MXPA04000268A

MXPA04000268A - Metodos para la modificacion genetica de celulas hemotopoyeticas progenitoras y usos de las celulas modificadas.

Info

Publication number: MXPA04000268A
Application number: MXPA04000268A
Authority: MX
Inventors: Amado Rafael
Original assignee: Johnson & Johnson Res Pty Ltd
Priority date: 2001-07-10
Filing date: 2002-07-10
Publication date: 2005-03-07
Also published as: ATE490322T1; NZ530624A; AU2002316640C1; JP2010077125A; US7776595B2; US20080044394A1; JP5179697B2; US7345025B2; CN1553963A; DE60238486D1; IL159637A; KR101015913B1; AU2002316640B2; EP1414996B1; JP2005528319A; HK1065074A1; EP1414996A4; KR20040032852A; EP2322618A1; WO2003006691A1

Abstract

Se describen composiciones y metodos relacionados con terapia genetica, particularmente como aplicada a celulas hematopoyeticas progenitoras (HP), con celulas transducidas y metodos para obtenerlas, y con metodos de uso de ellas para proporcionar un injerto prolongado de celulas hematopoyeticas modificadas en sujetos humanos. La invencion se relaciona particularmente con la terapia genetica ex vivo de celulas HP para el tratamiento o prevencion de la infeccion por VIH.

Description

METODOS PARA LA MODIFICACION GENETICA DE CELULAS HEMOTOPOYETICAS PROGENITORAS Y USOS DE LAS CELULAS MODIFICADAS - CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con la terapia genética, particularmente como la aplicada a células hematopoyéticas progenitoras (HP) , células transducidas y métodos para pbtenerlas, y con métodos de uso.

. ANTECEDENTES DE LA INVENCION La terapia genética se ' refiere al uso de secuencias genéticas y. su introducción en células para alterar la constitución genética de las células y por lo tanto cambiar las propiedades o funcionamiento de aquellas, células. La terapia genética puede ser usada, por ejemplo, para corregir un defecto genético proporcionando a las células una buena copia de un gen que funcione como se desee, o para proporcionar un gen que cpdifique para un ARN o proteína que inhiba una actividad celular o patogénica' indeseable. La terapia genética puede ser dirigida a cualquiera de una variedad de enfermedades en las cuales exista un aspecto genético. De interés particular son enfermedades de los sistemas sanguíneo o inmune, puesto que las células hematopoyéticas son relativamente fáciles de recolectar en un sujeto, permitiendo que sean usados procedimientos ex vivo. Esas incluyen hemaglobinopatías , defectos de la producción o función de los leucocitos, deficiencias inmunes, enfermedades de almacenamiento lisosomal y defectos de células no diferenciadas como la anemia de Fanconi, enfermedad granulomatosa crónica, enfermedad de Gaucher, eficiencia de G6PD, etc. Muchos de esos trastornos han sido tratados exitosamente por transplantes de células de médula ósea alogénicos (Parkman 1986) . Sin embrago, el requerimiento de supresión inmune u ocurrencia de efectos inmunológicos como el rechazo de injertos es una desventaja del transplante de médula ósea alogénico. La terapia genética de células hematopoyéticas no diferenciadas ha sido sugerida como medios alternativos para tratar enfermedades que afecten al sistema hematopoyético en humanos . A pesar del primer éxito promisorio en la terapia genética en humanos, el éxito clínico ha sido muy difícil de lograr a pesar del esfuerzo masivo en la última década (Mountain, 2000) . Esto se debe al menos en parte a las bajas eficiencias de transferencia de genes, una incapacidad por modificar suficientes células, una incapacidad por dirigir los tipos de células apropiados, y una falta de persistencia del efecto deseado en sujetos humanos .

La terapia genética de las células hematopoyéticas no diferenciadas humanas (HS) ha probado ser difícil de llevar a cabo en la práctica (Kohn et al 1998, Halene y Kohn 2000, Kume et al 1999) . En la mayoría de los ensayos en humanos, el nivel de leucocitos en sangre periférica que contienen el gen ha sido bajo y esos han vivido un corto tiempo, sugiriendo una falla en la transducción de células HS reconstituyentes (Bordignon et al 1995, Kohn 1995, Kohn et al 1998, Dunbar et al 1995, Hoogerbrugge et al 1996) . Esto se relaciona en parte con las relativamente pocas HS y células hematopoyéticas progenitoras (HP) en el cuerpo (Bertolíni et al 1998, Reis 1999) y el requerimiento de que las células sean activadas cuando se usen algunos de vectores retrovirales murinos para la transducción. Esto se relaciona con el bajo nivel de receptores anfotropicos en células HS humanas en reposo (Bodine et al 1998) . La mayoría de las células HS humanas están en reposo, responden de manera relativamente lenta a estímulos (Hao et al 1996, Gothot et al 1998) y cuando son inducidas a dividirse, tienen de perder la capacidad de repoblación a largo plazo (Traycoff et al 1998) . Casi todos los intentos de terapia genética en humanos usando células HS hasta ahora han sufrido de esos dos problemas básicos: números insuficientes de células HS que sean totipotentes y capaces de haber sido transducidas en un injerto a largo plazo para tener un efecto terapéutico, y en segundo lugar, las células transducidas no han persistido a proporcionar células hematopoyéticas modificadas a largo plazo. El ensayo más promisorio de terapia genética en células HP humanas implicó la transferencia de un gen en un niño con inmunodeficiencia combinada severa ligada al cromosoma X (SCID) el cual condujo la reconstitución de un sistema inmune con linfocitos T que contenían el gen (Cavazzana-Calvo et al 2000; Hacein-Bey-Abína et al 2002) . Ese ensayo usó células CD34+ de médula ósea de pacientes pediátricos (< 12 meses) y proporcionó más de 106 células transducidas por kg. El numero de células CD34+ (por kg de peso) que puede ser aislado de niños, particularmente de bajo peso, es mucho mayor que en los adultos. La timopoyésis es también más activa en niños. Además, este estudio es inusual dado que la quimopoyesis en el contexto SCID-X1 resulta únicamente de células CD34+ que contienen el gen exógeno (Cavazzana-Calvo et al 2001) . De alguna manera, este estudio es análogo a aquellos donde es llevada a cabo la mieloablasión dado que las células infundidas pueden llenar el espacio fisiológico que no es ocupado en el paciente SCID. Los primeros estudios con transplante de médula ósea alogénicos mostraron que el injerto de células HS no se sostuvo en pacientes que no fueron sometidos a mieloablasión, principalmente debido a la presencia continua de las células HS en el receptor (Parkman 1986) . Por lo tanto, las conclusiones sacadas de los estudios de injerto anteriores usando- células HS humanas en el contacto ablativo no pueden ser transferidas simplemente a los sistemas no ablativos. Otros reportes de ensayos clínicos en humanos para la terapia genética de células hematopoyéticas progenitoras son menos positivos. Kohn et al 1999 reportó resultados de un ensayo clínico usando células CD34+ derivadas de medula ósea .de pacientes pediátricos (8-17 años) transducidas con un gen que codifica para una RRE decoy (molécula de ARN) contra el VIH. Este ensayo no logró una transducción significativa y el injerto de células progenitoras. En otro ensayo, fueron tratados pacientes con cáncer de mama u ovario con células HP después de la transducción con un gen marcador, después de la mieloablasión, pero únicamente se observó la presencia transitoria de células marcadas (Bagnis et al 2002) . Un ensayo clínico que incluyó 3 pacientes con la enfermedad de Gaucher mostró la presencia del vector que contenía al gen en sangre periférica y médula ósea hasta 3 meses después de la infusión pero a niveles muy bajos (Dunbar et al 1998) . En otro ejemplo, se llevó a cabo un ensayo con cinco pacientes que padecían de Enfermedad Granulomatosa Crónica (CGD) donde fue introducido el gen p47phox en células CD34+ de sangre periférica. Aunque se encontraron neutrófilos corregidos en la sangre periférica durante los primeros pocos meses después de la infusión, ellos no fueron detectables a los seis meses después de la infusión (Maleen et al 1997) . Además, un ensayo para corregir la anemia de Fanconi donde se insertó el gen C del grupo de complementación en células CD34+ dio como resultado solo una detección transitoria del gen en pacientes después de la infusión (Liu et al 1999) . .. . Los pobres resultados en esos ensayos pueden reflejar la ausencia de una ventaja de sobrevivencia de las células corregidas en comparación con las células no corregidas, en contraste con el caso de SCID ligada al cromosoma X. Además, la mayoría de esos ejemplos, las poblaciones de células manipuladas fueron administradas a pacientes con o sin mieloablasión parcial, requiriendo que las células transducidas compitieran con las células no diferenciadas residentes a injertar. También pueden operar otros factores. Las células HS pueden ser reducidas en número en pacientes con infección por VIH (Maradin et al 1996) , haciendo más difícil obtener un número suficientes de esas células. Además, las células HS de individuos infectados por VIH están comprometidas en su reproducción y capacidades clonogénicas y muestran una mayor propensidad a la apoptosis (Vignoli et al 1998; Zauli et al 1996) . La movilización de células HP de sangre periférica usando el factor estimulante de la colonia de los granulositos (G-CSF) fue demostrada en individuos infectados por VIH (Law et al 1999) . La movilización máxima fue lograda después de 4 días de administración de G-CSF. El producto de la leucaferesis contuvo aproximadamente 3 x 106 células CD34+ por kg. Law et al no transdujeron las células CD34+ aisladas ni demostraron que las células CD34+ aisladas pudieran ser injertadas en un sujeto a largo plazo. Ellos simplemente especulan que la terapia genética de las células HP pueden proporcionar una cura para la infección por VIH. Ellos también comentan que la discusión del número de células no diferenciadas requeridas para la terapia genética del SIDA es prematuro debido a la existencia de mucha incertidumbre , incluyendo el potencial de injerto de las células modificadas genéticamente, la necesidad de quimioterapia, la necesidad de mieloablasión o no, el requerimiento para establecer un nicho para las células infundidas, y la respuesta desconocidas del microambiente en la médula de pacientes con SIDA después de la infusión de las células. El número mínimo de células CD34+ de sangre periférica requerido para la restauración eficiente del sistema hematopoyético, particularmente la recuperación de las plaquetas, en el contexto de la mieloablasión ha sugerido ser 2.0 x 106 células por kg de peso de un sujeto (Zimmerman 1995) . Sin embargo, el número requerido para el injerto eficiente cuando no se efectúa mieloablasión era desconocido hasta antes de esta invención. Se desconocía si se había estableció un "nicho" para las células infundidas, o el efecto de la competencia, de células residentes en la médula. Como se mencionó anteriormente, esto fue particularmente cierto en el contexto de la infección por VIH. Muchos estudios han usado sistemas en animales modelo, particularmente en ratones, para mejorar los métodos de transduccion e incrementar el injerto. Sin embargo, aunque las células HS murinas pueden ser transducidas eficientemente con vectores retrovirales , los esfuerzos por traducir los hallazgos del sistema murino a aplicaciones para células HS humanas han revelado mayores dificultades (Halene y ohn 2000; Richter y Karlson 2001) . Una dificultad más para la aplicación terapéutica de la terapia genética es los procedimientos de escalamiento para obtener números suficientes de células transducidas (Schilz et al, 2000) . Schilz et al midieron la eficiencia de la transduccion y un injerto en un modelo de ratón, pero no está claro como pueden aplicarse las conclusiones a sujetos humanos.

Cada uno de esos factores es resuelto o tratado por la presente invención. SUMARIO DE LA INVENCION Esta invención proporciona una composición adecuada para administrarse a un sujeto humano, que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos 1.63 X 10s células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal del sujeto humano a quien va ser administrada, al menos 0.52 X 106 de esas células hematopoyéticas CD34+ más siendo transducidas por un constructo viral el cual expresa un agente anti VIH. Esta invención también proporciona el método para insertar en células hematopoyéticas de un sujeto humano un gen de interés, que comprende: a) movilizar células hematopoyéticas progenitoras CD34+ en la sangre del sujeto humano; b) aislar los leucocitos del sujeto por aféresis ,· c) aislar las células hematopoyéticas CD34+ de los leucocitos aislados por un método inmunoselectivo; d) someter las células hematopoyéticas CD34+ del paso c) a un proceso de transducción con un gen de interés en presencia de un agente que colocalice las células con un vector de transducción; e) determinar el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso d) , y si el número total es de al menos 1.63 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces proceder al paso f) , y si el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso d) es menor de 1.63 x 10s por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces efectuar al menos los pasos b) -d) y combinar las células hematopoyéticas CD34+; y f) proporcionar al sujeto las células hematopoyéticas CD34+, insertando por lo tanto en las células hematopoyéticas del sujeto un gen de interés. Esta invención proporciona además el uso de una composición que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos 1.63 X 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal del sujeto humano a quien va a ser administrada la composición, al menos 0.52 X 106 de esas células CD34+ por kg siendo transducidas por un constructo viral el cual expresa un agente anti VIH, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento del sujeto humano infectado con VIH. Esta invención proporciona todavía además un equipo que comprende a) una cantidad de un agente capas de movilizar células hematopoyéticas progenitoras en un sujeto humano ,- b) un medio de cultivo que incluye al menos una citocina aceptable para cultivar células hematopoyéticas CD34+; c) un vector retroviral que comprende nucleótidos que tienen una secuencia que en una célula da lugar a una ribozima que tiene la secuencia 5' - UUA GGA UCC UGA ÜGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3' (Rz2) ; y d) recipientes de cultivo tisular recubiertos sobre su interior con un fragmento de fibronectina recombinante . Un paquete que comprende el equipo e instrucciones para su uso y también proporcionado por esta invención.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Figura 1 (A) . Ciclo de reproducción de un retrovirus típico. (A) El virus se une a los receptores de la superficie celular sobre la célula objetivo y el ARN genómico entra a la célula objetivo después de la fusión y descubrimiento viral . (B) Ocurre la transcripción inversa dando como resultado la conversión el ARN viral en ADNc . (C) El ADNc entra al núcleo y es convertido a una forma circular . (D) El ADNc queda entonces integrado en el genoma de la célula hospedera. (E) Transcripción del provirus para producir ARN viral y ARNm. (F) La traducción produce proteínas virales.

(G) Se forma el núcleo viral a partir de las proteínas codificadas viralmente y el ARN viral empaquetado . (H) El núcleo obtiene una membrana y sale de la célula brotando a través de la membrana celular.

Figura 1 (B) . Modo de acción propuesto por la invención. La ribozima puede actuar como cualquiera de varios puntos en el ciclo de vida del virus VIH-1. Esta puede escindir el ARN genómico después del descubrimiento y antes de la transcripción inversa, o puede escindir transcriptor virales en el núcleo o citoplasma para inhibir la traducción de proteínas virales, o puede escindir al ARN genómico recién formado antes de o durante el montaje.

Figura 2. Racionalización científica para el uso de la transferencia del gen de ribozima para tratar VIH/SIDA. A. Las células hematopoyéticas progenitoras CD34+ normales dan lugar a linfocitos y monocitos/macrófagos que pueden ser infectados por VIH-1 y esas células infectadas generan partículas de VIH-l antes de secarse. B. Las células hematopoyéticas progenitoras CD34+ transducidas con el gen de ribozima dan lugar a linfocitos y monocitos/macrófagos que expresan el gen de ribozima. La ribozima terapéutica escinde al ARN del VIH-1 e inhibe la reproducción del VIH-1 en esos dos tipos de células clave.

Figura 3. Esquema de la hematopoyesis. Las células hematopoyéticas progenitoras CD34+ dan lugar a células de mayor madurez a través de células progenitoras intermedias. Las células claves en términos de la infección por VIH/SIDA son linfocitos T CD4+ y los monocitos/macrófagos (con asterisco) . Todas las células mostradas esquemáticamente son células hematopoyéticas.

Figura 4. Localización del sitio del objetivo de Rz2. A. El esquema del genoma de VIH-1 muestra la localización de los genes reproductores, reguladores y accesorios. B: Secuencia de ribozima junto con el objetivo complementario y la secuencia hibridante dentro del gen tat. La escisión ocurre inmediatamente 3' del triplete GUA. C: Localización de la secuencia del objetivo de GUA en los genes que codifican para las proteínas Tat y Vpr .

Figura 5. Representación esquemática del Ensayo Clínico en Fase I de CD34+. Fueron enrollados diez sujetos con infección VIH-1. Se introdujeron por separado los vectores L L6 y RRz2 en células hematopoyéticas CD34+ autólogas . Ambas poblaciones de células fueron infundidas a los pacientes sin tratamiento por mieloablasió .

Figura 6. Efecto de la retronectina sobre la transducción . Esta muestra esquemáticamente como la retronectina facilita la transducción retroviral llevando las células CD34+ muy cerca del vector retroviral.

Figura 7. Presencia y expresión del vector a largo plazo- Se efectuó un análisis por PCR semicuantitativo en subconjuntos de leucocitos usando cebadores dirigidos contra el gen neoR que se superpone a la secuencia de Rz2 en el vector RRz2. Los productos de la PCR para el LNL6 y el RRz2 son 174 y 216 pares de bases respectivamente, e incluyen un tracto del término no traducido del gen neoR. La gráfica A muestra que las secuencias de los vectores L L6 y RRz2 en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , células mononucleares de médula ósea (B MC) , linfocitos T y monocitos en 5 pacientes de dos años después de la infusión de células CD34+ transducidas . La Gráfica B muestra la expresión a corto y largo plazo de LNL6 y RRz2 en PBMC en 3 pacientes representativos, de acuerdo a lo medido por RT-PCR. La expresión fue evaluada en una reacción en cadena de la polimerasa anidada con transcriptasa inversa (RT+) un cebador marcado radioactivamente. Por cada muestra, se incluyó una reacción que no contenía transcriptasa inversa (-RT) . Gráfica C. Detección de las secuencias de vector en linfocitos T Cándidos. El gel muestra el que análisis por PCR para las secuencias de los vectores LNL6 y RRz2 en linfocitos T de CD4+ y CD8+, y en subconjuntos de linfocitos T Cándidos seleccionados de sangre periférica en 2 años del paciente 7 después de la infusión de células CD34+ transducidas . D, E y F muestran la detección de secuencias de vector en linfocitos T Cándidos. El gel muestra los resultados de la PCR para las secuencias de los vectores LNL6 y RRz2 en linfocitos T CD4+ y CD8+, y en subconjuntos de linfocitos T Cándidos seleccionados de sangre periférica en 3 pacientes. Las secuencias de los vectores fueron detectadas en subconj ntos de células T candidas tan rápido como a las cuatro semanas de la infusión (panel F) , y la detección a largo plazo es mostrada en los paneles E y D, a los 2.5 y 2 años después de la infusión de células CD34+ transducidas, respectivamente.

Figura 8. Resumen de la detección del vector por PCR en 10 pacientes. Las células fueron examinadas por PCR para la detección del vector LNL6 o RRz2 hasta 36 meses después de la infusión. Los tipos de células fueron células mononucleares de médula ósea, células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , granulositos , linfocitos T y monocitos de acuerdo a lo indicado. Los datos son mostrados para cada paciente marcados en el eje Y. se observó marcación del gen a largo plazo después del uso del fragmento de fibronectina (CH-296) , lo cual dio como resultado un incremento en la eficiencia de la transducción (véase la tabla 1) . La presencia o ausencia de detección de vectores es indicada por círculos, sin importar el número de copias del vector: negro, ambos vectores detectados; abiertos, ningún vector detectado ,-círculos con bandas verticales, únicamente detectado del vector de ribozima; círculo con bandas horizontales, únicamente detectado el vector de control LKTL6.

Figura 9. Comparación entre la cinética de decaimiento del vector en linfocitos T y células mononucleares de médula ósea. La comparación de la velocidad de decaimiento de las copias de vector a través de los linfocitos T y células mononucleares de médula ósea (BMMC) muestra mayor persistencia de la marcación del RRz2 en linfocitos T en comparación con el LNL6 (A) . La marcación del LNL6 es mostrada en (B) . Las gráficas muestran que el nivel de marcación del vector representado como por ciento de línea basal, donde la línea basal es definida como el promedio del número de copias del vector a las semanas 4 y 12 para cada tipo de células (diamante y línea roja: linfocitos T, cuadrados abiertos y línea negra: BM C) . (C) y (D) muestran las gráficas que describen la relación lineal entre la dosis de célula CD34+ transducidas z2, y la diferencia entre el número de copias entre LNL6 y RRz2 (índice de protección) en linfocitos T (C) y PBMC (D) . (E) , (F) , (G) y (H) muestran la comparación entre la cinética de decaimiento del vector en linfocitos T y células mononucleares de médula ósea, y la correlación con la dosis de células CD34÷ transducidas infundida. La protección inducida por la ribozima contra la disminución de células relacionadas con el VIH fue evaluada comparando el decaimiento del ADN de los vectores RRz2 y LNL6 en células vulnerables y no vulnerables a la infección por VIH. El panel E muestra la detección de los vectores RRz2 y LNL6 por PCR en linfocitos T CD4+ para el paciente 7 a los puntos en el tiempo indicados. Los volúmenes de radioactividad para cada banda fueron normalizados a estándares conocidos ensayados en la misma reacción de PCR (no mostrada) , y la relación de RRz2 a LNL6 (valores mostrados bajo cada gel) fueron graficados contra el tiempo (panel F) . Como un control negativo para la protección de RRz2, la gráfica de BMMC (la cual contiene la mayoría de las células invulnerables a la infección por VIH) se muestra en el panel F (geles de PCR no mostrados) . Las tendencias con el tiempo en la relación de marcación de RRz2 a la marcación de LNL6 fueron estimadas por relación lineal, con los valores de P reflejando la diferencia de una velocidad de cambio de 0 (esperado si la marcación de RRz2 y LNL6 decae a velocidades equivalentes) . En este paciente, la relación de marcación de RRz2 a LNL6 en BMMC permaneció aproximadamen e constante con el tiempo (pendiente= diferencia de -0.0005 de 0, P=.281). En contraste, la marcación de RRz2 se incrementó en relación a la marcación de LNL6 con el tiempo en linfocitos T vulnerables al VIH (pendiente=0.0036 , diferencia de 0, P = .008) . La diferencia entre las líneas de tendencia fue estadísticamente significativa (P < .006). Para determinar si la magnitud del decaimiento diferencial en la marcación del gen de LNL6 contra RRz2 para un paciente dado estaba relacionada con el número de células transducidas RRz2 infundidas, se correlacionó la diferencia entre las pendientes de decaimiento de cada vector (rango de spearman) con el número de células CD34+ transducidas por RRz2 reintroducidas . Las pendientes de decaimiento específicas del paciente para la marcación de LNL6 y RRz2 fueron calculadas por regresión lineal, y la diferencia entre esas pendientes (RRZ2 - LNL6) fue tomada como un indicador de la protección mediada por RRz2. Los paneles G y H muestran las gráficas que describen esta relación lineal y los intervalos de confianza (líneas punteadas) entre la dosis de células CD34+ transducidas por RRz2, y la diferencia entre el número de copias de LNL6 y RRz2 (índice de protección) en los linfocitos T (gráfica H) y PBMC (gráfica G) .

Figura 10. Conteos absolutos de células CD4+ (A) y cargas virales (B) en pacientes de estudio. Los conteos absolutos de célula CD4+ por mm3 (A) y cargas virales (B) en copias de ARN de VIH por mi de sangre se muestran para los pacientes Nos. 1-10 a través del estudio. Se observó un incremento inicial en la carga viral al día 1 después de la infusión en algunos pacientes, quienes descontinuaron la terapia antirretroviral durante el periodo de movilización. La descontinuación del fármaco o sustitución de inhibidores de transcriptasa inversa nucleosídica por inhibidor de transcriptasa inversa no nucleosídica o inhibidor de proteasa incluido en el protocolo para evitar la inhibición potencial de la transcriptasa inversa de MMLV durante la transducció . Los aumentos ocasionales de viremia fueron corregidos después de la modificación de la terapia antirretroviral.

Figura 11. Marcación a largo plazo de población en células hematopoyéticas en el Paciente #005 a partir del estudio de CD34+ Autólogas en Fase I. En gel se muestran bandas amplificadas de PCR de células marcadas con LNL6 y RRz2 en poblaciones de médula ósea y sangre periférica 2 años después de la infusión.

Figura 12. Expresión del Gen en Células Mononucleares de Sangre Periférica en 4 pacientes del estudio de células CD34+ autólogas en Fase I. La expresión de ambos del LNL6 y el RRz2 es mostrada para 2 pacientes a los 2 años después de la infusión. La expresión fue evaluada en una reacción de PCR anidada con transcriptasa inversa usando cebador marcado radioactivamente. Por cada muestra, se incluyó una reacción que no contenía RT (-RT) . Es indicada la presencia o ausencia de RT.

Figura 13. Marcación a largo plazo de subpoblaciones de linfocitos T (CD4+, CD8+) en el paciente #007. Los resultados muestran la marcación en linfocitos CD4+ y CD8+ cándidos y con memoria 1 año después de la infusión de células CD34+ transducidas con LNL6 o RRz2 autólogas .

Figura 14. Diseño esquemático de un ARNi con la capacidad de blancos múltiples. El transcripto de ARN contiene tres unidades de ARNi cada una de las cuales contiene un segmento sentido (1A, 2A, 3A) y antisentido (IB, 2B, 3B) separados por separadores (SP) . Las unidades de ARNi están flanqueadas por ribozimas de cabeza de martillo y horquilla de escisión, los cuales escinden en las posiciones indicadas por las flechas.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Esta invención proporciona una composición que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y al menos 1.63 x 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal del sujeto humano a quien va a ser administrada la composición, al menos 0.52 x 106 de esas células hematopoyéticas CD34+ siendo transducidas con un constructo antiviral el cual expresa un agente anti-VIH. De manera alternativa, la composición comprende al menos aproximadamente 1.7 x 105 células hematopoyéticas CD34+ por kg, al menos aproximadamente 0.5 x 106 de esas células por kg siendo transducidas con el constructo viral . La composición es adecuada para administrarse a un su eto humano. El sujeto humano puede ser un adulto. El constructo viral puede ser un constructo retroviral . La composición también puede estar secuencialmente libre de citocinas, o sustancialmente libre de virus . Esta invención también proporciona una composición donde al menos 5 x 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal de un sujeto humano al cual va a ser administrada la composición son transducidas ,- o que comprende al menos 9.37 x 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal de un sujeto humano, donde al menos 5 x 106 de esas células hematopoyéticas CD34+ están transducidas; o que comprende al menos aproximadamente 10 x 106 células hematopoyéticas CD34÷ por kg de peso corporal donde al menos 5 x 105 de esas células están tranduscidas; o donde el agente anti-VIH es una molécula de ARN; o donde el agente anti-VIH es una molécula de. AR i ; o donde el agente anti-VIH es una molécula antisentido; o donde el agente anti-VIHG es una ribozima. La ribozima puede comprender nucleótidos que tengan la secuencia 5'- UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC -3' (Rz2) . En la composición, las células CD34* transducidas son capaces de injertarse y dar lugar a una progenie de células durante al menos 12 meses, de un sujeto. Las células pueden estar en un cultivo celular primario . También se describe una composición que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos 1.63 x 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal del sujeto a quien va a ser administrada la composición, al menos 0.52 x 10s de esas células hematopoyéticas CD34+ siendo transducidas con un constructo viral el cual expresa un agente an i-VIH, donde la composición es producida por un proceso que comprende los pasos de: (a) aislar las células hematopoyéticas CD34+ del sujeto; (b) cultivar las células hematopoyéticas CD34+ con al menos una citocina; (c) transducir las células hematopoyéticas CD34+ con el constructo viral que expresa el agente anti- VIH en presencia de un agente el cual mejora la colocalización de las células y el constructo viral; (d) lavar las células hematopoyéticas CD34+, y (e) mezclar las células hematopoyéticas CD34+ con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, para tener por lo tanto la composición. La composición es adecuada para administrarse a un sujeto humano. En la composición, el cultivo de paso (b) puede ser efectuado en presencia de al menos una citocina, al menos dos citocinas o únicamente dos citocinas. El paso (c) puede ser efectuado en presencia de un fragmento de fibronectina recombinante . Esta invención también proporciona una composición que comprende un portador- o excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos 1.63 x 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal del sujeto humano a quien va a ser administrada la composición, al menos 0.52 x 106 células hematopoyéticas CD34+ de esas células hematopoyéticas CD34+ siendo transformadas con un gen de interés no encontrado en las células CD34+ antes de la transformación. La composición es adecuada para administrarse a un sujeto humano. En esta composición, los números de células pueden ser como se definieron anteriormente. El sujeto puede ser un adulto. En esta composición, el gen de interés puede expresar un agente de AR . Esta invención también se proporciona aún con una composición que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos 1.63 x 106 células hematopoyéticas CD34+ por- kg de peso corporal del sujeto humano a quien va a ser administrada la composición, al menos 0.52 x 105 CD34+ de esas células hematopoyé icas CD34+ siendo transformadas con un gen de interés no encontrado en las células CD34+ antes de la transformación, donde la composición es producida por un proceso que comprende los pasos de: (a) aislar las células hematopoyéticas CD34+ del suj eto ; (b) cultivar las células hematopoyéticas CD34+ con al menos una citocina; (c) transformar las células hematopoyéticas CD34+ con un vector que codifique para un gen de interés en presencia de un gen que mejore la colocalización de las células y el vector; (d) lavar las células hematopoyéticas CD34+, y (e) mezclar las células hematopoyéticas CD34+ con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, para obtener por lo tanto la composición. La composición es adecuada para administrarse a un sujeto humano. En esta composición, los números de células pueden ser como se definieron anteriormente. El sujeto humano puede ser un adulto. En esta composición, el gen de interés puede expresar un agente de ARN. Esta invención proporciona además un método para insertar en células hematopoyéticas de un sujeto humano un gen de interés que comprende: (a) movilizar células hematopoyéticas progenitoras CD34+ en la sangre del sujeto humano; (b) aislar los leucocitos de la sangre del sujeto por aféresis; (c) aislar las células hematopoyéticas CD34+ de los leucocitos aislados por un método inmunoselectivo ,- (d) someter las células hematopoyéticas CD34+ del paso c) a un proceso de transducción con un gen de interés en presencia de una fuente que colocaliza las células con un vector de transducción; e) determinar el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso d) , y si el número total es al menos 1.63 x 10s células por kg de peso corporal de sujeto humano, entonces proceder al paso f) , y si el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso d) es menor de 1.63 x 106 células por kg de peso corporal del suj eto . humano, entonces efectuar al menos los pasos b) -d) y combinar las células hematopoyéticas CD34+; y f) proporcionar al sujeto las células hematopoyéticas CD34+, insertando por lo tanto en las células hematopoyéticas del sujeto humano un gen de interés. El sujeto humano puede ser un adulto. En el método, el agente que colocaliza las células con un vector de transducción puede ser un fragmento de fibronectina . En el método, el paso f) puede ser efectuado sin mieloablasión . El paso a) de movilización de células hematopoyéticas progenitoras en el sujeto puede ser efectuado administrando al sujeto una cantidad de una citocina suficiente para movilizar las células hematopoyéticas progenitoras. En el paso de aislamiento de los leucocitos de la sangre del sujeto, la aféresis puede ser efectuada al menos dos veces.

En el método, el paso de someter las células hematopoyéticas CD34+ a un proceso de transducción con un gen de interés es efectuado en presencia de un fragmento de fibronectina recombinante , el cual puede ser el fragmento de fibronectina recombinante CH-296. En el método, el gen de interés puede codificar para un agente anti-VIH. El agente anti-VIH puede ser una molécula de ARN; o una molécula de ARNi; o una molécula antisentido, o una ribo2ima. La ribozima puede comprender nucleótidos que tengan la secuencia 5'- UUA GGA UCC ÜGA UGA GUC CGÜ GAG GAC GAC GAA ACU GGC UCC -3' (Rz2) . En una modalidad del método, en el paso e) , si el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso d) es menor de 1.63 x 106 por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces se incluye además un paso de almacenamiento criogénico de las células hematopoyéticas CD34+ del paso d) , repitiendo los pasos a) -d) , y combinando cualesquier células almacenadas criogénicamente con las células del paso d) . El número específico de células a ser obtenidas puede incrementarse como se describió anteriormente. En el método, todas o casi todas las células hematopoyéticas CD34+ del paso e) son proporcionadas al sujeto, por ejemplo en al menos el 90% del número total. El método puede comprender además un paso de cultivar las células hematopoyéticas CD34+ aisladas del paso c) en presencia de al menos dos citocinas o una mezcla de citocinas. La mezcla de citocinas puede comprender una o más citocinas seleccionadas del grupo que consiste de factor de células no diferenciadas (SCF) , factor del crecimiento y desarrollo de los rnegacariocitos (MGDF) , ligando Flt-3 (FL, algunas veces abreviado como Flt-3) , interleucina 3 (IL-3) , factor estimulante de la colonia de los granulositos-macrófagos (GM-CSF) y trombopoyetina (TPO) . La mezcla de citocinas puede comprender además una o más citocinas seleccionadas del grupo que consiste de interleucina 1 (IL-1) , interleucina 4, (IL-4) , interleucina 5 (IL-5) , interleucina (IL-6) , interleucina 7 (IL-7) , interleucina 9 (IL-9) , interleucina 11 (IL-11) , interleucina 12 (IL-12) , interleucina 15 (IL-15) , factor estimulante de la colonia de los granulositos (G-CSF) , factor estimulante de la colonia de los macrofagos (M-CSF) , eritropoietina (EPO) , factor inhibidor de la leucemia (LIF) , factor beta del crecimiento transformante (TGF-ß) , proteína inhibidora de los macrofagos 1 (MIP-1) , factor de la necrosis tumoral (TNF) y factor derivado de células estromales 1 (SDF-1) . En una modalidad más del método, la mezcla de citocinas comprende una citocina seleccionada de un primer grupo y una citocina seleccionada de un segundo grupo, donde el primer grupo consiste de SCF, MGDF, FL, IL-3, G -CSF, TPO, IL-1, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, G-CSF, -CSF, EPO, LIF, TGF-ß, MIP-1, TNF y SDF-1, y donde el segundo grupo consiste de MGDF, FL, G -CSF, TPO, IL-1, IL-4, IL-5, IL-7, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15, G-CSF, M-CSF, EPO, LIF, TGF-ß, MIP-1, TNF y SDF-1. Esta invención proporciona además un método para insertar en células hematopoyéticas de un sujeto humano un gen de interés, que comprende: a) movilizar células hematopoyéticas progenitoras CD34+ en la sangre del sujeto; b) aislar los leucocitos de la sangre del sujeto por aféresis; c) aislar las células hematopoyéticas CD34+ de los leucocitos aislados por un método inmunoselectivo ; d) determinar el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso c) , y si el número total es al menos de 1.63 x 106 células de kg de peso corporal del sujeto humano, entonces proceder al paso e) , y si el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso c) es menor de 1.63 x 10s células por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces efectuar los pasos b) -c) y combinar las células hematopoyéticas CD34+; e) someter las células hematopoyéticas CD34+ del paso c) a un proceso de transducción con un gen de interés en presencia de un agente que localiza las células con un vector de transducción; y f) proporcionar al sujeto las células ematopoyéticas CD34"1', insertando por lo tanto las células hematopoyéticas del sujeto humano un gen de interés. Las especificidades relevantes de este método pueden variar de acuerdo a lo discutido por los métodos anteriores. La invención proporciona además un método para insertar en células hematopoyéticas de un sujeto un gen que expresa una ribozima que comprende nucleótidos que tienen la secuencia 5'- UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC -3' (Rz2) que comprende: a) movilizar las células hematopoyéticas progenitoras CD34+ en la sangre del sujeto administrando al sujeto una cantidad de una citocina suficiente para movilizar las células hematopoyéticas progenitoras ; b) aislar los leucocitos de la sangre del sujeto por aféresis, lo cual se efectúa al menos dos veces; c) aislar las células hematopoyéticas CD34+ de los leucocitos aislados por un método inmunoselectivo ; d) cultivar las células hematopoyéticas CD34+ aisladas del paso c) durante al menos un día en un medio de cultivo en presencia de una citocina; e) someter las células hematopoyéticas CD34+ del paso d) a un proceso de transducción con un retrovirus que comprende un vector que da lugar a las células a una ribozima que comprende nucleótidos que tienen la secuencia 5'- UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC -3' (Rz2) en presencia de un fragmento de fibronectina recombinante ; f) determinar el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso e) , y si el número total es al menos 1.63 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces proceder al paso g) , y si el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso e) es menor de 1.63 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces efectuar nuevamente los pasos b) -e) y combinar las células hematopoyéticas CD34+; y g) proporcionar al sujeto, sin mieloablasión, las células hematopoyéticas CD34+, insertando por lo tanto en las células hematopoyéticas del sujeto humano un gen que exprese la ribozima. Las especificidades relevantes de este método pueden variar de acuerdo a lo discutido para los métodos anteriores. También se proporciona un método para preparar las composiciones descritas anteriormente, que comprende: a) movilizar las células hematopoyéticas CD34+ en la sangre del sujeto; b) aislar los leucocitos de la sangre del sujeto por aféresis; c) aislar las células hematopoyéticas CD34+ de los leucocitos aislados por un método inumoselectivo; d) someter las células hematopoyéticas CD34+ del paso c) a un proceso de transducción con un gen de interés en presencia de un agente que colocaliza las células con un vector de transducción; y e) determinar el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso d) , y si el numero total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso d) es menor de 1.63 x 106 células por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces se efectúan nuevamente los pasos b) -d) y combinar las células hematopoyéticas CD34+. También se proporciona el uso de una composición que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos 1.63 x 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal de un sujeto humano a quien ya se ha administrado la composición, al menos 0.52 x 10s CD34+ de esas células por kg siendo transducidas con un constructo viral el cual expresa un agente anti-VIH, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento del sujeto humano infectado por VIH. También se proporciona un equipo que comprende elementos para usarse para llevar a cabo los métodos descritos. Una modalidad específica de un equipo comprende : a) una cantidad de un agente capaz de movilizar células hematopoyeticas progenitor en un sujeto humano ; b) un medio de cultivo que incluye al menos una citocina aceptable para cultivar células hematopoyeticas CD34+; c) un vector retroviral que comprende nucleótidos que tienen una secuencia que en una célula da lugar a una ribozima que tiene la secuencia 5'- UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC -3' (Rz2) ; y d) recipientes de cultivo tisular recubiertos sobre su interior con un fragmento de fibronectina recombinante . Se proporciona además un paquete que comprende los equipos descritos e instrucciones para el uso de los equipos . En una modalidad más del método descrito, el tiempo combinado total tomado por los pasos de cultivar y transducir las células hematopoyétícas CD34+ no es mayor de aproximadamente 3 días, es decir, que el tiempo durante el cual las células están en un medio de cultivo a 37°C en presencia de citocinas agregadas (a niveles normales) no es mayor de aproximadamente 3 días. De manera alternativa, el tiempo durante el cual las células están en medios de cultivo en presencia de más de una citocina no es de más de tres días. La transducción de las células puede ser efectuada en presencia de un fragmento de fibronectina recombinante como, CH-296, o un agente equivalente. Las composiciones y métodos de esta invención pueden ser usados para tratar cualquiera de una variedad de enfermedades en las cuales exista algún aspecto genético. De interés particular son enfermedades de los sistemas sanguíneo o inmune. Esas incluyen hemoglobinopatxas , defectos de la producción o función de los leucocitos, incluyendo cáncer-es, deficiencias inmunes como el VIH, infecciones virales, enfermedades de almacenamiento lisosomal y defectos de las células no diferenciadas como la anemia de Fanconi, enfermedad granulomatosa crónica, enfermedad de Gaucher, deficiencia de G6PD, etc. Ellas también incluyen enfermedades infecciosas como el SIDA/infección por VIH o enfermedades adquiridas como cánceres o enfermedades cardiovasculares. La presente invención se relaciona con terapia genética, particularmente como la aplicada a las células hematopoyética progenitoras (HP) , células transducidas y métodos para obtenerlas, y con métodos para usarlas para proporcionar injerto prolongado de células hematopoyética modificadas en sujetos humanos. La invención se relaciona, de manera particular, con la terapia genética ex vivo de células HP para el tratamiento o prevención de la infección por VIH. La invención proporciona composiciones de células HP transducidas que comprenden números suficientes de células totipotentes capaces de proporcionar beneficio terapéutico. En una modalidad, esta invención proporciona composiciones de células HP humanas transducidas y métodos de terapia genética contra el VIH para dar lugar, en sujetos humanos, a linfocitos T protegidos. En el contexto de la infección viral, particularmente infección por VIH, es proporcionado un beneficio terapéutico significativo por la invención a través del incremento de la sobrevivencia a largo plazo de linfocitos T modificados en el sujeto humano y por lo tanto números incrementados de linfocitos T y función inmune mejorada, conduciendo a una menor reproducción viral y carga viral . En una modalidad más, las células HP humanas transducidas de la composición o sistemas pueden injertarse a largo plazo cuando son infundidas en un paciente, dando lugar a celular hematopoyéticas diferenciadas durante al menos 12 meses después de la infusión, preferiblemente al menos 24 meses y de manera aún más preferible al menos 30 meses después de la infusión. En una modalidad más, las células HP humanas transducidas pueden ser injertadas a largo plazo cuando son infundidas en un sujeto autónomo. En una modalidad más, las HP humanas transducidas pueden ser injertadas a largo plazo cuando son infundidas en un sujeto sin mieloablasión . Otra modalidad proporciona una composición o sistema que comprende células HP humanas transducidas en números suficientes de modo, que cuando son proporcionadas en un sujeto humano, proporcionan injerto a largo plazo a un nivel tal de al menos 0.01% células modificadas genéticamente de al menos un tipo de célula que puede ser detectado en la sangre o médula ósea por ejemplo por biopsia. Se prefiere que el tipo de célula sea linfocitos T o macrófagos/monocitos . Preferiblemente, el nivel de células modificadas genéticamente es de al menos el 0.1%, de manera más preferible al menos 1%, y de manera más preferible, al menos 10%. Se prefiere que las células transducidas sean proporcionadas a un sujeto autólogo. Se prefiere que las células transducidas sean proporcionadas en ausencia de mieloablasión. Se prefiere que el injerto a largo plazo ocurra durante al menos 12 meses, de manera más preferida al menos 24 meses, de manera aún m s preferida, al menos 30 meses. Se prefiere que el gen transducido sea para el tratamiento de enfermedades diferentes a SCID, por ejemplo, cánceres y enfermedades infecciosas . Se prefiere más que el gen transducido sea para el tratamiento o prevención de infección por VIH. Las células HP para la transducción fueron obtenidas preferiblemente de un sujeto. La pureza de CD34+ de las células HP humanas transducidas (% de CD34+) deberá ser de al menos el 65%, de manera preferible al menos el 90%, y de manera más preferible, al menos el 95%. El porcentaje de transducción deberá ser al menos aproximadamente 10%, de manera preferible al menos aproximadamente 30% y, de manera más preferible al menos aproximadamente 50%. En una modalidad más, las células HP humanas transducidas son derivadas de células CD34+ aisladas de la sangre de un sujeto humano después de la movilización de las células HP en la sangre periférica. La movilización puede ser lograda mediante el uso de citocinas, preferiblemente una o más del grupo que consiste de factor estimulador de la colonia de los granulositos (G-CSF) , G-CSF conjugado, G-CSF pegilado y factor estimulador de la colonia de los granulositos -macrófagos (GM-CSF) . Las citocinas pueden comprender además factor de células no diferenciadas (CSF) , interleucina 3 (IL-3), o factor 1 derivado de células estromales (SDF-1, Lataillade et al 2000) o citocinas que actúan de manera similar. La movilización puede ser ayudada por el uso de una quimioterapia de uso corto con agentes como la ciclofosfamida . De manera m s preferible, la movilización se lleva a cabo usando G-CSF o G-CSF pegilado. Las citocinas pueden ser administradas diariamente en una cantidad de al menos aproximadamente lC^g por kg de peso del sujeto y, de manera más preferible aproximadamente 30 ^i por kg. Las células CD34+ pueden ser recolectadas por aféresis los días 3, 4, 5, 6 o más tarde después de comenzar el tratamiento con citocina . Preferiblemente, la aféresis se lleva a cabo al menos dos veces. Las células CD34+ pueden ser seleccionadas por cualquier dispositivo de grado clínico conocido en la técnica como sistema de selección de células Isolex 300i o el Sistema de Concentración de Células no Diferenciadas CEPRATE SC . En una modalidad más, las células CD34+ son tratadas antes de la transducción con una mezcla de citocinas que comprenden preferiblemente MGDF y SCF, o esencialmente MGDF y SCF, para inducir la entrada al ciclo celular, preferiblemente a concentraciones de aproximadamente 100 ng/ml y 50 ng/ml, respec ivamente. Se prefiere que la inducción del ciclo celular ocurra en ausencia de citocinas agregadas, IL-3, IL-6 o SCF, o la combinación de tres de esas . Las células HP humanas transducidas contienen un gen introducido el cual puede codificar para una o más proteínas o moléculas de ARN, por ejemplo moléculas antisentido, moléculas de ARNi, decoys de ARN o ARN de ribozima (es decir, agentes de ARN) . El gen introducido puede ser cualquier gen introducido siempre que la proteína o ARN o ambos codificadora alteren las propiedades de las células HP humanas transducidas en una forma deseada en comparación con las células HP no transducidas. En una modalidad, el gen introducido, cuando se expresa, proporciona resistencia a las células HP transducidas o a la progenie diferenciada de esas células contra infecciones virales, preferiblemente resistencia contra la infección por VIH. De manera más preferible, el gen introducido codifica para ARN antisentido o de ribozima de ARN capaz de inhibir la reproducción del VIH-1 en las células. Los tipos de ribozimas que pueden ser dirigidas contra infecciones virales como la infección por VIH-1 o contra enfermedades no virales incluyen la cabeza de martillo, horquilla, ARNasa P, virus delta de la hepatitis (HDV) , ribozimas de secuencia interviniente del tipo de grupo I o el grupo II, motivos catalíticos seleccionados por métodos de selección in vi tro. Las ribozimas son preferiblemente ribozimas de cabeza de martillo u horquilla, de manera más preferible ribozimas de cabeza de martillo. Esas ribozimas son capaces de escindir moléculas de ARN asociadas con la enfermedad.

La invención incluye el uso de ribozimas múltiples, (por ejemplo Ramezani et al 2002) , por ejemplo una ribozima con dominios catalíticos múltiples, o una combinación de tipos de ribozimas . Esa deberá reducir la probabilidad de resistencia viral en el caso de tratamiento de la infección viral. También se prefiere que el sitio de escisión de la ribozima este altamente conservado en el ARN objetivo viral, como es el caso para el sitio de escisión Rz2. También es posible cualquier combinación de lo anterior, proporcionando más de un mecanismo de efecto. Las células HP humanas transducidas de la composición o sistema son transducidas por ADN o un plásmido o vector de transferencia viral. Es deseable que el gen introducido sea integrado en el genoma de la célula, después de la transcripción inversa si es apropiado. De manera preferible, las células transducidas con un vector retroviral , por ejemplo un vector retroviral murino o un vector lentiviral . De manera más preferible, el vector retroviral es derivado del LNL6 (Bender et al. 1987) u otro vector oncorretroviral . En una modalidad particular, las células son transducidas con RRz2. El gen introducido es expresado en las células HP humanas transducidas o células de la progenie de un promotor. El promotor puede ser expresado de manera constitutiva o inducible, por ejemplo siendo expresado preferiblemente bajo condiciones o circunstancias favorables. El gen puede ser transcrito por ARN polimerasa II (promotores ARN pol II) o por ARN polimerasa III. En otra modalidad de la invención, la composición es formulada para estar lista para ser proporcionada a un sujeto humano. La gran mayoría de células deberán ser viables, por ejemplo más del 95% y, de manera más preferible, más del 98%. El volumen de la composición, es de manera preferible, de aproximadamente 10 mi hasta aproximadamente 1000 mi, de manera más preferible, de aproximadamente 100 mi hasta aproximadamente 500 mi. La composición comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable el cual es preferiblemente una solución de sales amortiguada que comprende un agente proteico como una albúmina o gelatina y/o un azúcar como la glucosa, agentes los cuales pueden actuar para estabilizar las células. El excipiente o portador puede contener agentes anticoagulantes como el citrato de sodio . El excipiente o portador puede comprender un expansor de plasma, bien conocido en la técnica. En aspectos adicionales, la composición es estéril (bacterial, fungal, micoplasma) , detectablemente libre de bacterias, endotoxinas, micoplasmas, antígeno p24 del VIH o retrovirus competente de reproducción, sustancialmente libre de vector de transducción, libre, o cualquier combinación de esos. En un aspecto más, la composición está sustancialmente libre de citocinas agregadas . La composición es administrada al sujeto por medios parenterales , preferiblemente por infusión o inyección en una o más ocasiones. La invención también proporciona métodos para la terapia genética de células hematopoyética , particularmente células hematopoyética progenitoras , usando las composiciones descritas aquí. La invención también proporciona métodos de tratamiento o prevención de enfermedades genéticas o infecciosas, por ejemplo, infección por VIH. Los métodos pueden comprender el uso del fragmento CH-296 de la fibronectina humana (RetroNectinMR) o equivalente, o uno o más pasos de desmontaje para remover células indeseables, o uno o más pasos de lavado . La terapia genética puede ser llevada a cabo ex vivo o in vivo. Los métodos descritos aquí se aplican preferiblemente al método ex vivo pero también podrían ser aplicados a métodos in vivo (por ejemplo, Newbound et al., 2001) . La invención puede ser efectuada en sujetos que ya tengan la enfermedad, o profilácticamente para reducir la ocurrencia de o prevenir enfermedades . Las células HP para usarse en los métodos de la invención pueden ser obtenidas de sangre periférica, médula ósea, sangre del cordón umbilical, o de células no diferenciadas que den lugar a células hematopoyética . Ellas son obtenidas preferiblemente de sangre periférica después de la movilización. Las células HP pueden ser movilizadas en la sangre periférica administrando una o más citocinas, con o sin administración de un agente quimioterapéutico . Las citocinas pueden ser seleccionadas del grupo que consisten de G-CSF, G-CSF pegilado, G-CSF conjugado, G -CSF y cualquier combinación de las anteriores. Las citocinas pueden comprender además uno o más seleccionado del grupo que consiste de SCF, FL e IL-3. Los métodos de la invención pueden proporcionar al menos 0.01% de células hematopoyética modificadas genéticamente a largo plazo en el paciente en ausencia de mieloablasión. Los parámetros y características de cada una de las modalidades descritas anteriormente son intercambiables cuando son aplicables entre sí, y por lo tanto no se repiten. De este modo, por ejemplo, cualquier parámetro o característica de la primera modalidad puede ser empleado en otras modalidades de la invención.

Definiciones Células hematopoyéticas como se usa aquí se refiere a las células normalmente encontradas en la sangre así como las células que dan lugar a células normalmente encontradas en la sangre, como las células encontradas en la médula ósea. En este contexto, "normalmente" incluye la situación donde una persona es tratada para alterar el número o calidad de las células en la sangre o médula ósea . El vector viral se usa aquí con el significado de un vector que comprende todo o parte de un genoma viral el cual puede ser introducido en células y expresada. Esos vectores virales pueden incluir virus nativos, imitantes o recom inantes . Esos virus pueden tener un genoma de ARN o ADN. Los ejemplos de vectores virales adecuados incluyen vectores retrovirales (incluyendo vectores lentivirales) , vectores adenovirales , vectores virales adenoasociados y vectores híbridos) . Un vector retroviral es un vector viral donde el virus es de la familia retrovíridae . Un "constructo" se usa con el significado de ácido nucleico recombinante el cual puede ser una molécula de ADN o ARN recombinante, que ha sido generada para el propósito de la expresión de una secuencia nucleotídica específica, o va a ser usada en la construcción de otros ácidos nucleicos recombinantes. En general, "constructo" se usa aquí para referirse a una molécula de ADN o ARN aislada, recombinante .

Un "agente anti-VIH", como se usa aquí se refiere a cualquier agente que puede ser expresado por una célula de mamífero y que inhibe la reproducción del VIH o la entrada del VIH en la célula de mamífero. Esos agentes pueden ser ácidos nucleicos o polipéptidos . El término "capas de ser injertado" se usa aquí para referirse a la capacidad de una célula hematopoyética para implantarse en la médula ósea durante un periodo de tiempo prolongado, por ejemplo de al menos un año. La implantación puede ser detectada directamente (por ejemplo por biopsia) o por la producción de células de progenie en la sangre. Los términos "movilizar" y "movilizada" se usan aquí para referirse a células hematopoyétícas que se están moviendo de los almacenes tisulares en la médula ósea hacia la sangre periférica. El término "citocina" se usa para referirse a cualquier número de proteínas de bajo peso molecular, como hormonas, secretadas por varios tipos de células o recombinantes , que regulan la intensidad y duración del crecimiento o función celular, por ejemplo comunicación célula a célula. Las citocinas están implicadas, por ejemplo, en la mediación de la inmunidad, alergias, y la regulación de la maduración y crecimiento de las células . Un "adulto" se usa aquí para referirse a un sujeto humano completamente crecido y físicamente maduro.

La edad generalmente aceptada de un "adulto" humano es de 18 años o más . La transducción se usa para referirse a la introducción de material genético en una célula usando un vector viral . Como se usa aquí una célula transducida resulta de un proceso de transducción y contiene material genético que no contenía antes del proceso de transducción, si es integrado establemente o no. Como se usa en algunas técnicas anteriores, pero no como se usa aquí, "células transducidas" puede referirse a una población de células que ha resultado de un proceso de transducción y población la cual incluye células que contienen el material genético y células que no contienen el material genético integrado de manera estable o no. La transfeccion se refiere a la introducción de material genético en una célula sin usar un vector viral . Los ejemplos de transfeccion incluyen la inserción de ADN "desnudo" o ADN en liposomas, es decir sin un recubrimiento o envoltura viral. La mieloablasión se refiere al tratamiento, generalmente químico o radiológico, que da como resultado la destrucción de al menos una parte significativa del compartimiento mieloide (el cual incluye células progenitoras hematopoyéticas ) en un paciente. La mieloablasión no incluye tratamientos acondicionadores que puedan causar únicamente una destrucción menor o no sustancial de células de compartimiento mieloide. La frase "excipiente o portador farmacéuticamente aceptable" se usa para referirse a cualquiera de los portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables estándar. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, solución salina amortiguada como fosfato, solución salina fisiológica y agua . "Fragmento de fibronectina recombxnante" se usa para referirse a un agente que funcione para colocalizar las células con el vector durante el proceso de transducción y se basa en la actividad de la fibronectina. Por ejemplo, la RetroNectinME, TaKaRa Shuzo Co. Ltd., es un fragmento de fibronectina recombxnante que contiene tres dominios, un dominio de unión celular central que se une a la integrina VLA-5, un dominio de unión de heparina de alta afinidad que se une a los proteoglicanos , y un sitio CS-1 dentro de la región IIICS de empalme alternativamente que se une a la integrina VLA-4 (Williams 1999) . Las retronectinas equivalentes contienen tres dominios que son funcionalmente equivalentes a la RetroNectinMR, mientras que los agentes de colocalización que son similares a la RetroNectinMR contienen al menos dos dominios que son funcionalmente equivalentes .

"Secuencia de ácido nucleico" como se usa aquí se refiere a un oligonucleótido , o polinucleótido , y fragmentos o porciones de los mismos, y a ADN o ARN de origen genómico o sintético el cual puede ser de una sola o doble hebra, y representa la hebra sentido o antisentido. De manera similar, "secuencia de aminoácidos" como se usa aquí se refiere a un oligopéptido, péptido, polipéptido, o secuencia de proteína y fragmentos o porciones de la misma, y con moléculas naturales o sintéticas. El término "antisentido", como se usa aquí, se refiere a secuencias nucleotídicas las cuales son complementarias a una secuencia de ADN o ARN específica. El término "hebra antisentido" se usa en referencia a una hebra de ácido nucleico que es complementaria a la hebra "sentido" . Las moléculas antisentido pueden ser producidas por cualquier método, incluyendo la síntesis mediante la ligación de los genes de interés en una orientación invertida a un promotor, lo cual permite la síntesis de una hebra complementaria. Una vez introducida en una célula, esta hebra transcrita se combina con las secuencias naturales producidas por la célula para formar dúplex. Esos dúplex bloquean entonces la transcripción o translación adicional. De esta manera, pueden ser generados fenotipos mutantes. La designación "negativa" se usa algunas veces en referencia a la hebra antisentido , y "positiva" se usa algunas veces en referencia a la hebra sentido. A través de esta especificación, deberá comprenderse que la palabra "comprende" o variaciones como "comprenden" o "que comprende" , implica la inclusión de un elemento establecido, entero o gradual, o un grupo de elementos, enteros o graduales, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, entero o gradual, o un grupo de elementos, enteros o graduales.

Modelo que Prueba los Principios de la Invención El modelo seleccionado para probar los principios de la invención es un humano infectado con VIH. Un tratamiento o erradicación o prevención efectiva, a largo plazo y práctica de la infección por VIH en un sujeto humano ha sido una meta evasiva. De este modo, las ventajas de la invención son ejemplificadas en el contexto de un problema altamente complejo, es decir la terapia contra la infección por VIH en un sujeto humano. Sin embargo, como será evidente a partir de la siguiente descripción, pueden ser tratadas diferentes enfermedades usando las composiciones o métodos de la invención, incluyendo cualquiera de los sistemas sanguíneo o inmune. Esas incluyen hemoglobinopatías, defectos de la producción o función de los leucocitos, deficiencias inmunes, enfermedades de almacenamiento lisosomal y defectos de las células no diferenciadas como la anemia de Fanconi, enfermedad granulomatosa crónica, enfermedad de Gaucher, deficiencia de G6PD, etc. Muchos de esos trastornos han sido tratados exitosamente por transplantes de células HP alogénicos (Parkman 1986) . Sin embargo, el requerimiento de supresión inmune o la ocurrencia de efectos inmunológicos como el rechazo del injerto o enfermedad de injerto contra hospedero son una desventaja del trasplante de médula ósea alogénica. La invención proporciona ventajas donde son usadas células HP autólogas . La invención también puede ser usada para conferir resistencia a células HP o su progenie contra efectos mielosupresores . La invención también puede ser usada para tratar enfermedades infecciosas, como la e emplificada por el SIDA u otras infecciones virales como el HTLV-1 (Bunnel y Morgan 1998) , o enfermedades adquiridas como enfermedades cardiovasculares (por ejemplo, véase Orlic et al 2001) o cánceres. Con respecto a los cánceres, las técnicas de trasplante de médula ósea han sido usadas para una variedad de cánceres incluyendo aquellos principalmente del sistema hematopoyético . Existe una ventaja de proporcionar protección a las células hematopoyéticas contra agentes anti-cáncer (Carpinteiro et al, 200) , para permitir un tratamiento más efectivo (véase la revisión efectuada por Brenner 2001) . Los genes que pueden ser usados incluyen al gen de resistencia a fármacos múltiples (MDR) el cual confiere resistencia a las antraciclinas , alcaloides de Vinca, podofilinas y taxol, y genes de la dihidrofolato reductasa mutante (mDHFR) para conferir resistencia al metotrexato o trimetrexato, y genes para la O-alquilguanin-ADN-alquiltransferasa para la resistencia a agentes alquilantes. Los métodos de terapia genética de esta invención también pueden ser usados en el tratamiento de enfermedades malignas alterando la respuesta inmune a células cancerosas o simplemente marcando células para verificar la eficacia de las terapias convencionales (Cornetta et al 1996) . Para el tratamiento de enfermedades malignas donde la terapia genética de las células hematopoyéticas también es llevada a cabo, con frecuencia se efectuará una mieloablasión parcial o completa antes de proporcionar las células modificadas.

Terapia Genética para el VIH-1 El grupo del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) incluye tipos VIH-1 y VIH-2. La reproducción del VIH-1 es ahora bien comprendida. El tratamiento estándar actual usa una combinación de fármacos antirretrovirales , con frecuencia tres o más, y pueden proporcionar control de la reproducción del VIH a corto plazo, pero con frecuencia está asociada con aspectos negativos como la toxicidad del fármaco, resistencia viral, regímenes de dosificación difíciles o desagradables, y el costo del tratamiento. Usando células hematopoyéticas progenitoras como objetivo de la transducció , la terapia genética para el VIH/SIDA tiene como propósito reemplazar una fracción del conjunto celular infectado por VIH con células diseñadas para inhibir la reproducción del virus. Esta estrategia puede contribuir potencialmente a la erradicación del virus protegiendo las células CD4+ y permitiendo el establecimiento de una respuesta antiviral mediada por elementos inmunes protegidos. Para que esas estrategias tengan impacto positivo sobre le curso de la infección por VIH, es esencial que i) ocurra un grado de reconstitución inmune en el establecimiento de la infección por VIH, ii) el sistema inmune reconstituido sea protegido contra el agotamiento inducido por el VIH, permitiendo que reconozca el antígeno y protege al hospedero contra patógenos. Es deseable que esta estrategia tenga impacto sobre la carga viral. Con respecto al potencial para la reconstitución inmune en la infección por VIH, varios reportes han tratado los efectos de la terapia antirretroviral altamente activa (HAART) sobre el sistema inmune (Ho et al 1995; Zhang et al 1998). En esencia, la HAART está asociada con incrementos en los conteos de células CD4+, principalmente debido a la expansión de células de memoria durante los primeros cuatro meses de la HAART . Esto es seguido por un incremento en las células CD4+ candidas, asociado con una disminución en los marcadores de activación de CD4 y un incremento en las respuestas proliferativas a los antígenos renumerados (Autran et al 1997; Pakker et al 1998) . Aunque estudios in vi tro han demostrado que el timo no infectado de un adulto mantiene la capacidad de soportar linfopoiesis T (Jamieson et al 1999; Poulin 1999) , no se ha probado anteriormente que la terapia genética con células hematopoyéticas progenitoras pueda dar como resultado la restauración prolongada del sistema inmune con células diseñadas para inhibir la reproducción del VIH-l. Con respecto a la ausencia de terapia genética, aunque la emergencia de emigrantes tímicos recientes en la periferia ha sido descrita en pacientes que fueron previamente Cándidos a la HAAR , esta se sostuvo únicamente en tanto la viremia se mantuvo en verificación (Douek et 1998; Zhang et al 1999). No se sabe si ocurriría una respuesta similar en paciente con infección por VIH más avanzada en el contexto de la resistencia a fármacos y viremia no controlada. Además, la fuente de progenitores que da lugar a esos emigrantes tímicos recientes no ha sido determinada; no se sabe si los precursores hematopoyéticos responsables del grado de timopoyésis observada después de la HAART en adultos raigran de la médula ósea al timo como respuesta al agotamiento de las células T, o si el desarrollo linfoide T después de la HAART se deriva de progenitores linfoides T que colonizan el timo al inicio de la vida. En realidad, la capacidad de las células progenitoras de sangre periférica para experimentar desarrollo de linfocitos T en el timo adulto no ha sido determinada previamente en el escenario de la reproducción de VIH activa, puesto que la emergencia de los linfocitos T después del transplante autólogo de paciente con VIH podría ser adscrita al desarrollo de los linfocitos T que surge de precursores de linfocitos T residuales endógenos (Gabarre et al 2000) . Además, los pacientes adultos no infectados que reciben transplantes de células hematopoyéticas progenitoras alogeneicas usando células CD34+ seleccionadas presentan un retraso marcado y una recuperación de linfocitos T suboptima, indicando actividad tímica subnormal después de la supresión intensiva de la médula ósea (Behringer et al 1999; Martínez et al 1999) . También deberá considerarse que factores potenciales inherentes a los métodos empleados en la manipulación genética de los progenitores hematopoyéticos pueden afectar su capacidad para experimentar desarrollo linfoide T. Esos factores identificados anteriormente incluyen la inducción de progenitores en el ciclo celular en la preparación para la transducción con retrovirus murinos (Roe et al 1993) , lo cual daría como resultado un compromiso de linaje mieloide, y la presencia de un gen externo expresado constitutivamente que puede interferir con los procesos requeridos de la migración, alojamiento y diferenciación de células progenitoras . Por lo tanto, buscamos determinar si los linfocitos T protegidos genéticamente, incluyendo los linfocitos T candidos, podrían ser producidos en el contexto de la infección por VIH adulta. La interferencia con la multiplicación del VIH-1 puede ocurrir en cualquier etapa de su ciclo de reproducción. La infección retroviral de una célula es iniciada por la interacción de glicoproteínas virales con receptores celulares (A) (véase la Figura 1) . Después de la adsorción y descubrimiento, el ARN viral entra a la célula objetivo y es convertido en ADNc por la acción de la transcriptasa inversa, una enzima transportada dentro del virion (B) . El ADNc adopta una forma circular (C) es convertido al ADNc de doble hebra y entonces se integra al ADN genómico de la célula hospedera mediante la acción de la integrasa (D) . Una vez integrado, el ADNc províral es transcrito del promotor dentro del 5' LTR (?) . El ARN transcrito, incluyendo los ARNm para gag, pol y env y los factores reguladores tat, rev y vpr son traducidos para producir las proteínas virales (F) o es dejado como ARN viral incipiente o naciente. Este ARN viral contiene una secuencia de empaquetamiento Psi la cual es esencial para su empaquetamiento en viriones (G) . Una vez que el producido el virion, este es liberado de la célula por un brote de la membrana plasmática (H) . En general, los retrovirus no causan la lisis de la célula hospedera,- el VIH es una excepción a esto. El ADNc proviral permanece integrado establemente en el genoma hospedero y se reproduce con el ADN del hospedero, de modo que las células de la progenie también heredan el provirus. Los agentes antivirales potenciales pueden ser dirigidos a cualquiera de esos puntos de control reproductivo. Por ejemplo, la desregulación del receptor CCR5 puede inhibir la reproducción del VIH-1 (Bai et al 2000) . Pueden ser usados diferentes tipos de métodos con esta invención para la terapia genética contra el VIH-1, incluyendo la expresión extracelular de proteínas transdominantes (por ejemplo Smythe et al. 1994), anticuerpos intracelulares (por ejemplo Marasco et al. 1998, Shaheen et al 1996), ácido ribonucleico (ARN) antisentido (por ejemplo, Sczakiel y Pa lita 1991) , decoy virales (por ejemplo Kohn et al. 1999), ribozimas catalíticas (por ejemplo Sarver et al. 1990; Sun et al. 1996) y ARNi (por ejemplo Novina et al 2002) .

Las proteínas (mutantes) transdominantes, particularmente las proteínas Rev o Tat imitantes, actúan uniéndose al ARN del VIH o factores requeridos para la reproducción del VIH. Ellas tienen una función alterada en comparación con la proteína no mutante, dado que interfieren con la función de la proteína no mutante. Ellas pueden ser una proteína de fusión, que combine dos o más actividades. En una modalidad particular, la proteína transdominante es la proteína RevMIO (Ranga et al 1998) , la cual ha demostrado inhibir la reproducción del VIH-1 en células T primarias . Las células CD34+ transducidas con RevMIO aisladas de sangre de cordón umbilical humano o sangi'e periférica dan lugar a timocitos maduros en un modelo de ratón y células T protegidas contra el VIH-1 (Bonyhadi et al 1997) . Además, la liberación retroviral RevMIO a células CD4+ protege esas células en individuos infectados con VIH (Ranga et al 1998) . Los anticuerpos intracelulares , generalmente del tipo de una sola cadena, como los que son producidos a partir del constructo retroviral pSLXCMV (Shaheen et al 1996) , pueden inhibir el ciclo de vida del VIH uniéndose a o secuestrando proteínas virales especificas . En una modalidad particular, fragmentos de anticuerpo anti-transcriptasa inversa (RT) inhibieron la infección por VIH in vitro (Macie ewski et al 1995) .

El ARN antisentido puede unirse al ARN viral, ya sea a productos genómicos o de transcripción, y desestabilizar al ARN o inhibir procesos como la traducción o exportación del núcleo. La unión al ARN viral incipiente o naciente también puede actuar para inhibir el empaquetamiento productivo del ARN en viriones. Como es bien sabido en la técnica, la región complementaria para una molécula antisentido puede ser tan corta como de 15 nucleótidos, de manera más preferible, de más de 30 nucleótidos, y de manera más preferible, de entre 100 y 500 nucleótidos de longitud. La inhibición de la reproducción del VIH-1 ha sido demostrada para ARN antisentido dirigidos contra varios genes reguladores y estructurales virales, incluyendo al pol, gag, env, tat, vif, y psi (véase Veres et al 1998) .

La reproducción del virus de inmunodeficiencia de los simios (VIS) relacionado fue limitada y el progreso de la enfermedad fue reducido en monos después del tratamiento con linfocitos que contenían tat/rev antisentido (Donahue et al 1998) demostrando que la expresión antisentido puede inhibir la reproducción de lentivirus in vivo. En una modalidad particular, el vector retroviral HGTV 3 codifica para una molécula antisentido que dirige a tar y dos sitios separados de la región tat/rev en el genorna del VIH-1. Esta molécula ha demostrado proporcionar protección contra la infección por VIH in vi tro.

Los decoys de ARN como los decoys RRE y decoys TAR también han sido usados para proteger células contra el VIH (Lee et al 1994, Lisziewicz et al 1993) y son usados preferiblemente en una forma polimérica para incrementar la capacidad para unir proteínas relacionadas con el VIH-1 y secuestrarlas. Las ribozimas pueden actuar uniendo no solo ARN virales sino también escindiéndolas e inactivándolas y de este modo son atractivas para usarse con esta invención. Ellas consisten de una o más (usualmente dos) regiones de complementariedad al ARN objetivo y una región catalítica que proporciona actividad enzimática. Las ribozimas, particularmente aquellas con brazos hibridantes más largos, también pueden actuar a través de mecanismos similares a aquellos usados por las moléculas antisentido. Los motivos de ribozima más ampliamente usados son los tipos de cabeza de martillo y horquilla los cuales son descritos en la Patente Estadounidense No. 6,127,114 y la Patente Estadounidense No. 6,221,661, respectivamente. En una modalidad particular, el vector retroviral pTCAG codifica para una ribozima de horquilla que dirige una región U5 (posición +111/112 del sitio con la tapa) de LTR de VIH-1 fusionado con parte de una secuencia de RRE y una ribozima que dirige la región codificadora de rev/env (posición B629-8644 de HXB2 aislado) , expresada de un promotor tARNval (Gervaix et al 1997) . Las moléculas de ARNi son aquellas con regiones de ARN de doble hebra que disparan los mecanismos de degradación de ARN de células hospederas en una forma específica de la secuencia. Ellas pueden por lo tanto ser usadas para inactivar ARN endógenos o ARN patógenos como el ARN del VIH-l. Cada región de doble hebra puede ser relativamente corta, por ejemplo de 21-25 pares de bases de longitud, preferentemente de menos de aproximadamente 30 pares de bases de longitud, y de manera más preferible con una región de doble hebra de 19 a 25 pares de bases. Se prefiere que exista no más de un mal apareamiento (los malos apareamientos son definidos como aquellos pares que no incluyen G-.U) en cada región de doble hebra, de manera más preferible no malos apareamientos, y de manera más preferible que las regiones de doble hebra estén perfectamente apareadas. Donde la molécula objetivo es variable (por ejemplo, ARN de VIH-l) , las regiones altamente conservadas serán el blanco u objetivo. Una familia de variantes pueden ser el blanco u objetivo siempre que no tengan más de un mal apareamiento con una u otra de las hebras de la región de doble hebra de la molécula de ARNi. Para moléculas de ARNi más largas, pueden ser unidos varios dúplex más cortos, permitiendo hacer blanco de genes múltiples, lo cual es preferido para blancos objetivos con mayor variabilidad. Los dúplex de ARNi también pueden ser producidos a partir de transcriptos' de ARNm más largos empalmados o por medio de autoescisión, por ejemplo incorporando ribozimas de autoescisión entre o flanqueando las regiones dúplex. Las moléculas de ARNi son formadas fácilmente a partir de moléculas de ADN que tengan una estructura repetida invertida. De manera alternativa, los dúplex de ARNi pueden ser formados a partir de dos moléculas de ARN con regiones complementarias. Las moléculas de ARNi con regiones de doble hebra de más de 30 pares de bases pueden ser usadas si se localiza nuclearmente , por ejemplo, si son producidas sin señales para la exportación citoplásmica, como secuencias poliadeniladas . Hasta recientemente, no se había demostrado que el ARNi funciona en células human s. Recientemente, sin embargo, se ha demostrado que el ARNi (también llamado ARNi, ARNi corto, o ARN de horquilla) inhibe la reproducción del VIH-1 en linfocitos T (Novina et al 2002) . Las moléculas de ARNi dirigidas al LTR viral, o los genes vif y nef accesorios inhibieron los pasos inicial y final de la reproducción del VIH en líneas celulares y linfocitos principalmente (Jacque et al 2002) . El ARNi también ha sido dirigido exitosamente a otros virus (por ejemplo Gitlin et al 2002) y puede ser dirigido contra genes endógenos .

Los agentes de ARN descritos aquí para usarse en la invención pueden ser expresados de promotores virales (por ejemplo, LTR retroviral, citomegalovirus ) u otros promotores que utilicen ARN polimerasa II para la expresión de alto nivel. El agente de ARN puede ser incorporado en transcriptos más largos, por ejemplo, en la región no traducida 3' de un gen marcador. El transcripto puede ser modificado para la autoescisión para la liberación del agente. El agente de ARN también puede ser expresado de promotores de ARN polimerasa III usando constructos genéticos derivados de genes de ARNt, adenovirus VA1, Ul y U6 u otros genes de ARN nucleares pequeños. Además, el agente de ARN puede ser provisto con señales que ayuden a la colocalización del agente con la molécula objetivo (por ejemplo, véase ichienzi et al 2000) . La racionalización científica para el uso de una ribozima u otros genes para tratar el VIH u otras infecciones se muestra esquemáticamente en la Figura 2. Un objeto de esta invención es proporcionar beneficio terapéutico permitiendo la emergencia a largo plazo de linfocitos T protegidos del timo, con mayor sobrevivencia de las células CD4+, y el establecimiento de un incremento en la respuesta inmune por elementos inmunes protegidos. hematopoyesis Las células hematopoyéticas incluyen células normalmente encontradas en la sangre así como células que dan lugar a células normalmente encontradas en la sangre, como las células encontradas en la médula ósea. En este contexto "normalmente" incluye la situación donde una persona es tratada para alterar el número o calidad de las células en la sangre o médula ósea. El proceso de diferenciación de las células hematopoyéticas se muestra esquemáticamente en la Figura 3. La hematopoyesis es el proceso a través del cual se mantiene el sistema que forma la sangre. Este proceso implica un equilibrio entre la muerte celular y la regeneración y diferenciación de nuevas células . La producción de células linfoides maduras requiere que las precursoras abandonen la médula ósea, pasen a través de los mecanismos de selección dentro del timo y sean exportadas como células candidas a la sangre periférica. La eficiencia de este proceso está relacionada con la edad puesto que el timo evoluciona con la edad y su tasa de exportación de linfocitos T CD4+ decae en consecuencia. La sobrevivencia y expansión de linfocitos T para dar lugar a células T activadas y con memoria depende de mecanismos homeostátíeos naturales. La hematopoyesis es mantenida por un conjunto de células no diferenciadas hematopoyéticas (HS) pluripotentes las cuales tienen la capacidad a largo plazo de autorrenovarse, así como de dar lugar a una progenie que prolifera y se diferencia en células sanguíneas efectoras maduras de los grupos mieloide y linfoide (Ogawa et al 1993, Orlic y Bodine 1994) . Los números de células progenitoras (HS) son mantenidos por división celular, de modo que esas células son efectivamente inmortales. Al menos en teoría, el sistema hematopoyético completo podría ser regenerado a partir de una sola célula HS . Muchas de esas células HS están en reposo en el cuerpo (Hodgson y Bradley 1979, Jones et al 1990) . Las células hematopoyéticas progenitoras (HP) se caracterizan por la presencia del antígeno de la superficie celular CD34 y su capacidad para dar lugar a una progenie multilinaje de los tipos mieloide y linfoide . Algunas células hematopoyéticas progenitoras CD34+ tienen la capacidad de autorrenovarse y pueden ser consideradas células no diferenciadas verdaderas, mientras que otras células hematopoyéticas CD34+ pueden no tener la capacidad de autorrenovarse o únicamente una capacidad limitada. El antígeno CD34+ está ausente sobre la mayoría de las células hematopoyéticas maduras . Las células CD34+ son en sí heterogéneas (Bertolini et al 1998) y pueden ser fraccionadas en subpoblaciones sobre la base de la expresión de otros marcadores, por ejemplo CD38 (Hogan et al 2002) . Las células CD34+/CD38" humanas, que representan aproximadamente el 5% de la población de células CD34+, demostraron tener una mejor capacidad de reconstitución a largo plazo en el modelo de ratón SCID que las células CD38+ (Hogan et al 2002). De este modo, 2.5 x 104 CD34+/CD38" (CD34+/CD38ba a) pueden ser equivalentes a 5 X 105 CD34+. otros marcadores que pueden ser usados para enriquecer la población de células para células con capacidad de reconstitución a largo plazo incluyen Thy-1+, CD133+, KD + humano (receptor VEGF) , C1QRP+ humano, HLA-DR', y retención de tintes vitales de bajo nivel como la Rodamina 123 o el Hoechst 33342. Reportes recientes indican que pueden existir células HS que carezcan del antígeno CD34 durante al menos algún tiempo (Halene and Kohn 2000, Dao y Naolta 2000) . Ha sido demostrada la expresión reversible del marcador CD34 sobre células HS murinas, sugiriendo que el CD34 sirve como un marcador de activación (Sato et al 1999) . Las células CD34" han demostrado ser capaces de producir un injerto multilinaje y dar lugar a células CD34+ (Zanjani et al 1998) . La capacidad de las células HP, las cuales van a ser alteradas por la terapia genética de acuerdo a esta invención, para injertarse y dar lugar a una progenie diferenciada multilinaje a largo plazo es una característica crítica de esta invención. Esta proporciona la persistencia de células hematopoyéticas modificadas genéticamente en el sujeto humano. Esta capacidad puede ser ensayada por la capacidad para repoblar los sistemas hematopoyéticos de animales sometidos a mieloablasión (Harrison 1980, Harrison 1988) o preferiblemente humanos sometidos a mieloablasión, o de manera más preferible humanos no sometidos a mieloablasión. De manera aún más preferible, esta capacidad es ensayada en el contexto de infecciones virales, como la infección por VIH-1.

Células HP y su aislamiento El aislamiento y purificación de células HP humanas ha sido revisado recientemente (To et al 1997, Huss 2,000, Thomas et al 1999, Sadelain et al 2000) . Las células HP para usarse en la terapia genética de acuerdo a la invención pueden ser aisladas de sangre periférica después de la movilización, médula ósea, o sangre del cordón umbilical. Las células HP también pueden ser obtenidas de células no diferenciadas que den lugar a células hematopoyéticas . Las células HP son obtenidas preferibl mente de sangre periférica después de la movilización (Huss 2000) . Existen algunas ventajas en el aislamiento de células HP de sangre periférica movilizada. Puede recolectarse un número absoluto mayor de células CD34+ de la sangre periférica después de la movilización en comparación con la médula ósea o la sangre del cordón umbilical, debido a la cantidad relativamente grande de sangre que puede ser procesada. El procedimiento no requiere anestesia general y está asociado con costos de hospitalización reducidos. Como será bien comprendido en la técnica (por ejemplo, Fu y Liesveld 2000) la movilización puede ser efectuada por tratamiento con una o más citocinas, opcionalmente agregando un curso corto de quimioterapia con agentes como la ciclofosfamida (Campos et al 1993) . Las células HP pueden ser movilizadas hacia la sangre periférica usando G-CSF (Ho 1993, Lañe et al 1995), G-CSF pegilado, G-CSF conjugado, GM-CSF (Siena et al 1989) , o cualquier combinación de esos. La movilización puede ser mejorada combinando una o más de esas citocinas con otras como el factor de las células no diferenciadas (SCF) , ligando Flt-3 (Ho et al 1996 abreviada como Flt3), o interleucina 3 (IL-3; Huhn et al 1996). La movilización puede ser mejorada contrarrestando al factor 1 derivado de células estromales (SDF-l Benboubker et al 2001) u otros factores que actúan negativamente para restringir la movilización. La movilización de las células HP de sangre periférica usando G-CSF en individuos infectado con VIH ha sido demostrada por Law et al en 1999. La movilización máxima fue lograda después de 4 días de administración de G-CSF. Las células HP pueden ser obtenidas por aféresis los días 4, 5, 6 o posteriores. Los niveles de células CD34+ en la sangre pueden ser verificados desde aproximadamente el día 3 en adelante, por ejemplo pueden ser efectuados conteos de sangre completos (CBC) , conteo diferencial y de plaquetas diariamente durante la administración de citocina para evaluar el grado de leucocitosis. El conteo de células CD34+ es preferiblemente mayor de 20 células/mm3 antes del inicio de la aféresis. La aféresis puede ser llevada a cabo con el Cobe Spectra (Gambra) , Hemonetics (Domediac) , Amicus (Baxter) o equipo equivalente. La aféresis da como resultado una población de leucocitos altamente rica en células tnononucleares y pobre en granulositos , lo cual es lo deseable. Si se obtienen suficientes células CD34+ de una primera serie de movilización/aféresis, el procedimiento puede ser repetido con el mismo régimen de movilización o modificado. Alternativamente, la aféresis puede ser repetida. Las células CD34+ del primer procedimiento pueden ser criopreservadas y combinadas con aquellas de procedimientos posteriores . Se ha demostrado que las células HP primitivas están reducidas o ausentes en pacientes con infección por VIH ( arandin et al 1996) ; esto ce más difícil obtener números suficientes de células en el contexto de la infección por VIH. Las células HP también pueden ser aisladas de médula ósea aspirada aislando células mononucleares (MNC) y purificando células CD34+. Las células HP también pueden ser aisladas de sangre de cordón umbilical (Gluckman 2000) . Pueden obtenerse hasta 200 mi de sangre de cordón al nacimiento. Esas células pueden ser criopreservadas y usadas para la transducción y transplante exitoso posteriores (Huss 2000) . Existe evidencia de que las células HP de sangre de cordón umbilical son transducidas más fácilmente y tienen mayor potencial de autorrenovación que aquellas de la sangre periférica (Moore y MacKenzie 1999) . Han sido desarrollados dispositivos que permiten el enriquecimiento de las células CD34+ para uso clínico, incluyendo el Isolex 300i o equivalente. Eso se basa en el reconocimiento del antígeno de la superficie celular CD34+, el cual es una sialomucina transmebranal que es expresada sobre células HP y sobre células endoteliales vasculares. Los métodos incluyen métodos inmunoselectivos usando anticuerpos con especificidad para el antígeno CD34, anticuerpos los cuales pueden ser marcados con marcas magnéticas o fluorescentes o de otro tipo que permitan la selección. Las células pueden expresar la proteína CD34 internamente pero no permitirían la inmunoselección . Unicamente las células que expresan el antígeno CD34 sobre la superficie celular al mismo tiempo, que permiten el acceso al anticuerpo, son consideradas CD34+. Las poblaciones de células hematopoyéticas que están altamente enriquecidas en células CD34+ también pueden ser obtenidas de la fuente mencionada anteriormente por estrategias de agotamiento de antígeno, por ejemplo, para agotar selectivamente la población de células que expresan marcadores específicos del linaje como glicoproteína A CD2 , CD3 , CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, o CD66b. Este tipo de estrategia permite el aislamiento de poblaciones de células ricas en células HS CD34" así como células CD34+. El conjunto enriquecido de CD34+ o las células empobrecidas en linaje preferiblemente comprenden al menos 40%, de manera más preferible al menos 60%, y de manera más preferible al menos 80% de células de este tipo. Puede existir un equilibrio entre la pureza y la recuperación de las células deseadas. La proporción de células CD34+ en las muestras puede ser determinada por el método de citometría de flujo, por ejemplo como el efectuado por Bender et al 1991, o métodos inmunológicos . El número y proporción absolutas de las células CD34+ pueden ser determinados por procedimientos estandarizados (Barnett et al 1998, Sand aus et al 1998) . Los conteos absolutos de células nucleadas pueden ser determinados por analizadores hematológicos , o de manera más preferible, en ensayos de una sola plataforma, donde los conteos absolutos de CD34+ son producidos directamente a partir de un solo análisis de citometría de flujo. La enumeración de las células CD34+ y algunos de los equipos que pueden ser usados han sido revisadas recientemente (Reis 1999) . Una vez aisladas, las células CD34+ pueden se cultivadas en cualquier medio adecuado, bien conocido en la técnica, en recipientes como frascos o bolsas, por ejemplos las bolsas de polipropileno permeables a gases (Giarratana et al 1998) . Existen cada vez más evidencia de que la mayoría de las células CD34+ están implicadas en la reconstitución a corto plazo pero no a largo plazo, y que únicamente una pequeña fracción de todas las células CD34+ tiene protencial de injerto multilinaje a largo plazo (véase Bertolini et al 1998) . Esto da lugar a problemas a cerca de la enumeración de los números de CD34+ en los primeros reportes y potencial de injerto (Ducos et al 2000) . Nosotros hemos demostrado aquí que las células CD34+ humanas transducidas y el método de la invención son capaces de proporcionar injerto multilinaje a largo plazo.

Tratamiento de las células HP para la transducción con vectores oncorretrovirales laurinos. La transducción eficiente de células HP humanas con vectores oncorretrovirales murinos (por ejemplo, aquellos basados en MMLV) y algunos otros vectores retrovirales requiere la inducción del ciclo celular, por ejemplo, con una o más citocinas (factor del crecimiento) (Dao y Nolta 1999) o inhibidores del control del ciclo celular. La combinación de trombopoietina (TPO) , ligando Flt-3 (FL) y ligado de Kit ( L, también conocido como SCF) ha sido usada in vitro (Murray et al 1999, Ng et al 2002) . La combinación de MGDF, SCF y FL fue usada en ensayos de repoblación en primates (Wu et al 2000) . Amado et al ha demostrado que el tratamiento de células con MGDF y SCF soporta mejor la sobrevivencia de células precursoras de los timocitos que otras combinaciones de factores en un modelo de ratón (Amado et al 1998) . La IL-3, IL-6, el SCF o el TPO o combinaciones de los mismos han demostrado tener efectos benéficos sobre la transducción de células HP (Nolta et al 1992, Hennemann et al 1999) . Las combinaciones FL/SCF/IL-3/IL-6, SCF/G-CSF, FL/SCF/TPO/IL-6 , FL/SCF/G-CSF, FL/SCF/TPO y FL/SCF/GM-CSF también han sido usadas en modelos con animales grandes (Richter y Karlson 2001) . Existe evidencia, sin embargo, que la combinación de la IL-3, la IL-6 y el SCF pueden mejorar el injerto (Peters et al 1996) . Otros métodos para inducir el ciclo de las células HP incluyen el uso de inhibidores (por ejemplo moléculas antisentido o anticuerpo) de p27 (kipl) (Dao et al 1998, Cheng et al 2000) o factor beta-1 de crecimiento transformador (Ducos et al 2000, Imbert et al 1998) para incrementar los números de células. Sin embargo, la capacidad de las células estimuladas en cualquiera de esas formas y a continuación transducidas para conferir injerto a largo plazo en humanos era desconocida antes hasta esta invención. El SCF (ligando c-kit) es una citocina producida principalmente por células estromales de la molécula y tiene un papel importante en la sobrevivencia y la autorrenovación de la HSC (Lyman y Jacobsen 1998) . También actúa como comitógeno en el movimiento de las células HS fuera del conjunto de células no diferenciadas hacia la progenie. El ligando Flt-3 (FL) es una citocina que se une a una tirocina cinasa del receptor de la clase III que se expresa sobre células hematopoyéticas primitivas (Lyman y Jacobsen 1998) . El FL tiene un efecto sinérgico con el SCF sobre la sobrevivencia y proliferación de las células HP (Dao et al 1997) . La trombopoyetina (TPO) es un ligando para el receptor c-Mpl y es un factor del crecimiento implicado en la hematopoyesis inicial así como la formación de megacariocitos y plaquetas (Solar et al 1998) . El MGDF es una forma pegilada y truncada de la TPO y actúa en una forma similar a la TPO; este puede considerarse como equivalente funcional de la TPO. Cualquiera de esas citocinas puede ser modificada, formulada de manera diferencial o conjugada proporcionando aún un efecto equivalente .

Ribozimas Las ribozimas son ARN enzimáticos que pueden escindir específicamente al ARN (por ejemplo, Haseloff y Gerlach, 1988) . Siendo catalíticas, ellas exhiben recambio y por lo tanto pueden escindir moléculas objetivo o blanco múltiples. Los ribozimas se aparean con el ARN objetivo específico en virtud de la secuencia de complementariedad e inducen la escisión en sitios específicos a lo largo del esqueleto fosfodiéster del ARN (Haseloff y Gerlach, 1988; Rossí et al., 1992; Hampel et al 1990; Ojwang et al 1992) . La ribozima cabeza de martillo es pequeña, simple y tiene la capacidad de mantener la escisión específica del sitio cuando se incorpora en una variedad de motivos de secuencia flanqueantes (Haseloff y Gerlach, 1988; Rossi et al., 1992). Los requerimientos para la escisión por una ribozima son una región de ARN accesible y, en el caso de la ribozima cabeza de martillo, un motivo objetivo NUH (donde ?G es cualquier ríbonucleótido y H es los ribonucleótidos A, C o U) . La escisión ocurre inmediatamente 3' del motivo objetivo NUH. Esas características lo hacen particularmente muy adecuado para la supresión genética. Otros tipos de ribozimas incluyen la llamada ribozima de horquilla, la ribozima del virus delta de la hepatitis (HDV) , ARNasa P, secuencia interviniente del Grupo I (IVS) , IVS del Grupo II, y motivos identificables por el método de selección in vitro. Los tipos de cabeza de martillo y horquilla se encuentran entre los más pequeños y más ampliamente usados .

Descripción, de Rz2 Un número de estudios han demostrado la actividad de escisión de la ribozima en reacciones en tubo de prueba, y efectos protectores en sistemas de cultivo tisular contra aislados de VIH-1 de laboratorio y clínicos (Sarver et al. 1990; Sun et al. 1995; Wang et al 1998) . Una ribozima cabeza de martillo particular denotada como Rz2 es dirigida contra la región altamente conservada del gen tat (Figura 4) . El gen tat es esencial para la reproducción del VIH-1; este codifica y produce la proteína Tat que es un activador transcripcional del provirus VIH-1 integrado. Sun et al (1995) usó Rz2 para proteger linfocitos T contra el VIH-1 in vitro pero no describió los resultados en pacientes. Ellos tampoco describieron que debe ser usado un número mínimo de células HP transducidas para el injerto prolongado, o que número debe ser. Amado et al (1999) describe en términos generales el protocolo usado en un ensayo clínico en fase 1 para determinar la factibilidad y seguridad de la transduccion de células CD34+ en individuos infectados con VIH-l con un vector retroviral basado en MoMLV. Ellos no describen los resultados del ensayo o que número mínimo de células HP transducidas deberá ser usado por el injerto a largo plazo. Los objetivos del ensayo incluyeron determinar la eficiencia de la transduccion y la seguridad y para probar si la ribozima conferiría una ventaja de sobrevivencia (o desventaja) a las células de la progenie in vivo. La Figura 4 muestra la estructura de Rz2 y su secuencia objetivo en la posición 5833 a 5849 dentro del VIH-l cepa HXB2 (secuencia del Genbank 03455) , donde la escisión ocurre después del triplete GUA en la posición 5842. Las secuencias objetivo comprende los nucleótidos 5833-5849 (GGAGCCA GUA GAUCCUA) de la cepa de referencia VIH-HXB2 (número de acceso del Genbank K03455) o los nucleótidos 5865 a 5882 (GGAGCCA GUA GAUCCUA) del VIH IIIB (número de acceso del Genbank X01762) o la región correspondiente de otras cepas de VIH. Los nucleótidos de ADN con la secuencia 5'-TTA GGA TCC TGA TGA GTC CGT GAG GAC GAA ACT GGC TC-3' correspondientes a la ribozima Rz2 fueron insertados en el sitio Salí en la región 3' no traducida del gen neoR dentro del plasmado pLNLS , el cual contiene el vector retroviral incompetente para la reproducción LNL6 (número de acceso del Genbank M63653) para generar un nuevo virus, Rz2. La secuencia de la ribozima fue expresada como el transcripto de fusión neoR~ribozima de la Repetición Terminal Larga (LTR) del Virus de la Leucemia Murxna de Moloney (MoMLV) en RRz2. Se prefiere que la secuencia nucleotídica inmediatamente alrededor del sitio de escisión de la ribozima esté altamente conservada en el ARN objetivo viral. Esto puede ser determinado fácilmente mediante la comparación de secuencias disponibles en bases de datos de secuencia, o probado experimentalmente por ensayos de pasajes múltiples (Wang et al 1998) . El sitio objetivo/escisión de Rz2 en el VIH-1 está conservado en casi todos los aislados infecciosos naturales. En el ensayo clínico en Fase I, se observaron dos variantes de la secuencia en las posiciones -4 y -1 con relación al triplete GUA en el sitio de la escisión. Sin embargo, esas variantes pueden representar pseudotipos menos ajustados . Puesto que los linfocitos T CD4+ y CD8+, los monocitos y los macrofagos son los más susceptibles a la infección por VIH, la modificación genética de esas células de modo que expresen Rz2 conduce a la inhibición de la infección por VIH. Preferiblemente, la modificación genética es efectuada durante la etapa inicial de la hematopoyesis .

Vectores Pueden ser usados diferentes tipos de vectores para la transducción o transformación de las células HP. Esos incluyen plásmidos o vectores virales. Los vectores retrovirales han sido ampliamente usados en la terapia genética (Chu et al 1998) , particularmente aquellos basados en el virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV) , un miembro de los oncoretrovirus murinos . Otros vectores retrovirales murinos que pueden ser usados incluyen aquellos basados en virus de células no diferenciadas embriónicas murinas ( ESV) y virus de células no diferenciadas murinas ( SCV) . Los vectores basados en oncorretrovirus murinos pueden ser usados para la transducción altamente eficiente de células, sin embargo, ellos requieren que las células estén activas en división celular. Después de la entrada al citoplasma celular y la transcripción inversa, el transporte del complejo preintegración al núcleo requiere el rompimiento de la membrana nuclear durante la mitosis. La transducción de las células HP con vectores basados en retrovirus murinos requiere por lo tanto la activación de las células .

Los vectores lentivirales (Amado y Chen 1999) , una subclase de los vectores retrovirales , también pueden ser usados para la transducción altamente eficiente (Haas et al 2000, Miyoshi et al 1999, Case et al 1999) y pueden transducir células que no estén dividiéndose (Uchida et al 1998, Sutton et al 1998) . El complejo de preintegración puede entrar al núcleo sin mitosis, y por lo tanto la transducción lentiviral no requiere la inducción de células HP en el ciclo celular. Esto incrementa la probabilidad de que las células permanezcan pluripotentes . El uso de vectores lentivirales en la terapia genética contra el VIH-I ha sido revisado (Mautino y Morgan 2002) . Otros grupos de retrovirus como los espumavirus, por ejemplo, los virus espumosos (Vassilopoulos et al 2001) también son capaces de transducir eficientemente células que no estén dividiéndose . Otros tipos de vectores virales que pueden ser usados en la invención incluyen vectores adenovirales (Fan et al 2000, Knaan-Shanzer et al 2001, Marini et al 2000) , vectores virales adenoasociados (AAV) (Fisher-Adams et al 1996) , vectores basados en SV40 (Strayer et al 2000), o formas de vectores híbridos (por ejemplo Feng et al, 1997 o Lieber et al 1999) . Los vectores adenovirales pueden ser producidos fácilmente en altos títulos, dado a que puede ser fácilmente concentrados (1012 ufp/ml) , y pueden transducir células que no estén dividiéndose. Pueden ser acomodados insertos de ADN grandes (7-8 kb) . Las reacciones inmunes contra adenovirus in vivo pueden ser aliviadas removiendo genes que codifiquen para ciertas proteínas. Los vectores AAV no son patógenos, transducen células proliferantes y no proliferantes, incluyendo células CD34+, y se integran de manera estable en el genoma celular (Grimm y Kleinschmidt 1999) . Además, ellos no inducen una respuesta inmune del hospedero y pueden ser producidos en sistemas libres de auxiliares en altos títulos de aproximadamente 1010 ufe por mi. El AAV es un virus no envuelto con un genoma de ADN de una sola hebra. Los vectores AAV pueden incorporar fácilmente hasta aproximadamente 4 kxlobases de ADN nuevo, aunque estudios recientes han ampliado esto. Los vectores AAV pueden transducir efectivamente células CD34+ en cultivos a largo plazo (Chatterjee et al 1999) . Los vectores que dan como resultado la integración del gen introducido en el genoma de las células, son los preferidos para obtener un efecto largamente duradero después del retorno de las células al paciente, por ejemplo, los vectores retrovirales , incluyendo los vectores lentivirales , y vectores AAV. Los vectores virales integrantes son definidos aquí como aquellos que dan como resultado la integración de todo o parte de su material genético en el genoma celular. Ellos incluyen vectores retrovirales y vectores 7AAV. Ellos también incluyen también vectores híbridos, vectores adenovirales/retrovirales (por ejemplo, Feng et al 1997) y vectores adenovirales/AAV (por ejemplo, Lieber et al 1999) . Sin embargo, también pueden ser usados vectores que se reproduzcan de manera estable como episomas . También es deseable que el vector pueda ser producido en líneas celulares hasta un título alto, en una forma barata, y que tenga el mínimo riesgo para los pacientes, por ejemplo que no de lugar a virus que compitan con la reproducció .

Producción del vector Los métodos para construir y producir vectores retrovirales son revisados en Gambotto et al (2000) . Los vectores son empaquetados en líneas de células empaquetadoras como las líneas celulares PA317 o A -12 las cuales contienen vectores auxiliares que si son defectivos en el empaquetamiento. Han sido descritas varias variaciones en los métodos para producir sobrenadantes retrovirales con altos títulos (Schilz et al 2001) , incluyendo variaciones en el medio, células empaquetadoras, la temperatura de cosecha y métodos de concentración por centrifugación o complej ación (Le Doux et al 2001) . Cualquiera de esos métodos pueden ser usados dentro de esta invención. Los retrovirus empaquetados en envolturas anfotrópicas murinas pueden no transducir células HP primitivas eficientemente debido a los bajos niveles del receptor anfotrópico (Bodine et al 1998) . Sin embargo, la inducción del ciclo celular ha demostrado conducir a un incremento en la expresión del receptor anfotrópico con un incremento concordante en la transferencia del gen (Orlic et al 1999) . Un método alternativo es el de los vectores retrovirales pseudotipo con envolturas como la envoltura del virus de la leucemia del simio gibbon (GALV) ( iem et al 1997, Eglitis y Schneiderman 1997, elander et al 2002) , virus de la estomatitis vesicular (proteína VSV-G) (Naldini et al 1996, von Laer et al 1998) o virus endógeno felino (Kelly et al 2002) . Los vectores de pseudotipificación pueden permitir la concentración, por ejemplo por centrifugación. Los vectores AAV pueden ser producidos en líneas de células empaquetadoras o en células que expresen los genes rep y cap AAV ya sea de manera constitutiva o transitoria. La producción de vectores AAV ha sido revisada (Grimm y Kleinschmidt 1999) , incluyendo el desarrollo de métodos de empaquetamiento libres de auxiliares y el establecimiento de líneas productoras de vectores . Los vectores adenovirales pueden ser producidos y purificados de acuerdo a métodos estándar (por ejempl véase Fan et al 2000) . El título biológico de los patrones virale puede ser determinado fácilmente (por ejemplo Tavoloni e al 1997) .

Expresión del gen en vectores El gen introducido es expresado en las células HP humanas transducidas de esta invención o las células de la progenie de un promotor. El promotor puede ser expresado de manera constitutiva o inducible, por ejemplo, siendo expresado preferiblemente bajo condiciones o circunstancias favorables (por ejemplo Chang y Roninson 1996, Saylors et al 1999) . La expresión dirigida a tipos de células específicas puede ser preferida con algunos trastornos genéticos como las hemoglobinopatías o talasemias (Grande et al 1999) . Los promotores/me oradores de los vectores virales como el promotor LTR retroviral de MoMLV puede ser modificado para mejorar la expresión (Robbins et al 1998, Halene et al 1999) o modificado mediante la inserción de elementos como aislantes (Rivella et al 2000) o regiones de unión por andamiaje (SAR) (Murray 2000) . Los promotores y elementos reguladores adicionales preferidos, como las señales de poliadenilación, son aquellos que deberán producir una expresión máxima en el tipo de célula (por ejemplo linfocitos T) los cuales el agente de la terapia genética va a ser expresado. De este modo, por ejemplo, el VIH-1, VIH-2, HTLV-1 y HTLV-2 infectan todos a las células linfoides, y para expresar eficientemente el agente de la terapia genética contra esos virus, se selecciona una unidad de control transcripcional (promotor y señal de poliadenilación) , los cuales proporcionan la expresión eficiente en células (o tejidos) hematopoyéticos, particularmente linfoides. Los promotores preferidos son el promotor inicial inmediato de citomegalovirus (C V) , usado opcionalmente en conjunto con la señal de poliadenilación de la hormona del crecimiento, y el promotor LTR de MuLV de Moloney. Una característica deseable de un promotor LTR es que tiene el mismo tropismo tisular que los retrovirus de su origen. El promotor CMV es expresado en linfocitos. Otros promotores incluyen a los promotores de VA1 y ARNt los cuales dependen de la ARN polzmerasa III. El promotor de metalotioneina tiene la ventaja de inducibilidad . El promotor inicial de SV 40 exhibe un alto nivel de expresión ín vi tro en células de médula ósea. Pueden ser usados promotores específicos de células hematopoyéticas en lugar de promotores virales (por ejemplo Malik et al 1995} . La expresión de varios genes anti-VIH de vectores basados en Mo LV fue mantenida a largo plazo (Austin et al 2000, Su et al 1997) . Los vectores basados en retrovirus diferentes al MoMLV han mostrado una expresión prolongada, por ejemplo para vectores de virus de células no diferenciadas de ratón (MSCV) (Cherry et al 2000) o FrMLV (Cohen-Haguenauer et al 1998) . La expresión de vectores lentivirales también parece ser mantenida en células transducidas (Case et al 1999) . La pérdida de expresión del gen de vectores retrovirales ha sido observada varias veces después de la transducción de células hematopoyéticas murinas (Challita y Kohn 1994, Lange y Blankenstein 1997) pero ha sido raramente observada en células HP humanas transducidas en humanos.

Métodos de transducción En el caso de la transducción con algunos vectores retrovirales murinos, puede ser necesario que las células HP humanas sean tratadas con factores de crecimiento para inducir el ciclo celular (véase arriba) . Este puede no ser el caso con otros vectores retrovirales después de cualquier tratamiento, las células necesitan ser puestas en contacto con un vector transductor. En el método de transducción de esta invención, es preferible usar la fibronectina de la proteína de la matriz extracelular (o fragmentos quimiotrípticos de la fibronectina) la cual mejora la colocalización de las células y partículas virales e incrementa las frecuencias de transducción (Hanenberg et al 1996, Hanenberg et al 1997, Kramer et al 1999, Williams et al 1999) , o de manera más preferible, el fragmento de fibronectina recombinante CH-296. Los fragmentos equivalentes que contienen el dominio de unión de heparina y también puede ser usada la región del segmento de conexión del tipo 3 alternativamente empalmado (Kiem et al 1998) . El uso de CH-296 también puede ayudar al mantenimiento del potencial regenerativo de las células HP como se muestra en un modelo del injerto de ratón (Dao et al 1998) . Se hizo uso de combinaciones de CH-296 y factor del crecimiento en un modelo canino (Goerner et al 1999) pero no se sabe como se aplicaría esto a humanos. También pueden ser usados otros agentes de colocalización como el polibreno y sulfato de protamina. Esos agentes actúan incrementando el título aparente de partículas virales. La colocalización física de las células y vectores también puede ser logrado sobre filtros membranales (Hutchings et al 1998) o por centrifugación en tubos recubiertos con fibronectina (Sanyal y Schuening 1999) . El cocultivo de células HP sobre monocapas de fibroblastos murinos productores de vector conduce a una transducción eficiente del gen pero no es clínicamente útil puesto que expondría a los pacientes a grandes números de células murinas infundidas (Halene y Kohn 2000) . En contraste, las células no diferenciadas mesenquimales humanas pueden proporcionar soporte estromal para la transducción eficiente de CD34+ (Reese et al 1999) . Pueden ser usados métodos libres de suero para preparar vectores retrovirales para la transducción de células HP humanas (por ejemplo Glimm et al 1998, Schílz et al 1998) . La frecuencia de transducción puede ser incrementada, particularmente para células CD3 ' CD38bajas , en presencia del fragmento de fibronectina reduciendo la concentración del medio que contiene el vector o precargando el vector solo sobre el fragmento de fibronectina (Relander et al 2001) . También puede lograse un incremento en la frecuencia de la transducción enriqueciendo las preparaciones de virus, por ejemplo con polímeros catiónicos y aniónicos (LeDoux et al 2001) . La transfección de células por medios no virales puede ser lograda mediante el uso de líposomas catiónicos, o complejos de ADN-proteína como complejos de poli-lisina-ADN, y otros medios conocidos en la técnica. Varios autores han revisado las condiciones para la transferencia genética en células hematopoyéticas humanas (Moore y MacKenzie 1999, Sadelain et al 2000) .

Frecuencia de la transducción La frecuencia de la transferencia de genes en células HP humanas puede ser determinada por métodos estándar, por ejemplo PCR o detección fluorescente (Gerard et al 1996) . Han sido obtenidas frecuencias de transducción de hasta el 70-100% con vectores retrovirales , pero esta fue para muestras de células relativamente pequeñas (Halene et al 1999) . El escalamiento a niveles clínicamente relevantes de material generalmente da como resultado frecuencias de transducción más bajas, particularmente para las células HP más primitivas que son necesarias para la reconstitución a largo plazo (por ejemplo en el intervalo de 1-5% sin agentes de colocalización} . Se ha sugerido que pueden obtenerse números mayores de células HP transducidas por expansión in vi tro. Sin embargo, esto puede conducir a pérdidas de totipotencia de las células y daño a las células no diferenciadas (Bunting et al 1999, Briones et al 1999, Takatoku et al 2001) . Se prefiere que la expansión in vitro sea mantenida en un mínimo, aunque algunas condiciones de cultivo permiten alguna expansión de las células HP sin pérdida de repoblación potencial (Kobari et al 2000, Lewis y Verfaillie 2000, Rosler et al 2000) . Por ejemplo, puede ser usada la combinación de citocinas Flt3-ligando, SCF y trombopoyetina (TPO) (Ng et al 2002) . La adición adicional de IL-3 e IL-6 no fue preferida (Herrera et al 2001) . De manera alternativa o adicional, el cultivo de las células después de la transducción con SCF únicamente durante dos días puede mejorar el potencial del injerto (Dunbar et al 2001) . El tratamiento para desactivar las células de la postransducción puede mejorar el potencial del injerto. La frecuencia de transducción de células HP humanas aisladas de sangre de cordón umbilical con vectores retrovirales se incrementó cuando la sangre del cordón fue criopreservada primero (Orlic et al 1999) . Las células HP humanas transducidas también pueden ser enriquecidas introduciendo genes marcadores como los que codifican para reporteros de la superficie celular (por ejemplo véase Fehse et al 1997) ; sin embargo este puede no ser deseable en un escenario clínico. Las frecuencias de transducción pueden ser medidas por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo por PCR, crecimiento de colonias en presencia de agentes selectivos como G418 cuando es incluido un marcador seleccionable en el constructo, o clasificación activada por fluorescencia. Se prefiere que la frecuencia de transducción sea medida sobre una muestra verdaderamente representativa de células de la población total, por ejemplo por medios de PCR cuantitativos (por ejemplo PCR en tiempo real) sobre el ADN total de una muestra de la población de células. El análisis de las frecuencias de transducción sobre colonias individuales producidas de células en la población no es el preferido, pero no se excluye. Hemos encontrado en esta invención que debe ser usado un número mínimo de células HP humanas transducidas para el injerto prolongado. Además, las células HP transducidas pueden ser capaces de experimentar timopoyesis para dar un aumento en los leucocitos multilinaje diferenciados.

Tipos de genes introducidos. Puede ser introducido cualquier gen por transducción en células HP humanas por esta invención. El gen puede ser usado para corregir deficiencias inmunes, incluyendo inmunodeficiencias combinadas severas . Por ejemplo, vectores que expresen el gen de la adenosina desaminasa, el RAGl, RAG2 o genes de recombinación/proceso de reparación del ADN que estén defectuosos en la Alinfocitosis tipo SCID, el gen CD45, o los genes ye, Jak3 , IL-7 Ra pueden todos ser usados (Cavazzana-Calvo 2001) . Pueden ser tratadas enfermedades como el almacenamiento lisosomal como la enfermedad de Gauchers, el trastorno de almacenamiento liposomal humano más prevaleciente. Pueden ser usados vectores que codifiquen para el gen de la glucocerebrosidasa (GC) como el vector retroviral MFG-GC (Takiyama et al 1998) para el tratamiento de la enfermedad de Gauchers (Dunbar et al 1998a, Dunbar et al 1998b) . La Enfermedad Granulomatosa Crónica (CGD) resulta de defectos en la NADPH oxidasa, una enzima de subunidades múltiples con cuatro componentes, y puede ser corregido con el gen apropiado, como el gen p47phox o el gen gp91phox. La deficiencia de glucosa-6-fosfato des idrogenasa , la cual es relativamente prevaleciente en humanos, puede ser tratada con el gen G6PD (Rovira et al 2000) . La anemia de Fanconi , la cual resulta de defectos en cualquiera de al menos ocho genes, puede ser corregida con el gen apropiado, por ejemplo, por el gen del grupo C de complementación (Liu et al 1999) . Las hemaglobinopatías pueden ser corregidas, como puede ser la trombastenia de Glanzmann (Wilcox et al 2000) , y la enfermedad de Fabry (Takenaka et al 2000) , cada una con un gen apropiado. Las células CD34+ pueden ser transducidas con genes mieloprotectores como el MDR-1 como parte del tratamiento de enfermedades malignas hematopoyéticas , incluyendo leucemias, mielomas y linfornas así como enfermedades malignas no hematopoyéticas donde los regímenes quimioterapéuticos darían como resultado mieloablasión (por ejemplo, Abonour et al 2000, Michallet et al 2000). Puede ser usado un acondicionamiento no mieloablativo en esos casos (Nagler et al 2000) . Si existe el potencial de efectos dañinos de expresión del gen sobre la función de células HP donde esto no sea deseable, la expresión del gen puede ser controlada por promotores regulables, bien comprendidos en la técnica. Deberá considerarse que la presencia de un gen externo expresado consecutivamente en células HP transducidas puede interferir con los procesos de migración, alojamiento y diferenciación de las células no diferenciadas . Una respuesta inmune dirigida a una proteína apropiada también puede conducir a la eliminación de células que contengan el gen. Esto ha sido observado después de la liberación del gen mediada por adenovirus pero normalmente no ocurre después de la liberación del gen mediada por retrovirus o la introducción de genes en células CD34+. Generalmente no son observadas reacciones inmunológicas al producto del neo gen. Nosotros hemos encontrado en esta invención que la introducción de un gen externo expresado constitutivamente en dos vectores retrovirales diferentes no interfirió con los procesos de migración, alojamiento y diferenciación de las células no diferenciadas. Además, se espera que el uso de células HP humanas como objetivo para la corrección de enfermedades genéticas sea ventajoso dado que el desarrollo de tolerancia inmunológica al producto transgénico puede ser inducido en esas células (Halene y Kohn 2000) . Además, se espera que productos de ARN del transgen como las ribozimas tengan inmunogenicidad despreciable. El gen RevMIO que codifica para una protexna anti-VIH no inhibió la diferenciación de células CD34+ humanas transducidas en ratones SCID (Su et al 1997, también Yu et al 1995) . Proteínas como IMFalfa han sido expresadas en células CD34+ sin afectar el injerto y diferenciación en ratones MOD/SCID (Quan et al 1999). Además, las células HP humanas pueden ser modificadas para proporcionarles una ventaja selectiva in vivo en ciertas circunstancias (por ejemplo Kirby et al 2000) o en presencia de agentes selectivos (Omori et al 1999, Ragg et al 2000) .

Ej emplos Ejemplo 1; Reactivos Todos los pasos se efectuaron asépticamente Gabinete de Seguridad Biológica Clase II. 1.1. Solución de ADNasa (10 mg/ml) . Se usó una solución de ADNasa patrón en la preparación del medio de criopreservación de CD34+. Se agregaron 1.4 mi de solución salina estéril (solución salina estéril para inhalación USP (0.9% de NaCl) , Dey Corp. NDC# 49502 830) para la ADNasa (ADNasa I Tipo US, Sigma Cat# D-4513) en un tubo de eppendorf tapado con rosca, estéril, de 1.5 mi (Sarstedt, Cat# 72692005) y se disolvió por agitación suave. Se almacenó a -20°C. Se usó 1 mi de ADNasa patrón por cada 50 mi de medio criopreservación . 1.2 Medio de Criopreservación de PBMC (90% de FBS + 10% de DMSO) Se usó medio de criopreservación de PBMC para la criopreservación de células PBMC para propósitos de archivo y de prueba de seguridad. El medio se constituyó para proporcionar la recuperación viable máxima de células PBMC tras descongelamiento. Este contenía 90% de Suero Bovino Fetal (StemCell Technologies, Cat# HCC-6450) y 10% de DMSO (Sigma Cat# D-2650) , se filtró en forma estéril y se almacenó en alícuotas de 4 mi. Una vez abierto, se reservó una alícuota para el uso exclusivo de un paciente. 1.3 Medio de Criopreservación de CD34+ Este fue usado para la criopreservación de células CD34+ para propósitos de pruebas de archivo y seguridad. El medio se constituyó para proporcionar la recuperación viable máxima de las células CD34+ tras el descongelamiento . Este procedimiento fue usado para la preparación de 50 mi de medio de criopreservación: Los siguientes fueron pipeteados en un tubo estéril de 50 mi, en este orden: 31 mi de IMDM (Medio de Dulbecco Modificado por Iscove, Gibco BRL, Cat 12440-046) . 10 mi de DMSO (Dimetil Sulfóxido; Sigma, Cat# D-2650) 8 mi de Albuminarc25MR (Albúmina de Suero Humano al 25% (HSA) ; American Red Cross, Cat# 451-0513) 15 µ? de solución de Heparina (10,000 U Heparina/ml ; Elkins- Sinn Inc.) 1 mi de solución patrón ADNasa (100 mg/ml) . Véase 1. Anteriormente. Los componentes fueron mezclados perfectamente por agitación. Para filtrar de manera estabilizada, una muestra fue filtrada por un sistema de filtración con Corning de 150 mi (Corning Cat# 25932-200) . Se almacenaron alícuotas de 4 mi de tubos de Nunc estériles de 5 mi a -20°C. Se usó un tubo por paciente (4 mi) para las muestras de archivo y las muestras de cocultivo. El medio de criopreservación fue descongelado y mantenido a 4°C hasta estar listo para usarse (El DMSO es tóxico a las células a temperaturas más altas) . 1.4 MGDF (Factor del Crecimiento y Desarrollo Megakariocito Pegilado Humano Recortíbinante 100 µg/ml) El factor de crecimiento y desarrollo Megakariocítico pegilado humano recombinante fue usado para cultivar células no diferencias para promover el crecimiento celular y la transducción retroviral . Este fue preparado y formado en alícuotas como una solución patrón de trabajo de 100 mg/ml y agregado al medio de cultivo de células no diferenciadas a una concentración final de 100 ng/ml. El contenido de un frasco de GDF (Amgen Inc., MGDF pegilado humano recombinante 500 mg/ml en 1 mi de acetato de sodio 10 mM con un contenido de sorbitol al 5%, pH 5) y algo de medio de cultivo IMDM (Medio de Dulbecco Modificado Iscove; Gibco BRL Cat#12440~046) donde se calentó a temperatura ambiente. Usando una técnica aséptica, se retiró 1 mi de solución de MGDF del frasco y se transfirió a un tubo estéril de 15 mi (tubo cónico de polipropileno; Corning Cat #25319-15 o Falcon Cat# 352097) . El MGDF fue diluido a un volumen final de 5 mi con 4 mi de IMDM para crear una solución patrón de trabajo de 100 mg/ml. Fueron transferidas alícuotas (1 mi) de solución patrón de trabajo a tubería microcentrífuga de tapa roscada estériles (Sarstedt Cat# 72692005) . Una vez preparada, la solución patrón de trabajo de MGDF tiene una vida de anaquel limitada de tres días. Las alícuotas de MGDF preparadas fueron almacenadas a 4-8°C hasta tres días sin congelamiento. Se preparó un lote de MGDF fresco por cada paciente el día de la preparación de la célula CD34+ (día 0 de cultivo) .

Por cada paciente, se prepararon alícuotas patrón de trabajo de MGDF de un frasco separado de material que fue desechado después de su uso. Se prepararon alícuotas suficientes para al menos cinco preparaciones de medio de cultivo celular individuales . 1.5 Factor Celular No Diferencial (Factor de Células no Diferenciadas Humanas con Metionilo Recombinantes 50 µg/ml) . El factor celular de las células no diferenciadas humanas con metionilos recombinantes fue usado en el medio de cultivo de células no diferenciadas para promover el crecimiento celular y la transducción retroviral . Este se preparó con una solución patrón de 50 mg/ml y se usó a una concentración final de 50 ng/ml. El frasco y el frasco con SCF (Amgen Inc., 1875 mg de SCF con metionilo humano recombinante liofilizado) y el medio de cultivo IMDM (Medio de Dulbecco Modificado por Iscove; Gibco BRL Cat# 12440-046) fueron calentados a temperatura ambiente. Usando una técnica aséptica, se extrajeron 1.25 mi de agua esterilizada a través de una aguja hacia una jeringa y se inyectaron en el frasco con SCF. El SCF fue reconstituido agitando sin sacudir. Usando una aguja y jeringa nuevas, se extrajeron 0.2 mi de la solución de SCF y se agregaron a 15 mi de un tubo cónico estéril que contenía 5.8 mi de IMDM. Esto constituyó 6 mi de una solución patrón de trabajo de 50 mg/ml. Usando una pipeta estéril de 5 mi, se transfirieron alícuotas de 1 mi de solución patrón de trabajo de SCF a tubos de microcentríf ga estériles. Las alícuotas de SCF preparadas fueron almacenadas a 4-8 °C durante hasta tres días sin congelamiento. El patrón de 50 mg/ml fue preparado fresco para cada paciente el día de la preparación de las células CD34+ (día 0 de cultivo) . Se usó un frasco de material separado para cada paciente. Cada alícuota fue de un solo uso únicamente para la preparación de medio de cultivo celular diariamente. 1.6 Nevirapina (5 mg/ml de Nevirapine-VirimmuneMR, 18.7 mM) La nevirapina (VirimmuneMR) fue usada para inhibir la reproducción del VIH en cultivos de células no diferenciadas CD34 durante el periodo del cultivo celular y la transducción retroviral - La nevirapina fue preparada y divididas en alícuotas como una solución patrón de 5 mg/ml (18.7 mM) y agregada al medio de cultivo celular a una concentración final de 500 mM. Se preparó un solo lote de patrón de trabajo de nevirapina para todo el ensayo clínico. Este patrón fue dividido en alícuotas para proporcionar tres frascos por paciente por cada día de preparación en medio de cultivo. Se pesaron aproximadamente 100 mg de polvo anhidro de Nevirapina (Boehringer Ingelheim. Mfr# 43074) en un tubo de 50 mi (Tubo de centrifuga de polipropileno estéril de 50 mi BluemaxWR; Falcon Cat# 2098) . Se agregó etanol (Alcohol Deshidratado Prueba 200 USP, Punctilious ; Quantum Chemical Corp) , al tubo para producir una solución de 5 mg/ml. Fueron transferidas alícuotas de 0.5 mi de solución patrón de trabajo de 5 mg/ml a tubos de microcentrífuga tapados con una tapa roscada, estéril, de 1.5 mi (Sarstedt Cat# 72692005) y se almacenó a -20°C. La solución patrón de Nevirapina fue descongelada a temperatura ambiente antes de su uso. Cada alícuota fue de un solo uso para la preparación de medio de cultivo celular diariamente. 1.7 Suero Bovino Fetal El suero bovino fetal fue un constituyente del medio de cultivo de CD34+ y se usó a una concentración del 20%. Los sobrenadantes virales usados para la transducción tuvieron 10% de FBS y por lo tanto fueron suplementados con 10% de FBS antes de usarse en la transducción de las células CD34. El FBS, proporcionado en botellas de 500 mi, fue dividido en alícuotas en volúmenes de 50 mi para minimizar el desperdicio. El suero (suero bovino fetal 500 mi; Stem Cell Technologies HCC-6450) fue descongelado en un baño de agua a 37°C, mezclado con agitación sin sacudir hasta estar visiblemente homogéneo y se dividió en alícuotas asépticamente en volúmenes de 50 mi en tubos de centrífuga de 50 mi (tubo de centrífuga de polipropileno estéril de 50 mi BluemaxMR; Falcon Cat# 2098) . Las alícuotas fueron almacenadas congeladas. Cada alícuota fue de un solo uso para la preparación del medio diariamente . 1.8 Preparación del medio de cultivo de CD34". Las células CD34+ asiladas hicieron crecer en este medio de cultivo durante al menos un día antes de la transducción . El medio fue diseñado para mantener una alta viabilidad de células progenitores. Este procedimiento es para la preparación de 500 mi de medio: Se pipetearon los siguientes en un embudo de filtración (matraz filtro de 0.45 µta con receptor de 500 mi; Nalgene cat# SFC 162-0045) en este orden: 400 mi de IMDM (Medio de Dulbecco Modificado por Iscove,-Gibco BRL, Cat # 12440-046) . 100 mi de FBS (Suero bovino fetal en 2 alícuotas de 50 mi de acuerdo a 1.2 anteriormente) 500 mi de SCF (véase 1.5 arriba) 500 mi de MGDF (véase 1.4 arriba) 13.3 mi de nevirapina (véase 1.6 arriba) Se aplicó vacío hasta que la mitad había pasado a su través, entonces el contenido se agitó suavemente para mezclar. La filtración fu completada y el contenido se agitó nuevamente.

El medio de cultivo de CD34+ se preparó fresco cuando se requirió. Este fue almacenado a temperatura ambiente en un ambiente protegido de la luz hasta aproximadamente 30 minutos antes de su uso, entonces se calentó a 37°C en un baño de agua. El medio en exceso de los requerimientos inmediatos fue marcado con el ID# de CRF del paciente y se almacenó a 4°C. Esto no fue usado para ningún otro paciente y se desechó cuando se completó el procedimiento de cultivo/transducción/cosecha celular del paciente. 1.9 Sulfato de Protamina La protamina facilita la unión del vector en el medio acondicionado viral a las células CD34+ objetivo. El sulfato de protamina de ampolletas (Elkin-Sinn, 5 mi, 10 mg/ml) fue divido en alícuotas para minimizar el desperdicio. Cada transducción de CD34+ usó dos alícuotas por paciente de modo que se distribuyeron alícuotas de aproximadamente 0.5 mi en 10 tubos de microcentrífuga tapados con tapa roscada estériles de 1.5 mi. Esos fueron almacenados a 4°C sin congelamiento. Un frasco fue usado cada día de la transducción (día l y día 2) para preparar la mezcla de transducción al VC . Las alícuotas fueron de un solo uso y se desecharon después de la preparación de VCM cada día. 1.10 Mezclas de transducción de VCM con sulfato de protamina .

Las células CD34+ cultivadas fueron transducidas con Medio Acondicionado con Virus (VCM) producido por Magenta Corporation (blOrELIANCE Corp.) bajo condiciones GMP. Existieron dos preparaciones "VCM correspondientes a la ribozima y vectores control . El VCM de PA317/RRz2 fue de un menor título que el VCM de PA317/LNL6, por lo tanto se usaron 300 mi de RRz2 o 200 mi de LWL6 por transducción para igualar los números de partículas virales infecciosas en cada transducción. La transducción procedió durante dos días consecutivos. Para producir las mezclas de transducción de VCM, cada VCM fue suplementado con factores de crecimiento y suero para igualar el medio de cultivo del primer día como sigue : El día 1, una botella de 200 mi de VCM de PA317/LNL6, dos botellas de 200 mi de PA317/RRz2 y 2 alícuotas de 30 mi de Suero Bovino fetal fueron descongeladas completamente a 37 °C en un baño de agua. Una alícuota de Nevirapina fue descongelada a temperatura ambiente y los otros reactivos calentados a temperatura ambiente: 1 alícuota de Sulfato de Protamina, 1 alícuota de SCF, 1 alícuota de MGDF. La preparación de la mezcla de LNL6 fue completada antes de comenzar la mezcla de RRz2. Para preparar el VCM de LNL6, se pipetearon los siguientes en un embudo filtro (matraz filtro de 0.45 mm de Walgene con receptor de 500 mi, Nalge SFCA 162-0045) en este orden: 20 mi de FBS (véase arriba) 88 mi de sulfato de protamina (véase más adelante) 220 mi de SCF (véase arriba) 220 mi de MGDF (véase arriba) 6 mi de nevirapina (véase arriba) 200 mi de PA317/LNL6 (PA317/LNLS-3 ; Magenta Corporation, título de 1.4xl07 ivp/ml) . El embudo fue agitado suavemente para mezclar y se le aplicó vacío para filtrar la mezcla. El VCM de RRz2 fue preparado de la misma forma excepto que se usaron los siguiente volúmenes: 30 mi de FBS 132 mi de sulfato de protamina 330 mi de SCF 330 mi de MGDF 9 mi de nevirapina 300 mi de' PA317/RRz2 (PA317/RRz2-17R' ; Magenta Corporation, título de 0.8X107 ivp/ml) Los 100 mi restantes de RRz2 VCM fueron marcados con el CRF# e inmediatamente congelados de nuevo a -80°C. Estos fueron usados al segundo día de la transducción . Se siguió el mismo procedimiento el Día 2 para la preparación de las segundas mezclas de transducción de VCM LNL6 y RRz2 excepto que se usó una botella de 200 mi de PA317/RRz2 y los 100 mi restantes del Día 1 fueron usados para la mezcla de RRz2. Cada mezcla de transduccion de VC fue preparada fresca cada día de la transduccion y almacenada en el gabinete de seguridad biológica hasta que las células CD34+ estuvieron listas para la transduccion. 1.11 Preparación de la Retronectin® (25 mg/ml de Retronectina en PBS) . Se usó una solución de Retronectin® (fragmento de fibronectina humana CH-296) para recubrir recipientes de cultivo tisular para facilitar la transduccion retroviral de células CD34+. Un frasco que contenía 2500 mg de Retronectin® liofilizada de Takara Shuzo Co. Ltd., código #T100B, ordenado de BioWhittaker, fue calentado a temperatura ambiente. Se le agregaron 2.5 mi de agua estéril, el material fue dísuelto agitando suavemente, removido con una jeringa con aguja. La mezcla fue filtrada a través de un filtro Millex (Millipore, cat # SLGV 013 OS) en un tubo de 50 mi (tubo de cultivo tisular de 50 mi, estéril; Falcon Cat# 2098) y diluida con 4 mi de PBS dividido en dos tubos de 50 mi y aforando a 100 mi de volumen total. Se removieron 200 mi para la prueba de endotoxina al mismo tiempo que el producto final, el resto fue almacenado a 4°C. Generalmente, el reactivo fue recubierto sobre los recipientes inmediatamente. 1.12 Preparación de HSA al 2% (Seroalbúmina Humana en PBS) . La HSA al 2% fue usada para bloquear los recipientes de cultivo tisular después de que fueron recubiertos con Retronectina. Esta se preparó asépticamente mezclando 8 mi de solución de HSA al 25% (Albumarc25MR) con 92 mi de PBS (libre de calcio y magnesio, lx; Virus Core Lab o JRH Biosciences Cat #59321-78p) . El reactivo fue usado generalmente de manera inmediata . 1.13 Recipientes recubiertos con Retronectina. Se usaron matraces recubiertos con Retronectina para algunos pacientes para transducir células CD34+ con vectores retrovirales . Se pipetearon 25 mi de solución de Retronectina (véase más arriba) en 4 matraces de 175 mi (matraces de plástico Bacteriales 175 cm2, con cierres ventilados de 0.2 µ?t?, Sarstedt 83.1812.502) y se dejaron reposar durante dos horas a temperatura ambiente. La solución fue removida de los matraces y se agregaron 25 mi de HSA al 2%. Después de 30 minutos adicionales a temperatura ambiente, la solución fue removida y los matraces lavados con 25 mi de IMDM (Medio de Dulbecco Modificado por Iscove; GIBCO BRL Cat #12440-046) . Los matraces fueron sellados en bolsas de plástico y almacenados a 4°C antes de usarse dentro de 2-3 días. 1.14 Mezclas de Transducción de VCM (usadas con Retronectina) . Cuando los matraces recubiertos con retronectina fueron usados para las transducciones, se omitió sulfato de protamina de las Mezclas de Transducción de VCM. Esas se prepararon en una forma similar a aquellas descritas en 1.10., anteriormente excepto que se usaron los siguientes volúmenes: Para la primera transducción en la mañana del día 2, se descongelaron 200 mi de alícuotas de preparación de virus en un baño de agua a 37°C, como lo fue la alícuota de FBS . Las Mezclas de Transducción de VCM LNL6 o RRz2 (con Retronectina) fueron preparadas agregando un embudo filtro (matraz filtro de C-45 µt? de Nalgene con un receptor de 250 mi, Nalge SFCA 162-0045) en este orden: 10 mi de FBS (véase arriba) 110 mi SCF (véase arriba) 110 mi MGDF (véase arriba) 3 mi de nevirapina (véase arriba) 100 mi de PA317/LNL6 o 100 mi de PA317/RRz2 (véase arriba) . Los componentes fueron mezclados agitando suavemente y esterilizados por filtración. La preparación de la mezcla de LNL6 fue completada antes de iniciar la mezcla de RRz2. Para una segunda transducción en la noche, se usaron los 100 mi restantes de PA317/LNL6 y 100 mi de PA317/RRz2 de la misma manera para preparar Mezclas de Transducción de VCM. Esas fueron almacenadas a temperatura ambiente hasta ser usadas. 1.15 Mezclas de transducción de VCM usadas con Retronectina (pacientes 8-10) . Las mezclas de transducción de VCM para los pacientes #8-10 fueron preparadas y usadas de la misma manera, excepto que los volúmenes usados en la preparación fueron duplicados. Se efectuaron tres rondas de transducción durante 2 dias, a saber en la noche del día 1, y en la mañana y tarde de día 2. 1.16 Amortiguador de Lavado de células CD34+ (PBS con Ca2+ y Mg2+ , + HSA al 1%) . Se usó amortiguador de lavado de CD34+ que contenía 1% (concentración final) de HSA para lavar las células antes de la infusión de las células CD34+ transducidas . Se usó 1L de amortiguador de lavado por paciente y se preparó fresco o varios días de anticipación . De una botella nueva de 1L de PBS, fueron removidos 40 mi de PBS con una pipeta estéril de 25 mi, de modo que se mantenían aproximadamente 960 mi. Se transfirieron asépticamente 40 mi de solución de HSA al 20% (Solución de HSA al 25%, Albumarc25MR) a la botella de PBS usando una jeringa de 50 mi con una aguja calibre 18 unida, y se mezcló bien agitando, sin sacudir. El amortiguador de lavado fue almacenado a 4°C y calentado a 37°C antes de su uso. Un lote de 1L fue para el uso exclusivo de un paciente y fue de un solo uso únicamente, cualquier residuo fue desechado. 1.17 Amortiguador de Infusión de CD34"1" (RPMI, libre de rojo de fenol, +5% de Seroalbúmina Humana) . El amortiguador de infusión CD34+ está diseñado para mantener la viabilidad de células CD34+ transducidas cosechadas hasta ser transfundidas. El RPMI estuvo libre de rojo de fenol cuando fue usado para la infusión directa en el paciente. Este contenía seroalbúmina humana a una concentración final del 5%. Se usaron 100 mi para la suspensión de cada lote de células cosechadas después el lavado. Este amortiguador puede ser producido fresco el día de la cosecha/infusión o puede ser preparado con varios días de anticipación. Usando una pipeta estéril de 25 mi, fueron transferidos 80 mi de RPMI libre de rojo de fenol (Libre de Rojo de Fenol, Gibco-BRL, Cat 118-030) a un tubo de centrífuga cónico de 250 mi. Se agregaron asépticamente 20 mi de solución de HSA al 25% (Albumarc25MR) , American Red Cross, usando una jeringa de 25 ce con una aguja calibre 21 unida. La mezcla fue agitada suavemente. Si el reactivo fue preparado de manera anticipada, este fue almacenado a 4°C, pero si fue preparado fresco el día de la cosecha, fue almacenado a temperatura ambiente hasta su uso. La mezcla fue precalentada a 37°C antes de su uso. Un lote de 100 mi fue para el uso exclusivo de un paciente y fue de un solo uso únicamente. 1.18 Preparación de PBS para FACS (PBS, libre de Ca2+ y Mg2+, + Suero de Bovino Fetal al 2% + NaN3 al 0.1%) . El PBS para FACS es un amortiguador de lavado que fue usado para lavar las células durante el procedimiento de tinción por FACS. Adicionalmente, si el análisis por FACS fue efectuado inmediatamente después de la tinción (es decir dentro de las siguientes 4-6 horas) este fue usado para resuspender las células teñidas . Se preparó una solución patrón de Azida (al 10%) disolviendo 4 g de azida de sodio en un tubo de 50 mi en agua destilada. La solución de PBS FACS fue preparada agregando a 48.5 mi de PBS, en un tubo de 50 mi, 1 mi de suero bovino fetal y 0.5 mi de la solución de azida de sodio. Las soluciones fueron almacenadas a 4°C. La solución patrón de azida tiene una vida de anaquel ilimitada, el PBS para FACS tiene una vida de anaquel de 1 año. El PBS para FACS se usó frío. 1.19 Preparación de Bloqueador de FACS (Suero AB Humano al 5% en PBS, libre de Ca2+ y Mg2+) . Este fue usado en la reacción de tinción de anticuerpo por FACS para reducir la tinción de fondo no específica de las células. Este contenía 5% de suero AB humano (Sigma cat #H-4522, almacenado a -20°C, descongelado a 37°C en un baño de agua) diluido en PBS estéril (libre de calcio y magnesio, lx Virus Core Lab o JRH Biosciences cat #59321-78P) . Este fue filtrado de manera estéril a través de un filtro de 0.45 µt? Acrodisc (Gelman #4184) y almacenado como alícuotas de 1 mi a -20°C . 1.20 Preparación de fijador de Paraformaldehído para FACS (PBS, libre de Ca y Mg, paraformaldehído al 2%) . El Paraformaldehído para FACS es una solución fijadora que preserva las células después de la tinción del anticuerpo para el análisis por FACS. Se usó a una concentración del 1% para resuspender células después de la tinción por PACS, la tinción del anticuerpo permanecerá estable hasta al menos 3 días . Después de este tiempo, la señal de fondo de los anticuerpos fluorescentes puede incrementarse. Esta contenía 10 mi de paraformaldehído al 10% (Polysciences #04018) mezclado con 40 mi de PBS y se almacenó a 4°C. Las células fueron suspendidas en 200 µ? de PBS y a continuación fijadas con 200 µ? de este amortiguador para crear una concentración de trabajo del 1%. 1.21 Amortiguador de Lisis de Urea El amortiguador de lisis de urea fue usado para preparar Usados celulares para la extracción con fenol del ADN. Este contenía 84 g de urea (Boehringer-Mannheim 1685 899), 4 g de SDS (USB 21651), 1 mi de EDTA a 0.2 M, 1 mi de base de Tris 1M, 1 mi de Tris HC1 1M, 14 mi de NaCl 5 en un volumen final de 200 mi en agua. Esta solución fue filtrada a través de un filtro de 0.45 µ y almacenada a temperatura ambiente .

EJEMPLO 2 : Ensayo Clínico en Fase I Efectuamos un estudio clínico de terapia genética de fase I para investigar si i) la introducción de una ribozima anti-VIH-1 en células hematopoyéticas progenitoras circulantes podría dar como resultado la emergencia de emigrantes tímicos que tuvieran secuencias de vector, ii) la maduración de linfocitos T normales podrá tomar lugar en células modificadas genéticamente, iii) la presencia y expresión del vector podría persistir a largo plazo y iv) la ribozima podría conferir una ventaja de sobrevivencia a las células vulnerables al VIH-1 (Amado et al. 1999) . Para la transducción de células con un gen de ribozima, se usó RRz2. El RRz2 codifica para la ribozima cabeza de martillo Rz2, la cual está dirigida contra una región altamente conservada del gen tat del gen del VIH-1. La secuencia de ADN que codifica para Rz2 fue subclonada en un Sitio Sal-I dentro de la región no traducida del gen de la neomicina fosfotransferasa (neoR) en pLNL6 (Bender et al 1987) para producir el RRz2. La ribozima es expresada como un transcripto de neo-ribozima de LTR de MoMLV en RRz2. Para controlar los efectos específicos de la ribozima potenciales sobre el injerto de células progenitoras y el desarrollo del linfoide T, y para estudiar los efectos potenciales sobre la sobrevivencia de los linfocitos T conferida por Rz2 , las células progenitoras también fueron transducidas con el vector retroviral de control LNLS . En este estudio, los pacientes infectados con VIH-1 con menos viremia de 10,000 copias/ml y conteos de CD4 de entre 300 y 700 células/mm3 fueron sometidos a movilización de células progenitoras sanguíneas periféricas (PBPC) con la citocina factor estimulante de la colonia de los granulositos (G-CSF) durante 6 días. Los pacientes recibieron factor estimulante de la colonia de los granulositos (G-CSF) subcutáneamente a una dosis de 10 µg/kg diariamente durante 6 días. La procuración de PBPC se llevó a cabo efectuando un volumen de sangre de aféresis los días 5 y 6 del tratamiento con G-CSF usando el sistema de Aféresis COBE® SpectraMR (Gambro BCT, Lakewood, CO) . La selección de las células CD34+ se efectuó usando el Sistema de Concentración de Células NO Diferenciadas CEPRATE® SC (CellPro Inc. Bot ell, WA) (pacientes 1 a 7) y sistemas de selección de células Isolex 300i (Nexell Therapeutics , Irvine, CA) (pacientes 8 a 10) . Después de la purificación de PBPC para la expresión del marcador superficial CD34, las células fueron cultivadas durante únicamente un día en Medio de Cultivo de CD34 para la inducción al ciclo usando la combinación de citocinas de factor' del crecimiento y desarrollo megacariocito (MGDF) y factor de células no diferenciadas (SCF) (Amado et al 199B) . El MGDF y el SCF fueron proporcionados por Amgen Inc. (Thousand Oaks, CA) y usados a una concentración de 100 ng/ml y 50 ng/ml, respectivamente . Aproximadamente, fueron transducidos números iguales de células CD34+ independientemente con los vectores de RRz2 y LNL6. Las líneas celulares productoras de LNL6 y RRz2 fueron preparadas en un proceso de dos etapas transíectando los constructores de ADNc, pLNL6 o p Rz2, en la linea celular empaquetadora psi2 para producir dos poblaciones de virus ecotrópico incompetente para la reproducción. Esas dos poblaciones fueron usadas entonces para infectar la línea de células empaquetadoras anfotrópicas PA317 (Miller y Buttimore 1986) . Las líneas celulares productoras clónales derivadas siguiendo la selección en G418, fueron verificadas por la integridad de los constructos y enviadas a BioReliance Corporation (Rockville, MD) para la manufactura de un banco de Células Maestras y la manufactura posterior de virus GMP con prueba de seguridad. Todos los lotes de sobrenadante retroviral (LNL6 y RRz2) fueron probados por su esterilidad, retrovirus competente para la reproducción y seguridad general por BioReliance Corporation. Los títulos ???-ales fueron confirmados infectando la línea celular NIH 3T3 usando diluciones en serie y calificando la resistencia a G418. Los títulos de LNL6 y RRz2 fueron de 1.4 x 107 y 0.8 x 107 partículas virales infecciosas/ml respectivamente. El sobrenadante retroviral (Mezcla de Transducción de VCM) fue agregado una vez al día durante dos días a los pacientes 1 a 3, dos veces al día para los pacientes 4-7, y 3 veces durante 2 días para los pacientes 8 a 10. Para los pacientes 4 a 10, las transducciones fueron efectuadas en un matraz recubierto con el fragmento CH296 de fibronectina humana (RetroNectinMR, Takara Shuzo, obtenida de BioWhittaker , Inc. Walkersville , MD) . Para inhibir la reproducción de VIH potencial in vi tro, se llevaron a cabo cultivos y transducciones de células CD34+ en presencia de Nevirapine a una concentración de 500 nM (Boehringer Ingelheim, Ridgefield, CT) . La ausencia de la reproducción de VIH fue verificada midiendo el antígeno p24 por ELISA en el infundido final (las 10 muestras tuvieron niveles de p24 indetectables) . Los cultivos fúngales, bacterianos y de micoplasma, así como los ensayos de detección de endotoxina fueron negativos en el producto celular final para los 10 pacientes . Después de la transducción, las células fueron reunidas, probadas para determinar su esterilidad, el conteo de células, viabilidad, fenotipo CD34/CD38, p24, y endotoxina, y a continuación lavadas e infundidas con pacientes receptores autólogos sin mielosupresión . Este esquema de tratamiento es ilustrado en la Figura 5. Las muestras fueron mantenidas a un lado para su prueba final en ensayos de CFC, análisis por RCR y análisis por PCR para la eficiencia de la transducción. Fueron enrolados diez pacientes en este estudio (Tabla 1) . La edad media fue de 42 años (intervalo de 32 a 59) . El número medio de regímenes antirretrovirales usados fue de 3 (intervalo de 1 a 6) . El número total de células CD34+ infundidas fluctuó de 1.3 a 10.1 X 106 células por kilogramo de peso corporal (kg) (media 3.2 +/- 1.1 X 106 células/kg) . La eficiencia de la transduccion para los primeros tres pacientes, llevada a cabo en presencia de sulfato de protamina, fue baja (intervalo de <1% a 4%) , contabilizando un número de células CD34+ transducidas infundidas que fluctúan de 0.01 a 0.08 X 10s células/kg (Tabla 1) . Las células que contenían el transgen fueron detectadas hasta 6 meses en el paciente 1 (ribozima en médula ósea y células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , LNL6 en granulositos) , hasta 9 meses en el paciente 2 (RRz2 en PBMC) y 12 meses en el paciente 3 (LNL6 en PBMC y RRz2 en monocitos) .

Tabla 1. Caracterxsticas de los pacientes y del producto de infusión de células CD34+. La Tabla muestra la edad del paciente, el género, número de regímenes antirretrovirales anteriores (ART) , el uso de retronectina para soportar la transduccion, la pureza de CD34+, el número de células CD34+ infundidas, porcentaje de transduccion, y el número de células CD34+ transducidas infundidas .

TABLA 1 Para mejorar la eficiencia de la transducción, se transduj eron células CD34+ autólogas recibidas de 7 pacientes subsecuentes en presencia del fragmento CH296 de fibronectina humana (Hanenberg et 1997; Hanenberg et al 1996) . En esos pacientes, la eficiencia de la transducción se incrementó a un nivel medio de 32% +/- 6.9 (intervalo del 7% al 57%) (Figura 6) . El cálculo de las eficiencias de la transducción se llevó a cabo efectuando PCR competitivas en células CD34+ transducidas (Knop et al 1999) . Las eficiencias también fueron determinadas efectuando PCR para secuencias de vector en colonias únicas que crecieron a partir del producto de células CD34+ transducidas final. En promedio, la eficiencia de la transducción para el LNL6 fue 1.6 veces mayor que la obtenida con RRz2 , probablemente reflejando diferencias en los títulos de vector. Después de un seguimiento medio de hasta 30 meses (intervalo de 12 a 36 meses) , fueron detectados transgenes en todos los pacientes en puntos en el tiempo múltiples y en linajes hematopoyéticos múltiples. En promedio, se encontró la presencia del gen en 0.1 a 0.01% de PBMC analizadas. La Figura 7 muestra la presencia del gen multilinaje a largo plazo en un paciente representativo. La Figura 7a muestra secuencias de vector de LWL6 y RRz2 en células monomio] eares de sangre periférica (PBMC) , células mononucleares de médula ósea (PBMC) , linfocitos T y monocitos en el paciente 5 dos años después de la infusión de células CD34+ transducidas. Los linfocitos T y los monocitos fueron seleccionados de PBMC a una pureza de > 90%, de acuerdo a lo confirmado por citometría de flujo. Para cada tipo de célula, se muestran cuatro replicas de un conjunto de muestras. También se analizó la expresión de los constructos genéticos en PBMC usando RT-PCR. Se preparó el ARN de PBMC seleccionadas por centrifugación por Ficoll-Hypaque de muestras de sangre, usando el equipo RNeasy de Qiagen (Valencia, California) , siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN residual fue removido por digestión con ADNasa. El ARN fue transcrito de manera inversa usando Transcriptasa Inversa Superscript de Gibco (Carlsbad, California) con 7 replicas de cada muestra. Las muestras fueron entonces reunidas, y se efectúo la amplificación del ADNc en 10 replicas. La PCR inicial en caliente de la Ronda 1 se efectúo usando perlas Promega Taq (Madison, WI) . La ronda 2 se efectúo usando Perkin Elmer Ampli ax gem (Boston, MA) . La Figura 7b muestra la expresión del vector a corto y largo plazo de ambos del LNL6 y el RRz2 en PBMC hasta 2 años después de la infusión en 3 pacientes representativos usando un cebador marcado radioactivamente. Por cada muestra, se incluyó una reacción que no contenía transcriptasa inversa (-RT) . Para determinar si las células CD34+ transducidas podrían experimentar desarrollo del linfocito T en pacientes infectados por VIH seleccionamos células CD4+ y CD8+ de sangre periférica por la expresión del marcador superficial CD45RA y CD62L, la cual caracteriza a los linfocitos T candidos (Sanders et al 1988; Tedder et 1985; Kansas 199S; Picker et al 1993), y analizamos esas subpoblaciones de linfocitos T por la presencia de LNL6 y RRz2.

Se efectúo un análisis por PCR semicuantitativo en subconjuntos de leucocitos usando cebadores dirigidos contra el gen neoR que se superpone a la secuencia de Rz2 en el vector RRz2. Para la detección por PCR, el ADN fue extraído de las poblaciones celulares usando el método de extracción de Polímero Acest ( ard et al 1938) . Se construyó un control de la relación de ADN diluyendo ADN de células CEM T4 transducidas con LNL6 y RRz2 a una relación de 1:5 (donde LNL6 =1) en un fondo de ADN de PBL (negativo) a una concentración de células marcadas de 0.005%. Entonces se efectuó una PCR anidada (inicio en caliente) en 50 µ? de mezcla de reacción de PCR. Los cebadores usados fueron 5L1A: CAC TCA TGA GAT GCC TGC AAG; 3L2A: GAG TTC TAC CGG CAG TGC ???; 5Nesl: GAT CCC CTC GCG AGT TGG TTC A (Ronda #1 de los Cebadores : 5Nesl y 3L2A:, Ronda #2: 3L2A y marcado: 5L1A) . Se incluyeron diez replicas por muestra de PCR de la ronda 1 de 17 ciclos de recocido a 68°C y desnaturalización a 94 °C. Las replicas de las muestras fueron entonces reunidas y usadas como patrón para la PCR de la ronda 2 de 35 ciclos con una temperatura de recocido de 68 °C y una temperatura de desnaturalización a 94 °C. Las muestras de productos cuádruples fueron resueltas sobre un gel de partes desnaturalizante al 5%, y cuantificadas usando los programas y sistemas de programación Molecular Dynamics Imagequant . Los productos de la PCR para el LNL6 y RRz2 fueron de 174 y 216 pares de bases, respectivamente, e incluyen una extensión del término no traducido del gen neoR. Los resultados fueron incluidos si la relación control se encontraba dentro de los límites aceptados (para una relación de 1:3.5 de LNL6:RRz2 en una muestra que contenía vector del 0.005%, el intervalo aceptado fue de 1:1.1 a 1:6.9) . La Figura 7c muestra la detección de secuencias de vector en linfocitos T Cándidos . El gel muestra análisis por PCR para las secuencias de vector de LNL6 y RRz2 en linfocitos T CD4+ y CD8+, y en subconjuntos de linfocitos T candidos seleccionados de sangre periférica en dos años del paciente 7 después de la infusión de células CD34* transducidas . Las poblaciones de linfocitos T candida fueron seleccionadas a una pureza de >90% de poblaciones seleccionadas CD4 y CD8. Los linfocitos T y los monocitos son seleccionados de PBMC usando microperlas MACS CD3 y CD14 (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) . Linfocitos T Cándidos fueron seleccionados tiñendo con anticuerpo anti-CD45RA IgGi monoclonal conjugado con FITC (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) seguido por selección usando un equipo Multisort anti-FITC (Miltenyi Biotec Inc., Auburn CA) . Posteriormente, se efectúo la selección de CD62L usando un anticuerpo anti-CD62L IgG2a murino (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) , seguida por la selección con microperlas IgGa+ anti-ratón de rata (Miltenyi Biotec Inc., Auburn, CA) . La Figura 7 (D) muestra secuencias de vector detectadas en subconjutos de células T candidas en el paciente 5 a los 2.5 años. La Figura 7 (E) muestra secuencias de vector detectadas en subconjutos de células T candidas en el paciente 7 a los 2 años . La Figura 7 (F) muestra secuencias de vector detectadas en subconjutos de células T candidas en el paciente 8 a las 4 semanas después de la infusión. La Figura 8 muestra un resumen de la detección de transgenes ribozima y vector de control por PCR semicuantitativa en células mononucleares de médula ósea (BMMC) , PBMC, granulositos , linfocitos T y monocitos en los 10 pacientes hasta 3 años después de la infusión. En los 10 pacientes, los ensayos biológicos para retrovirus competentes para una reproducción (RCR) al final de la transducción usando sobrenadante viral y células enriquecidas con CD34+ cultivadas fueron negativos . La prueba de RCR del infundido de células final fue efectuada al 5% del sobrenadante del cultivo al final de la transducción así como el 1% de las células CD34+ transducidas por cocultivo, usando un paso de amplificación de 2 pases en la línea células Mus dunni . Los sobrenadantes del cultivo de células Mus dunni resultantes fueron probados entonces por retrovirus infecciosos usando el ensayo enfocado con PG4 S+L- . Las muestras de PBMC del paciente analizadas por PCR para RCR 6 meses y 1 año después de la infusión de células CD34+ no reveló evidencias de RCR. Para la detección de RCR en las células del paciente, se analizó el ADN extraído de PBMC 6 meses y 1 año después de la infusión de células CD34+ transducidas para determinar la presencia de secuencias de envoltura anfotrópica usando los siguientes cebadores: 5'-CTA TGT GAT CTG GTC GGA GA-3' y 5'-CCA CAG GCA ACT TTA GAG CA-3'. El ensayo permite la detección de retrovirus competentes para la reproducción amplificando una reacción altamente conservada que codifica para parte de la región determinante del hospedero del gen de la envoltura, la cual se requiere para la infección de células a través del receptor anfotrópico. La región amplificada es de una longitud de 289 pares de bases. La sensibilidad del ensayo es una célula positiva en un fondo de 10s células negativas. Como un control positivo, se efectuó la línea celular empaquetadora PA317 en cada ensayo . Los productos de la PCR fueron resueltos sobre un gel NuSieve al 2.5%). Para ambos vectores, encontramos una fuerte correlación lineal entre el número de células CD34+ transducidas infundidas y la persistencia de la detección del gen a 2 años después de la infusión en PBMC (LNL6 p=0.021; RRz2 p=0.034) y linfocitos T (p<0.0001 para LNL6 y RRz2) . Se usó a correlación del rango de Spearman para cuantificar la relación entre el número de células transducidas reintroducidas y la marcación posterior de PBMC y linfocitos T de la progenie. Los análisis se basaron en valores dados en células/kg por cada paciente. En esos análisis, la marcación de LNL6 se correlacionó con la cantidad de células transducidas por LNL6 reintroducidas, y la marcación con RRz2 se correlacionó con la cantidad de células transducidas con RRz2 reintroducidas. El número mínimo de células CD34+ transducidas que dio como resultado una marcación mayor de 1 año fue de 0.5X106 células/kg. Se detectaron secuencias de vector en células candidas hasta 2.5 años después de la infusión (el último punto en el tiempo evaluado) . Por ejemplo, la Figura 7c muestra la presencia de secuencias de vector en células candidas altamente enriquecidas en un paciente representativo . Las secuencias de vector fueron detectadas en células Cándidas hasta 3 años después de la infusión (el último punto en el tiempo evaluado) . Las Figura 7D-F muestran secuencias de vector en células Cándidas y con memoria altamente enriquecidas de 4 a 130 semanas después de la infusión en tres pacientes. La edad promedio y carga viral de los pacientes cuyos linfocitos T Cándidos tuvieron secuencias de vector detectables fue de 41 años (intervalo de 32 a 48 años) y 3,680 copias/ml (intervalo: indetectable a 22,628 copias/ml) respectivamente. Un resumen de la detección del vector en linfocitos T candidos y la carga viral al momento de la detección se muestra en la Tabla 2. También analizamos aspirados con agujas finas de nodos linfáticos de 4 pacientes para la presencia de secuencias de vector. Fueron detectados ambos del LNL6 y RRz2 en 2 de los 4 pacientes (paciente 7 a los 2.5 años después de la infusión y paciente 10, 1 año después de la infusión) .

Tabla 2- Resumen de Detección del Vector de Células T Cándidas. Se seleccionaron poblaciones de linfocitos T candidos circulantes a una pureza de >85% de poblaciones seleccionadas CD4 y CD8. Las células fueron analizadas por PCR. La carga viral en el punto en el tiempo del análisis del vector se muestra bajo cada símbolo, ND : no determinada. Dos valores indican que están disponibles dos determinaciones para un intervalo de tiempo. NT: no probada; (+ ) : LNL6 , RRz2 o ambos vectores detectados en linfocitos T CD4+CD45+CD62L+ o CD8+CD45+CD62L+ (candidos) ; (-) : Ningún vector detectado en células T Cándidas CD4 ó CD8.

NUMERO DE <3 MESES DE 3 A 6 6-12 MESES 12-24 >24 MESES PACIENTE MESES MESES 1 NT NT + NT NT 660 2 NT NT + NT NT 12, 893 3 NT NT NT 782 ND 4 + NT + NT NT 590 22, 628 5 NT NT + + ++ 3 , 183 3 , 899 130/15,800 6 NT ++ NT 368/606 2, 905 7 + NT + + + 4,509 ND 12, 96 ND 8 + NT NT NT NT ND 9 + NT + + NT ND ND ND 10 NT + + + NT 925 1, 384 4, 562 Para determinar si la presencia de ribozima anti-VIH-l en células CD4+ confirió protección contra la infección por VIH, medimos los números de copias de vectores de LNL6 y RRz2 por PCR en diferentes tipos de células con el tiempo. Se implementaron comparaciones intraconstructo de la velocidad de decaimiento de la marca como regresión lineal de efecto mezclado ( iller, 1986) . La intensidad de la marcación se sometió a regresión en (a) (log) del tiempo desde la infusión, (b) un indicador del tipo de célula, y (c) un término de interacción tiempo x tipo de célula (producto multiplicativo) . Podrían ser efectuados análisis de modelos lineales mezclados para esos datos debido a que la estimación de los algoritmos convergió consistentemente (ajuste de modelos en SAS PROC MEZCLADOS) . La correlación intrasujeto de las intensidades de marcación fue modelada usando una estructura de bloqueo de "mediciones repetidas" para los datos. A través de esos análisis, ajustamos los modelos usando una matriz de varianza-covarianza no estructurada para residuos, o asumiendo una matriz simétrica compuesta. Emergieron estimados de parámetros sustancialmente idénticos y pruebas de significancia de cada tipo de análisis. Un nivel más sostenido de marcación con RRz2 en tipos de células vulnerables al VIH que en tipos de células no sometidas a agotamiento inducido por VIH es consistente con la protección inducida por Rz2 que proporciona una ventaja de sobrevivencia selectiva para células transducidas con RRz2. Como se muestra en la Figura 9a, la marcación con RRz2 decayó a aproximadamente un octavo de la tasa en linfocitos T de sangre periférica que en BMMC (-0.081 células por log- semana para los linfocitos T contra -0.643 células para BMMC por log-semana, diferencia p=0.0095) . A diferencia de la tasa o velocidad de decaimiento de BMMC que contiene Rz2 , la tasa o velocidad de decaimiento de linfocitos T que contenían RRz2 no fue significativamente diferente de cero, y la diferencia entre ambas tasas o velocidades fue significativa (p<0.0001 para BMMC, p=0.55 para linfocitos T, p=0.009 para la prueba estadística que compara las tasas de decaimiento de células que contienen RRz2 entre ambos tipos de células) . Para excluir la posibilidad de que esos resultados se deban a diferencias en la tasa de decaimiento intrínsecas entre los tipos de células, la marcación de LNL6 se muestra en la Figura 9b. Este análisis mostró una tasa de decaimiento de copias de LNL6 de -0.716 para los linfocitos T y -0.725 para BMMC. Ambas curvas fueron significativamente diferentes de una curva de tasa o velocidad de decaimiento de cero (valores de p 0.0019 y 0.004 para linfocitos T y médula ósea respectivamente) . El valor de p para la prueba estadística que compara las tasas o velocidades de decaimiento de RRz2 entre ambos tipos de células fue de 0.97 reflejando cinéticas de decaimiento casi idénticas para el vector de L L6. Esas comparaciones fueron implementadas como modelos de regresión de efecto mezclado (Mi11er 1986) . Consistente con la ausencia de actividad protectora con VIH conferido por LNL6, no se observó decaimiento diferencial para la marcación con LNL6 entre esos dos tipos de células (p=0.9781), (Figura 9b) . Esos resultados muestran que las diferencias estadísticamente significativas a las velocidades o tasas de decaimiento de la marcación los dos vectores fueron observados a favor de RRz2 en PBMC y linfocitos T, pero se observaron tasas o velocidades de decaimiento iguales entre los vectores en el caso de BBMC y granulositos .

Además, los linfocitos T candidos que contienen RRz2 se incrementaron con el tiempo, mientras que los que contienen LNL6 declinaron (+ 0.145 contra -0.240 por log semana para RRz2 y LNL6 respectivamente, diferencia p=0.033) . Esos resultados indican que RRz2 confiere una ventaja de sobrevivencia selectiva a células vulnerables al VIH, incluyendo los emigrantes tímicos recientes, en pacientes con infección por VIH-1. A continuación, buscamos determinar si la magnitud del decaimiento diferencial entre linfocitos T que contienen LNL6 y RRz2 fue correlacionada con el número de células CD34* transducidas con RRz2 que cada paciente recibió. Hasta este punto, la diferencia entre las pendientes de decaimiento entre ambos vectores para cada paciente se correlacionó con el número de células CD34+ transducidas con RRz2 que fueron infundidas . Las pendientes de decaimiento específicas del paciente para la marcación LNL6 y RRz2 fueron calculadas por regresión lineal, y la diferencia en las pendientes (RRz2-LNL6) fue tomada como un indicador de la protección mediada por RRz2. Se usó la correlación del rango de Spearman para examinar las relaciones entre las velocidades de decaimiento diferencial y los números de células CD34÷ transducidas e infundidas) . Las gráficas que describen esta relación para las pendientes de decaimiento de linfocitos T y PBMC se muestran en las Figuras 9c y d respectivamente. Esos análisis demuestran una fuerte relación lineal entre el número de células CD34+ transducidas que fueron infundidas en la magnitud del decaimiento diferencial de LNL6 contra RRz2 en PBMC y linfocitos T. Cuando los números de células CD34+ transducidas por RRz2 reinfundidas son tomados como una variable continua que predice el decaimiento diferencial de la marcación con el tiempo en un análisis de regresión, los resultado son estadísticamente significativos con p < 0.0001 (estadísticas con el coeficiente de regresión t para el término de interacción en una regresión de marcación diferencial (RRz2~LNL6) sobre (log) tiempo, número de células infundidas, y su interacción del término del producto) . Esos datos indican que existe un efecto dependiente de la dosis inesperado sobre la sobrevivencia diferencial entre células vulnerables al VIH-1 protegidas y no protegidas, y que el beneficio clínico usando las estrategias de terapia genética de células hematopoyéticas progenitoras dependerá de la dosis de progenitoras transducidas administradas a los pacientes. Todos los pacientes en esta estudio han estado recibiendo terapia antirretroviral y hasta la fecha, ninguno de los pacientes ha desarrollado infecciones oportunistas. La cinética del conteo de células CD4+ y la carga viral se ilustran en la Figura 10. Se observó un incremento inicial en la carga viral al día 1 después de la infusión en algunos pacientes quienes descontinuaron la terapia antirretrovial durante el periodo de movilización. La continuación o sustitución de fármacos de inhibidores de la transcriptasa inversa nucleotídicos para el inhibidor de la transcriptasa inversa no nucleotídico o inhibidor de proteasa fue incluida en el protocolo para evitar la inhibición potencial de la transcriptasa inversa de MMLV durante la transducción (H. Bazin, et al., 1989) . Los aumentos ocasionales en la viremia respondieron a modificaciones de la terapia antirretroviral . El cambio promedio en el conteo de linfocitos T CD4+ de entrada al año 3 fue un incremento de 10 células por mm3 (intervalo de -40 a +80) . La carga viral disminuyó en un promedio de 2.25 logs en 6 pacientes (intervalos de 0.35 a 3.9), permaneció indetectable en 3 pacientes, y se incrementó l log en un paciente. Esos cambios no se correlacionan con el grado o persistencia de detección del vector o expresión del vector en ningún tipo de célula, y se piensa que son influenciados por la susceptibilidad viral individual a la terapia antirretroviral . La genotipificación viral demostró mutaciones de resistencia a fármacos múltiples en todos los pacientes (no se muestran los datos) . También efectuamos análisis genotípicos de la región de unión/escisión Rz2 del VIH en todos los pacientes al entrar al estudio y a las 12, 24, 52 y 104 semanas. Después del tratamiento con ribozima se efectuó ei análisis del sitio de escisión como se describió anteriormente (Wang et al. 1998) con modificaciones menores. Brevemente, se extrajo el A N viral y se transcribió de manera inversa con un equipo de RT-PCR Access (Promega, Madison, WI) usando el Cebador 1 (TGGCAATGAAAGCAACACT) durante 45 minutos a 48°C. El ADNc resultante fue amplificado por PCR mediante la adición del Cebador 2 (TTTAGAGGAGCTTAAGAATGA) durante 25 ciclos (94°C durante 20 seg. , 55°C durante 30 seg, y 68°C durante 30 seg) . Se produjo ADN de una sola hebra para el secuenciamiento del ciclo por medio de un segundo paso de PCR usando AmpliTaq (Perkin-Elme ) y Cebador 3 (AGTTTTAGGCTGACTTCCTGG) durante 25 ciclos a 94°C durante 20 seg, 55°C durante 30 seg, y 68°C durante 30 seg. El secuenciamiento se efectuó sobre productos de PC purificados con el equipo de Reacción Listo para secuenciamiento del ciclo de terminación con tinte ABI P ISM con ADN polimerasa AmpliTaq (Perkin-Elmer) en un secuenciador de ADN automatizado (ABI Model 377, Applied Biosystems, Foster City, CA) usando Cebador 4 (TGGAAGCCATAATAAGAAT) . La alineación de las secuencias se efectuó con los programas y sistemas de programación Sequence Navigator (Perkin-Elmer) y se leyó y editó manualmente. La secuencia resultante fue comparada con la cepa de referencia de VIH- HXB2 clade B . Seis de los 10 pacientes tuvieron cargas virales que permitieron la determinación de la secuencia. Los pacientes 1, 2, 5 y 6 tuvieron secuencias naturales.

El paciente 4 tuvo una transición de A a C en la posición -1 del triplete objetivo GUA. El paciente 7 tuvo una transición de G a T en la posición -4 del triplete objetivo GUA. Las evidencias indican que esos ARN mutantes son eliminables por la ribozima. Las mutaciones detectadas en ambos de esos pacientes estuvieron presentes antes del tratamiento,- en consecuencia no se usaron como resultado de insistencia inducida por la eficacia al constructo. Los estudios descritos aquí fueron conducidos en ausencia de mielosupresión, por lo tanto las células CD34+ modificadas contribuyeron a formar un sistema hematopoyético quimérico. Las células CD34+ transducidas deben competir con células no diferenciadas endógenas por la reconstitución hematopoyética . En realidad esto resultados indican una correlación entre las dosis de células y la duración del injerto con células transducidas. Debido a que no se esperaba una ventaja de sobrevivencia al nivel de las células CD34+ transducidas, y dada la correlación establecida de sobrevivencia a los números de células CD34+ más infundidas, estudios futuros tendrán como propósito incrementar el número de células modificadas genéticamente administradas. Recientemente, se reportó que la corrección genética de la deficiencia del receptor de la citocina ye que caracteriza a la enfermedad de inmunodeficiencia combinada severa humana (SCID) -XI conduce al desarrollo de un sistema inmune funcional (Cavazzana-Calvo et al. 2000) . Con respecto a la aplicación de estrategias de corrección genética, el modelo de infección con VIH es diferente del modelo de SCID-X1. E diferencia del escenario del VIH/SIDA, donde ambas células CD34 transducidas y no transducidas pueden contribuir a la timopoyésis, en el caso de la SCID-X1, donde el receptor funcional resultante media las señales de sobrevivencia, la timopoyésis resulta únicamente de células CD34+ que contienen el gen exógeno . De este modo, en la infección por VIH, presumiblemente tomaría lugar la ventaja de sobrevivencia al nivel de los linfocitos T CD4÷ que da como resultado una expansión de esas células que contienen ribozima en presencia de reproducción de VIH. En este caso el virus proporciona a la presión de sobrevivencia selectiva, puesto que las células no protegidas seguirían siendo vulnerables . Esta hipótesis no fue probada en este estudio, puesto que nuestros pacientes habían permanecido en terapia antirretroviral . Es posible que pueda ocurrir un mayor grado de sobrevivencia preferencial en presencia de reproducción viral no controlada. Esos estudios han demostrado que los constructos pueden ser introducidos retroviralmente en células hematopoyéticas progenitoras CD34+, y que esas células contribuirán a la hematopoyesis multilinaje a largo plazo en pacientes infectados por VIH. Nuestro estudio representa el segundo reporte de un ensayo de terapia genética con células no diferenciadas en la infección por VIH. Un ensayo previo empleando un vector retroviral que contiene un gen decoy de elemento que responde a rev en pacientes pediátricos dio como resultado la detección del gen anti-VIII en 2 de 4 pacientes únicamente en una ocasión al día 1 después de la infusión celular. El vector control fue detectado a bajos niveles en los 4 pacientes a los 30 días, en 3 pacientes a 90 días y en 1 paciente a los 250 y 330 días después de la infusión (Kohn et al. 1999) . Esos resultados contrastan con nuestros resultados de reconstitución a largo plazo. Sobre la base de nuestros resultados, la marcación a corto plazo observada en el reporte anterior parece deberse al menos en parte a las bajas dosis de células CD34 transducidas administradas. Mientras que estudios de terapia genética para VIH anteriores usando linfocitos T transducidos han mostrado una persistencia más prolongada de un vector terapéutico en comparación con un vector control hasta un año después de la infusión (Ranga et al. 1998), el nuestro es el primer reporte que indica que el desarrollo de los linfocitos T sobrevive a largo plazo a partir de progenitores hematopoyéticos modificados genéticamente en el contexto de la infección por VIH, y que muestra evidencias de protección celular de linfocitos T Cándidos y con memoria contra el agotamiento inducido por VIH. El descubrimiento de que la producción sostenida de linfocitos T cándidos que contienen transgen ocurre aún en pacientes con viremia detectable es significativo, dado que se sabe que los timocitos Cándidos son infectados por VIH (Ostro ski et al. 1999) , y que el timo puede actuar como una fuente de latencia de VIH-1 durante la diferenciación de los linfocitos T (Brooks et al. 2001) . A medida que continúe la timopoyésis en el paciente adulto, el reemplazo de este conjunto latente basado en linfocitos T Cándidos con células que son modificadas para inhibir efectivamente la reproducción viral dará como resultado el restablecimiento de células inmunes protegidas y la inhibición del rebote viral después del retiro de la terapia antirretroviral , o después del desarrollo de resistencia al fármaco. La presencia de secuencias de ribozima en otros reservorios virales como los monocitos también podría contribuir a controlar la reproducción del virus en esos escenarios. Esos resultados justifican aún más la exploración de la transferencia de genes de células no diferenciadas anti-VIH como una forma de terapia anti-VIH.

Ejemplo 3: Métodos Específicos Usados 3.1 Ensayo de Micoplasma Después del cultivo y transducción, los cultivos celulares cosechados fueron probados para la determinación de micoplasma. El procedimiento usado se basó en la amplificación de una secuencia de ADN específica de micoplasma por PCR y la detección posterior del amplicon por ELISA. El procedimiento usó el equipo de prueba de ELISA por PCR para Micoplasma (Boehringer Mannheim, Cat#l 663 925) - Las muestras de prueba (1 muestra por donador) y una muestra control negativo (alícuota de 1 mi de medio de cultivo RPMI fresco que contenía 5% de seroalbúmina humana) fueron centrifugadas en tubos de microcentrífuga a una velocidad máxima durante 10 minutos a 4°C para sedimentar cualquier micoplasma. Para solubilizar el sedimento, se agregaron 10 µ? de agua estéril y 10 µ? de reactivo de Lisis (solución 1 del equipo) . Se llevó a cabo un procesamiento adicional de acuerdo a las instrucciones del equipo. Se evitó la contaminación cruzada de las muestras y reactivos en el procedimiento de PCR usando puntas para aerosol nuevas para todos los pasos de pipeteo. Cada experimento incluyó dos controles negativos y un control de ensayo positivo. La amplificación por PCR usó un ciclo de 5 min a 95°C, 39 ciclos de 30 segundos a 94°C; 30 segundos a 62°C; 1 minuto a 72°C, finalizando con 10 minutos a 72 °C. Después del paso de ELISA de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes, los controles negativos fueron aceptados si eran menores de 0.25 unidades de A45o-Ae9o, si no el ensayo fue repetido. Los controles de ensayo positivos fueron aceptados si eran mayores de 1.2 unidades de A450-A69o, si eran menores fueron repetidos. Las muestras fueron consideradas como positivas para contaminación por micoplasma si la absorbancia era de más de 0.2 unidades de 45o-AS9o mayores que los controles negativos . 3.2 Ensayo de endotoxina La presencia de endotoxina fue determinada en los cultivos celulares después del cultivo y la transducción por dos razones: la presencia de un bajo nivel de endotoxina en los cultivos seria una indicación de una contaminación previa posible por microorganismos Gram negativos, y en segundo lugar, los altos niveles de endotoxina son tóxicos a las células en cultivo. Este ensayo se llevó a cabo el día de la cosecha después de la transducción, antes de la infusión. El ensayo se llevó a cabo usando el equipo de Lisado de Amebocitos QCL-1000 Limulus (BioWhittaker #50-647U) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se preparó una solución de interrupción que consistía de ácido acético glacial al 25% puesto que esta no fue proporcionada con el equipo BioWhittaker. Un equipo fue suficiente para 5 cultivos de paciente. Los resultados fueron analizados con los programas y sistemas de programación Softmax. Si los resultados de la muestra de infusión diluida o muestra de VCM diluida eran mayores de 5 EU/ml, la infusión podría no haber procedido. Si los resultados de la muestra de infusión no diluida o la muestra de VCM no diluida eran mayores de 0.3 EU/ml, los resultados de la tinción de Gram fueron referidos a confirmación de una posible contaminación por bacterias en la bolsa de infusión. De otro modo se procedió con la infusión. 3.3 Tinción de Gram Se usó la tinción de Gram para probar bacterias Gram positivas y Gram negativas en cultivos celulares antes de la infusión. Se usaron portaobjetos de calidad controlada, los cuales tenían controles positivos y negativos incorporados (portaobjetos Fisherbrand Gramv QC cat #08-80) y el Dispositivo de Tinción de Gram de diagnóstico de Fisher (Cat #SG 100D) de acuerdo a las instrucciones de los fabricantes. Se dispersó una muestra de 5 µ? de cada mezcla de infusión uniformemente sobre los portaobjetos. Después de la tinción, los portaobjetos fueron examinados bajo un objetivo lOOx con aceite de inmersión. Los cuadros control en la primera columna marcados con "+", que contienen Staph. Aureus Gram positivo aparecieron como puntos redondos púrpura oscuro.

Los cuadros control en la primera columna marcados con "-" que contienen E. coli Gram negativa aparecieron como cilindros rojos-rosas. Si los controles no se vieron como éstos, se repitió la tinción. Si las muestras de infusión contenían cualesquier objetos que se vieran como los controles, la infusión no habría procedido. Las células cultivadas mostraron objetos relativamente largos y membranas celulares como filamentos delgados opacos. 3.4 Preparación de Muestras de Cocultivo y Amplificación para la Prueba de RCR.

Las células transducidas con retrovirus de paciente y el sobrenadante de cultivo celular transducido fueron probadas para retrovirus competente para la reproducción (RCR) . Por los requerimientos de la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA) de los Estados Unidos se probó 1% o 108 de las células de paciente transducidas totales (lo que fuera menor) por cada paciente en un ensayo de cocultivo de Mus dunni y se probó el 5% del sobrenadante de cultivo celular transducido en el ensayo de amplificación de Mus dunni. Esos ensayos fueron efectuados en BioReliance Corp., (anteriormente MA BioServices en Rockville, Maryland, EÜA) . Las muestras para esos ensayos fueron tomadas al momento de la cosecha celular y la preparación para la infusión y se almacenaron hasta que todos los procedimientos de transducción/cosecha del paciente fueron completados y entonces se transportaron para su prueba . Las muestras de RCR para la amplificación fueron preparadas para almacenarse como sigue. Se prepararon muestras de sobrenadante de las células CD34+ cosechadas finales por triplicado y consistieron de alícuotas de sobrenadante clarificado (5% del volumen total por tubo) . Ellas fueron almacenadas a -80°C hasta que ha sido recolectada la mezcla de amplificación de pacientes transducida final . Se prepararon muestras de cocultivo de RCR por duplicado para su almacenamiento, usando 2% de cada lote de célula CD34+ por muestra, y se resuspendieron en medios de criopreservación . Las muestras fueron entonces almacenadas en nitrógeno líquido hasta el momento del transporte . Fueron incluidas suficientes células para asegurar que el número correcto de células disponibles (1%) fuera logrado tras el descongelamiento de la muestra en BioReliance Corp. laboratories . 3.5 Aislamiento de Plasma/PB C/Médula Osea Se recolectaron muestras de sangre y muestras de médula ósea de pacientes antes de la selección para la infusión y a varios puntos en el tiempo hasta al menos 3 años después de la infusión. La sangre fue recolectada de tubos ACD de 10 mi, el volumen recolectado dependió de las pruebas requeridas. De esas muestras de sangre, fue recolectado el plasma y se preparó un PBMC como masas celulares o muestras criopreservadas . Las BMMC fueron preparadas a partir de médula ósea y usadas frescas para el ensayo de CFC y el resto se criopreservaron . Los procedimientos usados fueron los siguientes . Recolección de plasma: se centrifugaron tubos de sangre (10 mi, vacutainers ACD-A) durante 10 minutos a 2000 rpm. La fracción de plasma de cada tubo fue recolectada cuidadosamente y reunida en un tubo estéril de 50 mi. Se tomaron alícuotas de volúmenes de 2 mi de plasma y se almacenaron a -80°C. Preparación de PB C : usando la masa de células eritrocítica/leucocíticas después de la recolección del plasma, las células fueron diluidas a 3 veces el volumen de partida inicial con amortiguador de lavado y se distribuyeron en lotes de 30 mi en tubos de centrífuga de 50 mi. Cada suspensión celular diluida fue subcolocada con 10 mi de Ficoll-Paque (Pharmacia Cat#17-0849-03) y centrifugada a 2000 rpm durante 20 min a 20 °C en un rotor de paletas giratorio. La capa superior fue aspirada, dejando la capa de células mononucleares sin perturbación en ' la interfase. Las células de la interfase fueron transferidas a un nuevo tubo de 50 mi, reunidas si era apropiado, lavadas con amortiguador de lavado, centrifugadas a 1500 rpm durante 15 min, y la masa celular resuspendida en 5-10 mi de amortiguador de lavado. Se llevó a cavo un control de células viables sobre 50 mi de mezcla de células usando un hemacitómetro y Azul de Trypan (dilución 1:25) . Se tomaron alícuotas de las muestras 1-2 x 10s células por tubo y se almacenaron congeladas si se requería, y se lisaron con 140 µ? de amortiguador de lisis de Urea. Para la criopreservación, las células fueron resuspendidas a 1-5 x 106 células por mi en medio criopreservativo de PBMC y se enfriaron gradualmente en nitrógeno líquido para su almacenamiento.

Preparación de Células ononucleares de Médula Osea (BMMC) : Se diluyó medula ósea 1:1 con amortiguador de lavado, y se subcolocaron muestras de 30 mi con Ficoll-Paque y se trataron como anteriormente para PBMC. Los conteos de células viables se llevaron a cabo en 30 µ? de muestras y el volumen requerido para el ensayo de CFC (2.5-3 x 106 células) colocada a un lado para el ensayo. Todas las BMMC restantes fueron criopreservadas a 1 x 107 células por mi en el Medio de Criopreservación de CD34+. 3.6 Selección de la Muestra para el Ensayo CFU de Médula Osea Los ensayos de CFU se efectuaron en médula ósea de pacientes antes de la infusión, proporcionando por lo tanto una línea basal o control para todos los otros ensayos de colonia efectuados después de la infusión.

Puesto que las células no habían sido expuestas a un agente terapéutico genético o control, ellas no fueron seleccionadas sobre G418. Todos los procedimientos se efectuaron en una campana de vil contención y se aplicó una técnica aséptica en todo momento. Las BMMC preparadas como se describió anteriormente fueron divididas en alícuotas en tres tubos de microcentrífuga estériles de 1.5 mi a 1.5xl06 células, 7.5xl05 células, 3xl05 células por tubo. Las muestras fueron centrifugadas a 2500 rpm durante 2 min, el medio aspirado y las masas celulares suspendidas perfectamente en 300 µ? de RPMI (Gibco BRL, Cat # 118-030) + 1% de FBS (Stem Cell tecnologías, Cat# HCC-6450) . Las mezclas celulares fueron pipeteadas en tubos (de poliestireno de 6 mi Falcon, Cat#2058) cada una conteniendo 3 mi de Methocult 6FH4434 (Stem Cell Techologies , Cat# HCC-4434) . Los contenidos fueron agitados vorticialmente perfectamente durante al menos 15 segundos, dejándose en reposo hasta que las burbujas sedimentaran, y se recubrieron cuidadosamente alícuotas de 1.1 mi sobre discos en forma de rejilla (Nunc Cat# 174926) arreglados en una caja de petri . Las cajas de petri tenían un disco en forma de rejilla adicional que contenía agua estéril, abierto para mantener la humedad durante el cultivo. Las cajas de petri con las cajas en forma de rejilla fueron incubadas a 37°C en un incubador modificado y las colonias se observaron después de 10-14 días. 3.7 Ensayo de CFC Después de la Infusión El ensayo de Células Formadoras de Colonias (CFC) después de la infusión incluyeron cultivos con y sin G418. Este fue usado para evaluar el desarrollo de células progenitoras transducidas después de la infusión. Se usaron dos números/discos de células para asegurar que las colonias estuvieran a una densidad óptima cuando fueran retiradas . Las BMMC se prepararon como se describió anteriormente y se dividieron en alícuotas a 6xl05 o 1.5xl06 células en tubos de microcentrífuga estériles. Las células fueron centrifugadas a -2500 rpm durante 2 min. El medio fue aspirado y el sedimento celular resuspendido perfectamente en 600 µ? de RPMI + 1% de FBS . Se agregaron 300 µ? de cada mezcla celular a tubos que contenían 3 mi de Methocult GFH4434 (StemCell Technologies, Cat# HCC-4434) , uno +G418 a 0.9 mg/ml (G418, genticina cristalina, Gibco-BRL Cat# 11811-031) y otros sin -G418. Las muestras fueron entonces agitadas vorticialmente y tratadas adicionalmente como se describió anteriormente para la Selección de la Muestra en CFU en Médula Osea. 3.8 Preparación de Células T, Monocitos y granulositos de sangre. Se aislaron leucocitos de sangre de paciente en varios puntos en el tiempo después de la infección. Esas células fueron fraccionadas en tres tipos (los linajes de células T, macrófagos y granulositos) para seguir la presencia de RRz2 o LNL6 y niveles de VIH. La sangre fue separada primero en Polimorfos en el paso 1 en eritrocitos, granulositos y células mononucleares de sangre periférica {PBMC) . Las PBMC se fraccionaron además en dos columnas: una columna CD3 para producir linfocitos y una columna CD14 para producir monocitos . La fracción de granulositos fue evaluada por su pureza por tinción con Giemsa y las fracciones de linfocitos y monocitos fueron teñidas con FACS para evaluar la pureza. Todas las fracciones fueron tratadas para preparar lisados celulares para la extracción de ADN y análisis por PCR posteriores . Todos los procedimiento fueron efectuados en un gabinete Contención Biológica Clase II. 5 mi de sangre humana, fresca, anticoagulada con ACD en tubos de 10 mi, recolectada menos de 2 horas anteriormente y mantenida a temperatura ambiente, fueron colocados sobre 3.5 mi de polimorfos del paso 1 (Accurate Chemical & Scientific Corporation, Cat# AN221710, almacenado a temperatura ambiente y protegido contra la luz) . Los tubos fueron centrifugados a 1650 rpm durante 30 minutos a temperatura ambiente en un rotor de paletas giratorio. Después de la centrifugación, fueron visibles dos bandas de leucocitos. La banda superior en la interfaz plasma/Paso 1 consistió de células mononucleares y la banda inferior de células PMN (granulositos). Los eritrocitos son centrifugados. Todo excepto 1 mi de plasma fue aspirado y transferido a un tubo de "Plasma", dejando la capa de células mononucleares sin perturbación en la interfase . Todas las recolecciones de plasma fueron reunidas para cada paciente, divididas en alícuotas en lotes de 2 mi y conservadas para la preparación posterior de la tinción granulocítica . Las células de la interfase de P3MC fueron transferidas cuidadosamente a un tubo de "PBMC", teniendo cuidado de no retirar la banda inferior. Todas las recolecciones de PBMC fueron reunidas para cada paciente. La banda inferior fue transferida a un tubo de "granulositos" y reunida. Se agregó un volumen igual de PBS hipotónico al tubo de Granulocítos . Ambos tubos "PBMC" y "granulositos" fueron llenados con amortiguador de lavado hasta 50 mi, mezclados y centrifugados a 1500 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente . Un sobrenadante fue aspirado y las células lavadas una vez con 50 mi de amortiguador de lavado. Después de la centrifugación, las células fueron resuspendidas en 10 mi de PBS. Se efectuó un conteo celular (dilución 1:20 con suspensión celular de PBMC y 1:5 con suspensión de granulositos) . Preparación y fenotipificación de sedimento/lisado de células granulocíticas: la suspensión o sedimento celular original fue rcsuspendido a una concentración final de IxlO7 células/ml, si fue necesario recentrifugando las células primero. Se transfirieron 100 µ? a un tubo de microcentrífuga para la tinción del fenotipo. Esas células fueron centrifugadas en una microcentrífuga a -3000 rpm durante 1 minuto, suspendidas en 10 µ? de fracción de plasma, y 5 µ? de esta suspensión concentrada se esparcieron sobre cada uno de dos portaobjetos de microscopio. Los portaobjetos fueron secados al aire, teñidos con tinción de Giemsa durante 30 min, enjuagados con agua destilada y se dejaron secar al aire. Ellos fueron examinados bajo un objetivo de 20x y se contó la fracción de granulositos . El resto de las células granulocíticas fueron sedimentadas en una microcentrífuga a -3000 rpm durante 2 minutos para la extracción de ADN posterior. 3.9 Preparación de ADN de células (ADN Vacutainer-Fenoling) Se usaron Vacutainers (Hemogard, SerumSep, 6 mi. Cat# 369789) para algunas extracciones de ADN. Esta fue una forma rápida de extraer ADN genómico de células CD34+ seleccionadas, colonias de metilcelulosa, y PBMC pacientes. Se sedimentaron 1 ó 2 millones de células en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mi a 3000 rpm durante 3 minutos en la microcentrífuga, se lavaron una vez con un mi de PBS y a continuación se dispersaron en 70 µ? de agua. Se agregaron 140 µ? de Amortiguador de Lisis de Urea a cada tubo, y las fases se mezclaron perfectamente agitando vorticialmente los tubos de 5 a 8 veces. Esos tubos pueden ser conservados congelados a -70°C indefinidamente. Por cada muestra, se agregaron 0.5 mi de solución de fenol (Tris equilibrado de United States Biochemical # 20083, con 0.4 g de semisulfato de hidroxiquinolina agregados por 400 mi) y la mezcla se bombeo 2 ó 3 veces usando una jeringa de 1 mi con una aguja calibre 23 ó 25, a continuación se vertieron en un vacutainer que contenía 210 µ? de agua. Entonces se agregaron 15 µ? de cloroformo a cada vacutainer. Ellos fueron tapados, centrifugados a 2400 rpm durante 5 min, a continuación se agregaron 0.5 mi de fenol/cloroformo. Ellos fueron agitados durante 30 segundos y recentrifugados a 2000 rpm durante 3 min. Se repitió la extracción con fenol/cloroformo, seguido por dos extracciones con cloroformo/alcohol isoamílico. 400 µ? de extracto anterior fueron transferidos a un tubo de microcentrífuga con una punta resistente al aerosol, y el ADN precipitado con 25 µ? de NaCl 5M y 850 µ? de etanol absoluto a -20°C. El ADN fue recuperado por centrifugación, lavado una vez con etanol al 70%, secado al aire, y resuspendido en 50 µ? de agua o Tris 5 mM pH 9. Para las fracciones de PBMC o muestras de médula ósea, se usaron 20 µ? por cada 106 células. Las preparaciones de ADN fueron almacenadas a -70 °C. Para muestras de colonias, los 210 µ? de agua en los vacutainers contenían 10 µg de ARNT (Sigma R 9001) como portador.

También se preparó ADN de células usando el "Protocolo Acest" y se usó en ensayos de PCR competitivos y PCR-RCR. Las masas celulares de aproximadamente 5xl06 células en un tubo de microcentrífuga fueron resuspendidas en 300 µ? de amortiguador de lisis (Tris-HC1 a 10 mM, KC1 50 mM, CaCl2 a 3 niM, Tritón al 0.4% x 100, pH 8.0, esterilizado por filtración), se agregaron 3 µ? de PreTaq (Boehringer Mannheim Cat #1696491) , la muestra se hirvió durante 5 minutos y se centrifugó a 13000 rpm durante 2 min . El sobrenadante fue transferido a un tubo de 1.5 mi tapado con taparrosca limpia, se agregaron 100 µ? de amortiguador ACES (2.28 Aces (Sigma Cat. No. A-7949) , en 12.5 mi de NaOH 0.5 M, 12.5 mi de Tween 20, pH 6.8, en un volumen de 50 mi, esterilizado por filtración) y 25 µ? de polímero (Ward et al 1998) , la muestra se mezcló vorticialmente brevemente y a continuación se centrifugó durante 2 min a 13000 rpm. El sedimento fue resuspendido en 50 µ? de NaOH 20 mM y se dejó a temperatura ambiente hasta que se disolvió perfectamente. La muestra fue hervida durante 5 minutos y la concertración de ADN determinada midiendo la densidad óptica a 260 nm. Las extracciones de células después de la infusión se llevaron a cabo bajo contención de PC3 debido a la presencia de VIH. 3.10 PCR Para la detección de las secuencias de LNL6 o RRz2 en células o colonias de células, se llevó a cabo el análisis por PCR del ADN celular. Los cebadores del PCR fueron marcados con P32 para permitir la detección cuantitativa del producto de la PCR. La marcación se llevó a cabo con ?32?-??? (XCN #3502005) y Polinucleótido cinasa T4 (GIBCO-BRL Cat# 18004-010) por el procedimiento recomendado. El exceso de marca no incorporada fue removido usando columnas giratorias de G25 Sephadex. Se usó amortiguador lOx para PCR, que contenía Tris 250 mM, MgCl2 50 mM, NaCl 500 mM, dATP, dCTP, dGTP, TTP cada uno de 2.5 mM (Gibco BRL 10297-018), 1.0 mg/ml de BSA (Sigma A-4378, aforando a 100 mg/ml) , pH 8.0. Los estándares de ADN de pLNL6 y pRRz2 fueron diluidos en Tris 5 mM, pH 9 para dar 1, 000 y 100,000 copias por µ? usando ADN de hígado humano como portador y se diluyeron posteriormente para dar un intervalo de 5-5000 copias por 5 µ? de muestra. Para el análisis de la globulina beta humana, se produjeron estándares de ADN humano a partir de un patrón de 1 mg/ml para producir diluciones a 10,000, 3000, 1000, 300 y 100 copias de gen por µ? . "Copias superiores" de LNL6/RRz2 : Método usado para cuantificar niveles relativamente altos de LNL6 y RRz en preparaciones de ADN. Ese ADN fue derivado de células CD34 y colonias hematopoyéticas . En este protocolo las reacciones de PCR fueron de 25 µ? con no más de 104 copias del genoma humano. Los cebadores oligonucleotidicos fueron 5L1A, 3L1D, polimerasa Taq de Fisher. La amplificación se llevó a cabo durante 94 °C durante 3 minutos, 68 °C durante 1 minuto, seguida por 27 ciclos de 94 °C durante 1 minuto y 68 °C durante 1 minuto usando ur. Controlador Térmico Programable de MJ Research. También se trataron diez muestras estándar (control) , que contenían 5000, 1000, 500, 100, 50, 10, 5, 0, 0, y 0 copias de RRz2 y 0, 0, 0, 5, 10, 50, 100, 500, 1000, y 5000 copias de LNL6, respectivamente, todas en presencia de 5000 de genoma humano. "Copias inferiores" de LNL6/RRz2: Método usado para cuantificar niveles relativamente bajos de LNL6 y RRz en preparaciones de ADN. Ese ADN fue derivado de células de sangre periférica (linfocitos, macrófagos, y granulositos) . En este protocolo la reacción se llevó a cabo en muestras de 50 µ? con aproximadamente 106 copias del genoma humano. Se mezclaron 20 µ? de muestras de ADN con 30 µ? que contenían los cebadores 5L1A y 2L1D (uno marcado) , amortiguador y polimerasa, y se trataron como para las "Copias superiores", excepto que los pasos de 94°C fueron durante 90 segundos. Las muestras estándar fueron en presencia de 106 copias del genoma humano.

Las muestras amplificadas fueron analizadas sobre geles de poliacrilamida al 5% ó 6% por electroforesis usando amortiguador de Tris-Borato-EDTA (TBE lOx, borato de Tris 0.89M pH 8.3 + EDTA 20 mM) y la radioactividad en las bandas se cuantificó usando un AMBIS 4000 Radioimager . Como un estándar adicional, se cuantificó ADN de beta globulina en preparaciones de ADN donde el número de copias del genoma humano fue de =10000. Ese ADN fue derivado de células CD34+ y colonias hematopoyéticas , y PBMC, células T, y médula ósea del paciente. La amplificación se llevó a cabo usando cebadores oligonucleotidicos Lxl y LA2 , y 25 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 65 °C durante 2 minutos. También se usó un método de PCR radioactiva anidada para calcular la relación de marcación de LNL6:RRz2 donde menos de aproximadamente 0.01% de las células contienen cualquier constructo. Las dos rondas de PCR proporcionaron mayor sensibilidad y la incorporación de la marca radioactiva permitió fácilmente la cuantificación usando los programas y sistemas de programación Imagequant . Se usó una técnica de laboratorio meticulosa para evitar la contaminación cruzada y se llevaron a cabo controles apropiados. La primera ronda de PCR usó 1 µg de ADN patrón, los cebadores 5Nesl y 3L2A, Amortiguador II (Perkin Elmer Cat#N808-0010) con MgCl2 2mM, dNTP y ADN Polimerasa Taq (Perkin Elmer Cat #N801-0060) en volúmenes de 50 µ? con taqbeads (Perkin Elmer Cat #1?G808-0100) . La amplificación se llevó a cabo para diez réplicas de cada muestra en placas de PCR Thermofast 96 (Advances Biotechnologies , Cat #AB0600) usando 1 ciclo a 94°C, 17 ciclos de 30 seg/68°C y 30 sec/94°C, y enfriando a 4°C. Los productos de las diez réplicas fueron reunidos y se usaron 5 µ? de muestra reunida por cada segunda ronda de reacción de amplificación. La PCR de la segunda ronda usó el cebador marcado 5L1A y el cebador 3L2A bajo las mismas condiciones que la primera ronda, excepto que se llevaron a cabo 35 ciclos de amplificación. Los productos fueron analizados sobre geles de poliacrilamida . El producto de 216 pb correspondió al RRz2, el producto de 174 pb al LNL6. Paso 3 - Paso de Lavado #1 (preferiblemente en los días de la aféresis) . Las células reunidas son lavadas. Esto se hace por centrifugación celular o de manera más preferible usando un lavador de células automatizado, en un ejemplo este lavado de célula se efectúa usando un lavador Wexell CitoMate .

Paso 4 - Paso de Desmontaje (preferiblemente los días de la aféresis) .

En una modalidad, las células del procedimiento de la aféresis son "desmontadas" usando un sistema como el sistema Charter Medical DACS-SCMR. En la modalidad donde el producto es almacenado durante la noche desde el primer día para reunirlo con el producto del segundo día, los dos productos de la aféresis son desmontados el día de la recolección y el primer producto almacenado hasta que el segundo producto haya sido desmontado.

Paso 5 - Paso de Lavado #2 (preferiblemente el Día 6) . Las células son tomadas, reunidas (en la modalidad donde existen dos productos) y lavadas por centrifugación o usando un dispositivo Nexell CitoMate o similar. (Si existen más de dos productos todos serán reunidos en el último punto en el tiempo) .

Paso 6 - Selección de Células CD34+ (preferiblemente el día 6) Las células CD34+ son seleccionadas del producto después del lavado usando el Isolex 300i, Miltenyi o una estrategia de agotamiento del linaje de células que expresan marcadores (por ejemplo, glicoproteína A CD2 , CD3, CD14, CD16, CD19, CD24, CD56, CD66b, StemSep) . La fracción reunida enriquecida de CD34+ o células agotadas en linaje preferiblemente comprende al menos 40%, de manera más preferible al menos 60% y de manera más preferible al menos 80% de células de este tipo .

Paso 7 - Paso de Lavado #3 (preferiblemente el Día 6) Las células son lavadas por centrifugación o usando el Nexell CytoMate o equipo similar.

Paso 8 - Cultivo Celular (preferiblemente los Días 6-9) Las células son contadas y colocadas preferiblemente a lxlO5 a 5xl06 células/ml en matraces de cultivo celular, bolsas de cultivo celular o en una modalidad preferida en una bolsa de cultivo Nexell Lifecell X-Fold de 1,000 mi (390 cm2) o similar con medio de Dulbecco Modificado por Iscove más Suero Fetal Bovino al 10% (FBS) que contiene citocinas/factores del crecimiento. En una modalidad preferida esta mezcla de citocina/factor del crecimiento consiste del factor de células no diferenciadas (50 ng/ml) y Factor del Crecimiento y Desarrollo de Megacariocitos (100 ng/ml) . Los pasos 3-9 darán como resultado hasta 12xl07 células HP o más (de acuerdo a lo evaluado por la positividad CD34) por kg.

Paso 9 - Procedimiento de Transducción (preferiblemente el Día 8) Las células son cosechadas del primer matraz, la bolsa de cultivo tisular, incluyendo una modalidad preferida de una bolsa de Cultivo Lifecell o similar y usando el dispositivo Cytomate similar, resuspendidas en sobrenadante retroviral (un . ejemplo de éste es un alícuota de 200 mi) y transferidas a un segundo recipiente de cultivo tisular, un tipo del cual es la Bolsa de Cultivo Lifecell X-Fold la cual tiene un agente que facilita la transducción en el retrovirus. Estos agentes incluyen polibreno, sulfato de protamina, lípidos catiónicos o en una modalidad preferida, en un recipiente de cultivo tisular que ha sido prerrecubierto con RetroNectina a 1-4 mcg/cm2. Después de 4-10 horas o hasta 24 horas, el procedimiento de transferencia será repetido usando el CytoMate o similar,- para esta segunda transducción las células son transferidas a un nuevo recipiente de cultivo tisular (polibreno, sulfato de protamina) o regresadas al mismo recipiente o recubierto con RetroNectina similar del cual provienen. En una modalidad preferida, esto se hace en una alícuota fresca de sobrenadante retroviral y se cultiva durante la noche. En otras modalidades esto no se hace o repite varias veces durante periodos de tiempo similares. Se recolecta una alícuota de los sobrenadantes retrovirales para probar la esterilidad. Esto dará como resultado hasta 6x107 células HP que contienen gen o más (de acuerdo por lo evaluado por la positividad CD34) por kg. Este número es determiziado por un ensayo cuantitativo. La eficiencia de la transducción será de al menos 20%, y preferiblemente en el intervalo de 30-50%, y de manera más preferible, más del 50%.

Paso 10- Cosecha de Producto Celular (Preferiblemente el día 9) . La mañana del día 9, las células son cosechadas y lavadas usando una centrifuga celular estándar o sistemas automatizados como las muestras de Cytomate de cultivo celular. Esto producirá hasta 5.7xl07 células HP que contienen gen o más (de acuerdo con lo evaluado por la positividad en CD34) por kg . Paso 11- Producto de la Infusión (preferiblemente el Día 9) Las células son resuspendias en un amortiguador de infusión fisiológico que contiene 5% de seroalbúmina humana o similar como portador. Son removidas muestras en alícuotas para determinar la esterilidad (aeróbica, anaeróbica, fungal, micoplasma) . El producto de la infusión no es liberado hasta que estén disponibles los resultados de la prueba de endotoxina (LAL) y tinción de Gram. Paso 12- Infusión del Paciente (Preferiblemente el día 9) . La preparación de células CD34+ es administrada al paciente premedicado según sea apropiado. En una modalidad preferida, el paciente recibe una sola infusión de 0.5-6xl07 células CD34+ transducidas por kilogramo de peso corporal (célula/kg) en amortiguador de infusión fisiológico con un contenido de 5% por seroalbúmina humana o similar como portador. La dosis de células CD34+ transducidas por paciente dependerá de la eficiencia de cada paso de los procedimientos de movilización, aféresis, aislamiento, cultivo y transduccion . El número total de células CD34+ (transducidas o no transducidas) es determinado por conteo celular y citometría de flujo. Las células HP que contienen gen introducido da lugar a un sistema hematopoyétíco quimérico en el cual existe un porcentaje de células HP que contiene un gen en la médula ósea. En una modalidad preferida, para el tratamiento de VIH-SIDA, este porcentaje de células HP que contienen genes de al menos el 5%, de manera preferible mayor del 10%, y de manera más preferible, mayor del 20%.

Ejemplo 5. Uso de ARNi con capacidad de blancos múltiples para inhibir la reproducción de VIH-1 Se diseñó un constructo de ARNi con capacidad de blancos múltiples contra VIH-1 como sigue. Se produce un cásete que comprende 3 unidades de ARNi cada una de las cuales tiene segmentos de 19-25 nucleótidos correspondientes al VIH-1 en orientación sentido (1A, 2A, 3A) y orientación antisentido (IB, 2B, 3B) véase la Figura 14, de modo que IB, 2B y 3B sean complementarias en secuencia a 1?, 2A y 3A, respectivamente. Las secuencias 1A, 2A y 3? son seleccionadas como si estuvieran altamente conservadas en la mayoría de las cepas de VIH-1, por ejemplo la posición de las secuencias 5831-5849 (atggagccagtagatccta) , la posición de la secuencia 5852-5870 (ctagagccctggaagcatc) , y la posición de la secuencia 5971-5989 (tggcaggaagaagcggaga) en la cepa HXB2 o regiones correspondientes en otras cepas. Las secuencias fueron calculadas usando el servicio localizado en el siguiente sitio en la red mundial : http: //hiv-web. lanl . gov/content/hiv-db/NUM- HXB2/HXB2. Nuc ¦ html . Las secuencias 1A, 2A y 3A preferiblemente difieren en no más de un nucleótido en comparación con las secuencias correspondientes en la mayoría de las células de VIH-1. Cada una de la secuencias de 19 nucleótidos son conservadas razonablemente dentro del gen tat sobre muchos subtipos de VIH y muy bien conservadas en el subtipo B. Cada una de esas secuencias de 19 nucleótidos tiene no más de una desviación de un par de bases de la secuencia de consenso dentro del subtipo B. La primera secuencia incluye el objetivo para Rz2. Las diferencias cerca de los extremos de las secuencias pueden ser toleradas mejor. Las unidades ARNi están separadas por separadores los cuales pueden ser de 3-7 nucleótidos de longitud. Los separadores pueden ser más largos, por ejemplo comprender secuencias de intrón para ayudar a la localización citoplásmica de las unidades de ARNi. El cásete es flanqueado por secuencias de ribozima de autoescisión para permitir la liberación de moléculas de ARNi múltiples. Por ejemplo, el extremo 5' puede ser procesado por una ribozima cabeza de martillo donde el dominio catalítico es diseñado de acuerdo a la Patente Estadounidense No. 6,127,114, y el extremo 3' por una ribozima de horquilla autocatalítica diseñada de acuerdo a la Patente Estadounidense No. 5,856,188. Tal configuración proporciona extremos con bases apareadas (romos) para la molécula de ARNi sin nucleótidos extra, aunque esos pueden ser tolerados. La escisión autocatalítica ocurre en las posiciones flechadas (Figura 14) para liberar las tres moléculas que contienen ARNi. Los separadores 1/2 y 2/3 pueden comprender secuencias de escisión, por ejemplo secuencias escindibles de las ribozimas cabeza de martillo o de horquilla o unidades de ribozima adicionales, para permitir la separación de las unidades ARNi. Claramente, pueden ser usadas unidades de ARNi únicas o multímeros de hasta 6 o aún 10 unidades. El cásete es montado como una molécula de ADN a partir de oligonucleótidos recocidos traslapados e insertados en un vector plasmídico bajo el control de un promotor T7. Una cepa de E.coli deficiente en recombinación permite la reproducción estable de plásmidos con secuencias repetidas invertidas, como es bien comprendido en la técnica, es usada como hospedero de la clonación. Los separadores más largos (por ejemplo intrones) también ayudan a este respecto. La secuencia nucleotídica del inserto de ADN es confirmada por el secuenciamiento de ADN. Se usa ARN polimerasa T7 para transcribir el ADN in vitro en presencia de UTP marcado radiactivamente y la capacidad de autoescisión de las unidades de ribozima son ensayadas por electroforesis en los productos de la transcripción sobre geles de poliacrilamida y autorradiografía . La autoescisión ocurre a una eficiencia mayor del 90% durante la transcripción a 37°C durante 1 hora. La longitud y/o secuencia de los racimos y ciclos en los dominios de ribozima pueden ser ajustadas si la escisión es menos eficiente de lo deseado. El cásete es insertado en la forma plásmida de un vector retroviral como el pLNL6 bajo el control de un promotor dependiente de la ARN polimerasa II . De manera alternativa, puede ser usado un promotor dependiente de la ARN polimerasa III . El cásete es insertado en un sitio de restricción en el vector en la orientación apropiada.

El plásmido resultante es introducido en líneas de células empaquetadoras como la línea AM-12 y células transfectadas de manera estable usada para producir vector retroviral . La línea de células CemT4 o PBL son transducidas con el vector retroviral y la expresión del constructo de ARNi determinada por ensayos de protección con ARNasa o PCR de transcripción inversa, como es bien comprendido en la técnica. Se observa una protección significativa de las células transducidas después de la infección con cualquiera de las diferentes cepas de VIH-1. Se observa una reducción de producción de p24 de más de 90% en comparación con el control (vector sin cásete de ARNi), indicando una reproducción de VIH-1 reducida. Las células CD34+ son obtenidas de pacientes, transducidas con el vector retroviral en presencia de RetroNectina por métodos como se describió al principio en esta solicitud. Son administradas al menos 0.5 x 106 CD34+ células transducidas por kg (de peso del paciente) en una población de células total de más de 1.S3 x 106 de esas células CD34+ por kg a los pacientes por infusión. De manera preferible, son administradas más de 5 x 106 células CD34+ transducidas por kg. Esas células se injertan a la médula ósea de los pacientes y producen linfocitos T y macrófagos/monocitos protegidos durante más de 3 años después de la infusión. Esas células están relativamente protegidas contra la infección por VIH-1 y contribuyen a una función inmune mej orada .

Discusión concluyente El ensayo clínico descrito aquí, se mostró que la introducción de un gen para la expresión de un agente anti-VIH en células CD34+ ex vivo y la infusión de esas células en pacientes autólogos es técnicamente factible y segura. Se encontró la presencia y expresión del constructo de ribozima en células linfoides y mieloides de sangre periférica durante al menos 3 años . El grado de marcación celular varió en los 10 pacientes tratados en este estudio, y esto permitió las siguientes conclusiones. Se encontró que los parámetros relevantes al grado de marcación celular fueron - el porcentaje de transducción de células CD34+, el número de células CD34+ transducidas infundidas, y el número total de células CD34÷ infundidas. Se encontró que el número real de células transducidas es importante. Las células no transducidas podrían jugar un papel en la mejora de la sobrevivencia de las células transducidas en la sangre periférica y órganos como el hígado puesto que se alojan en el compartimiento de la médula ósea. El injerto prolongado de células hematopoyéticas CD34+ transducidas requirió una dosis mínima de 0.52 x 106 células transducidas en una población de células CD34+ total de al menos 1.63 x 106 células, en el contexto de la ausencia de preacondicionamiento mieloablativo . Existió una sobrevivencia preferencial de los linfocitos que contienen ribozimas sobre los linfocitos control, aún bajo niveles relativamente bajos de selección. El grado de sobrevivencia preferencial fue dependiente de las dosis de células CD34+, es decir, que se correlacionó positivamente con el número de células transducidas infundidas, lo cual fue inesperado. Es razonable esperar un grado aún mayor de sobrevivencia preferencial de linfocitos protegidos con ribozima a niveles mayores de selección, y un mayor beneficio terapéutico a dosis de células mayores . Esto proporciona las bases para una terapia genética efectiva de células hematopoyéticas para el tratamiento del SIDA/infección por VIH y muchas otras enfermedades . Esto proporciona conocimiento importante para asegurar una calidad efectiva y la evaluación del procedimiento en un escenario clínico.

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Claims

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una composición, caracterizada porque comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos 1.63 X 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal de un sujeto humano a quien va ser administrada la composición, al menos 0.52 X 106 de esas células hematopoyéticas CD34+ siendo transducidas con un constructo viral el cual expresa un agente anti-VIH. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterieada porque comprende al menos 9.37 X 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal de un sujeto humano, donde al menos 5 x 10s de esas células hematopoyéticas CD34+ son transducidas . 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente anti-VIH es un ARN. . La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente anti-VIH es una molécula de AR . 5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente anti-VIH es una molécula antisentido. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente anti-VIH es una ribozima. 7. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el agente anti-VIH es una ribozima que comprende nucleótidos que tienen la secuencia 5 ' -UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC-3' . 8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el constructo viral es un constructo retroviral . 9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición está sustancialvnente libre de citocinas. 10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición está sustancialmente libre de virus. 11. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque las células CD34+ transducidas pueden ser injertadas, y pueden dar lugar a células progenitoras durante al menos 12 meses, en el sujeto. 12. Una composición, caracterizada porque comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos 1.63 X 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal del sujeto a quien va ser administrada la composición, al menos 0.52 X 10s de esas células hematopoyéticas CD34÷ siendo transducidas con un constructo viral el cual expresa un agente anti-VIH, donde la composición es producida por un proceso que comprende los pasos de : (a) aislar las células hematopoyéticas CD34+ del sujeto; (b) cultivar las células hematopoyéticas CD34+ con al menos una citocina; (c) transducir las células hematopoyéticas CD34+ con el constructo viral que expresa el agente anti-VIH en presencia de un agente el cual mejora la colocalización de las células y el constructo viral; (d) lavar las células hematopoyéticas CD34+, y (e) mezclar las células hematopoyéticas CD34+ con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, para obtener por lo tanto la composición. 13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el cultivo del paso (b) es efectuado en presencia de al menos dos citocinas . 1 . La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el cultivo del paso (b) es efectuado en presencia de dos citocinas. 15. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la transducción de células del paso (c) es efectuado en presencia de un fragmento de fibronectina recombinante . 16. Una composición que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable de al menos 1.63 X 10e células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal del sujeto humano a quien va ser administrada la composición, al menos 0.52 X 106 de CD34+ de esas células hematopoyéticas CD34+ siendo transformadas con un gen de interés no encontrado en las células CD34+ antes de la transformación. 17. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque comprende al menos 9 X 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal del sujeto humano, donde al menos 5 X 106 células hematopoyéticas CD34+ son transducidas . 18. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el gen de interés expresa un agente de ARN. 19. La composición de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el sujeto es un adulto . 20. Una composición que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable de al menos 1.63 X 106 células hematopoyéticas CD34* por kg de peso corporal del sujeto humano a quien va ser administrada la composición, al menos 0.52 X 106 de CD34+ de esas células hematopoyéticas CD34+ siendo transformadas con un gen de interés no encontrado en las células CE34+ antes de la transformación, donde la composición es producida por un proceso que comprende los pasos de: (a) aislar las células hematopoyéticas CD34+ del suj eto ; (b) cultivar las células hematopoyéticas CD34+ con al menos una citocina; (c) transformar las células hematopoyéticas CD34+ con el vector que codifica para un gen de interés en presencia de un agente el cual mejora la colocalización de las células y el vector; (d) lavar las células hematopoyéticas CD34+, y (e) mezclar las células hematopoyéticas CD34+ con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, para obtener por lo tanto la composición. 21. Un método para insertar en células hematopoyéticas de un sujeto humano un gen de interés, caracterizado porque comprende: a) movilizar células hematopoyéticas progenitoras CD34+ en la sangre de un sujeto humano; b) aislar los leucocitos de la sangre del sujeto por aféresis; c) aislar las células hematopoyéticas CD34+ de los leucocitos aislados por un método inmunoselectivo; d) someter las células hematopoyéticas CD34+ del paso c) a un proceso de transducción con un gen de interés en presencia de un agente que colocaliza las células con un vector de la transducción; e) determinar el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso d) , y si el número total es de al menos 1.63 X 106 células por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces proceder al paso f) , y si el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso d) es menor de 1.63 X 10s células por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces efectuar al menos los pasos b)-d) y combinar las células hematopoyéticas CD34+; y f) proporcionar al sujeto las células hematopoyéticas CD34+, insertando por lo tanto en las células hematopoyéticas del sujeto humano un gen de interés. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el agente que colocaliza las células con un vector de transducción es un fragmento de fibronectina . 23. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el paso f) es efectuado sin mieloablasión . 24. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el paso de movilizar las células hematopoyétícas progenitoras en el sujeto es efectuado administrando al sujeto una cantidad de citocina suficiente para movilizar las células hematopoyéticas progenitoras. 25. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el paso de aislar los leucocitos de la sangre del sujeto, la aféresis es efectuada al menos dos veces . 26. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el paso de someter las células hematopoyéticas CD34+ a un proceso de transducción con un gen de interés es efectuado en presencia de un fragmento de fibronectina recombinante . 27. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque comprende además el paso de cultivar las células hematopoyéticas CD34+ aisladas en el paso c) en presencia de al menos dos citocinas . 28. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el sujeto humano es un sujeto humano adulto. 29. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el gen de interés codifica para un agente anti-VIH. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el agente anti-VIH es un ARN. 31. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el agente anti-VIH es una molécula antisentido. 32. El método de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque el agente anti-VIH es una ribozima. 33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque el agente anti-VIH es una ribozima que comprende nucleótidos que tienen la secuencia 5'-UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC-3 ' . 34. El método de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque en el paso e) , si el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso d) es menor de 1.63 x 10s células por kg de peso corporal del su eto humano, incluye entonces un paso de almacenar criogénicamente las células hematopoyéticas CD34+ del paso d) , repitiendo los pasos a) -d) , y combinando cualesquier células almacenadas criogénicamente con las células del paso d) . 35. Un método para insertar en células hematopoyéticas de un sujeto humano un gen de interés, caracterizado porque comprende: a) movilizar células progenitoras hematopoyéticas CD34+ hacia la sangre del sujeto; fc>) aislar los leucocitos de la sangre del sujeto por aféresis; c) aislar las células hematopoyéticas CD34+ de los leucocitos aislados por un método inmunoselectivo; d) determinar el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso c) , y si el número total es de al menos 1.63 X 105 células por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces proceder al paso e) , y si el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso c) es menor de 1.63 X 10s células por kg de peso corporal del sujeto humano, entonces efectuar los pasos b) -c) y combinar las células hematopoyéticas CD34+; e) someter las células hematopoyéticas CD34+ del paso c) a un proceso de transducción con un gen de interés en presencia de un agente que colocaliza las células con un vector de transducción; y f) proporcionar al sujeto las células hematopoyéticas CD34+, insertando por lo tanto en las células hematopoyéticas del sujeto humano un gen de interés. 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, caracterizado porque el agente que colocaliza las células con un vector de transducción es un fragmento de fibronectina . 37. Un método para insertar en células hematopoyéticas de un sujeto humano un gen que expresa una ribozima que comprende nucleótidos que tienen la secuencia 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3', caracterizado porque comprende: a) movilizar células hematopoyéticas progenitoras CD34+ en la sangre del sujeto administrando al sujeto una cantidad de una citocina suficiente para movilizar las células hematopoyéticas progenitoras; b) aislar los leucocitos de la sangre del sujeto por aféresis, la cual es efectuada al menos dos veces ; c) aislar las células hematopoyéticas CD34+ de los leucocitos aislados por un método inmunoselectivo; d) cultivar las células hematopoyéticas CD34+ aisladas del paso c) durante aproximadamente un día en un medio de cultivo en presencia de una citocina ,- e) someter las células hematopoyéticas CD34+ del paso d) a un proceso de transducción con un retrovirus que comprende un vector que da lugar en la célula a una ribozima que comprende nucleótidos que tienen la secuencia 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3 ' en presencia de un fragmento de fibronectina recombinante ; f) determinar el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso e) , y si el número total es al menos de 1.63 X 106 células por kg de peso corporal de un sujeto humano, entonces proceder al paso g) , y si el número total de células hematopoyéticas CD34+ después del paso e) es menor de 1.63 X 10s células por kg de peso corporal de un sujeto humano, entonces nuevamente efectuar los pasos b) -e) y combinar las células hematopoyéticas CD34+; y g) proporcionar al sujeto, sin mieloablasión, las células hematopoyéticas CD34+/ insertando por lo tanto las células hematopoyéticas de un sujeto humano un gen que expresa la ribozima . 38. Un método para preparar la composición de la reivindicación 1, caracterizado porque comprende: a) movilizar células hematopoyéticas CD34+ hacia la sangre del sujeto; b) aislar los leucocitos de la sangre del sujeto por aféresis; c) aislar las células hematopoyéticas CD34+ de los leucocitos aislados por un método inmunoselectivo ; d) someter las células hematopoyeticas CD34+ del paso c) a un proceso de transducción con un gen de interés en presencia de un agente que colocaliza las células con un vector de transducción; y e) determinar el número total de células hematopoyeticas CD34+ después del paso d) , y si el número total de células hematopoyéticas CD34+ después de paso d) es menor de 1.63 X 106 células por kg de peso corporal de un sujeto humano, entonces se efectúan nuevamente los pasos b) -d) y combinar las células hematopoyéticas CD34+. 39. El uso de una composición que comprende un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable y al menos 1.63 X 106 células hematopoyéticas CD34+ por kg de peso corporal de un sujeto humano a quien va ser administrada la composición, al menos 0.52 X 106 CD34+ de esas células por kg siendo transducidas con un constructo viral el cual expresa un agente anti-VIH, para la manufactura de un medicamento para el tratamiento del sujeto humano infectado con VIH. 40. Un equipo, caracterizado porque comprende elementos para usarse para llevar a cabo el método de conformidad con la reivindicación 35. 41. Un equipo, caracterizado porque comprende a) una cantidad de un agente capaz de movilizar células hematopoyéticas progenitoras en un sujeto humano; b) un medio de cultivo que incluye al menos una citocina aceptable para cultivar células hematopoyéticas CD3 +; c) un vector retroviral que comprende nucleótidos que tiene una secuencia que en una célula da lugar a una ribozima que tiene la secuencia 5' - UUA GGA UCC UGA UGA GUC CGU GAG GAC GAA ACU GGC UCC - 3 ' ; y d) recipientes de cultivo tisular recubiertos en su interior con un fragmento de fibronectina recombinante . 42. Un paquete caracterizado porque comprende el equipo de conformidad con la reivindicación 41, e instrucciones para el uso del equipo.