MXPA06004810A - Metodos y sistemas micromecanicos para efectuar ensayos. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona un sistema micromecanico para efectuar ensayos para determinar la presencia de uno o mas analitos seleccionados en una muestra. El dispositivo comprende una base y una tira desechable con al menos un pozo de reaccion y al menos un miembro movil capaz de mover fluidos y partes a traves de los fluidos en un pozo de reaccion definido. Los reactivos en las camaras de reaccion y/o miembros moviles, reaccionan con la muestra para producir un cambio detectable fisicamente. Las partes moviles son capaces de ejecutar movimientos como mezclar, mover los componentes de reaccion, intercambiar o proporcionar sistematicamente reactivos a blancos en el cartucho. Los detectores en la base estan configurados para detectar y/o cuantificar la presencia de una muestra en el pozo de reaccion y de analitos en la muestra. La senal es convertida a una salida en una ventana de representacion visual sobre la parte externa de la base.

Description

MÉTODOS Y SISTEMAS MICROMECANICOS PARA EFECTUAR ENSAYOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con sistemas microfluídicos para efectuar ensayos para determinar la presencia de uno o más analitos seleccionados en una muestra.

ANTECEDENTES Los ensayos inmunológicos y químicos cualitativos y cuantitativos han ganado aceptación como herramientas importantes en las industrias médicas y de alimentos. Esos métodos han sido usados para el diagnóstico de condiciones de enfermedades, detecciones de analitos, y para la detección de microbios, como bacterias. Esos métodos de diagnóstico se han establecido efectivamente, y los métodos han hecho más fácil a los médicos verificar y manejar pacientes que sean sometidos a varias formas de terapia. Tradicionalmente, los ensayos de diagnóstico han sido efectuados en instalaciones hospitalarias y clínicas, e implican el uso de equipo sofisticado y caro, que requiere personal especialmente capacitado para su operación. Además, los resultados de les ensayos algunas veces no están disponibles durante días o semanas después de que las muestras de los pacientes han sido obtenidas. Los ensayos de diagnóstico actualmente disponibles son de este modo costosos, consumen tiempo y no son convenientes. Se han hecho intentos por desarrollar ensayos menos costosos. Por ejemplo, una prueba automática doméstica típica para detectar los componentes de la sangre requiere que el paciente se pinche un dedo con una lanceta esterilizada, aplique una gota de la muestra de sangre a un área de aplicación de muestra sobre la tira desechable, y entonces espere los resultados. Los ensayos que usan otros fluidos corporales, como la orina funcionan esencialmente de manera similar. Esos dispositivos se diseñaron de modo que una persona postrada típica pueda efectuar los ensayos correctamente con muy poca capacitación. Sin embargo, esos sistemas de ensayo generalmente sufren de baja exactitud o requieren que se efectúen numerosos pasos de preparación que podrían comprometer los resultados de la prueba, y de este modo no son convenientes. La Patente Estadounidense No. 5,580,794 de Alien Michael describe un dispositivo de ensayo electrónico de un solo uso que ensaya analitos específicos en una muestra dada. La Patente Estadounidense No. 4,806,312 de Greenquist describe un elemento analítico multizona que tiene una zona de concentración de señales detectable. La Patente Estadounidense No. 4,627,445 de García et al . describe un sistema, de diagnóstico médico portátil manual para verificar la medición de glucosa en sangre, nitrógeno y urea, hemoglobina o componentes de la sangre, donde un paquete de sondeo de aguja o lanceta desechable contiene una tira reactiva química como un reactivo químico que reacciona con la sangre, una lectura visual y un sistema de computadora. La Patente Estadounidense No. 4,197,734 de A.

Rosenberg describe un aparato que es capaz de medir el tiempo de coagulación de la sangre. El aparato incluye un armazón de soporte, el cual soporta una jeringa que contiene una muestra de sangre, y un tornamesa que gira. La sangre de la aguja gotea sobre el tornamesa donde el tiempo de coagulación es descrito automática y gráficamente por una gráfica que gira sobre la tornamesa. El aparato también puede ser empleado para determinar variaciones en la viscosidad del plasma sanguíneo y otros fluidos. La Patente Estadounidense No. 3,486,859 de Greiner et al . describe un aparato que tiene un sujetador de doble brazo con cámaras de reacción de líquidos con la sangre que están conectadas entre sí vía un pequeño conducto capilar. Se proporciona una bomba de aire para aplicar cambios de presión a una de las cámaras para efectuar el mezclado periódico de los líquidos vía el conducto capilar. Se incluyen medios indicadores para detectar la restricción progresiva del conducto capilar tras la coagulación de la sangre. Los métodos descritos anteriormente tienen severas limitaciones los cuales los hacen extremadamente desafiantes para uso doméstico. Algunos de los métodos requieren preparaciones y manipulaciones de la sangre especiales, haciéndolos adecuados para una clínica central con personal bien capacitado, mientras que otros son caros, o no son exactos. De este modo, existe la necesidad de sistemas de ensayo para detectar analitos que sean exactos, convenientes y baratos.

SUMARIO La presente invención proporciona métodos y sistemas microtecnológicos para efectuar ensayos para determinar la presencia de uno o más analitos preseleccionados en una muestra. El aparato incluye una tira de plástico desechable que puede ser insertada en una máquina de análisis de prueba manual portátil. La tira aisla a la muestra de modo que no entre en contacto con la máquina y la muestra no se contamine. La tira desechable de la presente invención puede tener una pluralidad de pozos definidos sobre un soporte sólido. Los pozos pueden estar ligados por canales capilares. La superficie de los pozos y los canales capilares puede ser recubierta con reactivos para ayudar a extraer la muestra de liquido del pozo de muestreo hacia los pozos de reacción. Dentro de al menos una de las cámaras de reacción se encuentra al menos una barra agitadora magnética la cual puede ser atraída magnéticamente y accionada por un dispositivo magnético- móvil arreglado fuera de la tira en la máquina de análisis de prueba. La barra agitadora magnética no es capaz de ejecutar movimientos que mezclan los componentes de reacción, mover los componentes de reacción, intercambiar o proporcionar sistemáticamente reactivos a los blancos en el cartucho, y similares. La tira puede ser colocada en una máquina manual portátil que tenga detectores configurados para detectar y/o cuantificar la presencia de un analito en los pozos de reacción de la tira, correspondiendo a la vez a los cambios físicamente detectables, produciendo señales que correlacionen la presencia de y/o la cantidad del analito seleccionado en la muestra. Los reactivos pueden comprender el sistema de detección, por lo que ocurre un resultado detectable en relación a la presencia de un analito. La señal puede ser convertida a una salida en una ventana de despliegue visual sobre la parte externa de la base. Para probar una muestra, la tira desechable puede ser insertada en la base, y una gota de muestra puede ser colocada en un pozo de aplicación de la muestra de la tira. La muestra puede ser llevada hacia el pozo de reacción a través de los canales internos. Cuando la muestra es llevada a los pozos de reacción, los detectores detectan el movimiento y activan la barra agitadora magnética en el momento apropiado, lo cual mezcla los reactivos dentro del pozo de muestreo. Para ensayos sincronizados, un microprocesador contenido dentro de la base comienza un cronómetro mientras que el detector, el cual puede ser eléctrico u óptico, verifica las diferentes partes de la tira por respuestas de analitos específicos. Cuando sean detectados y/o cuantificados, los resultados son reportados de manera cualitativa o cuantitativa con las unidades apropiadas en la ventana de visualización de la base. El movimiento y los detectores pueden ser controlados por un microprocesador. Un montaje calentador puede ser activado en la base, para ensayos sensibles a la temperatura como las pruebas de coagulación y la temperatura puede mantenerse constante o hacerse variar en una forma predeterminada durante la duración del ensayo. En un aspecto de la invención, se describe una tira desechable donde la tira desechable comprende un primer sustrato sólido que comprende un pozo de recolección de muestras, un pozo de referencia y un pozo de reacción, donde los pozos están en comunicación fluídica vía primeros canales capilares; y un segundo sustrato sólido que comprende orificios donde el primer sustrato sólido y el segundo sustrato sólido están unidos y los orificios se comunican con los pozos. En otro aspecto de la invención, se describe una tira desechable que comprende un primer sustrato sólido que comprende un pozo de aplicación de muestra como un pozo de referencia, y un pozo de reacción, donde los pozos están en comunicación fluídica vía canales capilares, y donde el pozo de referencia comprende un primer agente Usante y el pozo de reacción comprende un segundo agente usante, un anticuerpo, y una barra agitadora; un segundo sustrato sólido que comprende orificios donde el primer sustrato sólido y el segundo sustrato sólido están unidos y los orificios se comunican con los pozos; y una membrana que tiene una zona de captura donde la membrana está conectada al pozo de reacción vía un segundo canal capilar. En otro aspecto más, la invención pertenece a un método para determinar el porcentaje de hemoglobina que es HbAlc, el método comprende proporcionar una tira desechable que comprende un primer sustrato sólido que comprende un pozo de muestreo, un pozo de referencia y un pozo de reacción, donde los pozos están en comunicación fluídica vía un primer canal capilar, y donde el pozo de referencia comprende un primer agente usante y el pozo de reacción comprende un segundo agente Usante, un anticuerpo específico para HbAlc, y una barra agitadora; y un segundo sustrato sólido que comprende orificios donde el primer sustrato sólido y el segundo sustrato sólido están unidos y los orificios se comunican con los pozos; y una membrana que tiene una zona de captura donde la membrana está conectada al pozo de reacción vía un segundo canal capilar; colocar una muestra en el pozo de aplicación de muestras; agregar un diluente al pozo de aplicación de muestras; determinar la hemoglobina total de la célula de referencia y la HbAlc total de la zona de captura; y dividir la HbAlc total por la hemoglobina total para obtener el porcentaje de hemoglobina que es HbAlc. Esos y otros aspectos de la invención se volverán evidentes tras hacer referencia a la siguiente descripción detallada. Además, se exponen aquí varias referencias las cuales describen con mayor detalle ciertos procedimientos o composiciones, y por lo tanto se incorporan aquí como referencia en su totalidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 ilustra una vista en perspectiva de la tira desechable con un conjunto de cámaras de reacción interconectadas y un miembro móvil en una de las cámaras. La Figura 2 ilustra otra vista de la tira desechable que comprende una composición de membranas montadas para aislar los componentes de la sangre y dirigir el analito deseado a las zonas de capturas apropiadas. La Figura 3 ilustra una vista en perspectiva de los componentes principales en el dispositivo base como se describe con detalle más adelante.

DESCRIPCIÓN DETALLADA I . Definiciones A menos que se establezca otra cosa, los siguientes términos usados en esta solicitud, incluyendo la especificación y las reivindicaciones, tienen las definiciones dadas a continuación. Debe notarse que, como se usan en la especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una" y "el" incluyen referentes a los plurales a menos que el contexto dicte claramente otra cosa. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas aquí, ya sea supra o infra , se incorporan por lo tanto aquí como referencia en su totalidad. Como se usa aquí, el término "sujeto" abarca mamíferos y no mamíferos. Los ejemplos de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, ningún miembro de la clase de los Mamíferos: humanos, primates no humanos como chimpancés, y otras especies de simios y monos; animales de granja como ganado vacuno, caballos, ovejas, cabras, cerdos; animales domésticos como conejos, perros y gatos; animales de laboratorio incluyendo roedores, como ratas, ratones y cobayos y similares. Los ejemplos de no mamíferos incluyen, pero no se limitan a, aves, peces y similares. El término no denota una edad o género particular. El término "anticuerpo", como se usa aquí, incluye, pero no se limita a un polipéptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos que se unan específicamente y reconozcan a un analito (antígeno) . "Anticuerpo" también incluye, pero no se limita a, un polipéptido sustancialmente codificado por un gen de inmunoglobulina o genes de inmunoglobulina, o fragmentos de los mismos que se unan específicamente a y reconozcan la región de unión específica del antígeno (idiotipo) de anticuerpos producidos por el anfitrión en respuesta a la exposición a antígenos de trico onas. Los ejemplos incluyen anticuerpos policlonales, monoclonales, quiméricos, humanizados, y de una sola cadena, y similares. Los fragmentos de inmunoglobulinas, incluyen fragmentos Fab y fragmentos producidos por una biblioteca de expresión, incluyendo la presentación de fagos. Véase, por ejemplo, Paul, Fundamental Immunology, 3rd Ed. , 1993, Raven Press, New York, para la estructura y terminología de anticuerpos . Los términos "se une específicamente a" o "específicamente inmunorreactivo con" se refieren a una reacción de unión la cual es determinante de la presencia del analito blanco en presencia de una población heterogénea de proteínas y otros productos biológicos. De este modo, bajo las condiciones de ensayo designadas, las porciones de unión especificadas se unen preferiblemente a un analito blanco particular y no se unen en una cantidad significativa a otros componentes presentes en una muestra de prueba. La unión específica a un analito blanco bajo esas condiciones puede requerir una porción de unión que sea seleccionada por su especificidad para un analito blanco particular. Puede usarse una variedad de formatos de inmunoensayo para seleccionar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con un antígeno particular. Por ejemplo, los inmunoensayos de ELISA en fase sólida son usados de manera rutinaria para seleccionar anticuerpos monoclonales específicamente inmunorreactivos con un analito. Véase Harlow and Lañe (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Publications, New York, para una descripción de los formatos de inmunoensayo y las condiciones que pueden ser usadas para determinar la inmunorreactividad específica. Típicamente, una reacción específica o selectiva proporcionará una relación de señal a ruido de al menos dos veces el fondo y de manera más típica de al menos 10 a 100 veces el fondo. Como se usan aquí, los términos "marca" y "marca detectable" se refieren a una molécula capaz de ser detectada, incluyendo, pero sin limitarse a, isótopos radioactivos, entidades fluorescentes, entidades quimioluminiscentes, cromóforos, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos, cromóforos, tintes, iones metálicos, soles metálicos, ligandos (por ejemplo, biotina, avidina, estreptavidina o haptenos) y similares. Como se usa aquí, un "soporte sólido" se refiere a una superficie sólida como una placa de plástico, perla magnética, perla de látex, pozo de placa microtituladora, placa de vidrio, nylon, agarosa, acrilamida, y similares. "Específica" en referencia a la unión de dos moléculas o a una molécula y un complejo de moléculas se refiere al reconocimiento específico de uno por otro y la formación de un complejo estable en comparación con el reconocimiento menos sustancial de otras moléculas y la ausencia de formación de complejos estables con otras moléculas. Los ejemplos de unión específica son interacciones anticuerpo-antígeno, interacciones enzima-sustrato, hibridaciones polinucleotídicas y/o formación de dúplex, interacciones receptor celular-ligando, y así sucesivamente.

II. VISTA GENERAL La invención pertenece a una tira desechable que puede ser usada para efectuar ensayos inmunológicos y químicos cualitativos y cuantitativos. Sobre la tira se encuentran al menos tres pozos, donde los pozos pueden estar en comunicación fluídica entre sí vía canales capilares. En un pozo es colocada la muestra, preferiblemente una muestra líquida, para el análisis. El fluido muestreado se mueve hacia el otro de los dos pozos vía los canales capilares. Una de los pozos puede servir como un estándar que mide el analito total en la muestra. El otro pozo puede servir como el pozo de reacción, donde los componentes individuales de la muestra pueden ser identificados. La tira desechable puede ser colocada en un analizador (también referido aquí como una "base") que detecta los componentes individuales de la muestra y el analito total de la muestra. El analizador incluye un sistema de visualización que puede presentar los resultados de los análisis así como proporcionar instrucciones durante la operación del ensayo. En una aplicación, puede ser determinado el por ciento de hemoglobina total, es decir, de hemoglobina Ale (HbAlc) en células rojas sanguíneas (glóbulos rojos) humanas. La sangre de un sujeto puede ser depositada en el pozo de muestreo. La sangre se mueve hacia los otros dos pozos vía los canales capilares. En el pozo de referencia puede ser colocado un reactivo que lise las células, liberando por lo tanto la hemoglobina de las células rojas sanguíneas. La concentración de hemoglobina en el pozo de referencia puede ser medida usando mediciones infrarrojas o ultravioleta. En el pozo de reacción puede ser colocado un lisado, una cantidad conocida de un anticuerpo específico para HbAlc, y un agitador magnético. Cuando la sangre se mueva hacia el pozo de reacción, el imán agita los líquidos mezclándolos por lo tanto en el pozo. El lisado lisa las células, y el anticuerpo se une a la HbAlc. Después de un periodo de tiempo específico, la pantalla puede dar instrucciones al operador para agregar un diluente al pozo de reacción. El diluente empuja el líquido en la cámara de reacción a través de otro canal capilar hacia una o más zonas de captura. Las zonas de captura han inmovilizado sobre ellas antígenos que se unen al complejo de anticuerpo unido únicamente, y sobre una parte separada de la zona otros antígenos que se unen a todos los anticuerpos. El complejo anticuerpo-HbAlc puede ser capturado por los antígenos en la primera parte de la zona de captura, y todos los anticuerpos pueden ser capturados por los antígenos en la última parte de la zona de captura. Puede ser usado un sistema de detección para detectar el anticuerpo unido a la primera y segunda parte de la zona de captura. La relación y/o la suma de las dos zonas puede ser usada para cuantificar la cantidad de HbAlc presente en la muestra. La relación de la primera zona a la hemoglobina total de la célula de referencia puede proporcionar el porcentaje de HbAlc en la muestra de sangre. Los resultados pueden ser desplegados en el sistema de visualización.

III. SISTEMA MICROMECANICO La invención proporciona una tira desechable, una máquina manual portátil (es decir, una base) y una combinación que comprende una tira desechable y una base. La tira puede ser colocada sobre la máquina para efectuar ensayos, y para detectar analitos, y para presentar o desplegar información, instrucciones y resultados. Un aspecto de la tira desechable se ilustra en la Figura 1. La tira desechable puede ser hecha uniendo juntos dos o más soportes sólidos con ranuras presentes en al menos uno de los soportes. El soporte sólido puede ser rectangular, circular, oval o de cualquier forma. El soporte puede ser hecho de un material adecuado que sea seleccionado por sus propiedades, como buena conductividad térmica, claridad para la transmisión óptica, propiedades mecánicas para su fácil soldadura, propiedades superficiales que permitan su recubrimiento uniforme y estabilidad del reactivo, y neutralidad con el medio liquido para evitar la interferencia con el ensayo. Para este propósito, los plásticos adecuados incluyen aquellos con energías superficiales libres altas y absorción de agua baja, incluyendo el PETG, poliéster (Mylar®) , policarbonato (Lexan®) , cloruro de polivinilo, poliestireno, SAN, acrilonitrilo-butadieno-estireno (ABS), particularmente ABS distribuido por Borg Warner bajo el nombre comercial de Cycolac, entre otros. Cuando el soporte sólido sea un plástico hidrofóbico, puede ser tratado por métodos conocidos en la técnica para volver las superficies hidrofílicas, como por ataque con plasma o tratamiento con corona. De manera alternativa y equivalente, puede ser usado un soporte sólido moldeado, comercialmente disponible en la práctica de la invención. Para propósitos de ilustración, esta modalidad de la invención es descrita con referencia a una tira desechable formada uniendo dos soportes sólidos. Al menos uno de los soportes sólidos tiene ranuras o cavidades que sirven como las cámaras de reacción 5 y 7, y canales capilares 2 y 8. Las ranuras pueden ser de cualquier forma geométrica y son preferiblemente circulares. Las ranuras tienen dimensiones que son de volumen suficiente para mantener las muestras y permitir que ocurra la reacción. De este modo, las ranuras circulares pueden tener un diámetro de entre aproximadamente 0.01 mm hasta aproximadamente 100 mm, dependiendo de la longitud y ancho del material de soporte, y pueden tener un altura de aproximadamente 0.001 mm hasta aproximadamente 4 mm, dependiendo del espesor del material de soporte. El diámetro y la altura de las ranuras pueden ser determinados fácilmente por un experto en la técnica. En un aspecto de la invención, una de las piezas de soporte tiene orificios perforados a través de las ranuras donde los orificios sirven como orificios de ventilación 3 y 6. Además, los orificios pueden permitir el acceso al pozo, donde será colocada la muestra, como el pozo de aplicación de la muestra, 1. Antes de la unión de las dos piezas, el miembro móvil, 4, puede ser insertado en la cámara de reacción deseada, 5. En el proceso de moldeo, son necesarios rebordes que redirijan la energía al menos sobre el contorno adyacente a la periferia de la ranura de al menos una de las dos piezas de plástico. Cuando se solden ultrasónicamente, las dos piezas de plástico son fundidas juntas a lo largo de los rebordes de energía que forman un sello hermético al aire alrededor de las cámaras y canales, con el único acceso al exterior desde las cámaras de reacción siendo los orificios de ventilación y el pozo de aplicación de la muestra. La superficie de la cámara de reacción puede ser opcionalmente ligeramente texturizada para usarse con miembros móviles. La texturización puede acomodar una presión desarticulante, IT. II, es la presión, en el caso de dos placas sumergidas en un medio, en exceso de presión externa, debe ser aplicada al medio entre las placas para mantener una separación dada. En este caso, II es numéricamente solo la fuerza de atracción o repulsión entre el miembro móvil y la superficie de la cámara de reacción por unidad de área. A más ancho el miembro móvil, mayor será la presión entre las superficies y la texturización que eliminaría cualquier sujeción indeseable del miembro móvil sobre las paredes de la cámara de reacción. Una definición más general para la presión desarticulante es p = -l/I( G /Qx)?,T ,V donde I = rea T = Temperatura V = Volumen G - Energía libre de Gibb El miembro móvil 4, puede ser producido mediante el uso de acero inoxidable o una combinación de acero inoxidable con cualquier otro material deseable, de modo que sea capaz de ser atraído y accionado por un dispositivo móvil magnético externo. El material puede ser cualquier forma de aleación magnetizable con una cubierta de acero inoxidable para evitar la corrosión o recubierto especialmente para la unión específica de moléculas. El espesor del miembro móvil se basa en la altura de la cámara de reacción. Este tiene que ser suficientemente pequeño para colocarse en la cámara de reacción y moverse libremente. Para una cavidad de la cámara de reacción, un altura de 0.254 milímetros (0.010 pulgadas), el espesor del miembro móvil puede ser de entre aproximadamente 0.177 (0.007) hasta aproximadamente 0.203 milímetros (0.008 pulgadas). El modo para aplicar la muestra a las cámaras de reacción así como otros reactivos, como las soluciones salinas y azucaradas para los canales capilares incluyen el rocío, pintado, liofilización, evaporación, adsorción, conjugación covalente o similares. Para reactivos con componentes de partícula grande, pintar por rocío o liofilización sería adecuado. La biodeposición de gotas con un tamaño del orden de picolitros da como resultado el secado instantáneo cuando se distribuya a temperatura ambiente debido al tamaño de las gotas. Una tira desechable montada se muestra en la Figura 2, donde 5 es una almohadilla absorbente, 7 es una tira de membrana de referencia interna, 9 es un canal capilar, 11 es una cámara de reacción, 13 es un canal capilar, 15 es un receptáculo de muestras, 17 es un orificio de aplicación de muestras, 19 es una cámara de reacción, 21 es un miembro móvil, 23 son zonas de captura sobre una membrana base 25. La Figura 3 es un diagrama en perspectiva de los componentes principales del analizador en el cual es insertada la tira desechable antes de aplicar una muestra de prueba. La tira desechable puede ser colocada en 46 sobre la base. La tira puede ser colocada en la parte superior de un montaje de calentamiento 44 que puede acomodar un detector (emisores y/o detectores) incluidos en o muy cerca, pero arreglados, de modo que una señal se desplace hacia la cámara de reacción. Otro conjunto de detectores que también puedan servir como emisores, detectores o ambos, pueden ser colocados sobre el otro lado de la tira desechable (no mostrada) . Debe comprenderse que el arreglo del haz reflector, el detector y el emisor pueden ser sobre el mismo lado de la tira, dependiendo del mecanismo de detección que sea usado. El mecanismo de detección no se limita al método de detección óptica, sino que también podrían ser usados métodos eléctricos, radioactivos y otros. Una ventana de visualización electrónica 30 puede ser, pero no se limita a, una Pantalla de Cristal Líquido, LCD. 28, representa conmutadores o teclas sobre una membrana para la selección de función de un menú desplegado sobre la LCD. El tablero electrónico 36 comprende un microprocesador que controla la operación y mecánica del analizador. La energía puede ser suministrada por las baterías 38, o cualquier otra fuente de suministro de energía eléctrica alterna. El motor 40 acciona el imán, 42, y los dos pueden ser conectados, como por una varilla. El patrón de movimiento definido del motor y el imán son responsables de crear el movimiento correspondiente del miembro móvil en una o más de las cámaras de reacción de la tira desechable. 32, representa un conector a un suministro de energía externo y 34 representa un conector para la salida de datos . Un ejemplo de un sistema de detección para la detección automatizada para usarse con la tira desechable de la presente y los métodos asociados comprenden una fuente de excitación, un monocromador (o cualquier dispositivo capaz de resolver espectralmente los componentes de la luz, o un conjunto de filtros de banda estrecha) y un arreglo detector. La fuente de excitación puede comprender longitudes de onda infrarroja azul o UV, y la longitud de onda de excitación puede ser más corta que las longitudes de onda de emisión a ser detectadas. El sistema de detección puede ser: una fuente de luz UV de banda ancha, como una lámpara de deuterio con un filtro en la parte frontal; la salida de una fuente de luz blanca como una lámpara de xenón o una lámpara de deuterio después de pasar a través de un monocromador para extraer las longitudes de onda deseadas; o cualquiera de un número de láseres de gas de onda continua (cw) , incluyendo, pero sin limitarse a cualquiera de las Líneas de láser Iónico de Argón (457, 488, 514, etc. nm) o un láser de HeCd; láseres de diodos en estado sólido en el azul como láseres basados en GaN y GaAs (doblado) o la salida doblada o triplicada de láseres basados en YAG o YLF; o cualquiera de los láseres impulsados con salida en el azul. La luz emitida de la muestra o los reactivos en el pozo de reacción puede ser detectada en un dispositivo que proporcione información espectral para el sustrato, por ejemplo, un espectrómetro de rejilla, espectrómetro de prisma, espectrómetro de formación de imágenes, o similar, o el uso de filtros de interferencia (paso de banda) . Usando un formador de imágenes de área bidimensional como una cámara CCD, muchos objetos pueden formar imágenes simultáneamente. La información espectral puede ser generada recolectando más de una imagen vía diferentes filtros de paso de banda, paso largo o paso corto (filtros de interferencia) , o los filtros sintonizables electrónicamente son apropiados. Puede ser usado más de un formador de imágenes para recabar datos simultáneamente a través de filtros dedicados o el filtro puede ser cambiado de una parte frontal de un solo formador de imágenes. Los sistemas basados en la formación de imágenes, como del sistema Biometric Imaging, exploran una superficie para encontrar señales fluorescentes. Otras modalidades apropiadas para este sistema incluyen el uso de sistemas de membranas recubiertas con reactivo como parte de la tira colocada de forma que permita el flujo continuo y dirigido de la muestra dentro de todo el sistema de la tira. Los sistemas detectores serían colocados de modo que pudieran verificar las porciones de la membrana de la tira para el analito o respuestas que estén siendo probadas.

IV. OPERACIÓN Un modo de operación general del dispositivo ilustrado en la Figura 3 implica la inserción de la tira desechable mostrada en las Figuras 1 y 2 en un receptáculo que permita colocar la tira en una sola posición. Para un ensayo con un requerimiento de temperatura específica, el montaje calentador, 44 calienta la tira desechable a la temperatura deseada controlada por el microprocesador. La LCD sugiere los pasos simples, después de que la tira es insertada y el analizador encendido, en los cuales el operador puede seguir, incluyendo la adición de la muestra al receptáculo de muestras. El instrumento puede opcionalmente tener detectores para detectar la presencia de cantidades 5. adecuadas de muestra en las cámaras de reacción y un mecanismo para iniciar y detener la temporización del ensayo. El detector detecta las señales de conclusión de la reacción, como midiendo la transmisión de una señal óptica emitida y dirigida a través de las paredes de la cámara de reacción. 0 La muestra aplicada es distribuida exactamente en las diferentes cámaras de reacción vía los canales capilares. La colocación de las cámaras de reacción puede ser tal que puedan ocurrir reacciones independientes en las diferentes cámaras de reacción aún cuando compartan una muestra común de 5 la muestra acumulada. Los modos de movimiento definidos del miembro móvil aseguran un mezclado apropiado del reactivo y las mezclas de muestras y también contribuyen a intercambio de reactivo y muestra intercámara. Para ensayos que requieren la cuantificación de un analito, el sistema detector verifica 0 la carga ya sea en una o más cámaras de reacción, un sistema de membrana o miembros móviles, hasta que sea logrado el punto final deseado. Para ensayos que requieren solo la determinación de la presencia del analito, el sistema detector verifica las partes específicas de la tira durante la duración del tiempo apropiado. El microprocesador calcula los resultados cuantitativa o cualitativamente, los cuales son desplegados sobre la LCD. La tira puede entonces ser removida al final del ensayo y desechada. De este modo, el operador inserta la tira en el receptáculo de la tira en el analizador. El operador empuja entonces un botón de inicio, el cual podría ser activado automáticamente por la tira en sí, espera una sugerencia para agregar una gota de muestra, y entonces obtiene los resultados del despliegue, típicamente dentro de unos cuantos minutos o segundos, dependiendo del tipo de ensayo.

V. DETECCIÓN DE HEMOGLOBINA Ale (HbAlc) Hemoglobina glicada se refiere a una serie de componentes menores de la hemoglobina que se forman a través de la unión de glucosa a la molécula de hemoglobina. La célula sanguínea roja humana es libremente permeable a la glucosa. Dentro de cada célula sanguínea roja, se forma hemoglobina glicada a una velocidad que es directamente proporcional a la concentración de glucosa en el ambiente. Aproximadamente 97% de la hemoglobina total en las células sanguíneas rojas en circulación es hemoglobina A. La hemoglobina A consiste de cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas a y dos cadenas b. La glicación de la Hemoglobina A ocurre a través del acoplamiento covalente de la glucosa con el aminoácido valina N-terminal de cada cadena peptídico b.

Inicialmente se forma una base de Schiff (aldimina) inestable, la cual entonces experimenta un rearreglo de Amadori irreversible para formar una cetoamina estable, la Hemoglobina Ale (HbAlc) . El periodo de vida de la Hemoglobina A que contiene células sanguíneas rojas promedia 120 días. El porcentaje de Hemoglobina A que es glicado a HbAlc es directamente proporcional al tiempo en que las células sanguíneas rojas están expuestas a la glucosa a la concentración de glucosa promedio encontrada. La medición de la fracción de HbAlc da un cuadro integrado de la concentración de glucosa en sangre promedio durante la vida media de las células rojas, es decir, durante los últimos 60 días. El nivel de HbAlc usualmente es expresado como un porcentaje de la hemoglobina total. En sujetos normales, la HbAlc está típicamente en el intervalo de 3-6% de la hemoglobina total. En pacientes con niveles de glucosa elevados, por ejemplo en el caso de la diabetes Tipo I y Tipo 2, el nivel puede elevarse a dos veces el límite superior del normal o más. El control a largo plazo de los niveles de glucosa en diabéticos es muy importante. Demasiada glucosa en la sangre durante muchos años puede dañar los ojos, riñones y nervios. También incrementa el riesgo de enfermedad cardiaca y de los vasos sanguíneos. La medición de la HbAlc como porcentaje de la hemoglobina total proporciona un medio valioso para evaluar el control a largo plazo de los niveles de glucosa y también constituye un indicador de riesgo importante para identificar diabéticos del Tipo 1 y el Tipo 2. Una muestra de sangre del sujeto puede ser obtenida y depositada en el pozo de muestras 15 de la tira desechable (Figura 2) . La sangre se mueve hacia las cámaras de reacción 11 y 19 vía los canales capilares 13. La cámara de reacción 11 puede servir como referencia donde se mida la hemoglobina total. La cámara de reacción 19 mide la HbAlc en la muestra de sangre. La relación de HbAlc a la hemoglobina total proporciona el porcentaje de hemoglobina total que es HbAlc. Ambas cámaras de reacción contienen un agente usante. El agente usante lisa las muestras de sangre completa, liberando por lo tanto la hemoglobina. Los agentes usantes son típicamente tensoactivos, y de manera preferible tensoactivos no iónicos, como por ejemplo el TRITONMR X-100. La cámara de reacción 19 contiene adicionalmente un anticuerpo que puede detectar HbAlc. El anticuerpo puede ser un anticuerpo (Ac) monoclonal o policlonal, o fragmento de Ac que contenga el sitio de unión del antígeno, o región determinante de la complementareidad (CDR) , como un fragmento de F(ab')2 o Fab. La porción o marca detectable puede ser una sustancia radioactiva, fluorescente o quimioluminiscente o una enzima. De manera alternativa, también puede ser usado un segundo Ac marcado que reconozca el fragmento Fe específico de la especie de este primer Ac. Además, el anticuerpo puede ser marcado con una marca detectable. En un aspecto, la marca detectable es una molécula fluorescente. Los ejemplos de marcas fluorescentes adecuadas incluyen a la fluoresceína (FITC), 5, 6-carboximetil fluoresceína, rojo de Texas, nitrobenz-2-oxa-l, 3-diazol-4-il (NBD) , coumarina, cloruro de dansilo, rodamina, 4'-6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) , y los tintes de cianina Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7. Las marcas fluorescentes preferidas son la fluoresceína (éster de 5-carboxifluoresceína-N-hidroxisuccinimida) , rodamina (5, 6-tetrametil rodamina), compuestos de rodamina sustituidos, y tintes de cianina Cy3, Cy3.5, Cy5, Cy5.5 y Cy7. La absorción y emisión máximas, respectivamente, para esos fluoróforos- son: FITC (490 nm; 520 nm) , Cy3 (554 nm; 568 nm) , Cy3.5 (581 nm; 588 nm) , Cy5 (652 nm: 672 nm) , Cy5.5 (682 nm; 703 nm) y Cy7 (755 nm; 778 nm) , permitiendo de este modo su detección simultánea. Las marcas fluorescentes pueden ser obtenidas de una variedad de fuentes comerciales, incluyendo Molecular Probes, Eugene, OR y Research Organics, Cleveland, Ohio. Como otra alternativa, en lugar de una marca adicional, la hemoglobina unida en sí, debido a sus propiedades similares a las de la peroxidasa, puede generar una señal detectable. Esto se logra agregando peróxidos de hidrógeno, con o sin adición de otro sustrato (por ejemplo isoluminol) . Las células en los dos pozos de reacción son usadas. En el pozo de referencia 11, la hemoglobina total puede ser obtenida por métodos espectroscópicos, como midiendo en la región UV o la región infrarroja. El aparato espectroscópico es conocido en la técnica y está incorporado dentro de la máquina manual portátil. En particular, las mediciones pueden ser hechas a 880 nm y a 580 nm. En el pozo de reacción 19, los anticuerpos se unen a HbAlc. Para asegurar una reacción completa, los líquidos en los pozos de reacción pueden ser agitados magnéticamente, y opcionalmente calentados a una temperatura más alta. Tras completar la reacción, puede ser agregado un diluente al pozo de muestras 15. El diluente hace que los reactivos en 19 se muevan a través de los canales capilares 9 hacia las zonas de captura 23. Las zonas de captura pueden ser antígenos u otros compuestos que puedan unirse específicamente al complejo anticuerpo- HbAlc, cualquier anticuerpo, y similar, o combinaciones de los mismos. De este modo, en un aspecto, la primera zona de captura contiene antígenos que se unen específicamente al complejo anticuerpo-HbAlc, mientras que la segunda zona de captura contiene antígenos que se unen al anticuerpo y el complejo anticuerpo-HbAlc. La almohadilla absorbente 5 absorbe todo el líquido y puede ayudar a drenar el líquido de los pozos a través de las membranas . La cantidad de material en cada zona de captura puede ser determinada usando los sistemas de detección descritos anteriormente. Los calibrados o estándares que son ensayados con el ensayo proporcionan curvas de calibración (o estándar) de las cuales se determina el % de HbAlc en la muestra usando la señal medida. La suma de todas las zonas de captura es preferiblemente igual a la cantidad que fue colocada en el pozo de reacción, y puede proporcionar un control interno para determinar el porcentaje de reacción que ha ocurrido. La concentración del complejo anticuerpo-HbAlc puede ser determinada de la lectura de la primera zona de captura. El por ciento de HbAlc en la muestra de sangre puede ser determinada dividiendo la concentración del complejo anticuerpo-HbAlc con la concentración total de hemoglobina. En otro aspecto, puede ser incluida una cámara de referencia 7 (Figura 2) en la tira desechable. La membrana de referencia pudo haber sido depositada en concentraciones conocidas del complejo antígeno-anticuerpo-HbAlc, y el complejo antígeno-anticuerpo. Las mediciones espectro-fotométricas de la membrana de referencia pueden ser usadas para calibrar las lecturas de la membrana activa 25. Aunque la invención ha sido mostrada y descrita particularmente con referencia a una modalidad preferida y varias modalidades alternativas, será comprendido por aquellos expertos en la técnica relevante que pueden hacerse varios cambios en la forma y detalles de la presente sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. Todas las patentes y publicaciones referidas en esta solicitud se incorporan por lo tanto en su totalidad como referencia.

Claims (27)

1. REIVINDICACIONES 1. Una tira desechable, caracterizada porque comprende : un primer sustrato sólido que comprende un pozo de recolección de muestras, un pozo de referencia, y un pozo de reacción, donde los pozos están en comunicación fluídica vía primeros canales capilares; y un segundo sustrato sólido qué comprende orificios donde el primer sustrato sólido y el segundo sustrato sólido están unidos y los orificios se comunican con los pozos.
2. 2. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el primer sustrato y el segundo sustrato son rectangulares.
3. 3. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sustrato seleccionado del grupo que consiste de plástico, vidrio, nylon, metal y combinaciones de los mismos.
4. 4. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque el sustrato es plástico.
5. 5. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además una barra agitadora en el pozo de reacción.
6. 6. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además un anticuerpo depositado en el pozo de reacción.
7. 7. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el anticuerpo es específico para HbAlc.
8. 8. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el pozo de referencia y el pozo de reacción comprenden un agente usante.
9. 9. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente usante es un tensoactivo no iónico.
10. 10. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque comprende además una membrana que tiene una zona de captura, donde la membrana está conectada al pozo de reacción vía un segundo canal capilar.
11. 11. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la membrana está interpuesta entre una almohadilla absorbente y el pozo de reacción.
12. 12. Una tira desechable caracterizada porque comprende : un primer sustrato sólido que comprende un pozo de aplicación de muestras, un pozo de referencia, y un pozo de reacción, donde los pozos están en comunicación fluídica vía canales capilares, y donde el pozo de referencia comprende un primer agente usante y el pozo de reacción comprende un segundo agente usante, un anticuerpo, y una barra agitadora; un segundo sustrato sólido que comprende orificios donde el primer sustrato sólido y el segundo sustrato sólido están unidos y los orificios se comunican con los pozos; y una membrana que tiene una zona de captura donde la membrana está conectada al pozo de reacción vía un segundo canal capilar.
13. 13. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el primer sustrato y el segundo sustrato son rectangulares.
14. 14. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el sustrato es seleccionado del grupo que consiste de plástico, vidrio, nylon, metal y combinaciones de los mismos.
15. 15. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el sustrato es plástico.
16. 16. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el primer y segundo agentes Usantes son tensoactivos no iónicos.
17. 17. La tira desechable de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el anticuerpo es específico para HbAlc.
18. 18. Un método para determinar el porcentaje de hemoglobina que es HbAlc, el método se caracteriza porque comprende : proporcionar una tira desechable que comprende un primer sustrato sólido que comprende un pozo de muestreo, un pozo de referencia y un pozo de reacción, donde los pozos están en comunicación fluídica vía un primer canal capilar, y donde el pozo de referencia comprende un primer agente usante y el pozo de reacción comprende un segundo agente usante, un anticuerpo específico de HbAlc, y una barra agitadora; un segundo sustrato sólido que comprende orificios donde el primer sustrato sólido y el segundo sustrato sólido están unidos y los orificios se comunican con los pozos; y una membrana que tiene una zona de captura donde la membrana está conectada al pozo de reacción vía un segundo canal capilar; colocar una muestra en el pozo de aplicación de muestras; agregar un diluente al pozo de aplicación de muestras; determinar la hemoglobina total de la célula de referencia y la HbAlc total de la zona de captura; y dividir la HbAlc total por la hemoglobina total para obtener el porcentaje de hemoglobina que es HbAlc.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el primer sustrato y segundo sustrato son rectangulares.
20. 20. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el sustrato es seleccionado del grupo que consiste de plástico, vidrio, nylon, metal y combinaciones de los mismos.
21. 21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el sustrato es plástico.
22. 22. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque el primer y segundo agentes usantes son tensoactivos no iónicos.
23. 23. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la membrana comprende dos o más zonas de captura.
24. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque una zona de captura comprende antígenos que se unen específicamente al complejo anticuerpo-HbAlc, y otra zona de captura que comprende antígenos que se unen al anticuerpo.
25. 25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la HbAlc total es determinada por mediciones de UV.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la hemoglobina total es determinada por UV, IR o combinaciones de las mismas.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado porque la hemoglobina total es determinada espectrofotométricamente usando luz de 580 nm y 880nm.