KR20080075044A

KR20080075044A - Ｃｄ20에 결합하는 길항제를 사용한 외래 항원에 대한 면역반응 차단 방법

Info

Publication number: KR20080075044A
Application number: KR1020087018967A
Authority: KR
Inventors: 안토니오 제이. 그릴로-로페즈; 로리 에이. 쿤켈; 티모시 에이. 스튜어트
Original assignee: 제넨테크, 인크.; 아이덱 파마슈티칼즈 인코포레이티드
Priority date: 1999-07-12
Filing date: 2000-07-10
Publication date: 2008-08-13
Also published as: CA2379274A1; ZA200200272B; NO20020128L; MXPA02000419A; WO2001003734A1; AU778863B2; JP2003528805A; IL147547A0; PL352758A1; AU2005201189A1; NZ516491A; CN1373672A; NO20020128D0; BR0013201A; HK1047702A1; CN101264324A; HUP0202238A2; AU6082500A; HUP0202238A3; AU2005201189B2

Abstract

본 발명은 CD20에 결합하는 길항제를 사용하여 포유동물에서 외래 항원에 대한 면역 반응을 차단하는 방법에 관한 것이다.

외래 항원, 림프구, 길항제.

Description

ＣＤ20에 결합하는 길항제를 사용한 외래 항원에 대한 면역 반응 차단 방법 {Blocking Immune Response to a Foreign Antigen Using an Antagonist Which Binds to CD20}

림프구는 조혈 반응 동안 골수에서 생산되는 많은 유형의 백혈구 세포 중 하나이다. 림프구에는 두 가지 주요 군, 즉 B 림프구 (B 세포)와 T 림프구 (T 세포)가 있다. 본원에서 특히 관심의 대상이 되는 림프구는 B 세포이다.

B 세포는 골수내에서 성숙하며 골수를 떠나서는 그의 세포 표면상에 항원 결합성 항체를 발현시킨다. 무경험 B 세포가 그의 막결합 항체에 대해 특이적인 항원과 처음 마주하게 되면, 이 세포는 급속하게 분열하기 시작하며, 그의 자손은 "혈장 세포"라 불리는 기억 B 세포 및 작용성 세포로 분화하게 된다. 기억 B 세포는 더 긴 수명을 가지며 본래의 모 세포와 동일한 특이성을 갖는 막결합 항체를 지속적으로 발현시킨다. 혈장 세포는 막결합 항체를 생산하지 않는 대신 분비될 수 있는 형태의 항체를 생산한다. 분비 항체는 체액성 면역의 주요 작용성 분자이다.

CD20 항원 (인간 B-림프구에 제한된 분화 항원, 즉 Bp35라고도 함)은 예비-B 림프구 및 성숙 B 림프구상에 위치하는 약 35 kD의 분자량을 갖는 소수성 막횡단 단백질이다(Valentine et al. J. Biol. Chem. 264 (19): 11282-11287 (1989); and Einfeld et al. EMBO J. 7 (3): 711-717 (1988)). 이 항원은 또한 90%를 넘는 B 세포 비-호지킨(non-Hodgkin's) 림프종(NHL)에서 발현되지만(Anderson et al. Blood 63 (6): 1424-1433 (1984)), 조혈간세포, 전-B 세포, 정상 혈장 세포 또는 기타 정상 조직에는 존재하지 않는다(Tedder et al. J Immunol. 135 (2): 973-979 (1985)). CD20은 세포 주기의 개시 및 분화의 활성화 과정의 초기 단계를 조절하며(Tedder et al., supra), 칼슘 이온 채널로서 작용할 수도 있다(Tedder et al., J Cell. Biochem. 14D: 195 (1990)).

B 세포 림프종에서의 CD20의 발현에 있어서, 이 항원은 그러한 림프종을 "표적화"하는 후보로서 작용할 수 있다. 본질적으로, 이러한 표적화는 다음과 같이 일반화될 수 있다: B 세포의 CD20 표면 항원에 대해 특이적인 항체를 환자에게 투여한다. 이 항-CD20 항체는 (표면상으로) 정상 및 악성 B 세포 둘 다의 CD20 항원에 특이적으로 결합하며, CD20 표면 항원에 결합된 항체는 종양성 B 세포의 파괴 및 사멸을 초래할 수 있다. 또한, 종양을 파괴시킬 잠재력을 갖는 화학 물질 또는 방사성 표지를 항-CD20 항체에 연결하여 이 물질이 종양성 B 세포에 특이적으로 "전달"되도록 할 수 있다. 이러한 연구와는 무관하게, 주요 목표는 종양을 사멸시키는 것이고, 특정 방법은 이용되는 특정 항-CD20 항체에 의해 결정할 수 있으며, 따라서 CD20 항원을 표적화하는 이용가능한 방법은 상당히 다를 수 있다.

리툭시맵(rituximab) (RITUXAN(등록상표)) 항체는 CD20 항원에 대해 지시되는 유전적으로 조작된 키메라 쥐/인간 모노클로날 항체이다. 리툭시맵은 1998년 4월 7일 허여된 미국 특허 제5,736,137호(Anderson et al.)에서 "C2B8"이라 불리는 항체이다. 리툭산(RITUXAN(등록상표))은 재발성 또는 불응성 저급 또는 소포의 CD20 양성 B 세포 비-호지킨 림프종을 앓는 환자의 치료를 위해 지시된다. 시험관내 작용 메카니즘 연구에 의해 리툭산(RITUXAN(등록상표))이 인간 보체와 결합하여 보체-의존성 세포독성(CDC)을 통해 림프계 B 세포주를 용해시킨다는 사실이 입증되었다(Reff et al. Blood 83 (2): 435-445 (1994)). 또한, 리툭산은 항체-의존성 세포의 세포독성(ADCC) 분석에 있어서 상당한 활성을 나타낸다. 보다 최근에는, 리툭산(RITUXAN(등록상표))이 삼중수소화 티미딘 혼입 분석에서 항-증식 효과를 가지며 아폽토시스를 직접 유도하지만, 다른 항-CD20 항체는 그렇지 못한 것으로 밝혀졌다(Maloney et al. Blood 88 (10): 637a (1996)). 또한, 리툭산(RITUXAN(등록상표)) 및 화학요법 및 독소 사이의 상승작용은 실험적으로 관찰되었다. 특히, 리툭산(RITUXAN(등록상표))은 독소루비신, CDDP, VP-16, 디프테리아 독소 및 리신의 세포독성 효과에 대하여 약물-내성인 인간 B 세포 림프종 세포주를 감응화한다(Demidem et al. Cancer Chemotherapy & Radiopharmaceuticals 12 (3): 177-186 (1997)). 생체내 임상전 연구 결과, 리툭산(RITUXAN(등록상표))은 시노몰구스(cynomolgus) 원숭이의 말초 혈류, 림프절 및 골수로부터 아마도 보체 및 세포-매개 반응을 통해 B 세포를 사멸시키는 것으로 밝혀졌다(Reff et al. Blood 83 (2): 435-445 (1994)).

본 발명의 목적은 CD20에 결합하는 길항제를 악성 종양을 앓지 않는 포유동물에게 치료 유효량으로 투여하여, 상기 포유동물에서 외래 항원에 대한 면역 반응을 차단하는 방법을 제공하는 것이다.

<발명의 개요>

제1 측면으로, 본 발명은 CD20에 결합하는 길항제를 악성 종양을 앓지 않는 포유동물에게 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 외래 항원에 대한 면역 반응을 차단하는 방법을 제공한다.

다른 측면으로, 본 발명은 CD20에 결합하는 길항제 이외의 치료제 및 CD20에 결합하는 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 치료제는 상기 포유동물에서 면역원성이고 상기 길항제는 포유동물에서 상기 치료제에 대한 면역 반응을 차단시키는 것인, 포유 동물의 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 CD20에 결합하는 길항제를 포유동물에게 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 이식편-대-숙주 또는 숙주-대-이식편 질환의 치료 방법을 추가로 제공한다.

또한, 본 발명은 CD20에 결합하는 길항제를 이식을 받으려 하는 포유동물에게 치료 유효량 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물을 비감응화하는 방법을 제 공한다.

본 발명은 또한 상기 방법들에 사용되는 제품에 관한 것이다. 예를 들어, 이 제품은 용기, 이 용기에 포함된, CD20에 결합하는 길항제를 포함하는 조성물, 및 이 조성물을 사용하여 외래 항원에 노출되었거나 노출될 환자를 치료할 것을 지시하는 포장 삽입물을 포함할 수 있다. 이 제품은 임의로 제2의 용기, 및 이 용기에 함유된, 치료제를 포함하는 제2 조성물을 추가로 포함한다.

<발명의 상세한 설명>

I. 정의

"CD20" 항원은 말초 혈류 또는 림프계 기관 유래의 B 세포의 90%를 넘는 세포의 표면상에 존재하는 약 35 kDa 크기의 비-글리코실화된 인단백질이다. CD20은 예비-B 세포의 발달 초기 동안 발현되어 혈장 세포의 분화시까지 존재한다. CD20은 정상의 B 세포뿐 아니라 악성 B 세포 둘 다에 존재한다. 문헌에서는 CD20에 대하여 "B-림프구에 제한된 항원" 및 "Bp35"라는 다른 이름으로 기록되어 있다. CD20 항원은 예를 들어 문헌[Clark et al. PNAS (USA) 82: 1766 (1985)]에 기재되어 있다.

"외래 항원"이란 포유동물이 노출되는, 내생적이거나 천연의 것이 아닌 분자 또는 분자들을 의미한다. 외래 항원은 포유동물에서 면역 반응, 예를 들어, 체액성 반응 및(또는) T 세포 매개 반응을 유도할 수 있다. 일반적으로, 외래 항원은 그에 대한 항체의 생산을 촉진시킬 것이다. 본원에서 고려되는 외래 항원의 예로는 면역 치료제, 예를 들어 항체, 특히 비-인간 아미노산 잔기를 포함하는 항체 (예를 들어, 설치류, 키메라/인간화 및 영장류의 항체) 등의 단백질; 독소 (항체 등과 같이 면역원성일 수도 있는 표적화 분자에 임의로 연결됨); 유전자 요법 바이러스 벡터, 예를 들어 레트로바이러스 및 아데노바이러스; 이식편; 감염성 물질 (예를 들어, 박테리아 및 바이러스); 동종항원 (즉, 일부에는 존재하지만 같은 종의 다른 구성원에는 존재하지 않는 항원) 예를 들어 혈액형에서의 차이, 인간 림프구 항원 (HLA), 혈소판 항원, 이식된 기관에서 발현되는 항원, 혈액 성분, 임신 (Rh), 및 혈우병 인자 (예를 들어, 인자 VIII 및 인자 IX)가 포함된다.

외래 항원에 대하여 "면역 반응을 차단하는 것"이란 외래 항원에 대한 노출로부터 발생하는 하나 이상의 면역 매개 반응을 감소시키거나 방지하는 것을 의미한다. 예를 들어, 포유동물에서 항원에 대하여 지시되는 항체의 생산을 방지하거나 감소시킴으로써 외래 항원에 대한 체액성 반응을 감소시킬 수 있다. 별법으로 또는 추가적으로, 이디오타입을 억제하고 동종항체로 코딩된 세포의 제거를 "완화"하고(하거나) 항원-제시 세포의 사멸을 통해 동종항원의 제공에 영향을 줄 수 있다.

본원에서 치료될 포유동물은 일반적으로 "악성 종양을 앓지 않는" 동물이며, 따라서 악성 종양 또는 암, 예를 들어, B 세포 림프종, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 모세포 백혈병, 만성 골수모세포성 백혈병 또는 이식후 림프증식성 질환(PTLD)에 걸린 것으로 진단되지 않은 동물이다.

"치료제"라는 용어는 환자에서 질병 또는 질환의 치료에 사용되는 화합물 또는 조성물을 의미한다. 치료제는 예를 들어 항체와 같은 폴리펩티드; 독소 (임의 로 항체와 같은 표적화 분자에 연결됨); 유전자 요법 바이러스 벡터 및(또는) 혈우병 인자 (예를 들어, 인자 VIII 또는 인자 IX)를 포함할 수 있다. 치료제는 일반적으로 대상 질병 또는 질환의 치료를 위한 치료 유효량으로 포유동물에게 투여되며, 여기서 치료 유효량이란 치료될 포유동물에서 치료제에 의해 유도되는 면역 반응을 일으키는 양을 말한다.

본원에 사용된 바와 같이, "폴리펩티드"란 일반적으로 약 10개 이상의 아미노산을 갖는 펩티드 및 단백질을 의미한다. 포유동물 폴리펩티드의 예로는 레닌, 인간 성장 호르몬, 소 성장 호르몬을 비롯한 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 인자, 부갑상선 호르몬, 갑상선 자극 호르몬; 지단백질; 1-안티트립신; 인슐린 A-쇄; 인슐린 B-쇄; 프로인슐린; 트롬보포이에틴; 여포 자극 호르몬; 칼시토닌; 황체형성 호르몬; 글루카곤; 혈액응고인자, 예를 들어, 인자 VIIIC, 인자 IX, 조직 인자, 및 폰 빌레브란트(von Willebrands) 인자; 항-응고 인자, 예를 들어, 단백질 C; 심방성 나트륨이뇨인자; 폐 계면활성제; 플라스미노겐 활성자, 예를 들어, 유로키나제 또는 인간 뇨 또는 조직-유형 플라스미노겐 활성자(t-PA); 봄베신; 트롬빈; 혈구 성장 인자; 종양 괴사 인자-알파 및 -베타; 엔케팔리나제; 혈청 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민; 뮐러리안-억제 물질; 릴렉신 A-쇄; 릴렉신 B-쇄; 프로릴렉신; 마우스 성선자극호르몬-관련 펩티드; 미생물 단백질, 예를 들어, 베타-락타마제; DNase; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자 (VEGF); 호르몬 또는 성장 인자에 대한 수용체; 인테그린; 단백질 A 또는 D; 류마티스양 인자; 신경영양 인자, 예를 들어, 뇌-유래의 신경영양 인자 (BDNF), 뉴로트로핀-3, -4, -5 또는 -6 (NT-3, NT-4, NT-5 또는 NT-6), 또는 신경 성장 인자, 예를 들어, NGF; 카디오트로핀 (심장 비대증 인자), 예를 들어, 카디오트로핀-1 (CT-1); 혈소판-유래 성장 인자 (PDGF); 섬유아세포 성장 인자, 예를 들어, aFGF 및 bFGF; 상피 성장 인자 (EGF); 변형 성장 인자 (TGF), 예를 들어, TGF-1, TGF-2, TGF-3, TGF-4 또는 TGF-5를 비롯한 TGF-알파 및 TGF-베타; 인슐린-유사 성장 인자-I 및 -II (IGF-I 및 IGF-II); des(1-3)-IGF-I (뇌 IGF-I), 인슐린-유사 성장 인자 결합 단백질; CD 단백질, 예를 들어, CD3, CD4, CD8 및 CD20; 에리트로포이에틴; 골유도 인자; 면역독소; 골 형태형성 단백질 (BMP); 인터페론, 예를 들어, 인터페론-알파, -베타 및 -감마; 혈청 알부민, 예를 들어, 인간 혈청 알부민 (HSA) 또는 소 혈청 알부민 (BSA); 콜로니 자극 인자 (CSF), 예를 들어, M-CSF, GM-CSF 및 G-CSF; 인테루킨 (IL), 예를 들어, IL-1 내지 IL-10; 사이토카인 (하기 참조); 수퍼옥사이드 디스뮤타제; T-세포 수용체; 표면 막 단백질; 쇠퇴 촉진 인자; 바이러스 항원, 예를 들어, AIDS 엔벨로프의 일부; 운반 단백질; 귀소 수용체; 어드레신; 조절 단백질; 항체; 및 상기 나열된 임의 폴리펩티드의 단편 또는 변이체와 같은 분자가 포함된다.

본원에 사용된 "이식편"이란 용어는 수용자로의 이식에 있어서 공여자로부터 유도되는 생물학적 물질을 의미한다. 이식편으로는 예를 들어 소도 세포와 같은 단리된 세포; 신생아의 양막 등의 조직, 골수, 조혈 전구 세포, 및 눈 조직, 예를 들어, 각막 조직; 및 기관, 예를 들어, 피부, 심장, 간, 비장, 췌장, 갑상선 엽, 폐, 신장, 관 기관 (예를 들어, 장, 혈관 또는 식도) 등과 같은 다양한 물질이 포함된다. 이러한 관 조직을 사용하여 식도, 혈관 또는 담관의 손상된 부위를 대체 할 수 있다. 피부 이식편은 화상뿐 아니라 손상된 장에 대한 드레싱 또는 횡격막 탈장과 같은 몇몇 손상을 아물게 하는데 사용할 수 있다. 이식편은 사체이던지 살아 있는 공여자이던지 간에 인간을 비롯한 임의 포유동물 공급원으로부터 유도된다. 바람직하게는, 이식편은 골수 또는 심장과 같은 기관이고, 이식편의 공여자와 숙주는 HLA 클래스 II 항원에 대하여 매치된다.

본원에 사용된 "포유동물 숙주"란 용어는 임의 적합한 이식 수용자를 의미한다. "적합한"이란 공여된 이식편을 받아들일 포유동물 숙주에 적합한 것을 의미한다. 바람직하게는, 숙주는 인간이다. 이식편의 공여자 및 숙주가 둘 다 인간이라면, 이들은 바람직하게는 조직적합성을 향상시키기 위해 HLA 클래스 II 항원에 대하여 매치된다.

본원에 사용된 "공여자"라는 용어는 죽었던지 살아있던지 간에 이식편이 유래된 포유동물 종을 의미한다. 바람직하게는, 공여자는 인간이다. 혈액 군 장벽의 교잡에 의해 동종이식편의 생존을 손상시킬 수 있기 때문에, 주요 인간 공여자는 바람직하게는 물리적 검사 결과 정상이며 동일한 주요 ABO 혈액형 군에 속하는 지원자의 혈액과 관련된 공여자이다. 그러나, 예를 들어, O형 공여자의 신장을 A, B 또는 AB형 수용자에게 이식할 수 있다.

용어 "이식하다" 및 그의 유의어는 이식이 동계성(공여자 및 수용자가 유전적으로 동일함), 동종이형성(공여자 및 수용자의 유전적 근원은 다르지만 동일한 종에 속함) 또는 이종성(공여자 및 수용자가 다른 종에 속함)이든지 간에 이식편이 숙주로 삽입되는 것을 의미한다. 따라서, 통상의 시나리오에서는, 숙주는 인간이 고 이식편은 유전적 기원이 동일 또는 상이한 인간으로부터 유도된 동종이식편이다. 다른 시나리오에서, 이식편은 계통발생학적으로 폭넓게 분류된 종들로부터 유래하는 동물을 비롯하여 인간 수용자 숙주로 이식되는 비비 심장과 같이, 예를 들어, 인간 숙주로 이식되는 돼지 심장 판막 또는 동물 베타 소도 세포 또는 신경 세포와 같이 이식되는 대상과는 다른 종으로부터 유래하는 것이다.

"유전자 요법"이란 이 요법에 의해 치료되는 포유동물내에 핵산을 도입하는 일반적인 방법을 의미한다. 핵산은 목적 폴리펩티드를 코딩하거나 또는 안티센스 핵산일 수 있다. 유전자 요법 벡터 또는 조성물의 1종 이상의 성분은 그를 사용하여 치료하는 포유동물에서 면역원성일 수 있다. 예를 들어, 바이러스 벡터 (예를 들어, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스 또는 레트로바이러스); 지질; 및(또는) 조성물 중의 표적화 분자는 그를 사용하여 치료하는 포유동물에서 면역 반응을 유도할 수 있다.

"이식을 받으려는 포유동물을 비감응화하는 것"이라는 표현은 포유동물에 이식체를 투여하기에 앞서 이식체에 대한 알러지 감응성 또는 반응성을 줄이거나 또는 제거하는 것을 의미한다. 이는 비감응화된 포유동물에서, 예를 들어, 인간 림프구 항원(HLA)에 대해 지시되는 항-공여자 항체를 감소시키는 것과 같은 임의 메카니즘에 의해 달성될 수 있다.

본원에서 "자가면역성 질환"이란 개체 자신의 조직으로부터 유발되고 이 조직에 대해 지시되는 비-악성 질병 또는 질환을 말한다. 본원에서 자가면역성 질환에는 특히 악성 또는 암성 질병 또는 증상, 보다 특히는 B 세포 림프종, 급성 림프 아구성 백혈병 (ALL), 만성 림프구 백혈병 (CLL), 모세포 백혈병 및 만성 골수모세포성 백혈병을 제외한 것을 말한다. 자가면역성 질병 또는 질환의 예로는 염증 반응, 예를 들어 건선 및 피부염(예를 들어, 아토피성 피부염)을 비롯한 염증성 피부 질환; 전신성 피부경화증 및 경화증; 염증성 장 질환(예를 들어, 크론(Crohn's)병 및 궤양성 대장염)과 관련된 반응; 호흡 곤란 증후군(성인성 호급 곤란 증후군; ARDS 포함); 피부염; 뇌막염; 뇌염; 포도막염; 대장염; 사구체신염; 알러지 증상, 예를 들어 습진 및 천식, 및 T 세포의 침윤 및 만성 염증 반응을 포함하는 다른 증상; 아테롬성경화증; 백혈구 부착 결핍증; 류마티스성 관절염; 전신성 홍반성 루프스(SLE); 당뇨병(예를 들어, 타입 I 당뇨병 또는 인슐린 의존성 당뇨병); 다발성 경화증; 레이노이드(Reynaud's) 증후군; 자가면역성 갑상선염증; 알러지성 뇌척수염; 소르젠(Sjorgen's) 증후군; 소년기 발병 당뇨병; 및 결핵증, 유육종증, 다발성근염, 육아종증 및 혈관염에서 통상적으로 발견되는 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연성 과민증과 관련된 면역 반응; 악성 빈혈(애디슨(Addison's) 병); 백혈구 유출을 포함하는 질병; 중추신경계(CNS) 염증 질환; 다발성 기관 손상 증후군; 용혈성 빈혈(저온형글로불린혈증 또는 쿰브(Coomb) 양성 빈혈을 포함하지만 이에 한정되지는 않음); 중증 근무력증; 항원-항체 복합체 매개 질환; 항-사구체 기저막 질환; 항인지질 증후군; 알러지성 신경염; 그레이브(Graves') 병; 램버트-이튼(Lambert-Eaton) 근무력 증후군; 수포성유천포창; 천포창; 자가면역성 다내분비질환; 레이터(Reiter's) 병; 스티프-만(stiff-man) 증후군; 베흐셋(Behcet) 병; 거대세포성 동맥염; 면역 복합성 신장염; IgA 신장병; IgM 다발신경병증; 면역 혈소판감소성 자반증(ITP) 또는 자가면역성 혈소판감소증 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는다.

"길항제"는 CD20와 결합하게 되면 포유동물에서 B 세포를 파괴 또는 사멸시키고(시키거나), 예를 들어, B 세포에 의해 유도되는 체액성 반응을 감소시키거나 방지함으로써 B 세포의 하나 이상의 기능을 방해하는 분자이다. 길항제는 바람직하게는 이를 사용하여 처리한 포유동물에서 B 세포를 사멸시킬 수 있다(즉, 순환성 B 세포의 수준을 감소시킨다). 이러한 사멸은 항체-의존성 세포-매개 세포독성(ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성(CDC), B 세포 증식의 억제 및(또는) B 세포 사멸의 유도(예를 들어, 아폽토시스를 통해)와 같은 다양한 메카니즘을 통해 달성할 수 있다. 본 발명의 범위내에 포함되는 길항제로는 임의로 세포독성제와 연결 또는 융합되는 CD20와 결합하는 항체, 합성 또는 천연 서열 펩티드 및 소분자 길항제가 포함된다. 바람직한 길항제로는 항체를 들 수 있다.

"항체-의존성 세포-매개 세포독성" 및 "ADCC"는 Fc 수용체(FcR)를 발현시키는 비특이적 세포독성 세포(예를 들어, 자연살(NK) 세포, 호중구 및 마크로파지)가 표적 세포상에 결합된 항체를 인식한 다음, 표적 세포를 용해시키는 세포-매개 반응을 의미한다. ADCC를 매개하는 주요 세포, 즉 NK 세포는 FcγRIII만을 발현시키지만, 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII를 발현시킨다. 조혈 세포에서 FcR의 발현은 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991)]의 464쪽 표 3에 요약되어 있다. 목적 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,500,362호 또는 동 제5,821,337호에 기재된 것과 같은 시험관내 ADCC 분 석을 수행할 수 있다. 이러한 분석에 유용한 작용성 세포로는 말초 혈류 단핵구 세포(PBMC) 및 자연살(NK) 세포가 포함된다. 별법으로 또는 부가적으로, 목적 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어, 문헌[Clynes et al., PNAS (USA) 95: 652-656 (1998)]에 기재된 것과 같은 동물 모델에서 평가될 수 있다.

"인간 작용성 세포"는 1종 이상의 FcR을 발현시키고 작용성 기능을 수행하는 백혈구이다. 바람직하게는, 이 세포는 적어도 FcyRIII를 발현시키고 ADCC 작용 기능을 수행한다. ADCC를 매개하는 인간 백혈구의 예로는 말초 혈류 단핵성 세포(PBMC), 자연살(NK) 세포, 단핵구, 세포독성 T 세포 및 호중구가 포함되며, 이 중에서 PBMC 및 NK 세포가 바람직하다.

"Fc 수용체" 또는 "FcR"은 항체의 Fc 영역에 결합하는 수용체를 설명하기 위해 사용된 용어이다. 바람직한 FcR은 천연 서열 인간 FcR이다. 게다가, 바람직한 FcR은 IgF 항체와 결합하는 수용체(감마 수용체)이며, 그 예로는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII 서브클래스의 수용체 및 이러한 수용체의 대립유전자 변이체 및 선택적으로 스플라이싱된 형태가 포함된다. FcγRII 수용체에는 그의 세포질 도메인에서 주로 차이가 나는 유사한 아미노산 서열을 갖는 FcγRIIA ("활성화 수용체") 및 FcγRIIB ("저해 수용체")가 포함된다. 활성화 수용체 FcγRIIA는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 활성화 모티프(ITAM)를 포함한다. 저해 수용체 FcγRIIB는 그의 세포질 도메인에 면역수용체 티로신계 저해 모티프(ITIM)를 포함한다[문헌[Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15: 203-234 (1997)]을 참조]. FcR에 대하여는 문헌[Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9: 457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4: 25-34 (1994); and de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126: 330-41 (1995)]을 검토한다. 향후 동정될 것들을 포함하여 다른 FcR은 본원의 "FcR"이라는 용어에 포함된다. 이 용어는 또한 모친의 IgG를 태아에 전달하는 역할을 하는 신생아 수용체, 즉 FcRn을 포함한다(Guyer et al., J Immunol. 117: 587 (1976) and Kim etal, J Immunol. 24: 249 (1994)).

"보체 의존성 세포독성" 또는 "CDC"는 보체의 존재하에 표적을 용해시키는 분자의 능력을 의미한다. 보체 활성 경로는 보체 시스템의 제1 성분(C1q)을 동종의 항원과 복합체화된 분자(예를 들어, 항체)에 연결함으로써 개시된다. 보체 활성화를 평가하기 위해, 예를 들어, 문헌[Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202: 163 (1996)]에 기재된 CDC 분석을 수행할 수 있다.

"성장 억제성" 길항제란 이 길항제가 결합하는 항원을 발현시키는 세포의 증식을 방지 또는 감소시키는 것을 말한다. 예를 들어, 길항제는 시험관내 및(또는) 생체내에서 B 세포의 증식을 방지 또는 감소시킬 수 있다.

"아폽토시스를 유도하는" 길항제란 아넥신 V의 결합, DNA의 단편화, 세포 수축, 소포체의 팽창, 세포의 단편화 및(또는) 막 소포(아폽토시스 바디라 부름)의 형성과 같은 표준 아폽토시스 분석에 의해 결정된 바와 같이, 예를 들어, B 세포의 계획된 세포 사멸을 유도하는 것들이다.

본원에서 "항체"란 가장 광범위한 의미로 사용되었으며, 구체적으로는 온전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2종 이상의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체(예를 들어, 이중특이적 항체)뿐 아니라 목적하는 생물학적 활성을 나 타내기만 하면 항체 단편도 포함된다.

"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')₂ 및 Fv 단편; 디아바디(diabody); 선형 항체; 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체 등이 포함된다.

"천연 항체"란 일반적으로 2개의 동일한 경쇄(L) 및 2개의 동일한 중쇄(H)로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 디술피드 공유결합에 의해 중쇄에 연결되지만, 디술피드 결합의 개수는 상이한 이뮤노글로불린 동종형의 중쇄에서 달라진다. 또한, 각각의 중쇄 및 경쇄는 규칙적 간격으로 쇄 내부의 디술피드 결합을 갖는다. 각각의 중쇄는 한 말단에 가변 도메인(V_H) 및 이 도메인에 후속하는 많은 불변 도메인을 갖는다. 각각의 경쇄는 한 말단에 가변 도메인(V_L) 및 다른 말단에 불변 도메인을 갖고, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 나란히 배열되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 나란히 배열된다. 특정 아미노산 잔기들이 경쇄와 중쇄 가변 도메인 사이의 경계면을 형성하는 것으로 생각된다.

"가변"이란 용어는 항체들 간에 가변 도메인의 특정 영역의 서열이 크게 상이하고 그 특정 항원에 대한 각각의 특정 항체의 결합 및 특이성에 사용된다는 사실을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체에 걸쳐 균일하게 분포되지는 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 모두의 초가변 영역으로 불리는 3개의 세그먼트에 집중된다. 가변 도메인에서 보존도가 보다 높은 부분은 프레임워크 영역(FR)이라 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인은 루프 연결을 형성하며 어떤 경우에는 β-시트 구조의 일부를 이루는 3개의 초가변 영역에 의해 연결되는, 주로 β-시트의 입체형태인 프레임워크 영역 4개를 포함한다. 각 쇄 내의 초가변 영역은 FR 영역에 의해 서로 매우 근접하게 유지되고, 다른 쇄의 초가변 영역은 항체의 항원 결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. Ⅰ, pages 647-669 (1991) 참조). 불변 도메인은 항체의 항원 결합시에 직접 관여하지 않지만, 항체 의존성 세포의 세포독성(ADCC)에서 항체의 관여와 같은 다양한 작용 기능을 보인다.

항체를 파파인(papain)으로 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신으로 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')₂ 단편이 생성된다.

"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이 구조에서는 각 가변 도메인의 초가변 영역 3개가 상호작용하여 V_H-V_L 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6개의 초가변 영역이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 초가변 영역만을 포함 하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.

또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 항체 힌지(hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 몇 개의 잔기가 부가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)이 유리 티올기를 하나 이상 보유하는 Fab'을 지칭한다. F(ab')₂ 항체 단편은 본래 그들 사이에 힌지 시스테인이 있는 Fab' 단편의 쌍으로 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.

임의의 척추동물 종으로부터 유래한 항체(이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 그의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 유형 중의 하나로 분류될 수 있다.

항체는 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 상이한 클래스로 분류될 수 있다. 온전한 항체에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇몇은 서브클래스(동종형), 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 상이한 클래스의 항체에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불리운다. 상이한 클래스의 이뮤노글로불린에 대한 서브유닛 구조와 3차원 구조는 잘 알려져 있다.

"단쇄 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 단일 폴리펩티드 쇄에 존재하는 항체의 V_H 및 V_L 도메인을 포함한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합에 대한 바람직한 구조를 형성하도록 하는, V_H 및 V_L 도메인 사이의 폴리펩티드 링커도 포함한다(scFv에 관해서는 문헌 (Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)) 참조).

"디아바디(diabody)"라는 용어는 동일한 폴리펩티드 쇄 내에서 경쇄 가변 도메인(V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함(V_H-V_L)하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 쇄에 있는 2개의 도메인을 연결시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보성 도메인과 강제로 연결시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어, 유럽 특허 제404,097호, 국제 공개 제WO93/11611호 및 문헌 (Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))에 보다 상세하게 기재되어 있다.

본원에서 사용된 "모노클로날 항체"라는 용어는 실질적으로 동종인 항체들의 집단으로부터 얻은 항체, 즉, 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외한, 한 집단을 이루는 동일한 개별 항체를 의미한다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되는 매우 특이적인 항체이다. 또한, 전형적으로 상이한 결정군(에피토프)에 대한 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와 달리, 각 모노클로날 항체는 항원상의 단일 결정군에 대해 지시된다. 모노클로날 항체는 그 특이성 이외에 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브 리도마 배양물에 의해 합성된다는 이점이 있다. 수식어 "모노클로날"은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻어진 항체 특성을 가리키는 것이며, 임의의 특별한 방법으로 항체를 제조하는데 요구되는 것으로 여겨지지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 먼저 문헌(Kohler et al., Nature, 256:495[1975])에 기재된 하이브리도마 방법으로 제조할 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법(예를 들어, 미국 특허 제4,816,576호 참조)으로 제조할 수 있다. "모노클로날 항체"는 또한 예를 들어, 문헌(Clackson et al., Nature, 352:624-628[1991] 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597(1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.

본원에서의 모노클로날 항체는 구체적으로, 목적하는 생물학적 활성을 발휘하기만 한다면 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부분이 특정 종으로부터 유래된 항체 또는 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있지만, 쇄(들)의 나머지는 다른 종으로부터 유래된 항체 또는 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 또는 그러한 항체의 단편과 동일하거나 상동성이 있는 "키메라" 항체(이뮤노글로불린)를 포함한다(미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855[1984]). 본원에서 목적 키메라 항체로는 인간 이외의 영장류(예를 들어, 개코 원숭이, 레서스 또는 시노몰구스 원숭이와 같은 구세계 원숭이)로부터 유도되는 가변 도메인 항원 결합 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 "영장류화" 항체가 포함된다(미국 특허 제5,693,780호).

비-인간(예를 들어, 쥐과 동물) 항체의 "인간화" 형태는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기를 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 갖는 마우스, 래트, 토끼 또는 인간 이외의 영장류와 같은 인간 이외의 종 (공여자 항체)의 초가변 영역으로부터의 잔기로 치환시킨 인간 이뮤노글로불린 (수용자 항체)을 포함한다. 몇몇 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 프레임워크 영역(FR)의 잔기는 상응하는 비-인간 잔기에 의해 치환된다. 또한, 인간화 항체는 수용자 항체 또는 공여자 항체에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 이러한 변형은 추가로 항체 수행성을 개선하기 위해 수행된다. 일반적으로, 인간화 항체는 하나 이상, 통상적으로 두개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 영역에 상응하며, 모든 또는 실질적으로 모든 FR은 인간 이뮤노글로불린 서열의 영역에 해당한다. 또한, 인간화 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 통상적으로 인간 이뮤노글로불린 영역의 일부를 임의로 포함할 것이다. 보다 상세한 것에 대하여는, 문헌[Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

본원에 사용된 "초가변 영역"이란 항원 결합을 담당하는 항체의 아미노산 잔기를 말한다. 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"(경쇄 가변 도메인의 잔기 24 내지 34(L1), 50 내지 56(L2) 및 89 내지 97(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 31 내지 35(H1), 50 내지 65(H2) 및 95 내지 102(H3); Kabar et al., Sequences of Proteins of Immunological Interests, 5th Ed. Public Health Services, National Institute of Health, Bethesda, MD. [1990])로부터의 아미노산 잔기 및(또는) "초가변 루프"(경쇄 가변 도메인의 잔기 26 내지 32(L1), 50 내지 52(L2) 및 91 내지 96(L3), 및 중쇄 가변 도메인의 잔기 26 내지 32(H1), 53 내지 55(H2) 및 96 내지 101(H3); Clothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917[1987])로부터의 아미노산 잔기를 포함한다. "프레임워크" 또는 "FR" 잔기는 본원에 정의된 초가변 영역 잔기 이외의 가변 도메인의 잔기이다.

목적 항원 예를 들어 CD20과 "결합하는" 길항제는 이 길항제가 이 항원을 발현시키는 세포를 표적화하는 치료제로 유용하도록 충분한 친화성 및(또는) 친화도를 갖는 항원과 결합할 수 있는 것이다.

CD20과 결합하는 항체의 예로는 "리툭시맵(rituximab)"(리툭산(RITUXAN, 등록상표))이라 불리는 "C2B8" (본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,736,137호); "Y2B8"로 명명된 이트륨-[90]-표지된 2B8 쥐 항체(본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,736,137호); "¹³¹I-B1" 항체를 생성시키기 위해 ¹³¹I로 임의로 표지된 쥐 IgG2a"B1" (BEXXAR(등록상표)) (본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,595,721호); 쥐 모노클로날 항체 "1F5" (Press et al., Blood 69 (2): 584-591 (1987)); "키메라 2H7" 항체 (본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,677,180호); 및 인터내셔날 루코사이트 타이핑 워크샵으로부터 이용할 수 있는 모노클로날 항체 L27, G28- 2, 93-1B3, B-C1 또는 NU-B2 (Valentine et al, In: Leukocyte Tvping III (McMichael, Ed., p. 440, Oxford University Press (1987))가 포함된다.

본원에서 리툭시맵(rituximab) 또는 리툭산(RITUXAN(등록상표))이라는 용어는 CD20 항원에 대하여 지시되고 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제5,736,137호에서 "C2B8"로 명명되는 유전적으로 조작된 키메라 쥐/인간 모노클로날 항체를 의미한다. 이 항체는 쥐 경쇄 및 중쇄 가변 영역 서열 및 인간 불변 영역 서열을 포함하는 IgG1 카파 이뮤노글로불린이다. 리툭시맵(rituximab)은 CD20 항원에 대하여 약 8.0 nM의 결합 친화도를 갖는다.

"단리된" 길항제는 자신의 자연 환경의 성분으로부터 확인 및 분리 및(또는) 회수된 길항제이다. 자연 환경의 오염 성분은 길항제의 진단 또는 치료적 사용을 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 길항제는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량％ 초과, 가장 바람직하게는 99 중량％ 초과의 길항제로, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도로, 또는 (3) 쿠마시 블루, 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 정제될 것이다. 단리된 길항제는 그 길항제의 자연 환경에 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문에, 재조합 세포 내의 원래 위치에 존재하는 길항제를 포함한다. 그러나, 단리된 길항제는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.

치료 목적의 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물, 및 동물원용, 경기용 또는 애완 동물, 예를 들어, 개, 말, 고양이, 소 등을 비롯한 포유동물로 분류되는 임의 동물을 말한다. 바람직한 포유동물은 인간이다.

"치료"는 치료 처리 및 예방 또는 방지 조치 모두를 가리킨다. 치료를 필요로 하는 대상에는 이미 질병 또는 질환에 걸린 대상 뿐만 아니라 질병 또는 질환을 예방해야 하는 대상도 포함된다. 따라서, 포유동물은 질병 또는 질환을 앓는 것으로 진단되거나 또는 질병에 걸리기 쉽거나 감염되기 쉬울 수 있다.

"치료 유효량"이라는 표현은 해당 질병 또는 증상의 예방, 개선 또는 치료에 효과적인 길항제의 양을 말한다.

본원에서 사용된 보조 치료를 위한 "면역억제제"라는 용어는 본원에서 치료받을 포유동물의 면역계를 억제 또는 차폐하는 작용을 하는 물질을 말한다. 이들 물질에는 사이토카인 생산을 억제하는 물질, 자가-항원 발현을 하향조절하거나 또는 억제하는 물질, 또는 MHC 항원을 차폐하는 물질이 포함된다. 이러한 물질의 예로는 2-아미노-6-아릴-5-치환된 피리미딘(개시 내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 제4,665,077호); 항증식성 물질, 예를 들어, 아자티오프린, 레플루노미드 또는 시롤리무스; 시클로포스파미드; 브로모크립틴; 다나졸; 다프손, 글루타르알데히드 (미국 특허 제4,120,649호에 기재된 바와 같이 MHC 항원을 차폐함); MHC 항원 및 MHC 단편에 대한 항-이디오타입 항체; 시클로스포린 A; 코르티코스테로이드와 같은 스테로이드, 예를 들어, 프레드니손, 메틸프레드니솔론 및 덱사메타손; 미코페놀레이트 모페틸; 칼시뉴린 억제제 (예를 들어, 타크롤리무스); 항-인터페론-γ, -β 또는 -α항체, 항-종양 괴사 인자-α 항체, 항-종양 괴사 인자-β항체, 항-인터루킨-2 항체 및 항-IL-2 수용체 항체를 비롯한 사이토카인 또는 사이토카인 수용체 길항제; 항-CD11a 및 항-CD18 항체를 비롯한 항-LFA-1 항체; 항-L3T4 항체; 항-림프구 항체, 예를 들어, 폴리클로날 항-림프구 항체; pan-T 항체, 바람직하게는 항-CD3 또는 항-CD4/CD4a 항체; LFA-3 결합 도메인을 포함하는 가용성 펩티드(1990년 7월 26일 공개된 WO90/08187); 스트렙토키나제; TGF-β; 스트렙토도르나제; 숙주로부터의 RNA 또는 DNA; FK506; RS-61443; 데옥시스페르구알린; 라파마이신; T-세포 수용체 (Cohen et al., 미국 특허 제5,114,721호); T-세포 수용체 단편 (Offner et al., Science, 251: 430-432 (1991); WO 90/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989); 및 WO 91/01133); 및 T 세포 수용체 항체 (유럽 특허 제340,109호), 예를 들어, T10B9이 포함된다.

본원에 사용된 "세포독성제"라는 용어는 세포의 기능을 저해하거나 억제하고(하거나) 세포를 파괴하는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, At²¹¹ I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소), 화학요법제 및 독소(예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 소분자 독소 또는 효소 활성 독소, 또는 이들의 단편)를 포함한다.

"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화합물이다. 화학치료제의 예로는 알킬화제, 예를 들어 티오테파 및 시클로스포스파미드(CYTOXAN(등록상표)); 알킬 술포네이트, 예를 들어 부술판, 임프로술판 및 피포술판; 아지리딘, 예를 들어 벤조도 파, 카르보쿠온, 메투레도파 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸올로멜라민을 비롯한 에틸렌이민 및 메틸아멜라민; 질소 머스타드, 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 콜로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 하이드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비신, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아, 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 라니무스틴; 항생제, 예를 들어 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 카크티노마이신, 칼리케아마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이신, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르루이신, 독소루비신, 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신, 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항-대사물질, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실(5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-메르캅토푸린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘, 5-FU; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스톨락톤; 항-아드레날, 예를 들어 아미노글루테티 미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 공급원, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에토글루시드; 갈륨 니트레이트; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다민; 미토구아존; 미토크산트론; 모피다몰; 니트라크린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표); 라족산; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2''-트리클로로트리에틸아민; 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 파클리탁셀 (TAXOL(등록상표), Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) 및 도세탁셀 (TAXOTERE(등록상표), Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); 클로람부실; 젬시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토푸린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드(VP-16); 이포스파미드; 미토마이신 C; 미토크산트론; 빈크리스틴; 비노렐빈; 나벨빈; 노반트론; 테니포시드; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; CPT-11; 토포아이소머라제 저해제 RFS2000; 디플루오로메틸오르니틴(DMFO); 레티노산; 에스페라마이신; 카페시타빈; 및 상기 언급된 것들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다. 또한, 이 정의에는 예를 들어 타목시펜, 랄록시펜, 아로마타제 저해 4(5)-이미다졸, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤 및 토레미펜(Fareston)을 비롯하여 항-에스트로겐과 같이 종양에 대한 호르몬 작용을 조절 또는 억제하는 작용을 하는 항 호르몬제; 및 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 루프롤리드 및 고세렐린; 및 상기 언급된 것들의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

"사이토카인"이란 하나의 세포 군집에 의해 방출되는, 세포간 매개자로서 다른 세포상에 작용하는 단백질의 포괄적인 용어이다. 이러한 사이토카인의 예로는 림포카인, 모노카인 및 전형적인 폴리펩티드 호르몬이 있다. 사이토카인에는 성장 호르몬, 예를 들어, 인간 성장 호르몬, N-메티오닐 인간 성장 호르몬 및 소 성장 호르몬; 부갑상선 호르몬; 티록신; 인슐린; 프로인슐린; 릴랙신; 프로릴랙신; 여포 자극 호르몬(FSH), 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 황체 호르몬(LH) 등의 당단백질 호르몬; 간세포 성장 인자; 섬유아세포 성장 인자; 프롤락틴; 태반 락토젠; 종양 괴사 인자-α및 -β; 뮐러리안 억제 물질; 마우스 성선자극호르몬 관련 펩티드; 인히빈; 액티빈; 혈관 내피 성장 인자; 인테그린; 트롬보포이에틴(TPO); 신경 성장 인자, 예를 들어, NGF-β; 혈소판 성장 인자; 변형 성장 인자(TGF), 예를 들어, TGF-α및 -β; 인슐린 유사 성장 인자-Ⅰ 및 -Ⅱ; 에리트로포이에틴(EPO); 골유도 인자(osteoinductive factor); 인터페론, 예를 들어, 인터페론-α, -β및 -γ; 콜로니 자극 인자(CSF), 예를 들어, 마크로파지-CSF(M-CSF); 과립세포-마크로파지-CSF(GM-CSF); 및 과립세포-CSF(G-CSF); 인터루킨(IL), 예를 들어, IL-1, IL-1α, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; 종양 괴사 인자, 예를 들어, TNF-α또는 TNF-β; 및 LIF 및 키트 리간드(KL)를 비롯한 다른 폴리펩티드 인자가 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 사이토카인이란 용어에는 천연 공급원 또는 재조합 세포 배양물로부터의 단백질 및 천연 서열 사이토카인의 생물학적 활성 등가물이 포함된다.

본원에서 사용된 "전구약물"이란 용어는 모약물에 비해 종양 세포에 대한 세포독성이 덜하며 효소적으로 활성화되거나 보다 활성인 모 형태로 전환될 수 있는 제약상 활성 물질의 전구체 또는 유도체 형태를 말한다(문헌[Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical Society Transactions, 14:375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)] 및 [Stella et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al., (ed.), pp. 147-276, Humana Press (1985)] 참조). 본 발명의 전구약물로는 보다 활성인 세포 무독성 약물로 전환될 수 있는 포스페이트 함유 전구약물, 티오포스페이트 함유 전구약물, 술페이트 함유 전구약물, 펩티드 함유 전구약물, D-아미노산 개질 전구약물, 글리코실화된 전구약물, β-락탐 함유 전구약물, 임의로 치환된 페녹시아세트아미드 함유 전구약물 또는 임의로 치환된 페닐아세트아미드 함유 전구약물, 5-플루오로시토신 및 기타 5-플루오로우리딘 전구약물이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 본 발명에 사용하기 위한 전구약물로 유도체화될 수 있는 세포독성 약물의 예로는 상기 기재된 화학요법제가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다.

"리포좀"은 포유동물에게 약물(예를 들어, 본원에 개시된 길항제 및 임의로 화학요법제)을 전달하는데 유용한 여러 유형의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 소포이다. 리포좀 성분들은 통상적으로 생물학적 막의 지질 배열과 유사한 이중층 형태로 배열되어 있다.

"패키지 삽입물"이라는 용어는 이러한 치료 제품의 사용에 있어서의 적응증, 용법, 투여량, 투여법, 금기사항 및(또는) 주의 사항에 대한 정보를 포함하는 시판되는 치료 제품 패키지에 통상적으로 포함되어 있는 것들을 의미한다.

II . 길항제의 생산

본 발명의 방법 및 제품은 CD20에 결합하는 길항제를 사용 또는 포함하고 있다. 따라서, 하기에는 이러한 길항제를 생성하는 방법이 기재되어 있다.

길항제의 생산 또는 스크리닝에 사용되는 CD20 항원은 예를 들어 목적하는 에피토프를 포함하는 가용성 형태의 항원 또는 그의 일부일 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 그의 세포 표면에 CD20을 발현하는 세포를 사용하여 길항제를 생성시키거나 스크리닝할 수 있다. 길항제를 생성하는데 유용한 다른 형태의 CD20은 당업자에게는 분명한 것이다.

바람직한 길항제는 항체이지만, 본원에서는 항체 이외의 길항제도 고려 대상이 된다. 예를 들어, 길항제는 임의로 (본원에 기재된 것들과 같은) 세포독성제에 융합되거나 또는 그와 결합되는 소분자 길항제를 포함할 수 있다. CD20에 대해 소분자 라이브러리를 스크리닝하여 이 항원과 결합하는 소분자를 동정할 수 있다. 이들 소분자는 그의 길항제 특성에 대하여 추가로 스크리닝될 수 있고(있거나) 세포독성제와 결합될 수 있다.

길항제는 합리적인 설계 또는 파아지 디스플레이에 의해 생성된 펩티드일 수도 있다(예를 들어, 1998년 8월 13일에 공개된 W098/35036 참조). 한 실시양태에서, 선택 분자는 항체의 CDR을 기초로 하여 설계된 "CDR 모방체" 또는 항체 유사체 일 수 있다. 이들 펩티드는 그 자체로도 길항성을 가질 수 있지만, 이 펩티드는 펩티드의 길항제 특성을 추가 또는 증대시키기 위하여 임의로 세포독성제에 융합될 수 있다.

하기에는 본 발명에 따라 사용되는 항체 길항제의 생산을 위한 예시적인 기술들이 기재되어 있다.

(i) 폴리클로날 항체

폴리클로날 항체는 바람직하게는 동물에서 관련 항원 및 보조제를 피하내(sc) 또는 복강내(ip) 수회 주입하여 생성된다. 이관능성 물질 또는 유도체화 물질, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙신이미드 에스테르(시스테인 잔기를 통한 연결), N-히드록시숙신이미드(라이신 잔기를 통해 연결), 글루타르알데히드, 숙신산 무수물, SOCl₂, 또는 R¹N=C=NR(여기서, R 및 R¹은 다른 알킬기임)을 사용하여 관련 항원을 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 또는 콩 트립신 저해제와 연결시키는 것이 유용할 수도 있다.

단백질 또는 컨쥬게이트 100 ㎍ 또는 5 ㎍(각각 토끼 또는 마우스에 대한 것임)과 이들 양의 3배에 해당하는 프러이드(Freund's) 완전 보조제를 배합하고 이 용액을 여러 부위에 피부내로 주사함으로써 동물을 항원, 면역원성 컨쥬게이트 또는 유도체에 대하여 면역화하였다. 그로부터 1개월 후에, 펩티드 또는 컨쥬게이트의 원래 양의 1/5 내지 1/10을 프러이드 완전 보조제 중에 넣어 여러 부위에 피하 주사하여 동물을 항원자극하였다. 7일 내지 14일 후에, 동물을 채혈하여 혈청을 항체 역가에 대하여 분석하였다. 역가 정체시까지 동물을 항원자극하였다. 바람직하게는, 다른 단백질에 연결되고(되거나) 다른 가교-연결 시약에 의해 연결된 동일한 항원의 컨쥬게이트로 항원자극하였다. 컨쥬게이트는 또한 재조합 세포 배양에서 단백질 융합체로서 제조될 수 있다. 또한, 명반과 같은 응집제는 적합하게는 면역 반응을 증대시키기 위해 사용된다.

(ii) 모노클로날 항체

모노클로날 항체는 실질적으로 동종 항체의 집단으로부터 얻어지는데, 즉 집단을 구성하는 각 항체는 소량 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하면 동일하다. 따라서, "모노클로날"이라는 수식어는 여러가지 항체의 혼합물로서가 아닌 항체의 특징을 나타낸다.

예를 들어, 모노클로날 항체는 문헌[Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)]에 최초로 기재된 하이브리도마법을 이용하거나 또는 재조합 DNA법(미국 특허 제4,816,567호)에 의해 제조할 수 있다.

하이브리도마법에서, 마우스 또는 다른 적절한 숙주 동물, 예를 들어, 햄스터는 면역화에 사용되는 단백질과 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도하기 위해 상기 언급된 바와 같이 면역화된다. 또는, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 림프구를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다(Goding, Monoclonal Antibodies. Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)).

이렇게 하여 제조된 하이브리도마 세포를 바람직하게는 비융합된 모 골수종 세포의 증식 또는 생존을 억제하는 1종 이상의 물질을 포함하는 적합한 배양 배지에 씨딩하여 배양한다. 예를 들어, 모 골수종 세포에 효소인 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있다면, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 통상적으로 HGPRT-결핍 세포의 증식을 억제하는 물질인 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함할 것이다(HAT 배지).

바람직한 골수종 세포는 효과적으로 융합하고, 선별된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정된 높은 수준의 생산을 뒷받침하며, HAT 배지와 같은 배지에 감응성인 세포이다. 이들 중에서, 바람직한 골수종 세포주는 쥐 골수종 세포주, 예를 들어, 솔크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터(Salk Institute Cell Distribution Center; San Diego, California USA)로부터 입수할 수 있는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양으로부터 유래된 것들 및 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection; Rockville, Maryland USA)으로부터 입수할 수 있는 SP-2 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유래된 것들이다. 인간 골수종 세포주 및 마우스 인간 이종 골수종 세포주는 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위한 것으로도 기재되어 있다(Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)).

하이브리도마 세포가 자라는 배양 배지를 항원에 대하여 지시되는 모노클로 날 항체의 생산에 대하여 분석한다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침전법 또는 시험관내 결합 분석법, 예를 들어, 방사성면역분석법(RIA) 또는 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 결정한다.

모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들어 문헌[Munson et al, Anal Biochem., 107: 220 (1980)]의 스캐처드(Scatchard) 분석법에 의해 결정할 수 있다.

목적하는 특이성, 친화성 및(또는) 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 동정한 다음, 제한 희석 방법에 의해 클론을 서브클로닝하고 표준 방법에 의해 배양하였다(Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)). 이러한 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들어 D-MEM 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양으로서 생체내에서 배양될 수 있다.

서브클론에 의해 분비되는 모노클로날 항체는 적합하게는, 예를 들어, 단백질 A-세파로스(Sepharose), 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피 등의 통상의 이뮤노글로불린 정제 방법에 의해 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 분리된다.

모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법에 의해(예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용하여) 쉽게 단리하여 서열분석한다. 하이브리도마 세포는 그러 한 DNA의 바람직한 공급원으로서의 역할을 한다. 단리한 다음에는, DNA를 발현 벡터에 위치시킬 수 있으며, 이어서 달리 이뮤노글로불린 단백질을 생산하지 않는 이. 콜라이(E. coli) 세포, 원숭이 COS 세포, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 트랜스펙션시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성한다. 박테리아에서 이러한 항체를 코딩하는 DNA의 재조합 발현에 대한 연구에 관하여는 문헌[Skerra et al, Curr. Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) and Pluckthun, ImmunoL. Revs., 130: 151-188 (1992)]에 기재되어 있다.

추가 실시양태에서, 항체 또는 항체 단편은 파지 라이브러리를 사용한, 뮤린 및 인간 항체 각각의 단리가 기재된 문헌 (McCafferty et al, Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al, Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol Biol., 222: 581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 얻은 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 후속 문헌에는 사슬 셔플링 (Marks et al, Biol. Technology, 10: 779-783 (1992)) 뿐만 아니라, 매우 큰 파지 라이브러리를 제작하기 위한 방법인 조합 감염 및 생체내 재조합 (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993))에 의한 고친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생산이 기재되어 있다. 따라서, 이들 기술은 모노클로날 항체의 단리를 위한 종래의 모노클로날 항체 하이브리도마 기술의 대안으로 이용가능하다.

또한, 예를 들어, DNA는 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열을 치환시킴으로써 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., 상기 문헌), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 변이시킬 수 있다.

전형적으로, 상기 비이뮤노글로불린 폴리펩티드는 항체의 불변 도메인 대신에 치환되거나, 항체의 한 항원-결합 부위의 가변 도메인 대신에 치환되어 한 항원에 대한 특이성을 갖는 한 항원-결합 부위 및 다른 항원에 대한 특이성을 갖는 다른 항원-결합 부위를 포함하는 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.

(iii) 인간화된 항체

비인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 바람직하게는, 인간화된 항체는 인간이 아닌 공급원으로부터 유래된 항체에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 불리며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열 대신에 초가변 영역 서열을 치환함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화된 항체는 통상적으로 일부 초가변 영역 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체의 동족 부위로부터의 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.

인간화된 항체를 제조하는 데 사용될 인간 경쇄 가변 도메인과 인간 중쇄 가 변 도메인 사이의 선택은 항원성을 감소시키는 데 매우 중요하다. 소위 "가장 적합한" 방법에 따르면, 공지된 인간 가변-도메인 서열의 전체 라이브러리에 대하여 설치류 항체의 가변 도메인의 서열을 스크리닝한다. 그 다음, 설치류의 서열과 가장 근접한 인간 서열을 인간화된 항체를 위한 인간 골격 영역 (FR)으로 채택한다 (Sims et al, J. Immunol, 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196: 901 (1987)). 다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 서브그룹의 모든 인간 항체의 컨센서스 서열로부터 유도된 특정한 골격 영역을 사용한다. 여러 가지 다른 인간화된 항체에 대해 동일한 골격을 사용할 수 있다 (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4285 (1992); Presta et al, J. Immunol., 151: 2623 (1993)).

항체가 항원 및 다른 유리한 생물학적 성질에 대한 고친화성을 보유하도록 인간화하는 것도 중요하다. 이 목적을 달성하기 위해, 바람직한 방법에 따라, 모 서열 및 인간화 서열의 3 차원 모델을 사용한, 모 서열 및 다양한 이론상 인간화 생성물의 분석 방법으로 인간화 항체를 제조한다. 3 차원 이뮤노글로불린 모델은 시판되고 당업자에게 공지되어 있다. 선택된 후보 이뮤노글로불린 서열의 가능한 3차원 구조를 설명하고 보여주는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 이러한 컴퓨터 프로그램의 디스플레이를 조사하면 후보 이뮤노글로불린 서열의 기능화에 있어서의 잔기의 가능한 역할 분석, 즉 후보 이뮤노글로불린이 그의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 가능케 한다. 이 방식으로, 수용자 서열 및 임포트 서열로부터 FR 잔기를 선별하고 조합하여 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화 성과 같은 원하는 항체의 특성을 얻을 수 있다. 일반적으로, 초가변 영역의 잔기는 항원 결합에 영향을 주는 데 직접적으로, 그리고 가장 실질적으로 관여한다.

(iv) 인간 항체

인간화에 대한 대안으로서, 인간 항체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 면역화시, 내인성 이뮤노글로불린 생성의 부재 하에 인간 항체의 전체 레파토리를 생산할 수 있는 형질전환 동물 (예를 들어, 마우스)를 만드는 것도 현재 가능하다. 예를 들어, 키메라 및 생식세포주 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 (J_H) 유전자를 동형접합 결실시키면 내인성 항체 생산이 완전히 억제된다는 것이 기재된 바 있다. 상기와 같은 생식세포주 돌연변이 마우스내로 인간 생식세포주 이뮤노글로불린 유전자 배열이 전달되면 항원에 노출시 인간 항체가 생산될 것이다 [예를 들어, 문헌 (Jakobovits et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al, Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al, Year in Immuno., 7: 33 (1993); 및 미국 특허 제5,591,669호, 제5,589,369호 및 제5,545,807호) 참조].

별법으로, 파지 디스플레이 기술 (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990))을 이용하여 면역화되지 않은 공여자로부터 얻은 이뮤노글로불린 가변 (V) 도메인 유전자 레파토리로부터의 인간 항체 및 항체 단편을 시험관내에서 생산할 수 있다. 이 기술에 따라, 항체 V 도메인 유전자를 M13 또는 fd와 같은 섬유상 바테리오파지의 주요 코팅 단백질 또는 소수 코팅 단백질 유전자내로 인프레임으로 클로닝하고 상기 파지 입자의 표면 상에 기능성 항체 단편으로 디스플레이한다. 상기 섬유상 입자가 파지 게놈의 단일 가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질을 기준으로 한 선별은 상기 성질을 나타내는 항체를 코딩하는 유전자도 선별할 수 있게 한다. 따라서, 파지는 B 세포의 일부 성질을 흉내낸다. 파지 디스플레이는 다양한 포맷으로 수행할 수 있다 [예를 들어, 문헌 (Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993) 참조]. V-유전자 단편의 여러 공급원을 파지 디스플레이에 사용할 수 있다. 클랙슨 (Clackson et al., Nature, 352 : 624-628 (1991))은 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래한 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 얻은 다양한 배열의 항-옥사졸론 항체를 단리하였다. 면역화되지 않은 인간 공여자로부터 얻은 V 유전자의 레파토리를 제작하고, 본질적으로 문헌 (Marks et al., J. Mol Biol. 222: 581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993), 미국 특허 제5,565,332호 및 제5,573,905호도 참조)에 기재된 기술에 따라 다양한 배열의 항원 (자가-항원을 포함함)에 대한 항체를 단리할 수 있다.

인간 항체는 시험관내에서 활성화된 B 세포에 의해서도 생성된다 (미국 특허 제5,567,610호 및 제5,229,275호 참조).

(v) 항체 단편

항체 단편을 생산하기 위한 다양한 기술이 개발되어 있다. 종래에, 이들 단편은 온전한 항체의 단백질분해 절단을 통해 유도하였다 (see, e. g., Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)). 그러나, 이들 단편은 현재 재조합 숙주 세포에 의해 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 위에서 논의된 항체 파지 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 별법으로, Fab'-SH 단편은 이. 콜라이로부터 직접 회수하여 F(ab')₂ 단편에 화학적으로 커플링시킬 수 있다 (Carter et al., Bio/Technology 10: 163-167 (1992)). 다른 방법에 따라, F(ab')₂ 단편을 숙주 세포 배양물로부터 직접 단리할 수 있다. 항체 단편을 생산하기 위한 다른 기술은 당업자에게 자명할 것이다. 다른 실시양태에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (scFv)이다 (WO 93/16185; 미국 특허 제5,571,894호; 및 미국 특허 제5,587,458호 참조). 항체 단편은 예를 들어, 미국 특허 제5,641,870호에 기재된 바와 같은 "선형 항체"일 수도 있다. 이러한 선형 항체는 단일특이적 또는 이중특이적일 수 있다.

(vi) 이중특이적 항체

이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 항체이다. 예시적 이중특이적 항체는 CD20의 두 가지 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 별법으로, 항-CD20 결합 아암 (arm)은 백혈구 상의 촉발성 분자, 예를 들면 T-세포 수용체 분자 (예: CD2 또는 CD3), 또는 IgG에 대한 Fc 수용체 (FcγR), 예를 들면 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)에 결합하는 아암과 결합하여, B 세포에 대한 세포성 방어 메카니즘에 초점을 맞추도록 할 수 있다. 이중특이적 항체를 사용하여, B 세포에 세포독성제를 표적화시킬 수도 있다. 이들 항체는 CD20-결합 아암, 및 세포독성제 (예를 들면, 사포린, 항-인터페론-α, 빈카 알칼로이드, 리신 A 쇄, 메토트렉세이트 또는 방사성 동위원소 햅텐)와 결합하는 아암을 갖고 있다. 이중특이적 항체는 전장 길이 항체 또는 항체 단편 (예를 들면, F(ab')₂ 이중특이적 항체)으로서 제조될 수 있다.

이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 전장 길이의 이중특이적 항체의 종래 생산 방법은 상이한 특이성을 갖는 2개의 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍을 함께 발현시키는 것을 기초로 한다 [Milstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)]. 이뮤노글로불린 중쇄와 경쇄의 무작위 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (quadroma)는 10가지 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생성시키는데, 이들 중의 단지 1개만이 정확한 이중특이적 구조를 지니고 있다. 통상적으로 친화 크로마토그래피 단계에 의해 행해지는, 이러한 정확한 분자의 정제는 다소 번거로운 과정이며, 생성물 수율은 낮다. 유사한 과정이 문헌 [WO 93/08829; and Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991)]에 기재되어 있다.

상이한 방법에 따라서, 목적하는 결합 특이성 (항체-항원 결합 부위)을 갖는 항체 가변 도메인을 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열에 융합시킨다. 이러한 융합은 바람직하게는, 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인을 사용한다. 이러한 융합물 중 하나 이상에 존재하는, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)을 갖는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 융합물을 코딩하고, 경우에 따라, 이뮤노글로불린 경쇄 를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내로 삽입하고, 이들을 적합한 숙주 유기체 내로 함께 형질감염시킨다. 이로써, 해당 작제에 사용된 동등하지 않은 비율의 3가지 폴리펩티드 쇄가 최적의 수율을 제공하는 실시양태에서 이들 3가지 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는 데 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동등한 비율의 둘 이상의 폴리펩티드 쇄의 발현이 고수율을 가져다 주는 경우나 이러한 비율이 특별한 유의성이 없는 경우에는, 3가지 폴리펩티드 쇄 중 2개 또는 이들 모두에 대한 코딩 서열을 하나의 발현 벡터 내에 삽입하는 것이 가능하다.

이러한 방법의 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 항체는 하나의 아암에 제1 결합 특이성을 갖는 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄와, 다른 아암에 하이브리드 이뮤노글로불린 중쇄-경쇄 쌍 (제2 결합 특이성을 제공해 줌)으로 구성된다. 이러한 비대칭 구조가, 바람직하지 못한 이뮤노글로불린 쇄 조합물로부터의 목적하는 이중특이적 화합물의 분리를 용이하게 해주는 것으로 밝혀졌는데, 이는 이뮤노글로불린 경쇄가 이러한 이중특이적 분자의 절반에만 존재함으로 인해 용이한 분리 방법이 제공되기 때문이다. 이러한 방법은 WO 94/04690에 기재되어 있다. 이중특이적 항체 생성에 대한 추가의 내용은, 예를 들면 문헌 [Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986)]을 참조할 수 있다. 미국 특허 제5,731,168호에 기재된 또다른 방법에 따르면, 항체 분자 쌍 간의 계면을 유전공학적으로 조작하여, 재조합 세포 배양물로부터 회수되는 헤테로이량체의 비율 (%)을 최대화할 수 있다. 바람직한 계면은 항체 불변 도메인의 C_H3 도메인의 적어도 일부를 포함한다. 이러 한 방법에서는, 제1 항체 분자의 계면으로부터의 하나 이상의 작은 아미노산 측쇄를 보다 큰 측쇄 (예: 티로신 또는 트립토판)으로 대체시킨다. 큰 측쇄(들)을 동일하거나 유사한 크기의 "캐비티(cavity)"로 보상하는 것은 큰 아미노산 측쇄를 보다 작은 아미노산 (예: 알라닌 또는 트레오닌)으로 대체시킴으로써 제2 항체 분자의 계면 상에서 일어난다. 이로써, 기타 바람직하지 못한 최종 생성물 (예: 호모이량체)에 비해 헤테로이량체의 수율을 증가시키는 기작이 제공된다.

이중특이적 항체는 가교결합 또는 "헤테로컨쥬게이트" 항체를 포함한다. 예를 들면, 헤테로컨쥬게이트 내의 항체 중 하나는 아비딘에 커플링시킬 수 있고 다른 항체는 비오틴에 커플링시킬 수 있다. 그러한 항체는 예를 들면 원치않는 세포로 면역계 세포를 표적화하고 (미국 특허 제4,676,980호) HIV 감염을 치료하기 위해 (WO 91/00360, WO 92/200373 및 EP 03089) 제안된다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 통상의 가교 결합법을 이용함으로써 제조될 수 있다. 적합한 가교결합제는 많은 가교결합 기술과 함께 당분야에 널리 공지되어 있으며 미국 특허 제4,676,980호에 기재되어 있다.

항체 단편으로부터 이중특이적 항체를 생성시키기 위한 기술도 당분야의 문헌에 보고되었다. 예를 들면, 이중특이적 항체는 화학적 가교를 이용하여 제조할 수 있다. 문헌 [Brennan et al., Science, 229:81 (1985)]에는 온전한 항체를 단백질 분해 효소로 절단하여 F(ab')₂ 단편을 생성시키는 과정이 기재되어 있다. 이들 단편을, 인접한 디티올을 안정화시키고 분자간 디설파이드 형성을 방지시키기 위한 디티올 결합체 형성제 나트륨 아르세나이트의 존재 하에 환원시킨다. 이어서, 이로써 발생된 Fab' 단편을 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환시킨다. 이어서, Fab'-TNB 유도체 중의 하나를 머캅토에틸아민으로 환원시킴으로써 Fab'-티올로 재전환시키고, 이를 등몰량의 기타 Fab'-TNB 유도체와 혼합하여 이중특이적 항체를 형성시킨다. 이로써 생성된 이중특이적 항체를 효소의 선택적인 고정화를 위한 물질로 사용할 수 있다.

최근의 과학 발달로 인해, 이. 콜라이로부터 Fab'-SH 단편을 직접적으로 회수하는 과정이 용이하게 되었는데, 이러한 단편을 화학적으로 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시킬 수 있다. 문헌 [Shalaby et al., J. Exp. Med., 175:217-225 (1992)]에는 완전히 인간화된 이중특이적 항체 F(ab')₂ 분자의 생산 방법이 기재되어 있다. 각각의 Fab' 단편을 이. 콜라이로부터 개별적으로 분비시키고, 시험관내에서 직집적으로 화학적 커플링시켜 이중특이적 항체를 형성시켰다. 이로써 형성된 이중특이적 항체는 ErbB2 수용체를 과발현하는 세포 및 정상적인 인간 T 세포와 결합할 수 있었을 뿐만 아니라 인간 유방 종양 표적에 대한 인간 세포독성 임파구의 용균 활성을 유도할 수 있었다.

재조합 세포 배양물로부터 이중특이적 항체 단편을 직접적으로 제조 및 단리하는 각종 기술 또한 기재되어 있다. 예를 들면, 루이신 지퍼 (zipper)를 사용하여 이중특이적 항체를 생성하였다 [Kostelny et al., J. Immunol., 148 (5):1547-1553 (1992)]. Fos 및 Jun 단백질로부터 상기 루이신 지퍼 펩티드를 유전자 융합 에 의해 2가지 상이한 항체의 Fab' 부분에 연결시켰다. 이러한 항체 호모이량체를 힌지 영역에서 환원시켜 단량체를 형성시킨 다음, 재산화시켜 항체 헤테로이량체를 형성시켰다. 이러한 방법 또한 항체 호모이량체를 생성하는 데 이용할 수도 있다. 문헌 [Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)]에 기재된 "디아바디" 기술은 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또다른 기작을 제공한다. 상기 단편은 너무 짧아 동일한 쇄 상의 두 도메인 간에 쌍을 형성시키지 못하는 링커에 의해 경쇄 가변 도메인 (V_L)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (V_H)을 포함한다. 따라서, 한 단편의 V_H 및 V_L 도메인을 또다른 단편의 상보적 V_L 및 V_H 도메인과 쌍을 형성하게 함으로써, 2개의 항원 결합 부위를 형성하는 데 촛점을 두고 있다. 단일쇄 Fv (sFv) 이량체를 사용함으로써 이중특이적 항체 단편을 제조하는 또 다른 방법도 보고되어 있다 [Grubber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)].

2가 이상의 항체도 고려된다. 예를 들면, 삼중 특이적 항체를 제조할 수 있다 [Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991)].

III . 컨쥬게이트 및 길항제의 다른 변형물

본 발명의 방법에 사용되거나 본원의 제품에 포함되는 길항제는 임의로 세포독성제에 결합시킨다.

이러한 길항제-세포독성제 컨쥬게이트의 생성에 유용한 화학요법제는 위에 기재되어 있다.

길항제와 하나 이상의 소분자 독소, 예컨대, 칼리케아미신, 메이탄신 (미국 특허 제5,208,020호), 트리코텐 및 CC1065와의 컨쥬게이트도 본원에 포함된다. 본 발명의 한 바람직한 실시양태에서, 길항제는 하나 이상의 메이탄신 분자 (예를 들면, 길항제 분자 당 약 1 내지 약 10개의 메이탄신 분자)에 결합된다. 메이탄신은, 예를 들면, May-SH3으로 환원될 수 있는 May-SS-Me로 전환될 수 있으며 변형된 길항제와 반응하여 메이탄시노이드-길항제 컨쥬게이트를 형성할 수 있다 [Chari et al.. Cancer Research 52:127-131 (1992)].

별법으로, 길항제는 하나 이상의 칼리케아미신 분자에 결합된다. 이중 가닥 DNA를 생산할 수 있는 칼리케아미신 족의 항생제는 피코몰 이하의 농도에서 파괴된다. 사용될 수 있는 칼리케아미신의 구조적 동족체로는 γ₁ ^I, α₂ ^I, α₃ ^I, N-아세틸-γ₁ ^I, PSAG 및 θ₁ ^I이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다 [Hinman et al.. Cancer Research 53:3336-3342 (1993) and Lode et al.. Cancer Research 58:2925-2928 (1988)].

사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편으로는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄 (슈도모나스 아에루기노사로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디이 단백질, 디안틴 단백질, 파이토라카 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모르디카 카란티아 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센이 있다 [1993. 10. 28에 공개된 WO 93/21232 참조].

본 발명은 또한 핵분해 활성을 갖는 화합물 (예를 들면, 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제, 예를 들면 데옥시리보뉴클레아제; DNase)와 결합된 길항제를 포함한다.

레디오컨쥬게이트 길항제의 생산에 각종 방사성 동위원소가 사용될 수 있다. 그 예로는 At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³² 및 Lu의 방사성 동위원소가 있다.

길항제와 세포독성제와의 컨쥬게이트는 각종 이관능성 단백질 커플링제, 예를 들면, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실레이트, 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이관능성 유도체 (예: 디메틸 아디프이미데이트 HCL), 활성 에스테르 (예: 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드 (예: 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예: 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예: 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예: 톨리엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 불소 화합물 (예: 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 만들 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 문헌 [Vitetta et al., Scence 238:1098 (1987)]에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 탄소-14-표지 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DPTA)은 길항제에 대한 레디오뉴클레오티드의 결합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다 (WO 94/11026 참조 ). 링커는 세포내에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "절단가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산 불안정 링커, 펩티다제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술파이드 함유 링커가 사용될 수 있다 (Chari et al., Cancer Research 52:127-131 참조].

별법으로, 길항제 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질을, 예를 들면 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 제조할 수 있다.

또다른 양태에서는, 길항제를 종양 예비표적화에 사용하기 위하여 "수용체" (예: 스트렙타비딘)에 결합시킬 수 있는데, 여기서 길항제-수용체 컨쥬게이트를 환자에게 투여한 다음, 세척제를 사용하여 순환계로부터 비결합된 컨쥬게이트를 제거한 후, 세포독성제 (예: 레디오뉴클레오티드)에 결합되는 "리간드" (예: 아비딘)를 투여한다.

본 발명의 길항제는, 전구약물 (예: 펩티딜 화학요법제; WO 81/01145 참조)을 활성 항암제로 전환시키는 전구약물 활성화 효소와 결합시킬 수도 있다 [예를 들면, WO 88/07378 및 미국 특허 제4,975,278호 참조].

이러한 컨쥬게이트의 효소 성분은, 이를 보다 활성이고 세포독성인 형태로 전환시키는 방식으로 전구약물 상에서 작용할 수 있는 효소가 포함된다.

본 발명의 방법에 유용한 효소에는 포스페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 알칼리성 포스파타제; 술페이트 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 아릴술파타제; 무독성 5-플루오로시토신을 항암제인 5-플루오로우라실로 전환시키는 데 유용한 시토신 데아미나제; 펩티드 함유 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 프로테아제, 예를 들면, 세라티아 프로테아제, 써모라이신, 서브틸리신, 카르복시펩티다제 및 카텝신 (예: 카텝신 B 및 L); D-아미노산 치환체를 함유하는 전구약물을 전환시키는 데 유용한 D-알라닐카르복시펩티다제; 글리코실화 전구약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 탄수화물 절단 효소, 예를 들면, β-갈락토시다제 및 뉴라미니다제; β-락탐으로 유도체화된 약물을 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 β-락타마제; 및 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도체화된 약물을 각각 유리 약물로 전환시키는 데 유용한 페니실린 아미다제, 예를 들면, 페니실린 V 아미다제 또는 페니실린 G 아미다제가 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또는, 당분야에 "아브자임 (abzyme)"으로도 공지되어 있는, 효소 활성을 갖는 항체를 사용하여 본 발명의 전구약물을 자유 활성 약물로 전환시킬 수 있다 [Massey, Nature 328:457-458 (1987)]. 아브자임을 종양 세포 집단에 전달하기 위한 길항제-아브자임 결합체는 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다.

본 발명의 효소는 상기 논의된 헤테로이관능성 가교결합 시약을 사용하는 것과 같이, 당분야에 널리 공지된 기술에 의해 길항제에 공유 결합시킬 수 있다. 또는, 본 발명의 효소의 적어도 기능적 활성 부분에 연결된 본 발명의 길항제의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은, 당분야에 널리 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조할 수 있다 [Neuberger et al., Nature 312:604-608 (1984)].

길항제의 다른 변형물도 본원에 포함된다. 예를 들어, 길항제는 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예컨대, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리 옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체에 연결시킬 수 있다.

본원에 개시된 길항제는 리포좀으로서 제제화될 수도 있다. 길항제를 함유하는 리포좀은 당분야에 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 미국 특허 제4,485,045호 및 제4,544,545호; 및 WO 97/38731 (1997. 10.23자로 공개됨)]에 기재된 방법으로 제조한다. 순환 시간이 증진된 리포좀이 미국 특허 제5,013,556호에 개시되어 있다.

특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도체화 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물을 사용하는 역상 증발 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 리포좀을 일정한 공극 크기의 필터를 통하여 압출시켜, 목적하는 직경을 갖는 리포좀을 생성시킨다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 디설파이드 교환 반응을 통하여 문헌[Martin et al., J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)]에 기재된 바와 같이 리포좀에 결합시킬 수 있다. 임의로, 화학요법제를 이러한 리포좀에 함유시킨다 [Gabizon et al., J. National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989)].

본원에 기재된 단백질 또는 펩티드 길항제의 아미노산 서열 변형물(들)이 고려된다. 예를 들면, 길항제의 결합 친화도 및(또는) 기타 생물학적 특성을 개선시키는 것이 바람직할 수 있다. 길항제의 아미노산 서열 변이체는 적당한 뉴클레오티드 변화를 길항제 핵산에 도입하여 제조하거나, 펩티드 합성에 의해 제조한다. 이러한 변형에는, 예를 들면, 길항제의 아미노산 서열 내의 잔기로부터의 결실, 및(또는) 잔기로의 삽입 및(또는) 잔기의 치환이 포함된다. 최종 작제물에 도달하기 위한 결실, 삽입 및 치환의 어떠한 조합도 가능한데, 단 최종 작제물은 목적하는 특징을 보유해야 한다. 상기 아미노산 변화는 또한, 길항제의 번역 후 과정을 변화시킬 수 있는데, 예를 들면 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시킬 수 있다.

돌연변이유발에 바람직한 위치인, 길항제의 특정 잔기 또는 영역을 동정하는 데 유용한 방법은 문헌 [Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)]에 기재된 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불리운다. 여기서, 표적 잔기 또는 잔기 군을 동정하고 (예를 들면, arg, asp, his, lys 및 glu과 같은 하전된 잔기), 이를 중성 또는 음전하를 띤 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)으로 대체시킴으로써, 상기 아미노산과 항원의 상호작용에 영향을 준다. 이어서, 이러한 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 아미노산 부위들은, 다른 변이체 또는 기타 변이체를 치환 부위에 또는 치환 부위 대신에 도입함으로써 정의된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 예정되어 있지만, 돌연변이 자체의 성질은 예정될 필요가 없다. 예를 들면, 주어진 부위에서의 돌연변이의 성능을 분석하기 위해서, 표적 코돈 또는 영역에서 알라닌 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 수행하고, 발현된 길항제 변이체를 목적하는 활성에 대해 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입물에는 1개의 잔기 내지 수 백개 이상의 잔기를 함유하는 길이의 폴리펩티드의 아미노- 및(또는) 카르복실-말단 융합물 뿐만 아니라 단일 또 는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입물이 포함된다. 말단 삽입물의 예에는 N-말단 메티오닐 잔기를 갖는 길항제 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 길항제가 포함된다. 길항제 분자의 기타 삽입 변이체에는 길항제의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드 또는 효소 (예: ADEPT용 효소)에 대한 길항제의 N- 또는 C-말단과의 융합물이 포함된다.

또 다른 유형의 변이체는 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 상이한 잔기로 대체된, 길항제 분자 내의 1개 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 치환 돌연변이유발에 가장 큰 관심을 끄는 부위에는 초가변 영역이 포함되지만, FR 변이도 또한 고려된다. 보존적 치환이 "바람직한 치환부"란 표제 하에 표 1에 제시되어 있다. 이러한 치환으로 생물학적 활성이 변하게 되면, 표 1에서 "예시적 치환부"로 명명되거나 아미노산 부류를 참조하여 하기 추가로 기재된 바와 같은 보다 실질적인 변화가 도입될 수 있고, 생성물을 스크리닝할 수 있다.

본래의 잔기	예시적 치환기	바람직한 치환기
Ala (A)	val; leu; ile	val
Arg (R)	lys; gln; asn	lys
Asn (N)	gln; his; asp; lys; arg	gln
Asp (D)	glu; asn	glu
Cys (C)	ser; ala	ser
Gln (Q)	asn; glu	asn
Glu (E)	asp; gln	asp
Gly (G)	ala	ala
His (H)	asn; gln; lys; arg	arg
Ile (I)	leu; val; met; ala; phe; 노르루이신	leu
Leu (L)	노르루이신; ile; val; met; ala; phe	ile
Lys (K)	arg; gln; asn	arg
Met (M)	leu; phe; ile	leu
Phe (F)	leu; val; ile; ala; tyr	tyr
Pro (P)	ala	ala
Ser (S)	Thr	thr
Thr (T)	Ser	ser
Trp (W)	tyr; phe	tyr
Tyr (Y)	trp; phe; thr; ser	phe
Val (V)	ile; leu; met; phe; ala; 노르루이신	leu

생물학적 성질에 있어서의 실질적인 변화는 (a) 치환 영역 내의 폴리펩티드 골격의 구조, 예를 들면 시트 또는 나선 입체 구조를 유지하는 데 있어서의 이들의 효과, (b) 표적 부위에서의 상기 분자의 전하 또는 소수성을 유지하는 데 있어서의 이들의 효과, 또는 (c) 측쇄의 벌크를 유지하는 데 있어서의 이들의 효과가 상당히 상이한 치환부를 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 통상의 측쇄 성질을 기준으로 하여 다음 그룹으로 구분된다:

(1) 소수성: 노르루이신, met, ala, val, leu, ile;

(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;

(3) 산성: asp, glu;

(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;

(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및

(6) 방향족: trp, tyr, phe.

비-보존적 치환은 이들 부류 중의 하나의 구성원을 또다른 부류로 교체함으로써 이루어질 것이다.

길항제의 적당한 입체 구조를 유지하는 것과 관련이 없는 어떠한 시스테인 잔기도 일반적으로 세린으로 치환되어 상기 분자의 산화적 안정성을 향상시키고 이상한 가교결합을 방지할 수 있다. 역으로 말하면, 시스테인 결합(들)을 길항제에 가하여 그의 안정성을 향상시킬 수 있다 (특히, 길항제가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).

특히 바람직한 유형의 치환 변이체는 모 항체 (예: 인간화 또는 인간 항체)의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 이로써 생성된, 추가의 개발을 위해 선택된 변이체(들)은 이들을 생성시킨 모 항체에 비해 개선된 생물학적 성질을 지닐 것이다. 이러한 치환 변이체를 생성시키는 편리한 방법은 파지 디스플레이를 이용하는 친화 성숙화 과정이다. 간략하게 언급하면, 몇 개의 초가변 영역 부위 (예: 6 내지 7개 부위)를 돌연변이시켜 각 부위에 가능한 모든 아미노산 치환부를 생성시킨다. 이로써 생성된 항체 변이체는, 각 입자 내에 포장된 M13의 유전자 III 생성물과의 융합물로서 필라멘트상 파지 입자로부터 1가 방식으로 디스플레이된다. 이어서, 이와 같이 파지 디스플레이된 변이체를 본원에 기재된 바와 같이 이들의 생물학적 활성 (예: 결합 친화도)에 대해 스크리닝한다. 변형에 적합한 후보 초가변 영역 부위를 동정하기 위해서는, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발을 수행하여, 실질적으로 항원 결합에 기여하는 초가변 영역 잔기를 동정할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 항원-항체 복합체의 결정 구조를 분석하여 상기 항체와 항원 간의 접촉점을 동정하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 접촉 잔기와 이에 이웃하는 잔기가 본원에서 검토된 기술에 따라서 치환하기 위한 후보이다. 이러한 변이체가 일단 생성되면, 변이체 패널을 본원에 기재된 바와 같이 스크리닝하고, 한 가지 이상의 관련 검정법에서 우수한 성질을 나타내는 항체를 추가의 개발을 위해 선별할 수 있다.

길항제의 아미노산 변이체 중 다른 유형의 변이체는 길항제 고유의 글리코실화 패턴을 변화시킨다. 변화란 의미는 길항제에서 발견된 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실 및(또는) 길항제 내에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가이다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결되거나 O-연결된 것이다. N-연결된이란 탄수화물 잔기가 아스파라진 잔기의 측쇄에 부착된 것을 말한다. 트리펩티드 서열 아스파라진-X-세린 및 아스파라진-X-트레오닌 (여기서, X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산임)은 탄수화물 잔기를 아스파라진 측쇄에 효소적으로 부착시키기 위한 인식 서열이다. 따라서, 이들 트리펩티드 서열 중의 하나가 폴리펩티드에 존재함으로써, 잠재적인 글리코실화 부위가 생성된다. O-연결된 글리코실화는 당 N-아세틸갈락토사민, 갈락토스 또는 크실로스 중의 하나를 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 부착시키는 것을 의미하지만, 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록시라이신을 사용할 수도 있다.

길항제로의 글리코실화 부위의 부가는 하나 이상의 상기 언급된 트리펩티드 서열을 함유하도록 아미노산 서열을 변화시킴으로써 편리하게 달성된다 (N-연결된 글리코실화 부위의 경우). 이러한 변화는 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 최초 항체의 서열에 부가하거나 이들 잔기로 치환함으로써 이루어질 수도 있다 (O-연결된 글리코실화 부위의 경우).

길항제의 아미노산 서열 변이체를 코딩하는 핵산 분자는 당분야에 공지된 각종 방법에 의해 제조된다. 이들 방법에는 천연 공급원으로부터의 단리 방법 (자연 발생 아미노산 서열 변이체의 경우), 또는 앞서 제조된 길항제의 변이체 또는 비-변이체 변형물의 올리고뉴클레오티드 매개 (또는 부위 특이적) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발에 의한 제조 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들면, 본 발명의 길항제의 항원-의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC) 및(또는) 보체 의존성 세포독성 (CDC)이 향상되도록, 길항제의 작용 기능을 변화시키는 것이 바람직할 수 있다. 이는 상기 항체 길항제의 Fc 영역 내에 하나 이상의 아미노산 치환부를 도입함으로써 달성할 수 있다. 별법으로 또는 부가적으로, 시스테인 잔기(들)를 Fc 영역 내에 도입함으로써, 이러한 영역에서 쇄간 디설파이드 결합을 형성시킬 수 있다. 이로써 생성된 호모이량체 항체는 개선된 내부이행 능력 및(또는) 증가된 보체 매개 세포 사멸성과 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 [Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) and Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)]. 향상된 항종양 활성을 갖는 호모이량체 항체는 또한, 문헌 [Wolff et al., Cancer Research 53:2560-2565 (1993)]에 기재된 바와 같이 헤테로이관능성 가교결합제를 사용하여 제조할 수도 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 갖는 항체를 유전공학적으로 조작함으로써, 향상된 보체 용균성과 ADCC 능력을 가질 수 있다 [Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)].

길항제의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 예를 들어 미국 특허 제5,739,277호에 기재된 바와 같이 구제 (salvage) 수용체 결합 에피토프를 길항제 (특히 항체 단편) 내로 혼입시킬 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내 혈청 반감기를 증가시키는 것에 관여하는 IgG 분자 (예: IgG₁, IgG₂, IgG₃, 또는 IgG₄)의 Fc 영역의 에피토프를 말한다.

IV . 제약 제제

본 발명에 따라서 사용된 길항제의 치료 제제는, 목적하는 순도를 갖는 길항제를 임의로 제약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]와 혼합함으로써, 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 저장되도록 제조한다. 허용되는 담체, 부형제, 또는 안정화제는 이용된 투여량과 농도에서 수용자에게 무독성이고, 인산염, 시트르산염 및 기타 유기 산 등의 완충제; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함한 항산화제; 방부제 (예를 들면, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤즈에토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 메틸 또는 프로필 파라벤 등의 알킬 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 예를 들면 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린; 폴리비닐피롤리돈 등의 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신 등의 아미노산; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한, 모노사카라이드, 디사카라이드 및 기타 탄수화물; EDTA 등의 킬레이트화제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 솔비톨 등의 당; 나트륨 등의 염 형성 반대-이온; 금속 착물 (예: Zn-단백질 착물); 및(또는) TWEEN(상표명), PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 등의 비이온성 계면활성제를 포함한다.

예시적 항-CD20 항체 제제는 WO98/56418에 기재되어 있고, 이 문헌의 내용은 본 명세서에 명백히 포함되는 것으로 한다. 이 공개 출원에는 40 mg/mL의 리툭시맵, 25 mM 아세테이트, 150 mM 트레할로스, 0.9%의 벤질 알코올, 2-8℃에서 2년의 최소 반감기를 갖는 0.02%의 폴리소르베이트 20 (pH 5.0)을 포함하는 수회 투여용 액상 제제가 기재되어 있다. 관심있는 다른 항-CD20 제제는 9.0 mg/mL 염화나트륨 중의 10 mg/mL의 리툭시맵, 7.35 mg/mL의 소듐 시트레이트 디히드레이트, 0.7 mg/mL의 폴리소르베이트 80 및 주사용 멸균수 (pH 6.5)를 포함한다.

피하 투여에 적합한 동결건조 제제가 WO 97/04801에 기재되어 있다. 이러한 동결건조 제제는 적절한 희석제를 사용하여 고 단백질 농도로 재구성될 수 있고, 재구성된 제제는 본원에서 치료될 포유동물에게 피하로 투여될 수 있다.

본원의 제제는 또한, 치료 받을 특정 증상에 필요한 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로에 대해 불리한 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들면, 세포독성제, 화학요법제, 사이토킨 또는 면역억제제 (예: T 세포에 결합하는 사이클로스포린 또는 항체와 같은, T 세포에 작용하는 약제, 예를 들어, LFA-1에 결합하는 약제)를 제제에 추가로 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 약제의 유효량은 제제에 존재하는 길항제의 양, 질환 또는 장애의 유형이나 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자에 달려 있다. 이들은 일반적으로 앞서 사용된 것과 동일한 투여량 및 투여경로로 사용되거나 앞서 사용된 투여량의 약 1 내지 99%로 사용된다.

활성 성분은 또한 코아세르베이션 (coacervation) 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포좀, 알부민 미소구, 미소에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼에서, 예를 들면, 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-미소캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 미소캡슐 각각으로부터 제조된 미소캡슐 내에 포획시킬 수도 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)]에 기재되어 있다.

지속 방출형 제제를 제조할 수 있다. 지속 방출형 제제의 적합한 예에는 길항제를 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되는데, 이러한 매트릭스는 성형품, 예를 들면 필름 또는 미소캡슐 형태이다. 지속 방출형 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들면 LUPRON DEPOT (상표명) (락트산-글리콜산 공중합체와 루프롤라이드 아세테이트로 구성된 주사 가능한 미소구), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 포함된다.

생체내 투여에 사용될 제제는 멸균해야 한다. 이는 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 수행된다.

V. 길항제로의 치료

CD20에 결합하는 길항제를 사용하여 포유동물에서 외래 항원에 대한 면역 반응을 차단할 수 있는데, 여기서, 포유동물은 악성 종양을 앓지 않는다. 바람직하게는, 길항제는 항-CD20 항체를 포함한다. 한 실시양태에서 상기 항체는 세포독성제와 결합하지 않고, 다른 실시양태에서 상기 항체는 세포독성제 (예를 들어, Y2B8 또는 ¹³¹I-B1)와 결합한다.

본원에서 치료할 포유동물은 CD20에 결합하는 길항제, 및 다른 치료제, 예를 들어, 포유동물에서 면역원성인 치료제 둘 다에 노출시킬 수 있다. 이 실시양태에서, 길항제는 그로 치료 받는 포유동물에서 치료제에 대한 면역 반응을 차단시킬 수 있다. 치료적인 면에서의 장점은 비장에 의한 항체 코팅 세포 제거의 차단을 포함할 수도 있다. 치료제는 치료 유효량으로 포유동물에게 투여되어 치료제의 투여로부터 효과를 얻을 수 있는 질환 또는 장애를 치료한다. 이 실시양태에서, 치료제 및 길항제를 포유동물에게 동시에, 또는 순서와 관계없이 따로 투여할 수 있다. 그러므로, 길항제를 포유동물에게 투여한 후 치료제를 투여할 수 있고, 또는 치료제를 포유동물에게 투여한 후 길항제를 투여할 수 있다.

따라서, CD20에 결합하는 길항제를 사용하여 포유동물에서 이식편-대-숙주 또는 숙주-대-이식편 질환을 치료하고(거나) 조직을 받으려는 포유동물의 민감성을 감소시킬 수 있다.

본원에 개시된 다양한 지시의 경우, CD20에 결합하는 길항제를 포함하는 조성물은 우수한 의학적 관행과 일치하는 방식으로 제제화하고 투여량을 결정하여 투여한다. 본원에서 고려하는 인자에는 치료할 특정 질환 또는 증상, 치료할 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 증상, 질환 또는 증상의 원인, 약제가 전달되는 부위, 투여 방법, 투여 스케쥴, 및 의학적 분야의 숙련가에게 공지된 다른 인자가 포함된다. 투여될 길항제의 치료 유효량은 이러한 인자들을 고려하여 결정할 것이다.

일반적인 제안에 의하면, 1회 투여 당 경구 투여되는 길항제의 치료 유효량은 약 0.1 내지 20 mg/kg(환자의 체중)/일이고 사용되는 길항제의 전형적인 초기 양은 약 2 내지 10 mg/kg이다.

바람직한 길항제는 세포독성제에 결합되지 않은 항체, 예를 들어, RITUXAN(등록상표)와 같은 항체이다. 결합되지 않은 항체의 적절한 투여량은 예를 들어, 약 20 mg/m² 내지 약 1000 mg/m²이다. 한 실시양태에서, 항체의 투여량은 RITUXAN(등록상표)에 대하여 현재 권장되는 투여량과 다르다. 예를 들어, 실질적으로 375 mg/m² 미만의 항체, 예를 들어, 약 20 mg/m² 내지 약 250 mg/m², 예를 들어, 약 50 mg/m² 내지 약 200 mg/m²의 투여량을 1회 이상 환자에게 투여한다.

또한, 초기 투여량의 항체를 1회 이상 투여한 후 후속 투여량을 1회 이상 투여할 수 있는데, 여기서 후속 투여량 중의 항체의 mg/m² 투여량은 초기 투여량 중의 항체의 mg/m² 투여량을 초과한다. 예를 들어, 초기 투여량은 약 20 mg/m² 내지 약 250 mg/m² (예를 들어, 약 50 mg/m² 내지 약 200 mg/m²)일 수 있고 후속 투여량은 약 250 mg/m² 내지 약 1000 mg/m²일 수 있다.

그러나, 상술한 바와 같이, 길항제의 이러한 제안된 양은 치료적인 면에서 많은 신중을 기울여야 한다. 적절한 투여량을 선택하고 투여 계획을 세우는 데 있어서의 핵심 인자는 상기한 바와 같이 얻은 결과이다. 예를 들어, 상대적으로 높은 투여량은 진행성 및 급성 질환의 초기 치료에 필요할 수 있다. 질환 또는 증상에 따라 다른 가장 효과적인 결과를 얻기 위해, 질환 또는 증상의 첫 번째 징후, 진단, 양상 또는 발생과 가능한 가까운 시기에, 또는 질환 또는 증상이 완화하는 동안에 길항제를 투여한다.

길항제는 비경구, 피하, 복강내, 폐동맥내 및 비강내, 그리고 국소 면역억제 치료를 원하는 경우에는 병소내 투여를 비롯한 임의의 적절한 방법으로 투여한다. 비경구 관주에는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 또한, 길항제는 예를 들어, 길항제의 투여량을 감소시키면서 펄스 관주로 적절하게 투여할 수 있다. 바람직하게는, 주사, 가장 바람직하게는, 정맥내 또는 피하 주사로 투여하며, 정맥내 주사와 피하 주사 중의 선택은 투여 기간이 단기인지 아니면 장기인지에 부분적으로 달려 있다.

세포독성제, 화학요법제, 면역억제제 및(또는) 사이토킨과 같은 다른 화합물을 본원의 길항제와 함께 투여할 수 있다. 이렇게 함께 투여하는 방법에는 분리된 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하여 함께 투여하는 방법, 및 순서대로 연속 투여하는 방법이 포함되는데, 상기 연속 투여 방법에서 두 활성제 (또는 모든 활성제)를 그들의 생물 활성이 동시에 나타나는 기간이 있는 것이 바람직하다.

단백질 길항제를 환자에게 투여하는 것 이외에, 본원은 유전자요법으로 길항제를 투여하는 것도 고려한다. 길항제를 코딩하는 핵산의 이러한 투여는 "치료 유효량의 길항제를 투여하는 것"이라는 표현에 포함된다. 예를 들어, 세포내 항체를 생성하기 위한 유전자요법의 이용에 관해서는 1996년 3월 14일 공개된 WO96/07321을 참조한다.

핵산 (임의로 벡터에 포함된 것)을 생체내 및 생체외에서 환자의 세포내로 도입하는 두 가지 주요 방법이 있다. 생체내 전달의 경우, 핵산은 대체적으로 길항제가 필요한 환자의 부위에 직접 주사한다. 생체외 치료의 경우, 환자의 세포를 적출하고 핵산을 이들 단리된 세포내에 도입하고, 변이된 세포를 환자에게 직접, 또는 예를 들어 환자에 이식되는 다공성 막내에 캡슐화된 상태로 투여한다 (예를 들어, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조). 핵산을 생존 세포에 도입하는 데 이용할 수 있는 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 시험관내에서 배양된 세포로 전달되느냐 아니면 목적하는 숙주의 생체내 세포에 전달되느냐에 따라 다르다. 핵산을 시험관내에서 포유동물 세포내로 전달하기에 적합한 기술에는 리포좀의 사용, 일렉트로포레이션, 미세주입, 세포 융합, DEAE-텍스트란, 인산칼슘 침전법 등이 포함된다. 유전자의 생체외 전달에 통상적으로 사용되는 벡터는 레트로바이러스이다.

현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술에는 바이러스 벡터(예컨대, 아데노바이러스, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스)를 사용한 형질감염 및 지질 기재 시스템 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임)이 포함된다. 몇몇 경우, 세포막 단백질 또는 표적 세포에 특이적인 항체, 표적 세포 상의 수용체에 대한 리간드 등과 같은, 표적 세포를 표적화하는 물질과 함께 핵산 공급원을 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 엔도사이토시스 (endocytosis)와 관련된 세포 표면막 단백질에 결합하는 단백질은 표적화에 사용되고(되거나), 예를 들어, 특정 세포 유형에 친화적인 캡시드 단백질 또는 그의 단편, 엔도사이토시스 사이클에서 세포내로 들어가는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 국소화 (localization)를 표적으로 하여 세포내 반감기를 향상시키는 단백질의 유입을 용이하게 하는 데 사용할 수 있다. 수용체-매개 엔도사이토시스의 기술은 예를 들어, 문헌 (Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); 및 Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990))에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 마킹 (marking) 및 유전자요법 프로토콜에 대한 자세한 내용은 문헌 (Anderson et al., Science 256: 808-813 (1992))을 참조한다. WO 93/25673 및 본원에 언급된 참조 문헌도 참조할 수 있다.

VI . 제품

본 발명의 또 다른 양태에서는, 위에 기재된 질환 또는 증상의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 이러한 제품은 용기와, 이러한 용기 상의 표지 또는 포장 삽입물 또는 이러한 용기와 연관된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들면 병, 바이알, 주사기 등이 포함된다. 이러한 용기는 유리나 플라스틱과 같은 각종 재료로부터 형성될 수 있다. 상기 용기는 해당 질환 또는 증상을 치료하는 데 효과적인 조성물을 보유하거나 함유하며, 멸균된 출입구를 가질 수 있다 (예를 들어, 이러한 용기는 피하 주사 바늘로 꿰뚫을 수 있는 마개를 갖는 정맥내 용액제 백 또는 바이알일 수 있음). 이러한 조성물 중의 하나 이상의 활성제가 CD20에 결합하는 길항제이다. 상기 표지 또는 포장 삽입물은 해당 조성물이 외래 항원에 대한 면역 반응의 차단 및(또는) 본원에 기재된 질환 또는 증상의 치료에 사용된다는 것을 지시한다. 또한, 제품은 제약학적으로 허용되는 희석 완충제, 예를 들면 멸균된 주사용 물 (BWFI), 인산염 완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제2 용기를 추가로 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 제2 용기는 조성물 중의 활성제가 치료제인 조성물을 보유하거나 함유한다. 포장 삽입물은 환자가 본 발명의 이 실시양태의 두 조성물로 치료 받아야 한다는 것을 지시할 수 있다. 제품은 기타 완충제, 희석제, 여과제, 바늘 및 주사기를 비롯하여 상업적인 관점 및 사용자 관점에서 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따라, CD20에 결합하는 길항제를 악성 종양을 앓지 않는 포유동물에게 치료 유효량으로 투여하여, 상기 포유동물에서 외래 항원에 대한 면역 반응을 효과적으로 차단할 수 있다.

본 발명의 자세한 설명은 하기 비제한적 실시예에 의해 설명된다. 명세서에서 언급된 모든 문헌의 개시 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다.

<실시예 1>

치료 단백질에 대한 면역 반응의 차단

본 실시예에서, 항-CD20 항체를 사용하여 특정한 치료 단백질 즉, 거핵세포 생장 및 발달 인자 (MGDF, 트롬보포이에틴 또는 Mpl 리간드로도 알려짐)에 대한 면역 반응을 차단한다. 특히, 재조합 인간 MGDF의 페길레이트 (pegylated) 형태 (PEG-rHuMGDF)는 암 환자 및 혈소판 공여자에서 중화 항체를 발생시키는 것으로 보고되어 있다. 본원에 개시된 항-CD20 항체의 투여는 PEG-rHuMGDF에 대한 면역 반응, 특히 체액성 면역을 완화시킬 것이다.

PEG-rHuMGDF는 미국 특허 제5,795,569호 (1998년 8월 18일 간행, 본원에 그 내용이 명백히 포함되는 것으로 함)에 기재된 바와 같이 제조한다. PEG-rHuMGDF는 N-말단의 α-아미노기에 부착된 단일 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)이 있는 인간 이. 콜라이 유래 MGDF의 아미노산 1-163 (성숙 단백질의 앞쪽부터 번호를 매김)으로 구성된다.

예를 들어, 화학요법 또는 방사선요법으로 인한 혈소판감소증을 앓는 환자의 혈소판 수를 증가시키기에 적절한 투여량, 예를 들어, 체중 1 kg 당 0.1 내지 1000 마이크로그램의 MGDF를 상기 환자에게 투여한다. MGDF 치료법은 임의로 1종 이상의 다른 사이토킨, 예를 들어, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 인터루킨-3 (IL-3) 및 과립구 거핵세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF)의 투여와 함께 병행한다.

이렇게 치료 받은 환자의 항-MGDF 항체 역가는 항체 역가 효소결합 면역흡착 분석법(ELISA)과 같은 적당한 분석법으로 모니터링한다. 그 후, MGDF에 대한 낮은 역가의 면역 반응을 보이는 환자는 항-CD20 항체, 예컨대, RITUXAN(등록상표)을 사용한 치료를 위한 후보자이다. 항-CD20 항체를 MGDF로의 치료 후에 투여하거나, MGDF로의 치료와 동시에 투여하거나 MGDF로의 치료에 앞서 투여할 수 있다. 항-CD20 항체의 적합한 투여량은 375 mg/m² (주 당 4회 관주에 의해 투여됨)이다. 그러나, 더 적은 투여량, 예를 들어, 약 50 내지 약 250 mg/m²의 투여량도 투여할 수 있다. 항-CD20 항체를 환자에게 투여하면 상기한 바와 같이 MGDF 및 항-CD20 둘 다로 치료 받은 환자에서 항-MGDF 항체의 형성이 저해되거나 허용 가능한 수준으로 감소될 것이다. 따라서, 치료 값이 매우 크고 면역원성이 공지된 단백질 약물의 경우, 본원에 기재된 항-CD20 항체를 함께 투여하면 상기 약물을 환자에게 투여시 발생하는 면역원성 부작용이 치료될 것이다.

<실시예 2>

유전자요법 바이러스 벡터에 대한 면역 반응의 차단

생체내에서 치료 유전자를 전달하는, E1, E3-결실, 복제-불능 재조합 아데노 바이러스의 능력을 조사하였다. E2a 또는 E4 영역에서의 추가 결실이 있는 신규 벡터가 개발되어 있다 (Christ et al., Immunol. Let. 57: 19-25 (1997)). 이들 바이러스 영역의 결실에도 불구하고, 초기 및 말기 바이러스 유전자가 생체내에서 낮은 수준으로 발현된다. 항-아데노바이러스 항체의 생성, 세포성 면역 반응 뿐만 아니라 벡터의 초기 비특이적 제거는 성공적인 유전자요법에 대한 장애가 된다. 아데노바이러스에 대한 중화 항체의 생성을 억제하거나 허용 가능한 수준으로 감소시키기 위해, 항-CD20 항체 (예컨대, RITUXAN(등록상표))를 본원에 기재된 유전자요법 환자에게 투여한다.

예를 들면, 낭성 섬유증 환자는 인간 낭성 섬유증 막횡단 전위 조절제 (CFTR)를 발현하는 복제-불능 아데노바이러스로 치료한다 (Bellon et al., Human Gene Therapy 8: 15-25 (1997)). CFTR 유전자요법 벡터의 적당한 투여량 (바이러스 플라크 형성 단위, pfu라는 용어로 정의됨)을 에어로졸로 투여하여 폐에서의 CFTR의 발현 (예를 들어, 약 10⁷ 내지 약 10⁹ pfu)을 달성한다. 환자내의 항-아데노바이러스 항체는 ELISA, 면역형광법 및(또는) 보체 고정화법으로 검출할 수 있다. 항-아데노바이러스 항체가 검출되는 환자에서, 항-CD20 항체 (예를 들어, 키메라 2H7; 미국 특허 제5,677,180호)를 임의로 다른 면역억제 약물 (예를 들어, 시클로포스프아미드, FK506, 또는 T 세포 수용체 또는 공자극 경로를 차단하는 모노클로날 항체)과 함께, 유전자요법 벡터의 재투여 전에, 재투여와 동시에, 또는 재투여 후에 환자에게 투여한다. 항-CD20 항체의 적합한 투여량은 375 mg/m² (주 당 4회 관주)이다. 항-CD20 항체를 투여하면 환자의 면역 반응이 감소 또는 제거되어 (항-아데노바이러스 항체 생성이 감소되어) 성공적인 유전자요법의 재치료가 용이하게 된다.

<실시예 3>

이식조직에 대한 면역 반응의 차단

항-CD20 항체는 급성 거부의 예방을 위한 조합 면역억제 투약법의 일부로 사용한다. 이러한 경우, 항-CD20 항체, 예를 들어 RITUXAN(등록상표)은 시클로스포린, 코르티코스테로이드, 마이코페놀레이트 모페틸과 같은, T 세포에 작용하는 약제를 포함하는 일련의 병용 투약법의 일부로서 항-IL2 수용체 항체와 함께 또는 항-IL2 수용체 항체 없이 조직 이식 기간에 투여한다. 따라서, 항-CD20 항체는 만성 면역억제요법과 함께 사용되는 유도 투약법의 일부로서 간주된다. 항-CD20 항체는 항원-제시 세포의 고갈을 통해 동종항원 생성을 억제하고(하거나) 동종항원 제시에 영향을 줌으로써 동종거부 반응의 예방에 기여할 수 있다.

상기 치료법은 조직이식 전 또는 조직이식 기간에 RITUXAN(등록상표)을 주 당 4회 관주 (375 mg/m²)할 것을 필요로 할 수 있다. 다른 면역억제제의 적절한 투여량은 다음과 같다: 시클로스포린 (5 mg/kg/일); 코르티코스테로이드 (1 mg/kg, 점차적으로 감소됨); 마이코페놀레이트 모페틸 (1일 당 2회 1그람씩 투여); 및 항-IL2 수용체 항체 (1 mg/kg, 매주 5회 관주). 또한, 항-CD20 항체는 폴리클로날 항-림프구 항체 또는 모노클로날 항-CD3 항체와 같은 다른 유도 면역억제 약물; 칼시 뉴린 억제제 (예컨대, 타크로리무스) 및 항증식제 (예컨대, 아자티오프린, 레플루노미드 또는 시로리무스)와 같은 유지 면역억제 약물; 또는 T 세포 공자극의 방해, T 세포 부착 분자의 방해 및 T 세포 보조 분자의 방해를 포함하는 조합 치료법과 함께 사용할 수 있다.

급성 거부의 예방을 제외하고, 항-CD20 항체를 사용하여 급성 거부를 치료할 수 있다. 항-CD20의 적절한 투여량은 상술한 바와 같다. 항-CD20 항체는 임의로 항-CD3 모노클로날 항체 및(또는) 코르티코스테로이드와 함께 급성 거부의 치료에 사용한다.

항-CD20 항체는 (a) 조직이식 기간 후에 단독으로, 또는 다른 면역억제제 및(또는) 보조자극 방해물과 함께 "만성" 동종이식 거부의 치료 또는 예방에 사용할 수도 있고; (b) 내성 유도 치료법의 일부로서 사용할 수도 있고; 또는 (c) 이종이식의 경우에 사용할 수도 있다.

<실시예 4>

혈액친화성 인자에 대한 면역 반응의 차단

인자 VIII가 유전적으로 결핍된 환자에게 인자 VIII 제제를 수회 수혈 하여 높은 역가의 항-인자 VIII 항체를 발생시킨다. 항-CD20 항체, 예컨대, RITUXAN(등록상표)을 항-인자 VIII 항체와 함께 예를 들어, 상술한 바과 같은 투여량으로 상기 환자에게 투여한다. 항-CD20 항체는 인자 VIII에 대한 항체의 생성에 영향을 주거나 이디오타입 억제와 같은 다른 메커니즘을 통해 인자 VIII에 대한 면역 반응을 차단할 수 있다.

<실시예 5>

혈소판에 대한 면역 반응의 차단

혈소판 수혈을 수회 받은 환자는 혈소판에 대한 동종항체를 발생시킨다. 스테로이드 치료법으로 치료시 실패한 환자에게 다른 치료제 (예를 들어, 시클로스포린, 스태프, 단백질 A 컬럼 등)를 투여할 수 있다. 항-CD20 항체 (예컨대, RITUXAN(등록상표))를 예컨대, 상술한 바와 같은 투여량으로 환자에게 투여한다. 항-CD20 항체는 항체의 생성에 영향을 주거나 이디오타입 억제 또는 비장에 의한 코팅 혈소판 제거의 억제와 같은 다른 메커니즘을 통해 면역 반응을 차단 또는 완화시킬 수 있다.

Claims

치료 유효량의 CD20에 결합하는 길항체를 악성 종양을 앓지 않는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 상기 포유동물에서 외래 항원에 대한 면역 반응을 차단하는 방법.