstein et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc . Na ti . Acad. Sci . USA, 77: 4030 (1980); patentes de los E.U.A. Números 4,485,045 y 4,544,545; y W097/38731 publicado en octubre 23, 1997. Liposomas con tiempo de circulación mejorado se describen en la patente de los E.U.A. Número 5,013,556. Liposomas particularmente útiles pueden generarse por el método de evaporación de fase inversa con una composición lípida que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE) . Se extruyen liposomas a través de filtros con tamaño de poro definido, para dar liposomas con el diámetro deseado. Fragmentos Fab1 de un anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse a los liposomas como se describe en Martin et al. J. Biol . Chem . 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio disulfuro. Un agente quimioterapéutico está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Ver Gabizon et al. J. Na tional Cáncer Inst . 81 (19) 1484(1989). Una o varias modificaciones de secuencias de aminoácidos del anticuerpo se contemplan. Por ejemplo, puede ser conveniente el mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo se preparan al introducir cambios de nucleótido apropiados en el ácido nucleico de anticuerpo o por síntesis de péptido. Estas modificaciones incluyen por ejemplo eliminaciones de, y/o inserciones en y/o sustituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácido del anticuerpo. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución se realiza para llegar a la construcción final, siempre que la construcción final posea las características deseadas . Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos posttraducción del anticuerpo, tales como cambio del número o posición de los sitios de glicosilación. Un método útil para identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son ubicaciones preferidas para mutagénesis, se denomina "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham and Wells Science, 244: 1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos diana se identifica (por ejemplo residuos cargados tales como arg, asp, his, lys, y glu) y reemplaza por un aminoácido neutro o de carga negativa (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con antígenos. Aquellas ubicaciones de aminoácido que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones se refinan entonces al introducir adicionales u otras variantes en o, para los sitios de sustitución. De esta manera, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no requiere estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio determinado, se realiza mutagénesis aleatoria o de exploración ala en la región o codón diana y las variantes de anticuerpo expresadas se supervisan para la actividad deseada. Inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de terminal carboxilo y/o amino en el intervalo en longitud de un residuo a polipéptidos que contienen cien o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos aminoácido sencillos o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N-terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluyen la fusión al extremo N o C del anticuerpo de una enzima, o un polipéptido que aumenta la vida media en suero del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen cuando menos un residuo aminoácido en la molécula de anticuerpo reemplazada por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para mutagénesis de sustitución de anticuerpos incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan alteraciones FR. Sustituciones conservadoras se muestran en la tabla 1 bajo el encabezado de "sustituciones preferidas". Si estas sustituciones resultan en un cambio de actividad biológica, entonces cambios más sustanciales denominados "sustituciones ejemplares" en la tabla 1 o como se describe más a continuación con referencia a clases de aminoácidos, podrán introducirse y los productos supervisarse. Tabla 1 Modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se logran al seleccionar sustituciones que difieren significativamente de su efecto para mantener (a) la estructura principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo como una hoja o una conformación helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (c) el volumen de la cadena lateral. Pueden agruparse aminoácidos de acuerdo con similaridades en las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, en Biochemistry, segunda edición pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)): (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , He (I), Pro (P) , Phe (F) , Trp (W) , Met (M) (2) polares sin carga: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y) , Asn (N) , Gln (Q) (3) acídicas: Asp (D) , Glu (E) (4) básicas: Lys (K) , Arg (R) , His (H) En forma alterna, residuos de origen natural pueden dividirse en grupos con base en propiedades de cadena lateral comunes : (1) hidrofóbicas: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrofílicas neutras: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acídicas: Asp, Glu; (4) básicas: His, Lys, Arg; (5) residuos que influencian la orientación de cadena: Gly, Pro; (6) aromáticas: Trp, Tyr, Phe.

Sustituciones no conservadoras involucrarán intercambiar a un miembro de una de estas clases por otra clase . Cualquier residuo cisteína no involucrado en mantener la conformación adecuada del anticuerpo también puede ser sustituido, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrelazamiento aberrante. Por el contrario, pueden agregarse uno o varios enlaces cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv' ) . Un tipo particularmente preferido de variante de sustitución, involucra sustituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo padre. En general, la o las variantes resultantes seleccionadas de adicional desarrollo tendrán mejoradas propiedades biológicas respecto al anticuerpo padre del cual se generan. Una forma conveniente para generar estas variantes de sustitución es maduración de afinidad utilizando exhibición fago. Brevemente, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo 6 a 7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones amino en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se exhiben en una forma monovalente de partículas fago filamentosas como fusiones al producto gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes de exhibición fago después se supervisan por su actividad biológica (afinidad de enlace), como aquí se describe. A fin de identificar sitios de región hipervariable candidatos para modificación, mutagénesis de de exploración de alanina puede realizarse residuos de región hipervariable que contribuyen significativamente a enlace de antígeno. En forma alterna o además, puede ser benéfico el analizar una estructura cristal del complejo antígeno-anticuerpo para identificar puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Estos residuos de contacto y residuos vecinos son candidatos para sustitución de acuerdo con las técnicas aquí elaboradas. Una vez que estas variantes se generan, el panel de variantes se somete a supervisión como se describe aquí y anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para mayor desarrollo. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glicosilación original del anticuerpo. Esta alteración incluye eliminar una o más porciones carbohidrato que se encuentran en el anticuerpo y/o agregar uno o más sitios de glicosilación no presentes en el anticuerpo.

Glicosilación de polipéptidos típicamente ya está N-enlazada u O-enlazada. N-enlazada se refiere a la conexión de la porción carbohidrato a la cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para conexión enzimática de la porción carbohidrato a la cadena lateral esparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. Glicosilación O-enlazada se refiere a la conexión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también pueden emplearse 5 -hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . Adición de sitios de glicosilación al anticuerpo se logra convenientemente alterando la secuencia aminoácidos de manera tal que contenga una o más de las secuencias tripéptido anteriormente descritas (para sitios de glicosilación N-enlazados) . La alteración también puede realizarse por la adición de, o sustitución por, uno o más residuos serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glicosilación O-enlazados) .

Cuando el anticuerpo comprende una región Fc, el carbohidrato conectado al mismo puede ser alterado. Por ejemplo, anticuerpos con una estructura carbohidrato madura que carece de fucosa conectada a una región Fc del anticuerpo, se describen en la solicitud de patente de los E.U.A. Número 2003/0157108 Al, Presta, L. Ver también la patente de los E.U.A. Número 2004/0093621 Al (Kyowa Hakko Kogyo Co . , Ltd.) referente a una composición de anticuerpo CD20. Anticuerpos con una N-acetilglucosamina de bisección (GlcNAc) en el carbohidrato conectado a una región Fc del anticuerpo, son referidos en WO03/011878, Jean-Mairet et al. y la patente de los E.U.A. Número 6,602,684, Umana et al. Anticuerpos con al menos un residuo galactosa en el oligosacárido conectado a una región Fc del anticuerpo se reportan en W097/30087, Patel et al. Ver también W098/58964 (Raju, S.) y W099/22764 (Raju, S.) referentes a anticuerpos con carbohidrato alterado conectado a su región Fc . La variante de glicosilación preferida aquí comprende una región Fc, en donde una estructura carbohidrato conectada a la región Fc carece de fucosa. Estas variantes tienen función ADCC mejorada. Opcionalmente, la región Fc además comprende una o más sustituciones aminoácido que además mejoran ADCC, por ejemplo sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fc (numeración Eu de residuos) . Ejemplos de publicaciones relacionadas a anticuerpos "desfucosilados" o "deficientes en fucosa" incluyen: solicitud de patente de los E.U.A. Número 2003/0157108 Al, Presta, L WO00/61739A1; WO01/29246A1 ; US2003/0115614A1 US2002/0164328A1; US2004/0093621A1 ; US2004/0132140A1 US2004/0110704A1; US2004/0110282A1 ; US2004/0109865A1 W003/085119A1; W003/084570A1 ; W02005/035778 W02005/035586 (que describe inhibición de RNA (RNAi) de fucosilación); Okazaki et al. J. Mol . Biol . 336: 1239-1249 (2004) ; Yamane- Ohnuki et al. Biotech . Bioeng. 87: 614 (2004) . Ejemplos de líneas celulares que producen anticuerpos desfucosilados incluyen células Lecl3 CHO deficientes en fucosilación de proteína ( (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249: 533-545 (1986); solicitud de patente de los E.U.A. Número 2003/0157108 Al, Presta, L; y WO 2004/056312 Al, Adams et al. en especial, el ejemplo 11), y líneas de células de genes inoperativos, tales como el gen alfa-1, 6- fucosiltransferasa, células CHO de genes in operativos FUT8 (Yamane-Ohnuki et al. Biotech . Bioeng. 87: 614 (2004) ) . Moléculas de ácido nucleico que codifican variantes de secuencia de aminoácido del anticuerpo, se preparan por una variedad de métodos conocidos en la especialidad. Estos métodos incluyen pero no están limitados a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácido de origen natural) o preparación por mutagénesis mediada por oligonucleótido (o dirigida de sitio) , mutagénesis PCR, y mutagénesis de cásete, de una variante preparada previa o una versión no variante del anticuerpo. Puede ser conveniente el modificar el anticuerpo de la invención respecto a la función efectora, a fin de mejorar la citotoxicidad mediada por células dependientes de antígeno (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto puede lograrse al introducir una o más sustituciones de aminoácido en una región Fc de un anticuerpo anticuerpo anticuerpo. En forma alterna o adicionalmente, pueden introducirse uno o varios residuos cisteína en la región Fc, permitiendo de esta manera formación de enlace disulfuro intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o incrementado exterminio de células mediadas por complemento y citotoxicidad dependiente de anticuerpo (ADCC). Ver Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol . 148: 2918-2922 (1992). Anticuerpos homodiméricos con mejorada actividad anti-tumor también puede prepararse utilizando entrelazadores heterobifuncionales como se describe en Wolff et al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993) . En forma alterna, un anticuerpo puede someterse a ingeniería que tiene regiones Fc duales y puede de esta manera tener mejoradas capacidades de ADCC y lisis de complemento. Ver Stevenson et al. Anti -Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989) . WOOO/42072 (Presta, L.) describe anticuerpos con mejorada función ADCC en la presencia de células efectuadas humanas, en donde los anticuerpos comprenden sustituciones de aminoácido en su región Fc . De preferencia, el anticuerpo con mejorada ADCC comprende sustituciones en las posiciones 298, 333, y/o 334 de la región Fc . De preferencia, la región Fc alterada es una región IgGl Fc humana, que comprende o consiste de sustituciones en una, dos o tres de estas posiciones. Anticuerpos con citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) y/o enlace Clq alterado se describen en W099/51642, patente de los E.U.A. Número 6,194,551B1, patente de los E.U.A. Número 6,242,195B1, patente de los E.U.A. Número 6,528,624B1, patente de los E.U.A. Número 6,528,624B1 y patente de los E.U.A. Número 6,538,124 (Idusogie et al.). Los anticuerpos comprenden una sustitución aminoácido en una o más posiciones de aminoácido 270, 322, 326, 327, 329, 313, 333 y/o 334 de su región Fc .

Para aumentar la vida media en suero del anticuerpo, se puede incorporar un epítope de enlace receptor de recuperación en el anticuerpo (en especial un fragmento de anticuerpo como se describe en la patente de los E.U.A. Número 5,739,277, por ejemplo. Como se emplea aquí, el término "epítope enlace receptor de recuperación" , se refiere a un epítope de la región Fc de una molécula IgG (IgGi, IgG2, IgG3 , o IgG4) que es responsable por aumentar la vida media en suero in vivo de la molécula IgG. Anticuerpos con sustituciones en su región Fc e incrementadas vidas medias en suero también se describe en WOOO/42072 (Presta, L.). Anticuerpos de ingeniería con tres o más sitios de enlace de antígeno funcionales (de preferencia 4) también se contemplan (solicitud de patente de los E.U.A. Número US2002/0004587 Al, Miller et al.). V. Formulaciones Farmacéuticas. Formulaciones terapéuticas de los anticuerpos empleados de acuerdo con la presente invención se preparan para almacenamiento, al mezclar un anticuerpo que tiene el grado deseado de pureza con portadores excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables opcionales (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Portadores excipientes o estabilizantes aceptables no son tóxicos a los recipientes en la dosis y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butil o bencil alcohol; alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (con menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa mannitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo complejo de Zn-proteína) ; y/o surfactantes no iónicos tales como TWEENMR, PLURONICSMR, o polietilengliciol (PEG) . Formulaciones de anticuerpo anti-CD20 ejemplares se describen en W098/56418. Esta publicación describe una formulación de múltiples dosis, líquida, que comprende 40 mg/ml de Rituximab, acetato 25 mM, trehalosa 150 mM, alcohol bencílico 0.9%, polisorbato 20 0.02% a pH 5.0 que tiene una vida en almacenamiento mínima de dos años a 2-8 grados C. Otra formulación anti-CD20 de interés comprende 10 mg/ml de Rituximab en 9.0 mg/ml de cloruro de sodio, 7.35 mg/ml de citrato dihidrato de sodio, 0.7 mg/ml de polisorbato 80 y agua estéril para inyección, pH 6.5. Formulaciones liofilizadas adaptadas para administración subcutánea se describen en la patente de los E.U.A. Número 6,267,958. Estas formulaciones liofilizadas pueden constituirse como un diluyente conveniente a una elevada concentración de proteínas y la formulación reconstituida puede administrarse subcutáneamente al mamífero a tratar. Formas cristalizadas del anticuerpo o el anticuerpo también se contemplan. Ver por ejemplo la patente de los E.U.A. Número US2002/0136719A1 (Shenoy et al . ) . La presente formulación también puede contener más de un compuesto activo según sea necesario para la indicación particular a tratar, de preferencia aquellos con actividades complementarias que no se afectan adversamente entre sí. Por ejemplo, puede ser conveniente el proporcionar adicionalmente un agente citotóxico; un agente quimioterapéutico; agente inmunosupresor; citocina; antagonista o anticuerpo de citocina; factor de crecimiento; hormona; integrina; antagonista o anticuerpo integrina (por ejemplo un anticuerpo LFA-1 tal como efalizumab/RAPTIVA comercialmente disponible de Genetech, o un anticuerpo de alfa 4 integrina tal como asnatalizumab/TYSABRI®) disponible de Biogen; droga clase de interferona tal como IFN-beta-la (REBIF® y AVONEX®) o IFN-beta-lb (BETASERON®) ; un oligopéptido tal como acetato de glatiramer (COPAXONE®) ; un agente citotóxico tal como mitoxantrona (NOVANTRONA®) metotrexato ciclofosfamida clorambucil o aceatioprina; inmunoglobulina intravenosa (gammaglobulina) ; droga de agotamiento de linfocitos (por ejemplo mitoxantrona, ciclofosfamida, Campath, anti-C4 o cladrivina) ; droga inmunosupresora no agotadora de linfocitos (por ejemplo micofelonato mofetil MMF o ciclosporina) ; droga para reducir colesterol de la clase "estatina"; estradiol; testosterona; terapia de reemplazo de hormonas; droga que trata síntomas secundarios o relacionados a MS (por ejemplo espasticidad, incontinencia, dolor, fatiga) ; un inhibidor de TNF; droga anti-reumática que modifica enfermedad (DNARD = Desease Modify Anti Reumatic Drug) ; droga anti-inflamatoria no esferoidal (NSAID= Non Steroidal Anti-inflamatory Drug) ; corticoesteroide (por ejemplo metil prednisolona, prednisona, dexametazona o glucocorticoide; lebotiroxina; ciclosporina A; análogo de somatostatina; antagonista de citocina; anti-metabolito; agente inmunosupresor; antagonista o anticuerpo de integrina (por ejemplo anticuerpo LFA-1 tal como EFALIZUMAB o anticuerpo alfa4 integrina tal como NATALIZUMAB; u otro anticuerpo/antagonista de superficie de célula B; etcétera en la formulación. El tipo y cantidades efectivas de estos otros agentes dependen por ejemplo de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de esclerosis múltiple que se trata y los parámetros clínicos de los sujetos. Estos generalmente se emplean en las mismas dosis y con las rutas de administración que se emplean previamente o aproximadamente 1 a 99% de las dosis empleadas hasta la fecha. Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente en sistemas de suministro de droga coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16ava edición, Osol, A. Ed. (1980) . Pueden formularse preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos convenientes de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, estas matrices están en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) , o poli (vinilalcohol) ) , poli lactidas (patente de los E.U.A. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ? -etil-L-glutamato, etilen-vinil acetato no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradable tales como LUPRONDEPOT® (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido glicólico-ácido láctico y leuprolida acetato) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico. Las formulaciones a emplearse para administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estéril. VI . Artículos de Manu actura En otra modalidad de la invención, se proporciona un artículo de manufactura que contiene materiales útiles para el tratamiento de esclerosis múltiple descritos anteriormente. De preferencia, el artículo de manufactura comprende: (a) un recipiente que comprende una composición, que comprende un anticuerpo que liga a marcador de superficie de célula B (por ejemplo un anticuerpo CD20) y un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable dentro del recipiente; y (b) un inserto de empaque con instrucciones para administrar la composición a un sujeto que sufre de esclerosis múltiple, para proporcionar una exposición inicial de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos, seguida por una segunda exposición de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos, la segunda exposición no se proporciona hasta después de aproximadamente 16 a 60 semanas de la exposición inicial; o instrucciones para administrar la composición a un sujeto que sufre de PPMS. El artículo de manufactura comprende un recipiente y una etiqueta o inserto de empaque en o asociados con el recipiente. Recipientes convenientes incluyen, por ejemplo botellas, ampolletas, jeringas, etc . Los recipientes pueden formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente retiene o contiene una composición que es efectiva para tratar esclerosis múltiples y puede tener una compuerta de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o una ampolleta que tiene un tapón susceptible a perforar por una aguja de inyección hipodérmica) . Cuando menos un agente activo en la composición es el anticuerpo. La etiqueta o inserto de empaque indica que la composición se emplee para tratar esclerosis múltiple en un sujeto que sufre, con guía específica respecto a cantidades de dosificación e intervalos del anticuerpo y cualquier otra droga que se proporcione. El artículo de manufactura además puede comprender un segundo recipiente que comprende un amortiguador diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como agua para inyección bacterioestática (BWFI = bacteriostatic water for injection) , salino amortiguado con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. El artículo de manufactura además puede incluir otros materiales adecuados desde un punto de vista comercial y de usuario, incluyendo otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. Opcionalmente, el artículo de manufactura aquí además comprende un recipiente que comprende un agente diferente al anticuerpo para tratamiento y además comprende instrucciones para tratar al mamífero con este agente, este agente de preferencia es un agente quimioterapéutico o agente inmunosupresor, droga clase interferona tal como IFN-beta-la (REBIF® y AVONEX®) o IFN-beta-lb(BETASERON®) ; un oligopéptido tal como glatiramer acetato (COPAXONE®; un agente citotóxico tal como mitoxantrona (NOVANTRONE®, metotrexato, ciclofosfamida, clorambucil, o azatioprina; inmunoglobulina intravenosa (gamma globulina) ; droga que agota linfocitos (por ejemplo, mitoxantrona, ciclofosfamida, Campath, anti-CD4, o cladribina) ; droga inmune supresora que no agota linfocitos (por ejemplo, micofenolato mofetil (MMF) o ciclosporina) ; droga que reduce el colesterol del tipo "estatina"; estradiol; terapia de reemplazo de hormonas ; droga que trata síntomas secundarios o relacionados a MS (por ejemplo, espasticidad, incontinencia, dolor, fatiga) ; un inhibidor de TNF; droga antirreumática que modifica la enfermedad (DMARD = disease-modifying anti-rheumatic drug) ; droga antiinflamatoria no esferoidal (NSAID = non-steroidal anti-inflammatory drug) ; corticosteroide (por ejemplo metilprednisolona, prednisona, dexametasona o glucorticoide) ; levotiroxina; ciclosporina A; análogo de somatastatina; citocina o antagonista receptor de citocina; anti-metabolito; agente inmunosupresor; antagonista o anticuerpo de integrina (por ejemplo anticuerpo LFA-1, tal como efalizumab o anticuerpo alfa 4 integrina tal como natalizumab) ; y otro anticuerpo marcador de superficie de célula B; etc. Adicionales detalles de la invención se ilustran por los siguientes ejemplos no limitantes. Las descripciones de todas las citas en la especificación se incorporan aquí por referencia expresamente. EJEMPLO 1 TRATAMIENTO DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE PROGRESIVA PRIMARIA (PPMS = PRIMARY PROGRESSIVE MÚLTIPLE SCLEROSIS) Un sujeto con diagnóstico de PPMS como se define por McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001) se trata con un anticuerpo CD20 en este ejemplo. Rituximab, comercialmente disponible de Genentech, se formula para administración IV como un producto estéril en 9.0 mg/mL de cloruro de sodio, 0.7 mg/mL de polisorbato 80, 7.35 mg/mL de citrato de sodio deshidratado y Agua Estéril para Inyección (pH 6.5) . El primer curso de tratamiento consistirá de una dosis de 1 g de Rituximab intravenoso (IV) administrado en cada uno de los Días 1 y 15. Los sujetos recibirán acetaminofen (1 g) y difenhidramina HCl (50 mg) , o equivalente por vía bucal 30-60 minutos antes del inicio de cada infusión.

Cursos subsecuentes de tratamiento se administrarán empezando la Semana 24 (Día 169) , Semana 48 (Día 337) , y Semana 72 (Día 505) . La segunda infusión de cursos subsecuentes de tratamiento será 14 +/- 1 día después de la primera infusión. Sujetos que experimentan un primer relapso pueden recibir tratamiento de rescate con corticosteroides orales o IV. Corticosteroides sistémicos pueden administrarse utilizando un régimen que no excede la exposición o duración de tratamiento apropiado para un relapso de MS . Un relapso se define como todos los siguientes : Una aparición aguda de una anormalidad neurological que persiste por al menos 24 horas . Un cambio no atribuible a fiebre, infección, trauma, medicamentos con concomitantes u otra etiología Un evento con cambio objetivo al examen por investigador de examen ciego, incluyendo un mínimo de cambio de 1-punto en una de las siguientes escalas de FS : piramidal, nervios craneales, cerebelar, sensorial, visión o marcha El siguiente régimen de corticosteroides puede emplearse: 1 g de metilprednisolona IV diariamente por 3 días, seguido por 60 mg de prednisona diariamente por 5 días y disminuir en incrementos de 10-mg cada día posteriormente. Si no está disponible metilprednisolona IV, entonces 150 mg de dexametasona IV diariamente por 3 días puede ser substituida. Solo un curso de corticosteroides habrá de administrarse para una exacerbación . Subsecuentes estudios inmunológicos y exploraciones MRI habrán de obtenerse, al menos 4 semanas después de terminar el régimen de corticosteroide. Inhaladores de corticosteroides (orales y nasales) o inyecciones intra-articulares podrán emplearse. Tratamientos adicionales para combinarse en forma opcional con el anticuerpo CD20 incluyen IFN- ß , glatiramer acetato, metotrexato, ciclofosfamida o mitoxantrona. La medición de resultado de eficacia primaria es el tiempo para avance confirmado de la enfermedad. Un avance de enfermedad se define como un aumento de mayor = a 1.0 punto de la escala de Estado de Incapacidad Expandida de línea base (EDSS = Expanded Disability Status Scale) (Kurtzke J. Neurology 33 (11) : 1444-52 (1983)), si la EDSS de línea base está entre 2.0 y 5.5 puntos (incluyendo) , o un aumento >= a 0.5 puntos si el EDSS de línea base es > = a 5.5 puntos (inclusive), ya que este cambio no es atribuible a otra etiología (por ejemplo, fiebre, enfermedad concurrente, relapso o exacerbación de MS, o medicamento concomitante) . Confirmación del avance de enfermedad puede ocurrir en una visita programada regularmente que es al menos 12 semanas (84 días) después del avance inicial. Medidas de resultados de eficacia secundarios incluyen: - Cambio de línea base a la Semana 96 en el volumen total de lesions T2 en la exploración MRI del cerebro Cambio de línea base a la Semana 96 en volumen de cerebro en exploración MRI del cerebro Opcionalmente, mejora en cualquiera de uno o más de : - Escala Compuesta Funcional de Esclerosis Múltiple (MSFCS = Múltiple Sclerosis Functional Composite Scale) - EDSS Proporción de sujetos con avance de enfermedad confirmado en la Semana 96, como se determina utilizando EDSS Función de extremidades superiores, como se mide por la Prueba de Clavijas en 9-Orificios (una subescala del MSFCS) Ambulantaje, como se mide por el Andar Cronometrado de 7.6 metros (25-pies) (una sub-escala del MSFCS) Cognición, como se mide por la Prueba de Adición Serial Auditiva de Paso Medido (3 segundos solamente; una sub-escala del MSFCS) Volumen total de lesiones T2 del cerebro en exploraciones MRI (Semanas 48 y 122) Volumen total de lesiones TI del cerebro en exploraciones MRI Área en sección transversal de la médula espinal cervical en exploraciones MRI Volumen del cerebro en exploraciones MRI (Semanas 48 y 122) El sujeto tratado con Rituximab como se describe aquí, mostrará mejora en los signos, síntomas u otras indicaciones de PPMS, de acuerdo con cualquiera uno o más de las medidas de resultados anteriores . EJEMPLO 2 TRATAMIENTO DE RELAPSO-REMISIÓN DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE Sujetos con RRMS como se define por McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001) se tratan con un anticuerpo CD20 en este ejemplo, en donde las exposiciones al anticuerpo están espaciadas aproximadamente 6 meses.

Rituximab, comercialmente disponible de Genentech, se formula para administración IV como un producto estéril en 9.0 mg/mL de cloruro de sodio, 0.7 mg/mL de polisorbato 80, 7.35 mg/mL de citrato de sodio deshidratado y Agua Estéril para Inyección (pH 6.5) . El primer curso de tratamiento consistirá de una dosis de 1 g de Rituximab intravenoso (IV) administrada en cada uno de los Días 1 y 15. Sujetos recibirán por la boca, acetaminofen (1 g) y difenhidramina HCl (50 mg) , o equivalente, 30-60 minutos antes del inicio de cada infusión. Cursos de tratamiento subsecuentes se administrarán partiendo de la Semana 24 (Día 169) , Semana 48 (Día 337) , y Semana 72 (Día 505) . La segunda infusión de los cursos de tratamiento subsecuentes será 14 +/- 1 días después de la primera infusión. De preferencia Rituximab es el único agente administrado para tratar RRMS. Sin embargo, los sujetos pueden recibir opcionalmente corticosteroides en forma oral o IV, IFN- ?, glatiramer acetato, metotrexato, ciclofosfamida o mitoxantrona. Sujetos que experimentan un primer relapso puede recibir tratamiento de rescate con corticosteroides IV u orales. Corticosteroides sistémicos pueden administrarse utilizando un régimen que no excede exposición o duración de tratamiento apropiada para un relapso MS . Un relapso en este ejemplo se define como: La aparición de nuevos o recurrentes síntomas neurológicos consistentes con MS que duran más de 48 horas en un sujeto que ha estado relativamente estable o mejora el estado neurológico por al menos 30 días. El cambio en síntomas neurológicos debe acompañarse por empeoramiento neurológico objetivo consistente con un aumento de al menos la mitad de un escalón en el EDSS, o 2 puntos en una de las calificaciones de sistema funcional apropiadas (FSS) , o 1 punto en dos o más de las FSS apropiadas. El cambio debe verificarse por el investigador examinador y debe afectar las escalas FS selectas (es decir, piramidal, marcha, cerebelar, tallo cerebral, sensorial o visual) . Los síntomas deben persistir por >= a 24 horas y no deberán ser atribuibles a factores clínicos confusos (por ejemplo, fiebre, infección, lesión, reacciones adversas con medicamentos concomitantes) . Un solo episodio de un síntoma paroxismal (por ejemplo espamo tónico) no es un relapso, pero el nuevo inicio de múltiples ocurrencias de un síntoma paroxismal durante al menos 24 horas, puede ser un relapso si se acompaña por nuevas manifestaciones objetivas correspondientes.

Síntomas sensoriales sin cambio en examen clínico, fatiga, cambio de estado anímico o urgencia intestinal o de vejiga o incontinencia no serán suficientes para establecer un relapso. La medición de resultado de eficacia primario es el punto extremo de MRI de lesiones que mejoran gadolinio, o el tiempo para avance de enfermedad confirmado (definido como un aumento de _> 1.0 punto de la escala de estado de incapacidad expandida de línea base (EDSS); Kurtzke J. Neurology 33 (11) : 1444-52 (1983)). El punto extremo de eficacia primaria puede ser el número total de lesiones TI que mejoran gadolinio observadas en exploraciones MRI en serie del cerebro en las semanas 12, 16, 20, y 24. Medidas de resultados de eficacia secundarios incluyen frecuencia de relapso; cambio de línea base a semana 96 en volumen total de lesiones T2 en exploración MRI del cerebro (por ejemplo cambio en volumen total de lesiones T2 en exploraciones MRA del cerebro de supervisión a las semanas 24 y 36) ; cambio en volumen del cerebro de línea base a la semana 96 en exploración MRI del cerebro; escala compuesta funcional de esclerosis múltiple (MSFCS) y sus subescalas; función de extremidades superiores, como se mide por la prueba de clavijas en 9 orificios (una subescala de MSFCS) ; ambulantaje como se mide por la caminata cronometrada de 7.6 metros (25 pies) (una subescala de MSFCS); cuestionario de calidad de vida de esclerosis múltiple- 54 (MSQOL-54) ; volumen total de lesiones TI del cerebro en exploraciones MRI (por ejemplo número total de lesiones TI con mejora de gadolinio observadas en exploraciones MRA en serie del cerebro en las semanas 20, 28 y 36) ; área en sección transversal de la médula espinal cervical en exploraciones MRI; proporción de relapso de sujetos en las semanas 24 (es decir entre la semana 20 y 24) y 36 (es decir entre la semana 0 y semana 36) ; la medida de actividad única combinada en la semana 24 y 36. El paciente tratado con Rituximab como se describió anteriormente exhibirá una mejora en cualquiera una o más medidas de los resultados anteriores . EJEMPLO 3 TRATAMIENTO DE RELAPSO-REMISIÓN DE ESCLEROSIS MÚLTIPLE Un sujeto con RRMS como se define por McDonald et al. Ann Neurol 50:121-7 (2001) se trata con un anticuerpo CD20 aquí. En este ejemplo, las exposiciones de anticuerpos están separadas aproximadamente un año. Rituximab, comercialmente disponible de Genentech, se formula para administración IV como un producto estéril en 9.0 mg/mL de cloruro de sodio, 0.7 mg/mL de polisorbato 80, 7.35 mg/mL de citrato de sodio deshidratado y agua estéril por inyección (pH 6.5) . El primer curso de tratamiento consistirá de una dosis de 1 g de Rituximab intravenoso (IV) administrada en cada uno de los días 1 y 15. Los sujetos recibirán acetaminofen (1 g) y difenhidramina HCl (50 mg) , o equivalente por vía bucal, 30 a 60 minutos antes del inicio de cada infusión. Cursos de tratamiento subsecuentes se administrarán partiendo de la semana 48 y semana 96. La segunda infusión de los cursos de tratamientos subsecuentes será 14 + - un día después de la primera infusión. De preferencia Rituximab es el único agente administrado para tratar RRMS. Sin embargo, los sujetos pueden recibir en forma opcional corticoesteroides de forma oral o IV, IFN-beta, acetato de glatiramer, metotrexato, ciclofosfamida o mitoxantrona. Sujetos que experimentan un primer relapso pueden recibir tratamiento de rescate con corticoesteroides en forma oral o IV. Corticoesteroides sistémicos pueden administrarse utilizando un régimen que no excede la exposición o duración de tratamiento apropiada para un relapso de MS . Un relapso en este ejemplo se define como: La aparición de síntomas neurológicos nuevos o recurrentes consistentes con MS que dura más de 48 horas en un sujeto que se ha encontrado en un estado neurológico relativamente estable o de mejora por al menos 30 días. El cambio en síntomas neurológicos debe estar acompañado por empeoramiento neurológico objetivo consistente con aumento de al menos la mitad de un escalón en EDSS o 2 puntos en una de las calificaciones de sistema funcional apropiado (FSS) o un punto en dos o más de FSS apropiado. El cambio debe verificarse por el investigador examinador y debe afectar las escalas FS selectas (es decir piramidal, marcha, cereberal, tallo cerebral, sensorial o visual) . Los síntomas deben persistir por 24 horas y no deberán ser atribuibles a factores clínicos de confusión (por ejemplo fiebre, infección, lesión, reacciones adversas a medicamentos concomitantes) . Un solo episodio de un síntoma paroxismal (por ejemplo espasmo tónico) no es un relapso, pero el nuevo inicio de múltiples ocurrencias de un síntoma paroxismal durante al menos 24 horas puede ser un relapso que está acompañado por nuevas manifestaciones objetivas correspondientes . Síntomas sensoriales sin cambio en examen clínico, fatiga, cambio de estado anímico o urgencia o incontinencia de vejiga o intestinal no serán suficientes para establecer un relapso.

La medida de resultado de eficacia primarios es el punto extremo MRI de lesiones con mejora de gadolinio, o tiempo para avance de enfermedad confirmado (definido como un aumento de _> 1.0 punto de escala de estado de incapacidad expandida de línea base (EDSS) ; Kurtzke J. Neurology 33 (11) : 1444-52 (1983)). El punto extremo de eficacia primaria puede ser el número total de lesiones TI con mejora de gadolinio observados en exploraciones MRI en serie del cerebro en las semanas 12, 16, 20, y 24. Medidas de resultados de eficacia secundaria incluyen frecuencia de relapso; cambio de línea base a la semana 96 en el volumen total de lesiones T2 en exploración MRI del cerebro (por ejemplo cambio en volumen total de lesiones T2 en exploraciones MRA del cerebro, de supervisión a las semanas 24 y 36) ; cambio de línea base a la semana 96 en volumen del cerebro en exploración MRI del cerebro; escala compuesta funcional de esclerosis múltiple (MSFCS) y sus subescalas; función de extremidades superiores, como se mide por la prueba de clavijas de 9 agujeros (una subescala de MSFCS) ; ambulantaje, como se mide por la caminata cronometrada de 7.6 metros (25 pies) (una subescala de MSFCS); cognición, como se mide por la prueba de adición serial auditiva de paso medido (una subescala de MSFCS) ; cuestionario de calidad de vida de esclerosis múltiple-54 (MSQOL-54) ; volumen total de lesiones TI del cerebro en exploraciones MRI (por ejemplo número total de lesiones TI con mejora de gadolinio observadas en exploraciones MRA en serie de los cerebros en las semanas 20,28 y 36); área en sección transversal de la médula espinal cervical en exploraciones MRI; proporción de sujetos con relapso en la semana 24 (es decir entre la semana 0 y la semana 24) y semana 36 (es decir entre la semana 0 y la semana 36) ; la medida de actividad única combinada en las semanas 24 y 36. El paciente tratado con lo anterior con Rituximab exhibirá una mejora en cualquiera una o más de las medidas de resultados anteriores . EJEMPLO 4 VARIANTES 2H7 HUMANIZADAS Este ejemplo describe variantes de anticuerpo 2H7 humanizadas para utilizar en los métodos descritos aquí. El anticuerpo 2H7 humanizado de preferencia comprende una, dos, tres, cuatro, cinco o seis de las siguientes secuencias CDR: Secuencia CDR Ll RASSSVSYXH en donde X es M o L (SEQ ID NO. 18) , por ejemplo SEQ ID NO: 4 (Fig. ÍA) , Secuencia CDR L2 de SEQ ID NO: 5 (Fig. ÍA) , Secuencia CDR L3 QQWXFNPPT en donde X es S o A (SEQ ID NO. 19) , por ejemplo SEQ ID NO: 6 (Fig. ÍA) , Secuencia CDR Hl de SEQ ID NO: 10 (Fig. IB), Secuencia CDR H2 de AIYPGNGXTSYNQKFKG en donde X es D o A (SEQ ID NO. 20), por ejemplo SEQ ID NO: 11 (Fig. IB) , y Secuencia CDR H3 de WYYSXXYWYFDV en donde la X en la posición 6 es N, A, Y, W o D, y la X en la posición 7 es S o R (SEQ ID NO. 21) , por ejemplo SEQ ID NO: 12 (Fig. IB) . Las secuencias CDR anteriores en general están presentes dentro de las secuencias de marco de lectura ligero, variable y pesado variable humanos, tales como sustancialmente los residuos FR de consenso humano del subgrupo kappa de cadena ligera humana I (VL6I) , y sustancialmente los residuos Fr de consenso humano del subgrupo de cadena pesada humana III (VHIII) . Ver también WO 2004/056312 (Lowman et al.). La región pesada variable puede unirse a la región constante de cadena IgG humana, en donde la región puede ser por ejemplo IgGl o IgG3 , incluyendo regiones constantes de variantes y de secuencia nativa. En una modalidad preferida, este anticuerpo comprende la secuencia de dominio pesado variable de SEQ ID NO: 8 (vl 6, como se ilustra en Fig. IB), opcionalmente también comprende la secuencia dominio ligero variable de de SEQ ID NO: 2 (vl6, como se muestra en Fig. ÍA) , que opcionalmente comprende una o más sustituciones de aminoácido en las posiciones 56,100, y/o 100a, por ejemplo D56A, N100A o N100Y, y/o SlOOaR en el dominio pesado variable y una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 32 y/o 92, por ejemplo M32L y/o S92A, en el dominio ligero variable. De preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo intacto que comprende las secuencias de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NOs. 13 o 16, y secuencias de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO. 14,15, 17, 22 o 25. Un anticuerpo 2H7 humanizado preferido es ocrelizumab (Genentech) . El anticuerpo presente además puede comprender cuando menos una sustitución de aminoácidos en la región Fc que mejora la actividad ADCC, tal como aquella en donde las sustituciones de aminoácidos están las posiciones 298, 333, y 334, de preferencia S298A, E333A, y K334A, utilizando numeración Eu de residuos de cadena pesada. Ver también patente de los E.U.A. Número 6,737,056B1, Presta. Cualquiera de estos anticuerpos puede comprender cuando menos una sustitución en la región Fc que mejora el enlace FcRn o vida media en suero, por ejemplo una sustitución en la posición de cadena pesada 434, tal como N434W. Ver también la patente de los E.U.A. Número 6,737,056B1, Presta. Cualquiera de estos anticuerpos puede además comprender cuando menos una sustitución de aminoácidos en la región Fc que aumente la actividad CDC, por ejemplo que comprende al menos una sustitución en la posición 326, de preferencia K326A o K326W. Ver también la patente de los E.U.A. Número 6,528,624B 1 (Idusogie et al.). Algunas variantes 2H7 humanizadas preferidas son aquellas que comprenden el dominio ligero variable de SEQ ID NO: 2 y el dominio pesado variable de SEQ ID NO: 8, incluyendo aquellas con o sin sustituciones en una región Fc (de estar presente) , y aquellas que comprenden un dominio pesado variable con alteración N100A; o D56A y N100A; o D56A, N100Y, y SlOOaR; en SEQ ID NO: 8 y un dominio ligero variable con alteración M32L; o S92A; o M32L y S92A; en SEQ ID NO: 2. M34 en el dominio pesado variable de 2H7.vl6 se ha identificado como una fuente potencial de estabilidad de anticuerpo y es otro candidato potencial para sustitución. En un compendio de algunas diversas modalidades preferidas de la invención, la región variable de variantes con base en 2H7.vl6 comprende las secuencias de aminoácidos de vl6 excepto en las posiciones de sustituciones de aminoácido que se indican en la siguiente tabla. A menos que se indique de otra forma, las variantes 2H7 tendrán la misma cadena ligera que la de vl6. Variantes de anticuerpo 2H7 humanizadas ejemplares Un 2H7 humanizado preferido comprende la secuencia de dominio ligero variable 2H7.vl6: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMH YQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQ SFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO : 2 ) ; y 2H7.vl6 la secuencia de dominio pesado variable: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGNGDTSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARVVYYSNSYWYFDV GQGTLVTV SS (SEQ ID NO: 8) . En donde el anticuerpo 2H7.vl6 humanizado es un anticuerpo intacto, puede comprender la secuencia de aminoácido de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYMHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFATYVCQQ SFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFWPPSDEQLKSG TASWCLLNNFVPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKH KVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ( SEQ ID NO : 13 ) ; y la secuencia de aminoácido de cadena pesada de SEQID NO. 14 o: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMH VRQAPGKGLE VGAIYPGNGDTSY NQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSNSYWYFDVWGQGTLVTV SSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRV VSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVS LTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGNVFSCS VMHEALHNHYTQKSLSLSPG ( SEQ ID NO : 22 ) . Otro anticuerpo 2H7 humanizado preferido comprende la secuencia de dominio ligero variable 2H7.V511: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSS SYLHWYQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGV P SRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWAFNPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 23) y 2H7.v511 secuencia de dominio pesado variable: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMHWVRQAPGKGLEWVGAIYPGN GATSYNQKFKGRFTISVDKSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARWYYSYRYWYFDVWGQ GTLVTVSS (SEQ ID NO. 24) . En donde el anticuerpo 2H7.V15 humanizado es un anticuerpo intacto puede comprender la secuencia de aminoácidos de cadena ligera: DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASSSVSYLH YQQKPGKAPKPLIYAPSNLASGVPSRFSGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQAFNPPTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGT ASWCLLNNFYFREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 16) y la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO. 17 o: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGYTFTSYNMH VRQAPGKGLE VGAIYPGNGATSY NQKFKGRFT I S VDKS KNTLYLQMNS LRAEDTAVYYCARWYVS YR YWYFDVWGQGTL VT VS SASTKGPS VFPLAPS SKSTSGGTAALGCLVKDYFPE PVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS S GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY-NATYR WSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNAALPAPIAATISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQ VSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFS CSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG ( SEQ ID NO . 25 ) .

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar esclerosis múltiple en un sujeto, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva de un anticuerpo CD20 al sujeto, para proporcionar una exposición inicial de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos, seguida por una segunda exposición de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos, la segunda exposición no se proporciona hasta 16 a 60 semanas a partir de la exposición inicial y cada una de las exposiciones de anticuerpos se proporciona al sujeto como una o dos dosis de anticuerpo. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la segunda exposición no se proporciona sino hasta de aproximadamente 20 a 30 semanas a partir de la exposición inicial . 3. El método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque las exposiciones de anticuerpo inicial y segunda cada una se proporcionan en cantidades de aproximadamente 1.5 a 2.5 gramos . 4. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, caracterizado porque adicionalmente comprende administrar al sujeto una cantidad efectiva del anticuerpo CD20, para proporcionar una tercera exposición de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos, la tercera exposición no se administra sino hasta de aproximadamente 46 a 60 semanas a partir de la exposición inicial. 5. El método de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la tercer exposición de anticuerpo se proporciona en una cantidad de aproximadamente 1.5 a 2.5 gramos . 6. El método de conformidad con la reivindicación 4 o 5, caracterizado porque la tercera exposición no se proporciona hasta de aproximadamente 46 a 54 semanas a partir de la exposición inicial. 7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizado porque no se proporciona adicional exposición de anticuerpo sino hasta al menos aproximadamente 70 a 75 semanas a partir de la exposición inicial. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la segunda exposición no se proporciona sino hasta de aproximadamente 46 a 60 semanas a partir de la exposición inicial . 9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque cada uns de las exposiciones de anticuerpo se proporciona al sujeto como una dosis de anticuerpo. 10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque cada uno de las exposiciones de anticuerpo se proporciona al sujeto como dos dosis de anticuerpo, en donde las dos dosis constituyen una primera dosis y una segunda dosis. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la segunda dosis se administra de aproximadamente 3-17 días a partir del tiempo que se administró la primera dosis . 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la segunda dosis se administra de aproximadamente 6-16 días a partir del tiempo que se administró la primer dosis. 13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la segunda dosis se administra de aproximadamente 13-16 días a partir del tiempo en que se administró la primer dosis . 14. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque la primera y segunda dosis de anticuerpo son cada una de aproximadamente 0.5 a 1.5 gramos . 15. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 14, caracterizado porque la primera y segunda dosis de anticuerpo son cada una de aproximadamente 0.75 a 1.3 gramos. 16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque tres o más exposiciones de anticuerpo se administran al sujeto. 17. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado porque cuatro o más exposiciones de anticuerpo se administran al sujeto. 18. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, caracterizado porque se administra un segundo medicamento con la exposición inicial o exposiciones posteriores, en donde el anticuerpo CD20 es un primer medicamento. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el segundo medicamento se elige del grupo que consiste de una interferona, acetato de glatiramer, un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, mitoxantrona, metotrexato, ciclofosfamida, clorambucil, azatioprina, gamma globulina, Campath, anti-CD4, cladribina, corticosteroide, micofenolato mofetil (MMF) , ciclosporina, droga para reducción de colesterol de la clase estatina, estradiol, testosterona, droga de reemplazo de hormonas, un inhibidor de TNF, una droga anti-reumática modificadora de enfermedad (DMARD) , droga antiinflamatoria no esteroidal (NSAID) , levotiroxina, ciclosporina A, análogo de somatastatina, citocina o antagonista receptor de citocina, anti-metabolito, agente inmunosupresor, antagonista o anticuerpo de integrina, anticuerpo LFA-1, efalizumab, anticuerpo alfa 4 integrina, natalizumab, y otro anticuerpo marcador de superficie de célula B. 20. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la esclerosis múltiple es esclerosis múltiple de relapso-remisión (RRMS) . 21. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, caracterizado porque la esclerosis múltiple es esclerosis múltiple progresiva primaria (PPMS) . 22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, caracterizado porque el sujeto nunca ha sido tratado previamente con un anticuerpo CD20. 23. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo desnudo. 2 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, caracterizado porque el anticuerpo está conjugado con otra molécula. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la otra molécula es un agente citotóxico. 26. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque el anticuerpo se administra intravenosamente. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque el anticuerpo se administra intravenosamente para cada exposición de anticuerpo . 28. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque el anticuerpo se administra subcutáneamente. 29. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, caracterizado porque el anticuerpo se administra intratecalmente . 30. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 29, caracterizado porque el anticuerpo CD20 es el único medicamento administrado al sujeto para tratar esclerosis múltiple. 31. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el anticuerpo es Rituximab. 32. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el anticuerpo es 2H7 humanizado que comprende las secuencias de dominio variable en SEQ ID NOS . 2 y 8. 33. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 30, caracterizado porque el anticuerpo 2H7 humanizado que comprende las secuencias de dominio variable en SEQ ID NOS. 23 y 24. 3 . El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizado porque el sujeto tiene proteína básica anti-mielina elevada (MBP) , glicoproteína oligodendrocito anti-mielina (MOG) , anti-gangliósido y/o uno o varios niveles de anticuerpo anti-neurofilamentarios . 35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 34, caracterizado porque los niveles elevados de células B están presentes en fluido cerebroespinal (CSF) , lesión de esclerosis múltiple o suero del sujeto. 36. Un artículo de manufactura, caracterizado porque comprende: (a) un recipiente que comprende un anticuerpo CD20; y (b) un inserto de paquete o empaque, con instrucciones para tratar esclerosis múltiple en un sujeto, en donde las instrucciones indican que una cantidad del anticuerpo se administra al sujeto que es efectiva para proporcionar una exposición inicial de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos seguido por una segunda exposición de anticuerpo de aproximadamente 0.5 a 4 gramos, la segunda exposición no se administra sino hasta de aproximadamente 16 a 60 semanas a partir de la exposición inicial, y cada uno de las exposiciones de anticuerpo de proporciona al sujeto como una o dos dosis de anticuerpo. 37. El artículo de conformidad con la reivindicación 36, caracterizado porque además comprende un recipiente que comprende un segundo medicamento, en donde el anticuerpo CD20 es un primer medicamento y además comprende instrucciones en el inserto de empaque para tratar al sujeto con el segundo medicamento. 38. El artículo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el segundo medicamento se elige del grupo que consiste de interferona, acetato de glatiramer, un agente citotóxico, un agente quimioterapéutico, mitoxantrona, metotrexato, ciclofosfamida, clorambucil, azatioprina, gamma globulina, Campath, anti-CD4, cladribina, corticosteroide, micofenolato mofetil (MMF) , ciclosporina, droga para reducción de colesterol de la clase estatina, estradiol, testosterona, droga de reemplazo de hormonas, un inhibidor de TNF, una droga anti-reumática modificadora de enfermedad (DMARD) , droga antiinflamatoria no esteroidal (NSAID) , levotiroxina, ciclosporina A, análogo de somatastatina, citocina o antagonista receptor de citocina, anti-metabolito, agente inmunosupresor, y otro anticuerpo marcador de superficie de célula B.