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KR20200089289A - 비골수제거 골수 재건을 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

비골수제거 골수 재건을 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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KR20200089289A
KR20200089289A KR1020207016902A KR20207016902A KR20200089289A KR 20200089289 A KR20200089289 A KR 20200089289A KR 1020207016902 A KR1020207016902 A KR 1020207016902A KR 20207016902 A KR20207016902 A KR 20207016902A KR 20200089289 A KR20200089289 A KR 20200089289A
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South Korea
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cells
cell
hiv
expression
vector
Prior art date
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Application number
KR1020207016902A
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English (en)
Inventor
세르하트 검룩크
Original Assignee
위어드 사이언스 엘엘씨
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 위어드 사이언스 엘엘씨 filed Critical 위어드 사이언스 엘엘씨
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Abstract

본원은 비골수제거성 화학요법제 및 화학요법 저항성의 세포를 사용하는 골수 이식을 실행하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본원에 기술된 방법 및 조성물을 사용하여 환자의 골수가 재건될 수 있고 그리고 환자가 골수제거를 포함하는 유해한 부작용 및/또는 면역계 손상을 피한다.

Description

비골수제거 골수 재건을 위한 방법 및 조성물
관련된 출원과의 상호 참조
본 출원은 2017년 11월 15일에 출원된 미국 가특허출원번호 제62/586,813호의 우선권을 주장하고, 이는 전체가 본원에 참조로서 포함된다.
기술분야
본원은 HIV, 암(예를 들어 혈액암) 등과 같은 다양한 질병의 치료하는 도중을 포함하여 비골수제거 골수 이식을 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 본원에 제공된 일부 구체예는 환자의 골수 내에 생착되고 그리고 통상적인 골수 이식 중에 경험하게 되는 유해한 부작용 없이 골수 재건을 가능하게 하는 변형 줄기세포이다. 상기 세포는 본질적으로 치료적일 수 있는 관심 단백질을 발현하기 위해 사용될 수도 있다.
골수 이식(Bone marrow transplantation: BMT)은 손상되거나 파괴된 골수를 환자(자가) 또는 다른 사람(동종이형)으로부터 분리된 건강한 골수 줄기세포로 대체하는 시술이다. BMT는 벽혈병 뿐만 아니라, 중증 재생불량 빈혈, 림프종, 다발골수종, 면역결핍증 및 일부 고형 종양 암을 포함하는 다른 많은 질병 또한 치료하는 데 사용되어 왔다.
골수제거 BMT는 환자에게 골수에 있는 세포(정상 및 비정상 모두)를 죽이기 위한 처치 먼저 하고, 뒤이어 건강한 골수세포를 주입하는 것을 수반한다. 첫 단계에 있어서, 세포를 죽이기 위해 고용량의 화학요법 및/또는 방사선을 필요로 하고, 뒤이어 동종이형 또는 자가 세포가 도입된다. 환자의 골수를 제거하는 이 과정은 골수제거(myeloablation)로 지칭된다. 이 과정이 건강하지 못한 세포 뿐만 아니라, 건강한 면역세포 및 줄기세포 또한 죽이기 때문에, 환자는 감염에 굉장히 취약하고 그리고 흔히 다수의 항생제를 복용해야하고 그리고 무균 환경 속에 머물러야 한다. 골수가 재건되기 전까지 환자는 감염의 위험성이 큰 상태이고, 회복 기간은 6개월까지 지속된다. 이 기간 동안은 합병증이 발생할 경우를 대비하여 환자가 치료받는 병원 또는 클리닉 근처에 머무르는 것을 권한다. 급성 독성에 더하여, 골수제거 화학요법은 백내장, 성장 지연, 심장독성, 및 내분비 및 생식기 문제를 포함하는 다른 많은 부작용과 연관되어 왔다. 어린 환자들은 특히 이러한 부작용들에 취약하다. 그에 따라 BMT를 시행하기 위한 새로운 조성물 및 방법이 필요한 실정이다. 본원은 이러한 필요성 뿐만 아니라 다른 필요성 또한 충족시킨다.
도 1은 EGFP("대조 벡터")를 발현하는 렌티바이러스성 벡터로 형질도입된 골수세포 또는 EGFP+ALDH1A1("시험 벡터", SEQ ID NO: 2, 도 4)을 발현하는 렌티바이러스성 벡터로 형질도입된 골수세포가 투여되고 그리고 매일 표시된 농도의 복강내(i.p.) 시클로포스파미드(CTX)로 치료한 쥐의 말초 혈액에 있는 살아있는 GFP(녹색 형광 단백질) 양성(GFP+) 과립구의 퍼센트를 도시한다. 연구의 23, 35, 및 42일(이는 각자 CTX 투여의 16, 28, 및 35일에 해당한다)에 안구 뒤(retroorbital) 채혈로 채취되었고 그리고 말초 혈액에 있는 살아있는 GFP+ 과립구의 퍼센트가 유동 세포 분석법으로 분석되었다. 각 이식 후 CTX 없음 치료군에 대해서 n=3이고, 모든 나머지 군에 대해서는 n=6이다.
도 2a 및 도 2b는 대조 벡터로 형질주입된 골수세포 또는 시험 벡터로 형질주입된 골수세포가 투여되고 그리고 매일 표시된 농도의 CTX의 요법(regimen)을 받은 생쥐에 있어서 유동 세포 분석법으로 분석된 골수에 있는 GFP+ 과립구의 퍼센트를 도시한다. 각 이식 후 CTX 없음 치료군에 대해서 n=3이고, 모든 나머지 군에 대해서는 n=6이다. 도 2a는 % 총 (죽은 그리고 살아있는) GFP+ 세포를 도시하고, 도 2b는 % 살아있는 GFP+ 과립구를 도시한다.
도 3은 대조 벡터로 형질주입된 골수세포 또는 시험 벡터로 형질주입된 골수세포가 투여되고 그리고 매일 표시된 농도의 CTX의 요법을 받은 생쥐의 백혈구(WBC) 수를 도시한다. 각 이식 후 CTX 없음 치료군에 대해서 n=3이고, 모든 나머지 군에 대해서는 n=5이다.
도 4는 본원의 한 구체예에 따른 렌티바이러스성 벡터의 비제한적인 도식을 도시한다.
도 5는 본원의 한 구체예에 따른 렌티바이러스성 벡터의 비제한적인 도식을 도시한다.
도 6은 본원의 한 구체예에 따른 렌티바이러스성 벡터의 비제한적인 도식을 도시한다.
도 7은 투여량 범위 및 렌티바이러스성 벡터 효능 연구를 위한 연구 설계의 비제한적인 도식을 도시한다.
도 8은 shRNA 넉다운(knockdown) 연구의 렌티바이러스성 벡터 발현 및 효능을 위한 연구 설계의 비제한적인 도식을 도시한다.
도 9는 본원의 한 구체예에 따른 HIV에 다중저항성(multi-resistance)을 가지고 그리고 CTX에 화학 저항(chemoresistance)을 갖는 세포를 HIV+ 환자에게 이식하기 위한 연구 설계의 비제한적인 도식을 도시한다.
도 10은 HIV에 다중저항성을 가지고 그리고 CTX에 화학 저항을 갖는 세포를 환자에게 이식한 후 매일 CTX로 HIV+ 환자를 치료하는 연구 설계의 비제한적인 도식을 도시한다. 동일한 연구가 HIV를 예방하기 위해 HIV- 대상에게 실시될 수 있는 것으로 고려된다.
도 11은 본원의 한 구체예에 따른 렌티바이러스성 벡터의 비제한적인 도식을 도시한다.
도 12는 본원의 한 구체예에 따른 렌티바이러스성 벡터의 비제한적인 도식을 도시한다.
항상 명백하게 명시되어 있지는 않지만 모든 지정값은 용어 "약(about)"이 앞에 있는 것으로 이해해야 한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 수치가 근사치이고 그리고 작은 차이가 개시된 구체예의 실행에 유의하게 영향을 미치지 않을 것이라는 것을 의미한다.
본원 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같이, 문맥이 명확하게 달리 명시되어 있지 않은 한 단수형 관사는 복수의 지칭물을 포함한다는 것에 주의해야 한다. 따라서, 예를 들어, "한 세포(a cell)"에의 언급은 복수의 세포를 포함한다.
정의
본원에 사용된 바와 같이 다음의 용어들은 다음의 의미를 갖는다.
범위를 포함하여 지정값, 예를 들어 온도, 시간, 양, 농도 등과 같은 것 전에 사용되었을 때 용어 "약"은 ( + ) 또는 ( - ) 20%, 10%, 5% 또는 1%의 차이가 있을 수 있는 근사치를 나타낸다.
또한 본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 관련된 목록의 항목 하나 이상의 어느 그리고 모든 가능한 조합에 더하여, 대안("또는")으로 해석되었을 경우에 조합의 결여 또한 나타내고 그리고 포함한다.
용어 "투여하다", "투여" 등은 대상에 물질(예를 들어 세포)을 도입하는 것을 의미한다. 일반적으로 효과적인 양이 투여되고, 이 양은 치료 담당 의사 또는 그와 같은 사람이 결정할 수 있다. 예를 들어 국소, 피하, 복강내, 정맥내, 동맥내, 흡입, 질내, 직장, 비강내, 경구, 볼점막, 뇌척수액 내로 도입, 또는 신체 구획(body compartments) 내로의 점적주입과 같은 어느 경로의 투여라도 사용될 수 있다. 조성물과 관련되어 사용될 때 용어 및 표현 "투여하다" 및 "~의 투여"(그리고 문법상 균등물)는 전문 의료진이 환자에게 투여하거나 또는 환자가 자가투여하는 것일 수 있는 직접적인 투여, 그리고/또는 약을 처방하는 행위일 수 있는 간접적인 투여 모두를 의미한다. 예를 들어 환자에게 물질(예를 들어 세포)을 자가 투여하라고 지시하고 그리고/또는 환자에게 약의 처방전을 제공하는 의사는 환자에게 물질을 투여하는 것이다. "정기적 투여" 또는 "정기적으로 투여"는 일일, 주간, 또는 월 단위로 발생하는 다수의 치료를 의미한다. 정기적 투여는 하루에 1, 2, 3 또는 그 이상의 횟수로 물질을 투여하는 것 또한 의미할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "포함하는(comprising)"(그리고 "포함", 그리고 "포함했다"와 같은 어느 형태의 포함), "갖는(having)"(예를 들어 "갖고 있는" 그리고 "갖는다"와 같은 어느 형태의 가지다), "포함하는(including)"(그리고 "포함", 그리고 "포함했다"와 같은 어느 형태의 포함), 또는 "함유하는"(그리고 "함유하다" 그리고 "함유"와 같은 어느 형태의 함유하는)은 포괄적이거나 또는 제약이 없으며(opne-ended), 부가적인 기재되지 않은 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는다. 전환 어구 "포함" 또는 "포함하는"을 사용하는 어느 단계 또는 조성물은 전환 어구 "~로 이루어지는" 또는 "이루어진다"로 동일한 것을 기술한다고 말할 수도 있다.
"효과적인 양"은 이로운 또는 원하는 결과를 얻기에 충분한 양의 물질 또는 화합물(예를 들어 세포 또는 세포의 군집)이다. 효과적인 양은 하나 이상의 투여, 적용 또는 투여량에 있을 수 있다. 이 파라미터의 결정은 당업계의 기술 내에 있다. 이 고려 사항 뿐만 아니라 효과적인 제제 및 투여 절차 또한 당업계에 공지되어 있고 그리고 표준 교과서에 기술되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "접촉"은 시험관 내 시스템 또는 체내 시스템 내의 두 개의 요소를 한데 모으는 것을 의미한다. 예를 들어 바이러스와 세포 또는 개인 또는 환자 또는 세포를 "접촉시키는" 것은 바이러스를 개인 또는 환자, 예를 들어 사람에게 투여하는 것 뿐만 아니라, 예를 들어 관심 세포를 함유하는 세포 제제 또는 정제한 제제를 함유하는 샘플 내에 화합물을 도입하는 것 또한 포함한다.
핵산 분자, 단백질, 벡터, 또는 발현 카세트에 대해 언급할 때 용어 "이종(heterologous)"은 자연적으로 발생하지 않고 그리고 사용자의 조작을 통해서 세포 안에서 발현되는 핵산 분자, 단백질, 벡터, 또는 발현 카세트를 의미한다. 예를 들어 이종 유전자는 세포 또는 CRISPR와 같은 유전자 편집 방법 또는 세포 안에 있는 유전자를 대체하기 위한 다른 재조합 기법을 통해 조작된 게놈에 있는 유전자 안에 넣은 벡터 또는 다른 매개체에 의해 발현되는 유전자를 의미한다. 당업계의 숙련자는 용어 "이종"이 조작되지 않은 세포의 게놈에 있는 자연적으로 발생하는 유전자를 의미하지 않는다는 것을 이해할 것이다. "이종"은 "외인(exogenous)"이라고도 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 DNA 또는 RNA와 같은 핵산에 관하여 용어 "분리된(isolated)"은 각자 고분자의 천연 공급원에 존재하는 다른 DNA 또는 RNA로부터 분리된 분자를 의미한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "분리된"은 재조합 DNA 기법으로 생성되었을 때 실질적으로 세포 물질, 바이러스성 물질, 또는 배지를 갖지 않거나, 또는 화학적으로 합성되었을 때 화학적 전구체 또는 다른 화학 물질이 없는 핵산 또는 펩타이드 또한 의미한다. 또한 "분리된 핵산"은 단편으로는 자연적으로 발생하지 않고 그리고 자연의 상태로는 발견되지 않을 핵산 단편을 포함하는 것으로 여겨진다. "분리된 세포", 예를 들어, 분리된 골수세포는 실질적으로 그가 자연적으로 발견되는 환경의 다른 세포 물질, 조직, 배지가 없는 세포이다.
용어 "골수제거(myeloablative)"는 오래 지속되는(보통 비가역) 범혈구감소증을 야기하고, 투여로부터 1 내지 3주 안에 골수에 있는 세포를 죽이고, 그리고 자가 혈핵학적 회복을 허용하지 않는 치료를 의미한다. Bacigalupo et al., Biol Blood Marrow Transplant. 2009, 15(12): 1628-1633. 시클로포스파미드의 골수제거 투여량의 예시는, 비제한적으로, 결과적으로 누적 독성(cumulative toxicity)을 야기하는 기간 동안 2.5mg/kg/day CTX 또는 그 이상이다(McKinley et al., Clin J Am Soc Nephrol. 2009, 4:1754-1760).
용어 "비골수제거(non-myeloablative)"는 적은 독성과 최소 또는 가역 범혈구감소증을 야기하거나 또는 그를 아예 야기하지 않는 치료를 의미한다. 비골수제거 요법은 면역제거술(immuno-ablation)이다. 비골수제거성의 투여량(non-myeloablative doses)의 예시는, 비제한적으로, 결과적으로 누적 독성을 야기하지 않는 기간 동안 약 1.3mg/kg/day 또는 2 내지 4개월 동안 1.0 내지 1.5mg/kg/day이다(McKinley et al., Clin J Am Soc Nephrol. 2009, 4:1754-1760). 다른 비골수제거성의 투여량은 본원에 걸쳐 기술되고 그리고 비골수제거성의 투여량의 정의 내에 포함된다. 결과적으로 "누적 독성"을 야기하는 물질(agent) 또는 물질의 투여량은 시간이 지나면서 환자 내의 독성으로 이어지는 투여량을 의미한다. 예를 들어 몇 주의 기간 동안 2.5mg/kg/day의 투여량으로 사람에게 투여되는 시클로포스파미드는 누적 독성으로 이어질 것이다.
"대상(subject)", "개인(individual)", 또는 "환자"는 본원에서 서로 바꿔 사용되고 그리고 척추동물, 예를 들어 영장류, 포유동물 또는 바람직하게는 인간을 의미한다. 포유동물은 말, 개, 소, 양, 생쥐, 래트(rats), 유인원, 및 인간을 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
단백질 또는 아미노산 서열(또는 DNA 또는 RNA 서열)에 관하여 용어 "서열 동일성(sequence identity)"은, 서열을 정렬시키고 그리고, 만일 필요할 경우, 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 갭(gaps)을 도입한 후, 그리고 어느 보존적 치환이라도 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 후보 서열에서 특정한 단백질 또는 아미노산 서열에 있는 아미노산 잔기(또는 특정한 DNA 또는 RNA 서열에 있는 뉴클레오타이드 잔기)와 동일한 아미노산 잔기(또는 뉴클레오타이드 잔기)의 퍼센트를 의미한다. 정렬은 당업계의 숙련자에게 공지된 어느 방법, 예를 들어 BLAST 및 EMBOSS와 같은 공개적으로 사용 가능한 프로그램을 사용하는 것으로 달성할 수 있다. 당업계의 숙련자는 비교하고 있는 서열의 전체 길이에 대한 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 어느 알고리즘을 포함하는 정렬 측정을 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있지만, 일부 구체예에서는 디폴트 파라미터가 사용된다. 프로그램은 예를 들어 미국 국립 생물공학 정보 센터에서 이용할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같은 용어 "변종(variant)"은 기준 핵산 또는 단백질(즉 칼모듈린 또는 그의 단편)과 상이하지만 본질적인 속성(즉 생물학적 활성)을 계속 유지하는 핵산 또는 단백질이다. 폴리뉴클레오타이드의 일반적인 변종은 또 다른, 기준 폴리뉴클레오타이드와 뉴클레오타이드 서열에서 차이가 있다. 뉴클레오타이드 서열에서의 변경은 기준 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 바꿀 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 뉴클레오타이드 변경은 기준 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드에서의 아미노산 치환, 추가, 결실, 융합, 및/또는 절단을 야기할 수 있다.
본원에서 용어 "벡터"는 다른 핵산 분자를 전달 또는 운반하는 것이 가능한 핵산 분자를 의미한다. 전달된 핵산은 보통, 예를 들어, 벡터 핵산 분자에 연결된다. 벡터는 세포에서 자동 복제를 지시(direct)하는 서열을 포함하거나, 또는 세포 DNA 내로의 통합을 허용하기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. 벡터는, 예를 들어, 플라스미드(예를 들어 DNA 플라스미드 또는 RNA 플라스미드), 트랜스포존, 코스미드, 박테리아 또는 효모 인공 염색체 및 바이러스성 벡터를 포함한다. 유용한 바이러스성 벡터는, 예를 들어, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 특히 복제 결함 레트로바이러스, 및 렌티바이러스를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 벡터는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서 상기 벡터는 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, 또는 이들의 어느 조합의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다.
본원에서 "약학적으로 허용가능한"이란 표현은 건전한 의학적 판단의 범위 내에 있고, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 및 합병증 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고, 합당한 이익/위험 비율에 비례하는 화합물, 재료, 조합물, 및/또는 제형(dosage forms)을 나타내기 위해 사용되었다.
골수 이식을 실행하기 위한 방법
본원에는 그를 필요로 하는 환자에게 골수 이식을 실행하기 위한 방법이 제공된다. 본원에는 이종 핵산 분자 발현 카세트 또는 복수의 이종 발현 카세트를 발현하는 세포의 군집 또는 그의 게놈이 편집되고 그리고 대상의 게놈과는 상이한 세포로 대상의 골수세포를 대체하기 위한 방법 또한 제공된다. 일부 구체예에서 이 방법들은 환자에게 하나 이상의 화학요법 저항성(chemotherapeutic-resistant) 변형 세포를 투여하는 단계 및 화학요법제를 최소 1회 투여하는 단계를 포함한다. 특정 구체예에서 상기 투여량은 화학요법제의 비골수제거성의 투여량이다. 일부 구체예에서 상기 세포의 양은 치료적으로 효과적인 양이다.
본원에 제공된 방법의 일부 구체예에서 상기 환자는 HIV 환자이다.
본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 화학요법 저항성 변형 세포는 당업계의 숙련자에게 공지된 어느 적합한 세포라도 될 수 있다. 예를 들어 상기 세포는 줄기세포 또는 면역세포일 수 있다. 줄기세포의 비제한적인 예시는 제대혈 세포, 태아 줄기세포, 배아 줄기세포(ESC), 조혈 줄기세포(HSC), 조혈 전구세포, 다능성 줄기세포(PSC), 유도 PSC(iPSC), 또는 이들로부터 유래된 세포를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 면역세포는 T 세포이다. 일부 구체예에서 상기 세포는 CD34+ 및/또는 CD4+이다. 일부 구체예에서 상기 세포는 중간엽 줄기세포, 간질 줄기세포, 조혈 줄기세포/전구세포로부터 유래된 제대혈, 줄기/전구세포로부터 유래된 제대 조직, iPSC, HESC, 태아 조직 유래 줄기세포, CD4+ 세포 등과 같은 것이다. 일부 구체예에서 상기 줄기세포는 CD34+이다.
화학요법 저항성
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 화학요법 저항성 세포는 당업계에 공지된 화학요법 저항성을 부여하기 위한 어느 방법이라도 사용해서 생성될 수 있다. 특정 구체예에서 본원에서 제공된 골수 이식 방법은 하나 이상의 세포를 화학요법 저항성으로 변형하는 것을 포함한다. 예를 들어 특정 구체예에서는 화학요법 저항성의 변형된 세포를 생성하는 단계, 환자에게 효과적인 양의 화학요법 저항성의 변형된 세포를 투여하는 단계, 그리고 화학요법제를 최소 1회 투여하는 단계를 포함하는, 그를 필요로 하는 환자에게 골수 이식을 실행하기 위한 방법이 제공된다. 특정 구체예에서 상기 투여량은 화학요법제의 비골수제거성의 투여량이다. 일부 구체예에서 상기 화학요법 저항성 세포는 시클로포스파미드에 저항성을 갖는다. 일부 구체예에서 상기 화학요법 저항성 세포는 비골수제거성의 양의 시클로포스파미드에 저항성을 갖는다.
일부 구체예에서 상기 세포는 외인 화학요법 저항성 유전자(즉 형질도입된 유전자)를 발현하도록 변형될 수 있고, 예를 들어 상기 외인 화학요법 저항성 유전자는 시클로포스파미드 저항성 유전자, 변종, 또는 이들의 부분을 암호화하는 핵산 서열일 수 있다. 일부 구체예에서 상기 시클로포스파미드 저항성 유전자는 알데히드 탈수소효소 1(ALDH1)이다. 일부 구체예에서 상기 ALDH1은 SEQ ID NO: 1에 제시된 서열 또는 그의 변종을 포함하는 핵산 분자이다. 일부 구체예에서 상기 ALDH1은 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4에 제시된 서열 또는 그의 변종을 포함하는 렌티바이러스성 벡터에서 발현된다. ALDH1로 변형된 세포는 시클로포스파미드에 저항성을 가지면서도 다른 비시클로포스파미드 화학요법제에 대한 민감성은 유지할 수 있다(즉 세포는 다중약물 내성을 갖지 않을 것이다).
당업계의 숙련자에게 공지된 어느 변형 방법이라도 바이러스성 벡터(예를 들어 아데노바이러스, 복제 결함 레트로바이러스와 같은 레트로바이러스, 및 렌티바이러스), 비바이러스성 벡터(예를 들어 에피솜, 플라스미드), 또는 트랜스포존 시스템(예를 들어 슬리핑뷰티(Sleeping Beauty) 또는 피기백(PiggyBac))을 포함하는 외인 화학요법 저항성 유전자를 발현시키기 위해 사용될 수 있다. 일부 구체예에서 상기 벡터는 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4의 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 구체예에서 상기 화학요법 저항성 유전자는 합성 전령 RNA(mRNA)이다. 합성 mRNA는 관신 단백질을 만들기 위한 유전 정보를 제공하고 그리고 면역 반응을 유발하는 것을 방지하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다. Zangi et al. (2013) Nature Biotech 31:898-907. mRNA는 숙주 세포 게놈 내로 통합되지 않기 때문에, 합성 RNA는 일정 기간 동안 활동하고, 그런 다음 세포가 분열되면서 사라진다. 일부 구체예에서는 단일 가닥 RNA에 대한 선천 항바이러스 반응을 감소시키기 위해 mRNA는, 예를 들어, 유사우리딘(pseudouridine) 및/또는 5-메틸-시티딘으로 변형된다. 일부 구체예에서 합성 RNA는 ALDH(예를 들어 ALDH1) 및/또는 그들 각각의 균등물을 암호화한다.
일부 구체예에서 화학요법 저항성, 예를 들어 시클로포스파미드 저항성은 변형된 세포에 의해 일시적으로 발현된다. 일부 구체예에서 일시적으로 발현된 시클로포스파미드는 약 1주일, 약 2주일, 약 3주일, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 또는 약 3년의 기간 동안 변형된 세포에 의해 발현된다. 일시적 발현은 저항성을 부여하는 유전자 또는 단백질의 발현의 존속을 의미한다. 일시적이라는 것은 상기 저항성이 영구적이지 않다는 것을 의미한다.
일부 구체예에서 외인 화학요법 저항성 유전자, 예를 들어 시클로포스파미드 저항성 유전자는 비바이러스성 기반의 세포의 핵산전달감염과 같은, 잘 알려진 다양한 기법 중의 어느 하나를 사용하여 세포 내로 도입된다. 세포 내로의 도입은 전기 천공법, 인산칼슘 매개 전달, 뉴클레오펙션(nucleofection), 초음파 천공법, 열 충격법, 자기주입법, 리포솜 매개 전달, 현미주입법, 미세입자투사(microprojectile) 매개 전달(나노입자), 양이온 폴리머 매개 전달(DEAE-덱스트란, 폴리에틸렌이민, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 등), 또는 세포 융합과 같은, 하지만 이에 제한되지는 않는, 당업계에 공지된 비바이러스성 기반의 세포 핵산전달감염 방법에 의해 실행될 수 있다. 핵산전달감염의 다른 방법은 LipofectamineTM, Dojindo HilymaxTM, FugeneTM, jetPEITM, EffecteneTM, 및 DreamFectTM와 같은 핵산전달감염 시약을 포함할 수 있다.
세포 분리 및/또는 정제
본 발명의 방법에서 사용하기 위한 화학요법 저항성 변형 세포는 환자의 세포(즉 자가 세포), 공여자의 세포(즉 동종이형 세포), 또는 화학요법 저항성을 부여하기 위해 변형된 이들의 어느 조합일 수 있다. 특정 구체예에서 본원에서 제공된 방법은 환자 또는 공여자로부터의 세포를 분리 및/또는 정제하는 것을 더 포함한다. 이들의 특정 구체예에서 상기 방법은 세포가 화학요법 저항성을 갖도록 변형시키는 것을 더 포함한다. 예를 들어 특정 구체예에서는 환자 또는 대상으로부터의 하나 이상의 세포를 분리 및/또는 정제하는 단계, 하나 이상의 세포를 본원에 기술된 바와 같이 화학요법 저항성을 갖도록 변형시키는 단계, 환자에게 효과적인 양의 하나 이상의 화학요법 저항성 변형 세포를 투여하는 단계, 그리고 화학요법제를 최소 1회 투여하는 단계를 포함하는 그를 필요로 하는 환자에게 골수 이식을 실행하기 위한 방법이 제공된다.
세포는, 예를 들어, 특정 마커의 발현/발현의 결핍, 증식의 속도, 및 분화 가능성에 기반하여, 당업계의 숙련자에게 공지된 어느 방법에 의해서라도 분리될 수 있다. 일부 구체예에서, 상기 세포는, 예를 들어, CD34, CD4, Sca-1 CD38, CD123, CD90, CD45, CD133, 항원 제시 세포 마커(CD8, CD8알파, CD11b, CD11c, CD103, CD205, CD24, CD115, CD117, CD135, CD11clow, CD45RA, CD123, ILT-7, MHC 클래스 II, MHC 클래스 IIlow, TLR7, 및/또는 TRL9)를 포함하는 특정한 마커 또는 마커의 조합의 존재에 근거하여 분리된다. 일부 구체예에서 상기 세포는, 예를 들어 CD3, CD14, CD19, CD56, 및/또는 CD66b와 같은 특정한 마커의 결여에 근거하여 분리된다. 다른 구체예에서는, 예를 들어, T 세포, B 세포, 과립구, 및/또는 골수단핵구 세포의 마커에 대해 음성 선별(negative selection)이 실행된다. 일부 구체예에서 세포는 Thy-1 단독 또는 어느 다른 마커와의 조합으로서의 존재에 근거하여 분리된다. 일부 구체예에서, HSC는 Lin-Thy1+Sca-1+ 발현 프로필에 근거하여 분리된다. 일부 구체예에서 마우스 HSC는 발현 프로필 CD34-, Sca1+, c-kit+에 의해 분리될 수 있다. 일부 구체예에서 인간 HSC는 CD34 발현에 근거하여 분리될 수 있다.
화합요법제
일부 구체예에서 본원에 제공된 방법은 환자에게 하나 이상의 투여량의 화학요법제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 투여량은 화학요법제의 비골수제거성 투여량이다. 상기 화학요법제는 당업계의 숙련자에게 공지된 어느 적합한 화학요법제일 수 있다. 화학요법제의 비제한적인 예시는 악티노마이신, 올트랜스 레티노산, 아자시티딘, 아자티오프린, 블레오마이신, 보르테조밉, 부설판, 카페시티딘, 카보플라틴, 카르무스틴(BCNU), 시스플라틴, 클로람부실, 시클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에토포시드, 플루오로우라실, 젬시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이리노테칸, 로무스틴(CCNU), 메클로레타민, 멜팔란, 메르캅토푸린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 니무스틴(ACNU) 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 페메트렉시드, 테메졸아미드(temezolamide), 테니포시드, 티오테파, 티오구아닌, 토포테칸, 트레오설판, 발루비신, 베무라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 및 비노렐빈을 포함한다.
질환 특이적 변형
본원에 제공된 방법의 특정 구체예에서 화학요법 저항성의 변형된 세포는 화학요법 저항성과 관계없는 하나 이상의 부가적인 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어 특정 구체예에서는 상기 세포가 부가적인 HIV/질환 특이적 변형을 발현하기 위해 더 변형될 수 있다. 그에 따라 특정 구체예에서는 본원에 제공된 골수 이식 방법이 하나 이상의 HIV/질환 특이적 변형을 포함하는 하나 이상의 부가적인 변형을 편입(incorporating)시키는 것을 더 포함할 수 있다. 예를 들어 특정 구체예에서는 환자 또는 대상으로부터의 하나 이상의 세포를 분리 및/또는 정제하는 단계, 본원에 기술된 바와 같이 화학요법 저항성이도록 하나 이상의 세포를 변형시키는 단계, 하나 이상의 부가적인 변형을 하나 이상의 세포 내로 편입시키는 단계, 환자에게 효과적인 양의 하나 이상의 화학요법 저항성의 변형된 세포를 투여하는 단계, 그리고 화학요법제를 최소 1회 투여하는 단계를 포함하는 그를 필요로 하는 환자에게 골수 이식을 실행하기 위한 방법이 제공된다. 일부 구체예에서 상기 투여량은 화학요법제의 비골수제거성 투여량이다.
일부 구체예에서 상기 변형된 세포는 HIV 저항성을 갖도록 더 변형된다. 예를 들어 상기 변형된 세포는 HIV 감염에 대한 저항성을 부여하는 적어도 하나의 돌연변이 HIV 공수용체(co-receptor), 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제의 발현, 또는 이들의 어느 조합을 발현하도록 더 변형될 수 있다. 일부 구체예에서 상기 세포는 HIV 공수용체의 발현을 억제하거나 감소시키는 분자를 발현하도록 변형된다. 일부 구체예에서 상기 분자는 안티센스 분자이다. 일부 구체예에서 상기 세포는 shCCR5, shCXCR4, GP-41 융합 억제제, C46 융합 억제제, C34 융합 억제제, 어느 다른 C 펩타이드 융합 억제제, 또는 이들의 어느 조합을 발현하도록 변형된다. 일부 구체예에서 CCR5 돌연변이는 CCR5-델타 32 돌연변이이다. 일부 구체예에서 세포에 있는 CCR5 유전자의 복제본 모두 CCR5-델타 32 돌연변이로 대체된다. 일부 구체예에서는 CCR5 유전자의 한 복제본은 CCR5-델타 32 돌연변이로 대체된다.
본원은 화학요법 저항성, 예를 들어 시클로포스파미드 저항성, 및 HIV 저항성을 갖도록 변형된다. 일부 구체예에서 세포는 시클로포스파미드 저항성 및 HIV 저항성을 갖도록 변형될 수 있다. HIV 저항성은 적어도 하나의 HIV 공수용체의 감소된 발현, 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제의 발현, 또는 이들의 어느 조합에 의해 부여될 수 있다. HIV 저항성은 CCR5 HIV 공수용체의 감소된 발현, CXCR4 HIV 공수용체의 감소된 발현, C 펩타이드 융합 억제제(예를 들어 C46 융합 억제제 또는 C34 융합 억제제)의 발현, 또는 이들의 어느 조합에 의해 부여될 수 있다.
상기 세포는 또한 어느 관심 분자라도 발현하도록 변형될 수 있다. 관심 분자는 사용자 또는 특정한 환자의 필요에 따라 결정된 대로 변형될 수 있다.
환자에게 투여
일부 구체예에서 본원에 제공된 방법은 환자에게 효과적인 양의 화학요법 저항성의 변형된 세포 및 비골수제거성 투여량의 화학요법제를 투여하는 단계를 포함한다. 상기 변형된 세포 및 화학요법제는 어느 적합한 경로로도 투여될 수 있고, 이는 치료될 질병 또는 질환에 따라 숙련자에게는 명확할 것이다. 투여의 일반적인 경로는 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 두개내, 비강내, 피내, 경구 또는 복강내 투여를 포함한다.
일부 구체예에서는 대상의 신체 표면적의 각 m2 당 약 l x l08 내지 약 l x 1011개의 세포가 대상에게 투여된다. 상기 세포는 세포의 절대수로 개인에게 투여될 수 있는데, 예를 들어 상기 개인에게는 약 1000 세포/주사에서 약 1000억 세포/주사까지, 예를 들어 각 주사 당 약, 적어도 약, 또는 최대 약 1 x 108, 1 x 107, 5 x 107, 1 x 106, 5 x 106, 1 x 105, 5 x 105, 1 x 104, 5 x 104, 1 x 103, 5 x 103(등등)개의 세포, 또는 종점을 포함하여 어느 두 숫자 사이의 어느 범위 만큼이 투여될 수 있다. 일부 구체예에서는 약 5 x 106/kg 내지 약 10 x 106/kg의 세포가 HSC 이식을 위해 사용된다.
다른 구체예에서 상기 대상에게는 약 1000 세포/주사/m2에서 약 1000억 세포/주사/m2까지, 예를 들어 각 주사 당 약, 적어도 약, 또는 최대 약 1 x 108/m2, 1 x 107/m2, 5 x 107/m2, 1 x l06/m2, 5 x 106/m2, 1 x 105/m2, 5 x 105/m2, 1 x 104/m2, 5 x 104/m2, 1 x 103/m2, 5 x 103/m2(등등)개의 세포, 또는 종점을 포함하여 어느 두 숫자 사이의 어느 범위 만큼이 투여될 수 있다.
다른 구체예에서 상기 세포는 그러한 개인에게 상대적인 수의 세포로 투여될 수 있는데, 예를 들어 상기 개인에게는 개인의 체중 1 킬로그램 당 약 1000 세포에서 약 1000억 세포까지, 개인의 체중 1 킬로그램 당 약, 적어도 약, 또는 최대 약 1 x 108, 5 x 107, 1 x 107, 5 x 106, 1 x 106, 5 x 105, 1 x 105 , 5 x 104, 1 x 104, 5 x 103, 1 x 103(등등)개의 세포, 또는 종점을 포함하여 어느 두 숫자 사이의 어느 범위 만큼이 투여될 수 있다.
일부 구체예에서는 적어도 한 비골수제거성 투여량의 화학요법제가 환자에게 투여된다. 화학요법제의 투여는 변형된 세포의 투여와 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 일부 구체예에서는 적어도 한 비골수제거성 투여량의 화학요법제가 변형된 세포의 투여 후에 투여된다. 일부 구체예에서는 세포의 투여 전에 사전조건화(preconditioning) 단계가 실행되고, 여기서 환자에게는 변형된 세포의 투여 전에 화학요법제, 예를 들어 플루다라빈 또는 시클로포스파미드가 최소 1회 투여된다. 일부 구체예에서 상기 사전조건화 단계는 비골수제거성 화학요법 사전조건화 단계이다. 일부 구체예에서는 사전조건화 단계가 세포의 투여 전에 실행되지 않는다. 본원의 세포는 세포의 투여 전의 사전조건화 단계(예를 들어 플루다라빈) 없이도 환자의 골수 내에 효율적으로 생착할 수 있는 것으로 고려된다.
일부 구체예에서 인간 대상 또는 환자를 위한 최소 1회의 비골수제거성 투여량은 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량이다. 일부 구체예에서 상기 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량은 약 0.15mg/kg/day 내지 2.5mg/kg/day 이하, 약 0.4mg/kg/day 내지 약 1.7mg/kg/day, 또는 약 0.8mg/kg/day 내지 약 1.5mg/kg/day이다. 일부 구체예에서 상기 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량은 약 0.15mg/kg/day, 약 0.2mg/kg/day, 약 0.25mg/kg/day, 약 0.3mg/kg/day, 약 0.35mg/kg/day, 약 0.4mg/kg/day, 약 0.45mg/kg/day, 약 0.5mg/kg/day, 약 0.55mg/kg/day, 약 0.6mg/kg/day, 약 0.65mg/kg/day, 약 0.7mg/kg/day, 약 0.75mg/kg/day, 약 0.8mg/kg/day, 약 0.85mg/kg/day, 약 0.9mg/kg/day, 약 0.95mg/kg/day, 약 1.0mg/kg/day, 약 1.1mg/kg/day, 약 1.2mg/kg/day, 약 1.3mg/kg/day, 약 1.4mg/kg/day, 약 1.5mg/kg/day, 약 1.6mg/kg/day, 약 1.7mg/kg/day, 약 1.8mg/kg/day, 약 1.9mg/kg/day, 약 2.0mg/kg/day, 약 2.1mg/kg/day, 약 2.2mg/kg/day, 약 2.3mg/kg/day, 또는 약 2.4mg/kg/day이다. 일부 구체예에서 상기 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량은 약 1.3mg/kg/day이다. 일부 구체예에서 상기 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량은 약 0.8mg/kg/day 내지 약 1.6mg/kg/day, 약 0.8mg/kg/day, 약 0.98mg/kg/day, 약 1.3mg/kg/day, 약 1.5mg/kg/day, 또는 약 1.6mg/kg/day이다. 일부 구체예에서 상기 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량은 약 0.5 내지 약 2mg/kg/day이다.
일부 구체예에서 비골수제거성 투여량의 화학요법제는 최소 약 1일, 최소 약 2일, 최소 약 3일, 최소 약 4일, 최소 약 5일, 최소 약 6일, 최소 약 1주, 최소 약 2주, 최소 약 3주, 최소 약 1개월, 최소 약 2개월, 최소 약 3개월, 최소 약 4개월, 최소 약 5개월, 최소 약 6개월, 최소 약 1년, 또는 더 긴 기간 동안 매일 투여된다.
일부 구체예에서 상기 비골수제거성 투여량은 누적 독성을 야기하지 않는 기간에 대해 제공된다. 예를 들어 누적 독성을 야기하지 않는 기간은 약 1년 이하, 약 6개월 이하, 약 3개월 이하, 약 2개월 이하, 약 1개월 이하, 약 3주 이하, 약 2주 이하, 약 1주 이하, 약 6일 이하, 약 5일 이하, 약 4일 이하, 약 3일 이하, 또는 약 2일 이하의 기간이다.
일부 구체예에서는 시클로포스파미드 저항성 변형 세포 및 적어도 한 비골수제거성 투여량의 화학요법제의 투여 사이에 일정 기간의 적어도 한 휴지 기간(break)이 있다. 예를 들어 상기 일정 기간은 약 2일, 약 3일, 약 4일, 약 5일, 약 6일, 약 1주, 약 2주, 약 3주, 약 1개월, 약 2개월, 약 3개월, 약 6개월, 약 1년 또는 그 이상 동안 일 수 있다. 일부 구체예에서는 상기 일정 기간이 약 3일, 약 7일, 약 10일, 및 약 14일이다.
일부 구체예에서는 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 변형된 세포로 대체된다. 일부 구체예에서는 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 약 1년 내에 변형된 세포로 대체된다. 일부 구체예에서는 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 약 6개월 내에 변형된 세포로 대체된다. 일부 구체예에서는 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 약 5개월 내에 변형된 세포로 대체된다. 일부 구체예에서는 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 약 4개월 내에 변형된 세포로 대체된다. 일부 구체예에서는 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 약 3개월 내에 변형된 세포로 대체된다. 일부 구체예에서는 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 약 2개월 내에 변형된 세포로 대체된다. 일부 구체예에서는 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 약 1개월 내에 변형된 세포로 대체된다. 일부 구체예에서는 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 약 2주 내에 변형된 세포로 대체된다. 일부 구체예에서는 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 약 1주 내에 변형된 세포로 대체된다.
일부 구체예에서 환자는 상기 방법 도중에 골수제거가 되지 않고 그리고/또는 면역 손상을 입지 않는다. 일부 구체예에서 환자는 임상적으로 관련된 빈혈, 호중구 감소증, 혈소판 감소증, 범혈구 감소증, 낮은 혈소판, 낮은 백혈구, 낮은 적혈구, 또는 이들의 어느 조합 또는 관련된 증상(들)을 겪지 않는다.
다른 구체예에서는 본원의 세포 및 화학요법제 치료를 받았을 때 대상 또는 대상군이 하기의 결과 중 하나 이상을 보일 수 있다:
(i) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 백혈구 증가;
(ii) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 과립구 증가;
(iii) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 호중구 증가;
(iv) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 림프구 증가;
(v) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 호산구 증가;
(vi) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 단핵구 증가;
(vii) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 호염기구 증가;
(viii) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 적혈구 증가;
(ix) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 혈액의 세 가지 세포 구성요소(적혈구, 백혈구, 및 혈소판) 증가;
(x) 최소 약 6개월, 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 약 10년, 약 15년, 약 20년, 약 25년, 약 30년, 약 35년, 약 40년, 약 45년, 약 50년, 약 55년, 약 60년, 또는 그 이상의 기간 동안 재발 없음;
(xi) 대조군과 비교하여 최소 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 약 10년, 약 15년, 약 20년, 약 25년, 약 30년, 약 35년, 약 40년, 약 45년, 약 50년, 약 55년, 약 60년, 또는 그 이상의 환자의 무재발 생존 기간 증가;
(xii) 대조군과 비교하여 최소 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 약 10년, 약 15년, 약 20년, 약 25년, 약 30년, 약 35년, 약 40년, 약 45년, 약 50년, 약 55년, 약 60년, 또는 그 이상의 환자의 생존 기간 증가;
(xiii) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 HIV 세포내 수명 감소;
(xiv) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 HIV 병원소 감소; 및
(xv) 대조군과 비교하여 최소 약 5%, 최소 약 10%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30%, 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 60%, 최소 65%, 최소 70%, 최소 약 75%, 최소 80%, 최소 85%, 최소 90%, 최소 95%, 또는 최소 99%(실제 % 변화 또는 중간값 % 변화)의 바이러스성 DNA의 고갈.
일부 구체예에서 상기 대조군은 플라시보, 기준 대조군(baseline control)으로 치료 받은 대상, 또는 변형되지 않은 세포로 치료받은 대상이 될 수 있다.
일부 구체예에서 상기 변형되지 않은 세포는 대조군과 비교하여 HIV의 적어도 한 증상을 최소 약 2%, 최소 약 3%, 최소 약 4%, 최소 약 5%, 최소 약 6%, 최소 약 7%, 최소 약 8%, 최소 약 9%, 최소 약 10%, 최소 약 11%, 최소 약 12%, 최소 약 13%, 최소 약 14%, 최소 약 15%, 최소 약 20%, 최소 약 25%, 최소 약 30% 최소 약 35%, 최소 약 40%, 최소 약 45%, 최소 약 50%, 최소 약 55%, 최소 약 60%, 최소 약 65%, 최소 약 70%, 최소 약 75%, 최소 약 80%, 최소 약 85%, 최소 약 90%, 최소 약 95%, 최소 약 97%, 최소 약 98%, 최소 약 99%, 또는 100% 감소시키기에 효과적인 기간 동안 대상에게 투여된다. 상기 대조군은 플라시보, 기준 대조군으로 치료 받은 대상, 또는 변형되지 않은 세포로 치료받은 대상이 될 수 있다.
비제한적인 증상은 열, 두통, 기력 부족, 피부 발진, 피부 욕창, 부은 선(swollen glands), 감염(예를 들어 폐렴, 결핵, C형 간염), 야간 발한, 설사, 구역 및 구토, 체중 감량, 심한 두통, 관철 통증, 근육통, 및 만성 기침을 포함한다.
일부 구체예에서는 변형된 세포가 적어도 하나의 다른 HIV 요법과 투여된다. 다른 적합한 HIV 요법은 당업계의 숙련자에게 공지된 어느 HIV 요법이라도 포함한다. 다른 HIV 요법의 비제한적인 예시는
복합약(예를 들어 에파비렌즈/엠트리시타빈/테노포비르 디소프록실 푸마르산염(Atripla®), 에파비렌즈/릴피비린/테노포비르 디소프록실 푸마르산염(Complera®), 엘비테그라비르/코비시스타트/엠트리시타빈/테노포비르 디소프록실 푸마르산염(Stribild®), 및 아바카비르/돌루테그라비르/라미부딘(Triumeq®)), 뉴클레오시드/뉴클레오타이드 역전사효소 저해제(NRTI)(예를 들어 아바카비르(Ziagen®), 에파비렌즈/엠트리시타빈/테노포비르 디소프록실 푸마르산염(Atripla®), 라미부딘/지도부딘(Combivir®), 에파비렌즈/릴피비린/테노포비르 디소프록실 푸마르산염(Complera®), 엠트리시타빈(Emtriva®), 라미부딘(Epivir®), 아바카비르/라미부딘(Epzicom®), 지도부딘(레트로비르®), 아바카비르/라미부딘/지도부딘(Trizivir), 엠트리시타빈/테노포비르 디소프록실 푸마르산염(Truvada®), 디다노신(Videx®), 디다노신 연장 방출(Videx EC®), 테노포비르 디소프록실 푸마르산염(Viread®), 및 스타부딘(Zerit®)), 비뉴클레오시드 역전사효소 저해제(NNRTI), 단백질 분해효소 억제제(예를 들어 티프라나비르(Aptivus®), 인디나비르(Crixivan®), 아타자나비르/코비시스타트(Evotaz®), 사퀴나비르(Invirase®), 로피나비르/리토나비르(Kaletra®), 포삼프레나비르(Lexiva®), 리토나비르(Norvir®), 다루나비르/코비시스타트(Prezcobix®), 다루나비르(Prezista®), 아타자나비르(Reyataz®), 넬피나비르(Viracept®)), 진입 억제제(예를 들어 엔푸비르티드(Fuzeon®)), 통합효소 억제제(예를 들어 랄테그라비르(Isentress®), 돌루테그라비르(Tivicay®), 및 엘비테그라비르(Vitekta®)), 케모카인 공수용체 길항제(CCR5 길항제)(예를 들어 마라비록(Selzentry®) 또는 비크리비록), 사이토크롬 P4503A 억제제, 및 면역 기반 요법(예를 들어 황산 하이드록시클로로퀸(Plaquenil))을 포함한다. 일부 구체예에서는 변형된 세포 및 적어도 하나의 다른 HIV 요법이 동시에 투여된다. 다른 구체예에서는 변형된 세포 및 적어도 하나의 다른 HIV 요법이 순차적으로 투여된다. 일부 구체예에서는 적어도 하나의 상기에 언급된 다른 HIV 요법의 투여가 명확하게 배제되는데, 예를 들어 일부 구체예에서는 NRTI가 명확하게 배제된다. 일부 구체예에서는 본원에 개시된 변형된 세포 및 적어도 한 비골수제거성 투여량의 화학요법제(예를 들어 시클로포스파미드) 외에 다른 HIV 요법이 투여되지 않는다.
상기 세포, 화학요법제, 그리고 선택적으로 다른 HIV 요법은 HIV를 가진 환자에게 1회 투여되거나 또는 여러번, 예를 들어 치료 중에 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 또는 23시간마다 1회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7일마다 1회, 또는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10주 또는 그 이상마다 1회, 또는 종점을 포함하여 어느 두 숫자 사이의 어느 범위마다 투여될 수 있다.
일부 구체예에는 HIV를 가진 환자를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 구체예에서 상기 방법은 환자의 CD34+ 줄기세포를 골수로부터 주변부로 동원(mobilizing)시키는 것을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 세포는 G-CSF(Granulocyte-colony stimulating factor: 과립구 집락 자극 인자)의 투여에 의해 동원된다. G-CSF는, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5일 화학요법으로서 투여될 수 있다. 일부 구체예에서 G-CSF는 3-5일 동안 투여된다. 동원된 세포는 성분채집술과 같은 방법을 사용하여 포착될 수 있다. 일부 구체예에서, 예를 들어, 성분채집술에 의한 세포의 분리는 CD34+ 세포수가 10.0 내지 20.0 x 106/kg body weight이 되거나 또는 그를 초과했을 때 실행된다. 일부 구체예에서 상기 세포수는 5.0 내지 25.0 x 106/kg body weight이거나 또는 그를 초과한다. CD34+ 세포가 형질도입을 위해 세포를 포착하기 위한 마커로 사용되지만, 본원에 기술된 것과 같은 다른 세포 마커도 사용될 수 있다. 예를 들어 사용되는 세포는, 예를 들어, CD34, CD4, Sca-1 CD38, CD123, CD90, CD45, CD133, 항원 제시 세포 마커(CD8, CD8알파, CD11b, CD11c, CD103, CD205, CD24, CD115, CD117, CD135, CD11clow, CD45RA, CD123, ILT-7, MHC 클래스 II, MHC 클래스 IIlow, TLR7, 및/또는 TRL9)을 포함하는 특정한 마커 또는 마커의 조합의 존재에 근거하여 분리된다. 일부 구체예에서 상기 세포는, 예를 들어, CD3, CD14, CD19, CD56, 및/또는 CD66b와 같은 특정한 마커의 결여에 근거하여 분리된다. 다른 구체예에서는, 예를 들어, T 세포, B 세포, 과립구, 및/또는 단핵구의 마커에 대해 음성 선별이 실행된다. 일부 구체예에서 세포는 Thy-1 단독 또는 어느 다른 마커와의 조합의 존재에 근거하여 분리된다. 일부 구체예에서 HSC는 Lin-Thy1+Sca-1+ 발현 프로필에 근거하여 분리된다. 일부 구체예에서 마우스 HSC는 발현 프로필 CD34-, Sca1+, c-kit+에 의해 분리될 수 있다. 일부 구체예에서 인간 HSC는 CD34 발현에 근거하여 분리될 수 있다. 일부 구체예에서는 분리된 세포가 CD34+ 또는 CD4+, 또는 이들의 어느 조합이다.
일부 구체예에서 상기 방법은 수집된 세포를 원심분리시키는 단계를 포함한다. 이는, 예를 들어, 세포가 풍부한 펠렛(pellet)을 만들기 위해 할 수 있다. 그런 다음 상기 세포는 냉동보존 용액에 재현탁되고 그리고 냉동된다. 일부 구체예에서 상기 냉동보존 용액은 헤파린 첨가된 플라스마라이트 용액 및 10% DMSO(디메틸설폭사이드)의 용액을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 세포는 먼저 -4℃에서 보관되고, 그런 다음 샘플은 목표 온도인 -156℃(기상으로 보관될 경우) 내지 -196℃(액체상으로 보관될 경우)로 냉동될 것이다.
일부 구체예에서 상기 방법은 시클로포스파미드와 같은 화학요법제에 저항성을 갖도록 분리된 세포를 형질도입시키는 단계를 포함한다. 본원에 기술된 바와 같이, 화학요법 저항성은 ALDH1의 발현에 의해 달성될 수 있다. ALDH1은 벡터의 사용(본원에 걸쳐 기술된 바와 같이), 예를 들어 렌티바이러스성 벡터의 사용을 통해 선택된 세포에 도입될 수 있다. ALDH1은 세포 특이적일 수 있는 촉진자에 작동가능하게(operably) 연결될 수 있다. 일부 구체예에서 상기 촉진자는 CD34 촉진자이다. 일부 구체예에서 상기 촉진자는 hCD34 촉진자이다. 일부 구체예에서 상기 촉진자는 SEQ ID NO: 12의 서열을 갖는다. 일부 구체예에서 상기 촉진자는 SEQ ID NO: 8에 제공된 것과 같은 hCD34 촉진자이다. 일부 구체예에서 ALDH1의 서열은 SEQ ID NO: 10에 제공된 것과 같이 단백질로서 발현된다. 일부 구체예에서 ALDH1은 SEQ ID NO: 1의 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화된다. 유전 부호의 퇴행성 본질 때문에 SEQ ID NO: 1의 서열이 비제한적인 예시로서 제공되고 그리고 SEQ ID NO: 10을 포함하는 단백질의 발현을 위해 암호화하는 데 다른 핵산 분자도 사용될 수 있다. 일부 구체예에서 ALDH1은 ALDH1의 기능을 변경시키지 않는 1-10개의 보존적 치환을 포함한다. 일부 구체예에서는 발현된 ALDH1이 SEQ ID NO: 10과 적어도 95% 동종이거나 또는 동일하다.
벡터에서의 ALDH1의 발현은 또한 증강인자에 의해 유도될 수도 있다. 예를 들어 상기 증강인자는 CD3E 증강자일 수 있다. 일부 구체예에서 상기 CD3E 증강자는 SEQ ID NO: 9의 서열을 포함한다.
일부 구체예에서 CD34+ 세포는 자기구슬 분리에 의해 분리될 수 있다. 렌티바이러스성 매개 인간 CD34+　세포 형질도입은, 예를 들어, 사이토카인 줄기세포 인자(SCF), Fms 관련 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3L), 트롬보포이에틴(TPO), IL-6, IL-2, IL-3, 피브로넥틴, 또는 이들의 어느 조합의 첨가와 함께 배지에 있는 세포의 24시간 사전자극(prestimulation)을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서 상기 세포는 그런 다음에 ALDH1을 발현하는 렌티바이러스에 접촉(감염)시킨다. 일부 구체예에서 상기 벡터는 SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, 또는 SEQ ID NO: 5의 서열을 포함한다. 상기 접촉은 무혈청 X-Vivo 10 배지에서 SCF, FLT3L 및 TPO(각자 100ng ml-1)의 사이토카인이 있는 데서 실행될 수 있다. 상기 세포는 그런 다음에 선택적으로 냉동되거나 냉동되지 않을 수 있다. 일부 구체예에서 상기 세포는 AAV 또는 AV 벡터와 접촉하지 않는다.
일부 구체예에서 상기 방법은 형질도입된 세포를 대상에게 주입하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 대상은 HIV를 갖고 있다. 일부 구체예에서 상기 대상은 HIV를 갖고 있지 않지만 HIV에 걸릴 위험이 크고, 그리고 따라서 HIV 저항성을 갖기를 희망한다.
일부 구체예에서는 변형된 세포의 주입 후에 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드와 같은 화학요법제가 투여된다. 일부 구체예에서 상기 투여량은 50-200mg의 투여량이고 그리고 매일 투여된다. 일부 구체예에서 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량은 약 0.15mg/kg/day 내지 2.5mg/kg/day 이하, 약 0.4mg/kg/day 내지 약 1.7 mg/kg/day, 또는 약 0.8mg/kg/day 내지 약 1.5mg/kg/day이다. 일부 구체예에서 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량은 약 0.15mg/kg/day, 약 0.2mg/kg/day, 약 0.25mg/kg/day, 약 0.3mg/kg/day, 약 0.35mg/kg/day, 약 0.4mg/kg/day, 약 0.45mg/kg/day, 약 0.5mg/kg/day, 약 0.55mg/kg/day, 약 0.6mg/kg/day, 약 0.65mg/kg/day, 약 0.7mg/kg/day, 약 0.75mg/kg/day, 약 0.8mg/kg/day, 약 0.85mg/kg/day, 약 0.9mg/kg/day, 약 0.95mg/kg/day, 약 1.0mg/kg/day, 약 1.1mg/kg/day, 약 1.2mg/kg/day, 약 1.3mg/kg/day, 약 1.4mg/kg/day, 약 1.5mg/kg/day, 약 1.6mg/kg/day, 약 1.7mg/kg/day, 약 1.8mg/kg/day, 약 1.9mg/kg/day, 약 2.0mg/kg/day, 약 2.1mg/kg/day, 약 2.2mg/kg/day, 약 2.3mg/kg/day, 또는 약 2.4mg/kg/day이다. 일부 구체예에서 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량은 약 1.3mg/kg/day이다. 일부 구체예에서 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량은 약 0.8mg/kg/day 내지 약 1.6mg/kg/day, 약 0.8mg/kg/day, 약 0.98mg/kg/day, 약 1.3mg/kg/day, 약 1.5mg/kg/day, 또는 약 1.6mg/kg/day이다. 일부 구체예에서 시클로포스파미드의 비골수제거성 투여량은 약 0.5 내지 약 2mg/kg/day이다. 상기 투여량은 본원에 제공된 바와 같이 투여될 수 있다. 어느 특정한 이론에도 얽매이지 않고, 생착을 가능하게 하기 위한 일일 경구 시클로포스파미드는 유전자 변형된 골수세포를 증가시킨다. 변형된 CD34+ 세포가 주입될 때에 환자가 HIV+일 수 있다는 것이 고려되고, 이런 경우에 상기 세포는 HIV를 치료 그리고/또는 치유하기 위해 기능하고, 또는 변형된 CD34+ 세포가 주입될 때에 환자가 HIV-일 수 있고, 이런 경우에 상기 세포는 미래의 HIV 감염을 예방하기 위해 기능한다. HIV+ 환자를 치료하기 위한 비제한적인 도식이 도 9 및 도 10에 제공되지만, 환자가 HIV-일 수도 있다는 것으로 해석되어야 한다.
일부 구체예에서 상기 대상은 변형된 세포의 주입 전에 플루다라빈으로도 치료받는다. 일부 구체예에서는 수집 2일 후(또는 이식 5일 전), 환자가 5일 동안(이식 1일 전까지) 플루다라빈(15mg/m2)으로 치료받는다. 일부 구체예에서는 플루다라빈 대신에, 상기 환자가 이식 1일 전에 4mg/kg의 부설판으로 치료받을 수 있다. 일부 구체예에서 상기 환자는 이식 2일 전에 1000mg/m2의 단일 투여량의 시클로포스파미드로 치료받는다. 그러나 세포의 주입 후, 상기 대상은 본원에 제공된 바와 같이 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드로 치료받는다.
본원에 기술된 바와 같이, 상기 벡터는 shCCR5에 대하여 또는 C44, C46 또는 본원에 기술된 것과 같은 다른 것들과 같은 융합 억제제에 대해 발현하는 것을 포함하는 다른 발현 카세트 또한 포함할 수 있다. 상기 융합 억제제는 GPI 앵커 및 HIV 융합 억제제의 융합일 수 있다. 일부 구체예에서 상기 융합 억제제는 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구체예에서 상기 융합 억제제는 SEQ ID NO: 11의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 일부 구체예에서 상기 융합 억제제는 SEQ ID NO: 14의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구체예에서 상기 융합 억제제는 SEQ ID NO: 15의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이다. 일부 구체예에서 상기 융합 억제제는 GPI 앵커에 의해 막에 고정된다. 일부 구체예에서 상기 앵커는 SEQ ID NO: 16의 핵산 서열에 의해 암호화된다. 일부 구체예에서 상기 앵커는 SEQ ID NO: 17의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 융합 앵커 단백질은 IgG 경첩 부위(hinge region)을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 IgG 경첩 부위는 IgG3이다. 일부 구체예에서 융합 억제제 단백질은 SEQ ID NO: 19의 서열을 포함한다. 일부 구체예에서 융합 억제제 단백질은 SEQ ID NO: 18의 서열을 포함하는 핵산 분자에 의해 암호화된다. 일부 구체예에서 상기 앵커는 GP41이다.
일부 구체예에서 상기 융합 억제제는 ALDH1 촉진자 외에 다른 촉진자의 제어 하에 놓인다. 일부 구체예에서 상기 촉진자는 EFS 촉진자이다. 일부 구체예에서 상기 촉진자는 본원에 기술된 것과 같은 CD4 촉진자이다.
일부 구체예에서 본원에 제공된 바와 같이 세포 내로 형질도입된 벡터는 CCR5의 발현을 감소시키거나 또는 억제하는 안티센스 분자를 발현했다. 일부 구체예에서 벡터는 shCCR5 억제제 분자를 암호화한다. 일부 구체예에서 렌티바이러스성 벡터는 SEQ ID NO: 6의 hCCR5 shRNA 센스 서열, 또는 그의 보체, 그리고/또는 SEQ ID NO: 7의 hCCR5 shRNA 안티센스 서열, 또는 그의 보체에 대해 암호화한다. 일부 구체예에서 서열들은 역배향(reverse orientation)을 가질 수도 있다. 일부 구체예에서 상기 벡터는 mir30 발현 카세트를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 mir30 발현 카세트는 hCCR5 shRNA에 대해 암호화한다. 일부 구체예에서 mir30 구조물은 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함한다. CCR5 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있는 상기 안티센스 분자는 비제한적인 예시이고 그리고 CCR5을 표적하는 다른 안티센스 분자도 사용될 수 있다.
그에 따라 일부 구체예에서는 SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, 및/또는 SEQ ID NO: 13의 서열을 포함하는 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예에서 본원은 SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, 및/또는 SEQ ID NO: 19를 포함하는 단백질에 대해 제공된다.
일부 구체예에서는 핵산 분자가 제공되고, 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO 1, 또는 그의 변종, SEQ ID NO: 3, 또는 그의 변종, SEQ ID NO: 6, 또는 그의 변종, SEQ ID NO: 7, 또는 그의 변종, SEQ ID NO: 13, 또는 그의 변종, SEQ ID N: 14, 또는 그의 변종, SEQ ID NO: 16, 또는 그의 변종, SEQ ID NO: 18, 또는 그의 변종, 또는 이들의 어느 조합을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 핵산 분자는 SEQ ID NO: 1, 또는 그의 변종, SEQ ID NO: 6, 또는 그의 변종, SEQ ID NO: 7, 또는 그의 변종, 및 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14, 및 SEQ ID NO: 18 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구체예에서는 SEQ ID NO: 2 및 SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, 및 SEQ ID NO: 19 중 하나 이상을 포함하는 단백질에 대해 암호화하는 핵산 분자가 제공된다.
일부 구체예에서 본원은 ALDH1, 또는 그의 변종, shCCR5 분자, 또는 그의 변종, 및/또는 고정된 융합 억제제를 포함하는 융합 억제제에 대해 암호화하는 핵산 분자에 대해 제공한다.
일부 구체예에서는 단일 벡터와 같은 단일 핵산 분자가 본원에 제공된 각각의 핵산 분자 또는 단백질에 대해 암호화하거나 또는 그를 발현하는 데에 사용된다. 일부 구체예에서 단일 렌티바이러스는 본원에 제공된 핵산 서열을 포함한다. 일부 구체예에서는 각각의 ALDH1, 또는 그의 변종, shCCR5 분자, 또는 그의 변종, 및/또는 융합 억제제에 대해 암호화하는 단일 발현 구조물을 포함하는 렌티바이러스가 제공된다. 본원에 기술된 다양한 요소를 포함하는 벡터의 비제한적인 예시는 도 4, 도 5, 도 6, 도 11, 및 도 12에 도시된다. ALDH1, shCCR5, 및 융합 억제제(고정된 융합 억제제 포함)에 대해 암호화하는 핵산 분자를 작동가능하게 연결시키는 촉진자 및 반응 요소는 비제한적이며, 다른 촉진자 및 반응 요소도 사용될 수 있다. 당업계의 숙련자라면 도시된 상이한 촉진자들을 서로 바꿔 교환(swapped)할 수 있다는 것을 이해할 것이다.
바이러스성 벡터 또는 렌티바이러스를 형성하기 위한 기반으로서 사용될 수 있는 핵산 서열의 비제한적인 예시는, 예를 들어, SEQ ID NO: 2, 4, 및 5를 포함하는 것들을 포함한다.
일부 구체예에서 상기 핵산 분자는 ALDH1, shCCR5, 및/또는 융합 억제제 단백질에 대해 암호화하는 핵산 분자의 측면에 있는(flank) 5' LTR 및 3' LTR을 포함한다. 의심의 여지를 없애기 위하여, shCCR5 서열 및 융합 억제제 서열은 ALDH1과 공동발현(co-expressed)되도록 사용될 다른 관심 서열로 교환될 수 있다. 따라서 일부 구체예에서는 상기 핵산 분자가 ALDH1 및 관심 서열에 대해 암호화하는 서열을 포함하고, 이는 예를 들어 어느 다른 단백질, 안티센스, miRNA, 또는 골수 또는 본원에 제공된 세포 유형에서 발현되는 것이 바람직한 다른 핵산 분자일 수 있다.
그에 따라 일부 구체예에서는 ALDH1을 발현하는 세포 및 관심 분자를 개인에게 투여하는 단계 및 대상에게 비골수제거성 투여량의 화학요법제(예를 들어 시클로포스파미드)를 투여하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다.
일부 구체예에서는 대상의 HIV를 치료하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 ALDH 1 및 다음 중 하나를 이종 발현(heterologously expressing)하는 세포의 군집을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다: i) 적어도 하나의 HIV 공수용체 돌연변이에 대해 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 분자, 적어도 하나의 HIV 공수용체 한 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제, HIV 공수용체의 발현을 감소시키는 분자, 또는 이들의 어느 조합. 일부 구체예에서 상기 방법은 적어도 한 비골수제거성 투여량의 화학요법제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 세포는 대상의 자가 조직이다. 일부 구체예에서 상기 세포는 대상에 대해 동종이형이다. 일부 구체예에서 세포는 shCCR5, shCXCR4, 및/또는 C 펩타이드 융합 억제제를 발현한다. 일부 구체예에서 상기 세포는 1, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 세포는 SEQ ID NO: 10, 11, 6, 7, 13, 15, 17, 19, 또는 이들의 어느 조합의 서열에 대해 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서는 상기 세포가 CD34+ 및/또는 CD4+, 또는 본원에서 달리 제공된 것이다.
일부 구체예에서 상기 방법은 대상에서 관심 분자를 발현시키고, 상기 방법은 ALDH1 및 관심 분자를 이종 발현시키는 세포를 대상에게 투여하는 단계, 그리고 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 세포는 CD34+ 및/또는 CD4+, 또는 본원에서 달리 제공된 것이다. 일부 구체예에서 상기 관심 분자는 CCR5의 발현을 감소시키는 것, CXCR4의 발현을 감소시키는 것, C 펩타이드 융합 억제제의 발현을 위해 암호화하는 것, 또는 이들의 어느 조합이다. 일부 구체예에서 CCR5의 발현을 감소시키는 관심 분자는 shCCR5이다. 일부 구체예에서 상기 분자는 SEQ ID NO: 6 및/또는 SEQ ID NO: 7을 포함하는 또는 그에 대해 암호화하는 핵산 분자를 포함한다. 일부 구체예에서 상기 C 펩타이드 융합 억제제는 SEQ ID NO: 11, 15, 19, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함한다.
본원에는 다양한 서열이 제공되는 것으로 해석되어야 한다. 정확한 서열에 더하여 개시된 서열의 변종인 서열 또한 제공된다. 일부 구체예에서는 개시된 서열과 최소, 약, 또는 정확하게 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 또는 99%의 상동성 또는 동일성을 갖는 서열이 제공된다. 당업계의 숙련자는 두 개의 단백질 또는 핵산의 상동성을 어떻게 결정하는지를 쉽게 이해할 수 있다. 예를 들어 상동성은 최고 수준의 상동성을 위해 두 개의 서열을 정렬한 후 계산될 수 있다. 일부 구체예에서 상동성의 계산은 공개된 알고리즘에 의해 실행될 수 있다. 비교를 위한 서열의 최적의 정렬은 Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)의 국소(local) 상동성 알고리즘, Needleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)의 상동성 배열 알고리즘, Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)의 유사성 검색 방법, Wisconsin Genetics Software Package(Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)에 있는 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA 알고리즘의 컴퓨터 실행, 또는 검사에 의해 실시될 수 있다. 예를 들어 적어도 핵산 정렬에 관련된 자료에 있어서 참조로서 본원에 포함된 Zuker, M. Science 244:48-52, 1989, Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989, Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989에 개시된 알고리즘에 의해 핵산을 위해 동일한 유형의 상동성을 구할 수 있다. 두 개의 서열을 정렬하기 위하여 미국 국립 생물공학 정보 센터가 관리하는 웹사이트, 예를 들어 기본 설정으로 Blastn 또는 BlastP를 사용할 수 있다.
예를 들어, 본원에서 사용된 바와 같이, 다른 서열과 특정한 퍼센트의 상동성을 갖는 것으로 기재된 서열은 상기에서 기술된 어느 하나 이상의 계산 방법에 의해 계산된 기재된 상동성을 갖는 서열을 나타낸다. 예를 들어, 본원에서 정의된 바와 같이, 만약 어느 다른 계산 방법으로 계산했을 때 제1 서열이 제2 서열에 대해 80퍼센트의 상동성을 갖지 않더라도, 만약 Zuker 계산 방법을 사용했을 때 제1 서열이 제2 서열에 대해 80퍼센트의 상동성을 갖는 것으로 계산된다면 제1 서열은 제2 서열에 대해 80% 상동성을 갖는 것이다. 다른 예시로서, 본원에서 정의된 바와 같이, 만약 Smith and Waterman 계산 방법, Needleman and Wunsch 계산 방법, Jaeger 계산 방법, 또는 어느 다른 계산 방법으로 계산했을 때 제1 서열이 제2 서열에 대해 80퍼센트의 상동성을 갖지 않더라도, 만약 Zuker 계산 방법 및 Pearson and Lipman 계산 방법 둘 다를 사용했을 때 제1 서열이 제2 서열에 대해 80퍼센트의 상동성을 갖는 것으로 계산된다면 제1 서열은 제2 서열에 대해 80% 상동성을 갖는 것이다. 또 다른 예시로서, 본원에서 정의된 바와 같이, 만약 각각의 계산 방법을 사용했을 때 제1 서열이 제2 서열에 대해 80퍼센트의 상동성을 갖는 것으로 계산된다면(그러나 실제로는 상이한 계산 방법은 흔히 상이한 계산된 상동성 퍼센트 값을 낼 것이다) 제1 서열은 제2 서열에 대해 80% 상동성을 갖는 것이다.
세포 및 조성물
본원의 특정 구체예에서는 개시된 방법과 관련하여 상기에 기술된 것과 같은 화학요법 저항성의 변형된 세포, 그리고 개시된 방법에서 이 세포의 사용이 제공된다. 적합한 세포에 화학요법 저항성을 부여하는 하나 이상의 변형을 포함시키고, 그리고 선택적으로 화학요법 저항성과 관련 없는 하나 이상의 추가적인 변형, 예를 들어 추가적인 HIV/질병 특이적 변형을 포함시키는 것으로 상기 세포를 생성하는 방법 또한 제공된다.
본원의 특정 구체예에서는 본원에 제공된 것과 같은 적어도 하나의 화학요법 저항성의 변형된 세포를 포함하는 조성물 또한 제공되고, 이는 본원에 제공된 방법에서의 사용을 위한 조성물을 포함한다. 일부 구체예에서 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 운반체, 또는 이들의 어느 조합을 더 포함한다.
상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 부형제, 약학적으로 허용가능한 염, 희석제, 운반체, 매개체 및 숙련자에게 잘 알려진 다른 그러한 비활성 제제를 포함할 수 있다. 약학적 제제에 흔히 사용되는 매개체 및 부형제는, 예를 들어, 활석, 아라비아 고무, 락토스, 녹말, 스테아르산 마그네슘, 코코아 버터, 수성 또는 비수성 용매, 기름, 파라핀 유도체, 글리콜 등을 포함한다. 용액은 물 또는 에탄올, 1,2-프로필렌 글리콜, 폴리글리콜, 디메틸설폭사이드, 지방알코올, 트리글리세리드, 글리세린의 부분적 에스테르와 같은 생리적으로 적합한 유기 용제를 사용하여 조제될 수 있다. 조성물은 살균 등장성 식염수, 물, 1,3-부탄디올, 에탄올, 1,2-프로필렌 글리콜, 물과 혼합된 폴리글리콜, 링거액 등을 포함할 수 있는 통상적인 기법을 사용하여 조제될 수 있다. 한 관점에서는 상기 조성물의 위치를 찾아내고 그리고 상기 조성물을 의도한 치료 부위에 제대로 배치하는 것을 가능하게 하기 위해 착색제가 첨가된다.
조성물은 보존제 및/또는 안정제를 포함할 수 있다. 보존제의 비제한적인 예시는 메틸-, 에틸-, 프로필- 파라벤, 벤소산 나트륨, 벤조산, 소르브산, 소르빈산 칼륨, 프로피온산, 염화 벤잘코늄, 벤질 알코올, 티메로살, 페닐머큐레이트 염(phenylmercurate salts), 클로르헥시딘, 페놀, 3-크레솔, 4차 암모늄 화합물(quaternary ammonium compounds: QAC), 클로로부탄올, 2-에톡시에탄올, 및 이미드우레아를 포함한다.
긴장성을 제어하기 위하여 상기 조성물은 나트륨염과 같은 생리적 염을 포함할 수 있다. 염화 나트륨(NaCl)이 바람직하고, 이는 1 내지 20mg/ml 사이로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 다른 염은 염화 칼륨, 인산이수소 칼륨, 인산이나트륨 이수화물, 염화 마그네슘 및 염화 칼슘을 포함한다.
조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 일반적인 완충제는 다음을 포함한다: Tris 완충제, 붕산염 완충제, 석시네이트 완충제, 히스티딘 완충제, 또는 시트르산 완충제. 완충제는 일반적으로 5-20mM 범위의 농도로 포함될 것이다. 조성물의 pH는 일반적으로 5 내지 8 사이일 것이고, 그리고 더 일반적으로는 6 내지 8 사이, 예를 들어 6.5 내지 7.5 사이, 또는 7.0 내지 7.8 사이일 것이다.
일부 구체예에서 상기 조성물은 동결보호제를 포함할 수 있다. 동결보호제의 비제한적인 예시는 글리콜(예를 들어 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 및 글리세롤), 디메틸셀폭사이드(DMSO), 포름아미드, 수크로스, 틀레할로스, 덱스트로스, 및 이들의 어느 조합을 포함한다.
한 구체예에서 상기 세포는 배양된 세포의 군집(즉 시험관 내(in vitro))의 일부이다. 다른 구체예에서는 상기 세포가 대상의 세포의 군집(즉 체내(in vivo))의 일부이다. 예를 들어 변형된 세포 및/또는 비골수제거성 투여량의 화학요법제는 HIV 또는 관심 질병의 치료 또는 예방 목적으로 대상 안에서 조직 또는 장기를 형성하는 체내 세포 또는 체내 세포의 군집에 전달될 수 있다. 그렇지 않으면 변형된 세포 및/또는 비골수제거성 투여량의 화학요법제는 그가 특정한 유형의 세포에 미치는 영향을 연구하기 위한 실험을 실시하는 목적으로 배양된 세포 또는 배양된 세포의 군집에 전달될 수 있다.
상기 조성물은 삽입가능(implantable) 장치에 포함될 수 있다. 본원이 고려하는 적합한 삽입가능 장치는 혈관내 스텐트(예를 들어 자가 확장 가능 스텐트, 풍선 확장 가능 스텐트, 및 스텐트-이식편), 스캐폴드, 이식편(grafts) 등을 포함한다. 그러한 삽입가능 강치는 HIV 또는 다른 질병을 치료하거나 또는 예방할 수 있는 조성물로 적어도 한 표면이 코팅되거나, 또는 그가 주입(impregnated)될 수 있다.
본원에서는 서열을 참조하고 그리고 그는 하기의 표에 있는 서열 또는 그와 균등한 서열을 의미할 수 있다.
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상기 조성물은 어느 적합한 방법 및 경로에 의해 대상에게 투여될 수 있다. 비제한적인 예시는 내부, 폐, 직장, 비강, 질, 혀, 정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 피내 및 피하 경로를 포함한다. 조성물은 크림, 겔, 또는 패치의 일부로서 경피 전달에도 적합할 수 있다. 다른 제형은 정제, 캡슐, 알약, 분말, 에어로졸, 좌약, 비경구용, 및 현탁액, 용액 및 에멀젼을 포함하는 경구용 액체(oral liquids)를 포함한다. 지효성 제형 또한 사용될 수 있다. 비골수제거성 투여량의 화학요법제는 경구로 투여되거나 또는 본원에 제공된 대로 다르게 투여될 수 있다.
일부 구체예에서는 본원에 제공된 구체예가 다음 또한 포함하지만 그에 제한되지는 않은다:
1. 환자에게 골수 이식을 실행하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 환자에게 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포의 군집 및 최소 1회의 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드를 투여하는 단계를 포함한다.
2. 1번 구체예의 방법에 있어서, 상기 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포의 군집은 이종 유전자 암호화 알데히드 탈수소효소 1(ALDH1)이다.
3. 1번 구체예의 방법에 있어서, 상기 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포의 군집은 ALDH1을 발현한다.
4. 1번 구체예의 방법에 있어서, 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포의 시클로포스파미드 저항성은 알데히드 탈수소효소 1(ALDH1)의 발현에 의해 부여된다.
5. 1번 내지 4번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 환자의 골수의 50% 이상은 6개월 이내에 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포 또는 그로부터 유래된 세포로 대체된다.
6. 1번 내지 5번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 상기 환자는 HIV를 가졌다.
7. 1번 내지 6번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 상기 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포는 일과성이다.
8. 1번 내지 7번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 상기 세포는 줄기세포 또는 면역세포이다.
9. 8번 구체예의 방법에 있어서, 상기 줄기세포는 태아 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 조혈 줄기세포(HSC), 다능성 줄기세포(PSC), 유도 PSC(iPSC), 배아 줄기세포(ESC) 또는 이들로부터 유래된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포, CD90+ 세포, CD45+ 세포, CD17+ 세포, CD45RA- 세포, CD38-, 또는 이들의 어느 조합이다.
10. 8번 구체예의 방법에 있어서, 상기 면역세포는 T 세포이다.
11. 1번 내지 10번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 상기 변형된 세포가 환자에 대해 자가 세포이거나, 환자에 대해 동종이형이거나, 또는 이들의 조합이다.
12. 1번 내지 11번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 상기 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포를 만들기 위해 변형되지 않은 세포를 ALDH1의 발현을 위해 암호화하는 발현 벡터와 접촉시키는 단계를 더 포함한다.
13. 12번 구체예의 방법에 있어서, 상기 발현 벡터는 바이러스성 벡터이거나 또는 비바이러스성 벡터이다.
14. 12번 구체예의 방법에 있어서, 상기 바이러스성 벡터는 렌티바이러스성 또는 아데노바이러스성 벡터이다.
15. 12번 구체예의 방법에 있어서, 상기 발현 벡터는 레트로바이러스, 트랜스포존, 에피솜 발현 벡터, 변형된 RNA, 플라스미드, 또는 이들의 어느 조합이다.
16. 1번 내지 15번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 상기 최소 1회의 비골수제거성 투여량의 화학요법제는 상기 변형된 세포의 투여 후에 투여된다.
17. 1번 내지 16번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 상기 최소 1회의 비골수제거성 투여량의 화학요법제는 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드이다.
18. 17번 구체예의 방법에 있어서, 상기 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드는 약 0.16mg/kg/day에서 2.5mg/kg/day 이하이다.
19. 17번 구체예의 방법에 있어서, 상기 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드는 약 0.41mg/kg/day 내지 약 1.63mg/kg/day이다.
20. 17번 구체예의 방법에 있어서, 상기 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드는 약 0.81mg/kg/day 내지 약 1.46mg/kg/day이다.
21. 17번 구체예의 방법에 있어서, 상기 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드는 약 1.3mg/kg/day이다.
22. 17번 내지 21번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 연이은 1-14일 동안 환자에게 100mg/m2/day의 투여량의 시클로포스파미드가 투여되지 않는다.
23. 17번 내지 22번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 12-24시간 동안 환자에게 5-7mg/m2의 투여량의 시클로포스파미드가 투여되지 않는다.
24. 1번 내지 23번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 상기 비골수제거성 화학요법제는 최소 1주, 최소 2주, 최소 3주, 최소 1개월, 최소 2개월, 최소 3개월, 최소 4개월, 최소 5개월, 또는 최소 6개월 동안 매일 투여된다.
25. 1번 내지 24번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포 및 상기 최소 1회의 비골수제거성 투여량의 화학요법제의 투여 사이에 일정 기간 동안 비골수제거성 투여량의 화학요법제를 투여하지 않는 것을 더 포함한다.
26. 25번 구체예의 방법에 있어서, 상기 기간은 약 3일, 약 7일, 약 10일, 및 약 14일로 이루어진 군으로부터 선택된다.
27. 1번 내지 26번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 변형된 세포로 대체된다.
28. 1번 내지 27번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 최소 1회의 비골수제거성 투여량의 화학요법제의 투여의 결과로 환자의 골수가 제거되지 않고 그리고/또는 면역손상의 상태가 아니다.
29. 1번 내지 28번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 환자는 임상적으로 관련된 빈혈, 호중구 감소증, 혈소판 감소증, 범혈구 감소증, 낮은 혈소판, 낮은 백혈구, 낮은 적혈구, 또는 이들의 어느 조합 또는 관련된 증상을 겪지 않는다.
30. 1번 내지 29번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 세포의 투여 전에 사전조건화(preconditioning) 단계가 실행된다.
31. 30번 구체예의 방법에 있어서, 상기 사전조건화 단계는 비골수제거성 화학요법 사전조건화 단계이다.
32. 1번 내지 31번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 상기 변형된 세포는 HIV 감염에 대한 저항성을 있다.
33. 32번 구체예의 방법에 있어서, 상기 변형된 세포는 HIV 감염에 대한 저항성이 있는 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제, HIV 공수용체의 발현을 감소시키는 분자, 또는 이들의 어느 조합을 이종 발현한다.
34. 32번 구체예의 방법에 있어서, 상기 변형된 세포는 shCCR5, shCXCR4, C 펩타이드 융합 억제제 또는 이들의 어느 조합을 이종 발현한다.
35. 32번 구체예의 방법에 있어서, 상기 변형된 세포는 HIV 공수용체를 발현하지 않는다.
36. 32번 구체예의 방법에 있어서, 상기 변형된 세포는 CCR5, CXCR4, 또는 CCR5-Δ32 또는 이들의 조합을 발현하지 않는다.
37. ALDH1 및 다음 중 하나의 발현을 위해 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 세포: i) 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제, HIV 공수용체의 발현을 감소시키는 분자, 또는 이들의 어느 조합을 위해 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 분자; 및/또는 ii) 내인성 HIV 공수용체 돌연변이 또는 결실.
38. 37번 구체예의 방법에 있어서, 상기 세포는 i. CCR5의 발현을 감소시키는 분자를 위해 암호화; ii. CXCR4의 발현을 감소시키기 위해 암호화; iii. C 펩타이드 융합 억제제의 발현을 위해 암호화; iv. 1, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함; v. SEQ ID NO: 10, 11, 6, 7, 13, 15, 17, 19, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 위해 암호화; 또는 이들의 어느 조합을 수행하는 이종 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
39. 37번 및 38번 구체예의 방법에 있어서, 상기 세포는 shCCR5, shCXCR4, 및/또는 C44와 같은 C 펩타이드 융합 억제제를 발현한다.
40. 37번 구체예의 방법에 있어서, 상기 세포는 이종 뉴클레오타이드 서열을 발현하도록 비바이러스성 유전자 전달 시스템으로 변형된다.
41. 40번 구체예의 방법에 있어서, 상기 비바이러스성 유전자 전달 시스템은 트랜스포존 전달 시스템이다.
42. 37번 구체예의 방법에 있어서, 상기 트랜스포존 전달 시스템은 슬리핑뷰티 유전자 전달 시스템 또는 피기백 트랜스포존 유전자 전달 시스템이다.
43. 37번 내지 42번 중 어느 한 구체예의 방법에 있어서, 상기 세포는 SEQ ID NO: 4의 이종 핵산 서열을 포함한다.
44. 37번 내지 43번 중 어느 한 구체예의 세포를 하나 이상 포함하는 조성물.
45. ALDH1 및 다음 중 하나를 위해 암호화하는 핵산 분자: i) 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제, HIV 공수용체의 발현을 감소시키는 분자, 또는 이들의 어느 조합.
46. 45번 구체예의 핵산 분자에 있어서, 이종 뉴클레오타이드 서열은 i. CCR5의 발현을 감소; ii. CXCR4의 발현을 감소시키는 분자를 암호화; C 펩타이드 융합 억제제의 발현을 위해 암호화; 또는 이들의 어느 조합을 수행한다.
47. 45번 및 46번 구체예의 핵산 분자에 있어서, 상기 핵산 분자는 shCCR5, shCXCR4, 및/또는 C 펩타이드 융합 억제제의 발현을 위해 암호화한다.
48. 45번 구체예의 핵산 분자에 있어서, 상기 분자는 1, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함한다.
49. 45번 구체예의 핵산 분자에 있어서, 상기 분자는 SEQ ID NO: 10, 11, 6, 7, 13, 15, 17, 19, 또는 이들의 어느 조합을 위해 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
50. 45번 내지 49번 중 어느 한 구체예의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
51. 50번 구체예의 벡터에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스를 만드는데 사용될 수 있는 벡터이다.
52. 50번 구체예의 벡터에 있어서, 상기 벡터는 렌티바이러스성 벡터이다.
53. 50번 구체예의 벡터에 있어서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 1, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함한다.
54. 50번 구체예의 벡터에 있어서, 상기 벡터는 SEQ ID NO: 10, 11, 6, 7, 13, 15, 17, 19, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 위해 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
55. 대상의 HIV를 치료하는 방법으로, 상기 방법은 ALDH1 및 다음 중 하나를 이종 발현하는 세포의 군집을 대상에게 투여하는 단계를 포함한다: i) 적어도 하나의 HIV 공수용체, 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제, HIV 공수용체의 발현을 감소시키는 분자, 또는 이들의 어느 조합을 위해 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 분자; 및 적어도 한 비골수제거성 투여량의 화학요법제.
56. 55번 구체예의 방법에 있어서, 상기 세포는 shCCR5, shCXCR4, 및/또는 C 펩타이드 융합 억제제를 발현한다.
57. 55번 구체예의 방법에 있어서, 상기 세포는 1, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함한다.
58. 55번 구체예의 방법에 있어서, 상기 세포는 SEQ ID NO: 10, 11, 6, 7, 13, 15, 17, 19, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 위해 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
59. 대상 안에서 관심 분자를 발현시키는 방법으로서, 상기 방법은 대상에게 ALDH1 및 관심 분자를 이종 발현하는 세포를 투여하는 단계; 및 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드를 투여하는 단계를 포함한다.
60. 59번 구체예의 방법에 있어서, 상기 세포는 CD34+ 및/또는 CD4+, 또는 본원에 제공된 다른 것이다.
61. 59번 구체예의 방법에 있어서, 상기 관심 분자는 CCR5의 발현을 감소; CXCR4의 발현을 감소; C 펩타이드 융합 억제제의 발현을 위해 암호화; 또는 이들의 어느 조합을 수행하는 것이다.
62. 61번 구체예의 방법에 있어서, CCR5의 발현을 감소시키는 관심 분자는 shCCR5이다.
63. 61번 구체예의 방법에 있어서, 상기 분자는 SEQ ID NO: 6 및/또는 SEQ ID NO: 7을 포함하거나 또는 그를 암호화하는 핵산 분자를 포함한다.
64. 61번 구체예의 방법에 있어서, 상기 C 펩타이드 융합 억제제는 SEQ ID NO: 11, 15, 19, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함한다.
하기의 실시예는 본원에 기술된 화합물, 조성물 및 방법을 설명하기 위한 예시이고 제한적이지 않다. 당업계의 숙련자에게 공지된 다른 적합한 변형 및 번안은 하기의 구체예의 범위 내에 있다.
실시예
실시예 1: 마우스에서 자가 골수 이식의 생착 효율성
방법
골수의 분리. 0.5mM EDTA, 2% 소태아혈청(FBS) 및 항생제를 함유하는 이소코브 변형 둘베코 배지(Iscove's modified Dulbecco's medium: IMDM)로 생후 8 내지 16주의 동계 공여자 마우스의 대퇴골 및 경골로부터 골수를 관류시켰다(flushed). 세포는 5mM EDTA 및 소태아혈청을 함유하는 완충제(인산 완충 식염수: PBS)로 세척되었다.
골수의 형질도입. 마우스 골수세포는 형질도입 후 48시간 뒤에 MOI 10으로, 오직 EGPF(즉 pLV-Puro-EF1A-EGFP("대조군 벡터")) 만을 발현하는 렌티바이러스성 벡터 또는 EGFP 및 인간 ALDH1A(즉 pLV-Puro-EF1A-EGFP-hALDH1A, 도 4, SEQ ID NO: 2("시험 벡터"))를 발현하는 렌티바이러스성 벡터로 형질도입되었다. 형질도입 효율성은 FACS에 의해 계산되었다. 그런 다음 세포는 하기에 기술된 바와 같이 조사된 마우스에 이식되었다.
이식. 동계 수여자 마우스(Balb/c)는 4일 전 그리고 5일 전에는 0.5mg/kg의 플루다라빈, 2일 전에는 시클로포스파미드, 그리고 1일 전에는 부설판으로 전처리되었다. 이식 당일(0일)에 마우스가 마취되었고 그리고 꼬리 혈관 주사를 통해서 각 마우스 당 100μl IMDM에 있는 4 x 106 골수세포가 이식되었다. 이식의 조혈기능 회복은 GFP의 분석으로 FAC에 의해 모니터링되었다.
시클로포스파미드 치료. 이식 7일 후, 마우스는 상이한 투여량의 CTX를 매일 복강내(i.p.) 주사로 투여받았다: 0mg/kg("0mg/kg 이식 후 CTX"), 16mg/kg("16mg/kg 이식 후 CTX"), 또는 30mg/kg("30mg/kg 이식 후 CTX"). 이 연구 도중에 치료는 총 6주의 CTX 치료로서 5주의 CTX, 1주의 CTX 없음, 뒤이어 1주의 CTX 치료를 포함했다.
말초혈액 GFP 분석. 각 마우스로부터 안구 뒤 또는 꼬리 혈관으로 50마이크로리터의 말초혈액이 채취되었고 그리고 0.5mM EDTA를 함유하는 1ml PBS와 혼합되었다. 세포는 적혈구가 용해되고, PBS에 세척되고 그런 다음에 400ul PBS에 더 희석되었다. 살아있는 GFP+ 과립구의 퍼센트는 유동 세포 분석기를 사용하여 분석되었다.
골수의 말기 분석(terminal analysis). 6주의 CTX 치료 후, 동물은 희생되었고 그리고 유동 세포 분석법으로 골수에 있는 GFP+ 세포의 퍼센트가 분석되었다. 빛의 굴절에 따라 각자 크기 및 내부 복합도(입상도)로 세포가 플롯되는 통상의 전방 대 측면 산란 분산(forward vs. side scatter dispersion)을 사용하여 과립구/호중구가 식별되었다. 각각의 이식 후 CTX 없음 치료군에 있어서 n=3이었고, 그 외 모든 군에 있어서 n=6이었다. 6주 후에는 각 쥐에 대해 백혈구 수가 계산되었다. 결과는 CTX로 치료된 각 군에 있는 이상치의 존재를 보여줬고 그 데이터는 통계 분석을 위해 제외되었다. 따라서 각각의 이식 후 CTX 없음 치료군에 있어서 n=3이었고, 그 외 모든 군에 있어서 n=5이었다.
결과 및 논의
이식 후 골수의 재증식을 관찰할 때, 말초혈액이 이식 성공을 나타낼 수 있지만, 골수가 상이한 수명을 가진 다양한 면역세포가 생기게 하기 때문에, 그러기 전에 면역 세포의 세포 복잡성을 이해할 필요가 있다. 예를 들어 림프구의 수명은 180일에 이를 수 있는 반면, 호중구의 수명은 5-7일 밖에 되지 않는다. 그에 더하여 단핵구는 말초에서 며칠만 살 수 있지만, 그는 조직 상주(tissue-resident)가 될 수 있어 그의 수명을 몇 개월로 늘릴 수 있다. 따라서, 만약 공여자 골수의 재건에 대해서 림프구 군집을 분석할 경우, 시술 6개월 후에 공여자의 이식 전 림프구가 전부 죽기 전까지는 정확한 반영을 얻지 못 할 것이다. 수여자 세포의 골수 생착의 더 "실시간"의 판독을 제공하기 위해서는 과립구 군집이 가장 근접하게 나타낸다. 공여자의 이식 전 호중구가 7일 이내에 전부 죽기 때문에, 이식 후 둘째 주에서는 이 세포가 골수 환경 및 수여자 이식의 성공을 가장 직접적으로 반영하고, 이는 생착률을 반영하는 형질도입된 호중구의 퍼센트를 확인하는 것으로도 측정될 수 있다.
하기에 기술된 방법에 따라, 연구 23일, 35일, 및 42일(각자 CTX 투여의 16일, 28일, 및 35일)에 안구 뒤 채혈로 채취되었고 그리고 각 마우스의 말초 혈액에 있는 GFP+ 과립구의 퍼센트가 유동 세포 분석법으로 분석되었다.
결과는 모든 군의 마우스가 살아있는 GFP+ 과립구를 가졌다는 것을 보여줬다(도 1). 그에 더하여, 연구 42일 째에는 시험 벡터(즉 EGFP+ ALDH1A1을 발현하는 세포)로 형질도입된 골수세포가 투여되고 그리고 16mg/kg/day CTX로 치료받은 마우스가 시험 벡터로 형질도입된 골수세포가 투여되고 그리고 30mg/kg/day CTX로 치료받은 마우스와 유사한 퍼센트의 살아있는 GFP+ 과립구를 보였다(도 1, "시험 벡터, 16mg/kg 이식 후 CTX"와 "시험 벡터, 30mg/kg 이식 후 CTX" 비교).
6주 후의 결과는 총 GFP+ 세포(살아있는 세포와 죽은 세포)의 존재를 나타낸다(도 2a). 생착은 살아있는 GFP+ 과립구/호중구 군집의 퍼센트로 보여졌다(도 2b). 놀랍게도 시험 벡터(즉 EGFP + ALDH1A1을 발현)로 형질도입된 골수세포가 투여되고 그리고 비골수제거성의 16mg/kg/day CTX로 치료된 마우스와 시험 벡터로 형질도입된 골수세포가 투여되고 그리고 비골수제거성의 30mg/kg/day CTX로 치료된 마우스 모두 40% 이상의 유사한 생착을 보였다(도 2b, "시험 벡터, 16mg/kg p.t. 이식 후 CTX"와 "시험 벡터, 30mg/kg p.t. 이식 후 CTX" 비교). 또한 시험 벡터로 형질도입된 골수세포가 투여되고 그리고 16mg/kg/day CTX로 치료된 마우스는 대조군 벡터로 형질도입된 골수세포가 투여되고 그리고 동일한 투여량의 CTX(즉 16mg/kg/day CTX)로 치료된 마우스와 비교하여 상당히 더 놓은 퍼센트의 생착을 가졌다(도 2b, "시험 벡터, 16mg/kg p.t. 이식 후 CTX"와 "대조군 벡터, 16mg/kg p.t. 이식 후 CTX" 비교).
백혈구(WBC)는 신체에 침범하는 외부 물질을 공격하는 것으로 감염과 싸우는 것을 돕는다. WBC 수는 숨겨진 감염 및/또는 감염 감수성을 검출하는 데 도움이 될 수 있다. 말초혈액에 있는 WBC 수는 CTX 치료 6주 후에 각 연구 군에 대해 계산되었다. 도 3에 도시된 바와 같이, 대조군 벡터 또는 시험 벡터로 형질주입된 골수세포가 투여되었고 CTX 치료는 받지 않은 마우스는 정상 범위 내의 WBC 수를 가졌다. 각각의 CTX 치료된 군에는 하나의 이상치가 있었고, 이는 통계 분석을 위해 제외되었다. 높은, 정상, 그리고 낮은 WBC의 범위는 Charles River Research Models(BALB/C Mouse Hematology, North American Colonies, January 2008-December 2012), http://www.criver.com/files/pdfs/rms/balbc/rm_rm_r_balb-c_mouse_clinical_pathology_data.aspx에 수컷 마우스에 대해 제공된 것과 같이 당업계에 공지된 범위에 따른 것이다. 특히 시험 벡터로 형질도입된 골수세포가 투여되고 그리고 16mg/kg/day CTX로 치료된 마우스는 시험 벡터로 형질도입된 골수세포가 투여되고 그리고 30mg/kg/day CTX로 치료된 마우스에 비교하여 상당히 더 높은 수의 WBC를 가졌다(도 3, "시험 벡터, 16mg/kg p.t. 이식 후 CTX"와 "시험 벡터, 30mg/kg p.t. 이식 후 CTX" 비교).
실시예 2: 체내 인간화(humanized) 마우스 연구 #1
줄기세포의 정제. 인간 PBMC는 5일 동안 5mcg/kg/day의 과립구 집락 자극 인자(G-CSF)(Amgen, Thousand Oaks, CA)로 치료받은 건강한 공여자로부터 채집되고 그리고 뒤이어 5일 및 6일 째에 백혈구 성분채집술이 실시된다. 환자는 분리를 위해 골수로부터의 CD34+ 줄기세포를 말초로 동원하기 위해 10μg/kg 필그라스팀 또는 G-CSF의 요법을 받을 것이다. 말초혈액에 있는 CD34+ 세포 수가 10.0 내지 20.0 x 106/kg body weight를 초과했을 때 성분채집술이 실행된다. CD34+는 양성 선별 증균에 뒤이어 자기구슬 분리를 사용하는 것으로 정제될 수 있다. 샘플은 2% FBS를 함유하는 PBS에 세척되고, 원심분리되고 그리고 PBS에 재현탁된다. 그런 다음에 CD34+ 세포는 CD34 염색으로 FACS 분석에 의해 순도에 대해 검사되고, 그리고 생존력은 트리판 블루 염색에 의해 분석될 수 있다. 그런 다음에 세포는 즉시 쥐에 이식된다. 헬싱키 선언 프로토콜을 준수하여 채집 전에 공여자로부터 제대로 된 서면 동의 및 고지에 입각한 동의를 받을 것이다.
NOG 마우스 내로 인간 HSC의 이식. 성체 쥐는 생후 10-12주의 NOG 마우스였다. 신생 마우스로는 생 후 1-2일의 마우스가 사용된다. 성체 마우스는 2-2.5Gy 그리고 신생 마우스는 1Gy로 세포 전달 1일 전에 SPF 조건 하에 조사된다. 체중이 18g 이하인 마우스는 간혹 이 조사량에서 사망한다. 이소플루란에 의한 약한 마취 하에서 성체 마우스에 0.25mL(1-0.5 x 104)의 세포 현탁액이 27G 바늘을 가진 1mL 주사기 또는 29G 바늘을 가진 미량주사기로 꼬리 혈관을 통해 주사된다.
줄기세포의 형질도입. 동일한 공여자로부터의 CD34+　세포는 피브로넥틴으로 코팅된 용기(vessels)에서 100ng/ml의 줄기세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 및 Fms 관련 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3L)(CellGenix, Freiberg, Germany) 그리고 선택적으로 IL-2, IL-3, IL-6, 또는 이들의 어느 조합으로 보충된 X-Vivo 10 배지(Lonza)에 1 x 106　cells/ml로 37℃, 5% CO2에서 16시간 동안 배양된다. 그런 다음에 사전자극 배지는 제거되고 새로운 배양 배지가 더해지고, 이는 MOI 2 내지 MOI 50 사이의 감염다중도(multiplicity of infection: MOI)를 나타내는 1.35 x 108　tu/ml 벡터("대조군 벡터"=pLV-Puro-EF1A-EGFP 또는 "시험 벡터"=SEQ ID NO: 4, 도 5) 및 4mg/ml 황산 프로타민(Sigma, Saint Louis, MO)을 부가적으로 함유한다. 이 형질도입 혼합물은 12시간에서 48시간 사이 동안 배양기에 되돌려 보낸다. 형질도입된 세포는 트립신(Lonza, Walkersville, MD)으로 리프트(lifted)되고, 세척되고, PBS에 재현탁되고 그리고 쥐에 즉시 이식된다(상기에 기술된 바와 같이 조사 없이). 말초혈액 GFP 분석 및 비장, 혈액 및 골수의 말기 분석은 상기에 기술된 바와 같이 실행된다. 연구의 도식적인 묘사가 도 8에 도시되지만 이 묘사는 예시를 사용하여 설명하기 위한 목적일 뿐이며 다른 연구 디자인도 사용될 수 있다.
실시예 3: 체내 인간화 마우스 연구 #2
줄기세포의 정제. 인간 PBMC는 5일 동안 5mcg/kg/day의 과립구 집락 자극 인자(G-CSF)(Amgen, Thousand Oaks, CA)로 치료받은 건강한 공여자로부터 채집되고, 뒤이어 5일 및 6일 째에 백혈구 성분채집술이 실시된다. CD34+는 면역 자기구슬을 사용하는 양성 선별로 정제된다. 샘플은 0.5% HSA를 함유하는 PBS에 세척되고, 원심분리되고 그리고 PBS에 재현탁된다. 그런 다음에 CD34+ 세포는 CD34 염색 및 생존력 염료(viability dye)로 유동 세포 분석에 의해 순도에 대해 검사된다. 그런 다음에 세포는 즉시 쥐에 이식된다. 헬싱키 선언 프로토콜을 준수하여 채집 전에 공여자로부터 제대로 된 서면 동의 및 고지에 입각한 동의를 받을 것이다.
NOG 마우스 내로 인간 HSC의 이식. 성체 쥐는 생후 10-12주의 NOG 마우스가 사용된다. 신생 마우스로는 생후 1-2일의 마우스가 사용된다. 성체 마우스는 2-2.5Gy 그리고 신생 마우스는 1Gy로 세포 전달 1일 전에 SPF 조건 하에 조사된다. 체중이 18g 이하인 마우스는 간혹 이 조사량에서 사망한다. 성체 마우스에 0.25mL(1-0.5 x 104)의 세포 현탁액이 27G 바늘을 가진 1mL 주사기로 꼬리 혈관을 통해 주사된다.
줄기세포의 형질도입. 동일한 공여자로부터의 CD34+　세포는 피브로넥틴으로 코팅된 용기에서 100ng/ml의 줄기세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 및 Fms 관련 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3L)(CellGenix, Freiberg, Germany) 그리고 선택적으로 IL-3 및 IL-6으로 보충된 X-Vivo 10 배지(Lonza)에 1 x 106　cells/ml로 37℃, 5% CO2에서 16시간 동안 배양된다.
그런 다음에 사전자극 배지는 제거되고 새로운 배양 배지가 더해지고, 이는 1.35 x 108　tu/ml 벡터("대조군 벡터"=pLV-Puro-EF1A-EGFP 또는 "시험 벡터"를 부가적으로 함유하고 그리고 MOI 2 내지 MOI 50 사이의 감염다중도(MOI)를 나타낸다. 적합한 "시험 벡터"는 하기의 중 어느 하나 또는 조합을 포함한다:
Figure pct00015
이 형질도입 혼합물은 12시간에서 48시간 사이 동안 배양기에 되돌려 보낸다. 형질도입된 세포는 수확되고, 세척되고, PBS에 재현탁되고 그리고 쥐에 즉시 이식된다(상기에 기술된 바와 같이 조사 없이).
말초혈액 GFP 분석 및 비장, 혈액 및 골수의 말기 분석은 상기에 기술된 바와 같이 실행된다. 연구의 도식적인 묘사가 도 8에 도시되지만 이 묘사는 예시를 사용하여 설명하기 위한 목적일 뿐이며 다른 연구 디자인도 사용될 수 있다.
실시예 4: 렌티바이러스 개념 증명 연구
렌티바이러스성 벡터 발현. 인간 CD34+ 세포는 4개의 발현 카세트를 함유하는 렌티바이러스성(LV) 벡터로 형질도입된다. ALDH 및 C 펩타이드, shRNA 매개 CCR5의 넉다운, 그리고 선택적으로 shRNA 매개 CXCR4의 넉다운의 발현 수준이 형질도입된 세포 내에서 평가된다. 그런 다음에 세포의 C 펩타이드 발현은 CCR5의 넉다운과 상관 관계를 보여준다.
간단하게, CSF 동원된, 냉동보존된 인간 CD34+ 세포는 바이알의 내용물이 완전히 액체상이 될 때까지 37℃에서 해동된다. 세포는 멸균 15mL 원뿔형 튜브(Corning, Tewksbury, MA)로 옮겨진다. 한 방울씩(dropwise), 그리고 약한 교반과 함께, 사전에 데워진(pre-warmed) 배지 X-Vivo 10 무혈청 배지(Lonza, Basel, Switzerland)가 15mL에 첨가된다. 그런 다음에 세포는 5분 동안 200-300 x g에서 원심분리된다. 상청액을 흡입한 후, 펠렛은 10mL 배지에 재현탁되고 그리고 계수 및 생존력 계산을 위해 작은 부분 표본을 유지한다. 그런 다음에 세포는 원심분리, 상청액 흡입, 그리고 1.0 x 2.0 x 106 cells/m의 밀도로 재현탁되고 그리고 T75cm3 조직 배양 플라스크(Corning, Tewksbury, MA)로 옮겨진다.
세포는 각각 100ng/ml의 줄기세포 인자(SCF), 트롬보포이에틴(TPO), 및 flt3/flk2 리간드(Flt3L)(R&D Systems, Minneapolis, MN)를 배양 배지에 첨가하고 그리고 5% CO2 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양하는 것으로 사전자극된다. 그 뒤에 상기 세포를 배양기에서 꺼내서 원심분리한다. 세포는 SCF 및 Flt3L 둘 다 100ng/mL, 10ng/mL TPO, 및 60ng/mL의 IL-3으로 보충된 X-Vivo 10 배지에 1.0 x 106　cells/ml의 밀도로 재현탁된다. 그런 다음에 12웰(well) 비조직 배양 처리된 레트로넥틴(5μg/cm2) 코팅된 플레이트(TaKaRa Bio, Shiga, Japan)에 1.0 x 106 세포가 시딩된다(seeded).
렌티바이러스성 입자는 37℃에서 해동되고(CCR5.C펩타이드.LV 또는 CCR5.C 펩타이드.ALDH.LV) 그리고 해동되었을 때 부드럽게(gently) 혼합된다. 각각의 입자는 약 2 내지 50, 예를 들어 9의 MOI로 배지에 첨가되고, 그리고 플레이트를 부드럽게 빙빙 돌리는(swirling) 것으로 혼합된다. 그런 다음에 세포는 37℃의 5% CO2 배양기에 되돌려 보내고 그리고 24시간 내지 48시간 동안 배양된다. 그 뒤에 유동 세포 분석법 및 qRTPCR 평가에 의한 세포 계수, 생존력 및 형질도입 효율성을 위해 샘플이 유지된다.
나머지 세포는 원심분리되고, 상청액이 부드럽게 흡입되고, 그리고 1mL/well의 신선한 X Vivo 10 배지가 각각의 웰에 첨가된다. 플레이트는 인큐베이터에 되돌려 보낸다. 세포는 형질도입 후 3일 까지 증식될 수 있다.
유동 세포 분석법 염색 및 분석이 즉시 진행된다. 만약 LV 구조물이 형광 마커를 함유한다면 MacsQuant FACS Analyzer에서의 획득이 수행될 것이다. 만약 벡터에 형광 마커가 함유되지 않았을 경우, 표적 단백질 또는 HIV-1 LTR 전사 활성화를 위한 염색 절차가 수행될 것이다.
세포는 특성화를 위해 더 사용될 수 있다. 만약 특성화가 더 필요하지 않을 경우, 형질도입(또는 형질도입 후 확산)에 바로 뒤이어 세포는 50% IMEM(Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA), 45% 사람 혈청 알부민(HAS)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 및 5% 0.2μm 필터된 DMSO의 용액에 5 x 106cells/mL의 밀도로 자동 동결 시스템(control-rate freezer)에서 냉동보존된다. 세포는 즉시 액체 질소로 옮겨지거나 또는 드라이아이스와 함께 배송될 수 있다.
화학 보호(Chemoprotection). ALDH 발현을 보이는 LV 벡터(예를 들어 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 5)로 형질도입된 인간 CD34+ 세포는 화학요법제에 대한 저항성을 입증하기 위해 다양한 투여량의 시클로포스파미드로 처리된다. 실험은 형질도입된 그리고 형질도입되지 않은 세포와 다양한 투여량의 마포스파미드의 혼합 배양을 처리하는 것으로도 실행될 수 있다. 형질도입된 그리고 형질도입되지 않은 세포 모두의 생존은 각 투여량의 시클로포스파미드 처리 후에 측정된다.
간단하게, 동결건조된 마포스파미드는 증류수에 있는 1mg/mL의 작업 원액(working stock solution)에 재현탁된다. 그런 다음에 형질도입된 세포는 정규 배지(RPMI + 10% FBS)에 한 번 세척되고 그리고 형질도입된 세포(시험 벡터(예를 들어 SEQ ID NO: 4) 및 대조군 벡터(예를 들어 SEQ ID NO: 5) 모두)는 MethoCult 3330 배지(StemCell Technologies, Vancouver, BC, Canada)에 0.5 x 106cells/mL의 밀도로 재현탁된다. 최종 용액은 FBS, 에리트로포이에틴(1U/ml), IL-3(200U/ml), IL-6(200U/ml), SCF(100ng/ml), IL-1β(200ng/ml) 및 100ng/ml의 과립구 집락 자극 인자(Stem Cell Technologies)로 보충된, α 배지에 있는 0.8% 메틸셀룰로스로 이루어질 수 있다.
각 세트의 접시(dishes)(대조군 및 시험)에 마포스파미드가 다음의 최종 농도로 첨가된다: 0.15, 2.5, 5, 10, 15, 20μM. 그런 다음에 플레이트는 37℃, 5% CO2에서 14일 동안 배양된다. 14일 후, 집락이 각 플레이트에서 도립 광학 현미경을 사용하여 점수가 매겨진다(scored). 그런 다음에는 시험 벡터 및 대조군 벡터 발현 세포에 의해 형성된 집락 수의 어느 유의한 통계적 차이를 구하기 위해 Mann-Whitney U 테스트가 실행된다.
실시예 5: 융합 억제 연구
인간화 마우스의 비장 및 가슴샘으로부터 분리된 T 세포는 상기에 기술된 바와 같이 HIV 균주(strains)와 함께 배양된다. C44 발현 수준은 유동 세포 분석법으로 검출되는 C 펩타이드를 인식하는 항Gp41 항체를 사용하여 평가된다. 그런 다음에 C 펩타이드 발현 수준(양성 및 중간값의 형광 강도의 퍼센트)은 HIV 융합 차단 정도와 상관 관계를 보여준다.
재료 및 시약. 293T 세포(ATCC); pAdVAntage(Promega Corporation); pCMV4-BlaM-Vpr(Addgene); pNL4-3 프로바이러스성 DNA(NIH AIDS Reagent Program) 또는 TN6-GFP 암호화 일차 Env; DMEM(Mediatech, Cellgro®); RPMI 1640(Mediatech, Cellgro®); 1x 인산 완충 식염수(PBS); 소태아혈청(FBS); 100 U/ml의 페니실린 및 100 U/ml의 스트렙토마이신(Thermo Fisher Scientific, Gibco®); 2M CaCl2; Alliance HIV-I p24 ELISA kit (PerkinElmer) 또는 FlaQ 분석 시약(Hayden et al., 2003); 말초혈액 림프구(PBLs); CCF2-AM 기질 및 로딩(loading) 용액(Thermo Fisher Scientific); CO2 비의존 배지(Thermo Fisher Scientific, Gibco®); 프로베네시드(Sigma-Aldrich); APC-Cy7에 접합된 마우스 항인 CD3 및 PE-Cy7에 접합된 마우스 항인 CD4(BD Biosciences); BD CompBeads(BD Biosciences); 16% 파라포름알데히드(Electron Microscopy Sciences); HBSS(조제 방법 참조); 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium: DMEM) 배양 배지(조제 방법 참조); 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute: RPMI) 배양 배지(조제 방법 참조); CCF2 로딩 용액(조제 방법 참조); 250mM NaOH에 조제된 프로베네시드의 원액(250 mM)(조제 방법 참조); 발달(Development) 배지(조제 방법 참조).
벡터. pLV[Exp]-H1>hCCR5[shRNA] EF1A>hALDH1A1[NM_000689.4](ns):T2A:{C 펩타이드}(예를 들어 SEQ ID NO: 4).
조제 방법(recipes). HBSS(280mM NaCl; 10mM KCl; 1.5mM Na2HPO4; 12mM 덱스트로스; 50mM N-(2-하이드록시에틸피페라진)-N'-(2-에탄설폰산)(HEPES)(pH 7.05); -20℃에서 보관.
유동 세포 분석법 염색 완충제(Ca++ 및 Mg++이 없는 1x 인산 완충 식염수(PBS); 0.5% HSA; 4℃에서 보관).
둘베코 변형 이글 배지(DMEM) 배양 배지(DMEM; 10% 열불활성화 소태아혈청; 100U/ml의 페니실린; 100μg/ml의 스트렙토마이신).
RPMI 배양 배지(RPMI 1640; 10% 열불활성화 소태아혈청; 100U/ml의 페니실린; 100μg/ml의 스트렙토마이신).
CCF2 로딩 용액: 원액(1mM CCF2-AM)을 만들기 위해 디메틸설폭사이드(CCF2 키트의 용액 A)에 CCF2-AM 재현탁. 부분 표본으로 분할하고 그리고 어두운 곳에서 -80℃에서 보관. 1μl의 1mM CCF2-AM과 100mg/ml의 Pluronic-F127 및 0.1% 아세트산을 함유하는 9μl의 용액(CCF2 키트의 용액 B)를 볼텍스 혼합(vortex-mixing)으로 혼합. 1ml의 CO2 비의존 배지를 첨가하고 다시 볼텍스 혼합. 250mM NaOH에 조제된 프로베네시드(250mM)의 원액. 부분 표본으로 분할하고 그리고 -20℃에서 보관.
발달 배지(2.5mM 프로베네시드; CO2 비의존 배지에 있는 10% 소태아혈청).
장비. T175 cm2 배양 플라스크; 96웰 V형 바닥 플레이트(Corning Incorporated); 5, 10, 25ml 피펫; 50ml Falcon 튜브; 0.22μm 기공크기 Steriflip(EMD Millipore); 2ml Nalgene 튜브(Thermo Fisher Scientific); 투명 초원심분리 튜브(BD); 37℃, 5% CO2 배양기; SW28 로터를 가진 초원심분리기; 유동 세포 분석기. 단독의 융합 분석법은 바이올렛 레이저 자극(violet laser excitation)(405nm) 및 두 개의 측정 파라미터를 구비하는 유동 세포 분석기를 필요로 한다. 흔히 Pacific Blue의 검출을 위해 사용되는 450/50nm 대역 필터를 갖는 광전 증폭관(PMT)은 절개된 CCF2 기질의 검출을 위해 사용된다. 흔히 Amcyan 검출을 위해 사용되는 515/20nm 대역 필터를 갖는 다른 PMT는 절개되지 않은 CCF2 기질의 검출을 위해 사용된다. CD3 및 CD4 항체와 연관된 플루오로크롬의 측정을 위해서는 추가적인 PMT가 필요하다. APC-Cy7은 633nm 적색 레이저로 자극되고 그리고 755 롱 패스 필터를 갖는 PMT로 검출된다. PE-Cy7은 531nm 황록색 레이저로 자극되고 그리고 755 롱 패스 필터를 갖는 PMT로 검출된다.
소프트웨어. FlowJoX 소프트웨어(Tree Star) 또는 다른 FACS 분석 소프트웨어.
융합 억제 분석법. 1.5 x 107 293T 세포는 T175-cm2 조직 배양 플라스크에 20ml의 DMEM 배양 배지와 함께 플레이트되고(plated) 그리고 5% CO2 가습 배양기에 37℃에서 하룻밤 동안 배양된다. 60μg의 TN6-GFP 프로바이러스성 DNA, 20μg의 pCMV-BlaM-Vpr, 및 10μg의 pAdVAntage 벡터를 밤유하는 1.75 ml of H2O가 조제된다. 그런 다음에 2ml의 2x HBSS가 천천히 첨가되고 그리고 위아래로 피펫팅(pipetting)하는 것으로 부드럽게 혼합된다. 250μl의 2M CaCl2이 한 방울씩 첨가된다. 상온에서 10분 동안 배양하는 것으로 DNA가 침전된다. 293T 세포 배양 배지는 37℃로 미리 데워진 40ml의 신선한 DMEM 배양 배지로 대체된다. 그 다음에는 4ml의 DNA 침전물이 첨가되고 그리고 37℃에서 16시간 동안 배양된다. 그런 다음에 상기 배지는 37℃로 미리 데워진 40ml의 신선한 DMEM 배양 배지로 대체되고 그리고 37℃에서 24시간 동안 배양된다.
핵산전달감연된 293T 세포의 상청액은 50mL Falcon 튜브에 수확되고 그리고 세포 조직파편을 제거하기 위해 상온에서 10분 동안 원심분리된다. 그런 다음에 정화된 상청액이 Steriflip을 통해 여과된다. 36ml의 비리온 함유 상청액은 Ultra-Clear 원심분리 튜브로 옮겨진다. 상기 튜브는 SW28 로터의 버켓에 놓이고, 필요할 경우, DMEM 배양 배지로 균형 잡고(balanced), 그리고 브레이크를 사용하지 않고 4℃에서 초원심분리(72,000 x g, 90분)된다. 상척액은 제거되고 그리고 바이러스성 펠렛은 1ml의 DMEM에 재현탁되고, 100μl 부분 표본으로 분할되고, 그리고 -80℃에서 보관된다.
바이러스성 제제의 p24Gag 내용물은 효소 결합 면역흡착 검사 또는 FlaQ 분석법으로 수량화된다(Maiti et al., 2014).
PBL은 RPMI 배양 배지로 세척되고, PBL이 계수되고, 그리고 2 x 107cells/ml로 RPMI 배양 배지에 현탁된다. 세포 현탁액은 V형 바닥의 96웰 플레이트에 시험될 조건 당 100μl(2 x 106 세포)의 부분 표본으로 분할된다. 세포의 두 개의 추가적인 부분 표본이 보상 대조군의 역할을 하도록 두 개의 웰로 분배된다. 한 웰은 CCF2 기질로 로딩되고 그리고 다른 하나는 로딩되지 않은 채로 남아 있는다. 이 두개의 대조군 웰은 항CD3-APC-Cy7 및 항CD4-PE-Cy7 항체로 염색되지 않는다.
400ng의 p24Gag와 동등한 양의 BlaM-Vpr을 함유하는 HIV-1 비리온이 "비감염 대조군" 및 두 개의 보상 대조군을 제외한 모든 웰에 첨가되고 그리고 37℃에서 2시간 동안 배양된다.
그런 다음에 세포는 상온에서 5분 동안의 원심분리로 채집되고 그리고 200μl의 CO2 비의존 배지에 1회 세척되고 그리고 상온에서 5분 동안 원심분리된다. 펠렛은 100μl의 CCF2-AM 로딩 용액에 재현탁되고 그리고 어두운 곳에서 상온에서 1시간 동안 배양되며, 한 웰은 오직 CO2 비의존 배지로만 재현탁되어 염색되지 않은 상태로 유지한다. 세포는 상온에서 5분 동안 365 x g로 원심분리하여 채집된다. 채집된 세포는 그 다음에 200μl의 발달 배지로 세척되며, 상온에서 5분 동안 원심분리되고, 그리고 펠렛은 200μl의 발달 배지에 재현탁되고 그리고 세포를 어두운 곳에서 16시간 동안 상온에서 배양한다.
두 개의 비어있는 웰에는 각각의 BD 보상 비드 바이알(compensation beads vials)(음성 대조군 및 항마우스 IgK)이 한 방울씩 첨가된다. 그런 다음에 세포 및 비드가 4℃에서 5분 동안의 원심분리로 채집된다. 그 다음에 세포 및 비드는 200μl의 FACS 염색 완충제의 첨가로 1회 세척되고, 4℃에서 5분 동안의 원심분리로 채집되고, 그리고 펠렛은 항CD3-APC-Cy7의 1/100 희석액 및 항CD4-PE-Cy7의 1/50 희석액을 함유하는 100μl의 면역염색(immunostaining) 용액(유동 세포 분석법 염색 완충제)에 재현탁된다. 두 개의 보상 대조군과 비드는 염색되지 않는다. CompBeads는 항CD3-APC-Cy7의 1/100 희석액 또는 항CD4-PE-Cy7의 1/50 희석액을 함유하는 유동 세포 분석법 염색 완충제로 염색된다. 샘플은 4℃에서 30분 동안 배양된다.
4℃에서 30분 동안 배양한 후, 세포 및 비드는 4℃에서 5분 동안 원심분리하는 것으로 채집된다. 그런 다음에 세포 및 비드는 200μl의 유동 세포 분석법 염색 완충제로 세척된다. 1.2% 파라포름알데히드로 보충된 유동 세포 분석법 염색 완충제는 4℃에서 24시간 동안 세포를 고정(fix)하는 데 사용된다.
유동 세포 분석기 - MACSQuant 기기가 샘플을 얻는 데 사용된다. 샘플 세트는 다음을 포함한다: 로딩되지 않고 염색되지 않은 세포, CCF2 로딩된 염색되지 않은 세포, CD3-APC-Cy7 염색된 비드, CD4-PE-Cy7 염색된 비드, CCF2로 로딩되고 면역염색된 비감염 대조군, 및 CCF2로 로딩되고 면역염색된 감염된 샘플. 데이터는 FlowJo를 사용하여 분석된다.
실시예 6: HIV 시험감염: 렌티바이러스성 벡터 형질도입된 인간 CD4 + T 세포
CCR5shRNA/c-peptide/ALDH를 함유하는 LV로 형질도입된 GFP 리포터 CD4+ T 세포 또는 빈(empty) 대조군 벡터를 함유하는 LV로 형질도입된 T 세포는 R5, X4, 또는 실험실 HIV 균주 둘 다와 배양된다. HIV 감염력은 리포터 마커(T 세포 리포터 주를 사용할 경우) 또는 p24 ELISA로 분석된다.
실시예 7: 투여량 범위 및 렌티바이러스성 벡터 효능 연구
CCR5shRNA/C-peptide/ALDH 발현 벡터 또는 빈 대조군 벡터를 함유하는 렌티바이러스로 형질도입된 Sca1+/c-kit- 줄기세포 및 전구세포가 사전조건화된 C57BL/6 동계 마우스에 이식된다.
간단하게, 7일 후에 모든 마우스에 대해 시클로포스파미드(CTX) 치료의 일일 요법이 실행된다. 모든 군의 마우스가 다양한 투여량의 CTX로 치료된다(6 마우스/군/투여량): 0, 10, 13, 16, 19, 및 40mg/kg. CTX 치료 개시로부터 1주일 후, 마우스는 일주일 단위로 채혈된다. 화학요법의 어느 세포독성 효과(생착 효능: CTX 저항성의 ALDH 컨퍼런스(conference))라도 모니터링하기 위해 완전 혈구 측정(complete blood count: CBC) 패널이 진행되고, 유동 세포 분석법은 계통 특이적 마커 발현 뿐만 아니라 이 세포들에서의 C 펩타이드 및 CCR5 발현을 측정한다(발현 효율성: 넉다운 표적 유전자에 대한 shRNA의 효능). 연구는 CTX 치료의 최소 10주까지 또는 완전한 골수 생착에 도달할 때까지 계속된다. 연구의 도식이 도 7에 제공되고 그리고 더 상세한 프로토콜이 하기에 제공된다.
재료 및 시약. EasySepTM 마우스 조혈 전구세포 분리 키트(StemCell Technologies); Falcon 15mL 원뿔형 튜브(Corning); 5mL(12x75mm) 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브(Corning); StemSpan 무혈청 배지(StemCell Technologies); 마우스 조혈 줄기세포 증식 키트 사이토카인 패널(R&D); 레트로넥틱 재조합 인간 피브로넥틴 단편(Clontec); RPMI-1640(Thermo Fisher Scientific); 페트리 접시(Thermo Fisher Scientific); HBSS(Thermo Fisher Scientific); 27G x ½ 바늘(BD); 원심분리기(Thermo Fisher Scientific); Sorvall ST 40R Countess II 자동 세포 계수기(Thermo Fisher Scientific); 트리판 블루(Thermo Fisher Scientific); 계통 칵테일(Lineage Cocktail)(mCD3, mGr-1, mCD11b, mB220, mTer119)(동형 대조군 포함)(Biolegend); Ly-6A/E(Sca-1)(Thermo Fisher Scientific); CD117(c-kit)(Thermo Fisher Scientific); 생존력 염료 eFluor 506(Thermo Fisher Scientific); 항마우스 CD16/32 FC Block(Biolegend); 세포 염색 완충제(Biolegend); Balb/c 암컷 마우스(Charles River).
벡터. pLV[Exp]-H1>hCCR5[shRNA]-EF1A>hALDH1A1[NM_000689.4](ns):T2A:{C 펩타이드}(예를 들어 SEQ ID NO: 4).
골수로부터 전구세포 분리(필요한 전구세포 #). 하기의 표로부터 형질도입으로부터 필요한 수의 세포를 제공하기 위해 필요한 (공여자) 마우스의 수를 계산한다.
Figure pct00016
마우스 골수 분리. BALB/c 마우스(암컷, 20 내지 25g, 생후 8-10주)를 C02 질식으로 안락사시킨다. 그 뒤의 실험 단계는 층류식 생물안전 작업대(BSC)에서 실시된다. 골수는 대퇴골로부터 채집된다. 간단하게, 골수의 내용물을 27G Х ½ 바늘을 가진 1ml 인슐린 주사기를 사용하여 2ml의 HBSS로 관류시켰다. 상기 내용물은 멸균 50ml 원심분리 튜브에 수집되었다. 그런 다음에 상기에서 수집한 BM 세포 현탁액은 7.5ml의 최종 양으로 RPMI-1640으로 희석된다. 골수 현탁액 내의 어느 군집(cluster)은 강한 피펫팅으로 분해시킨다. 그 다음에 세포는 원심분리, 세척, 그리고 다시 원심분리된다. 각 대퇴골로부터의 세포 펠렛은 균질 현탁액을 제조하기 위해 7.5ml의 RPMI-1640에 부드럽게 다시 재현탁된다. NC-200 자동 세포 계수기를 사용하는 총 세포 계수 및 생존력을 위해 세포 현탁액의 부분 표본을 추출한다.
전구세포 분리. 분리된 세포는 새로운 튜브로 이동되고, 스핀 다운(spun down)되고, 그리고 1x108cells/mL의 농도를 달성하기 위해 0.5-2mL의 양 범위 내의 EasySep 완충제(PBS +2% FBS+ 1mM EDTA)에 재현탁된다. 그 다음에는 래트 혈청이 50μL/mL로 샘플에 첨가되고 그리고 샘플은 5mL(12x75mm) 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮겨진다. 그런 다음에 EasySep 마우스 조혈 전구세포 분리 칵테일이 샘플의 50μL/mL로 샘플에 첨가된다. 상기 샘플은 혼합되고 그리고 4℃에서 15분 동안 배양된다. 래피드 스피어(rapid spheres)는 30초 동안 볼텍스된 후 75μL/mL로 샘플에 첨가된다. 샘플은 혼합되고 그리고 4℃에서 10분 동안 배양한 다음에 EasySep 완충제를 사용하여 총 양이 2.5mL가 되게 한다. 전구세포는 자기분류(magnetic sorting)를 사용하여 분리된다.
유동 세포 분석기에 의한 분리된 전구세포의 평가. 세포는 새로운 96웰 플레이트로 옮겨지고, 스핀다운되고 그리고 50μL의 FACS 완충제(PBS+2%FBS+1mM EDTA)에 재현탁된다. 각 샘플에 3μL의 FC Block(Anti-CD16/32)이 첨가되고 그리고 4℃에서 15분 동안 배양된다. 하기의 패널 및 양이 사용된다.
Figure pct00017
대조군은 CD117, Ly6A/E를 위한 Fluorescence Minus One(FMO) 대조군 및 계통 칵테일 동형 대조군을 포함한다.
각 웰은 총 양이 100μL가 되게 하고 그리고 4℃에서 30분 동안 배양된다. 그 다음에 세포는 200μL의 유동 세포 분석 완충제로 세척되고 그리고 재현탁된다. 유동 세포 분석기는 MACSQuantCytometer에서 구한다. 순도는 Sca1-/c-kit +, Sca1+/c-kit -, Sca1+/c-kit +의 퍼센트를 더하고 그리고 살아있는 계통 칵테일 음성 이벤트(live lineage cocktail negative events)의 퍼센트를 곱하는 것으로 계산된다.
렌티바이러스 형질도입 및 전구 증식. 0일에 12 또는 24웰 플레이트가 0.3ml 레트로넥틴(100 ng/ml)으로 코팅되고 그리고 상온에서 적어도 2시간 동안 배양된다. 그 다음에는 코팅 배지가 플레이트로부터 흡입되고, 플레이트는 상온에서 적어도 30분 동안 1XPBS에 있는 2% BSA로 차단되고, 그리고 1XPBS로 3회 세척된다. 그러면 플레이트는 사용을 위한 준비가 끝난다. 플레이트가 건조되지 않도록 주의해야 한다.
신선한 분리된 골수 전구세포는 골수 전구세포 배양 배지에 약 0.2~0.4 x 106cells/ml로 시딩된다. 렌티바이러스는 세포에 24시간 동안 첨가된다(MOI=3).
1일에는 세포가 스핀 다운되고 그리고 렌티바이러스 함유 배지를 제거하고 그리고 신선한 골수 전구세포 배양 배지가 첨가된다.
2일에는, 렌티바이러스 형질도입 후, 렌티바이러스 감염된 세포를 선택하기 위해 퓨로마이신(1μg/ml)이 골수 전구세포 배양 배지에 첨가된다. 세포는 4일 동안 처리된다.
4일에는 신선한 배지가 퓨로마이신과 함께 첨가된다.
6일에는 세포가 스핀 다운되고 퓨로마이신 없이 신선한 배지가 공급된다.
7일에는 세포 계수를 위해 세포가 채집되고 그리고 형질도입 효율성을 계산하기 위해 GFP 유동(flow)을 실시한다. 남은 세포에는 신선한 골수 전구세포 배양 배지가 공급된다.
골수 전구세포는 10일까지 3일간 더 배양되고 9일에 배지가 교체된다.
10일에는 세포 계수를 위해 세포가 수확되고 그리고 형질도입 효율성을 계산하기 위해 유동 세포 분석법이 실행된다.
Figure pct00018
골수 전구세포 이식 및 치료 - 사전조건화. 이식 전에 마우스에는 플루다라빈(2일 동안 5mg/Kg)이 2회 투여된다. 0일(플루다라빈 치료 2일 후)에는 36마리의 마우스에는 대조군 벡터가 형질도입된 줄기세포 및 전구세포가 IV를 통해 이식되고, 36마리의 마우스에는 시험 벡터가 형질도입된 줄기세포 및 전구세포가 이식된다. 이식 후, 동물들은 이환율 및 사망률을 위해 매일 확인된다. 일상 모니터링을 실시할 때, 동물들은 이동성, 눈/털 무광(matting) 및 어느 다른 비정상적 효과와 같은 정상 행동에 미치는 어느 효과에 대한 확인, 그리고 또한 음식 및 물 섭취, 체중 증가/감소(체중은 매주 2회 측정된다)의 시각적 평가에 대해 확인된다. 사망 및 관찰된 임상적 징조는 각 동물에 대해 상세하게 데이터 시트의 의견 항목(comment section)에 기록된다.
CTX 치료. 골수 이식 7일 후에 CTX(시클로포스파미드) 치료가 다음의 투여량으로 I.P. 투여되는 것으로 시작된다: 체중 감량이 >15%인 경우를 제외하고, 12주 동안 중단 없이 매일 0, 10, 13, 16, 19, 및 40mg/kg. 실험군 및 치료 세부사항은 하기의 표에 도시된다.
Figure pct00019
샘플 채집. 첫 CTX 투여 7일 후, 꼬리 혈관 천자로 혈액이 채집된다. LV 벡터 발현 및 shRNA 넉다운의 효능과 부합하는 면역표현형(immunophenotyping) 패널을 위해 100μL의 혈액이 채집된다(하기의 표 참조). 샘플은 FACS로 분석된다. 완전한 CBC 분석을 실행하기 위해 추가적인 20μL의 혈액이 채집된다. 연구 종료까지 각 동물로부터 7일마다 채집이 실시된다. 완전한 생착을 평가하기 위해 골수는 연구 종결 시점에서 채집된다.
Figure pct00020
종결(termination). 지속적으로 악화되는 상태를 보이는 동물은 허용 불가한 독성 및/또는 큰 체중 감소(>20%)가 기록되었을 때, 또는 혼수상태에 빠지기 전에 인도적으로 안락사시킨다. 극심한 고통 및/또는 통증의 명백한 징조를 보이는 동물은 CO2에 뒤이은 경부 탈구로 인도적으로 안락사시킨다. 연구는 한 동물 군에서 완전한 생착(90% 이상)이 관찰되었을 때 종결된다.
실시예 8: 인간 연구
줄기세포 동원 및 채집. CD34+ 줄기세포를 동원하기 위해 환자는 3 내지 5일의 G-CSF의 요법을 채집 3일 전에 시작한다. 말초혈액에 있는 CD34+ 세포의 수가 10.0 내지 20.0 x 106cells/kg body weight을 초과했을 때 성분채집술이 실행된다. 이 물질은 CD34+ 줄기세포의 분리 및 형질도입을 위하여 2-8℃로 관리되는 배송으로 GMP 시설로 운반된다. 2 내지 3 x 106cells/kg의 재주입을 위해 3.0 내지 4.0 x 106　CD34+ cells/kg의 목표물이 채집된다. 채집 2일 후(또는 이식 5일 전), 환자는 5일 동안(이식 1일 전까지) 15mg/m2 플루다라빈으로 치료된다. 대안으로는 환자가 이식 1일 전에 4mg/kg의 부설판으로 치료된다. 그 다음에 환자는 이식 2일 전에 1000mg/m2의 시클로포스파미드의 1회 투여로 치료된다.
줄기세포의 냉동보존. 선택적으로 환자 유래 세포(조혈 줄기세포 함유)는 세포가 풍부한 펠렛을 만들기 위해 원심분리된다. 헤파린 첨가된 플라스마라이트 용액 및 10% DMSO(디메틸설폭사이드)의 용액이 펠렛화된 세포가 재현탁된 혈장 상청액에 첨가된다. 세포는 먼저 -4℃에서 보관되고, 그 뒤에 샘플이 -156℃(기상으로 보관될 경우) 내지 -196℃(액체상으로 보관될 경우)의 목표 온도로 냉동된다. 선택적으로 세포는 표준 절차에 따라 배송된다.
CD34+ 세포의 렌티바이러스 형질도입. GMP 시설에 도착했을 때, 세포는 자기구슬 분리에 의해 분리된다. 렌티바이러스성 매개 인간 CD34+　세포 형질도입은 사이토카인 줄기세포 인자(SCF), Fms 관련 티로신 키나아제 3 리간드(FLT3L), 트롬보포이에틴(TPO), IL-6, IL-2, IL-3, 피브로넥틴, 또는 이들의 어느 조합의 첨가에 의한 배지에 있는 세포의 24시간 사전자극에 뒤이어 24시간 벡터 노출(예를 들어 SEQ ID NO: 2 또는 SEQ ID NO: 4)을 포함하고, 둘 다 무혈청 X-Vivo 10 배지에서 SCF, FLT3L 및 TPO(각자 100ng ml-1)의 사이토카인이 있는 데서 실시된다. 그런 다음에 세포는 냉동보존되어 임상 현장(clinical site)으로 배송된다.
변형된 CD34 + 세포의 재주입. 변형된 CD34+ 세포가 해동된 후, 뉴욕 혈액 센터 프로토콜을 따르는 현재 표준 세척 프로토콜이 사용된다. 그는 해동된 줄기세포를 2.5% 사람 혈청 알부민 및 5% 덱스트란 40을 사용하는 2단계 희석과 그 뒤에 이어지는 10℃에서의 10분 동안의 원심분리를 포함한다. 그 다음에 상청액이 제거되고 그리고 1.7% 이하의 최종 DMSO 농도로 HSA 및 덱스트란 용액이 2회 더 첨가된다. 세척된 용액은 가능한 한 빨리 환자에게 주입된다. 세포의 주입으로부터 일정 시간 후, 예를 들어 7-45일 사이의 기간 후, 환자는 유전자 변형된 골수세포의 생착 증가를 촉진시키기 위해 매일 낮은 투여량(50-200mg 또는 본원에 기술된 것과 같은 비골수제거성 투여량)의 경구 시클로포스파미드를 복용하기 시작한다. 변형된 CD34+ 세포가 주입되는 시점에서 환자가 HIV+일 수 있다는 것이 고려되고, 이런 경우에 상기 세포는 HIV를 치료 그리고/또는 치유하기 위해 기능하고, 또는 변형된 CD34+ 세포가 주입될 때에 환자가 HIV-일 수 있고, 이런 경우에 상기 세포는 미래의 HIV 감염을 예방하기 위해 기능한다. HIV+ 환자를 치료하기 위한 도식이 도 9 및 도 10에 제공되지만, 환자가 HIV-일 수도 있다는 것으로 해석되어야 한다.
상기의 본원의 기술의 구체예의 상세한 설명은 기술을 정확하게 상기에 개시된 형태로 제한하거나 완전한(exhaustive) 것으로 의도되지 않았다. 상기 기술의 구체적인 구체예, 그리고 그를 위한 실시예가 실례의 목적으로 상기에 기술되었지만, 본원의 기술의 범위 내에서 다양한 균등한 변형이 기능하며, 관련 업계의 숙련자라면 이를 인식할 것이다. 본원에 기술된 다양한 구체예들은 구체예를 더 제공하기 위하여 조합될 수 있다.
앞서 개시된 것으로부터 본원의 기술의 구체적인 구체예가 실례의 목적으로 본원에 기술되었으나, 본원의 기술의 구체예의 설명을 필요 이상으로 이해하기 어렵게 만드는 것을 피하기 위하여 잘 알려진 구조 및 기능이 도시되거나 또는 상세하기 기술되지 않은 것이 이해될 것이다. 문맥이 허용할 때, 단수 또는 복수 용어가 각자 복수 또는 단수 용어 또한 포함할 수 있다.
구체적인 구체예가 실례의 목적으로 본원에 기술되었지만, 상기 기술로부터 벗어나지 않고서도 다양하게 변형될 수 있다. 또한 상기 기술의 특정 구체예와 연관된 이점이 그 구체예들의 문맥에서 기술된 반면, 다른 구체예 또한 그러한 이점을 보일 수 있고, 그리고 본원의 기술의 범위 내에 들기 위해 모든 구체예가 그러한 이점을 반드시 보여야 하는 것은 아니다. 그에 따라 개시된 그리고 연관된 기술은 본원에 명확하게 도시되거나 또는 기술되지 않은 구체예도 포함할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Weird Science LLC Gumrukcu, Serhat <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR NON-MYELOABLATIVE BONE MARROW RECONSTITUTION <130> 146611.00102 <150> US 62/586,813 <151> 2017-11-15 <160> 19 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1503 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hALDH1-cDNA <400> 1 atgtcatcct caggcacgcc agacttacct gtcctactca ccgatttgaa gattcaatat 60 actaagatct tcataaacaa tgaatggcat gattcagtga gtggcaagaa atttcctgtc 120 tttaatcctg caactgagga ggagctctgc caggtagaag aaggagataa ggaggatgtt 180 gacaaggcag tgaaggccgc aagacaggct tttcagattg gatccccgtg gcgtactatg 240 gatgcttccg agagggggcg actattatac aagttggctg atttaatcga aagagatcgt 300 ctgctgctgg cgacaatgga gtcaatgaat ggtggaaaac tctattccaa tgcatatctg 360 aatgatttag caggctgcat caaaacattg cgctactgtg caggttgggc tgacaagatc 420 cagggccgta caataccaat tgatggaaat ttttttacat atacaagaca tgaacctatt 480 ggtgtatgtg gccaaatcat tccttggaat ttcccgttgg ttatgctcat ttggaagata 540 gggcctgcac tgagctgtgg aaacacagtg gttgtcaaac cagcagagca 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aacgttgcgc 6540 aaactattaa ctggcgaact acttactcta gcttcccggc aacaattaat agactggatg 6600 gaggcggata aagttgcagg accacttctg cgctcggccc ttccggctgg ctggtttatt 6660 gctgataaat ctggagccgg tgagcgtggg tctcgcggta tcattgcagc actggggcca 6720 gatggtaagc cctcccgtat cgtagttatc tacacgacgg ggagtcaggc aactatggat 6780 gaacgaaata gacagatcgc tgagataggt gcctcactga ttaagcattg gtaactgtca 6840 gaccaagttt actcatatat actttagatt gatttaaaac ttcattttta atttaaaagg 6900 atctaggtga agatcctttt tgataatctc atgaccaaaa tcccttaacg tgagttttcg 6960 ttccactgag cgtcagaccc cgtagaaaag atcaaaggat cttcttgaga tccttttttt 7020 ctgcgcgtaa tctgctgctt gcaaacaaaa aaaccaccgc taccagcggt ggtttgtttg 7080 ccggatcaag agctaccaac tctttttccg aaggtaactg gcttcagcag agcgcagata 7140 ccaaatactg ttcttctagt gtagccgtag ttaggccacc acttcaagaa ctctgtagca 7200 ccgcctacat acctcgctct gctaatcctg ttaccagtgg ctgctgccag tggcgataag 7260 tcgtgtctta ccgggttgga ctcaagacga tagttaccgg ataaggcgca gcggtcgggc 7320 tgaacggggg gttcgtgcac acagcccagc ttggagcgaa cgacctacac cgaactgaga 7380 tacctacagc gtgagctatg agaaagcgcc acgcttcccg aagagagaaa ggcggacagg 7440 tatccggtaa gcggcagggt cggaacagga gagcgcacga gggagcttcc agggggaaac 7500 gcctggtatc tttatagtcc tgtcgggttt cgccacctct gacttgagcg tcgatttttg 7560 tgatgctcgt caggggggcg gagcctatgg aaaaacgcca gcaacgcggc ctttttacgg 7620 ttcctggcct tttgctggcc ttttgctcac atgttctttc ctgcgttatc ccctgattct 7680 gtggataacc gtattaccgc ctttgagtga gctgataccg ctcgccgcag ccgaacgacc 7740 gagcgcagcg agtcagtgag cgaggaagcg gaagagcgcc caatacgcaa accgcctctc 7800 cccgcgcgtt ggccgattca ttaatgcagc tggcacgaca ggtttcccga ctggaaagcg 7860 ggcagtgagc gcaacgcaat taatgtgagt tagctcactc attaggcacc ccaggcttta 7920 cactttatgc ttccggctcg tatgttgtgt ggaattgtga gcggataaca atttcacaca 7980 ggaaacagct atgaccatga ttacgccaag cgcgcaatta accctcacta aagggaacaa 8040 aagctggagc tgcaagctt 8059 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 shRNA sense <400> 6 actcttgaca gggctctatt t 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hCCR5 shRNA antisense <400> 7 aaatagagcc ctgtcaagag t 21 <210> 8 <211> 1096 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD4 Promoter:-1076 to +20 <400> 8 aagacaggtt ctcactctgt cactcaggct agagtgcagt ggtgcaatca cggttcactg 60 cagcctcaac ttcctgggct caagcgatcc ccccacctcg gcctcctaaa atgctgggat 120 tataggcatg agccaccact cccagcccca cttttttcag actggaaaac gcacactcac 180 atgtgcatct ttaaatgatc acttgggctg tggtatggag aatggcgacc agtgaggagg 240 caggagctgt tgtccgagca agggatgata ttggcatctt ggattggcat ggtggcagta 300 gtggtagtgc agagtgactt gggtagattt tggagccatt tagaaggtaa catccacagg 360 aactggtaaa taaatacgtg ggagaagttg ggtgaagggg gtgtcaaaga ttacacccaa 420 tttattttgc ttgggcaagt tggtggatgg tgagcccctc actgagtgag aagcctggag 480 aagcaggttt ggagggtggt agtatgcagg tggtatgcat agttggggat gtgtgttgag 540 tttgctatgt ccggtgagct tcccagtgga gatgtccaat gggcagacgg atactcacat 600 agagagttca tggtagattc gggctagagg aaagcacctg aggcctggcc agagacgcct 660 agaggaacag agcctggtta acagtcactc ctggtgtctc agatattctc tgctcagccc 720 acgccctctc ttccacactg ggccacctat aaagcctcca cagatacccc tggggcaccc 780 actggacaca tgccctcagg gccccagagc aaggagctgt ttgtgggctt accactgctg 840 ttcccatatg cccccaactg cctcccactt ctttccccac agcctggtca gacatggcgc 900 taccactaat ggaatctttc ttgccatctt tttcttgccg cttaacagtg gcagtgacag 960 tttgactcct gatttaagcc tgattctgct taactttttc ccttgacttt ggcattttca 1020 ctttgacatg ttccctgaga gcctgggggg tggggaaccc agctccagct ggtgacgttt 1080 ggggccggcc caggcc 1096 <210> 9 <211> 320 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Human CD3E <400> 9 aaggtacgga agaggacggt ggcggtggaa gccgggcttg gagatgggac acagatttcc 60 acaagctgcc tggaaaagct gcgagccagg gctggggaag tgaaggaggg aggtgtctca 120 agcaggcaca cccccaccct gaggcagccg cctgcagcca gaggcgggct gtggttaagc 180 agcgcaggat gtgggctgca ctgctaagcg tggcttctgg gagtgagggt gggagaggta 240 cagcggcagc tggcggaggc ccgtgtgaga gcgctttgtt ctcagtctcc cacagcacac 300 tctgcttgca gagggggatc 320 <210> 10 <211> 501 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hALDH1 protein <400> 10 Met Ser Ser Ser Gly Thr Pro Asp Leu Pro Val Leu Leu Thr Asp Leu 1 5 10 15 Lys Ile Gln Tyr Thr Lys Ile Phe Ile Asn Asn Glu Trp His Asp Ser 20 25 30 Val Ser Gly Lys Lys Phe Pro Val Phe Asn Pro Ala Thr Glu Glu Glu 35 40 45 Leu Cys Gln Val Glu Glu Gly Asp Lys Glu Asp Val Asp Lys Ala Val 50 55 60 Lys Ala Ala Arg Gln Ala Phe Gln Ile Gly Ser Pro Trp Arg Thr Met 65 70 75 80 Asp Ala Ser Glu Arg Gly Arg Leu Leu Tyr Lys Leu Ala Asp Leu Ile 85 90 95 Glu Arg Asp Arg Leu Leu Leu Ala Thr Met Glu Ser Met Asn Gly Gly 100 105 110 Lys Leu Tyr Ser Asn Ala Tyr Leu Asn Asp Leu Ala Gly Cys Ile Lys 115 120 125 Thr Leu Arg Tyr Cys Ala Gly Trp Ala Asp Lys Ile Gln Gly Arg Thr 130 135 140 Ile Pro Ile Asp Gly Asn Phe Phe Thr Tyr Thr Arg His Glu Pro Ile 145 150 155 160 Gly Val Cys Gly Gln Ile Ile Pro Trp Asn Phe Pro Leu Val Met Leu 165 170 175 Ile Trp Lys Ile Gly Pro Ala Leu Ser Cys Gly Asn Thr Val Val Val 180 185 190 Lys Pro Ala Glu Gln Thr Pro Leu Thr Ala Leu His Val Ala Ser Leu 195 200 205 Ile Lys Glu Ala Gly Phe Pro Pro Gly Val Val Asn Ile Val Pro Gly 210 215 220 Tyr Gly Pro Thr Ala Gly Ala Ala Ile Ser Ser His Met Asp Ile Asp 225 230 235 240 Lys Val Ala Phe Thr Gly Ser Thr Glu Val Gly Lys Leu Ile Lys Glu 245 250 255 Ala Ala Gly Lys Ser Asn Leu Lys Arg Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly 260 265 270 Lys Ser Pro Cys Ile Val Leu Ala Asp Ala Asp Leu Asp Asn Ala Val 275 280 285 Glu Phe Ala His His Gly Val Phe Tyr His Gln Gly Gln Cys Cys Ile 290 295 300 Ala Ala Ser Arg Ile Phe Val Glu Glu Ser Ile Tyr Asp Glu Phe Val 305 310 315 320 Arg Arg Ser Val Glu Arg Ala Lys Lys Tyr Ile Leu Gly Asn Pro Leu 325 330 335 Thr Pro Gly Val Thr Gln Gly Pro Gln Ile Asp Lys Glu Gln Tyr Asp 340 345 350 Lys Ile Leu Asp Leu Ile Glu Ser Gly Lys Lys Glu Gly Ala Lys Leu 355 360 365 Glu Cys Gly Gly Gly Pro Trp Gly Asn Lys Gly Tyr Phe Val Gln Pro 370 375 380 Thr Val Phe Ser Asn Val Thr Asp Glu Met Arg Ile Ala Lys Glu Glu 385 390 395 400 Ile Phe Gly Pro Val Gln Gln Ile Met Lys Phe Lys Ser Leu Asp Asp 405 410 415 Val Ile Lys Arg Ala Asn Asn Thr Phe Tyr Gly Leu Ser Ala Gly Val 420 425 430 Phe Thr Lys Asp Ile Asp Lys Ala Ile Thr Ile Ser Ser Ala Leu Gln 435 440 445 Ala Gly Thr Val Trp Val Asn Cys Tyr Gly Val Val Ser Ala Gln Cys 450 455 460 Pro Phe Gly Gly Phe Lys Met Ser Gly Asn Gly Arg Glu Leu Gly Glu 465 470 475 480 Tyr Gly Phe His Glu Tyr Thr Glu Val Lys Thr Val Thr Val Lys Ile 485 490 495 Ser Gln Lys Asn Ser 500 <210> 11 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Membrane Anchored C46 Fusion Inhibitor Protein <400> 11 Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Arg Ser Trp Met 20 25 30 Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu 35 40 45 Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu 50 55 60 Glu Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Arg Ser Glu Arg 65 70 75 80 Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly 85 90 95 Pro Leu Ile Ala Leu Val Thr Ser Gly Ala Leu Leu Ala Val Leu Gly 100 105 110 Ile Thr Gly Tyr Phe Leu Met Asn Arg Arg Ser Trp Ser Pro Thr Gly 115 120 125 Glu Arg Leu Glu Leu Glu Pro 130 135 <210> 12 <211> 540 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 12 aggatgatgg tgatggggaa ctaaatgggg aaatatggaa ggtcacagga aaagttaaca 60 caagttagca aaaagttaac ataacacaaa aaggtcttgc aggaaaaaaa aaagaaaaga 120 aaagaaagaa aaagtctcca agaatggttt ggacagccaa aatgaatact tatagtcacg 180 tatacctgct cactcctgac gcttcactca cacacagcac aggatctggt gaggctatca 240 ctaaatgtgc cacattgtgg ttaagtttta cctgattaac gaaatgctca cacttctaaa 300 ctgaggtcct tacagtagat tccttttgca agattgttac tggcttacaa cttaaaaata 360 aaggaaaatc acaaggaaag aaaagtgggg aaaaaatcgg aggaaacttg cccctgccct 420 ggccaccggc aaggctgcca caaaggggtt aaaagttaag tggaagtgga gcttgaagaa 480 gtgggatggg gcctctccag gaaagctgaa cgaggcatct ggagcccgaa caaacctcca 540 <210> 13 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 13 tgtttgaatg aggcttcagt actttacaga atcgttgcct gcacatcttg gaaacacttg 60 ctgggattac ttcgacttct taacccaaca gaaggctcga gaaggtatat tgctgttgac 120 agtgagcgca ctcttgacag ggctctattt tagtgaagcc acagatgtaa aatagagccc 180 tgtcaagagt ttgcctactg cctcggactt caaggggcta gaattcgagc aattatcttg 240 tttactaaaa ctgaatacct tgctatctct ttgatacatt tttacaaagc tgaattaaaa 300 tggtataaat taaatcactt t 321 <210> 14 <211> 132 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 14 gcctggaagg acctggagct gctggagcag gagaacaagg agcagcagaa ccagagcgag 60 gagatcctga gccacatcct gagcacctac aacaacatcg agagagactg ggagatgtgg 120 accatgaaca ac 132 <210> 15 <211> 44 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 15 Ala Trp Lys Asp Leu Glu Leu Leu Glu Gln Glu Asn Lys Glu Gln Gln 1 5 10 15 Asn Gln Ser Glu Glu Ile Leu Ser His Ile Leu Ser Thr Tyr Asn Asn 20 25 30 Ile Glu Arg Asp Trp Glu Met Trp Thr Met Asn Asn 35 40 <210> 16 <211> 273 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 16 gagctgaaga cccccctggg cgacaccacc cacacctgcc ccagatgccc cgagcccaag 60 agctgcgaca cccccccccc ctgccccaga tgccccgagc ccaagagctg cgacaccccc 120 cccccctgcc ccagatgccc cgagcccaag agctgcgaca cccccccccc ctgccccaga 180 tgcccccttg aaaatggtgg gacatcctta tcagagaaaa cagttcttct gctggtgact 240 ccatttctgg cagcagcctg gagccttcat ccc 273 <210> 17 <211> 91 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 17 Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys 1 5 10 15 Pro Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro 20 25 30 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu 35 40 45 Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Leu Glu 50 55 60 Asn Gly Gly Thr Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Val Thr 65 70 75 80 Pro Phe Leu Ala Ala Ala Trp Ser Leu His Pro 85 90 <210> 18 <211> 405 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 18 gcctggaagg acctggagct gctggagcag gagaacaagg agcagcagaa ccagagcgag 60 gagatcctga gccacatcct gagcacctac aacaacatcg agagagactg ggagatgtgg 120 accatgaaca acgagctgaa gacccccctg ggcgacacca cccacacctg ccccagatgc 180 cccgagccca agagctgcga cacccccccc ccctgcccca gatgccccga gcccaagagc 240 tgcgacaccc cccccccctg ccccagatgc cccgagccca agagctgcga cacccccccc 300 ccctgcccca gatgccccct tgaaaatggt gggacatcct tatcagagaa aacagttctt 360 ctgctggtga ctccatttct ggcagcagcc tggagccttc atccc 405 <210> 19 <211> 135 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic sequence <400> 19 Ala Trp Lys Asp Leu Glu Leu Leu Glu Gln Glu Asn Lys Glu Gln Gln 1 5 10 15 Asn Gln Ser Glu Glu Ile Leu Ser His Ile Leu Ser Thr Tyr Asn Asn 20 25 30 Ile Glu Arg Asp Trp Glu Met Trp Thr Met Asn Asn Glu Leu Lys Thr 35 40 45 Pro Leu Gly Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys 50 55 60 Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser 65 70 75 80 Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro Lys Ser Cys 85 90 95 Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Leu Glu Asn Gly Gly Thr 100 105 110 Ser Leu Ser Glu Lys Thr Val Leu Leu Leu Val Thr Pro Phe Leu Ala 115 120 125 Ala Ala Trp Ser Leu His Pro 130 135

Claims (64)

  1. 환자에게 골수 이식을 실행하기 위한 방법으로서, 상기 방법이 환자에게 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포의 군집 및 최소 1회의 비골수제거성 투여량의 화학요법제를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포의 군집이 이종 유전자 암호화 알데히드 탈수소효소 1(ALDH1)인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포의 군집이 ALDH1을 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포의 시클로포스파미드 저항성이 알데히드 탈수소효소 1(ALDH1)의 발현에 의해 부여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 환자의 골수의 50% 이상이 6개월 이내에 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포 또는 그로부터 유래된 세포로 대체되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 환자가 HIV를 가진 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포가 일과성인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 세포가 줄기세포 또는 면역세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 줄기세포가 태아 줄기세포, 제대혈 유래 줄기세포, 조혈 줄기세포(HSC), 다능성 줄기세포(PSC), 유도 PSC(iPSC), 배아 줄기세포(ESC) 또는 이들로부터 유래된 세포, 예를 들어 CD34+ 세포, CD90+ 세포, CD45+ 세포, CD17+ 세포, CD45RA- 세포, CD38-, 또는 이들의 어느 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 면역세포가 T 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 변형된 세포가 환자에 대해 자가 세포이거나, 환자에 대해 동종이형이거나, 또는 이들의 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포를 만들기 위해 변형되지 않은 세포를 ALDH1의 발현을 위해 암호화하는 발현 벡터와 접촉시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 발현 벡터가 바이러스성 벡터이거나 또는 비바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터가 렌티바이러스성 또는 아데노바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제12항에 있어서, 상기 발현 벡터가 레트로바이러스, 트랜스포존, 에피솜 발현 벡터, 변형된 RNA, 플라스미드, 또는 이들의 어느 조합인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제1항에 있어서, 최소 1회의 비골수제거성 투여량의 화학요법제가 상기 변형된 세포의 투여 후에 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제1항에 있어서, 최소 1회의 비골수제거성 투여량의 화학요법제가 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드가 약 0.16mg/kg/day에서 2.5mg/kg/day 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제17항에 있어서, 상기 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드가 약 0.41mg/kg/day 내지 약 1.63mg/kg/day인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제17항에 있어서, 상기 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드가 약 0.81mg/kg/day 내지 약 1.46mg/kg/day인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제17항에 있어서, 상기 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드가 약 1.3mg/kg/day인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제17항에 있어서, 상기 환자에게 100mg/m2/day의 투여량의 시클로포스파미드가 연이은 1-14일 동안 투여되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제17항에 있어서, 상기 환자에게 5-7mg/m2의 투여량의 시클로포스파미드가 12-24시간 동안 투여되지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제1항에 있어서, 상기 비골수제거성 화학요법제가 최소 1주, 최소 2주, 최소 3주, 최소 1개월, 최소 2개월, 최소 3개월, 최소 4개월, 최소 5개월, 또는 최소 6개월 동안 매일 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제1항에 있어서, 시클로포스파미드 저항성의 변형된 세포 및 최소 1회의 비골수제거성 투여량의 화학요법제의 투여 사이에 일정 기간 동안 비골수제거성 투여량의 화학요법제를 투여하지 않는 것을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 기간이 약 3일, 약 7일, 약 10일, 및 약 14일로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제1항에 있어서, 상기 환자의 골수의 약 60%, 약 70%, 약 80%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 100%가 변형된 세포로 대체되는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제1항에 있어서, 최소 1회의 비골수제거성 투여량의 화학요법제의 투여의 결과로서 상기 환자의 골수가 제거되지 않고 그리고/또는 면역손상의 상태가 아닌 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 환자가 임상적으로 관련된 빈혈, 호중구 감소증, 혈소판 감소증, 범혈구 감소증, 낮은 혈소판, 낮은 백혈구, 또는 이들의 어느 조합 또는 관련된 증상을 겪지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제1항에 있어서, 상기 세포의 투여 전에 사전조건화(preconditioning) 단계가 실행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제30항에 있어서, 상기 사전조건화 단계가 비골수제거성 화학요법 사전조건화 단계인 것을 특징으로 하는 방법.
  32. 제1항에 있어서, 상기 변형된 세포가 HIV 감염에 대한 저항성을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 상기 변형된 세포가 HIV 감염에 대한 저항성이 있는 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제, HIV 공수용체의 발현을 감소시키는 분자, 또는 이들의 어느 조합을 이종 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제32항에 있어서, 상기 변형된 세포가 shCCR5, shCXCR4, C 펩타이드 융합 억제제 또는 이들의 어느 조합을 이종 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제32항에 있어서, 상기 변형된 세포가 HIV 공수용체를 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제32항에 있어서, 상기 변형된 세포가 CCR5, CXCR4, 또는 CCR5-Δ32 또는 이들의 조합을 발현하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. ALDH1 및 다음 중 하나의 발현을 위해 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포: i) 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제, HIV 공수용체의 발현을 감소시키는 분자, 또는 이들의 어느 조합을 위해 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 분자; 및/또는 ii) 내인성 HIV 공수용체 돌연변이 또는 결실.
  38. 제37항에 있어서, 상기 세포가:
    i. CCR5의 발현을 감소시키는 분자를 위해 암호화;
    ii. CXCR4의 발현을 감소시키기 위해 암호화;
    iii. C 펩타이드 융합 억제제의 발현을 위해 암호화;
    iv. 1, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함;
    v. SEQ ID NO: 10, 11, 6, 7, 13, 15, 17, 19, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 위해 암호화;
    하는 이종 뉴클레오타이드 서열, 또는 이들의 어느 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  39. 제37항에 있어서, 상기 세포가 shCCR5, shCXCR4, 및/또는 C44와 같은 C 펩타이드 융합 억제제를 발현하는 것을 특징으로 하는 세포.
  40. 제37항에 있어서, 상기 세포가 이종 뉴클레오타이드 서열을 발현하도록 비바이러스성 유전자 전달 시스템으로 변형된 것을 특징으로 하는 세포.
  41. 제40항에 있어서, 상기 비바이러스성 유전자 전달 시스템이 트랜스포존 유전자 전달 시스템인 것을 특징으로 하는 세포.
  42. 제37항에 있어서, 상기 트랜스포존 전달 시스템이 슬리핑뷰티(Sleeping Beauty) 유전자 전달 시스템 또는 피기백(PiggyBac) 트랜스포존 유전자 전달 시스템인 것을 특징으로 하는 세포.
  43. 제37항에 있어서, 상기 세포가 SEQ ID NO: 4의 이종 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 세포.
  44. 제37항의 세포를 하나 이상 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
  45. ALDH1 및 다음 중 하나를 위해 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자: i) 적어도 하나의 HIV 공수용체 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제, HIV 공수용체의 발현을 감소시키는 분자, 또는 이들의 어느 조합.
  46. 제45항에 있어서, 이종 뉴클레오타이드 서열이:
    i. CCR5의 발현을 감소;
    ii. CXCR4의 발현을 감소;
    iii. C 펩타이드 융합 억제제의 발현을 위해 암호화;
    하는 분자, 또는 이들의 어느 조합을 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  47. 제45항에 있어서, 상기 핵산 분자가 shCCR5, shCXCR4, 및/또는 C 펩타이드 융합 억제제의 발현을 위해 암호화하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  48. 제45항에 있어서, 상기 핵산 분자가 1, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  49. 제45항에 있어서, 상기 핵산 분자가 SEQ ID NO: 10, 11, 6, 7, 13, 15, 17, 19, 또는 이들의 어느 조합을 위해 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  50. 제45항의 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  51. 제50항에 있어서, 상기 벡터가 렌티바이러스를 만드는 데 사용될 수 있는 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  52. 제50항에 있어서, 상기 벡터가 렌티바이러스성 벡터인 것을 특징으로 하는 벡터.
  53. 제50항에 있어서, 상기 벡터가 SEQ ID NO: 1, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  54. 제50항에 있어서, 상기 벡터가 SEQ ID NO: 10, 11, 6, 7, 13, 15, 17, 19, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 위해 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  55. 대상의 HIV를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 ALDH1 및 다음 중 하나를 이종 발현하는 세포의 군집을 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: i) 적어도 하나의 HIV 공수용체 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 공수용체의 돌연변이 또는 복수의 돌연변이, 적어도 하나의 HIV 융합 억제제, HIV 공수용체의 발현을 감소시키는 분자, 또는 이들의 어느 조합을 위해 암호화하는 이종 뉴클레오타이드 분자; 및
    최소 1회의 비골수제거성 투여량의 화학요법제.
  56. 제55항에 있어서, 상기 세포가 shCCR5, shCXCR4, 및/또는 C 펩타이드 융합 억제제를 발현하는 것을 특징으로 하는 방법.
  57. 제55항에 있어서, 상기 세포가 1, 3, 6, 7, 8, 9, 12, 13, 14, 16, 18, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  58. 제55항에 있어서, 상기 세포가 SEQ ID NO: 10, 11, 6, 7, 13, 15, 17, 19, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 위해 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  59. 대상 내에서 관심 분자를 발현시키는 방법으로서, 상기 방법이 대상에게 ALDH1 및 관심 분자를 이종 발현하는 세포를 투여하는 단계; 및 비골수제거성 투여량의 시클로포스파미드를 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  60. 제59항에 있어서, 상기 세포가 CD34+ 및/또는 CD4+, 또는 본원에 제공된 다른 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  61. 제59항에 있어서, 상기 관심 분자가 CCR5의 발현을 감소; CXCR4의 발현을 감소; C 펩타이드 융합 억제제의 발현을 위해 암호화; 또는 이들의 어느 조합을 수행하는 것인 것을 특징으로 하는 방법.
  62. 제61항에 있어서, CCR5의 발현을 감소시키는 관심 분자는 shCCR5인 것을 특징으로 하는 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 분자가 SEQ ID NO: 6 및/또는 SEQ ID NO: 7을 포함하거나 또는 그를 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  64. 제61항에 있어서, 상기 C 펩타이드 융합 억제제가 SEQ ID NO: 11, 15, 19, 또는 이들의 어느 조합의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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