MXPA05004480A - Derivados de [6, 7-dihidro -5h -imidazo [1, 2-a] imidazol -3- sulfonilamino]- propionamida. - Google Patents

Abstract

Derivados de [6, 7-dihidro-5H-imidazol [1, 2-a] imidazol-3-sulfonilamino]-propionamida que muestran buen efecto inhibidor sobre la interaccion de CAM y leucointegrinas y son asi utiles en el tratamiento de enfermedades inflamatorias.

Description

DERIVADOS DE [6 , 7 -DIHIDRO-5H- IMIDAZO [1 , 2 -a] IMIDAZOL- 3 - SULFONILAMINO] -PROPIONA IDA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere, en general, a una clase de derivados de [6 , 7-dihidro-5H- imidazo [1 , 2 -a] imidazol -3 -sulfonilamino] -pro ionamida , a la síntesis de estos compuestos, a su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias y a composiciones farmacéuticas que comprenden estos compuestos. 2. ANTECEDENTES DE LA INFORMACIÓN La investigación de la última década ha ayudado a aclarar los acontecimientos moleculares que se producen en las interacciones célula-célula en el cuerpo, especialmente aquellos acontecimientos implicados en el movimiento y en la actuación de las células en el sistema inmune. Véase generalmente, Springer, T. Nature, 1990, 346, 425-434. Las proteínas de la superficie de la célula y, especialmente, las Moléculas de Adhesión Celular ("CAMs") y "Leucointegrinas " , incluyendo LFA-1, MAC-1 y gpl50.95 (referidas en la nomenclatura WHO como CD18/CDlla, CD18/CDllb y CD18/CDllc, respectivamente) han sido correspondientemente el sujeto de la investigación y desarrollo farmacéutico, teniendo como objetivo la intervención en los procesos de extravasación de leucocitos a les lugares dañados y el movimiento de leucocitos a los distintos objetivos. Por ejemplo, actualmente se cree que antes de la extravasación de los leucocitos, que es un componente prioritario de la respuesta inflamatoria, ocurre la activación de las integrinas constitutivamente expresada sobre los leucocitos y seguida por una interacción 1 igando/receptor fuerte entre las integrinas (por ejemplo, LFA-1) y una o varias moléculas de adhesión intercelular distintas (ICA s) llamadas ICA -1, ICAM-2, ICAM-3 o ICA -4 que están expresadas sobre superficies celulares endoteliales de los vasos sanguíneos y sobre otros leucocitos. La interacción de las CAMs con las Leucointegrinas es una etapa vital en el funcionamiento normal del sistema inmune. Los procesos inmunes como la presentación de antígenos, la citotoxicidad mediada por células-T y la extravasación de leucocitos requieren la adhesión celular mediada por ICAMs que interactua con las Leucointegrinas. Véase generalmente, Kishimoto, T. K. ; Rothlein; R. R. Adv. Phar acol . 1994, 25, 117-138 y Diamond, M. ; Springer, T. Current Biology, 1994, 4, 506-532. Se ha identificado un grupo de individuos carentes de la expresión apropiada de Leucointegrinas, una condición llamada "Deficiencia de la Adhesión de Leucocitos" (Anderson, D. C; et al., Fed . Proc . 1985, 44, 2671-2677 y Anderson, D. C; et al., J. Infect. Dis. 1985, 152, 668-689). Estos individuos son incapaces de dar una respuesta (s) inmune y/o inflamatoria normal debido a una incapacidad de sus células de adherirse a los sustratos celulares. Estos datos muestran que las reacciones inmunes se mitigan cuando los linfocitos son incapaces de adherirse de forma normal debido a la pérdida de moléculas de adhesión funcional de la familia CD18. En virtud del hecho de que los pacientes LAD que pierden CD18 no pueden dar una respuesta inflamatoria, se cree que el antagonismo de las interacciones CD18, CD11/ICAM también inhibirá una respuesta inflamatoria. Se ha demostrado que el antagonismo de la interacción entre los CAMs y las Leucointegrinas pueden realizarla agentes dirigidos contra cada componente. Específicamente, el bloqueo de las CAMs, como se muestra en el ejemplo ICAM-1, o de las Leucointegrinas, como en por ejemplo LFA-1, por anticuerpos dirigidos contra cada una o ambas de estas moléculas inhibe efectivamente repuestas inflamatorias. Los modelos in vitro de respuesta inmune e inflamatoria inhibida por anticuerpos a las CAMs o a Leucointegrinas incluye proliferación de linfocitos de mitógenos inducidos o antígenos, agregación homotípica de linfocitos, citolisis mediada con células-T y tolerancia inducida de antígenos específicos. La relevancia de los estudios in vitro se ha sostenido por los estudios in vivo con anticuerpos dirigidos contra ICAM-1 o LFA-1. Por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra LFA-1, pueden prevenir el rechazo del injerto de tiroides y prolongar la supervivencia del trasplante de corazón , en ratones. (Gorski, A.; Immunology Today, 1994, 15, 251-255). Es muy significativo, que los anticuerpos dirigidos contra ICAM-1 se han mostrado eficaces in vivo como agentes antiinflamatorios en enfermedades humanas como rechazo al trasplante renal y artritis reumatoide (Rothlein, R. R.; Scharschmidt , L., en: Adhesión Molecules; egner, C. D., Ed.; 1994, 1-38, Cosimi, C. B . ; et al., J. Immunol. 1990, 144, 4604-4612 y Kavanaugh, A.; et al., Arthritis Rheum. 1994, 37, 992-1004) y los anticuerpos dirigidos contra LFA-1 han demostrado efectos inmunosupresores en transplantes de médula espinal y en la prevención del rechazo temprano de trasplantes renales (Fischer, A.; et al., Lancet, 1989, 2, 1058-1060 y Le Mauff, B . ; et al., Transplantation, 1991, 52, 291-295) . También se ha demostrado que una forma soluble recombinante de ICAM-1 puede actuar como inhibidor de la interacción de ICAM-1 con LFA-1. ICAM-1 soluble actúa como un antagonista directo de interacciones CD18, CD11/ICAM-1 sobre las células y muestra actividad inhibidora en modelos in vi tro de respuesta inmune como la respuesta de linfocitos mezclados humanos, las respuestas de la célula T citotóxica y la proliferación de células T en los pacientes diabéticos en respuesta a las células isleta (Becker, J. C . ; et al., J. Immunol. 1993, 151, 7224 y Roep, B. 0.; et al., Lancet, 1994, 343, 1590) .

Así, la técnica anterior ha demostrado que las moléculas de proteína grandes que antagonizan la unión de los CAMs a las Leucointegrinas tienen potencial terapéutico para mitigar las respuestas inflamatoria e inmunológica asociadas generalmente con la patogénesis de muchas enfermedades autoinmunes o inflamatorias. Sin embargo, las proteínas tienen deficiencias significativas como agentes terapéuticos, incluida la capacidad de administrarse oralmente y la inmunorreactividad potencial que limita la utilidad de estas moléculas para la administración crónica. Además, las terapias basadas en proteínas son generalmente caras de realizar. Por consiguiente, las moléculas pequeñas que tienen la misma capacidad que las moléculas de proteína grandes para antagonizar selectiva y directamente la unión de los CAMs a las Leucointegrinas serán agentes terapéuticos preferibles. Se han descrito varias moléculas pequeñas en la bibliografía que afectan a la interacción de las CAMs y las Leucointegrinas. Por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 6,355,664 y el WO 98/39303 correspondiente muestran un tipo de pequeña molécula, con un núcleo de hidantoína, que son inhibidores de la interacción de LFA-1 e ICAM-1. De mayor relevancia para esta invención es WO 01/07440 Al, que muestra compuestos que en lugar de ello tienen un núcleo de 6,7-dihidro-5íí-imidazo [1 , 2-a] imidazol . Aunque los compuestos que están descritos específicamente en WO 01/07440 Al tienen un efecto inhibidor más potente sobre la interacción de CAMs y Leucointegrinas que la de las hidantoínas de la Patente Norteamericana No. 6,3.55,664 y el WO9839303 correspondiente, sin embargo no son agentes terapéuticos ideales porque la velocidad a la que se metabolizan es demasiado alta. Por consiguiente, el problema a resolver con esta invención es encontrar moléculas pequeñas que tengan no sólo un buen efecto inhibidor sobre la interacción de CAMs y Leucointegrinas, sino que también se metabolizen a una velocidad que no sea excesivamente rápida.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN La invención es un subconjunto o una selección de 6, 7-dihidro-5H-imidazo [1, 2-a] imidazoles que se describen genérica, pero no específicamente en WO 01/07440 Al. Sorprendentemente, los compuestos incluidos dentro de la invención muestran no sólo un buen efecto inhibidor sobre la interacción de CAMs y Leucointegrinas sino que se metabolizan mucho más lentamente que los compuestos descritos específicamente en WO 01/07440 Al. Los compuestos de la invención resuelven el problema del metabolismo excesivamente rápido.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención comprende compuestos de fórmula I en donde : R1 es alquilo lineal o ramificado de 1 a 3 átomos de carbono el cual es opcionalmente mono o disustituido con restos independientemente seleccionados del grupo que consiste en: (i) oxo y (ii) morfolino; R2 y R3 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que comprende : (A) hidrógeno, y (B) alquilo lineal o ramificado de 1 a 4 átomos de carbono cuyo grupo alquilo está mono o disustituido con restos independientemente seleccionados del grupo que comprende: (i) CONH2 y (ii) OH, o R2 y R3 junto con el átomo de nitrógeno entre ellos forman un anillo de piperazina y R4 es: (A) ciano, (B) pirimidina que está mono o disustituida con NH2 o (C) trifluorometoxi .

Los compuestos preferidos de la invención son los de la fórmula I, en donde R1 es un grupo metilo; R2 y R3 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que comprende: (A) hidrógeno y (B) alquilo lineal o ramificado de 1 a 4 átomos de carbono que está mono o disustituido con restos independientemente seleccionados del grupo que comprende: (i) CONH2 y (ii) OH; y R4 es: (A) ciano o (B) trifluorometoxi . Más preferidos son los compuestos de fórmula I en donde : R1 es un grupo metilo; R2 y R3 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste de: (A) hidrógeno y (B) alquilo lineal o ramificado de 1 a 4 átomos de carbono que está mono o disustituido con restos independientemente seleccionados del grupo que consiste de: (i) C0NH2; y (ii) OH; y R4 es trifluorometoxi . Se apreciará que los compuestos de la fórmula I tienen al menos dos centros quirales. En un aspecto genérico preferido finalmente, la invención incluye compuestos de fórmula I con la estereoquímica absoluta expresada a continuación por la fórmula I*.

Específicamente preferidos son los compuestos de fórmula I seleccionados del grupo que consiste de: (S) -2- [ (R) -5- (4-ciano-bencil) -7- (3 , 5 -dicloro- fenil) - 5-met il -6-oxo- 6 , 7-dihidro- 5H-imidazo [1 , 2 -a] imidazol -3 -sulfonilamino] -propionamida; (S) -2- [ (R) -7- (3 , 5 -dicloro- fenil) -5-metil-6-oxo-5- (4-trifluorometoxi -bencil ) - 6 , 7 -dihidro- 5H-imidazo [1 , 2 -a] imidazol -3-sulfonilamino] -N- (2-hidroxi-2-metil-propil) -propionamida; (S)-2-[(R)-7-(3, 5 -dicloro- fenil) -5-metil -6-oxo- 5- (4-trifluorometoxi -bencil ) -6 , 7 -dihidro- 5H-imidazo [1 , 2 -a] imidazol -3-sulfonilamino] -propionamida; y(S) -N-carbamoilmetilo-2 - [ (R) -5- (4 -ciano-bencil ) -7- (3, 5 -dicloro- fenil ) -5-me il -6-oxo- 6 , 7-dihidro-5H-imidazo [1, 2-a] imidazol-3-sulfonilamino] -propionamida . La invención también incluye las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I. La invención también incluye composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de la fórmula I y al menos un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente o excipiente. La invención también incluye los compuestos de fórmula I para utilizarse como medicamentos, y el uso de compuestos de fórmula I para la preparación de composiciones farmacéuticas para tratar condiciones de inflamación o inflamatorias en un paciente. Ejemplos específicos de condiciones inflamatorias que pueden ser tratados como se describe en la presente.

Métodos de síntesis generales Los compuestos de la invención pueden prepararse por los métodos generales descritos a continuación. Típicamente el proceso de la reacción puede monitorizarse por cromatografía de capa fina (TLC) si se desea. Si se desea, los productos e intermediarios pueden purificarse por cromatografía sobre gel de sílice y/o recristalización y caracterizarse por una o más de las siguientes técnicas-. M , espectroscopia de masa y punto de fusión. Los materiales de partida y los reactivos están disponibles comercialmente o pueden prepararlos los expertos en la técnica utilizando los métodos descritos en la bibliografía química . Los compuestos de fórmula I pueden prepararse a partir del intermediario II. La síntesis del intermediario II la explican Wu et al.; la Solicitud Norteamericana provisional No. de Ser. 09/604,312 y Frutos et al. Norteamericana 6,441,183, ambas incorporadas en la presente para referencia.

El intermediario II puede prepararse por rocedimiento ilustrado en el Esquema I .

Esquema I VIII Como se ilustra en lo anterior, el intermediario III se desprotona con una base apropiada como una bis (trimetil -silil) amida de litio a aproximadamente -20°C a -30°C y se alquila después con un haluro de bencilo sustituido, preferiblemente un bromuro de bencilo (IV) para producir V. La hidrólisis del grupo de trifluoroacetamida de V, por ejemplo, por tratamiento con hidróxido de benciltrimetilamonio acuoso al 40% en dioxano/NaOH al 50%, seguido por el tratamiento con ácido, como KC1, proporciona VI. El tratamiento de VI con tiocarbonildiimidazol en presencia, de una base tal como 4-(W,W-dimetilamino) piridina proporciona VII. El tratamiento de VII con una solución de aminoacetaldehído dimetilacetal y t-butilhidroperóxido , seguido por el tratamiento del acetal intermediario con un ácido como ácido p- oluensulfónico proporciona VIII. La yodación de VIII por tratamiento con un agente yodador como N-yodosuccinamida proporciona II. El método utilizado para la preparación del intermediario III, el tratamiento de la amida formada a partir de N-Boc-D-alanina y 3 , 5 -dicloroanilina con ácido trifluoroacético para extraer el grupo-Boc, seguido por el tratamiento con pivalaldehido y la acilación de la imidazolodona resultante con anhídrido trifluoroacético se describe en la Norteamericana 6,414,161, citado antes, y la bibliografía química (N. Yee, Org Lett., 2000, 2, 2781). La síntesis de los compuestos de fórmula I a partir del intermediario II se ilustra en el Esquema II.

Esquema II I Como se ilustra en lo anterior, el tratamiento de II con un reactivo Grignard, tal como bromuro o cloruro de ciclopentilmagnesio, seguido de un tratamiento de la sal de magnesio resultante con S02 y después iV-clorosuccinimida proporciona el cloruro de sulfonilo IX. El tratamiento de IX con la amina deseada (X) en presencia de una base adecuada como trietilamina, proporciona el producto deseado de fórmula (I). Los productos intermedios X están disponibles comercialmente o bien se preparan fácilmente a partir de materiales de partida disponibles comercialmente por métodos conocidos en la técnica. El producto inicial de fórmula I puede además modificarse por métodos conocidos en la técnica para proporcionar compuestos adicionales de la invención. Se proporcionan varios ejemplos en la sección de Ejemplos de síntesis. Los R4 deseados sobre compuestos de fórmula I pueden obtenerse por selección del producto intermedio adecuadamente sustituido IV en el Esquema I. Alternativamente, el compuesto intermedio VIII que tiene R4 que es Br (Villa) puede convertirse en compuestos intermedios que tienen R4 que es CN o un grupo 5-pirimidilo sustituido como se ilustra en el Esquema III.

Esquema III K2C03 DME Como se ilustra más arriba, el bromuro de arilo Villa se trata con una sal de cianuro, preferiblemente CuCN y se calienta en un disolvente adecuado como DMF para proporcionar el producto ciano intermedio VlIIb. El tratamiento de Villa con un éster de boronato de pirimidina como 5 - (4 , 4 , 5 , 5 , -tetrametil -[1 , 3 , 2 ] dioxaborolan-2-il) pirimidina en la presencia de un catalizador de paladio tal como [1 1 ' -bis (difenilfosfino) ferroceno] -dicloropaladio (II ) -C2C12 (PdCl2 (dppf ) ·??2012) y una base tal como carbonato de potasio en un disolvente apropiado (reacción de Suzuki), por ejemplo dimetoxietano, proporciona el producto intermedio de pirimidina (VIIIc) . Los productos intermedios VlIIb y VIIIc pueden convertirse en los productos deseados de la fórmula I por los procedimientos descritos en los Esquemas I y II. La reacción de Suzuki para convertir R4 = Br en R4 = a una pirimidina opcionalmente sustituida puede también llevarse a cabo sobre un compuesto de fórmula I. La reacción de Suzuki puede también realizarse de manera inversa. El bromuro Villa (o un compuesto de fórmula I con R4=Br) puede convertirse en un éster de boronato por ejemplo por tratamiento con bis (pinacolato) diboro en la presencia de un catalizador de paladio tal como PdCl2(dppf) y después hacerle reaccionar con el deseado bromuro de pirimidilo. La invención se describe además por los siguientes ejemplos de síntesis.

Ejemplos de síntesis Ejemplo I: Síntesis de cloruro de (R) -5- (4-bromo-bencil) -7-(3, 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-6, 7 -dihidro-5H-imidazo [1,2-a] imidazol-3-sulfonilo Una solución de (R) - 3 - (4 -bromo-bencil ) - 1 - (3 , 5 -dicloro-fenil ) -3 -metil -1H- imidazo [1 , 2 -a] imidazol -2 -ona en THF (0.12 M) se trató con IV-yodosuccinimida (1.05 equiv) y p-toluensulfonato de piridinio) (0.1 equiv). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 17 h, se diluyó después con EtOAc y se lavó con solución de Na2S203 al 10% y agua. Las capas acuosas combinadas se extrajeron con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron. El aceite crudo se purificó por cromatografía de gel de sílice para proporcionar el yoduro deseado . Una solución del yoduro anterior en THF (0.12 M) se enfrió a -40°C y se agregó c-pentilcloruro de magnesio (1.05 equiv) gota a gota durante 10 min. Después de agitar a -40°C durante 1 hora, se agregó S02 (g) colocando una aguja de admisión justo encima de la superficie de la mezcla de reacción durante 1.5 min. La mezcla amarillo brillante se calentó a -20°C durante 1 h y después se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Se burbujeó N2 (g) a través de la mezcla durante 20 min seguido de concentración y bombeo bajo alto vacío durante 12 h. La espuma amarilla resultante se disolvió en THF (0.1 ) y se enfrió a -20°C como una solución de N-clorosuccinimida (1.2 equiv) en THF (0.3 M) se agregó gota a gota durante 5 min. Después de agitar a -20°C durante 1 h la mezcla se vertió sobre hielo y se extrajo con dos porciones de EtOAc . Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera enfriada en hielo, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de gel de sílice proporcionó cloruro de (R) - 5 - (4 -bromo-bencil ) -7 - ( 3 , 5 -dicloro- fenil ) -5-metil-6-oxo-6, 7-dihidro-5H- imidazo [1, 2 -a] -imidazol-3-sulfonilo como un sólido.

Ejemplo 2: (S) -2- [ (R) -5- [4- (4amino-pirimidin- 5 - il ) -bencil] -7-(3 , 5-dicloro-fenil) - 5 -metil- 6 -oxo- 6 , 7 -dihidro- 5H- imidazo [1,2-a] imidazol-3-sulfonilamino] -N- (2-hidroxi-etil) -propionamida (660.4, M+l) : 2 A una suspensión de la sal de clorhidrato de (S)-2-amino-iV- (2 -hidroxi -etil) -propionamida (0.53 g, 3.2 mmoles, 3 equiv) en 10 mi de DMF se agregó DMAP (4 equiv) , y la mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. A esta solución se agregó cloruro de (R) -5- (4-bromo-bencil) -7- (3 , 5-dicloro-fenil) - 5 -metil -6-oxo- 6 , 7-dihidro-5H-imidazo [1, 2-a] imidazol-3-sulfonilo) (0.580 mg, 1.06 mmoles) en 2 mi de DMF a temperatura ambiente. Después de agitar a temperatura ambiente durante 15 min, la mezcla se disolvió en EtOAc y se lavó con agua diluida, HC1, NaHC03 saturado y salmuera, se secó sobre Na2S04, se filtró y se concentró. La purificación del producto crudo por cromatografía de gel de sílice dio 0.305 mi del producto deseado. Una mezcla de (S) -2- [ (R) -5- (4bromo-bencil ) -7- (3 , 5-dicloro-fenil ) - 5 -metil -6 -oxo-6 , 7-dihidro-5fí- imidazo [1 , 2 -a] -imidazol-3-sulfonilamino] -N- (2-hidroxi-etil ) -propionamida (0.310 g, 0.473 mmol) , bis (pinacolato) diboro (0.240 g, 0.946 mmol) y KOAc (0.140 g, 1.419 mmoles) en 29 mi de dioxano se sometieron a reflujo con N2 durante 15 min. Se agregó PdCl2 (dppf) (0.039 g, 0.047 mmol), y la mezcla de reacción se calentó a 80°C durante 36 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se concentró, y el residuo se diluyó con 150 mi de EtOAc, se lavó con agua y salmuera, se secó sobre MgS04 , y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de gel de sílice para dar 0.204 g (62%) del boronato. Una mezcla del boronato anterior (0.204 g, 0.295 mmol), 5 -bromo- 2 -amino-pirimidina (0.078 g, 0.443 mmol), y K2C03 (0.122 g, 0.885 mmol) en 8 mi de dimetoxietano y 1.2 mi de agua se sometió a reflujo con N2 durante 20 min. PdCl2 (dppf) (0.025 g, 0.030 mmol) se agregó, y la mezcla de reacción se calentó a 80°C durante 2 h. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla se diluyó con EtOAc, se lavó con agua y salmuera, y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía de gel de sílice y TLC preparativa para conseguir 0.062 g (32%) del compuesto del ítulo (660.4, M+l) : El compuesto siguiente se preparó por procedimientos análogos a los descritos en el Ejemplo 2: (S)-2-[(R)-5-[4- (4 -amino-pirimidin- 5 -il) -bencil] -7 - (3, 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-6, 7-dihidro-5H-imidazo [1, 2-a] -imidazol-3-sulfonilamino] -N- (2-hidroxi-etil) -propionamida (687.1, M+l) : Ejemplo 3: Síntesis de (S) -2- [ (R) -5 - (4-ciano-bencil-7 - (3 , 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-6,7-dihidro-5ff-imidazo [1, 2-a] -imidazol -3 -sulfonilamino] -propionamida A una solución de (R) -3- (4-bromo-bencil ) -1- (3 , 5-dic oro-fenil) -3 -metil - líí-imidazo [1, 2-a] imidazol-2 -ona (3.0 g, 6.6 mmoles) en DMF (60 mi) se agregó Zn(CN2) (0.47 g, 4.0 mmoles) . La solución resultante se desgasificó con una corriente fuerte de N2 durante 2 h. Se añadieron Pd2dba3 y dppf y la mezcla de reacción se calentó a 120°C durante 2 h. El disolvente se evaporó y el residuo se disolvió en EtOAc, se lavó después con agua y salmuera, después se secó y se filtró y el residuo se purificó sobre Florisil para conseguir 2.42 g del producto deseado. Este producto se trató después de manera similar a la descrita en el Ejemplo 1 para producir cloruro de (R) - 5- (4-ciano-bencil) -7- (3 , 5-dicloro- fenil ) -5-me il-6-oxo-6 , 7-dihidro-5Jí- imidazo [1 , 2 - a] - imidazol-3 -sulfonilo . Clorhidrato de L-alaninamida (0.151 g, 1.209 mmoles) se disolvió en DMF anhidro y se agregó DMAP (0.197 g, 1.612 mmoles) a la solución. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h. Después se agregó clorure de (R) -5- ( -ciano-bencil) -7- (3 , 5-dicloro-fenil) - 5 -met il - 6 -oxo- 6 , 7-dihidro-5H-imidazo [1 , 2 -a] imidazol -3 -sulfonilo (0.24 g, 0.484 mmol) en DMF anhidro a la mezcla de reacción y se agitó durante 10 min adicionales. La solución de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con agua, HCl 1N y después agua. La fase orgánica se secó sobre Na2SC>4, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El producto crudo se purificó por cromatografía de columna de gel de sílice para conseguir 0.211 g del compuesto del título como un sólido escamoso blanco ( +l, 547.2) .

Ejemplo 4: Síntesis de (S) -N-carbamoilmetil-2- [ (R) -5- (4-ciano-bencil-7- (3, 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo- 6 , 7-dihidro-5H-imidazo [1, 2-a] imidazol-3-sulfonilamino] -propionamida 4 Clorhidrato de L-alanina t-butil éster (0.88 g, 4.84 mmoles) se disolvió en DMF anhidra (10 mi) y se agregó D AP (0.79 g, 6.46 mmoles) a la solución. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h y cloruro de (R)-5-(4-ciano-bencil - 7- (3 , 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-6 , 7-dihidro-5H-imidazo [1, 2-a] imidazol-3-sulfonilo (0.80 g, 1.61 mmoles) en DMF se agregó a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante otros 10 min. La mezcla de reacción se lavó con agua (x3), HCl 1N en NaHC03 saturado. La fase orgánica se secó sobre Na2S0 y se concentró. El producto crudo se purificó por columna de cromatografía de columna de gel de sílice utilizando CH2Cl2-MeOH (98:2) como eluyente para conseguir 0.94 g de la sulfonamida t-butil éster. El producto resultante se trató con ácido trifluoroacét ico (5 mi) en CH2C12 (10 mi) a temperatura ambiente durante 3 h. La solución de reacción se diluyó con CH C12 y se lavó con agua. La fase orgánica se secó sobre Na2S04 y después se concentró para conseguir 0.67 g de ácido (S) -2- [ (R) -5- (4 -ciano-bencil) -7- (3 , 5-dicloro- fenil) - 5-metil-6-oxo-6 , 7-dihidro-5H- imidazo [1, 2 -a] -imidazol-3-sulfonilamino] -propiónico como una espuma blanca. El ácido carboxílico anterior (0.05 g, 0.091 mmol) se disolvió en DMF anhidro (2 mi) y se agregó hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxitris (pirrolidino) fosfonio (PyBOP) (0.071 g, 0.137 mmol) a la solución de reacción. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 min y se agregó clorhidrato de glicinamida (0.015 g, 0.137 mmol) a la mezcla seguido de N, N-diisopropiletilamina (0.039 mi, 0.027 mmol). La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante otros 15 min. La mezcla se diluyó entonces con EtOAc (10 mi) y se lavó con agua (x2) , HCl 1N, NaHC03 saturado y después agua (xl) . La fase orgánica se secó después sobre Na2S04 y se concentró. El producto crudo se purificó por cromatografía en capa fina preparativa en gel de sílice utilizando CH2Cl2-MeOH (95:5) como eluyente para conseguir 0.043 g del compuesto del título como una espuma blanca (M+l, 604.2). El compuesto siguiente se hizo por procedimientos análogos a los descritos en el ejemplo anterior: (S) -2- [ (R) -5- ( -ciano-bencil ) -7- (3 , 5-dicloro-fenil ) -5-me il-6-oxo-6, 7- dihidro-5H-imidazo [1, 2-a] imidazol-3 -sulfonilamino] -N- (2- hidroxi-2 -metil -propil) -propionamida : (M+l, 619) propionamida Ejemplo 5: Síntesis de (S) -N- ( (R) -l-carbamoiletil-2 - [ ( ) -5- (4 ciano-bencil) -7- (3 , 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-6, 7-dihidro- 50-imidazo [1, 2-a] imidazol-3 -sulfonilamino] -propionamida El ácido (S) -2- [ (R) -5- (4 -ciano-bencil ) -7- (3, 5-dicloro- fenil ) -5-metil-6-oxo-6 , 7-dihidro-5H-imidazo [1,2-a] imidazol -3 -sulfonilamino] -propiónico (véase ejemplo 14) (0.05 g, 0.091 mmol) se disolvió en DMF anhidro (2 mi) y se agregó TBTU (0.044 g, 0.137 mmol) a la solución de reacción. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 10 min y se agregó clorhidrato de D-alaninamida (0.017 g, 0.137 mmol) a la mezcla seguido de N, N-diisopropiletilamina (0.039 mi, 0.227 mmol) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante otros 15 min. La mezcla se diluyó entonces con EtOAc (10 mi) y se lavó con agua, HC1 1 N, NaHC03 saturado y después agua. La fase orgánica se secó sobre Na2S04 y se concentró. El producto crudo se purificó por cromatografía en capa fina preparativa de gel de sílice para conseguir 0.035 g del compuesto del título como una espuma blanca (M+l, 618.2) .

Ejemplo 6: Síntesis de (S) -2 - [ (R) -5 - (4 -ciano-benci) -7- (3 , 5-dicloro- fenil) -5-metil-6-oxo- 6 , 7-dihidro-5H-imidazo [1,2-a] imidazol -3 -sulfonilamino] -N- (2-hidroxi-etil) -propionamida Una mezcla de L-Boc-alanina (0.40g, 2.11 mmoles) , etanolamina (0.15 mi, 2.54 mmoles) y HOBt (0.29 g, 2.11 mmoles) en CH3CN anhidro (9 mi) se enfrió a 0°C y se agregó clorhidrato de 1- (3-dimetilaminopropil) - 3 -etilcarbodiimida (EDC) (0.49 g, 2.54 mmoles) se agregó a la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante 19 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con ácido cítrico al 5%. La capa acuosa se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con NaHC03 y salmuera. La fase orgánica se secó sobre Na2S04 y se concentró para conseguir 0.38 g del producto acoplado como un aceite incoloro . El alcohol anterior (0.34 g, 1.45 mmoles) se disolvió en CH2C12 (3 mi) y se agregó HC1 4N en dioxano (3 mi) a la solución. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 2 h y se concentró entonces para conseguir clorhidrato de (S) -2 -amino-N- (2 -hidroxi -etil) -propionamida . A una solución de la sal de amina anterior (0.043 g, 0.254 mmol) en DMF anhidro, se agregó DMAP (0.027 g, 0.303 mmol) . La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 1 h, se agregó entonces cloruro de (R) -5- (4-ciano-bencil) -7- (3 , 5 -dieloro- fenil ) -5-metil-6-oxo-6, 7 - dihidro- 5H-imidazo [1 , 2-a] imidazol-3-sulfonilo (0.036 g, 0.073 mmol) entonces se agregó a la mezcla de reacción y se agitó durante otras 2 h. La mezcla de reacción se diluyó con EtOAc y se lavó con HC1 1N y NaHCC>3 saturado. La fase orgánica se secó sobre Na2S04 y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en capa fina preparativa de gel de sílice para conseguir 0.035 g del compuesto del título como una espuma blanca (M+l, 591.1) .

Ejemplo 7: Amida del ácido (S) -2- [ (R) -5- (4 -ciano-bencil) -7-(3 , 5 -dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-6, 7-dihidro- 5H-imidazo [1,2-a] imidazol - 3 - sulfonilamino] - 5 -morfolin- - il - 5- oxo -pentanoico A una mezcla del ácido 1-bencil éster (S) -2-ter-butoxicarbonilamino-pentanodioico (4.5 g, 13.4 mmoles) , morfolina (1.29 mi, 14.8 mmoles), HOBt (1.89 g, 14.0 mmoles) en CH2C12 (18 mi) a 0°C, se agregó lentamente una solución de DCC (2.89 g, 14.0 mmoles) en CH2C12 (18 mi). La mezcla resultante se permitió calentar a temperatura ambiente y se agitó durante la noche. El precipitado resultante se filtró y entonces el filtrado se diluyó con CH2C12. La solución se lavó con NaHC03 saturado, HCl 1 N, y finalmente salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2S0 y después se filtró. La evaporación del disolvente proporcionó la amida deseada (5.42 g) como un sólido blanco . Una mezcla de la amida anterior (6.17 g, 1.52 mmoles) y Pd/C al 10% (0.52 g) en EtOAc (50 mi) se hidrogenó bajo presión atmosférica durante 24 h. La mezcla se filtró y se concentró para proporcionar ácido (S)-2-ter-butoxicarbonilamino-5-morfolin- -il-5-oxo-pentanoico (3.12 g) como una espuma que se usa sin purificación posterior. Se burbujeó gas amoniaco dentro de una solución del ácido carboxílico obtenido antes (3.12 g, 9.86 mmoles) y hexafluorofosfato de ' 0- (7-azabenzotriazol-l-il) -N, N, N' , N' -tetrametiluronio (HATU) (5.25 g, 13.8 mmoles) en DMF (30 mi) con agitación durante 20 min. A la suspensión amarilla resultante se agregó N, iV-diisopropiletilamina (5.15 mi, 29.5 mmoles) mediante jeringa. La mezcla se agitó bajo una atmósfera de nitrógeno durante la noche. La reacción se filtró y se concentró bajo vacío. El residuo resultante se disolvió en CH2C12, se lavó con NaHC03 saturado, HCl 1 N y finalmente salmuera. La capa orgánica se secó sobre Na2S04, se filtró y se concentró. El residuo resultante se recristalizó desde EtOAc para proporcionar la amida (1.16 g) como un sólido blanco. El grupo Boc se separó con HCl en EtOAc y el resultante clorhidrato de la amida del ácido (S) -2-amino-5-morfol in- 4 - il - 5-oxo-pentanoico se recogió por filtración en vacío y se utilizó sin purificación posterior. A una solución agitada de cloruro de (R) - 5 - (4 -ciano-bencil ) - 7 - (3, 5-dicloro-fenil ) - 5-met il-6-???-ß , 7-dihidro-5H- imidazo [1 , 2 -a] - imidazol -3 -sulfonilo (76 mg, 0.13 mmol) en DMF (4 mi) se agregó N,JV-diisopropiletilamina (60 L, 0.39 mmol) y el clorhidrato de la amina (100 mg, 0.4 mmol) . Después de agitar durante la noche el DMF se separó bajo vacío y el residuo resultante se cromatografió bajo gel de sílice. El producto se purificó después por HPLC semipreparativa para proporcionar 32 mg del compuesto del título como un sólido blanco (M+l, 674.04).

Ejemplo 8: Síntesis de (S) -2- [ (R) -7- (3, 5-dicloro-fenil) -5-metil-6 -oxo-5- (4- trifluorometoxi-bencil) - 6 , 7-dihidro-5H-imidazo [1, 2-a] imidazol-3-sulfonilamino] -propionamida Bis (trimetilsilil) amida de litio (LiHMDS) (38.0 mi, 1 NI en THF) se agregó lentamente gota a gota durante 25 min a una solución de (2S , 5R) -2 - ter-butil -3- (3 , 5 -dicloro- fenil ) -5-metil -1- (2 , 2 , 2-trifluoroacetil) - imidazolidin-4 -ona (10.0 g, 25.17 mmoles) en 60 mi de THF a -20°C. Después de agitación a -20°C durante 20 min, se agregó gota a gota una solución de bromuro de - trifluorometoxibencilo (6.04 mi, 37.76 mmoles) en 30 mi de THF durante 20 min. La mezcla se agitó a -20°C durante 45 min, se calentó a -5°C durante 1 h y después sé vertió sobre 50 mi de solución saturada de H4C1 solución enfriada en hielo. La mezcla resultante se extrajo con EtOAc. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron. El producto crudo se trituró con hexanos para proporcionar 12.5 g (87%) de (2R, 5R) -2- ter-butil-3- (3 , 5-dicloro- fenil) -5-metil-l- (2, 2 , 2-trifluoro-acetil) -5- (4-trifluorometoxi -bencil ) - imidazolidin-4 -ona como un sólido blancuzco. A una solución de la imidazolidinona anterior (6.0 g, 10.5 mmoles) en 40 mi de dioxano se agregó hidróxido de benciltrimetilamonio acuoso al 40% (6.59 g, 15.75 mmoles) a temperatura ambiente. Cuando se hubo calentado la mezcla a 40°C, se agregó hidróxido sódico acuoso al 50% (1.68 g, 21.0 mmoles) gota a gota lentamente durante 5 min. La mezcla se agitó a 40°C durante 18 h, después se agregó lentamente una solución de 6.4 g de HCl concentrado en 3.3 mi de agua gota a gota durante 10 min. La mezcla se calentó a 50°C y se agitó durante 5 h adicionales, después se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. Se añadieron 50 mi de tolueno al residuo, y la mezcla bifásica se agitó vigorosamente mientras se añadía lentamente gota a gota hidróxido sódico acuoso al 50% (3.0 g) (pH de la fase acuosa >10) . La capa acuosa se extrajo con tolueno, y las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y concentraron para conseguir 4.24 g de (R) -2-amino-N- (3 , 5-dicloro-fenil) -2-metil-3- ( -trifluorometoxi - fenil) -propionamida como un aceite marrón claro. A una solución de la propionamida anterior (4.24 g, 10.41 mmoles) en 30 mi de THF se agregó tiocarbonildiimidazol (2.81 g, 15.77 mmoles) y 4 -dimetilaminopiridina (DMAP) (0.127 g, 1.04 mmoles) . La mezcla se calentó a reflujo durante 17 h, se enfrió a temperatura ambiente, y se concentró. El residuo aceitoso de color naranja se disolvió en 50 mi de tolueno y se trató lentamente gota a gota con 20 mi de solución de HCl acuoso al 5%. Después de agitar la mezcla durante 10 min, la capa acuosa se separó y se extrajo con tolueno. Las fases orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2S04 , se filtraron y se concentraron para proporcionar 4.48 g de (R) -3- (3 , 5 -dicloro-fenil ) -5-metil-2-tioxo-5- (4-trifluorometoxi -bencil) -imida-zolidin-4-ona como una espuma naranja. A una solución de la tiohidantoina anterior (4.47 g, 9.95 mmoles) y aminoacetaldehido dimetilacetal (6.50 mi, 59.7 mmoles) en 20 mi de eOH se añadieron 7.69 mi (59.7 mmoles, 70% en' agua) de solución de t-butil hidroperóxido gota a gota durante 25 min. Durante la adición y durante aproximadamente 1 h después, la temperatura interna de la mezcla se mantuvo por debajo de 20°C con un baño de agua helada. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 86 h, y se añadieron lentamente gota a gota 25 mi de solución saturada de NaHS03 manteniendo la temperatura interna por debajo de 20°C con un baño de agua helada. La mezcla blanca turbia resultante se concentró. Al residuo se agregó EtOAc, y esta mezcla se concentró de nuevo. El residuo aceitoso se dividió entre EtOAc y agua y la fase acuosa se- separó y se extrajo con EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con agua y salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron para dar 5.21 g de (R) -3 - (3 , 5-dicloro- fenil ) -2 -[ (E) -2 , 2 -dimetoxi -etilimino] -5-metil-5- (4 -trifluorometoxi -bencil ) - imidazol idin-4 -ona como un aceite espeso amarillo. Una solución del acetal crudo anterior (5.20 g, 9.95 mmoles) en 30 mi de acetona se trató con ácido p-toluensulfónico (1.89 g, 9.96 mmoles). La mezcla se calentó a reflujo durante 2 h, después se enfrió a temperatura ambiente y se concentró. El aceite resultante naranja oscuro se disolvió en 40 mi de EtOAc y se trató cuidadosamente con una solución de 2.3 g de NaHC03 en 23 mi de agua. Después de que ha cesado la evolución de gas, la fase acuosa se separó y se extrajo con dos porciones de EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con solución saturada de NaHC03, dos porciones de agua, y salmuera, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron. El residuo aceitoso se purificó por cromatografía de gel de sílice para conseguir 1.58 g de (R) -1- (3 , 5-dicloro-fenil) -3-metil-3- (4-trifluorometoxi -bencil) - ltf-imidazo [1 , 2 -a] imidazol-2-ona (456.2, M+l). Una solución de (R) -1- (3 , 5-dicloro-fenil) -3-metil-3- (4 - trifluorometoxi -bencil ) - lH-imidazo [1 ,2-a] imidazol -2 -ona (Ejemplo 1) (1.54 g, 3.38 mmoles) en 30 mi de THF se trató con W-yodosuccinimida (0.846 g, 3.76 mmoles) y p-toluensulfonato de piridinio (0.086 g, 3.76 mmoles) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 17 h, después se diluyó con EtOAc y se lavó con solución de a2S203 al 10% y agua. Las capas acuosas combinadas se extrajeron con 10 mi de EtOAc. Las. fases orgánicas combinadas se lavaron con 25 mi de salmuera, se secaron sobre Na2S0 , se filtraron y se concentraron. El aceite naranja crudo se purificó por cromatografía de gel de sílice para proporcionar 1.27 g (65%) de (R) - 1 - (3 , 5-dicloro-fenil ) - 5 -yodo-3-metil-3- (4-trifluorometoxi -bencil) -lH-imidazo [1,2-a] imidazol-2-ona como un aceite blancuzco (582.0, M+l) . Una solución del yoduro anterior (1.24 g, 2.13 mmoles) en 16 mi de THF se enfrió a -40°C mientras se añadía gota a gota cloruro de ciclopentilmagnesio (1.17 mi, 2 en éter dietílico durante 10 min. Después de agitar a -40°C durante 1 h, se agregó S02 (g) colocando una aguja de admisión justo encima de la superficie de la mezcla de reacción durante 1.5 min. La mezcla amarillo brillante se calentó a 20°C durante 1 h y después se agitó a temperatura ambiente durante 1 h N2 (g) se burbujeó a través de la mezcla durante 20 min seguido de concentración y bombeo bajo alto vacío durante 12 h. La espuma resultante amarilla se disolvió en 16 mi de THF y se enfrió a -20°C como una solución de iV-clorosuccinimida (0.341 g, 2.56 mmoles) en 8 mi de THF se añadía gota a gota durante 5 min. Después de agitar a -20°C durante 1 h, la mezcla se vertió sobre hielo. y se extrajo con dos porciones de EtOAc. Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera enfriada en hielo, se secaron sobre Na2S04, se filtraron y se concentraron. La purificación por cromatografía de gel de sílice proporcionó 0.975 g (83%) de aceite espeso de cloruro de (R)-7-(3,5-dicloro-fenil) -5 -metil -6-oxo-5- (4 - trifluorometoxi -bencil) -6,7-dihidro- 5fí- imidazo [ 1 , 2 -a] imidazol- 3 - sulfonilo (554.2, M+l) . Una solución de sal de L-alaninamida HCl (0.097 g, 0.782 mmol) en 6.5 mi de DMF se trató con trietilamina (0.163 mi, 1.17 mmoles) a temperatura ambiente. Después de agitar durante 10 min, se agregó rápidamente gota a gota una solución del cloruro de sulfonilo anterior (0.217 g, 0.391 mmol) en 1 mi de CH2C12, y la mezcla turbia se agitó a temperatura ambiente durante 5 h. Después de adición de EtOAc, la capa orgánica se lavó con agua, después salmuera, se secó sobre Na2S04, se filtró y se concentró. El producto crudo se purificó por cromatografía de gel de sílice para conseguir 0.193 g (81%) del compuesto del título como un sólido blanco (606.3, M+l) . El compuesto siguiente se preparó por un procedimiento análogo al Ejemplo 8: (R) -2 - [ (R) -7- (3 , 5 -dicloro- fenil) -5-metil -6-oxo- 5 - (4-trifluorometoxi -bencil ) -6 , 7 -dihidro- 5H- imidazo [1 , 2 -a] imidazol -3-sulfonilamino] -propionamida (606.4, M+l) : Ejemplo 9: Síntesis de (S) -2- [ (R) -7- (3, 5-dicloro-fenil) metil-6-oxo-5- (4-trifluorometoxi-bencil) -6,7 -dihidro-5H-imidazo [1,2-a] imidazol- 3 -sulfonilamino] -N- (2 -hidroxi-etil) -propionamida A una suspensión de N-Boc-L- (N' -hidroxietil) alaninamida (0.188 g, 0.809 mmol) en 1 mi de dioxano se agregó HC1 (2.0 mi, 4 M en dioxano) , y la mezcla resultante turbia se agitó a temperatura ambiente durante 2.5 h. La concentración de la mezcla se realizó por adición de CH2C12/ y este proceso se repitió dos veces. El bombeo final bajo alto vacío durante 12 h proporcionó un aceite incoloro. La sal cruda de amina HC1 se disolvió en 1.5 mi de DMF y se trató con trietilamina (0.157 mi, 1.13 mmoles) . Después de agitar a temperatura ambiente durante 10 min, una solución de cloruro de (R) -7- (3 , 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-5- (4 -trifluorometoxi-bencil ) - 6 , 7-dihidro-5H-imidazo [1 , 2 -a] imidazol - 3 -sulfonilo (0.125 g, 0.225 mmol) en 3 mi de CH2C12 se agregó rápidamente gota a gota a través de una cánula. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 4 h. Después de adición de EtOAc, la capa orgánica se lavó con tres porciones de solución de NaCl al 5%, después con salmuera, se secó sobre Na2S04 , se filtró y se concentró. El producto crudo se purificó por cromatografía preparativa TLC para conseguir 0.118 g (81%) del compuesto del título como una espuma blanca (649.9, M+l) . El compuesto siguiente se preparó por un procedimiento análogo al Ejemplo 9: (S)-2-[(R)-7- (3 , 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-5- (4-trifluorometoxi -bencil ) -6, 7-dihidro-5H-imidazo [1 , 2-a] imidazol- 3-sulfonilamino] -N- (2-hidroxi-2-metil-propil) -propionamida (678.3, M+l) : Descripción de las Propiedades Biológicas Las propiedades biológicas de los compuestos representativos de la fórmula I se investigaron por medio del protocolo experimental descrito a continuación.

Ensayo para determinar la inhibición de la unión de LFA-1 a ICAM-1 Propósito del ensayo: Este protocolo de ensayo está diseñado para estudiar el antagonismo directo, por un compuesto de prueba, de la interacción de CAM, ICAM-1 con la Leucointegrina CD18/CDlla (LFA-1) .

Descripción del protocolo de ensayo: LFA-1 se inmunopur f ica utilizando el anticuerpo TS2/4 de un pelet de 20 g de células JY o SK 3 humanas, utilizando un protocolo previamente descrito (Dustin, M. J.; et al., J. Immunol. 1992, 148, 2654-2660) . El LFA-1 se purifica a partir de lisatos SKW3 por cromatografía de inmunoafinidad sobre Sefarosa mAb TS2/4 LFA-1 y se eluye a pH 11.5 en la presencia de MgCl2 2 mM y octilglucósido al 1%. Después de recoger y neutralizar las fracciones de la columna TS2/4, las muestras se reúnen y se preaclaran con agarosa Proteína G. Se construye, se expresa, se purifica y se caracteriza una forma soluble de ICAM-1 como se ha descrito previamente (Marlin, S.; et al., Nature, 1990, 344, 70-72 y véase Arruda, A.; et al., Antijn roJb. Agents Chemother . , 1992, 36, 1186-1192) . Brevemente, la isoleucina 454 que se localiza en el límite putativo entre el dominio 5 del ectodominio y el dominio de la transmembrana se cambia a un codón de terminación utilizando mutagénesis dirigida por oligonucleótidos estándar. Esta construcción produce una molécula idéntica a los primeros 453 aminoácidos de ICAM-1 unido a la membrana. Se crea un vector de expresión con un gen de hidrofolato reductasa de hámster, un marcador de resistencia a neomicina, y la región codificante del constructo sICAM-1 descrito antes, junto con el promotor, las señales de empalme, y la señal de poliadenilacion de la región próxima SV40. El plásmido recombinante se transfecta a células CHO DUX . utilizando métodos de fosfato cálcico estándar. Las células se pasan a un medio selectivo (G418) y las colonias que secretan sICAM-1 se amplifican utilizando metotrexato. sICAM-1 se purifica desde medios libres de suero utilizando técnicas cromatográficas no de afinidad, incluyendo cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaño. La unión de LFA-1 a 1CAM-1 se controla incubando primeramente sICAM-1 a 40 µ9/?t?1 en solución salina tamponada de fosfato Dulbecco con calcio y magnesio, MgCl2 2 mM adicional y PMSF 0.1 mM (tampón de dilución) en una placa de 96 pocilios durante 30 min a temperatura ambiente. Las placas se bloquean después por adición de albúmina de suero bovino al 2%(p/v) en tampón de dilución a 37°C durante 1 h. La solución de bloqueo se separa de los pocilios y los compuestos de prueba se diluyen y después se añaden, seguidos de la adición de aproximadamente 25 ng de LFA-1 purificada por inmunoafinidad . La LFA-1 se incuba en presencia del compuesto de prueba e ICAM-1 a 37°C durante 1 h. Los pocilios se lavan tres veces con tampón de dilución. El LFA-1 unido se detecta por adición de un anticuerpo monoclonal dirigido contra un péptido que corresponde a la cola citoplásmica CD18 en una dilución 1:100 con tampón de dilución y BSA al 1% y se deja incubar durante 45 min a 37°C. Los pocilios se lavan 3 veces con tampón de dilución y el anticuerpo monoclonal unido se detecta por adición de una dilución 1:4000 de peroxidasa de rábano picante conjugada a inmunoglobulina de cabra dirigida contra inmunoglobulina de conejo. Este reactivo se deja incubar durante 20 min a 37°C, los pocilios se lavaron como anteriormente y se añade el sustrato para la peroxidasa de rábano picante a cada pocilio para desarrollar una señal colorimétrica cuantitativa proporcional a la cantidad de LFA-1 unido a sICAM-1. ICAM-1 soluble (60 9/??1) se usa como un control positivo para la inhibición de la interacción LFA-l/ICAM-1. La" ausencia de la adición de LFA-1 al ensayo de unión se usa como un control de fondo para todas las muestras . Se obtiene una curva dosis -respuesta para todos los compuestos de prueba . Todos los compuestos hechos en los ejemplos anteriores se probaron en este ensayo y se encontró que cada uno tenía un K¿ < 10 µ?.

Ensayo para Determinar el Metabolismo por Enzimas Microsomicas de Hígado Humano Propósito del ensayo: Este protocolo de ensayo está diseñado para medir el metabolismo in vitro de los compuestos de prueba por enzimas microsomicas de hígado humano. Los datos recogidos se analizan para calcular la vida media (t1/2, min) para los compuestos de prueba .

Descripción del protocolo de ensayo: El ensayo se realiza en tampón de fosfato potásico 50 mM, pH 7.4 y NADF 2.5 mM. Las muestras de prueba se disolvieron en acetonitrilo para una concentración de ensayo final de 1 -10 µ?. Los microsomas de hígado humano se diluyeron en tampón de ensayo hasta una concentración de ensayo final de 1 mg proteína/ml. Un volumen de 25 µ? de solución de compuesto y 50 µ? de suspensión de microsomas se añadieron a 825 µ? de tampón de ensayo. La preparación se incuba durante 5 min en un baño de agua a 37°C. La reacción se comenzó por la adición de 100 µ? de NADF. Se separan volúmenes de 80 µ? de la mezcla de incubación a 0, 3, 6, 10, 15, 20, 40, y 60 min después del comienzo de la reacción y se añadieron a 160 µ? de acetonitrilo. Las muestras se agitaron durante 20 segundos y después se centrifugaron durante 3 min a 3000 rpm. Un volumen de 200 µ? del sobrenadante se transfiere a platos de filtro de fibra de vidrio de 0.25 mm y se centrifuga durante 5 min a 3000 rpm. Volúmenes de inyección de 10 µ? se añaden típicamente a columnas de HPLC de Zorbax SB C8 con ácido fórmico en agua o acetonitrilo a un caudal de 1.5 ml/min. El porcentaje de pérdida del compuesto se calcula a partir del área bajo cada punto de tiempo para determinar la vida media. Los compuestos hechos en los ejemplos anteriores se comprobaron en este ensayo y se encontró generalmente que tenían t-¡_/2 50 min.

Descripción del uso terapéutico: Las nuevas moléculas pequeñas de fórmula I proporcionadas por la invención inhiben la agregación homotípica dependiente de ICAM-l/LFA-1 de linfocitos humanos y la adherencia de linfocitos humanos a ICAM-1. Estos compuestos tienen utilidad terapéutica en la modulación de activación/proliferación de células inmunes, por ejemplo, como inhibidores competitivos de reacciones de unión ligando/receptor intercelular que implican CAMs y Leucointegrinas . Más específicamente, los compuestos de la invención pueden utilizarse para tratar ciertos estados inflamatorios, incluyendo estados que resultan de una respuesta del sistema inmune no específico en un mamífero (por ejemplo, síndrome de distrés respiratorio, en adultos, shock, toxicidad por oxígeno, síndrome de daños orgánicos múltiples secundarios a septicemia, síndrome de daños orgánicos múltiples secundarios a trauma, daños por reperfusión de tejidos debido a bypass cardiopulmonar, infarto de miocardio o uso con agentes de trombolisis, glomerulonefritis aguda, vasculitis, artritis reactiva, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, shock, ictus, daño térmico, hemodiálisis , leucaferesis , colitis ulcerante, enterocolitis necrotizante o síndrome asociado con transfusión granulocítica) y estados que resultan de una respuesta del sistema inmune específico en un mamífero (por ejemplo, psoriasis, rechazo de trasplante de órgano/tejido, injerto frente a reacciones del huésped y enfermedades autoinmunes incluyendo el síndrome de Raynaud, tiroiditis auotinmune, dermatitis, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, uveitis, enfermedad inflamatoria del intestino incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerante, y lupus eritematoso sistémico) . Los compuestos de la invención también pueden usarse para tratar el asma o como un auxiliar para minimizar la toxicidad de la terapia con citoquina en el tratamiento de cánceres. En general estos compuestos pueden emplearse en el tratamiento de las enfermedades actualmente tratables mediante terapia con esteroides . Así , otro aspecto de la invención es la provisión de un método para el tratamiento o profilaxis de las condiciones descritas anteriormente mediante la administración de cantidades terapéuticas o profilácticas de uno o más compuestos de la fórmula I . De acuerdo con el método proporcionado por la invención, los nuevos compuestos de la fórmula I pueden administrarse con fines terapéuticos o prof lácticos, solos o con otros agentes inmunosupresores o antiinflamatorios. Cuando se suministran profilácticamente, los compuestos inmunosupresores se proporcionan antes de cualquier respuesta o síntoma inflamatorio (por ejemplo, antes de, en el momento o justo después de un trasplante de tejido o de órgano pero antes de cualquier síntoma de rechazo del órgano) . La administración profiláctica de un compuesto de la fórmula I sirve para prevenir o atenuar cualquier respuesta inflamatoria subsiguiente (como por ejemplo, rechazo de un órgano o tejido trasplantado, etc.) . La administración terapéutica de un compuesto de la fórmula I sirve para atenuar cualquier inflamación actual (como por ejemplo, el rechazo de un órgano o tejido trasplantado) . Así, de acuerdo con la invención, un compuesto de la fórmula I puede administrarse bien antes de la aparición de la inflamación (así como suprimir una inflamación anticipada) o bien después de la iniciación de la inflamación. El nuevo compuesto de la fórmula I puede, de acuerdo con la invención, administrarse en dosis única o dosis divididas por vía oral, parenteral o tópica. Una dosis oral adecuada para un compuesto de fórmula I estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 mg a 10 g por día. En las formulaciones parenterales , una unidad de dosificación adecuada puede contener desde 0.1 a 250 mg de esos compuestos, mientras que para administración tópica, se prefieren las formulaciones que contienen 0.01 a 1% de ingrediente activo. Debe comprenderse, sin embargo, que la administración de dosis variará de paciente a paciente y la dosificación para cualquier paciente particular dependerá del dictamen del médico, que usará como criterio para fijar una dosis adecuada el tamaño y el estado del paciente, así como la respuesta del paciente al fármaco. Cuando los compuestos de la presente invención se administran por vía oral, pueden administrarse como medicamentos en forma de preparaciones farmacéuticas que los contienen en asociación con un material soporte farmacéutico compatible. Ese soporte puede ser un material inerte orgánico o inorgánico adecuado para administración oral. Ejemplos de esos materiales soporte son agua, gelatina, talco, almidón, estearato de magnesio, goma arábiga, aceites vegetales, polialquilenglicoles , jalea de petróleo y similares. Las preparaciones farmacéuticas pueden prepararse de manera convencional y las formas de dosificación finales pueden ser formas sólidas, por ejemplo, comprimidos, grageas, cápsulas y similares o formas líquidas, por ejemplo, soluciones, suspensiones, emulsiones y similares. Las preparaciones farmacéuticas pueden someterse a operaciones farmacéuticas convencionales como la esterilización. Además, las preparaciones farmacéuticas pueden contener auxiliares convencionales, como conservadores, estabilizadores, emulsificadores , mejoradores del sabor, agentes humectantes, tampones, sales para variar la presión osmótica y similares. El material soporte sólido que puede usarse, incluye, por ejemplo, almidón, lactosa, manitol, metilcelulosa, celulosa microcristalina, talco, sílice, fosfato de calcio dibásico y polímeros de alto peso molecular (tales como polietilenglicol ) . Para uso parenteral, puede administrarse un compuesto de fórmula I en una solución acuosa o no acuosa, suspensión o emulsión en un aceite farmacéuticamente aceptable o una mezcla de líquidos, que pueden contener agentes bacteriostáticos, antioxidantes, conservadores, tampones u otros solutos para preparar la solución isotónica con la sangre, agentes espesantes, agentes de suspensión u otros aditivos farmacéuticamente aceptables. Los aditivos de este tipo incluyen, por ejemplo, tampones de tartrato, citrato y acetato, etanol propilenglicol , polietilenglicol , formadores de complejos (tal como EDTA) , antioxidantes (tal como bisulfito sódico, metabisulfito sódico y ácido ascórbico) , polímeros de alto peso molecular (tal como óxidos de polietileno líquidos) para regulación de la viscosidad y derivados de polietileno de anhídridos de sorbitol. Pueden también añadirse conservadores si es necesario, como ácido benzoico, metil o propilparabeno , cloruro de benzalconio y otros compuestos de amonio cuaternario . Los compuestos de esta invención pueden también administrarse como soluciones para aplicación nasal y pueden contener además de los compuestos de esta invención tampones adecuados, ajustadores de la tonicidad, conservadores microbianos, antioxidantes y agentes que aumentan la viscosidad en un vehículo acuoso. Ejemplos de agentes que aumentan la viscosidad son alcohol polivinílico, derivados de celulosa, polivinilpirrolidona, polisorbatos o glicerina. Los conservadores microbianos pueden incluir cloruro de benzalconio, timerosal, clorobutanol o alcohol feniletilíco . Adicionalmente , los compuestos proporcionados por la invención pueden administrarse tópicamente o por supositorios.

Formulaciones Los compuestos de la fórmula I pueden formularse para administración terapéutica de varias maneras. A continuación se dan ejemplos de varias formulaciones.

Ejemplo A Cápsulas comprimidos Ejemplo A-l Ingredientes Cantidad d Compuesto de fórmula I 250 mg Almidón 160 mg Celulosa microcristalina 90 mg Glicolato de almidón sódico 10 mg Estearato magnésico 2 mg Sílice coloidal ahumada 1 mg El compuesto de la fórmula I se mezcla para formar un polvo con los materiales excipientes mezclados previamente identificados con excepción del lubricante. El lubricante se mezcla después y la mezcla resultante se comprime en forma de comprimidos o se rellena en cápsulas de gelatina dura.

Ejemplo B Soluciones parentera Ingredientes Cantidad Compuesto de fórmula 500 mg PEG 400 40% en volumen Alcohol etílico 5% en volumen Solución salina 55% en volumen Los materiales excipientes se mezclan y se añaden después a uno de los compuestos de la fórmula I en tanto volumen como sea necesario para la disolución. Se continúa la mezcla hasta que esta solución esté clara. La solución se filtra después en los viales o ampollas apropiados y se esteriliza en autoclave.

Ejemplo C Suspensión Ingredientes Cantidad Compuesto de fórmula I 100 mg Ácido cítrico 1.92g Los materiales excipientes se mezclan con agua y después se añade uno de los compuestos de fórmula I y se continúa la mezcla hasta que la suspensión es homogénea. La suspensión se transfiere después a los viales o ampollas apropiados .

Ejemplo D Formulación tópica Ingredientes cantidad Compuesto de fórmula I 5% en peso Tefose 63 13% en peso Labrafil M 1944 CS 3% en peso Aceite de parafina 8% en peso Metilparabeno (MP) 0.15% en peso Propilparabeno (PP) 0.05% en peso Agua desionizada q . s . a 100 mi Las cantidades apropiadas de Tefose 63, Labrafil M 1S44 CS, aceite de parafina y agua se mezclaron y calentaron a 75°C hasta que todos los componentes se han fundido. La mezcla se enfría después a 50°C con agitación continua. El metilparabeno y el propilparabeno se añadieron y la mezcla se enfrió a temperatura ambiente. El compuesto de fórmula I se agregó a la mezcla y se mezcló muy bien.

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES 1. Compuesto de la fórmula I, caracterizado porque
2. R1 es alquilo lineal o ramificado de 1 a 3 átomos de carbono que está opcionalmente mono o disustituido con restos independientemente seleccionados del grupo que consiste de: (i) oxo, y (ii) morfolino; R2 y R3 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste: (A) hidrógeno, y
3. (B) alquilo lineal o ramificado de 1 a 4 átomos de carbono cuyo grupo alquilo está mono- o disustituido con restos independientemente seleccionados del grupo que consiste de: (i) CONH2, y (ii) OH, o R2 y R3 juntos con el átomo de nitrógeno entre ellos forman un anillo de piperazina; y R4 es: (A) ciano,
4. (B) pirimidina que está mono o disustituida con NH2 o (C) trifluorometoxi ; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables . 2. Compuesto de la fórmula I de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque: R1 es un grupo metilo; R2 y R3 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste de: (A) hidrógeno, y (B) alquilo lineal o ramificado de 1 a 4 átomos de carbono que está mono- o disustituido con restos independientemente seleccionados del grupo que consiste de: (i) CONH2, y (ii) OH; y R4 es: (A) ciano, o (B) trifluorometoxi ; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables. 3. Compuesto de la fórmula I , de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque: R1 es un grupo metilo; R2 y R3 se seleccionan cada uno, independientemente, del grupo que consiste de: (A) hidrógeno, y (B) alquilo lineal o ramificado de 1 a 4 átomos de carbono que está mono- o disustituido con restos independientemente seleccionados del grupo que consiste de: (i) CONH2 ; y (ii) OH; y R4 es trifluorometoxi ; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables . 4. Compuesto de la fórmula I, de conformidad con la reivindicación 1, 2 ó 3, que tiene la estereoquímica absoluta expresada a continuación por la fórmula I*.
5. 5. Compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3 ó 4, seleccionado del grupo, caracterizado porque consiste de: (a) (S) -2 - [ (R) -5 - (4 -ciano-bencil ) -7 - (3 , 5 -dicloro-fenil ) - 5 -metil - 6 -oxo- 6 , 7-dihidro-5H- imidazo [1 , 2 -a] imidazol -3 -sulfonilamino] -propionamida (b) (S) -2 - [ (R) -7- (3 , 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-5- (4 -trifluorometoxi -bencil ) -6, 7-dihidro-5H-imidazo [1, 2-a] imidazol-3 -sulfonilamino] -N- (2-hidroxi-2-metil-propil) -propionamida; (c) (S) -2- [ (R) -7- (3 , 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-5- (4-trifluorometoxi -bencil) -6, 7-dihidro-5H- imidazo [1, 2-a] imidazol-3-sulfonilamino] -propionamida; y (d) (S) -N-carbamoilmetil-2- [ (R) -5- (4 -ciano-bencil ) -7- (3, 5-dicloro-fenil) -5-metil-6-oxo-6, 7 -dihidro-5H- imidazo [1, 2-a] -imidazol -3-sulfonilamino] -propionamida; o una de sus sales farmacéuticamente aceptables.
6. 6. Composición farmacéutica que comprende un compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5 y al menos un portador farmacéuticamente aceptable, un diluyente o un excipiente.
7. 7. Compuesto de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 6 5 para su uso como medicamento.
8. 8. Uso de un compuesto de conformidad con la reivindicaciones 1, 2, 3, 4, ó 5 para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de condición de inflamación o inflamatoria en un paciente.
9. 9. Uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el estado que se ha de tratar es el síndrome de distrés respiratorio en adultos, shock, toxicidad por oxígeno, síndrome de daños orgánicos múltiples secundarios a septicemia, síndrome de daños orgánicos múltiples secundarios a trauma, daños por reperfusión de te idos debido a bypass cardiopulmonar, infarto de miocardio o uso con agentes de trombolisis, glomerulonefritis aguda, vasculitis, artitritis reactiva, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, ictus, daño térmico, hemodiálisis, leucaferesis , colitis ulcerante, enterocolitis necrotizante o síndrome asociado con transfusión granulocí ica .
10. 10. Uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde el estado que se ha de tratar es psoriasis, rechazo de trasplante de órgano/tejido, injerto frente a reacciones del huésped y enfermedades autoinmunes incluyendo el síndrome de Raynaud, tiroiditis autoinmune, dermatitis, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes mellitus dependiente de insulina, uveitis, enfermedad inflamatoria del intestino incluyendo enfermedad de Crohn y colitis ulcerante o lupus eritematoso sistémico.
11. 11. Uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde la condición a ser tratada es asma.
12. 12. Uso de conformidad con la reivindicación 8, en donde la condición a tratarse son los efectos tóxicos de la terapia con citoquina.
13. 13. Método para preparar un compuesto de la fórmula I de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el método comprende hacer reaccionar un compuesto de la fórmula IX en donde R4 es como se define en la reivindicación 1, con un compuesto de la fórmula X
14. 14. Método de conformidad con la reivindicación 13 , caracterizado porque el compuesto de la fórmula IX se obtiene mediante un método que comprende hacer reaccionar un compuesto de la fórmula II. en donde R4 es como se define en la reivindicación seguido de Grignard para tratamiento con S02 y clorosulfinimida para obtener un compuesto de la fórmula IX