MXPA04008302A - Procedimiento para producir l-treonina con el uso de bacterias que pertenecen al genero escherichia. - Google Patents

Abstract

Se produce L-treonina usando una bacteria productora de L-treonina que pertenece al genero Escherichia y que ha sido modificada para intensificar la actividad de aspartato aminotransferasa.

Description

PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-TREONINA CON EL USO DE BACTERIAS QUE PERTENECEN AL GENERO ESCHERICHIA CAMPO TECNICO La presente invención se refiere a biotecnología, específicamente a un método para producir L-aminoácidos mediante fermentación, y más específicamente a un gen derivado de la bacteria Escheríchia coli. El gen es útil para mejorar la productividad de L-aminoácidos, por ejemplo, L-treonina.

TECNICA ANTECEDENTE Convencionalmente, los L-aminoácidos se han producido industríalmente mediante métodos de fermentación que usan cepas de microorganismos obtenidos de fuentes naturales o mutantes de los mismos modificados especialmente para intensificar la productividad de L-aminoácidos. Para intensificar la productividad de L-aminoácidos se ha usado, por ejemplo, amplificación de genes biosintéticos mediante transformación de un microorganismo por ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,278,765). Estas técnicas se basan en aumentar la actividad de las enzimas que intervienen en la biosíntesis de aminoácidos y/o desensibilizar las enzimas objetivo para la inhibición, por retroalimentación, por el L-aminoácido resultante o sus subproductos (véase, por ejemplo, la solicitud japonesa abierta al público No. 56-18596 (1981 ), el documento WO 95/16042, o las patentes de E.U.A. Nos. 5,661 ,012 y 6,040,160). Se conocen varias cepas usadas para la producción de L-treonina mediante fermentación. Existen cepas con actividades incrementadas de las enzimas que intervienen en la biosíntesis de L-treonina (véase las patentes de E.U.A. 5,175,107; 5,661 ,012; 5,705,371 ; 5,939,307; EP 0219027), cepas resistentes a algunos compuestos químicos tales como L-treonina y sus análogos (véase los documentos WO 01 14525A1 , EP 301572A2, US 5,376,538), cepas con las enzimas objetivo desensibilizadas para la inhibición por retroalimentación por el L-aminoácido resultante o sus subproductos (véase las patentes de E.U.A. 5,175,107; 5,661 ,012), y cepas con enzimas inactivadas de degradación de treonina (véase las patentes de E.U.A. 5,939,307; 6,297,031 ). La cepa conocida productora de treonina VKPM B-3996 (véase las patentes de E.U.A. 5,175,107 y 5,705,371 ), es el mejor productor de treonina en la actualidad. Para la construcción de la cepa VKPM B-3996, se introdujeron varias mutaciones y un plásmido descrito más adelante, en la cepa progenitora de E. coli K-12 (VKPM B-7). El gen thrA mutante (mutación G 7?/4442) codifica para aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I resistente a inhibición por retroalimentación por treonina. El gen ilvA mutante (mutación / 4442) codifica para treonina desaminasa con baja actividad que lleva a baja velocidad de biosíntesis de isoleucina y a un fenotipo permeable de consunción de isoleucina. En bacterias con la mutación HvA442, la transcripción del operón thrABC no es reprimida por la isoleucina y, por lo tanto, es muy eficiente para la producción de treonina. La inactivación del gen tdh lleva a la prevención de la degradación de treonina. El determinante genético de la asimilación de sacarosa (genes scrKYABR), fue transferido a dicha cepa. Para aumentar la expresión de genes que controlan la biosíntesis de treonina, se introdujo el plásmido pVIC40 que contiene al operón de treonina muíante thrA442BC en la cepa intermediaria TDH6. La cantidad de L-treonina acumulada durante la fermentación de la cepa, alcanza hasta 85 g/l. Los presentes inventores obtuvieron, con respecto a E. coli K-12, un muíante que tiene una mutación, thrR (referido en la presente como rhtA22>), que iníerviene en la resisíencia a altas conceníraciones de íreonina u homoserina en un medio mínimo (Aslaurova, O. B. eí al., Appl. Bioch. and Microbiol., 21 , 61 1 -616 (1985)). La mulación mejoró la producción de L-treonina (véase la patente de E.U.A. No. 974817), homoserina y glutamaío (Astaurova, O. B. et al., Appl. Bioch. and Microbiol., 27, 556-561 , 1991 , EP 1013765 A) por la cepa productora de E. coli respectiva, tal como la cepa VPKM-3966. Además, los presentes ¡nveníores han revelado que el gen rhtA existe a 18 min en el cromosoma de E. coli cerca del operón glnHPQ que codifica para los componentes del sislema de íransporte de glutamina, y que el gen rhtA es idéntico al ORF1 (gen ybiF, números 764 a 1651 en el número de acceso del Banco de Genes AAA218541 , gi: 440181 ), localizado entre los genes pexB y ompX. La unidad que expresa una proteína codificada por el ORF1 , ha sido designada como gen rhtA (rht: resistencia a homoserina y treonina). Asimismo, los presentes inventores han encontrado que la mutación rhtA23 es una sustitución de A-por-G en la posición -1 con respecto al codón de inicio de ATG (véase los Resúmenes del Decimoséptimo Congreso Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, en conjunto con el Encuentro Anual de 1997 de la American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, agosto 24-29, 1997, resumen No. 457, EP 1013765 A). Bajo condiciones para el estudio de la vía de biosíntesis de treonina de la corriente principal, y optimización a un mayor grado, la mejora adicional de la cepa productora de treonina podría hacerse proveyendo a la bacteria con una cantidad incrementada de precursores distantes dé treonina, tales como aspartato. Se sabe que el aspartato es un donador de carbono para la síntesis de los aminoácidos de la familia del aspartato (treonina, metionina, lisina) y diaminopimelato, un compuesto constituyente de la pared celular bacteriana. Estas síntesis son llevadas a cabo por una vía compleja con varios puntos de ramificación y un esquema de regulación extremadamente sensible. En el punto de ramificación de aspartato, aspartato semialdehído, homoserina, existen muchas isozimas, ya que existen aminoácidos que se derivan de esta vía de biosíntesis. La aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I codificada por parte del operón thrABC, realiza primera y tercera reacciones de la biosíntesis de treonina. La treonina y la isoleucina regulan la expresión de la aspartocinasa homoserina deshidrogenase I, y la treonina inhibe ambas actividades para catalizar las reacciones mencionadas anteriormente (Escherichia coli y Salmoneifa, segunda edición, editor en jefe: F. C. Neidhardt, ASM Press, Washington D. C, 1996). Dos genes intervienen en la formación de aspartato - aspartato aminotransferasa (aspartato transaminasa) codificada por el gen aspC y aspartasa, que es un producto del gen aspA. La aspartato aminotransferasa convierte el oxaloacetato a aspartato. La aspartasa convierte el fumarato a aspartato. Se describió el efecto de la amplificación del gen aspC sobre la producción de L-lisina - un aminoácido de la familia del aspartato. Se usó la amplificación del gen aspC para la producción de L-lisina por E. coli (véase la patente de E.U.A. 6,040,160). Se usaron bacterias corineformes que albergan una aspartocinasa y secuencia de ADN mejorada que codifica para varias enzimas que incluyen aspartato aminotransferasa, para la producción de L-lisina (véase la patente de E.U.A. 6,004,773). Se observó que la aspartato aminotransferasa podría ser útil para la producción de L-treonina y L-lisina por bacterias corineformes (véase la patente de E.U.A. 4,980,285). Hasta la fecha, no existe reporte alguno del uso de bacterias que pertenecen al género Escherichia, con actividad intensificada de aspartato aminotransferasa para la producción de L-treonina.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Un objetivo de la presente invención, es intensificar la productividad de cepas productoras de L-treonina, y proveer un método para producir L-treonina usando estas cepas. Este propósito se logró al encontrar que el gen aspC que codifica para aspartato aminotransferasa clonado en un vector de bajo número de copias, puede intensificar la producción de L-treonina. De esta manera, se ha concluido la presente invención. Las presentes invenciones son las siguientes: (1 ) Una bacteria productora de L-treonina que pertenece al género Escherichia, en donde la bacteria ha sido modificada para intensificar una actividad de aspartato aminotransferasa. (2) La bacteria de acuerdo al inciso (1 ), en donde la actividad de aspartato aminotransferasa se intensifica aumentando la cantidad de expresión de un gen de aspartato aminotransferasa. (3) La bacteria de acuerdo al inciso (1 ), en donde la actividad de aspartato aminotransferasa se incrementa aumentando el número de copias del gen de aspartato aminotransferasa, o modificando una secuencia de control de la expresión del gen, de modo que se intensifica la expresión del gen. (4) La bacteria de acuerdo al inciso (3), en donde el número de copias se incrementa mediante transformación de la bacteria con un vector de bajo número de copias que contiene al gen. (5) La bactena de acuerdo a los incisos (2) a (4), en donde el gen de aspartato aminotransferasa se origina de una bacteria que pertenece al género Escherichia. (6) La bacteria de acuerdo al inciso (5), en donde el gen de aspartato aminotransferasa codifica para la proteína (A) o (B) siguiente: (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias; (B) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye deleción, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias, y la cual tiene una actividad de aspartato aminotransferasa. (7) La bacteria de acuerdo al inciso (5), en donde el gen de aspartato aminotransferasa comprende el ADN (a) o (b) siguiente: (a) un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1 a 1 196 en SEQ ID NO: 1 ; o (b) un ADN que es hibridable con una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1 -1 196 en SEQ ID NO: 1 , o una sonda que puede prepararse a partir de la secuencia de nucleótidos bajo condiciones severas, y codifica para una proteína que tiene una actividad de aspartato aminotransferasa. (8) La bacteria de acuerdo al inciso (7), en donde las condiciones severas son condiciones en las cuales se lleva a cabo lavado a 60°C, y a una concentración de sales que corresponde a 1 x de SSC y SDS a 0.1 %. (9) La bacteria de acuerdo a los incisos (1 ) a (8), en donde la bacteria ha sido modificada adicionalmente para intensificar la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de: el gen thrA mutante que codifica para aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I resistente a inhibición por retroalimentación por treonina; el gen thrB, que codifica para homoserina cinasa; el gen thrC, que codifica para treonina sintasa; el gen rhtA, que codifica para proteína de transmembrana putativa. (10) La bacteria de acuerdo al inciso (9), en donde la bacteria ha sido modificada para incrementar la cantidad de expresión del gen thrA, el gen thrB, el gen thrC y el gen rhtA mutantes. (1 1 ) Un método para producir L-treonina, que comprende cultivar la bacteria de acuerdo a los incisos (1 ) a (10) en un medio de cultivo para producir y acumular L-treonina en el medio de cultivo, y colectar la L-treonina del medio de cultivo. La presente invención se explicará en detalle a continuación: La bacteria de la presente invención es una bacteria productora de L-treonina que pertenece al género Escherichia, en donde la bacteria ha sido modificada para intensificar una actividad de aspartato aminotransferasa. La bacteria que pertenece al género Escherichia que puede usarse en la presente invención, no es particularmente limitada; sin embargo, por ejemplo, se contemplan las bacterias descritas por Neidhardt, F. C. et al. (Escheríchia coli y Salmonella typhimurium, American Society for Microbiology, Washington D. C, 1208, cuadro 1 ). En la presente invención, "bacteria productora de L-treonina" significa una bacteria que tiene una capacidad para acumular L-treonina en un medio, cuando la bacteria de la presente invención se cultiva en el medio. La capacidad productora de L-treonina puede impartirse o intensificarse mediante reproducción. La frase "actividad de aspartato aminotransferasa", significa actividad para catalizar la reacción de formación de aspartato a partir de oxaloacetato y L-glutamato con liberación de a-cetoglutarato, usando 5'-fosfato de piridoxal. La frase "modificada para intensificar una actividad de aspartato aminotransferasa", significa que la actividad por célula ha llegado a ser mayor que la de una cepa no modificada, por ejemplo, una cepa de tipo silvestre. Por ejemplo, se contempla un caso en donde el número de moléculas de aspartato aminotransferasa por célula aumenta, un caso en donde la actividad específica por molécula de aspartato aminotransferasa aumenta, etc. Además, como una cepa de tipo silvestre que sirve como objeto de comparación se contempla, por ejemplo, la Escheríchia coli K-12. Como resultado de la intensificación de la actividad intracelular de aspartato aminotransferasa, se obtiene un efecto de que la cantidad de acumulación de L-treonina en un medio, aumenta. La intensificación de la actividad de aspartato aminotransferasa en una célula bacteriana, puede lograrse intensificando la cantidad de expresión de un gen que codifique para aspartato aminotransferasa. Cualquiera de los genes derivados de bacterias que pertenecen al género Escherichia, y genes derivados de otras bacterias tales como bacterias corineformes, pueden usarse como el gen de aspartato aminotransferasa. Entre estos, se prefieren los genes derivados de bacterias que pertenecen al género Escherichia. Como el gen que codifica para aspartato aminotransferasa de Escherichia coli, se ha dilucidado ya aspC (números de nucleótidos 983742 a 984932 en la secuencia de acceso del Banco de Genes NC_000913.1 , gi: 16128895). Por lo tanto, puede obtenerse el gen aspC mediante PCR (reacción en cadena de polimerasa; refiérase a White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)), usando iniciadores preparados con base en la secuencia de nucleótidos del gen. Genes que codifican para aspartato aminotransferasa de otros microorganismos, pueden obtenerse en forma similar. El gen aspC originado de Escherichia coli es ejemplificado por un ADN que codifica para la proteína (A) o (B) siguiente: (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias; (B) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye deleción, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias, y la cual tiene una actividad de aspartato aminotransferasa. El número de "varios" aminoácidos difiere, dependiendo de la posición o el tipo de residuo de aminoácido en la estructura tridimensional de la proteína. Puede ser de 2 a 30, de preferencia de 2 a 15, y más preferiblemente de 2 a 5 para la proteína (A). Esto es por la siguiente razón: Algunos aminoácidos tienen alta homología con algún otro, y la diferencia en dicho aminoácido no afecta en gran medida la estructura tridimensional de la proteína y su actividad. Por lo tanto, la proteína (B) puede ser una que tenga homología no menor de 30 a 50%, de preferencia no menor de 50 a 70% con respecto a los residuos de aminoácidos completos para constituir la aspartato aminotransferasa, y que tenga la actividad de aspartato aminotransferasa. El ADN, que codifica para sustancialmente la misma proteína como la aspartato aminotransferasa descrita anteriormente puede obtenerse, por ejemplo, modificando la secuencia de nucleótidos del ADN que codifica para aspartato aminotransferasa (SEQ ID NO: 1 ), por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida a sitio, de modo que uno o más residuos de aminoácido es un sitio determinado implique deleción, sustitución, inserción o adición. El ADN modificado como se describió anteriormente, puede obtenerse mediante el tratamiento de mutación conocido convencionalmente. Dichos tratamientos incluyen tratamiento del ADN que codifica para las proteínas de la presente invención con hidroxilamina, o tratamiento de la bacteria que alberga el ADN con irradiación UV, o un reactivo tal como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina o ácido nitroso. Un ADN que codifique para sustancialmente la misma proteína como aspartato aminotransferasa, puede obtenerse expresando un ADN que tenga dicha mutación como se describió anteriormente en una célula adecuada, e investigando la actividad de un producto expresado. Un ADN que codifique para sustancialmente la misma proteína como aspartato aminotransferasa puede obtenerse también aislando un ADN que sea hibridable con una sonda que tenga una secuencia de nucleótidos que comprenda, por ejemplo, la secuencia de nucleótidos mostrada en el listado de secuencias como SEO. ID NO: 1 , bajo condiciones severas, y que codifique para una proteína que tenga la actividad de aspartato aminotransferasa, a partir de ADN que codifique para aspartato aminotransferasa que tenga una mutación, o de una célula que aloje el mismo. Las "condiciones severas" referidas en la presente, se refieren a una condición bajo la cual se forma el denominado híbrido específico y no se forma un híbrido no específico. Es difícil expresar claramente esta condición usando cualquier valor numérico. Sin embargo, por ejemplo, las condiciones severas se ejemplifican mediante una condición bajo la cual moléculas de ADN que tengan alta homología, por ejemplo, moléculas de ADN que tengan homología no menor de 50%, de preferencia no menor de 70%, más preferiblemente no menor de 90%, son hibridadas con alguna otra, pero moléculas de ADN que tengan homología menor que la anterior, no son hibridadas con alguna otra. En forma alternativa, las condiciones severas son ejemplificadas por una condición bajo la cual las moléculas de ADN son hibridadas entre sí a una concentración de sales que corresponde a una condición ordinaria de lavado en hibridación Southern, es decir, 1 x de SSC, SDS a 0.1 %, de preferencia 0.1 x de SSC, SDS a 0.1 %, a 60°C. Una secuencia parcial de la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 puede usarse también como sonda. Dicha sonda puede prepararse mediante PCR usando oligonucleótidos producidos con base en la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 como iniciadores, y un fragmento de ADN que contenga la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1 como molde. Cuando un fragmento de ADN de una longitud de aproximadamente 300 pares de bases se usa como la sonda, las condiciones de lavado para la hibridación consisten, por ejemplo, de 50°C, 2 x de SSC y SDS a 0.1 %. La sustitución, deleción, inserción o adición de nucleótidos como se describió anteriormente incluye también mutación, que ocurre en forma natural (mutante o variante), por ejemplo, con base en la diferencia individual o la diferencia en especie o género de bacteria que alberga aspartato aminotransferasa. La transformación de una bacteria con ADN que codifica para proteína, significa introducción del ADN en una célula bacteriana, por ejemplo, mediante métodos convencionales, para aumentar la expresión del gen que codifica para la proteína de la presente invención, y para intensificar la actividad de la proteína en la célula bacteriana. Los métodos para intensificar la expresión de los genes incluyen aumentar el número de copias del gen. La introducción de un gen en un vector que es capaz de funcionar en una bacteria que pertenece al género Escherichia, aumenta el número de copias del gen. Para dichos propósitos, pueden usarse de preferencia vectores de bajo número de copias. El vector de bajo número de copias es ejemplificado por pSC101 , pMW1 18, p W119, y similares. La intensificación de la expresión de los genes puede lograrse también por introducción de copias múltiples del gen en el cromosoma bacteriano, por ejemplo, mediante el método de recombinación homologa, o similares. Como el método de transformación, puede usarse cualquier método conocido que haya sido reportado hasta ahora. Por ejemplo, puede usarse un método para tratar células receptoras con cloruro de calcio para aumentar la permeabilidad del ADN, lo cual se ha reportado para Escherichia coli K-12 (Mandel, M. y Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)). Por otra parte, la intensificación de la expresión de los genes puede lograrse también poniendo el ADN de la presente invención bajo el control de un promotor potente. Por ejemplo, el promotor lac, promotor trp, promotor trc y los promotores PR, Pl del fago lambda, se conocen como promotores potentes. El uso del promotor potente puede combinarse con la multiplicación de copias del gen. En forma alternativa, un promotor puede intensificarse, por ejemplo, introduciendo una mutación en el promotor para aumentar el nivel de transcripción de un gen localizado hacia el extremo 3' del promotor. Además, se sabe que la sustitución de varios nucleótidos en el separador entre el sitio de unión al ribosoma (RBS) y el codón de inicio, y especialmente las secuencias inmediatamente hacia el extremo 5' del codón de inicio, afecta profundamente la capacidad de traducción del ARN mensajero. Por ejemplo, se encontró una escala 20 veces mayor en los niveles de expresión, dependiendo de la naturaleza de los tres nucleótidos que preceden al codón de inicio (Gold et al., Annu. Rev. Microbiol., 35, 365-403, 1981 ; Hui et al., EMBO J., 3, 623-629, 1984). En un principio, los inventores de la presente invención mostraron que la mutación rhtA23 es una sustitución de A-por-G en la posición -1 con respecto al codón de inicio de ATG (véase los Resúmenes del Decimoséptimo Congreso Internacional de Bioquímica y Biología Molecular, en conjunto con el Encuentro Anual de 1997 de la American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California, agosto 24-29, 1997, resumen No. 457). Por lo tanto, puede sugerirse que la mutación rhtA23 intensifica la expresión del gen rhtA y, como consecuencia, aumenta el nivel de resistencia a treonina, homoserina y algunas otras sustancias transportadas fuera de las células. Además, también es posible introducir sustitución de nucleótidos en la región de un promotor del gen de aspartato aminotransferasa en el cromosoma bacteriano, de modo que deba modificarse en uno más fuerte. La alteración de la secuencia de control de la expresión puede llevarse a cabo, por ejemplo, de la misma forma como la sustitución del gen usando un plásmido sensible a la temperatura, como se describe en la publicación de patente internacional WO00/18935 y la publicación de patente japonesa No. 1 -215280. El aumento del número de copias del gen de aspartato aminotransferasa puede lograrse también introduciendo copias múltiples del gen de aspartato aminotransferasa en el ADN cromosómico de la bacteria. Para introducir copias múltiples del gen de aspartato aminotransferasa en el cromosoma bacteriano, se lleva a cabo recombinación homologa usando una secuencia cuyas copias múltiples existan en el ADN cromosómico como objetivos. Como secuencias cuyas copias múltiples existen en el ADN cromosómico, puede usarse ADN repetitivo, repeticiones invertidas que existen en el extremo de un elemento transponible. Asimismo, como se describe en la patente japonesa abierta al público No. 2-109985, es posible incorporar el gen de aspartato aminotransferasa en transposones, y permitir que sea transferido para introducir copias múltiples del gen en el ADN cromosómico. Métodos para la preparación de ADN de plásmido, digestión y ligación de ADN, transformación, selección de un oligonucleótido como iniciador, y similares, pueden ser métodos ordinarios bien conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos se describen, por ejemplo, en Sambrook, J., Fritsch, E. F., y Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, segunda edición", Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989).

La bacteria de la presente invención puede obtenerse por introducción de las moléculas de ADN mencionadas anteriormente, en una bacteria que tenga inherentemente la capacidad de producir L-treonina. En forma alternativa, la bacteria de la presente invención puede obtenerse impartiendo la capacidad para producir L-treonina a la bacteria que alberga ya las moléculas de ADN. Como una cepa progenitora que se va a intensificar en la actividad de la aspartato aminotransferasa codificada por el gen aspC, pueden usarse las bacterias productoras de treonina que pertenecen al género Escheríchia, tales como la cepa de E. coli VKPM B-3996 (véase la patente de E.U.A. 5,175,107, patente de E.U.A. 5,705,371 ), la cepa de E. coli NRRL-21593 (véase la patente de E.U.A. 5,939,307), la cepa de E. coli FERM BP-3756 (véase la patente de E.U.A. 5,474,918), las cepas de E. coli FERM BP-3519 y FERM BP-3520 (véase la patente de E.U.A. 5,376,538), la cepa de E. coli MG442 (véase Gusyatiner et al., Genetika (en ruso), 14, 947-956 (1978)), las cepas de E. coli VL643 y VL2055 (véase el documento EP 1 14991 1 A), y similares. La cepa B-3996 es deficiente en el gen thrC, y asimila sacarosa, en donde el gen ilvA tiene una mutación permeable. La cepa tiene una mutación en el gen rhtA, que confiere resistencia a alta concentración de treonina u homoserina. La cepa B-3996 alberga el plásmido pVIC40 que se había obtenido insertando el operón thrA *BC que incluye el gen thrA mutante que codifica para aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I que es inhibida por retroalimentación sustancialmente desensibilizada por treonina, en el vector derivado de RSF1010. La cepa B-3996 fue depositada en abril 7 de 1987 en la Russian National Collection of Industrial Microorganisms (VKPM) (Dorozhny proezd. 1 , Moscú 1 13545, Federación Rusa), bajo el número de acceso B-3996. La bacteria de la presente invención es modificada además de preferencia para intensificar la expresión de uno o más de los siguientes genes, así como el gen aspC: El gen thrA muíante que codifica para aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I resistente a inhibición por retroalimentación por treonina; el gen thrB que codifica para homoserina cinasa; el gen thrC que codifica para treonina sintasa; otra modalidad preferida de la bacteria es modificada para intensificar el gen rhtA, que codifica para proteína de transmembrana putativa además de la intensificación del gen aspC. La modalidad más preferida de la bacteria es modificada para incrementar la cantidad de expresión del gen aspC, y el gen thrA, el gen thrB, el gen thrC y el gen rhtA mutantes. El método de la presente invención para producir L-treonina, comprende los pasos de cultivar la bacteria de la presente invención en un medio de cultivo, para permitir que la L-treonina sea producida y acumulada en el medio de cultivo, y colectar L-treonina del medio de cultivo. En la presente invención, el cultivo, la colecta y la purificación de L-aminoácidos del medio, y similares, puede llevarse a cabo en una forma similar al método de fermentación convencional, en donde se produce un aminoácido usando un microorganismo. El medio usado para el cultivo puede ser un medio sintético o un medio natural, en tanto el medio incluya una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno y minerales y, si es necesario, cantidades adecuadas de nutrientes que el microorganismo requiera para su crecimiento. La fuente de carbono puede incluir varios carbohidratos tales como glucosa y sacarosa, y varios ácidos orgánicos. Dependiendo del modo de asimilación que exhiba el microorganismo usado, puede usarse alcohol que incluya etanol y glicerol. Como la fuente de nitrógeno, se usan varias sales de amonio tales como amoníaco y sulfato de amonio, otros compuestos nitrogenados tales como aminas, una fuente de nitrógeno natural tal como peptona, hidrolizado de soya, y microorganismos fermentantes digeridos. Como minerales, se usan monofosfato de potasio, sulfato de magnesio, cloruro de sodio, sulfato ferroso, sulfato de manganeso, cloruro de calcio, y similares. Como vitaminas, se usan tiamina, extracto de levaduras, y similares. El cultivo se lleva a cabo de preferencia bajo condiciones aeróbicas tales como un cultivo con agitación, un cultivo con agitación con aereación, a una temperatura de 20 a 40°C, de preferencia de 30 a 38°C. El pH del cultivo está usualmente entre 5 y 9, de preferencia entre 6.5 y 7.2. El pH del cultivo puede ajustarse con amoníaco, carbonato de calcio, varios ácidos, varias bases y reguladores de pH. Típicamente, un cultivo de 1 a 5 días lleva a la acumulación del L-aminoácido objetivo en el medio líquido.

Después del cultivo, pueden removerse sólidos tales como células del medio líquido mediante centrifugación o filtración por membrana, y entonces puede colectarse y purificarse L-treonina mediante métodos de cristalización, concentración e intercambio iónico.

MODALIDAD PREFERIDA DE LA INVENCION La presente invención se explicará más concretamente continuación con relación a los ejemplos.

EJEMPLO 1 Clonación del gen aspC de E. co// en el vector pMW119 Se obtuvo el gen aspC de ADN cromosómico de la cepa de E. co/Z K-12 mediante PCR, usando los iniciadores mostrados en SEQ ID Nos: 3 y 4 en el listado de secuencias. El fragmento de ADN obtenido se trató con las enzimas de restricción PvuW y EcoRI , y fue ligado al plásmido estable de bajo número de copias pMW1 19 (replicón pSC101 ) tratado previamente con las enzimas de restricción HincW y EcoRI bajo el control del promotor Piac. De esta manera, se obtuvo el plásmido pMW-P|ac-aspC. Asimismo, se puso el gen aspC bajo el control del promotor PR fuerte del fago lambda, en lugar del promotor Piac. Se formó un dúplex de ADN que contenia al promotor PR usando los oligonucleótidos 5'-fosforilados químicamente sintetizados mostrados en SEQ ID Nos: 5 y 6 en el listado de secuencias. Entonces, el dúplex de ADN fue ligado al plásmido pMW-P|ac-aspC tratado previamente con las enzimas de restricción PvuW y Hind\\ \. De esta manera, se construyó el plásmido pM-PR-aspC. Pudo lograrse un alto nivel no regulado de expresión del gen aspC, usando estos plásmidos. Los plásmidos pMW-Piac-aspC y pM-PR-aspC son compatibles con el plásmido pVIC40 (replicón RSF1010); por lo tanto, pudieron mantenerse simultáneamente dos plásmidos, pVIC40 y pMW-P|ac-aspC o pVIC40 y pM-PR-aspC en las bacterias. Cada uno de los plásmidos pMW-Piac-aspC y p -PR-aspC fue introducido en la cepa de E. coli productora de treonina resistente a estreptomicina, B-3996 (véase la patente de E.U.A. No. 5, 175,107). De esta manera, se obtuvieron las cepas B-3996 (pMW-Piac-aspC) y B-3996 (pM-PR-aspC).

EJEMPLO 2 Efecto de la amplificación del gen aspC sobre la producción de treonina Se desarrollaron las cepas de E. coli B-3996 (pMW-Piac-aspC) y B-3996 (pM-PR-aspC) durante 18-24 horas a 37°C en placas de agar de Luria que contenían estreptomicina (100 µg/ml). Entonces, una asa de las células fue transferida a 50 mi de caldo de Luria de la siguiente composición: triptona - 10 g/l, extracto de levaduras - 5 g/l, NaCI - 5 g/l. Se usaron las células (50 mi, DO540 - 2 o.u.) desarrolladas a 37°C dentro de 5 horas sobre el agitador (a 240 rpm) para la siembra de 450 mi del medio para fermentación. La fermentación intermitente se llevó a cabo en termentadores de laboratorio que tenían una capacidad de 1.0 litros bajo aereación (1/1 vvm) con agitación a una velocidad de 1200 rpm a 37°C. El valor del pH se mantuvo automáticamente a 6.6 usando solución de amoníaco a 8%. Los resultados se dan en el cuadro 1. Composición del medio de fermentación (g/l): Sacarosa 100.0 NH4CI 1 .75 MgS0 7H20 0.8 FeS047H20 0.01 MnSCv5H20 0.01 Mameno (TN) 0.15 Betaína 1 .0 L-isoleucina 0.2 Se esterilizaron por separado sacarosa y sulfato de magnesio. El pH se ajustó a 6.6.

CUADRO 1 Aplicación industrial De conformidad con la presente invención, la L-treonina puede producirse en forma eficiente.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Ajinomoto Co . , Inc. <120> PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-TREONINA CON EL USO DE BACTERIAS QUE PERTENECEN AL GENERO ESCHERICHIA <130> C042AYOP1313 <140> <141> 2003-02-25 <150> RU 2002104983 <151> 2002-02-27 <160> 6 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1191 <212> ADN <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (1) .. (1191) <400 1 atg ttt gag aac att acc gcc gct ect gcc gac ccg att ctg ggc ctg 48 Met Phe Glu Asn lie Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro lie Leu Gly Leu 1 5 10 15 gcc gat ctg ttt cgt gcc gat gaa cgt ecc ggc aaa att aac ctc ggg 96 Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys lie Asn Leu Gly 20 25 30 att ggt gtc tat aaa gat gag acg ggc aaa acc ccg gta ctg acc age 144 lie Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser 35 40 45 gtg aaa aag gct gaa cag tat ctg ctc gaa aat gaa acc acc aaa aat 192 Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn 50 55 60 tac ctc ggc att gac ggc ate ect gaa ttt ggt cgc tgc act cag gaa 240 Tyr Leu Gly lie Asp Gly lie Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu 65 70 75 80 ctg ctg ttt ggt aaa ggt age gcc ctg ate aat gac aaa cgt gct cgc 288 Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu lie Asn Asp Lys Arg Ala Arg 85 90 95 acg gca cag act ccg 999 99c act ggc gca cta cgc gtg gct gcc gat 336 Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp 100 105 110 ttc ctg gca aaa aat acc age gtt aag cgt gtg tgg gtg age aac cea 384 Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro 115 120 125 age tgg ceg aac cat aag age gtc ttt aac tet gca ggt ctg gaa gtt Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val 130 135 140 cgt gaa tac gct tat tat gat gcg gaa aat cae act ctt gac ttc gat Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp 145 150 155 160 gca ctg att aac age ctg aat gaa gct cag gct ggc gac gta gtg ctg Ala Leu lie Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu 165 170 175 ttc cat ggc tgc tgc cat aac cea acc ggt ate gac ect acg ctg gaa Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly lie Asp Pro Thr Leu Glu 180 185 190 caá tgg caá acá ctg gca caá etc tec gtt gag aaa ggc tgg tta ceg Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro 195 200 205 ctg ttt gac ttc gct tac cag ggt ttt gee cgt ggt ctg gaa gaa gat Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp 210 215 220 gct gaa gga ctg cgc gct ttc gcg gct atg cat aaa gag ctg att gtt Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu lie Val 225 230 235 240 gee agt tec tac tet aaa aac ttt ggc ctg tac aac gag cgt gtt ggc Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly 245 250 255 gct tgt act ctg gtt gct gee gac agt gaa acc gtt gat cgc gca ttc Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe 260 265 270 age caá atg aaa gcg gcg att cgc gct aac tac tet aac cea cea gca Ser Gln Met Lys Ala Ala lie Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala 275 280 285 cae ggc gct tet gtt gtt gee acc ate ctg age aac gat gcg tta cgt His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr lie Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg 290 295 300 gcg att tgg gaa caá gag ctg act gat atg cgc cag cgt att cag cgt Ala lie Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg lie Gln Arg 305 310 315 320 atg cgt cag ttg ttc gtc aat acg ctg cag gaa aaa ggc gca aac cgc Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg 325 330 335 gac ttc age ttt ate ate aaa cag aac ggc atg ttc tec ttc agt ggc Asp Phe Ser Phe lie lie Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly 340 345 350 ctg acá aaa gaa caá gtg ctg cgt ctg cgc gaa gag ttt ggc gta tat Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr 355 360 365 gcg gtt gct tet ggt cgc gta aat gtg gee ggg atg acá cea gat aac Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn 370 375 380 atg gct ceg ctg tgc gaa gcg att gtg gca gtg ctg taa Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala lie Val Ala Val Leu 385 390 395 <210> 2 <211> 396 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Phe Glu Asn lie Thr Ala Ala Pro Ala Asp Pro lie Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ala Asp Leu Phe Arg Ala Asp Glu Arg Pro Gly Lys lie Asn Leu Gly 20 25 30 lie Gly Val Tyr Lys Asp Glu Thr Gly Lys Thr Pro Val Leu Thr Ser 35 40 45 Val Lys Lys Ala Glu Gln Tyr Leu Leu Glu Asn Glu Thr Thr Lys Asn 50 55 60 Tyr Leu Gly lie Asp Gly lie Pro Glu Phe Gly Arg Cys Thr Gln Glu 65 70 75 80 Leu Leu Phe Gly Lys Gly Ser Ala Leu lie Asn Asp Lys Arg Ala Arg 85 90 95 Thr Ala Gln Thr Pro Gly Gly Thr Gly Ala Leu Arg Val Ala Ala Asp 100 105 110 Phe Leu Ala Lys Asn Thr Ser Val Lys Arg Val Trp Val Ser Asn Pro 115 120 125 Ser Trp Pro Asn His Lys Ser Val Phe Asn Ser Ala Gly Leu Glu Val 130 135 140 Arg Glu Tyr Ala Tyr Tyr Asp Ala Glu Asn His Thr Leu Asp Phe Asp 145 150 155 160 Ala Leu lie Asn Ser Leu Asn Glu Ala Gln Ala Gly Asp Val Val Leu 165 170 175 Phe His Gly Cys Cys His Asn Pro Thr Gly lie Asp Pro Thr Leu Glu 180 185 190 Gln Trp Gln Thr Leu Ala Gln Leu Ser Val Glu Lys Gly Trp Leu Pro 195 200 205 Leu Phe Asp Phe Ala Tyr Gln Gly Phe Ala Arg Gly Leu Glu Glu Asp 210 215 220 Ala Glu Gly Leu Arg Ala Phe Ala Ala Met His Lys Glu Leu lie Val 225 230 235 240 Ala Ser Ser Tyr Ser Lys Asn Phe Gly Leu Tyr Asn Glu Arg Val Gly 245 250 255 Ala Cys Thr Leu Val Ala Ala Asp Ser Glu Thr Val Asp Arg Ala Phe 260 265 270 Ser Gln Met Lys Ala Ala lie Arg Ala Asn Tyr Ser Asn Pro Pro Ala 275 . 280 285 His Gly Ala Ser Val Val Ala Thr lie Leu Ser Asn Asp Ala Leu Arg 290 295 300 Ala lie Trp Glu Gln Glu Leu Thr Asp Met Arg Gln Arg lie Gln Arg 305 310 315 320 Met Arg Gln Leu Phe Val Asn Thr Leu Gln Glu Lys Gly Ala Asn Arg 325 330 335 Asp Phe Ser Phe lie lie Lys Gln Asn Gly Met Phe Ser Phe Ser Gly 340 345 350 Leu Thr Lys Glu Gln Val Leu Arg Leu Arg Glu Glu Phe Gly Val Tyr 355 360 365 Ala Val Ala Ser Gly Arg Val Asn Val Ala Gly Met Thr Pro Asp Asn 370 375 380 Met Ala Pro Leu Cys Glu Ala lie Val Ala Val Leu 385 390 395 <210> 3 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de Secuencia artificial: iniciador < 00> 3 gctacttacg aattccgttt gtcatcagtc tcagcc <210> 4 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Descripción de Secuencia artificial: iniciador <400> 4 cctagatcac agctgatgtt tgagaacatt accgcc <210> 5 <211> 36 <212> ADN <213> Secuencia artificial <400> 5 ttgactattt tacctctggc ggtgataatg gtccca <210> 6 <211> 40 <212> ADN <213> Secuencia artificial <400> 6 agcttgggac cattatcacc gccagaggta aaatagtcaa

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1 .- Una bacteria productora de L-treonina que pertenece al género Escherichia, en donde la bacteria ha sido modificada para intensificar una actividad de aspartato aminotransferasa.

2. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha actividad de aspartato aminotransferasa se intensifica aumentando la cantidad de expresión de un gen de aspartato aminotransferasa.

3. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha actividad de aspartato aminotransferasa se incrementa aumentando el número de copias del gen de aspartato aminotransferasa, o modificando una secuencia de control de la expresión del gen, de modo que dicha expresión de dicho gen se intensifica.

4. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque el número de copias se incrementa por transformación de dicha bacteria con un vector de bajo número de copias que contiene a dicho gen.

5. - La bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada además porque dicho gen de aspartato aminotransferasa se origina de una bacteria que pertenece al género Escherichia.

6. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el gen de aspartato aminotransferasa codifica para la proteína (A) o (B) siguiente: (A) una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias; (B) una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que incluye deleción, sustitución, inserción o adición de uno o varios aminoácidos en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 en el listado de secuencias, y la cual tiene una actividad de aspartato aminotransferasa.

7. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque el gen de aspartato aminotransferasa comprende el ADN (a) o (b) siguiente: (a) un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos de los. nucleótidos 1 a 1 196 en SEQ ID NO: 1 ; o (b) un ADN que es hibridable con una secuencia de nucleótidos de los nucleótidos 1-1196 en SEQ ID NO: 1 , o una sonda que puede prepararse a partir de dicha secuencia de nucleótidos bajo condiciones severas, y codifica para una proteína que tiene una actividad de aspartato aminotransferasa.

8. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque dichas condiciones severas son condiciones en las cuales se lleva a cabo lavado a 60°C, y a una concentración de sales que corresponde a 1 x de SSC y SDS a 0.1 %.

9. - La bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizada además porque dicha bacteria ha sido modificada adicionalmente para intensificar la expresión de uno o más genes seleccionados del grupo que consiste de: el gen thrA muíante que codifica para aspartocinasa homoserina deshidrogenasa I resistente a inhibición por retroalimentación por treonina; el gen thrB, que codifica para homoserina cinasa; el gen thrC, que codifica para treonina sintasa; y el gen rhtA, que codifica para proteína de transmembrana putativa.

10. - La bacteria de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque dicha bacteria ha sido modificada para incrementar la cantidad de expresión del gen thrA, el gen thrB, el gen thrC y el gen rhtA mutantes. 1 1. - Un método para producir L-treonina, que comprende cultivar la bacteria de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en un medio de cultivo para producir y acumular L-treonina en el medio de cultivo, y colectar la L-treonina del medio de cultivo.