KR20200003160A - 조혈모세포의 형질도입을 위한 개선된 렌티바이러스 - Google Patents

Abstract

적어도 하나의 이종 외피 단백질을 포함하는 외피 내에 패키지화된, 이종 전이유전자를 운반하는 렌티바이러스 벡터를 포함하는 재조합 바이러스가 개시된다. 또한, 이러한 재조합 바이러스를 제조하는 방법과 이러한 바이러스를 사용하여 유전자를 선택된 표적세포로 전달하는 방법이 개시된다. 이러한 재조합 바이러스는 조혈모세포, 특히 CD34+ 세포를 형질도입하는 데 있어 특히 유용하다.

Description

조혈모세포의 형질도입을 위한 개선된 렌티바이러스

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 2017년 5월 3일에 출원된 USSN 62/500,874의 혜택과 우선권을 주장하며, 해당 출원의 전체 내용은 모든 목적을 위하여 본 출원에 참조로서 포함된다.

기술분야

본 개시의 분야는 조혈모세포, 구체적으로 인간 CD34+ 세포의 렌티바이러스 형질도입 개선을 위한 것이다.

재조합 렌티바이러스는 아데노신 데아미나제 결손증(Farinelli, et al, 2014), β-지중해 빈혈, 겸상적혈구병(Negre et al., 2016), 증중복합 면역결핍증, 이염색 백색질장애, 부신백질 이영양증, Wiskott-Aldrich 증후군, 만성 육아종병(Booth et al., 2016) 및 일부 리소좀 축적질환(Rastall, et al., 2015)과 같은 유전질환을 치료하기 위하여 이종 전이유전자들(렌티바이러스로부터 유래하지 않는 유전자들)을 조혈모세포 내로 전달하는 데 유용하다.

그러나, 렌티바이러스의 제1 조혈모세포(예컨대, 인간 CD34+ 세포) 형질도입 효율은 293T 세포와 같은 형질전환 세포주만큼 높지 않다. 이러한 효율의 차이를 설명하기 위한 가설이 여럿 제안된 바 있다. 현재까지 제조된 거의 모든 재조합 렌티바이러스는 수포성 구내염 바이러스(VSV)의 Indiana 주(strain) 유래의 외피 단백질을 포함한다. 휴식기의 CD34 세포들은 저밀도 지단백질 수용체인(Finkelshtein, et al, 2013), VSV(Indiana)에 대한 주수용체를 매우 낮은 수준으로 발현하는 것으로 확인되었다(Amirache, et al., 2014). 동결된 CD34+ 세포의 생존률 유지 및 세포분열 촉진에 필요한, CD34 세포의 사이토카인 자극은 저밀도 지단백질 수용체를 상향 조절하며 VSV의 Indiana 주 유래의 외피 단백질을 포함하는 렌티바이러스에 의한 형질도입을 적절히 증가시킨다. 그러므로, 저밀도 지단백질 수용체를 세포 내 진입을 위한 수용체로서 사용하지 않는, 외피 단백질을 포함하는 재조합 렌티바이러스와, VSV 외피 단백질에 의한 형질도입 개선 방법이 유용할 것이다.

새로운 외피형 바이러스들이 계속해서 발견되고 있다. 특히, 최근 수년 동안 대량 병렬(또는 "심층") 핵산 서열분석 방법을 통해 바이러스들의 서열이 확인되었다. 이들 서열 중 다수는 생물학적 특징이 알려지지 않은 바이러스에서 유래한 것이다. 그러므로, 이들은 조혈모세포의 형질도입 개선과 같은 유용한 특성을 갖는 외피 단백질을 발견할 수 있는 기회를 제공한다.

조혈모세포의 형질도입 개선을 위한 또 다른 접근 방법은 렌티바이러스와 회합할 수 있는 비바이러스 단백질(즉, 세포 단백질)을 확인하고, 예를 들어 CD34+ 세포 또는 CD133+ 세포와 같이 장기간 재생 조혈모세포로 생각되는 기타 하위 세포들에 대한 결합을 강화하도록 하는 것이다. 이러한 목적을 위하여 CD133에 결합하여 홍역 바이러스 외피 단백질과 융합되는 단쇄 항체들이 사용되었다(Brendel, et al, 2015). 조작되고 융합된 외피 단백질을 갖는 이러한 렌티바이러스들은 표적세포에 대한 선택성은 더 우수할 수 있으나, 이때 바이러스 생산량이 감소되는 경우가 흔히 있다. CD34 세포의 표면에 단백질을 결합시키는 다른 단백질이 유용할 수 있는데, 특히 막관통 단백질일 경우 렌티바이러스의 막 내부로 더 쉽게 통합될 수 있다는 점에서 그러하다. 예컨대, CD52는 CD34+ 세포 내에서 발현되고(Klabusay, M., et al, 2007), SIGLEC10은 CD52에 대한 리간드로 알려져 있다(Bandala-Sanchez E., et al., 2013). CD34는 CD34+ 세포에서 발현되고, L-셀렉틴은 CD34에 결합하는 리간드로 알려져 있다(Nielsen, J. S., et al., 2009). 이러한 단백질들은 바이러스 생산자 세포(전형적으로, 인간 293T 세포) 내에서 발현되지 않는 것이 바람직한데, 그 이유는 바이러스 생산자 세포 내 외피-수용체 상호작용이 바이러스 생산자 세포 내에서 독성을 야기하여 바이러스 생산을 위하여 일시적인 트랜스펙션 시스템의 이용을 필요로 하게 하고 안정적인 렌티바이러스 생산 세포주의 발생을 방해할 것으로 생각되기 때문이다.

제1 인간 조혈모세포에 대한 렌티바이러스들의 형질도입 효율과 관련된 이러한 문제점들로 인해, 유전자치료 분야에서 인간 조혈모세포의 렌티바이러스 형질도입 개선이 요구된다 하겠다.

본 출원에는 재조합 렌티바이러스에 의한 인간 CD34+ 세포와 같은 조혈모세포의 형질도입을, 전형적인 VSV-G(Indiana 주) 슈도타입화된 렌티바이러스보다 효과적이게 하는 베지큘로바이러스 외피 단백질 및/또는 아레나바이러스 외피 단백질과, 예컨대 렌티바이러스 생산세포 내에서, L-셀렉틴과 같은 인간 CD34+ 세포에 결합하기 위한 리간드의 발현에 의한, 재조합 렌티바이러스에 의한 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 개선하기 위한 방법이 개시되어 있다. 따라서, 다양한 측면에 있어서, 본 개시(들)은 하기의 구현예들 중 하나 이상을 포함하나 반드시 그에 제한되는 것은 아니다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 조혈모세포를 형질도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스로서, 상기 재조합 렌티바이러스는 i) 이종 전이유전자, ii) 바이러스 외피 단백질 및 iii) CD34+ 세포와의 결합을 위한 리간드인 단백질을 포함하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다. 일 구현예에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 베지큘로바이러스 외피 단백질을 포함한다. 예컨대, 상기 베지큘로바이러스 외피 단백질은 수포성 구내염 바이러스 G(VSV-G), 모레톤(Morreton), 마라바(Maraba), 코칼(Cocal), 알라고아(Alagoa) 및 카라자스(Carajas)로 구성되는 베지큘로바이러스 종으로부터 유래한다. VSV-G 외피 단백질은 VSV-G의 Arizona, Indiana 또는 New Jersey 주(strain)로부터 유래할 수 있다.

또한, 상기 재조합 렌티바이러스는 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43로 개시된 바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 바이러스 외피 단백질을 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행된다. 하나 이상의 다른 구현예에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43로 개시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로부터 본질적으로 구성되거나 그로부터 구성된다.

다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 도 4에 표시된 CD34 세포 형질도입 결정자 내 이들의 각 위치의 31 개 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 바이러스 외피 단백질을 포함한다. 또한, 상기 바이러스 외피 단백질은 도 4에 표시된 CD34 세포 형질도입 결정자 내 이들의 각 위치의 31 개 아미노산 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 개 전부를 포함한다.

다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 아레나바이러스 외피 단백질을 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 아레나바이러스 외피 단백질은 마츄포(Machupo), 주닌(Junin), 악코조코아틀라(Ocozocoautla), 타카리브(Tacaribe), 구아나리토(Guanarito), 아마파르(Amapar), 쿠픽시(Cupixi), 사비아(Sabia) 또는 차프레(Chapre) 바이러스로부터 유래한다. 또한, 상기 재조합 렌티바이러스는 서열번호 제 41의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 바이러스 외피 단백질을 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행된다. 하나 이상의 다른 구현예에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 41에 기재된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로부터 본질적으로 구성되거나 그로부터 구성된다.

본 개시의 재조합 렌티바이러스 중 임의의 것은 인간 CD34+ 세포와 같은 조혈모세포를 형질도입할 수 있다.

본 개시의 재조합 렌티바이러스 중 임의의 것은 벡터를 더 포함하며, 상기 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 이종 전이유전자를 포함한다.

본 개시의 재조합 렌티바이러스 중 임의의 것은 자체 활성화(SIN) LTR을 포함한다.

다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스의 이종 전이유전자는 인간 단백질을 암호화한다. 선택적으로, 상기 이종 전이유전자는 인간 헤모글로빈 단백질을 암호화한다. 또 다른 구현예에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 또한 CD34+ 세포에 대한 결합용 리간드인 단백질을 포함한다. 선택적으로, CD34+ 세포에 대한 결합용 리간드인 상기 단백질은 상기 재조합 렌티바이러스의 표면에 존재한다. CD34+ 세포에 대한 결합용 리간드인 상기 단백질은 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행된다. 선택적으로, 인간 CD34+ 세포에 대한 결합용 리간드인 상기 단백질은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로부터 본질적으로 구성되거나 그로부터 구성된다.

또 다른 구현예에 있어서, 본 개시의 재조합 렌티바이러스 중 어느 하나는 상기 외피 단백질을 발현하는 벡터와 L-셀렉틴을 발현하는 상기 벡터의 농도비가 1:2 내지 1:5 범위인 세포에 의해 생산된다. 또한, 본 개시의 재조합 렌티바이러스 중 어느 하나에 있어서, 상기 외피 단백질과 L-셀렉틴의 농도비는 1:2 내지 1:5 범위이다.

본 개시의 다른 측면에 있어서, 조혈모세포 내로 이종 전이유전자를 도입하는 방법으로서, 상기 방법은 줄기세포에 (i) 상기 이종 전이유전자; (ii) 바이러스 외피 단백질; 및 (iii) CD34+ 세포에 대한 결합용 리간드인 단백질;을 포함하는 재조합 렌티바이러스를 형질도입하는 단계를 포함하는 방법이 제공된다. 조혈모세포 내로 이종 전이유전자를 도입하는 상기 방법에는 본 개시의 재조합 렌티바이러스 중 어느 하나가 사용될 수 있다. 상기 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 조혈모세포는 인간 CD34+ 세포와 같은 인간 조혈모세포이다.

일 구현예에 있어서, 상기 방법은 베지큘로바이러스 외피 단백질을 포함하는 재조합 렌티바이러스를 포함한다. 예컨대, 상기 베지큘로바이러스 외피 단백질은 수포성 구내염 바이러스 G(VSV-G), 모레톤(Morreton), 마라바(Maraba), 코칼(Cocal), 알라고아(Alagoa) 및 카라자스(Carajas)로 구성되는 군으로부터 선택되는 베지큘로바이러스 종으로부터 유래한다.

또한, 상기 방법은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43로 개시된 바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 바이러스 외피 단백질을 포함하는 재조합 렌티바이러스를 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행된다. 하나 이상의 다른 구현예에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43로 개시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로부터 본질적으로 구성되거나 그로부터 구성된다.

다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 도 4에 표시된 CD34 세포 형질도입 결정자 내 이들의 각 위치의 31 개 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 바이러스 외피 단백질을 포함하는 재조합 렌티바이러스를 포함한다. 또한, 상기 바이러스 외피 단백질은 도 4에 표시된 CD34 세포 형질도입 결정자 내 이들의 각 위치의 31 개 아미노산 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 개 전부를 포함한다.

다른 구현예에 있어서, 상기 방법은 아레나바이러스 외피 단백질을 포함하는 재조합 렌티바이러스를 포함한다. 예를 들어, 상기 아레나바이러스 외피 단백질은 마츄포(Machupo), 주닌(Junin), 악코조코아틀라(Ocozocoautla), 타카리브(Tacaribe), 구아나리토(Guanarito), 아마파르(Amapar), 쿠픽시(Cupixi), 사비아(Sabia) 또는 차프레(Chapre) 바이러스로부터 유래한다. 또한, 상기 방법은 서열번호 41의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 바이러스 외피 단백질을 포함하는 재조합 렌티바이러스를 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행된다. 하나 이상의 다른 구현예에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 41로 개시된 아미노산 서열을 포함하거나, 그로부터 본질적으로 구성되거나 그로부터 구성된다.

본 개시의 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러는 벡터를 포함하며, 상기 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 이종 전이유전자를 포함한다. 또한, 본 개시의 방법들 중 어느 하나에 있어서, 본 개시의 재조합 렌티바이러스는 자체 활성화(SIN) LTR을 포함한다.

다른 구현예에 있어서, 본 개시의 방법들 중 어느 하나에 있어서, 상기 조혈모세포는 인간 단백질을 암호화는 이종 전이유전자로 형질도입된다. 선택적으로, 상기 이종 전이유전자는 인간 헤모글로빈 단백질을 암호화한다.

또 다른 구현예에 있어서, 본 개시의 방법들 중 어느 하나는 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질을 포함하는 재조합 렌티바이러스를 포함한다. 선택적으로, CD34+ 세포 결합용 리간드인 상기 단백질은 상기 재조합 렌티바이러스의 표면에 존재한다. CD34+ 세포 결합용 리간드인 상기 단백질은 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행된다. 선택적으로, CD34+ 세포 결합용 리간드인 상기 단백질은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하거나, 그로부터 본질적으로 구성되거나 그로부터 구성된다.

또한, 본 개시의 방법들 중 어느 하나는 상기 외피 단백질을 발현하는 벡터와 L-셀렉틴을 발현하는 상기 벡터의 농도비가 1:2 내지 1:5 범위인 세포에 의해 생산된 재조합 렌티바이러스를 포함한다. 또한, 본 개시의 방법들 중 어느 하나는 상기 외피 단백질과 L-셀렉틴의 농도비가 1:2 내지 1:5 범위인 재조합 렌티바이러스를 포함한다.

일 구현예에 있어서, 본 개시의 방법들 중 어느 하나의 상기 형질도입 단계는 부착성 조혈모세포 상에서 수행된다. 다른 구현예에 있어서, 본 개시의 방법들 중 어느 하나의 상기 형질도입 단계는 부유 상태의 조혈모세포 상에서 수행된다.

다른 측면에 있어서, 본 개시는 조혈모세포를 형질도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스를 제공하며, 상기 재조합 렌티바이러스는 이종 전이유전자와, 수포성 구내염 바이러스 G(VSV-G), 모레톤(Morreton), 마라바(Maraba), 코칼(Cocal), 알라고아(Alagoa) 및 카라자스(Carajas)로 구성되는 군으로부터 선택되는 베지큘로바이러스 종으로부터 유래하는 바이러스 외피 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 개시는 조혈모세포를 형질도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스를 제공하며, 상기 재조합 렌티바이러스는 이종 전이유전자와, 도 4에 표시된 CD34 세포 형질도입 결정자 내 이들의 각 위치의 상기 31 개 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 바이러스 외피 단백질을 포함한다.

또 다른 측면에 있어서, 본 개시는 조혈모세포를 형질도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스를 제공하며, 상기 재조합 렌티바이러스는 이종 전이유전자와, 제1형 트랜스페린 수용체(TfnR1)를 사용하여 세포를 감염시킬 수 있는 아레나바이러스 종으로부터 유래하는 바이러스 외피 단백질을 포함한다. 예컨대, 본 개시는 상기 아레나바이러스 외피 단백질이 마츄포 바이러스로부터 유래하는 재조합 렌티바이러스를 제공한다.

일 측면에 있어서, 본 개시는 본 개시의 재조합 렌티바이러스 중 어느 하나와 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

다른 측면에 있어서, 본 개시는 본 개시의 재조합 렌티바이러스 중 어느 하나 또는 본 개시의 조성물 중 어느 하나로 형질도입된 조혈모세포를 투여하는 단계를 포함하는 이상혈색소 증상의 치료방법을 제공한다. 예를 들어, 상기 이상혈색소 증상은 겸상 적혈구성 빈혈 또는 지중해 빈혈이다.

또 다른 측면에 있어서, 본 개시는 이상혈색소 증상을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 본 개시의 재조합 렌티바이러스 중 어느 하나 또는 본 개시의 조성물 중 어느 하나로 형질도입된 조혈모세포의 용도를 제공한다. 예컨대, 상기 이상혈색소 증상은 겸상 적혈구성 빈혈 또는 지중해 빈혈이다.

또한, 본 개시는 본 개시의 재조합 렌티바이러스 중 어느 하나로 형질도입된 조혈모세포를 포함하는, 이상혈색소 증상을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 예를 들어, 상기 이상혈색소 증상은 겸상 적혈구성 빈혈 또는 지중해 빈혈이다.

도 1. 유연관계, 랍도바이러스 아과(subfamilies) 및 랍도바이러스 외피 단백질과 VSV Indiana 외피 단백질의 아미노산 % 동일성(%).
도 2. pCCL GLOBE1 βAS3 게놈과 해당 외피 단백질을 이용하여 생산된 렌티바이러스에 의한 인간 CD34+ 세포의 형질도입.
도 3. 베지큘로바이러스의 계통도. 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 시험한 베지큘로바이러스 외피를 표시하였다. 구대륙 또는 신대륙에서 유래한 것임을 표시하였다. 인간 CD34+ 세포 형질도입 효율이 높거나 낮은 신대륙 유래 베지큘로바이러스 외피들이 표시되어 있다.
도 4A 내지 도 4C. 인간 CD34+ 세포 형질도입 결정자. 인간 CD34+ 세포의 형질도입 매개효율이 낮은 베지큘로바이러스 외피 3종(Imsfahan(서열번호 26), Piry(서열번호 57), Chandipura(서열번호 18))과 인간 CD34+ 세포의 형질도입 매개효율이 높은 베지큘로바이러스 외피 8종((VSV-G(Arizona)(서열번호 4), VSV-G(Indiana)(서열번호 8), VSV-G(New Jersey)(서열번호 14), Morreton(서열번호 12), Maraba(서열번호 10), Alagoas(서열번호 2), Carajas(서열번호 6), Cocal(서열번호 43))를 정렬하였다. 인간 CD34+ 세포의 형질도입 매개효율이 높은 외피 단백질에서는 모두 발견되지만 인간 CD34+ 세포의 형질도입 매개효율이 낮은 외피 단백질에서는 발견되지 않는 31 개 아미노산으로 구성된 인간 CD34+ 세포 형질도입 결정자를 표시하였다.
도 5. VSV-G(Indiana)의 단량체성 전(pre)-융합 구조체 상의 "인간 CD34+ 세포 형질도입 결정자" 내 아미노산들의 위치. CD34+ 세포 형질도입 결정자를 포함하는 아미노산들을 공간 채움 모형으로, 나머지는 골격 모형으로 표시하였다.
도 6. 렌티바이러스 생산자 세포 내에서 인간 L-셀렉틴의 발현에 의한 CD34+ 세포의 렌티바이러스 형질도입의 개선.
도 7. VSV-G Indiana에 의해 매개되는 CD34+ 세포의 렌티바이러스 형질도입은 L-셀렉틴과 비교하여 렌티바이러스 생산자 세포 내에서 인간 SIGLEC10의 공동발현에 의해 개선되지 않았다.
도 8. (75 cm² 플라스크 당) 1 ㎍의 VSV-G Indiana 플라스미드와 5 ㎍의 L-셀렉틴 플라스미드를 사용하여 생산한 바이러스가 5 ㎍의 VSV-G Indiana 플라스미드를 사용하여 생산한 바이러스에 비해 CD34+ 세포 형질도입 효율이 더 높았다.
도 9. L-셀렉틴 발현벡터(SELL)의 추가가 5 ㎍의 VSV-G(Indiana)(IN) 발현벡터를 포함하는 바이러스 생산의 최적화에 미치는 영향.
도 10. 인간 L-셀렉틴을 발현하는 VSV-G in 생산자 세포의 Indiana 주로부터 유래하는 VSV-G 외피 단백질로 생산된 렌티바이러스에 의한 인간 CD34+ 세포의 형질도입 개선은 인간 L-셀렉틴을 중성화하는 항체에 의해 억제된다.
도 11. eGFP를 발현하며 인간 L-셀렉틴 존재 또는 부존재 하에 생산된 렌티바이러스에 의한 CD34 음성 세포(293T 세포)의 형질도입.
도 12. 렌티바이러스 생산 과정에서 Maraba 외피 플라스미드와 L-셀렉틴 플라스미드 발현 간 투여량-관계(dose relationship) 및 인간 CD34+ 세포의 렌티바이러스 형질도입에 미치는 영향.
도 13. Maraba 외피와 L-셀렉틴으로 슈도타입화한 렌티바이러스는 VSV-G(Indiana) 외피로 슈도타입화한 렌티바이러스에 비해 다수의 기증자로부터 유래한 인간 CD34+ 세포에 대하여 개선된 형질도입을 보인다.
도 14. 바이러스를 생산하는 293T 세포 내에서 인간 L-셀렉틴의 발현에 의한 인간 CD34+ 세포의 Morreton 베지큘로바이러스 외피 매개 형질도입의 개선.
도 15. 바이러스를 생산하는 293T 세포 내에서 인간 L-셀렉틴의 공동발현에 의한 인간 CD34+ 세포의 Carajas 베지큘로바이러스 외피 매개 렌티바이러스 형질도입의 개선.
도 16. 인간 CD34+ 세포를 Machupo 바이러스(Carvallo 주) 유래 아레나바이러스 외피 단백질로 생산한 렌티바이러스에 의해 형질도입하였다.
도 17. 아레나바이러스 외피 단백질의 계통도.
도 18. pHCMV-VSV-G(Indiana)(서열번호 44)의 지도.
도 19. pHCMV-XL5-인간 L-셀렉틴(서열번호 45)의 지도.
도 20. eGFP 리포터 렌티바이러스 게놈 플라스미드(pCCL-c-MNU3- eGFP; 서열번호 46)의 지도.
도 21. pCCL GLOBE1-βAS3(서열번호 47)의 지도.
도 22. pRSV rev(서열번호 48)의 지도.
도 23. pMDL g/p RRE(서열번호 49)의 지도.

본 개시는 유전자치료 분야에서 요구되는 조혈모세포의 렌티바이러스 형질도입이 개선된 렌티바이러스의 생산에 유용한 조성물들과 방법들을 제공한다. 아래에 기재된 구체적 구현예들은 이러한 조성물들과 방법들의 예들을 설명한다. 그러나, 이러한 구현예들에 대한 설명으로부터, 본 발명의 다른 측면들이 하기 기재로부터 성립 및/또는 실행될 수 있다.

I. 일반적 기법들　

다른 언급이 없는 한, 본 발명은 세포생물학, 분자생물학, 세포배양, 바이러스학 등의 종래기술을 이용한다. 이러한 기법들은 최근의 문헌들에 상세하게 개시되어 있으며, 구체적으로 Sambrook, Fritsch and Maniatis eds., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Celis J. E. "Cell BIology, A Laboratory Handbook" Academic Press, Inc. (1994)와 Bahnson et al., J. of Virol. Methods, 54:131-143 (1995)을 참고할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 인용된 모든 문헌들과 특허출원들은 본 개시과 관련된 기술분야의 당업자의 기술수준을 나타내며 그 전체 내용이 참조로서 포함된다.

II. 정의

본 명세서 전체에 걸쳐 아래에 정의된 용어들이 사용된다.

개방형 용어 "포함하는(comprising)"은 포함하는(including, containing) 또는 가지는(having)과 같은 비제한적 용어들과 동의어로서 사용되고 본 개시을 기술하고 구체예들을 청구하기 위해 사용되지만, "구성되는" 또는 "본질적으로 구성되는(consisting essentially of)"과 같은 보다 제한적인 용어에 의해 기술될 수도 있다.

본 명세서에 있어서, 수치에 적용된 용어 "약"은 계산 또는 측정이 약간 부정확할 수 있음(정확한 수치에 근접하거나, 그 수치에 근사적으로 또는 상당히 가깝거나, 거의 일치하는 경우)을 나타낸다. 만일, 어떤 이유로 당해 기술분야에서 "약"이 의미하는 부정확성이 이러한 일반적인 의미와 다르게 이해되는 경우, 본 명세서에서 사용된 "약"은 일반적인 측정방법 또는 변수를 사용함에 따라 적어도 편차가 발생할 수 있음을 나타낸다.

본 명세서에 있어서, 용어 "및/또는"은 나열된 관련 항목들의 하나 이상의 모든 조합을 포함한다.

용어 "렌티바이러스"는 복합 레트로바이러스의 군을 의미하고, 용어 "재조합 렌티바이러스"는 렌티바이러스 게놈(예컨대, HIV-1 게놈)으로부터 유래하는 재조합 바이러스로서 복제는 할 수 없지만 배양된 세포(예컨대, 293T 세포) 내에서 생산되어 관심 대상 세포로 유전자를 전달할 수 있도록 가공된 것을 의미한다.

용어 "베지큘로바이러스"는 Rhabdoviridae 과에 속하는 네거티브-센스(negative sense) 단일가닥 레트로바이러스의 속을 의미한다.

용어 "형질도입"은 관심 대상 세포를 감염시킨 후 유전자를 전달하고 발현하는 일련의 과정을 의미한다.

용어 "형질도입 결정자"는 바이러스에 의한 세포의 형질도입을 매개하거나 개선하는 바이러스 외피 단백질 내의 하나 이상의 특정한 아미노산을 의미한다. 예를 들어, "CD34+ 세포 형질도입 결정자"는 CD34+ 세포의 형질도입을 매개하거나 개선하는 바이러스 외피 단백질 내에서 발견되는 일단의 아미노산을 의미한다. 이러한 아미노산들은 렌티바이러스를 슈도타입화하여, 슈도타입화된 렌티바이러스가 전형적인 VSV-G Indiana 슈도타입화된 렌티바이러스와 동등한 또는 그 이상의 정도로 CD34+ 세포를 형질도입할 수 있게 한다.

용어 "외피 단백질"은 바이러스의 표면에 존재하는 막관통 단백질을 지칭하는 것으로, 해당 바이러스가 형질도입할 수 있는 세포의 종과 유형을 결정한다.

용어 "슈도타입화"는 바이러스의 임의의 성분을 이종 바이러스의 성분으로 교체하는 것을 의미한다. 특히, "슈도타입화"는 야생형 외피와 다른 외피를 포함하는 재조합 바이러스를 나타내며, 이에 따라 친화성이 달라짐을 의미한다. 슈도타입화된 렌티바이러스는 렌티바이러스로부터 유래하지 않거나 다른 종 또는 다른 아종의 렌티바이러스로부터 유래하는, 예컨대 다른 바이러스로부터 유래하거나, 세포로부터 유래하거나, 다른 바이러스 또는 세포로부터 유래하는 다른 세포막 단백질에 의해 교체된, 이종 외피를 갖는 렌티바이러스이다.

용어 "VSV 외피"는 수포성 구내염 바이러스(VSV)라고 불리는 랍도바이러스로부터 유래하는 외피 단백질을 의미한다. 이 단백질은 흔히 VSV-G 단백질이라고도 하는데, 이때 "G"는 당단백질을 의미한다. 랍도바이러스의 외피 단백질은 유일한 당화된 랍도바이러스 단백질이다.

용어 "조혈모세포"는 줄기세포 결핍 이식자에게 이식되는 경우 골수로 이동하고 분열하여 최종적으로 적혈구, T 세포, 호중구, 과립구, 단핵세포, 자연살해세포, 호염기구, 수지상 세포, 호산구, 비만세포, B 세포, 혈소판 및 거핵구와 같이 혈액에서 발견되는 골수 또는 적혈구 계통 세포로 분화하는 세포를 의미한다. 일부 구현예에 있어서, 상기 조혈모세포는 인간 조혈모세포이다.

CD34는 조혈모세포 및 내피 줄기세포와 같은 혈액 및 골수 유래 원시 전구세포에 대한 마커로 흔히 사용되는 당화된 막관통 단백질이다. 용어 "CD34+ 세포"는 조혈모세포, 내피 줄기세포 및 중간엽 줄기세포와 같이 CD34 단백질을 발현하는 세포를 의미한다.

용어 "부착성 조혈모세포"는 세포배양 용기 또는 다른 적당한 기질의 표면과 같은 고체 또는 반고체 기질에 부착하는 조혈모세포를 의미한다. 부착성 인간 조혈모세포는 생체 외에서 세포배양 용기 또는 기질의 이용 가능한 표면적을 덮을 때까지 또는 배지의 영양분이 고갈될 때까지 성장한다.

용어 "부유 상태의 조혈모세포"는 생체 외에서 성장하지만 세포배양 용기의 표면에 부착하지 않고 배양배지 내에 부유한 채 성장 중인 조혈모세포를 의미한다.

용어 "전이유전자"는 재조합 렌티바이러스 벡터와 같은 벡터에 의해 숙주세포 또는 생물체의 게놈 내로 도입된 외인성 핵산 서열을 의미한다. "이종 전이유전자"는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 효소 또는 다른 관심 대상 생성물을 암호화하는, 한 생물체에서 다른 생물체 내로 도입된 외인성 핵산 서열과, 숙주세포 내에서 암호화된 생성물의 전사 및/또는 번역을 지시하며 숙주세포 내에서 암호화된 생성물의 발현을 가능하게 하는 조절서열을 의미한다. 예컨대, 이종 전이유전자는 렌티바이러스 서열에 대하여 이종이며 숙주세포 내에서 암호화된 생성물의 발현을 가능하게 한다.

용어 "서열 동일성"은 둘 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 비교하여 결정되는 유사성을 의미한다. 당해 기술분야에서, "동일성"은 또한 경우에 따라 둘 이상의 뉴클레오티드 서열 또는 둘 이상의 아미노산 서열을 매칭하여 결정되는, 핵산 분자들 또는 폴리펩티드들 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 필요하다면 특정한 수학적 모델 또는 컴퓨터 프로그램을 이용하여 갭 정렬로 둘 이상의 서열 간의 동일한 부분의 백분율을 측정한다.

두 핵산 서열의 % 동일성을 결정하기 위하여, 최적 비교 목적으로 서열들을 정렬한다(예를 들어, 두 번째 아미노산 또는 핵산 서열과의 최적 정렬을 위해 첫 번째 핵산의 서열 내에 갭을 도입할 수 있다). 이어, 뉴클레오티드 위치의 뉴클레오티드 잔기들을 비교한다. 첫 번째 서열 내의 위치에 두 번째 서열 내의 해당 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드 잔기가 존재하는 경우, 두 분자는 해당 위치에서 동일하다. 두 서열 사이의 % 동일성은 두 서열이 공유하는 동일 위치의 수의 함수이다(즉, % 동일성 = 동일 위치의 수 / 위치의 총 수 (즉, 중첩 위치의 수)×100). 바람직하게, 두 서열은 길이가 같다.

서열 비교는 비교되는 서열들 전체 길이에 대하여 또는 두 서열의 단편에 대하여 수행될 수 있다. 전형적으로, 서열 비교는 비교되는 두 서열의 전체 길이에 대하여 수행된다. 그러나, 서열 동일성은 예를 들어, 약 20, 약 50, 약 100, 약 200, 약 500, 약 1000, 약 2000, 약 3000, 약 4000, 약 4500, 약 5000 또는 그 이상의 인접하는 핵산 잔기의 영역에 대하여 비교할 수 있다. 분석 대상 서열들 사이의 최대 매칭을 얻기 위하여 동일성 및/또는 유사성을 결정하기 위한 더 선호되는 방법들이 고안되어 있다. 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 방법들은 공개적으로 구할 수 있는 컴퓨터 프로그램으로 기술되어 있다. 두 서열들 사이의 동일성 및 유사성을 결정하기 위한 구체적인 컴퓨터 프로그램에는 GAP(Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))를 포함하는 GCG 프로그램 패키지가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. BLASTX 프로그램은 미국 국립생물공학정보센터(NCBI) 및 그 밖의 출처들(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al., supra)로부터 공개적으로 입수할 수 있다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘을 이용하여 동일성을 결정할 수도 있다.

용어 "CD34+ 세포 결합용 리간드"는 형질도입을 위하여 CD34+ 세포의 세포 표면에 대한 렌티바이러스의 결합을 촉진하는 분자를 의미한다. 리간드는 단백질, 당단백질, 당 또는 지질일 수 있다. 인간 CD34+ 세포에 결합하기 위한 리간드의 한 예는 L-셀렉틴이다. 용어 "벡터"는 핵산 서열을 세포 내로 도입하는 핵산 분자를 의미한다. 예를 들어, 재조합 렌티바이러스는 핵산 서열을 인간 CD34+ 세포 내로 도입하기 위한 벡터로서 작용한다.

용어 "작동 가능하게 연결된"은 하나의 핵산 분자, 예컨대 발현 카세트 또는 벡터에서 뉴클레오티드 서열들이, 하나 이상의 뉴클레오티드 서열의 기능이 상기 핵산 분자에 존재하는 적어도 하나의 다른 뉴클레오티드 서열에 영향을 받도록 연결된 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터와 같은 발현 조절 서열이 전이유전자의 핵산 서열을 발현시킬 수 있는 경우 해당 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 것이다.

용어 "프로모터"는 DNA에서 RNA로의 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 이것은 전이유전자의 발현을 촉진하는 기능을 하는 발현 조절서열이다.

용어 "자체 비활성화 렌티바이러스 벡터"는 비기능성의 또는 변형된 3' 긴 말단 반복서열(LTR)을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 의미한다. 이 서열은 융합 과정에서 벡터 게놈의 5' 말단으로 복제되어, 두 LTR에 의한 프로모터 활성을 비활성화한다.

III. 발명의 설명

A. 재조합 렌티바이러스

본 발명은 인간 CD34+ 세포와 같은 조혈모세포의 형질도입을 가능하게 하는, 렌티바이러스 유전자치료 벡터와 바이러스 외피 단백질을 함께 갖는 재조합 바이러스들을 제공한다. 일 구현예에 있어서, 본 개시는 랍도바이러스 외피 단백질의 결합 도메인 또는 그로부터 유래하는 아미노산 서열을 포함하는 이종 외피 내에 패키지화된 렌티바이러스 유전자 벡터로 구성되는 재조합 렌티바이러스를 제공한다. 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 최소한 렌티바이러스 5' 긴 말단 반복서열(LTR)과, 숙주세포로의 전달을 위한 분자, 그리고 렌티바이러스 3' LTR 서열의 기능성 부분을 포함한다. 선택적으로, 상기 벡터는 ψ(psi) 캡시드화 서열, Rev 반응요소(RRE) 서열 또는 그와 동등하거나 유사한 기능을 제공하는 서열을 더 포함할 수 있다. 숙주세포로의 전달을 위해 벡터에 의해 운반되는 이종 분자는 폴리펩티드, 단백질, 효소, 탄수화물, 화학물질, 또는 올리고뉴클레오티드, RNA, DNA 및/또는 RNA/DNA 하이브리드를 포함할 수 있는 핵산 분자를 포함한 임의의 바람직한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에 있어서, 상기 이종 분자는 사람의 염색체 내로 특정한 유전적 변형, 예컨대 돌연변이된 유전자의 교정을 도입하는 핵산 분자이다. 또 다른 바람직한 구현예에 있어서, 상기 이종 분자는 원하는 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 효소 또는 그 밖의 생성물을 암호화하는 핵산 서열과, 숙주세포 내에서 암호화된 생성물의 전사 및/또는 번역을 지시하고 숙주세포 내에서 암호화된 생성물의 발현을 가능하게 하는 조절서열을 포함하는 전이유전자를 포함한다. 적절한 생성물들과 조절서열들은 아래에서 더 자세하게 설명한다. 그러나, 벡터에 의해 운반되고 본 개시의 바이러스에 의해 전달되는 이종 분자의 선택이 본 발명을 제한하는 것은 아니다.

1. 렌티바이러스의 성분들

본 개시의 렌티바이러스 벡터와 재조합 바이러스를 제조하기 위한 렌티바이러스의 성분들을 선택함에 있어서, 임의의 적당한 렌티바이러스와 임의의 적당한 렌티바이러스 혈청형 또는 주를 용이하게 선택할 수 있다. 적당한 렌티바이러스에는 예컨대 인간 면역결핍 바이러스(HIV), 유인원 면역결핍 바이러스(SIV), 염소 관절염 및 뇌염 바이러스(CAEV), 말 전염성 빈혈 바이러스(EIAV), 비스나바이러스, 고양이 면역결핍 바이러스(FIV), 소 면역결핍 바이러스(BIV)가 포함된다. 본 명세서에 제시된 실시예들에서는 HIV로부터 유래한 벡터의 사용이 설명되어 있다. 그러나, 비인간 유래의 FIV 및 기타 렌티바이러스들도 특히 바람직하게 사용될 수 있다. 본 개시에 사용된 서열들은 교육기관, 비영리기관(예컨대, American Type Culture Collection, Manassas, Virginia) 또는 상업적인 렌티바이러스 출처로부터 얻을 수 있다. 또한, 상기 서열은 유전공학 기법을 이용하여 재조합 방법에 의해 생산하거나, 공개된 전자 데이터베이스에 포함된 서열을 포함하는, 공개된 바이러스 서열을 참조하여, 종래의 기법(예컨대, G. Barony and R.B. Merrifield, THE PEPTIDES: ANALYSIS, SYNTHESIS & BIOLOGY, Academic Press, pp. 3-285 (1980))을 이용하여 합성할 수 있다.

a) LTR 서열

렌티바이러스 벡터는 게놈을 역전사하여 cDNA를 생성하기에 충분하며, 렌티바이러스 벡터 내에 존재하는 RNA 서열의 발현을 허용하기에 충분한 양의 렌티바이러스 긴 말단 반복서열(LTR)을 포함한다. 이들 서열은 벡터의 5' 말단에 위치하는 5' LTR 서열들과 벡터의 3' 말단에 위치하는 3' LTR 서열들을 모두 포함한다. 이들 LTR 서열은 선택된 렌티바이러스 또는 교차반응성 렌티바이러스에 고유한 손상되지 않은 LTR, 보다 바람직하게는 변형된 LTR일 수 있다.

렌티바이러스 LTR에 대한 다양한 변형이 보고되었다. 특히 바람직한 한 가지 변형은 H. Miyoshi et al, J. Virol., 72: 8150-8157 (Oct. 1998)에 기재된 것과 같은 HIV용 자체 비활성화 LTR이다. 이러한 HIV LTR에서, 5' LTR의 U3 영역은 강력한 이종 프로모터(예컨대, CMV)로 교체되고 3' LTR의 U3 영역 내에서 133 bp가 결실된다. 따라서, 역전사시 3' LTR의 결실이 5' LTR로 이전되어 LTR의 전사가 비활성화된다. HIV의 전체 뉴클레오티드 서열이 알려져 있다(L. Ratner et al. Nature. 313(6000):277-284 (1985) 참조). 또 다른 적절한 변형은 U3 영역의 완전히 결실을 포함하나, 이에 따라 5' LTR이 강력한 이종 프로모터와 R 영역, U5 영역만을 포함하고, 3' LTR이 polyA를 포함하는 B 영역만을 포함한다. 또 다른 구현예에서는 5' LTR의 U3 영역과 U5 영역이 모두 결실되고, 3' LTR은 R 영역만을 포함한다. 이러한 그리고 다른 적절한 변형들은 HIV 및/또는 다른 선택된 렌티바이러스의 비교 영역에서 당업자에 의해 용이하게 수행될 수 있다.

선택적으로, 렌티바이러스 벡터는 5' 렌티바이러스 LTR 서열의 다운스트림에 ψ(psi) 패키징 신호서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, LTR 서열들 사이에, 그리고 ψ 서열의 바로 업스트림에 하나 이상의 스플라이스 공여부위가 위치할 수 있다. 본 발명에 따르면, ψ 서열은 gag 서열과의 중첩을 제거하고 패키지화를 개선하기 위해 변형될 수 있다. 예를 들어, gag 암호화 서열의 업스트림에 종결 코돈이 삽입될 수 있다. 당업자는 ψ 서열에 대하여 다른 적절한 변형을 수행할 수 있다. 본 발명은 그러한 변형에 의해 제한되지 않는다.

적절한 일 구현예에 있어서, 렌티바이러스 벡터는 LTR 및 ψ 서열의 다운스트림에 위치하는 렌티바이러스 Rev 반응요소(RRE) 서열을 포함한다. 적절하게, RRE 서열은 최소 약 275 내지 약 300 nt의 고유 렌티바이러스 RRE 서열을, 보다 바람직하게는, 적어도 약 400 내지 약 450 nt의 RRE 서열을 포함한다. 선택적으로, RRE 서열은 gag/pol의 발현과 세포핵으로의 이동을 돕는 적절한 다른 요소에 의해 대체될 수 있다. 예를 들어, 다른 적절한 서열들에는 Manson-Pfizer 바이러스의 CT 요소 또는 우드처크 간염 바이러스의 후조절 요소(WPRE)가 포함될 수 있다. 또한, gag와 gag/pol을 암호화하는 서열들을 변경하여 gag 및 gag/pol 폴리펩티드의 아미노산 서열 변경 없이 핵 이동이 변형되도록 할 수도 있다. 적절한 방법은 당업자에게 점차 더 명확해질 것이다.

b) 전이유전자

앞서 언급한 바와 같이, 바람직한 일 구현예에 있어서, 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는 분자는 전이유전자이다. 전이유전자는 렌티바이러스 서열에 대하여 이종이며 단백질, 펩티드, 폴리펩티드, 효소 또는 그 밖의 관심 대상 생성물을 암호화하는 핵산 서열과, 숙주세포 내에서 암호화된 생성물의 전사 및/또는 번역을 지시하며 숙주세포 내에서 암호화된 생성물의 발현을 가능하게 하는 조절서열을 포함하는 핵산 분자이다. 전이유전자의 조성은 본 개시의 벡터와 슈도타입화된 바이러스의 의도된 용도에 따라 달라진다.

예를 들어, 한 가지 유형의 전이유전자는 발현시 검출 가능한 신호를 생성하는 리포터 또는 마커 서열을 포함한다. 그러한 리포터 또는 마커 서열에는 β-락타마제, β-갈락토시다아제(LacZ). 알칼리 포스포타아제, 티미딘 키나아제, 녹색형광 단백질(GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), 루시페라아제, 예컨대 CD2, CD4, CD8 및 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질을 포함하는 막결합 단백질, 그 밖에 당해 기술분야에 잘 알려진 물질을 암호화하는 DNA 서열이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 개시의 재조합 바이러스는 예컨대 백신의 목적으로 항체 및/또는 세포 매개 면역반응을 야기하는 유전자 산물 및 다른 분자들을 전달하는 데 유용하다. 당업자는 바이러스와, 단세포 및 다세포 기생생물을 포함하는 원핵생물 및 진핵생물로부터 유래하는 면역원성 단백질들과 폴리펩티드들로부터 적절한 유전자 산물을 용이하게 선택할 수 있다. 또한, 본 개시의 재조합 바이러스는 연구 목적으로 바람직한 분자를 전달하는 데에도 유용하다.

특히 바람직한 일 구현예에 있어서, 본 개시의 재조합 바이러스는 정상적인 유전자가 발현되지만 그 수준이 정상 미만인 유전자 결함을 치료 또는 개선하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 치료 목적에 유용하다. 상기 재조합 바이러스는 기능성 유전자 산물이 발현되지 않는 유전적 결함을 치료 또는 개선하기 위해 사용될 수도 있다. 바람직한 유형의 전이유전자는 숙주세포 내에서 발현을 위한 바람직한 치료 산물을 암호화하는 서열을 포함한다. 전형적으로, 이러한 치료용 핵산 서열은 유전되는 또는 유전되지 않는 유전적 결함을 치료 또는 보완하거나, 후생적인 장애 또는 질환을 치료할 수 있는 산물들을 암호화한다. 따라서, 본 개시는 다수의 하위 단위체로 구성되는 단백질에 의한 유전자 결함을 치료 또는 완화하기 위하여 사용할 수 있는 재조합 바이러스를 생산하는 방법을 포함한다. 상황에 따라, 단백질의 각 하위 단위체를 암호화하기 위하여 다른 전이유전자가 사용될 수 있다. 이것은 예컨대 면역 글로불린이나 혈소판 유래 성장인자 수용체의 경우와 같이 단백질 하위 단위체를 암호화하는 DNA의 크기가 큰 경우에 바람직하다. 세포가 다수의 하위 단위체로 구성되는 단백질을 생산하도록 하기 위하여, 각 하위 단위체를 포함하는 재조합 바이러스로 세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 동일한 전이유전자로 각 단백질의 여러 하위 단위체들을 암호화할 수도 있다. 이 경우, 하나의 전이유전자는 각 하위 단위체를 암호화하는 DNA를 포함할 수 있고, 각 하위 단위체에 대한 DNA는 내부 리보솜 진입부위(IRES)에 의해 분리될 수 있다. 이것은 각 하위 단위체를 암호화하는 DNA의 크기가 작아서 하위 단위체들을 암호화하는 DNA와 IRES의 전체 길이가 9 킬로베이스 미만인 경우에 바람직하다. 또한, IRES의 사용을 요하지 않는 다른 방법들도 단백질의 공동발현에 이용될 수 있다. 이러한 다른 방법들은 제 2의 내부 프로모터, 다른 스플라이스 신호, 또는 번역 중 또는 번역 후 단백질 분해와 같이 당업자에게 알려진 방법의 사용을 포함할 수 있다. 본 개시의 구체적인 일 실시예에 있어서, 전이유전자에 의해 암호화되는 유전자 산물은 기능성 인간 헤모글로빈 단백질이다.

그 밖의 유용한 전이유전자에는 키메릭 또는 하이브리드 폴리펩티드 또는 삽입, 결실 또는 아미노산 치환을 포함하는, 자연적으로 존재하지 않는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 같은 자연적으로 존재하지 않는 폴리펩티드들이 포함된다. 다른 유형의 자연적으로 존재하지 않는 유전자 서열은 안티센스 분자들과 리보자임 같은 촉매성 핵산들을 포함하며, 유전자의 과발현을 줄이기 위해 사용될 수 있다. 전이유전자 서열 또는 렌티바이러스 벡터에 의해 운반되는 다른 분자의 선택은 본 발명을 제한하지 않는다. 전이유전자 서열의 선택은 본 출원의 개시내용을 참조할 때 당업자의 수준 내에 있다 하겠다.

c) 조절요소

세포와 숙주 내에서 원하는 유전자 산물을 얻기 위하여 전사, 번역 및/또는 발현을 요하는 전이유전자 또는 다른 핵산 서열의 설계는 암호화된 산물의 발현을 촉진하기 위하여 관심 대상 암호화 서열과 작동 가능하게 연결된 적절한 서열을 포함한다. "작동 가능하게 연결된" 서열은 관심 대상 핵산 서열과 인접하는 발현 조절서열과, 그 관심 대상 핵산 서열을 제어하기 위하여 트랜스로 또는 거리를 두고 작동하는 발현 조절서열을 모두 포함한다.

발현 조절서열은 적절한 전사 개시, 종료, 프로모터 및 인핸서 서열; 스플라이싱 신호 및 폴리아데닐화 신호와 같은 효과적인 RNA 처리신호; 세포질 mRNA를 안정화하는 서열; 번역 효율을 높이는 서열(Kozak 공통서열); 단백질 안정도를 높이는 서열; 그리고, 필요한 경우, 단백질 분비를 증가시키는 서열을 포함한다. 당해 기술분야에는 많은 수의 발현 조절서열들(원서열, 구조서열, 유도성 서열 및/또는 조직 특이적 서열)이 알려져 있으며, 원하는 발현 유형에 따라 이들을 이용하여 유전자를 발현시킬 수 있다. 진핵세포의 경우, 발현 조절서열은 전형적으로 프로모터, 면역 글로불린 유전자, SV40, 거대세포 바이러스 등으로부터 유래한 인핸서, 그리고 스플라이스 공여부위 및 수용부위를 포함할 수 있는 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 폴리아데닐화(폴리A) 서열은 일반적으로 전이유전자 서열에 뒤이어, 그리고 3' 렌티바이러스 LTR 서열의 앞에 삽입된다. 가장 적절하게, 전이유전자 또는 다른 분자를 운반하는 렌티바이러스 벡터는 LTR 서열을 제공하는 렌티바이러스, 예컨대 HIV로부터 유래하는 폴리A를 포함한다. 그러나, 다른 출처로부터 유래하는 polyA도 용이하게 선택되어 본 개시의 구성에 포함될 수 있다. 일 구현예에 있어서, 소 성장호르몬의 폴리A가 선택된다. 또한, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 바람직하게 프로모터/인핸서 서열과 전이유전자 사이에 위치하는 인트론을 포함할 수 있다. 한 가지 가능한 인트론 서열 역시 SV-40로부터 유래하는데, 이를 SV-40 T 인트론 서열이라 한다. 벡터 내에 사용될 수 있는 또 다른 요소는 내부 리보솜 진입부위(IRES)이다. IRES 서열은 하나의 유전자 트랜스크립트로부터 둘 이상의 폴리펩티드를 생산하기 위하여 사용된다. IRES 서열을 이용하여 둘 이상의 폴리펩티드 사슬을 포함하는 단백질을 생산할 수 있다. 이러한 그리고 그 밖의 일반적인 벡터 요소들의 선택은 일반적이며 이러한 다수의 서열들이 입수 가능하다(예를 들어, Sambrook et al.과 여기에 인용된 문헌들, 예컨대 pp. 3.18-3.26과 16.17-16.27 및 Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. John Wiley & Sons, New York, 1989를 참조).

일 구현예에 있어서, 높은 수준의 구조발현이 바람직할 것이다. 유용한 구조적 프로모터의 예로는 레트로바이러스 라우스육종 바이러스(RSV) LTR 프로모터(선택적으로 RSV 인핸서를 가짐), 거대세포 바이러스(CMV) 프로모터(선택적으로 CMV 인핸서를 가짐)(Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985) 참조), SV40 프로모터, 디히드로엽산 환원효소 프로모터, β-액틴 프로모터, 포스포글리세롤 키나아제(PGK) 프로모터 및 EFlα 프로모터(Invitrogen)가 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 외인성으로 공급되는 화합물에 의해 조절되는 유도성 프로모터 역시 유용하며, 아연 유도성 양 메탈로티오닌(MT) 프로모터, 덱사메타손(Dex) 유도성 생쥐 유선종양 바이러스(MMTV) 프로모터, T7 중합효소 프로모터 시스템(WO 98/10088); 엑디손 곤충 프로모터(No et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:3346-3351 (1996)), 테트라사이클린 억제성 시스템(Gossen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)), 테트라사이클린 유도성 시스템(Gossen et al, Science. 268: 1766-1769 (1995), 또한 Harvey et al, Curr. Opin. Chem. Biol. 2:512-518 (1998) 참조), RU486 유도성 시스템(Wang et al. Nat. Biotech. 15:239- 243 (1997) 및 Wang et al, Gene Ther. 4:432-441 (1997))과 라파마이신 유도성 시스템(Magari et al, J. Clin. Invest.. 100:2865-2872 (1997))을 포함한다. 이와 관련하여 유용할 수 있는 다른 유형의 유도성 프로모터는 예컨대 체온, 급성 단계, 세포의 특정 발현상태와 같은 특정한 생리적 상태에 의해 조절되거나 또는 복제 중인 세포 내에서만 조절되는 것들을 포함한다.

다른 구현예에 있어서, 전이유전자에 대한 고유 프로모터가 사용될 것이다. 전이유전자의 발현이 고유 발현과 유사해야 하는 경우에 고유 프로모터가 바람직할 수 있다. 전이유전자의 발현이 일시적으로 또는 발달 과정에 따라 조직 특이적인 방식으로 또는 특정한 전사 자극에 대한 반응으로서 조절되어야 하는 경우 고유 프로모터를 사용할 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, 인핸서 요소, 폴리아데닐화 부위 또는 Kozak 공통서열과 같은 다른 고유 발현 제어요소들 역시 고유 발현을 모방하기 위해 사용될 수 있다. 전이유전자의 또 다른 구현예는 조직 특이적 프로모터에 작동 가능하게 연결된 전이유전자를 포함한다.

모든 발현 조절서열이 본 개시의 모든 전이유전자를 동등하게 잘 발현하도록 기능하는 것은 아니다. 그러나, 당업자는 본 개시의 범위를 벗어나지 않고 이러한 발현 조절서열들로부터 선택할 수 있다. 당업자는 본 출원의 지침을 이용하여 적절한 프로모터/인핸서 서열을 선택할 수 있다. 그러한 선택은 일상적인 것이며 분자 또는 구조체를 제한하지 않는다. 예를 들어, 관심 대상 암호화 서열에 작동 가능하게 연결되고 본 개시의 전이유전자, 벡터 및 재조합 바이러스 내에 삽입되는 하나 이상의 발현 조절서열을 선택할 수 있다. 본 명세서에 개시된 또는 당해 기술분야에 알려진 렌티바이러스 벡터를 패키지화하기 위한 방법들 중 하나를 수행한 후에, 적절한 세포를 생체 외 또는 생체 내에서 감염시킬 수 있다. 서던 블로팅 또는 정량적 PCR에 의해 세포 내의 벡터의 카피 수를 모니터링할 수 있다. RNA 발현의 수준은 노던 블로팅 또는 정량적 RT- PCR에 의해 모니터링할 수 있다. 웨스턴 블로팅, 면역조직화학, ELISA, RIA 또는 유전자 산물의 생물학적 활성에 대한 시험에 의해 발현 수준을 모니터링할 수 있다. 따라서, 특정 발현 조절서열이 전이유전자에 의해 암호화된 구체적인 산물에 적합한지의 여부를 용이하게 분석할 수 있으며 가장 적절한 발현 조절서열을 용이하게 선택할 수 있다. 또한, 전달되는 분자가 발현을 요하지 않는 경우, 예컨대 탄수화물, 폴리펩티드, 펩티드 등인 경우, 발현 조절서열은 렌티바이러스 벡터 또는 다른 분자의 일부를 구성하지 않을 수 있다.

d) 기타 렌티바이러스 요소

선택적으로, 렌티바이러스 벡터는 당해 기술분야에서 잘 알려진 그 밖의 렌티바이러스 요소를 포함할 수 있으며, 이들 중 다수를 렌티바이러스 패키징 서열과 관련하여 아래에서 기재하였다. 그러나, 렌티바이러스 벡터는 렌티바이러스 외피 단백질과 결합하는 능력을 갖지 않는다는 점을 주목해야 한다. 이러한 렌티바이러스 벡터는 RRE에 해당하는 외피 서열의 일부를 포함할 수 있으나 다른 외피 서열은 갖지 않는다. 그러나, 보다 바람직하게, 복제 가능한 바이러스를 야기하는 재조합 반응의 가능성을 제거하기 위하여, 렌티바이러스 벡터는 어떠한 기능성 렌티바이러스 외피 단백질을 암호화하는 서열도 갖지 않는다.

따라서, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 최소한 렌티바이러스 5' 긴 말단 반복서열(LTR) 서열, (선택적으로) ψ(psi) 캡시드화 서열, 숙주세포로의 전달을 위한 분자, 그리고 렌티바이러스 3' LTR 서열의 기능성 부분을 포함한다. 바람직하게, 상기 벡터는 RRE 서열 또는 기능적으로 이와 유사한 서열을 더 포함한다. 적절하게, 본 개시의 렌티바이러스 벡터는 적절한 방법에 의해, 예컨대 렌티바이러스 벡터를 포함하는 "노출된" DNA 분자의 트랜스펙션에 의해 또는 상기한 다른 렌티바이러스 요소 및 조절요소와 그 밖의 벡터에서 흔히 발견되는 요소를 포함할 수 있는 벡터에 의해, 바이러스 내로의 패키지화를 위하여 숙주세포로 전달된다. "벡터"는 서열 또는 분자를 운반하여 세포로 전달할 수 있는 임의의 적절한 수단일 수 있다. 예컨대, 벡터는 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스 등으로부터 용이하게 선택되나, 이에 제한되지 않는다. 본 개시에 이용되기에는 플라스미드가 특히 적합하다. 선택된 벡터는 트랜스펙션, 전기천공, 리포좀 전달, 막융합 기술, 고속 DNA 코팅 펠릿, 바이러스 감염 및 원형질체 융합을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 전달될 수 있다. 본 개시에 따르면, 렌티바이러스 벡터는 본 개시의 재조합 바이러스를 형성하기 위한 아래 B 부분에 기술된 방법들을 이용하여 이종의(즉, 렌티바이러스가 아닌) 외피 내에 패키지화된다.

2. 외피 단백질

적절하게, 렌티바이러스 벡터가 패키지화되는 외피는 렌티바이러스 외피 단백질이 없으며 적어도 하나의 이종 외피 단백질의 결합 도메인을 포함한다. 일 구현예에 있어서, 상기 외피는 전적으로 랍도바이러스 당단백질로부터 유래하거나, 제 2의 바이러스의 외피 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드 내에 융합된 결합 도메인을 포함하는 랍도바이러스 외피(랍도바이러스 폴리펩티드 또는 펩티드)의 단편을 포함할 수 있다. 또한, 상기 외피는 도 4에 도시되고 아래에 기술한 CD34+ 세포 형질도입 결정자로부터 유래하는 서열을 포함하는 바이러스 외피 단백질을 포함할 수도 있다. 다른 구현예에 있어서, 상기 외피는 전적으로 아레나바이러스 당단백질 또는 그 단편으로부터 유래할 수 있다.

a) 랍도바이러스 외피 단백질

외피 단백질 또는 그 폴리펩티드 또는 펩티드(예컨대, 결합 도메인)를 암호화는 서열을 제공하는 랍도바이러스는 베지큘로바이러스 아군, 예컨대 VSV-G(Indiana), Morreton, Maraba, Cocal, Alagoa, Carajas, VSV-G(Arizona), Isfahan, VSV-G(New Jersey) 또는 Piry의 임의의 적절한 혈청형으로부터 유래할 수 있다. 외피 단백질을 암호화하는 서열은 바이러스원에 대한 유전공학 기법의 적용, 화학합성 및 기법, 재조합 생산 또는 이들의 조합을 포함하하는 임의의 적절한 방법에 의해 얻을 수 있다. 적절한 바이러스 서열의 출처가 당해 기술분야에서 잘 알려져 있으며, 여기에는 다양한 교육기관, 비영리기관 및 상업적 입수처와 전자 데이터베이스가 포함된다. 본 개시는 서열을 얻는 방법에 의해 제한되지 않는다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 이종의 외피 서열은 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 매개할 수 있는 모든 외피 단백질에서 발견되지만 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 매개하지 못하는 외피 단백질에서는 발견되지 않는, 31 개 아미노산으로 구성된 인간 CD34+ 세포 형질도입 결정자로부터 유래한다.

따라서, 일 구현예에 있어서, 상기 외피 단백질은 변형되지 않은 랍도바이러스 당단백질이다. 또한, 최소한, 31 개 아미노산으로 구성된 인간 CD34+ 세포 형질도입 결정자 내에 위치하는, 랍도바이러스 외피 당단백질의 결합 도메인을 포함하는 선택된 랍도바이러스의 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 적절하게, 이러한 랍도바이러스 단백질 단편은 링커에 의해 제 2의 비렌티바이러스 외피 단백질 또는 그 단편에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다. 이러한 융합 단백질은 얻어지는 외피 단백질의 패키지화, 수율 및/또는 정제를 개선하는 데 있어 바람직할 수 있다. 상기 제 2의 비렌티바이러스 외피 단백질 또는 그 단편은 최소한 막 도메인을 포함한다. 바람직한 일 구현예에 있어서, 31 개 아미노산으로 구성된 상기 인간 CD34+ 세포 형질도입 결정자의 잘린 단편이 VSV-G 외피 단백질에 융합된다. 당업자는 본 개시에 따른 또 다른 융합(키메릭) 단백질을 생성할 수 있다.

b) 아레나바이러스 외피 단백질

다른 구현예에 있어서, 상기 외피 단백질은 변형되지 않은 아레나바이러스 외피 단백질 또는 선택된 아레나바이러스 외피 단백질의 단편이며, 최소한 아레나바이러스 외피 당단백질의 결합 도메인을 포함한다. 적절하게, 이러한 아레나바이러스 단백질 단편은 링커에 의해 제 2의 비렌티바이러스 외피 단백질 또는 그 단편에 직접적으로 또는 간접적으로 융합된다. 이러한 융합 단백질은 얻어지는 외피 단백질의 패키지화, 수율 및/또는 정제를 개선하는 데 있어 바람직할 수 있다. 상기 제 2의 비렌티바이러스 외피 단백질 또는 그 단편은 최소한 막 도메인을 포함한다.

아레나바이러스 외피 당단백질(GP)에 대한 중화항체 면역은 미미한데, 이것은 감염 결과 재감염에 대한 항체 매개 보호작용이 미미하다는 의미이다. 이러한 특성으로 인해 아레나바이러스 외피 단백질을 포함하는 벡터를 이용한 반복 면역화가 가능하다. 전체 인구 중 아레나바이러스에 대해 면역을 가지는 비율은 낮거나 무시할 수 있는 수준이다. 또한, 아레나바이러스는 일반적으로 세포독성이 없으며(세포를 파괴하지 않음), 조건에 따라 동물 내에서 질환을 유발하지 않은 채 장기간 항체 발현을 유지할 수 있다.

아레나바이러스 외피 단백질은 Lassa 바이러스. Luna 바이러스, Lujo 바이러스, 림프구성 맥락수막염 바이러스(LCMV), Mobala 바이러스, Mopeia 바이러스, Ippy 바이러스, Amapari 바이러스, Flexal 바이러스, Guanarito 바이러스, Junin 바이러스, Latino 바이러스, Machupo 바이러스, Oliveros 바이러스, Parana 바이러스, Pichinde 바이러스, Pirital 바이러스, Sabia 바이러스, Tacaribe 바이러스, Tamiami 바이러스, Bear Canyon 바이러스, Whitewater Arroyo 바이러스, Merino Walk 바이러스, Menekre 바이러스, Morogoro 바이러스, Gbagroube 바이러스, Kodoko 바이러스, Lemniscomys 바이러스, Mus minutoides 바이러스, Lunk 바이러스, Giaro 바이러스, Wenzhou 바이러스, Patawa 바이러스, Pampa 바이러스, Tonto Creek 바이러스, Allpahuayo 바이러스, Catarina 바이러스, Skinner Tank 바이러스, Real de Catorce 바이러스, Big Brushy Tank 바이러스, Catarina 바이러스 및 Ocozocoautla de Espinosa 바이러스로부터 유래할 수 있다.

c) 키메릭 외피 당단백질

다른 구현예에 있어서, 유용한 외피는 제 2의 외피 당단백질의 단편 또는 랍도바이러스 또는 아레나바이러스 캡시드 단백질의 인접하지 않은 단편과 융합된 랍도바이러스 또는 아레나바이러스 외피 당단백질의 결합 도메인을 포함하는 키메릭 당단백질일 수 있다. 예를 들어, 선택된 랍도바이러스 또는 아레나바이러스 결합 도메인은 동일한 또는 다른 선택된 랍도바이러스 또는 아레나바이러스 주의 막관통 도메인에 융합될 수 있다. 다른 구현예에 있어서, 상기 제 2의 단백질 또는 단편은 다른 비렌티바이러스 출처로부터 유래할 수 있다. 예컨대, 한 가지 적절한 외피 단백질은 수포성 구내염 바이러스(VSV) 당단백질(G)로부터 유래하는 막 도메인을 포함할 수 있다. 또한, 다른 적절한 단편은 원하는 수준의 패키징을 제공하는 다른 적절한 바이러스원으로부터 선택될 수 있다. 상기 외피가 융합 단백질인 경우, 랍도바이러스 또는 아레나바이러스 외피 단백질(또는 그 단편)을 암호화하는 서열과 제 2의 외피 단백질(또는 그 단편)을 암호화하는 서열 사이에 링커가 삽입될 수 있다. 이러한 링커는 발현시 융합 단백질인 외피가 생산되도록 하기 위하여 바람직할 수 있다. 따라서, 상기 링커는 두 서열이 적절하게 번역되도록 하는 스페이서일 수 있다. 이러한 링커는 핵산(바람직하게는 비암호화 서열)일 수 있거나 화합물 또는 다른 적절한 모이어티일 수 있다. 그러한 융합 단백질을 설계하기 위한 적절한 기술들이 당업자에게 잘 알려져 있다. 일반적으로 Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor. New York를 참고하라.

3. CD34+ 세포 결합용 리간드

렌티바이러스 생산 세포 내에서 CD32+ 세포에 결합하기 위한 리간드가 발현되면 조혈모세포의 형질도입 효율이 개선된 렌티바이러스가 생산된다. CD34+ 조혈모세포는 형질도입을 위한 렌티바이러스의 세포 표면 결합을 촉진하는, 세포 표면의 리간드에 결합된다. 상기 리간드는 단백질, 당단백질, 당 또는 지질일 수 있다. CD34+ 세포 리간드의 구체적인 예는 L-셀렉틴이다. 셀렉틴은 특수한 탄수화물 결정자에 결합하는 렉틴으로서, α(2,3)-연결된 시알산 치환(들)과 α(1,3)-연결된 푸코신 변형(들)을 포함하는 시알로푸코실화로 구성되며, 전형적으로는 4당류인 시알릴 Lewis X(sLe.sup.x; Neu5Ac.alpha.2-3Gal.beta.1-4[Fuc.alpha.1-3]GlcNAc.beta.1-))의 형태이다(1, 6). L-셀렉틴은 순환 중인 백혈구에서 발현되며, 렌티바이러스 생산 세포 내에서 L-셀렉틴이 발현되면 CD34+ 조혈모세포의 렌티바이러스 형질도입 효율이 개선되는 것으로 확인되었다.

IV. 재조합 트랜스퍼 바이러스의 생산

본 개시는 또한 선택된 분자를 숙주세포로 전달하는 데 유용한 재조합 바이러스의 생산방법에 관한 것이다. 재조합 트랜스퍼 바이러스를 생산하기 위하여, 렌티바이러스는 바이러스 컨스트럭트, gag, pol, 외피 단백질 및 rev를 동일한 또는 다수의 벡터 내로 전달한다.

재조합 트랜스퍼 바이러스는 생체 내 및 생체 외 모두에서 전이유전자를 분열하지 않는 세포 내로 효과적으로 전달, 통합 및 장기간 발현할 수 있는 레트로바이러스 또는 렌티바이러스이다. 당해 기술분야에서 다양한 렌티바이러스 벡터가 알려져 있다. Naldini et al., (1996a, 1996b, and 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, 미국특허 제 6,013,516 호 및 제 5,994,136 호를 참조하라. 이들 중 어느 것이든지 본 개시의 트랜스퍼 벡터의 생산에 적용될 수 있다. 일반적으로, 이들 벡터는 플라스미드 또는 바이러스에 기반하며, 치료용 폴리펩티드를 숙주세포 내로 암호화하는 핵산의 전달을 위한 필수적인 서열을 운반하도록 구성된다.

A. 재조합 렌티바이러스의 생산방법

재조합 렌티바이러스는 복제능력이 없으므로, 이 바이러스는 단일 세포 내에 필요한 성분들이 갖추어진 "생산자 세포주" 내에서 생산된다. 본 명세서에서, 용어 "생산자 세포주"는 패키지화 세포주와 패키지화 신호를 포함하는 트랜스퍼 벡터 컨스트럭트를 포함하는, 재조합 레트로바이러스 입자를 생산할 수 있는 세포주를 의미한다. 감염성 바이러스 입자와 바이러스 원액의 생산은 종래의 기법을 이용하여 수행될 수 있다. 바이러스 원액을 제조하는 방법은 당해 기술분야에 알려져 있으며, 예컨대 Y. Soneoka et al. (1995) Nucl. Acids Res. 23:628-633과 N. R. Landau et al. (1992) J. Virol. 66:5110-5113에 기술되어 있다. 감염성 바이러스 입자는 종래의 기법을 이용하여 패키지화 세포로부터 수득할 수 있다. 예컨대, 당해 기술분야에서 알려진 바와 같이 세포 용해 또는 세포 배양액의 상등액 수거를 통해 감염성 입자를 수득할 수 있다. 선택적으로, 필요한 경우 수득된 바이러스 입자를 정제할 수 있다. 적절한 정제기법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

생산자 세포주의 생성에는 3 또는 4개의 개별적인 플라스미드 시스템이 이용된다. 4 플라스미드 시스템은 3 종의 보조 플라스미드와 하나의 트랜스퍼 벡터 플라스미드를 포함한다. 예를 들어, Gag-Pol 발현 카세트는 구조 단백질과 효소를 암호화한다. 또 다른 카세트는 벡터 게놈의 핵 외 반출에 필요한 부속 단백질인 Rev를 암호화한다. 세 번째 카세트는 베지큘로바이러스 또는 아레나바이러스 외피 단백질과 같은, 렌티바이러스 입자가 표적세포 내로 진입하도록 해 주는 이종의 외피 단백질을 암호화한다. 트랜스퍼 벡터 카세트는 입자 내로의 통합을 위한 신호와 전이유전자 발현을 지시하는 내부 프로모터를 운반하는 벡터 게놈 자체를 암호화한다. 트랜스퍼 벡터는 이종의 전이유전자를 운반하며, 표적세포, 예컨대 CD34+ 세포에 의해 전달되는 유일한 유전물질이다. 3 플라스미드 시스템은 gag-pol과 외피 기능을 암호화하는 2 종의 보조 플라스미드와 트랜스퍼 벡터 카세트를 포함한다. Merten et al., Mol. Ther. Methods Clin. Dev. 3: 16017, 2016을 참조하라.

상기 다성분 발현 카세트는 생산자 세포 내에서 일시적으로 또는 안정적으로 트랜스펙션된다. 일 구현예에 있어서, 필요한 성분을 갖춘 생산자 세포주는 연속적으로 그리고 구조적으로 생산된다. 생산자 세포는 HEK293 세포, HEK293T 세포, 2 93FT, 293SF-3F6, SODk1 세포, CV-1 세포, COS-1 세포, HtTA-1 세포, STAR 세포, RD-MolPack 세포, Win-Pac, CHO 세포, BHK 세포, MDCK 세포, C3H 10T1/2 세포, FLY 세포, Psi-2 세포, BOSC 23 세포, PA317 세포, WEHI 세포, COS 세포, BSC 1 세포, BSC 40 세포, BMT 10 세포, VERO 세포, W138 세포, MRCS 세포, A549 세포, HT1080 세포, B-50 세포, 3T3 세포, NIH3T3 세포, HepG2 세포, Saos-2 세포, Huh7 세포, HeLa 세포, W163 세포, 211 세포 및 211A 세포일 수 있다. 이들은 상업적으로 입수 가능한 렌티바이러스 패키지화 시스템, 예컨대 LentiSuite 키트(Systems Biosciences, Palo Alto, CA), Lenti-X 패키지화 시스템(Takara Bio, Mountain View, CA), ViraSafe 패키지화 시스템(Cell Biolabs, Inc. San Diego, CA), ViroPower 렌티바이러스 패키지화 믹스(Invitrogen) 및 Mission 렌티바이러스 패키지화 믹스(Millapore Sigma, Burlington, MA)로부터 구할 수 있다.

다른 구현예에 있어서, 생산자 세포주는 패키지화 기능을 발현하기 위한 유도성 발현 카세트를 포함한다. 예를 들어, TET-Off 시스템과 TET-On 시스템을 포함하는 생산자 세포를 생성하기 위하여 테트라사이클린 유도성 발현 시스템이 사용된다. 또한, 엑디손 유도성 시스템도 사용된다.

렌티바이러스는 Petri 접시와 T 플라스크, 멀티트레이 시스템(Cell Factories, Cell Stacks) 또는 HYPERFlask를 사용하여 성장시킨 표면 부착성 세포를 사용하여 생산한다. 최적의 컨플루언스(< 50%)에서, 전통적인 Ca 포스페이트 프로토콜 또는 보다 최근에 개발된 폴리에틸렌이민(PEI) 방법을 이용하여 세포를 트랜스펙션한다. 그 밖의 효과적인 양이온성 트랜스펙션제로는 리포펙타민(Thermo-Fisher), 퓨진(Promega) LV-MAX(Thermo-Fisher), TransIT(Mirus) 또는 293fectin(Thermo-Fisher)이 포함된다.

또한, 진탕 플라스크, 유리 생물반응기, 스테인리스강 생물반응기, 웨이브백 및 일회용 교반탱크를 사용하여 부유배양을 통해 렌티바이러스를 생산할 수도 있다. 부유배양액은 Ca 포스페이트 또는 양이온성 폴리머와 선형 폴리에틸렌이민을 사용하여 트랜스펙션한다. 또한, 전기천공에 의해 세포를 트랜스펙션할 수도 있다.

렌티바이러스의 정제는 여과/정화, 접촉 유동여과(TFF) 또는 막 기반 크로마토그래피를 이용한 농축/투석여과, 및/또는 이온교환 크로마토그래피(IEX), 친화성 크로마토그래피 및 크기배제 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 과정과 같은 막공정 단계를을 이용하여 수행된다. 이들 과정의 임의의 조합을 통해 렌티바이러스를 정제할 수 있다. 오염원으로 작용하는 DNA를 분해하기 위한 벤조나아제/DNase 처리를 벡터 생산 과정 도중에 또는 구 후에 수행할 수 있다.

정제는 다음의 3 단계로 수행된다. (i) 포획은 정제의 첫 단계로서 표적분자를 세포 배양액 원액 또는 그 정화액으로부터 포획하여 주요 오염원을 제거한다. (ii) 중간 정제단계는 포획 단계와 최종 정제단계 사이에서 정화된 공급액에 대해 수행하며, 그 결과 특정 불순물들(단백질, DNA 및 내독소)이 제거된다. (iii) 최종 정제는 마지막 단계로서 미량의 오염물질과 불순물을 제거하고 제형화 또는 패키지화에 적절한 형태의 활성과 안전성을 갖는 산물을 얻는 것을 목표로 한다. 오염물질들은 흔히 표적분자, 미량의 다른 불순물 또는 유출 산물을 동반한다. 중간 정제단계와 최종 정제단계(들)에서는 임의의 형태의 크로마토그래피 및 한외여과 과정이 사용된다.

렌티바이러스의 정제를 위한 표준 과정을 예로 들면 다음과 같다. i) 전면 여과(0.45 ㎛) 또는 원심분리를 수행하여 세포 및 잔해물을 제거한다. ii) Mustang Q 또는 DEAE Sepharose를 이용한 이온교환 크로마토그래피 또는 친화성 크로마토그래피(헤파린)를 이용한 포획 크로마토그래피를 수행한다. iii) 크기배제 크로마토그래피에 의한 최종 정제를 수행한다. iv) 접촉 유동여과 또는 초원심분리에 의한 농축 및 버퍼 교환을 수행한다. v) 벤조나아제를 이용한 DNA 환원을 수행한다. vi) 0.2 ㎛ 필터를 이용한 살균을 수행한다. Merten et al., Mol. Ther Methods Clin Dev. 3: 16017, 2016을 참조하라.

B. 표적세포의 형질도입을 개선하는 방법

형질도입이 개시되면, 바이러스 외피와 세포 표면의 특정 수용체들 사이의 특이적인 상호작용에 의해 바이러스 입자가 표적세포에 결합하게 된다. 그러나, 최근의 몇몇 연구에 의하면 바이러스가 결합하는 초기 단계는 특이적인 외피-수용체 상호작용을 수반하지 않고, 수용체와는 독립적으로 결합이 진행된다는 것이 밝혀졌다(Puizzato M, Marlow SA, Blair ED, Takeuchi Y. Initial binding of murine leukemia virus particles to cells does not require specific Env-receptor interaction. J. Virol. 1999;73(10):8599-8611; Sharma S, Miyanohara A, Friedmann T. Separable mechanisms of attachment and cell uptake during retrovirus infection. J. Virol. 2000;74(22):10790-10795). 이러한 초기 단계 작용의 효율과 그에 따른 렌티바이러스 형질도입의 효율은, 음전하의 세포와 이에 접근하는 외피로 둘러싸인 바이러스 사이의 강력한 정전기적 척력으로 인해 감소하게 된다(Jensen TW, Chen Y, Miller WM. Small increases in pH enhance retroviral vector transduction efficiency of NIH-3T3 cells.　Biotechnol.Prog.　2003;19(1):216-223; Swaney WP, Sorgi FL, Bahnson AB, Barranger JA. The effect of cationic liposome pretreatment and centrifugation on retrovirus-mediated gene transfer. Gene Ther. 1997;4(12):1379-1386). 이러한 문제를 해결하기 위하여 고안된 방법들로서, 바이러스와 결합한 표적세포를 낮은 속도에서 원심분리하는 방법, 고정된 단백질 상에서 세포와 바이러스를 함께 로컬라이제이션하는 방법, 그리고 형질도입을 여러 차례 수행하는 방법이 있다(Swaney et al. supra; O'Doherty U, Swiggard WJ, Malim MH. Human immunodeficiency virus type 1 spinoculation enhances infection through virus binding. J. Virol. 2000;74(21):10074-10080). 중요한 점은, 폴리브렌, DEAE-덱스트란, 프로타민 설페이트, 폴리-L-라이신 또는 양이온성 리포좀과 같이 양전하를 갖는 폴리양이온을 가하면 세포와 바이러스 사이의 척력이 감소하여 레트로바이러스 입자가 세포 표면에 결합하게 되므로 형질도입의 효율이 높아진다는 것이다(Skwaney et al. supra; Toyoshima K, Vogt PK. Enhancement and inhibition of avian sarcoma viruses by polycations and polyanions. Virology. 1969;38(3):414-426; Le Doux JM, Landazuri N, Yarmush ML, Morgan JR. Complexation of retrovirus with cationic and anionic polymers increases the efficiency of gene transfer. Hum. Gene Ther. 2001;12(13):1611-1621; Hodgson CP, Solaiman F. Virosomes: cationic liposomes enhance retroviral transduction. Nat. Biotechnol. 1996;14(3):339-342; Cornetta K, Anderson WF. Enhanced in vitro and in vivo gene delivery using cationic agent complexed retrovirus vectors. Gene Ther. 1998;5(9):1180-1186; Seitz B, Baktanian E, Gordon EM, Anderson WF, LaBree L, McDonnell PJ.).

C. 약학적 조성물과 제형

본 개시는 조혈모세포, 보다 구체적으로 CD34+ 세포와 같이 본 명세서에서 기재된 방법에 따라 생산된 렌티바이러스가 형질도입된 세포와 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학적 조성물과 제형을 제공한다. 본 명세서에서, "약학적으로 허용 가능한 담체"는 약학적으로 허용 가능한 세포배양 배지를 포함하는, 생리적으로 적합한 임의의 그리고 모든 용매, 분산매, 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제 등을 포함한다.

일 구현예에 있어서, 담체를 포함하는 조성물은 비경구 투여, 예컨대 혈관 내(정맥 내 또는 동맥 내), 복막 내 또는 근육 내 투여에 적합하다. 약학적으로 허용 가능한 담체는 멸균 수용액 또는 분산액과, 주사 가능한 멸균 용액 및 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 약학적 활성물질을 위한 이러한 매질 또는 제제의 사용은 당해 기술분야에 잘 알려져 있다. 종래의 매질 또는 제제가 형질도입된 세포와 양립할 수 없는 경우를 제외하고, 본 개시의 약학적 조성물에서는 이들의 사용을 고려한다.

본 개시의 조성물은 단독으로 또는 예컨대 사이토카인, 성장인자, 호르몬, 소분자 또는 다양한 약학적 활성제제와 같은 다른 제제와 함께 투여된다. 첨가되는 제제가 원하는 유전자 치료를 전달하는 조성물의 능력에 부정적인 영향을 미치지 않는 한, 조성물 내에 포함될 수 있는 다른 성분에 관해서는 사실상 거의 제한이 없다.

본 개시의 약학적 조성물에 있어서, 약학적으로 허용 가능한 부형제 및 담체 용액의 제형은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 적절한 용량과 본 명세서에 기재된 특정 조성물을 이용한 경구용, 비경구용, 정맥 내, 비내 및 근육 내 투여를 포함한 다양한 치료방법도 당업자에게 잘 알려져 있다.

경우에 따라, 본 개시에 개시된 조성물을 비경구적으로, 정맥 내로, 근육 내로, 또는 심지어 미국특허 제 5,543,158 호, 미국특허 제 5,641,515 호 및 미국특허 제 5,399,363 호(이들 각각은 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다)에 기재된 바와 같이 복막 내로 전달되는 것이 바람직할 수 있다. 자유 염기 또는 약리학적으로 허용 가능한 염 상태인 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필 셀룰로오스와 같은 계면활성제와 적절히 혼합된 물 내에서 제조될 수 있다. 분산액 역시 글리세롤, 액상의 폴리에틸렌 글리콜 및 이들의 혼합물과 오일 내에서 제조될 수 있다. 일반적인 저장 및 사용 조건 하에서, 이러한 제조물은 미생물의 성장을 억제하기 위한 보존제를 포함한다.

주사용으로 적합한 약학적 형태에는 멸균 수용액 또는 분산액과, 주사 가능한 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다(구체적으로, 미국특허 제 5,466,468 호 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다). 모든 경우에 있어서, 상기 형태는 멸균 상태여야 하며 주사가 용이할 정도로 유체 상태여야 한다. 상기 형태는 제조 및 저장 조건에서 안정적이어야 하며 박테리아 또는 곰팡이와 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 상기 담체는 예컨대 물, 에탄올, 폴리올(예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적절한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 포함하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 예컨대 레시틴과 같은 코팅을 이용하여, 분산액의 경우에는 계면활성제를 사용하여 필요한 입자 크기를 유지함으로써 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 미생물의 작용은 다양한 항균제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등을 사용하여 효과적으로 예방할 수 있다. 많은 경우에 있어서, 예컨대 당 또는 염화나트륨과 같은 등장화제를 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 주사 가능한 조성물의 경우 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴과 같은 흡수 지연제를 사용하여 흡수를 지연시킬 수 있다.

비경구 투여를 위한 수용액의 경우, 예를 들어, 필요하다면 적절하게 완충해야 하며 충분한 양의 식염수 또는 포도당으로 용액을 등장화해야 한다. 이러한 수용액은 특히 정맥 내, 근육 내, 피하 및 복막 내 투여에 적합하다. 이와 관련하여, 당업자는 본 개시에 비추어 사용 가능한 멸균된 수성 매질을 선택할 수 있을 것이다. 예를 들어, 1 ㎖의 등장성 NaCl 용액 내에 1 회 용량을 용해한 후 1000 ㎖의 피하 주사액에 가하거나 해당 주입 부위에 주사할 수 있다(예컨대 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, Md.: Lippincott Williams & Wilkins, 2000을 참조). 치료 대상에 따라 용량을 변화시키는 것이 필요한 경우도 있을 것이다. 투여에 책임이 있는 자는 어떤 경우에도 각 대상에 대하여 적절한 용량을 결정할 수 있을 것이다. 또한, 인체에 투여하는 경우, 제조물은 FDA가 요구하는 멸균성, 발열원성과 일반적인 안전성 및 정제도 기준을 만족시켜야 한다.

멸균 주사용액은 필요로 하는 다양한 상기 다른 성분과 함께 적절한 용매 중의 필요한 양의 활성 화합물을 도입하여 제조된 후, 여과 멸균한다. 통상적으로, 분산액은 다양한 멸균 활성 성분을 염기성 분산매와 위에 언급한 다른 필요한 성분들을 포함하는 멸균 용기에 도입하여 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 멸균 여과 용액으로부터 활성 성분의 분말과 추가로 요구되는 임의의 성분을 얻는 진공건조 및 냉동건조 기법이다.

본 명세서에 기재된 조성물은 중성 또는 염의 형태로 제형화 될 수 있다. 약학적으로 허용되는 염은 산 첨가 염(단백질의 유리 아미노기로 형성된)을 포함하고 이는 예를 들어, 염화수소산, 인산과 같은 무기산 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성된다. 유리 카르복실기와 함께 형성된 염은 또한, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 철수산화물과 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로캐인 등과 같은 유기 염기로부터 유래할 수 있다. 제형화시, 용액은 용량 제형과 일치하는 방식으로, 그리고 치료에 효과적인 양으로 투여될 수 있다. 상기 제형은 주사 용액, 약제 방출 캡슐 등과 같은 다양한 용량 형태로 용이하게 투여된다.

본 명세서에서 "담체"는 임의의 및 모든 용매, 분산매, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충액, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 시약이 활성 성분과 조화되지 못하는 경우를 제외하고, 치료용 조성물 내에서 이들의 사용이 고려된다. 추가적인 활성 성분 역시 조성물에 포함될 수 있다.

표현 "약학적으로 허용되는"은 인체에 투여되었을 때 알레르기 반응 또는 유사한 부적당한 반응을 일으키지 않는 분자 물질 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분으로서 단백질을 포함하는 수용성 조성물의 제조는 당업계에 잘 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사 가능한 형태의 액체 용액 또는 현탁액으로 제조된다. 또한, 주사 전에 액체에 가하여 용액 현탁액을 제조할 수 있는 고체 형태로도 제조될 수 있다. 이러한 제조물은 유화될 수도 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 조성물은 비강 내 스프레이, 흡입 및/또는 그 밖의 에어로졸 전달용 기구에 의해 전달될 수 있다. 유전자, 폴리펩티드 및 펩티드 조성물을 직접 폐로 또는 비강 에어로졸 스프레이에 의해 전달하는 방법이 예컨대 미국특허 제 5,756,353 호와 미국특허 제 5,804,212 호(이들은 각각 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다)에 기재되어 있다. 마찬가지로, 비강 내 미립자 수지(Takenaga et al., 1998) 및 라이소포스파티딜-글리세롤 화합물(미국특허 제 5,725,871 호, 전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다)을 사용한 약물의 전달도 또한 약학 분야에 잘 알려져 있다. 또한, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스 형태의 경점막 약물 송달이 미국특허 제 5,780,045 호(전체가 참조로서 본 명세서에 포함된다)에 기재되어 있다.

일부 구현예에 있어서, 상기 전달은 본 개시의 조성물을 적절한 숙주세포 내로 도입하기 위하여 리포좀, 나노캡슐, 마이크로입자, 미립구, 지질 입자, 소낭, 선택적 CPP 폴리펩타이드와의 혼합 등을 사용하여 수행될 수 있다. 특히, 본 개시의 조성물은 전달을 위해서 지질 입자, 리포좀, 소낭, 나노구체, 나노입자 등에 캡슐화하여 제형화될 수 있다. 이러한 전달 비히클의 제형화 및 사용은 공지되어 있는 통상의 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 본 개시의 제형 및 조성물은 단독으로 또는 하나 이상의 다른 치료 양식과 함께 세포 또는 동물에게 투여하기 위하여 약학적으로 허용되거나 생리학적으로 허용되는 용액(예컨대, 배양 배지) 중에서 제형화된, 본 명세서에 기재된 임의의 수의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 소분자의 조합으로 이루어지는 하나 이상의 억제제 및/또는 활성화제를 포함할 수 있다. 또한, 필요한 경우에, 본 개시의 조성물은 예를 들어, 세포, 다른 단백질 또는 폴리펩티드 또는 다양한 약학적 활성 제제와 같은 다른 제제와 함께 투여될 수 있는 것으로 이해될 수 있다.

특정한 일 구현예에 있어서, 본 개시에 따른 제형 또는 조성물은 본 명세서에 기재된 임의의 수의 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드 및 소분자의 조합과 접촉하는 세포를 포함한다.

일부 측면에 있어서, 본 개시는 레트로바이러스(예를 들어, 렌티바이러스) 벡터를 포함하는(단, 이들로 제한되지는 않는다) 바이러스 벡터 시스템의 전달(즉, 바이러스 매개 형질도입)에 적합한 제형 또는 조성물을 제공한다.

탈체(ex vivo) 전달을 위한 예시적인 제형은 또한 칼슘 포스페이트, 전기천공, 열 쇼크 및 다양한 리포좀 제형(지질 매개 트랜스펙션제)과 같은 본 기술분야에서 공지된 다양한 트랜스펙션제의 사용을 포함할 수 있다. 이하에 더 상세하게 기재한 바와 같이, 리포좀은 수성 유체를 일부 포획하는 지질 이중층이다. DNA는 자발적으로 양이온성 리포좀의 외부 표면에 회합하고(그 전하에 의해), 이들 리포좀은 세포막과 상호작용할 것이다.

일부 측면에 있어서, 본 개시는 하나 이상의 약학적으로 허용 가능한 담체(첨가제) 및/또는 희석제(예를 들어, 약학적으로 허용 가능한 세포배양 배지)와 함께 제형화된, 치료학적 유효량의 본 명세서에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 약학적으로 허용 가능한 조성물을 제공한다.

본 개시의 특정한 구현예들은 약학 기술분야에 잘 알려져 있으며, 예를 들어 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition. Baltimore, MD: Lippincott Williams & Wilkins, 2000에 기재된 것과 같은 다른 제형들을 포함할 수 있다.

D. 치료 방법

재조합 렌티바이러스는 개선된 유전자 치료의 방법을 제공한다. 본 명세서에서, 용어 "유전자 치료"는 폴리뉴클레오티드를 유전자 및/또는 유전자의 발현을 변형하는 세포의 게놈 내로 도입하는 것을 의미한다. 다양한 구현예에 있어서, 본 개시의 바이러스 벡터는 단일 유전자 질환, 장애 또는 증상 또는 조혈모세포 시스템의 질환, 장애 또는 증상으로 진단되거나, 이들을 가지는 것으로 의심되는 대상에게 치유적, 예방적 또는 개선적 이득을 제공하는 폴리펩티드를 암호화하는 치료용 전이유전자를 발현하는 조혈모세포 발현 조절서열을 포함한다. 또한, 본 개시의 벡터는 특정 세포, 예컨대 적아세포의 수 또는 계통을 증가 또는 확장하기 위하여, 세포 내에서 절단된 에리트로포이에틴 수용체를 발현하는 다른 발현 조절서열을 포함한다. 상기 바이러스는 생체 내, 탈체 또는 시험관 내에서 세포를 감염시키거나 형질도입할 수 있다. 탈체 및 시험관 내의 구현예에 있어서, 형질도입된 세포는 그 후에 치료가 필요한 대상에게 투여될 수 있다. 본 개시의 벡터 시스템, 바이러스 입자 및 형질도입된 세포를 대상에서 단일 유전자 질환, 장애 또는 증상 또는 조혈모세포 시스템의 질환, 장애 또는 증상, 예컨대 이상 혈색소를 치료, 예방 및/또는 개선시키기 위해서 사용될 수 있는 것으로 고려된다.

본 명세서에서, "조혈"은 전구세포로부터 혈구가 형성되고 발달하는 것과, 줄기세포로부터 전구세포가 형성되는 것을 의미한다. 혈구는 적혈구(RBC), 망상 적혈구, 단핵세포, 호중구, 거핵구, 호산구, 호염기구, B 세포, 대식세포, 과립구, 비만세포, 판혈소 및 백혈구를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

본 명세서에서, 용어 "이상 혈색소" 또는 "이상 혈색소 증상"은 혈액 내에 비정상적인 헤모글로빈 분자가 존재하는 임의의 장애를 포함한다. 이상 혈색소의 예로는 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상세포 질환(SCD), 겸상 적혈구성 빈혈 및 지중해 빈혈이 포함되나 이에 제한되지는 않는다. 또한, 혈액 내에 비정상적인 헤모글로빈의 존재가 함께 나타나는 이상 혈색소 증상(예컨대 겸상세포/Hb-C 질환)도 포함된다.

본 명세서에서, 용어 "겸상 적혈구성 빈혈" 또는 "겸상세포 질환"은 적혈구의 겸상화로 인한 임의의 빈혈 증상을 포함하는 것으로 정의된다. 겸상세포 질환의 징후는: 빈혈; 통증; 및/또는 신부전, 망막병증, 급성 흉부 증후군, 허혈, 음경 지속 발기 및 뇌졸중과 같은 장기 부전을 포함한다. 본 명세서에서, 용어 "겸상세포 질환"은 특히 HbS의 겸상세포 치환에 대하여 동형 접합체인 대상들에서 발생하는, 겸상 적혈구성 빈혈에 수반하는 다양한 임상적 문제를 의미한다. 본 명세서에서, 용어 겸상세포 질환과 관련하여 언급한 건강상의 징후에는 성장 및 발달 지연, 특히 폐렴구균에 의한, 심각한 감염 발생빈도의 증가, 비장 기능의 현저한 손상, 체내 박테리아의 효과적인 제거 억제, 경색의 재발, 비장 조직의 파괴가 포함된다. 또한, 용어 "겸상세포 질환"에는 주로 요추, 복부 및 대퇴골 간부에 영향을 미치며 메커니즘과 심각성 측면에서 벤즈와 유사한 급성 근골격계 통증이 포함된다. 성인의 경우, 이러한 질환은 흔히 수주 또는 수개월의 간격으로 짧은 기간 동안 지속되는 경증 또는 중증도의 증상으로 나타나며, 평균적으로 1 년에 한 번 5~7 일 동안 지속되는 매우 고통스러운 증상이 나타난다. 이러한 위기상황을 촉발하는 요인으로 알려진 것들에는 산증, 저산소증 및 탈수가 포함되는데, 이들은 모두 HbS의 세포내 중합의 가능성을 높인다(J. H. Jandl, Blood: Textbook of Hematology, 2nd Ed., Little, Brown and Company, Boston, 1996, pages 544-545). 본 명세서에서, 용어 "지중해 빈혈"은 헤모글로빈의 합성에 영향을 미치는 돌연변이로 인해 발생하는 유전성 빈혈을 포함한다. 따라서, 이 용어는 중증 또는 β 지중해 빈혈, 중증성 지중해 빈혈, 경증성 지중해 빈혈, 헤모글로빈 H 질환과 같은 α 지중해 빈혈 등의 모든 지중해 빈혈 증상으로부터 발생하는 빈혈 증상을 포함한다.

본 명세서에서, "지중해 빈혈"은 헤모글로빈의 생산 결함을 특징으로 하는 유전적 장애를 의미한다. 지중해 빈혈의 예로는 α 및 β 지중해 빈혈이 포함된다. β 지중해 빈혈은베타 글로빈 사슬의 돌연변이에 의해 발생하며, 중증성 또는 경증성의 형태로 발생할 수 있다. 중증성 β 지중해 빈혈의 경우, 태어날 때에는 정상이지만, 생후 첫 해부터 빈혈이 발생한다. 경증성 β 지중해 빈혈의 경우에는 작은 적혈구가 생산된다.

α 지중해 빈혈은 글로빈 사슬에서 하나 또는 그 이상의 유전자의 결실로 인해 발생한다. α 지중해 빈혈은 주로 HBA1 및 HBA2 유전자의 결실로 인해 발생한다. 이들 두 유전자는 모두 헤모글로빈의 성분(하위 단위체)인 α 글로빈을 암호화한다. 각 세포의 게놈에는 HBA1 유전자가 2 개, HBA2 유전자가 2 개 있다. 따라서, α 글로빈을 생산하는 대립유전자의 수는 4 개이다. 이들 대립유전자 중 일부 또는 전부가 결실되면 여러 유형의 α 지중해 빈혈이 발생한다. 가장 중증인 형태의 α 지중해 빈혈인 Hb Bart 증후군은 4 개의 대립유전자가 모두 결실되었을 때 발생한다. HbH 질환은 4 개의α 글로빈 대립유전자 중 3 개가 결실되었을 때 발생한다. 이들 두 가지의 경우, α 글로빈의 부족으로 인해 세포로부터 정상적인 헤모글로빈이 생성되지 않는다. 대신, 세포는 헤모글로빈 Bart(Hb Bart) 또는 헤모글로빈 H(HbH)라고 하는 비정상적인 형태의 헤모글로빈을 생산한다. 이러한 비정상적인 헤모글로빈 분자들은 산소를 신체 조직에 효과적으로 운반하지 못한다. Hb Bart 또는 HbH가 정상적인 헤모글로빈을 대체함에 따라 α 지중해 빈혈과 관련된 빈혈증 및 다른 심각한 건강상 문제가 야기된다.

특정한 일 구현예에 있어서, 본 개시의 유전자 치료방법은 헤모글로빈 C 질환, 헤모글로빈 겸상세포 질환(SCD), 겸상 적혈구성 빈혈, 유전성 빈혈, 지중해 빈혈, β 지중해 빈혈, 중증성 지중해 빈혈, 경증성 지중해 빈혈, α 지중해 빈혈 및 헤모글로빈 H 질환으로 구성되는 군으로부터 선택되는 이상 혈색소를 치료, 예방 또는 개선하기 위하여 사용된다.

다양한 구현예에 있어서, 상기 렌티바이러스 벡터는 유전자 치료를 필요로 하는 대상의 세포, 조직 또는 기관에 생체 내로 직접 주입하여 투여된다. 다른 다양한 구현예에 있어서, 세포를 본 개시의 벡터로 시험관 내 또는 탈체에서 형질도입하고, 선택적으로 탈체에서 증식시킨다. 이어, 형질도입된 세포를 유전자 유전자 치료를 필요로 하는 대상에게 투여한다.

다양한 구현예에 있어서, 유전자 치료방법에는 조혈모세포의 사용이 바람직한데, 이는 이들이 생체 내에서 특별한 생물학적 위치에 투여하면 적절한 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖기 때문이다. 용어 "줄기세포"는 (1) 장기간 자가재생, 즉 원래의 세포의 적어도 하나의 동일한 복제품을 생성하는 능력, (2) 단일 세포 수준에서 다수의, 그리고 일부의 경우에는 단지 하나의, 특수화된 세포 유형으로 분화하는 능력 및 (3) 생체 내에서 조직의 기능 재생 능력을 가지는 미분화된 세포인 세포를 의마한다. 줄기세포는 발달 잠재력에 따라 전능성, 만능성, 다능성 및 단능성으로 분류된다. "자가재생"은 변화되지 않은 딸 세포를 생산하고, 특수화된 세포 유형(효능)을 생성하는 고유의 능력을 갖는 세포를 의미한다. 자가재생은 두 가지 방법으로 달성될 수 있다. 비대칭 세포분열은 부모 세포와 동일한 하나의 딸 세포와, 부모 세포와 상이하며 전구체 또는 분화된 세포인 하나의 딸 세포를 생산한다. 비대칭 세포분열은 세포의 수를 증가시키지 않는다. 대칭 세포분열은 두 개의 동일한 딸 세포를 생산한다. 세포의 "증식" 또는 "팽창"은 대칭적으로 분열하는 세포를 의미한다.

본 명세서에서, 용어 "만능성"은 신체 또는 소마(배아)의 모든 계통을 형성하는 세포의 능력을 의미한다. 예를 들어, 배아 줄기세포는 3 개의 배엽인 외배엽, 중배엽 및 내배엽 각각으로부터 세포를 형성할 수 있는 만능 줄기세포 유형이다. 본 명세서에서, 용어 "다능성"은 하나의 계통의 여러 세포 유형을 형성시키는 성체 줄기세포의 능력을 나타낸다. 예를 들어, 조혈모세포는 혈액 세포 계통의 모든 세포, 예를 들어, 림프계 세포 및 골수계 세포를 형성할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "전구체(progenitor)" 또는 "전구세포(progenitor cell)"는 자가재생하고, 더 성숙한 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 전구세포는 만능 줄기세포 및 다능 줄기세포에 비해 감소된 잠재성을 가진다. 다수의 전구세포가 단일한 계통을 따라서 분화하지만, 매우 광범한 증식능력을 가질 수도 있다.

조혈모세포(HSC)는 생명체의 일생에 걸쳐 성숙한 혈액 세포 전체를 생성할 수 있는 조혈 전구세포(HPC)를 낳는다. 용어 "조혈모세포" 또는 "HSC"는 골수계 세포(예를 들어, 단핵구 및 대식세포, 호중구, 호염기구, 호산구, 적혈구, 거핵구/혈소판, 수지상 세포), 림프계 세포(예를 들어, T 세포, B 세포, NK 세포) 및 당업계에 공지된 그 밖의 다른 세포(Fei, R., et al ., 미국특허 제 5,635,387 호; McGlave, et al ., 미국특허 제 5,460,964 호; Simmons, P., et al., 미국특허 제 5,677,136 호; Tsukamoto, et al., 미국특허 제 5,750,397 호; Schwartz, et al., 미국특허 제 5,759,793 호; DiGuisto, et al., 미국특허 제 5,681,599 호; Tsukamoto, et al., 미국특허 제 5,716,827 호를 참조)를 포함하는, 생명체의 모든 혈액 세포 유형을 생성하는 다능성 줄기세포를 의미한다. 치사량의 방사선이 조사된 동물 또는 사람에게 이식되는 경우, 조혈모세포 및 전구세포는 적혈구, 호중구-대식세포, 거핵구 및 림프계 조혈세포를 증가시킬 수 있다.

바람직한 구현예들에 있어서, 상기 형질도입된 세포는 골수, 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 분리된 조혈모세포 및/또는 전구세포이다. 특히 바람직한 구현예들에 있어서, 상기 형질도입된 세포는 골수, 제대혈 또는 말초 혈액으로부터 분리된 조혈모세포이다.

HSC는 특정한 표현형 또는 유전자형 마커에 의해 확인할 수 있다. 예를 들어, HSC는 작은 크기, 계통(lin) 마커의 부재, 로다민 123(rhodamineDULL, rholo라고도 함) 또는 Hoechst 33342와 같은 생체염료에 대한 낮은 염색도, 그리고 다수가 분화 클러스터에 속하는 다양한 항원 마커(예컨대 CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45, Ter119 및 줄기세포 인자에 대한 수용체인 C 키트)의 세포 표면상의 존재에 의해 확인될 수 있다. HSC는 대체로 계통 순응을 검출하기 위해 흔히 사용되는 마커들에 대하여 음성이며, 따라서 흔히 Lin(-) 세포로 지칭된다.

일 구현예에 있어서, 인간 HSC는 CD34+, CD59+, Thy1/CD90⁺ CD38^-, C 키트/CD117⁺, CD49f⁺ 및 Lin(-)를 특징으로 할 수 있다. 그러나, 일부 HSC는 CD34^-/CD38^-이므로 모든 줄기세포가 이들의 조합에 포함되는 것은 아니다. 또한, 일부 연구에 의하면 초기의 줄기세포는 세포 표면에 C 키트가 존재하지 않을 수 있다. 인간 HSC의 경우, CD133는 CD34+ 및 CD34- HSC들이 모두 CD133+임이 확인되었으므로 초기 마커를 표현할 수 있다. CD34+ 및 Lin(-) 세포들 역시 조혈 전구세포를 포함할 수 있음이 당업계에 알려져 있다.

상기한 조성물과 방법, 용도는 설명의 목적이며 제한적인 것은 아니다. 당업자는 본 명세서에 개시된 내용을 바탕으로 상기 조성물, 방법 및 용도를 용이하게 변경할 수 있을 것이다.

실시예

하기 실시예들은 설명의 목적으로 제공되나, 본 발명을 제한하지 않는다.

실시예 1

인간 CD34+ 세포의 보다 효율적인 형질도입을 가능하게 하는 외피 단백질의 확인 및 인간 L-셀렉틴 및/또는 아레나바이러스 외피 단백질의 발현에 의한 인간 CD34+ 세포의 개선된 형질도입 방법.

방법

발현 벡터의 구축. pHCMV VSV-G Indiana 외피 발현 벡터는 Stanford 바이러스 코어로부터 얻었고 인간 CMV(HCMV) 프로모터의 조절 하에 VSV-G Indiana 외피 단백질을 포함한다(도 18; 서열번호 44). 5' 비번역 영역의 일부, VSV-G Indiana 외피 단백질에 대한 암호화 서열 및 3' 비번역 영역의 일부를 포함하는 pHCMV VSV-G Indiana 내 Apa I/Msc I 제한효소 단편을 합성된 다른 외피 단백질(DNA 2.0, Inc.)에 대한 암호화 영역으로 교체하고, 동일한 5' 및 3' 비번역 영역을 측면에 배치하여 외피 암호화 영역만이 변경되도록 하였다. 이러한 플라스미드의 예로는 pHCMV Bas Congo 외피, pHCMV Chandipura 외피, pHCMV Curionopolis 외피, pHCMV Ekpoma-1 외피, pHCMV Ekpoma-2 외피, pHCMV Isfahan 외피, pHCMV Kamese 외피, pHCMV Kontonkan 외피, pHCMV Kwatta 외피, pHCMV Le Dantec 외피, pHCMV rabies 외피, pHCMV VSV Alagoas 외피, pHCMV VSV Arizona 외피, pHCMV VSV Carajas 외피, pHCMV VSV Maraba 외피, pHCMV VSV Morreton 외피, pHCMV VSV New Jersey 외피 및 pHCMV Machupo 외피가 포함된다.

CMV 프로모터의 조절 하에 인간 L-셀렉틴(유전자 기호 : SELL) 암호화 영역을 포함하는 pCMV6-XL5 인간 SELL인 인간 L-셀렉틴 발현 벡터를 Origene, Inc에서 구입하였다(도 19; 서열번호 45). eGFP 렌티바이러스 벡터(pCCL MNDU3 eGFP)는 Don Kohn(UCLA)으로부터 입수하였고 이 벡터의 지도를 도 20 및 서열번호 46에 나타내었다. β-글로빈 렌티바이러스 벡터(pCCL GLOBE1 βAS3)는 Fulvio Mavilio(Genethon)로부터 입수하였다(도 21 참조; 서열번호 47).

렌티바이러스의 생산. 293T 세포(American Type Culture Collection)를 10% 우태아 혈청(Hyclone)을 포함하는 12.5 ㎖의 DMEM 배지(Invitrogen) 내에 75 cm² 플라스크 당 1.2×10⁷ 세포의 밀도로 도말하였다. 세포를 도말하고 24 시간 후에, 배지를 제거하고 겐타마이신(Lonza)을 포함하는 5 ㎖의 X-VIVO 15 배지로 세포를 세척한 다음 10 mM HEPES를 포함하는 12.5 ㎖의 X-VIVO 15 배지를 가하였다. 하나의 외피 단백질을 가지는 바이러스를 생산하기 위하여, 100 ㎕의 OptiMem I 배지(Invitrogen), 10 ㎍의 렌티바이러스 벡터 플라스미드, 5 ㎍의 pRSV rev(도 22; 서열번호 48), 5 ㎍의 pMDLg/pRRE(도 23; 서열번호 49) 및 5 ㎍의 외피 발현 플라스미드를 100 ㎍의 선형 25 kDal PEI(VWR)와 혼합하고 주위 온도에서 10 분 동안 인큐베이션한 다음 혼합액을 세포에 가하여 세포를 트랜스펙션하였다. L-셀렉틴 발현 하에 바이러스를 생산하기 위하여, 5 ㎍의 pCMV6-XL5 인간 SELL(도 19)을 상기 혼합액에 가한 후 외피 발현 플라스미드의 양을 5 ㎍에서 1 ㎍으로 줄였다. 트랜스펙션이 시작된 지 24 시간 후에, 배지를 플라스크에서 제거하고 4 ℃에서 보관한 후, 겐타마이신과 10 mM HEPES를 포함하는 12.5 ㎖의 X-VIVO 15 배지로 교체하였다. 트랜스펙션이 시작된 지 48 시간 후에, 배지를 플라스크에서 제거하고 처음 수확한 배지와 합하였다. 3,000×g에서 15 분 동안 4 ℃에서 원심분리하여 배지로 부터 세포와 잔해물을 펠릿화하였다. 상등액을 세공 크기 0.45 μM의 멸균된 필터장치(Steri-flip; Millipore)를 통해 여과하여 남아 있는 293T 세포를 모두 제거하였r고, 이는 이들 세포 중 일부가 바이러스 생산 과정에서 형질도입되어, 형질도입된 표적세포와 혼동될 수 있기 때문이다. 크루드 바이러스(crude virus)를 최종농도 50 U/㎖의 벤조나아제(Sigma)로 30 분 동안 37 ℃에서 처리하여 트랜스펙션 후에 잔류하는 플라스미드의 양을 줄였다. 약 0.2 ㎖로 재생한 셀룰로오스막을 포함하는 Amicon Ultra-15(Millipore, 100 kDal 분자량 컷오프)를 사용하여 바이러스를 한외여과에 의해 약 100 배로 농축하였다. 바이러스를 다양한 크기의 단일 사용량으로 나누고, 사용할 때까지 -80 ℃에서 보관하였다. p24 캡시드 ELISA(Clontech, Inc.)를 사용하여 바이러스 농도를 측정하였다. 다른 외피를 포함하는 바이러스의 감염성은 세포에 따라 크게 다를 수 있으므로, 알려진 양의 바이러스 입자가 형질도입될 수 있도록 배양된 세포에 대한 감염역가 대신 "입자 수"를 측정하는 분석(p24 캡시드 ELISA)을 수행하였다.

인간 CD34 세포의 형질도입. 골수 유래 인간 CD34+ 세포를 Lonza에서 구입하였다. 형질도입 2 일 전에, 미처리한 48 웰 플레이트(VWR cat# 73521-144)를 20 ㎍/㎖의 레트로넥틴(Lonza)을 포함하는 0.25 ㎖의 PBS로 24 시간 동안 4 ℃에서 코팅하였다. PBS/레트로넥틴을 제거하고, 플레이트를 2% 소혈청 알부민을 포함하는 PBS로 30 분 이상 주위 온도에서 블로킹하였다. CD34+ 세포를 해동, 펠릿화한 후 겐타마이신, 50 ng/㎖ 인간 C 키트 리간드(R&D Systems), 20 ng/㎖ 인간 IL-3(R&D Systems), 50 ng/㎖ 인간 Flt-3 리간드(R&D Systems) 및 50 ng/㎖ 인간 트롬보포이에틴(R&D Systems)을 포함하는 X-VIVO15 배지 내에, 웰 당 0.25 ㎖로 재현탁하였다. 세포를 37 ℃에서 24 시간 동안 인큐베이션한 후, 형질도입을 위해 원하는 양의 렌티바이러스를 가하였다. 필요한 경우, 세포 농도를 1×10⁶ 세포/㎖ 미만으로 유지하기 위하여 배지를 더 가하였다.

eGFP 발현 카세트를 포함하는 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 CD34 세포 중 eGFP+ 세포의 비율의 결정. 바이러스 형질도입이 시작된 지 3 일 후, 세포를 수거하여 96 웰 V-바닥 플레이트 내에서, 20 ℃에서 5 분 동안 300×g로 펠릭화하였다. 배지를 제거한 후, 1% FBS를 포함하는 200 ㎕의 PBS로 세포를 세척하였다. 20 ℃에서 5 분 동안 300×g로 세포를 펠릿화한 후, 1% FBS를 포함하는 PBS를 제거하였다. 2% 파라포름알데히드와 1% FBS를 포함하는 200 ㎕의 PBS 내에 세포를 재현탁하였다. Accuri 유세포 분석기(BD Biosciences)를 사용하여 eGFP+ 세포의 비율을 결정하였다.

트랜스펙션된 인간 CD34 세포 내에서 β 글로빈 미니유전자를 포함하는 통합된 렌티바이러스 벡터의 수의 결정. 바이러스 형질도입이 시작된 지 3 주 후에, 세포를 수거하여 1.5 ㎖ 마이크로 원심분리관 내에서, 20 ℃에서 5 분 동안 300×g로 펠릿화하였다. 배지를 제거하고 세포를 200 ㎕의 PBS에서 재현탁하였다. DNeasy Blood & Tissue Kit(Qiagen, Inc.)를 사용하여 제조업체의 지시에 따라 게놈 DNA를 제조하였다. 게놈 DNA에 대해 3 차례의 정량적 중합효소 연쇄반응(Q-PCR)을 수행하여 통합된 렌티바이러스의 수, (샘플 내 세포의 수를 카운트하기 위한) 단일 유전자의 수, 그리고 (렌티바이러스 게놈은 전이유전자 플라스미드 내에 완전히 포함되므로, 렌티바이러스 게놈의 정확한 정량화를 방해할 수 있는) 트랜스펙션 후 남은 플라스미드의 양을 측정하였다.

Q-PCR에 사용된 프라이머와 프로브의 서열은 다음과 같다.

통합된 렌티바이러스의 수를 정량화하기 위하여 Q-PCR의 타겟으로 바이러스 RNA 게놈 패키징 서열(psi)과 중복되는 서열을 사용하였다.

사용된 정방향 프라이머의 서열 : 5'-ACTTGAAAGCGAAAGGGAAAC-3' (서열번호 50).

사용된 역방향 프라이머의 서열 : 5'-CGCACCCATCTCTCTCCTTCT-3' (서열번호 51).

사용된 프로브의 서열 : 5'-6FAM-AGCTCTCTCGACGCAGGACTCGGC-TAMRA-3' (서열번호 52).

기준으로 사용된 DNA : pCCL-GLOBE1-βAS3 (서열번호 47).

단일 유전자의 수를 정량화하기 위하여 Q-PCR의 타겟으로 인간 RNAse P 유전자를 사용하였다. 사전 혼합된 프라이머와 프로브로 구성되는 TaqMan RNAse P 검출시약(Applied Biosystems)을 Q-PCR에 사용하였다. 기준으로 사용된 DNA는 상기 시약들과 함께 제공된 인간 DNA이다.

잔류 플라스미드를 정량화하기 위하여 Q-PCR의 타겟으로 바이러스 RNA 게놈을 암호화하는 영역 바깥의 pCCL 계 렌티바이러스 벡터 골격에서만 발견되고 바이러스 생산용으로 사용된 다른 플라스미드에서는 발견되지 않는, SV40 복제 원점(origin)의 서열을 사용하였다.

사용된 정방향 프라이머의 서열 : 5'-CTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTG-3' (서열번호 53).

사용된 역방향 프라이머의 서열 : 5'-CAGTGAGCGCGCGTAATA-3' (서열번호 X).

사용된 프로브의 서열 : 5'-6FAM-GACGTACCCAATTCGCCCTATAGTG-TAMRA-3' (서열번호 54).

기준으로 사용된 DNA : pCCL-GLOBE1-βAS3 (서열번호 47).

Taqman Fast 어드밴스드 마스터 믹스, 2x(Applied Biosystems)를 사용하였고, Roche LightCycler II 기기를 사용하여 Q-PCR을 수행하였다. (잔류 플라스미드의 양을 제외한) 렌티바이러스 게놈의 수를 단일 유전자의 수로 나눈 값이 형질도입된 세포 당 평균 벡터 수(VCN)이다. 일반적으로 잔류 벡터 플라스미드 DNA의 양은 렌티바이러스 게놈 수의 1% 정도로 많지 않았다.

인간 L-셀렉틴에 의한 인간 CD34+ 세포의 형질도입 개선의, 중화항체에 의한 억제. CCL-MNDU3-eGFP 게놈을 갖는 (p24 캡시드 ELISA에 의해 측정된) 2 ng의 슈도타입화된 VSV-G Indiana 렌티바이러스를 인간 L-셀렉틴 존재 또는 부존재 하에 위에서 설명한 바와 같이 생산하였다. 상기 바이러스는 10 μM 항-인간 L-셀렉틴 항체(클론 DREG56; Thermo Fisher) 존재 또는 부존재 하에 30 분 동안 37 ℃에서 20 ㎕의 부피로 인큐베이션한 다음, 상기와 같이 제조된 0.25 ㎖의 배지 내에 존재하는 사이토카인으로 자극한 인간 CD34+ 세포에 가하였다. 형질도입을 개시한 지 3 일 후에, eGFP+ 세포의 비율을 앞에서 설명한 방법에 따라 결정하였다.

결과

인간 CD34 세포의 형질도입을 가능하게 하는 것들의 스크리닝을 가능하게 하는 랍도바이러스 외피의 선택 전략. 약 6000 개의 랍도바이러스 외피 서열을 GenBank에서 검색하였다. 인간 또는 영장류로부터 유래하는 서열, 영장류 감염능력에 대한 혈청학적 증거가 있는 서열, 재조합 렌티바이러스에 결합된 적이 없는 서열, 그리고 외피 단백질 발현 벡터를 구축하기 위한 암호화 영역의 전체 서열이 알려진 서열을 선택하여 외피 서열의 수를 10으로 좁혔다. 이러한 기준을 충족하는 11 종의 외피 단백질은 다음의 랍도바이러스들로부터 유래한 것이다: VSV Arizona, Bas Congo, Curionopolis, Ekpoma-1, Ekpoma-2, Isfahan, Kamese, Kontonkan, Kwatta, Le Dantec 및 rabies. 또한, 다른 연구자들(Hu, et al., 2016)이 시험한 Chandipura rhabdovirus로부터 유래하는 외피 단백질 역시 실험 대상에 포함시켰다. 도 1은 이들 바이러스 외피 단백질의 유연관계, 이들이 속하는 랍도바이러스 아군 및 Indiana 외피 단백질과의 % 아미노산 동일성을 보여준다.

대부분의 랍도바이러스 아과로부터 유래하는 대표적인 외피 단백질들은 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 가능하게 하지 못한다. 상기 랍도바이러스 외피 단백질들 중에서, Le Dantec을 제외한 모두가 CCL-MNDU3-eGFP 게놈을 갖는 렌티바이러스에 의해 293T 세포를 형질도입할 수 있었다(표 1). 이것은 Le Dantec 외피를 제외한 모든 발현 플라스미드가 기능성 외피 단백질을 암호화한다는 것을 보여준다. Chandipura 및 rabies에 의한 세포주의 형질도입은 이전에 보고된 바 있다. 종래에 보고된 바 없는 Isfahan 외피에 의한 293T 세포의 형질도입 수준은, 이것이 다른 배양 세포주의 형질도입에도 유용할 수 있음을 시사한다.

이와 대조적으로, CCL MNDU3 eGFP 게놈을 갖는 렌티바이러스의 경우, VSV Arizona 및 Indiana 외피 단백질만 효과적인 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 가능하게 하였다(표 2).

[표 1]

렌티바이러스는 pCCL MNDU3 eGFP 게놈과 해당 외피 단백질을 사용하여 생산하였다. (24 웰 플레이트 상에서) 웰 당 1 ng의 p24를 사용하여 293T 세포를 형질도입하였다. GFP+ 세포의 비율은 감염 1 일 후에 측정하였다.

[표 2]

렌티바이러스는 pCCL-MNDU3-eGFP 게놈과 해당 외피 단백질을 사용하여 생산하였다. (48 웰 플레이트 상에서) 웰 당 10 ng의 p24를 사용하여 사이토카인으로 자극한 인간 CD34+ 세포를 형질도입하였다. GFP+ 세포의 비율은 감염 3 일 후에 측정하였다.

모든 신대륙 유래 베지큘로바이러스 외피 단백질은 인간 CD34+ 세포를 형질도입한다. VSV-G Indiana 이외에 다른 베지큘로바이러스 외피 단백질(VSV-G Arizona)이 인간 CD34+ 세포를 형질도입하였으므로, 인간 감염 가능성 여부에 대한 증거의 유무와 무관하게, 전체 암호화 영역이 알려진 모든 대표적인 베지큘로바이러스에 대하여 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 시험하였다. 다음의 VSV 주로부터 유래하는 5 종의 VSV 외피 단백질을 추가적으로 시험하였다: Alagoas, Carajas, Maraba, Morreton, 및 New Jersey. 이들 외피 단백질은 VSV Indiana 외피 서열에 대한 아미노산 서열 동일성에서 큰 차이를 보인다(표 3). 이들 외피 단백질은 모두 비록 효율은 달랐지만 인간 CD34+ 세포의 형질도입이 가능하였다(도 2). Alagoas, New Jersey 및 Carajas 외피 단백질을 갖는 렌티바이러스는 VSV Indiana 외피를 갖는 렌티바이러스에 비해 인간 CD34+ 세포의 형질도입 효율이 낮은 반면, Morreton, Arizona 및 Maraba 외피 단백질을 갖는 렌티바이러스는 VSV Indiana 외피를 갖는 렌티바이러스에 비해 인간 CD34+ 세포의 형질도입 효율이 높았다.

[표 3]

이러한 결과와 문헌에 보고된 결과를 종합하면, 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 잘 매개하지 못하는 베지큘로바이러스 외피가 3 종(Isfahan, Piry, Chandipura), 형질도입 효율이 높은 것이 8 종(VSV(Arizona), VSV(Indiana), VSV(New Jersey), Morreton, Maraba, Alagoas, Carajas, Cocal)이다. 인간 CD34+ 세포의 형질도입 매개효율이 낮은 3 종의 베지큘로바이러스 외피는 구대륙 베지큘로바이러스로부터 유래하는 것이고, 반면 인간 CD34+ 세포의 형질도입 매개효율이 높은 8 종은 신대륙 베지큘로바이러스로뷰터 유래하는 것이다(도 3).

이러한 다양한 베지큘로바이러스 외피 단백질들의 아미노산 서열을 비교하면, 31 종의 아미노산이 인간 CD34+ 세포의 형질도입 매개효율이 높은 모든 외피에서 발견되지만, 이들이 인간 CD34+ 세포의 형질도입 효율이 낮은 외피에서는 전혀 발견되지 않는다(도 4). 이러한 31 종의 아미노산은 "CD34+ 세포 형질도입 결정자"이며 향후 발견되는 베지큘로바이러스 외피가 인간 CD34+ 세포를 형질도입할 수 있을지를 예측하는 데 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 인간 CD34 세포의 형질도입 매개효율이 낮은 베지큘로바이러스 외피를 인간 CD34 세포의 형질도입 매개효율이 높은 외피 단백질로 전환하기 위하여 이들 아미노산을 도입할 수도 있다. 계통과 기능 사이의 이러한 상관관계는 구대륙 및 신대륙 베지큘로바이러스들에 대하여 다른 수용체가 결합하기 때문일 수 있다. Cocal 및 VSV Indiana 외피 단백질은 세포 내로 진입하기 위하여 LDL-R에 결합하는 것으로 알려져 있다. VSV Arizona 외피의 형질도입은 가용성 LDL-R에 의해 억제되었는데(데이터는 제시하지 않음), 이것은 이 외피 역시 LDL 수용체에 결합함을 시사한다. 그러므로, 모든 신대륙 베지큘로바이러스는 LDL-R에 결합하여 세포 내로 진입하는 반면, 구대륙 베지큘로바이러스는 (아직 확인되지 않은) 다른 수용체에 결합하는 것일 수 있다. CD34+ 세포 형질도입 결정자를 구성하는 31 종 아미노산 중 대부분은 VSV-G Indiana의 전융합 구조체 안에 묻혀 있다. VSV-G Indiana의 전융합 구조체 내에서 CD34+ 세포 형질도입 결정자 중 가장 표면에 노출되는 아미노산들은 Asp 290, Val 291, Glu 292, Ser 305 및 Gly 365이다(도 5).

신대륙 베지큘로바이러스 외피 단백질들 사이의 유연관계를 조사한 결과는 이들이 분리된 분지들을 형성하며 이러한 분지들이 인간 CD34+ 세포의 형질도입 효율과 관련될 수 있음을 시사한다. Alagoas 및 Carajas 외피를 포함하는 분지들 상에 존재하는 외피는 다른 분지의 외피들(Maraba, Morreton, Indiana 및 Cocal)에 비해 인간 CD34+ 세포의 형질도입 효율이 낮았다. 그러므로, "CD34+ 세포 형질도입 효율 결정자 서열" 역시 존재할 수 있다.

실시예 2 - L-셀렉틴에 의한 형질도입 효율의 개선

CD34+ 세포의 형질도입을 더 개선하기 위하여, 렌티바이러스의 표면에 회합할 수 있고 CD34+ 세포의 표면에 결합할 수 있는 비외피 단백질 리간드들을 스크리닝하였다. CD34는 CD34+ 세포에서 발현되며 L-셀렉틴은 CD34에 결합하는 리간드로 알려져 있다. L-셀렉틴의 발현 하에 생산된 렌티바이러스는 CD34+ 세포의 형질도입을 개선하였다(도 6). 이러한 효과의 크기는 형질도입되는 세포 내의 VCN에 의존하였다. 예를 들어, L-셀렉틴 존재 하에 바이러스가 생산된 경우에는, 1의 VCN을 달성하기 위하여 사용된 바이러스의 양이 L-셀렉틴이 없는 경우에 비해 5 배 적었다(도 8). 이러한 구체적인 실시예에서, 2의 VCN을 달성하기 위하여 사용된 바이러스의 양은 8 배 적었다. (예컨대 1 ㎍의 인간 L-셀렉틴 발현 벡터 pCMV6-XL5 huSELL과 5 ㎍의 VSV-G Indiana 외피 발현 벡터 pHCMV를 사용하여) 293T 생산자 세포 내에 L-셀렉틴이 발현되는 경우, 바이러스 생산량이 1.0~1.5 배 감소하였다(데이터는 제시하지 않음). 따라서, 생산량은 약간 감소하더라도 형질도입 효율은 여전히 증가될 수 있다.

CD52 역시 CD34+ 세포에서 발현되며 SIGLEC10은 CD52에 대한 리간드로 알려져 있다. SIGLEC10 발현 하에 생산된 렌티바이러스는 L-셀렉틴 존재 하에 생산된 렌티바이러스에 비해 CD34+ 세포 형질도입을 개선시키지 못하였다(도 7). 또한, 293T 생산자 세포 내에 SIGLEC10이 발현되는 경우 바이러스 생산량이 급격하게 감소하였다(데이터는 제시하지 않음). 따라서, 렌티바이러스 생산 과정에서 SIGLEC10 리간드의 공동발현은 CD34+의 형질도입을 개선하지 못하는 것으로 보인다.

L-셀렉틴 존재 하에 바이러스를 생산하기 위한 최적 조건(1 ㎍의 VSV-G Indiana 플라스미드, 5 ㎍의 L-셀렉틴 플라스미드)을 흔히 사용되는 최적 바이러스 생산방법(5 ㎍의 VSV-G Indiana 플라스미드) 및 VSV-G Indiana 플라스미드의 양을 L-셀렉틴을 포함하는 최적 생산조건의 수준으로 낮춘 경우(1 ㎍의 VSV-G Indiana 플라스미드)와 비교하였다. 예상한 바와 같이, VSV-G Indiana 플라스미드의 양을 5 ㎍에서 1 ㎍으로 줄이자 인간 CD34+ 세포의 형질도입 효율이 약간 감소하였다(도 8). 그러나, 5 ㎍의 L-셀렉틴 발현 벡터를 가하자 이러한 감소가 상새되고도 남았다. 이 실험에서, L-셀렉틴 존재 하에 생산된 VSV-G Indiana 외피 바이러스의 효율은 VSV-G Indiana 외피 바이러스의 약 5 배였다.

5 ㎍의 VSV-G Indiana 발현 벡터에 5 ㎍의 L-셀렉틴 발현 벡터를 가한 효과도 평가하였다. 5 ㎍의 VSV-G Indiana 발현 벡터에 5 ㎍의 L-셀렉틴 발현 벡터를 가한 경우, 렌티바이러스 형질도입 효율이 증가하지 않았다(도 9). 또한, 5 ㎍의 L-셀렉틴 발현 벡터와 5 ㎍의 VSV-G Indiana 발현 벡터를 조합한 경우 바이러스 생산량이 3 배로 증가하였다. 이 실험에서, L-셀렉틴 존재 하에 생산된 VSV-G Indiana 외피 바이러스의 효율은 VSV-G Indiana 외피 바이러스의 약 6 배였다. 5 ㎍의 인간 L-셀렉틴 플라스미드 존재 하에 바이러스 생산을 위해 사용된 pHMCV VSV-G Indiana 플라스미드의 양을 5 ㎍에서 1 ㎍으로 줄인 경우에 CD34+ 세포의 형질도입 개선은 감소하지 않았으나 렌티바이러스의 생산은 증가하였으므로, 외피 발현 벡터의 양을 더 줄이면 렌티바이러스 생산이 더 증가할 가능성이 있다. 외피 단백질 부존재 하에 바이러스를 생산한 경우, 5 ㎍의 VSV-G 외피 발현 플라스미드(75 cm² 플라스크 당)를 사용하여 바이러스를 생산한 경우에 비해 바이러스 입자의 생산량이 적어도 2~3 배 증가하였다. 외피 발현 플라스미드의 양을 외피 발현 플라스미드를 사용하지 않을 때 관찰되는 것과 유사한 정도의 완전한 무독성 수준까지 줄일 수 있다면, 그러면서도 바이러스 생산 과정에서 인간 L-셀렉틴 발현 벡터를 포함시켜 형질도입의 개선을 유지할 수 있다면, CD34+ 세포의 형질도입이 개선될 뿐 아니라 바이러스의 생산도 개선될 수 있을 것이다.

L-셀렉틴은 또한 Maraba(표 4), Morreton(도 14) 및 Carajas(도 15) 베지큘로바이러스 외피 단백질의 형질도입 효율을 개선시켰다. 초기 실험에서, 인간 CD34+ 세포의 Maraba 외피 매개 형질도입 개선은 전형적으로 3~6 배였으며, 한 실험에서 인간 CD34+ 세포의 Morreton 외피 매개 형질도입 개선은 10 배였다.

[표 4]

실시예 3 - L-셀렉틴은 렌티바이러스 내로 통합될 수 있다

렌티바이러스 생산 세포 내에서 L-셀렉틴의 발현은 L-셀렉틴이 바이러스 내로 통합되는 과정을 포함하거나 포함하지 않는 메커니즘에 의해 렌티바이러스에 의한 CD34+ 세포의 형질도입을 개선할 수 있다. 렌티바이러스 생산 세포 내에서 L-셀렉틴의 발현이 CD34+ 세포의 형질도입을 개선하는 이유에 대한 가장 간단한 가설은 L-셀렉틴이 바이러스 내부로 통합되며 이러한 통합의 결과로 CD34+ 세포에 대한 결합이 개선된다는 것이다. 바이러스가 세포에 결합하는 과정이 형질도입의 속도 제한 단계라는 것은 잘 알려져 있다. 또한, 렌티바이러스 생산 세포 내에서 L-셀렉틴의 발현은, 예컨대 VSV-G의 분해를 줄이거나 VSV-G가 렌티바이러스 내로 통합되는 것을 촉진하여, 렌티바이러스의 감염성에 간접적으로 영향을 미치는 것일 수도 있다. 바이러스 내 VSV-G 또는 다른 외피의 양은 형질도입 효율과 상관관계가 있다고 알려져 있다.

L-셀렉틴이 렌티바이러스 내로 통합될 수 있는지를 알아보기 위하여, CCL-MNDU3-eGFP 게놈을 갖는 렌티바이러스를 인간 L-셀렉틴 존재 또는 부존재 하에 생산한 후, 각각의 바이러스를 10 μM의 인간 L-셀렉틴에 대한 중화항체의 존재 또는 부존재 하에 인큐베이션하였다. 이어, 이들 샘플을 이용하여 사이토카인으로 자극한 CD34+ 세포를 형질도입하고, 형질도입이 시작된 지 3 일 후에 eGFP+ 세포의 비율을 측정하였다. 그 결과를 도 10에 도시하였다. 첫째로, 인간 L-셀렉틴 존재 하에 생산된 렌티바이러스는 형질도입을 약 2 배, eGFP+ 세포의 비율을 16.2%에서 27.1%로 증가시켰다. 둘째로, 인간 L-셀렉틴 부존재 하에 생산된 바이러스에 L-셀렉틴 중화항체를 가한 경우에는 CD34+ 세포의 형질도입 능력에 큰 변화가 없었다(eGFP+ 세포의 비율 = 15.6%). 그러나, 인간 L-셀렉틴 존재 하에 생산된 바이러스에 L-셀렉틴 중화항체를 가한 경우, CD34+ 형질도입 개선이 감소하였고(= 27.1% - 16.2% = 10.9%) eGFP+ 세포의 비율도 27.1%에서 18.5%로 79% 감소하였다(27.1% - 18.5% = 8.6%; 8.6%/10.9% = 79% 감소). 이것은 인간 L-셀렉틴이 바이러스 생산 세포 내에서 발현되는 경우 렌티바이러스 입자 내로 통합될 수 있고, 그러한 렌티바이러스에 의한 CD34+ 세포의 형질도입을 개선하는 데 있어 중요한 역할을 한다는 것을 의미한다.

실시예 4 - L-셀렉틴을 발현하는 세포 내에서 렌티바이러스가 생산되는 경우, CD34 를 발현하지 않는 세포의 형질도입이 개선되지 않는다 .

L-셀렉틴이 렌티바이러스 내로 통합되는 것에 대한 증거를 더 제공하기 위하여, CD34를 발현하지 않는 세포(293T 세포)를 인간 L-셀렉틴의 존재 또는 부존재 하에 생산된 바이러스(CCL-MNDU3-eGFP 게놈)로 형질도입하였다. 인간 L-셀렉틴이 렌티바이러스 내로 통합되어 렌티바이러스의 세포에 대한 결합을 개선한다면, 인간 L-셀렉틴 존재 하에 생산된 바이러스는 인간 L-셀렉틴 부존재 하에 생산된 바이러스에 비해 CD34- 세포를 형질도입하지 않아야 한다. 도 11에서 보듯이, 인간 L-셀렉틴 존재 하에 생산된 바이러스는 인간 L-셀렉틴 존재 하에 생산된 바이러스보다 293T 세포(CD34-인 세포)를 더 잘 형질도입하지 않았다. L-셀렉틴 발현의 발현이 바이러스 내 VSV 외피의 양을 증가시키는 것과 같이 간접적인 방법으로 감염성을 증가시킨다면, VSV 외피 렌티바이러스에 의한 형질도입이 가능한 다양한 세포들의 감염성이 이 바이러스에 의해 증가하였어야 한다.

실시예 5 - 렌티바이러스 생산 과정에서 공동 발현되는 L-셀렉틴 단백질은 다수의 다양한 베지큘로바이러스 외피 단백질에 의해 슈도타입화된 렌티바이러스 벡터에 의한 형질도입을 개선한다.

렌티바이러스 생산 과정에서 L-셀렉틴이 공동 발현되는 경우 인간 CD34+ 세포의 VSV-G(Indiana) 매개 형질도입이 개선되었으므로, 벡터 생산 과정에서 다른 베지큘로바이러스 외피 단백질에도 L-셀렉틴의 공동 발현에 의한 이러한 형질도입 개선 효과가 나타나는지를 조사하였다. Maraba 외피로 슈도타입화한 렌티바이러스는 VSV-G Indiana 외피에 비해 개선된 CD34+ 세포 형질도입을 보이므로 Maraba 외피가 특별히 관심을 끈다(도 12). L-셀렉틴 발현 플라스미드(5 ㎍에서 1 ㎍까지) 대비 Maraba 외피 발현 플라스미드(1 ㎍에서 0.25 ㎍까지)의 양을 변화시키면서 293T 생산자 세포가 들어 있는 T-75 플라스크 내로 (렌티바이러스 보조 플라스미드와 pCCL-GLOBE1-bAS3를 사용하여) 트랜스펙션을 수행하여 Maraba 외피와 L-셀렉틴 사이의 용량 의존관계를 조사하였다. 상기한 바와 같이 각 생산조건에서 얻은 렌티바이러스를 사용하여 인간 CD34+ 세포를 1, 3, 10 및 30 ng의 p24gag로 형질도입하였다(도 12). 흥미롭게도, 293T 세포 내로 트랜스펙션한 Maraba 외피 플라스미드의 양이 감소함에 따라, 그 결과 얻어진 Maraba 슈도타입화 렌티바이러스는 VCN 분석에 의해 측정된 CD34+ 세포의 형질도입이 개선되는 효과를 보였다. 따라서, 벡터 생산 293T 세포를 트랜스펙션하기 위해 사용된 L-셀렉틴 공동 발현 플라스미드의 양이 감소함에 따라, 그 결과 얻어진 Maraba 슈도타입화 렌티바이러스의 형질도입 효율 역시 개선되었다(0.25 ㎍의 Maraba 플라스미드를 사용하여 생산된 렌티바이러스를 이용한 경우의 VCN 형질도입과 293T 세포 공동 트랜스펙션 과정에서 5 ㎍ 또는 1 ㎍의 L-셀렉틴 플라스미드를 사용한 경우를 도 12의 맨 아래 그래프에 비교하였다). 이러한 VCN 형질도입의 결과로부터, 본 실시예에 기재된 트랜스펙션 조건하에서, 렌티바이러스 생산 과정에서 Maraba 외피 발현 플라스미드의 최적 범위가 0.25 ㎍ 내지 0.5 ㎍인 반면, L-셀렉틴 발현 플라스미드의 최적 범위는 1 ㎍ 내지 2.5 ㎍임을 알 수 있다. 최대의 형질도입 개선효과를 달성하려면 벡터 생산 과정에서 트랜스펙션된 베지큘로바이러스 외피:L-셀렉틴 발현 플라스미드의 비가 1:2 내지 1:5 범위이어야 한다. 다른 이종의 바이러스 외피 단백질을 사용하여 렌티바이러스를 슈도타입화하는 경우, 생산 과정에서 바이러스의 형질도입 개선을 위한 외피:L-셀렉틴 플라스미드의 비는 다를 수 있다.

Maraba 외피와 L-셀렉틴에 의해 매개된 렌티바이러스 형질도입의 안정성을 입증하기 위하여, VSV-G Indiana 외피(전형적인 대조군) 또는 Maraba 외피와 L-셀렉틴으로 슈도타입화한 렌티바이러스를 사용하여 3 명의 다른 제공자들로부터 유래한 CD34+ 세포를 형질도입하였다(도 13). CD34+ 세포 게놈 DNA에 대한 VCN 분석 결과, 렌티바이러스를 Maraba 외피와 L-셀렉틴으로 슈도타입화한 경우, 대조군인 V-G로 슈도타입화 렌티바이러스에 비해 VCN이 적어도 2 배 증가하였다.

벡터 생산 과정에서 L-셀렉틴이 공동 발현되는 경우, Morreton(도 14) 및 Carajas(도 15)와 같은 다른 베지큘로바이러스 외피의 형질도입 역시 개선되었다. 벡터 생산 과정에서 L-셀렉틴이 공동 발현되거나 그렇지 않은 경우에 대하여, Carajas 외피로 슈도타입화된 렌티바이러스를 VSV-G Indiana 외피 또는 Alagoas 외피로 슈도타입화된 렌티바이러스들과 비교하였다(도 15). 도 2와 비슷하게, Carajas 외피 렌티바이러스는 VSV-G Indiana로 슈도타입화된 렌티바이러스와 비슷한 정도로 CD34+ 세포를 형질도입한 반면, Alagoas 외피 렌티바이러스의 CD34+ 형질도입 매개효율은 VSV-G Indiana 렌티바이러스에 비해 낮았다. 렌티바이러스 생산 과정에서 L-셀렉틴이 Carajas 외피와 공동 발현된 경우 CD34+의 형질도입이 상당히 개선되었다. Alagoas 외피 매개 CD34+ 형질도입의 경우에는 렌티바이러스 생산 과정에서 L-셀렉틴의 발현에 따른 개선효과가 관찰되지 않았다. 그러나, 이것은 렌티바이러스 생산 과정에서 Alagoas 외피의 발현 수준이 낮았거나 Alagoas 외피와 L-셀렉틴의 발현 비율이 최적이 아니기 때문일 수도 있다.

요약하건대, 이러한 결과들은 다음과 같은 사실들을 입증한다. (1) 신규한 베지큘로바이러스 외피들(Maraba, Morreton, VSV-G Arizona 및 Carajas 외피 포함)이 제1 인간 CD34+ 세포를 슈도타입화할 수 있으며, 전형적인 VSV-G Indiana 베지큘로바이러스 외피와 유사하거나 더 높은 수준으로 렌티바이러스 형질도입을 매개할 수 있다. (2) 렌티바이러스 생산자 세포 내에서 인간 L-셀렉틴 단백질의 공동 발현은 CD34+ 세포 형질도입 특성이 개선된 VSV-G 슈도타입화 렌티바이러스를 생성한다. (3) 렌티바이러스 생산자 세포 내에서 L-셀렉틴의 공동 발현은 다양한 베지큘로바이러스 외피 단백질들(Maraba, Morreton 및 Carajas 외피 포함)로 슈도타입화된 렌티바이러스의 CD34+ 세포 형질도입을 개선한다. (4) 렌티바이러스 생산자 세포 내에서 베지큘로바이러스 외피와 L-셀렉틴 발현 플라스미드의 비율은 제1 인간 CD34+ 세포의 렌티바이러스 형질도입 개선 정도를 결정하는 중요한 요인일 수 있다. (5) 이러한 형질도입의 개선은 GFP 리포터 렌티바이러스와 인간 베타 글로빈 발현 렌티바이러스에도 적용되며, 따라서 실험용으로 또는 이상혈색소 또는 다른 임상적 증상을 치료하기 위해 사용되는 렌티바이러스들에게도 적용될 수 있다.

실시예 6 - Machupo 아레나바이러스 외피 단백질로 슈도타입화된 렌티바이러스에 의한 인간 CD34+ 세포의 형질도입 .

CD34 외에 CD34+ 세포에서 발현되는 다른 세포 표면 단백질로 제1형 트랜스페린 수용체(CD71)가 있는데, 이것은 대부분의 포유동물 세포에서 발현된다. Machupo 아레나바이러스는 인간 제1형 트랜스페린 수용체를 이용하여 인간 세포를 감염시키는 병원체이다. (세포배양 배지의 공통 성분인) 트랜스페린은 Machupo 바이러스에 의한 세포 감염을 억제하지 않는다(Rpadoshitzky, S. R., et al., 2007). 또한, Machupo GP1 외피 단백질(Carvallo 주)이 인간 제1형 트랜스페린 수용체에 결합하는 것이 결정구조를 통해 확인되었다(Abraham J., et al. (2010). 이것은 외피 단백질 가공에 유용할 것으로 생각될 뿐 아니라, 트랜스페린의 인간 제1형 트랜스페린 수용체에 대한 결합과 상충하지 않는 영역에서 Machupo 외피가 인간 제1형 트랜스페린 수용체에 결합하는 Machupo GP1 외피 단백질-인간 제1형 트랜스페린 수용체 구조에서도 발견되는데, 이는 Radoshitzky에 의해 보고된 세포배양 실험결과를 뒷받침한다. 이러한 특성에 착안하여, Machupo virus 외피 단백질이 렌티바이러스를 슈도타입화하고 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 매개하는 능력이 있는지를 시험하였다. CCL GLOBE1 βAS3 게놈을 갖는 렌티바이러스를 두 가지 다른 양의 발현 플라스미드(75 cm² 플라스크 당 1 또는 5 ㎍)를 사용하여, VSV-G Indiana 외피(양성 대조군; 75 cm² 플라스크 당 5 ㎍)와 Machupo 외피(Carvallo 주)를 이용하여 생산하였다. 또한, 75 cm² 플라스크 당 1 ㎍의 발현 플라스미드를 이용하여 인간 L-셀렉틴의 발현 하에 Machupo 외피(Carvello 주)에 대한 렌티바이러스를 생산하였다(75 cm² 플라스크 당 1 ㎍의 외피 발현 플라스미드 및 5 ㎍의 인간 L-셀렉틴 발현 플라스미드). Machupo 바이러스 외피는 바이러스 생산자 세포 내에서 VSV-G Indiana와 L-셀렉틴(SELL)이 공동 발현된 경우와 유사한 정도로 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 매개할 수 있었다(도 16).

아레나바이러스 외피 단백질은 계통적으로 구대륙계와 신대륙계로 분류할 수 있다(도 17). 또한, 이러한 분류는 이들의 굴성 및 수용체와 상관관계가 있다. 구대륙 유래 아레나바이러스 외피 단백질은 일반적으로 α-디스토글리칸을 이용하여 세포를 감염시키는 반면, 신대륙 유래 아레나바이러스 외피 단백질은 제1형 트랜스페린 수용체를 이용하여 인간 세포를 감염시킬 수 있으며 수용체 결합을 결정하는 공통서열을 가지는 것으로 보인다(Radoshitzky, et al., 2011). 2 종의 구대륙 유래 아레나바이러스 외피 단백질(LCMV 및 Lassa 바이러스 유래)이 CD34+ 세포 형질도입에 대해 시험된 바 있으며, 그 결과 인간 CD34+ 세포의 형질도입 효율이 매우 낮은 것으로 나타났다(Sandrin, et al., 2002). 그러나, 신대륙 유래 아레나바이러스 외피 단백질(Machupo)로 슈도타입화된 렌티바이러스는 인간 CD34 세포를 잘 형질도입할 수 있다(도 16). 그러므로, 베지큘로바이러스 외피의 경우와 마찬가지로, 다른 신대륙 유래 아레나바이러스 외피 단백질들도 Machupo 바이러스 외피에 비해 높거나 낮은 CD34+ 세포 형질도입 효율을 보일 수 있으므로 시험해 볼 가치가 있을 것이다. 신대륙 유래 아레나바이러스 외피 단백질들도 여러 하위 계통으로 분류될 수 있는 것으로 보이며(도 17), 이러한 하위 집단들은 다른 하위 집단들에 비해 높거나 낮은 CD34+ 세포 형질도입 효율을 보일 수 있다. 예를 들어, Machupo, Junin, Ocozocoautla 및 Tacaribe 외피 단백질은 인간 CD34+ 세포의 형질도입을 매개할 수 있는 분기군을 구성할 수 있으나, 이들의 효율은 서로 다를 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> BioMarin Pharmaceutical Inc. <120> IMPROVED LENTIVIRUSES FOR TRANSDUCTION OF HEMATOPOIETIC STEM CELLS. <130> 30610/51899 PC <150> US 62/500,874 <151> 2017-05-03 <160> 57 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 6507 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic plasmid <220> <221> misc_feature <223> plasmid with a sequence from Indiana vesiculovirus <400> 1 gagcttggcc cattgcatac gttgtatcca tatcataata tgtacattta tattggctca 60 tgtccaacat taccgccatg ttgacattga ttattgacta gttattaata gtaatcaatt 120 acggggtcat tagttcatag cccatatatg gagttccgcg ttacataact tacggtaaat 180 ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt 240 cccatagtaa cgccaatagg gactttccat tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa 300 actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc 360 aatgacggta aatggcccgc ctggcattat gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct 420 acttggcagt acatctacgt attagtcatc gctattacca tggtgatgcg gttttggcag 480 tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 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780 tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag 840 acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc 900 caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat 960 cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa 1020 tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc 1080 ggaatgatca gtggaactac cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa 1140 gacgtggaaa ttggacccaa tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta 1200 tacatgattg gacatggtat gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg 1260 ttcgaacatc ctcacattca agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt 1320 tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt 1380 tggaaaagct ctattgcctc ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg 1440 gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt 1500 tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aagtaa 1536 <210> 10 <211> 512 <212> PRT <213> Maraba vesiculovirus <400> 10 Met Leu Arg Leu Phe Leu Phe Cys Phe Leu Ala Leu Gly Ala His Ser 1 5 10 15 Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His His Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn 20 25 30 Val Pro Ser Thr Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Gln Asn Trp 35 40 45 His Asn Asp Leu Thr Gly Val Ser Leu His Val Lys Ile Pro Lys Ser 50 55 60 His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ala Lys Trp 65 70 75 80 Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His 85 90 95 Ser Ile His Ser Met Ser Pro Thr Leu Glu Gln Cys Lys Thr Ser Ile 100 105 110 Glu Gln Thr Lys Gln Gly Val Trp Ile Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln 115 120 125 Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Val Val Val Val Gln 130 135 140 Ala Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Ile 145 150 155 160 Asp Ser Gln Leu Val Gly Gly Lys Cys Ser Lys Glu Val Cys Gln Thr 165 170 175 Val His Asn Ser Thr Val Trp His Ala Asp Tyr Lys Ile Thr Gly Leu 180 185 190 Cys Glu Ser Asn Leu Ala Ser Val Asp Ile Thr Phe Phe Ser Glu Asp 195 200 205 Gly Gln Lys Thr Ser Leu Gly Lys Pro Asn Thr Gly Phe Arg 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120 tgtccttcta gttctgactt gaattggcac aatgggctga ttggcacttc tctccaagtc 180 aaaatgccca aaagccataa ggccatccaa gcggatggtt ggatgtgtca tgctgccaag 240 tgggtgacta cttgtgactt cagatggtac ggacctaaat atgtgacaca ttctataaag 300 tccatgatac ctacagtcga ccagtgtaaa gaaagtatag cccagactaa acaaggaacg 360 tggttaaatc cgggtttccc tccccaaagt tgtggatatg cttccgttac agatgcagag 420 gctgtgatag tcaaagcaac cccccaccag gttttggttg acgaatatac aggagaatgg 480 gttgactccc aatttccgac tggaaaatgc aataaagaca tttgcccaac agttcacaac 540 tcaactacct ggcactcaga ttataaggtc actggccttt gcgatgcaaa tttgatctca 600 atggacatca ctttcttctc cgaagatgga aaattaacat ccctcgggaa agaaggaaca 660 gggttcagaa gcaattactt tgcatacgaa aatggtgaca aagcatgccg catgcagtac 720 tgtaaacact ggggagttcg acttccatcc ggagtgtggt tcgaaatggc agataaagac 780 atctataatg atgcgaaatt cccggattgc cctgaaggat catccattgc ggctccctct 840 cagacttcag tcgatgttag tctcattcag gatgtagaga gaatcttgga ctactctttg 900 tgtcaggaaa cctggagcaa aattcgtgct catttgccca tttcaccagt tgacctcagc 960 tatttatccc 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DNA <213> Curionopolis virus <400> 21 atggatcttg ttcgattttc aattgcgttg tcagtcttcc tatgctacgg aaccccccca 60 tctcagggcc aagcaatcgt ttcgatcaaa gatagttgcg aagctaagtc agctccctgg 120 atcccttgtg agaaatttga ttatgtcaaa aatgctacgg ggtcaggaat caaatgctgg 180 attttttgtt ctagatcagg tttttactca aaaacaggga ggtttattag atgcatccaa 240 ggagatccgg aagcaaagta cataaaatcc tgtcgaaggc agatagagaa aagagggaaa 300 gaaaagatga gagaaggaac taggggaaaa agaaaaacgt cggaaccaaa agaagaagga 360 gtaagagcta aaacagattt tactcctgat gagagcagaa ggctgaacaa cttgaccaaa 420 gtattcagga aagtagaaga taaggacctc aatgatttca aaaagttcat attggaaaaa 480 ggattggaaa cgaagattaa gctagcaaat gatgggaaga tctctttcag agaccctgac 540 tgcggagaaa acaaagacta cccatgccac aggatccatc aaatcataga aggggtcaat 600 gaaaacatag actatataaa tgagatccta agcttaaaaa agatgaagga agaattgagg 660 ttgagagaaa gagaatcaga agaaggggag tttccaggcc ttctcaacac gactaatcga 720 agagggttcc ttcttcacta ccccgtggaa ctaggaaatt ggtcaagact cgaagatcct 780 agtcaaatca aatgcccgtc tcatcacaag gatatgctta gcaatcccag aagactgggg 840 aagtacaact tagacattat agtgaggagg cctagaatcg gaacttttga aacagtagtg 900 cctggttata tatgccaggg aatgcaatgg acatctactt gcaatgagat gtggtatttt 960 gtcacttacc atgacagagc agtgcactac ataacaccaa acaagctcaa atgtttacaa 1020 aacatcagag ctcacaaaag aggagaacac ataaaacctt attatcctct agaggaatgc 1080 aactggaatt cagaaacaac aaaaacagtg gattacttca tgatcacacc atactctcct 1140 gaagtagacc cattcactct agaatttaaa agtgagatct tcccagacag gacgtcctgt 1200 cgtcccggag acgagatctg tgttaccgat gatgacagca aagtctggtt cccagacgaa 1260 gatgacaagc tgatcgcaag gggacactgt cctgatgaaa cgtgggatga atctcatctc 1320 actatacatc cggaagagat gccggaaaat tgggaagatc ctcagtctcc ctgggtgagt 1380 gactacatac taaagggggt cttatttgga gaaaagagag tcaaaaagag ctgtctatta 1440 gagttttgtg gaacatctgg actcttgttt gaagatgggg aatggtggga gttaaatgtt 1500 ttcagcagag aaaaaggaag agaatcactg acgaagattt tcatagagca ggaggagatt 1560 cgacgatgca acggaacaga aacccgtgtc ggagtggctg ggaaagaaac tgatgaaaaa 1620 gctttgttga acgcagtgct gagcaaaaat gcctatgaga ggtgcaagtc tgctagatac 1680 agacttatag aaaacaagta cctcagatta gatgacctca gctacataaa tccaagagaa 1740 tctgttacat ggtgggccta cagagtgaga gcaggagacg acgagagaac gttcaaattg 1800 gaaaaaacga ccggagaata tcgttatctc caggttcccc cttcattgga gcaacatgta 1860 acagactgtg atgggcaaga aaattgctct gtcagtatcg gatactatag gggagaactg 1920 ataaactcat ctgattggac gagaacagga catgatgatg tctatgttgg ggttaatggg 1980 cttctacgga aagatacagg aaacaagaca atagttctat accctccact catgaaagag 2040 tatcaggaaa tattttcaga tagtggggaa tcagatgatg aggcatttat ttataaacca 2100 gacatacatg agaagaaggg gaagccaaag gaggcagaag atgaaaaaga tgaaaagtca 2160 aaaaagaaca agactcccat tgatgacata aaagattggt ggagcaacat caagggggaa 2220 tggcatctaa tcaaaggaat tctcatcgga ctgtttacat tcgcgcttct gatcggagtc 2280 gtcaaactcg gggttttcat caaatcttcc tttagaaaga ggagagatga ctccataccc 2340 gaggggaaag atgaagaaat aggaatcaag atgcagtcca ggaggtctag acagaatatt 2400 tatgaagaga tcaatgaagt gtcacccact atgacgagaa gaggaagaaa catattcaat 2460 taa 2463 <210> 22 <211> 685 <212> PRT <213> Ekpoma-1 virus <400> 22 Met Lys Lys Thr Thr Arg Arg Ser Ser Ser Glu Thr Met Ile Leu Leu 1 5 10 15 Ile His Leu Pro Val Ile Leu Thr Thr Leu Thr Lys Leu Ile Ser Gly 20 25 30 Asp Leu Ile Asn Phe Pro Phe His Cys Thr Asn Leu Glu Asn Ile Lys 35 40 45 Tyr Ser Asn Leu Ser Cys Pro Thr Val Trp Glu Thr Phe Lys Ile Lys 50 55 60 Thr Gly Asp Lys Val Glu Arg Gly Ser Met Cys Arg Pro Ser Leu His 65 70 75 80 Thr His Asp Leu Glu Glu Gly Tyr Leu Cys Tyr Lys Asp Thr Trp Thr 85 90 95 Thr Thr Cys Asp Glu Ser Trp Tyr Phe Ser Thr Glu Val Lys Tyr Lys 100 105 110 Ile Ile His Glu Glu Val His Asp Ile Asp Cys Leu Asp Ala Leu Ile 115 120 125 Glu Tyr Lys Val Gly Lys Leu Lys Ala Pro Phe Phe Pro Val Ala Thr 130 135 140 Cys Tyr Trp Ala Ser Ser Thr Thr Glu Ser Ile Thr Phe Met Met Ile 145 150 155 160 Lys Pro His Asn Ala Pro Leu Asp Pro Tyr Ser Asn Arg Ile Val Asp 165 170 175 Pro Ile Ile Gln Ala Asp Ser Gly Asp Asn Leu Lys Ile Tyr Arg Thr 180 185 190 Thr Phe Pro Lys Thr Arg Trp Ile Arg Glu Val Asn Thr Thr Leu Glu 195 200 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atttgtacta ttcaaaggag gtcttctagt ctggaacaaa 1800 tacaagacac tacgtcatca aacaaaaaga actccaaaag gaaaaaatag tcaagatccc 1860 gagaaactag atatttttgg gcaaaccgtg taa 1893 <210> 26 <211> 523 <212> PRT <213> Isfahan virus <400> 26 Met Thr Ser Val Leu Phe Met Val Gly Val Leu Leu Gly Ala Phe Gly 1 5 10 15 Ser Thr His Cys Ser Ile Gln Ile Val Phe Pro Ser Glu Thr Lys Leu 20 25 30 Val Trp Lys Pro Val Leu Lys Gly Thr Arg Tyr Cys Pro Gln Ser Ala 35 40 45 Glu Leu Asn Leu Glu Pro Asp Leu Lys Thr Met Ala Phe Asp Ser Lys 50 55 60 Val Pro Ile Gly Ile Thr Pro Ser Asn Ser Asp Gly Tyr Leu Cys His 65 70 75 80 Ala Ala Lys Trp Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys 85 90 95 Tyr Ile Thr His Ser Val His Ser Leu Arg Pro Thr Val Ser Asp Cys 100 105 110 Lys Ala Ala Val Glu Ala Tyr Asn Ala Gly Thr Leu Met Tyr Pro Gly 115 120 125 Phe Pro Pro Glu Ser Cys Gly Tyr Ala Ser Ile Thr Asp Ser Glu Phe 130 135 140 Tyr Val Met Leu Val Thr Pro His Pro Val Gly Val Asp Asp Tyr Arg 145 150 155 160 Gly His Trp Val Asp Pro Leu 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aagttccaat tggcataacg ccttccaact cggatggcta cctgtgtcat 240 gctgccaaat gggtcacaac atgtgatttt cgatggtatg gaccgaagta cataactcac 300 tctgtccaca gcttgagacc aacagtttct gattgtaaag cggccgtaga agcttacaat 360 gctggtactc tcatgtaccc gggttttcct cctgaatctt gtggatatgc atctatcacg 420 gattctgaat tttatgtcat gctagtaact ccgcatcctg ttggagtgga tgattacaga 480 ggacactggg tggatccatt gtttcctact agcgagtgca attccaattt ttgtgagact 540 gttcacaatg ccactatgtg gatcccgaaa gatcttaaaa ctcatgatgt ttgttctcag 600 gacttccaga cgattagggt ttccgtgatg tatcctcaaa ccaaacccac caagggggca 660 gacttgacac tgaaaagtaa gttccatgct cacatgaaag gtgacagagt ctgcaagatg 720 aaattctgca acaaaaatgg gttgcgactg ggaaacggag aatggattga agttggggat 780 gaggtcatgc tcgataactc gaaactcttg agtttattcc cagattgttt ggttggttct 840 gtggtaaaat ccactttgct ctcggaagga gttcaaacag cactgtggga gaccgacaga 900 ctattagatt actcattgtg ccagaacaca tgggaaaaaa tcgatcgaaa agagccgctg 960 tctgctgtgg acctgagcta tcttgcacct agatcacccg gaaaggggat ggcatacatc 1020 gttgccaatg gatctttgat gtctgctcct gctagataca tcagagtttg gattgacagt 1080 cccatactta aggagataaa aggaaagaaa gagtcagcct ccggaattga cactgtcctt 1140 tgggaacaat ggctcccctt caatggaatg gagttaggac ctaatggatt gatcaagacg 1200 aagtcaggtt acaaatttcc gctatatctt cttggaatgg gcattgtaga tcaagatctt 1260 caagagttgt cctcagtgaa ccctgtagac cacccacatg taccaattgc ccaggctttc 1320 gtttcagagg gagaagaagt cttctttggg gatacaggag tctctaaaaa cccaatcgag 1380 ctgatatctg gctggttctc agattggaaa gaaacagcag ccgcattagg gttcgctgca 1440 atatctgtga tcttaattat tggactaatg aggctgttgc cactattatg caggaggaga 1500 aagcaaaaaa aagttatcta caaagacgta gaattaaatt cttttgatcc tagacaagct 1560 tttcacagat ga 1572 <210> 28 <211> 611 <212> PRT <213> Kamese virus <400> 28 Met Ser Tyr Leu Leu Val Ile Ile Leu Ile Thr Ile Asn Arg Leu Tyr 1 5 10 15 Ala Phe Ser Arg Asp Ala Asp His Trp Tyr Val Arg Val Pro His Asp 20 25 30 Gln Ser Trp Phe Asp Asn Val Ile Thr Phe Pro Ile Asp Cys Lys Glu 35 40 45 Pro Trp Gln Gln Ile Thr Ser Gln Asn Leu Asn Cys Pro Ser Phe Asn 50 55 60 Asn Ile Ser 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tggaaactgg 780 tcatctccag aaccaacctg tcaagtgatt cagtgtgagc ctctatcagc accagatttg 840 gggatcatga actgtagcca tcccctggcc agcttcagct ttacctctgc atgtaccttc 900 atctgctcag aaggaactga gttaattggg aagaagaaaa ccatttgtga atcatctgga 960 atctggtcaa atcctagtcc aatatgtcaa aaattggaca aaagtttctc aatgattaag 1020 gagggtgatt ataaccccct cttcattcca gtggcagtca tggttactgc attctctggg 1080 ttggcattta tcatttggct ggcaaggaga ttaaaaaaag gcaagaaatc caagagaagt 1140 atgaatgacc catattaa 1158 <210> 41 <211> 496 <212> PRT <213> Machupo arenavirus <400> 41 Met Gly Gln Leu Ile Ser Phe Phe Gln Glu Ile Pro Val Phe Leu Gln 1 5 10 15 Glu Ala Leu Asn Ile Ala Leu Val Ala Val Ser Leu Ile Ala Val Ile 20 25 30 Lys Gly Ile Ile Asn Leu Tyr Lys Ser Gly Leu Phe Gln Phe Ile Phe 35 40 45 Phe Leu Leu Leu Ala Gly Arg Ser Cys Ser Asp Gly Thr Phe Lys Ile 50 55 60 Gly Leu His Thr Glu Phe Gln Ser Val Thr Leu Thr Met Gln Arg Leu 65 70 75 80 Leu Ala Asn His Ser Asn Glu Leu Pro Ser Leu Cys Met Leu Asn Asn 85 90 95 Ser Phe Tyr Tyr Met Arg Gly Gly 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ttctacagga agctctgaac 60 atcgctttag tggctgttag tctcatagct gtcatcaaag gcatcattaa cctttacaaa 120 agtggtctct tccagttcat cttctttctc ctcctagcag ggaggtcctg ctcggatggc 180 acattcaaaa taggcctaca cactgagttc cagtcagtca cccttaccat gcagagactt 240 ttagctaacc attcaaatga gctcccatct ctctgcatgc ttaacaatag tttttattat 300 atgaggggag gtgtgaacac cttcctgatt cgtgtttctg atatttcagt cctcatgaag 360 gagtatgatg tatcaatcta tgaaccagaa gaccttggaa attgtcttaa caagtctgac 420 tcaagctggg ctattcattg gttctcaaat gctttgggac atgactggct tatggatcct 480 ccaatgctat gtagaaacaa gacaaagaag gagggatcta acattcaatt caacatcagc 540 aaagctgatg atgccagagt gtatggaaag aagataagaa atggtatgag gcatctcttc 600 aggggcttcc atgacccgtg tgaggaaggg aaagtgtgct acctgaccat caatcagtgt 660 ggtgacccca gttcctttga ctactgtggc gtgaatcatc tttccaaatg tcagtttgac 720 catgtgaaca cccttcattt ccttgtgaga agtaagacac atctcaactt tgagaggtct 780 ttgaaagcat ttttctcatg gtctctgaca gactcctcag gaaaggacat gccaggaggt 840 tattgtctag aggaatggat gttgatagca gccaaaatga aatgtttcgg aaacactgct 900 gttgctaaat gtaatcaaaa tcatgactca gagttctgtg atatgctgag gctattcgac 960 tataacaaga atgcaataaa gaccctcaat gatgaatcaa agaaagaaat caatcttcta 1020 agccagacag tgaatgcctt aatctcagat aatttgttaa tgaagaataa aattaaagag 1080 ctaatgagca tcccttattg taattacaca aagttttggt atgtcaatca taccctgaca 1140 gggcagcaca ctcttccaag atgttggttg ataaggaatg gaagttatct taacacttct 1200 gaattcagga atgactggat tttagagagt gatcacctca tctcagagat gttaagtaag 1260 gaatatgctg aaaggcaagg caaaacccca atcacattag ttgatatttg tttctggagc 1320 acaattttct tcacagcatc attgttcctt catctagtcg gaatacccac ccatcgacac 1380 ctcaaaggcg aagcctgtcc tttgcctcat aagctggaca gcttcggagg ttgtagatgt 1440 ggcaaatatc ccagattgaa gaaacccacc atctggcaca aaagacatta a 1491 <210> 43 <211> 511 <212> PRT <213> Cocal virus <400> 43 Met Asn Phe Leu Leu Leu Thr Phe Ile Val Leu Pro Leu Cys Ser His 1 5 10 15 Ala Lys Phe Ser Ile Val Phe Pro Gln Ser Gln Lys Gly Asn Trp Lys 20 25 30 Asn Val Pro Ser Ser Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Gln Asn 35 40 45 Trp His Asn Asp Leu 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gaaaaaaaaa aaaaaaaacg gaattcctcg agggatccgt cgaggaattc 3120 actcctcagg tgcaggctgc ctatcagaag gtggtggctg gtgtggccaa tgccctggct 3180 cacaaatacc actgagatct ttttccctct gccaaaaatt atggggacat catgaagccc 3240 cttgagcatc tgacttctgg ctaataaagg aaatttattt tcattgcaat agtgtgttgg 3300 aattttttgt gtctctcact cggaaggaca tatgggaggg caaatcattt aaaacatcag 3360 aatgagtatt tggtttagag tttggcaaca tatgcccata tgctggctgc catgaacaaa 3420 ggttggctat aaagaggtca tcagtatatg aaacagcccc ctgctgtcca ttccttattc 3480 catagaaaag ccttgacttg aggttagatt ttttttatat tttgttttgt gttatttttt 3540 tctttaacat ccctaaaatt ttccttacat gttttactag ccagattttt cctcctctcc 3600 tgactactcc cagtcatagc tgtccctctt ctcttatgga gatccctcga cggatcggcc 3660 gcaattcgta atcatgtcat agctgtttcc tgtgtgaaat tgttatccgc tcacaattcc 3720 acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat gagtgagcta 3780 actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 3840 gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgctcttc 3900 cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 3960 tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 4020 gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 4080 ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 4140 aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 4200 tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 4260 ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 4320 gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 4380 tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 4440 caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 4500 ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 4560 cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 4620 ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 4680 cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 4740 gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 4800 aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa tcagtgaggc 4860 acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc ccgtcgtgta 4920 gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga taccgcgaga 4980 cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa gggccgagcg 5040 cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt gccgggaagc 5100 tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg ctacaggcat 5160 cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc aacgatcaag 5220 gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg gtcctccgat 5280 cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag cactgcataa 5340 ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt actcaaccaa 5400 gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt caatacggga 5460 taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac gttcttcggg 5520 gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac ccactcgtgc 5580 acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag caaaaacagg 5640 aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa tactcatact 5700 cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga gcggatacat 5760 atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc cccgaaaagt 5820 gccacctaaa ttgtaagcgt taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc 5880 agctcatttt ttaaccaata ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag 5940 accgagatag ggttgagtgt tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg 6000 gactccaacg tcaaagggcg aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca 6060 tcaccctaat caagtttttt ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa 6120 gggagccccc gatttagagc ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg 6180 aagaaagcga aaggagcggg cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta 6240 accaccacac ccgccgcgct taatgcgccg ctacagggcg cgtcccattc gccattcagg 6300 ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg 6360 aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga 6420 cgttgtaaaa 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acatctacgt attagtcatc gctattacca 720 tggtgatgcg gttttggcag tacaccaatg ggcgtggata gcggtttgac tcacggggat 780 ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa aatcaacggg 840 actttccaaa atgtcgtaat aaccccgccc cgttgacgca aatgggcggt aggcgtgtac 900 ggtgggaggt ctatataagc agagctcgtt tagtgaaccg tcagaatttt gtaatacgac 960 tcactatagg gcggccgcga attcggcacg aggcagcaca gcacactccc tttgggcaag 1020 gacctgagac ccttgtgcta agtcaagagg ctcaatgggc tgcagaagaa ctagagaagg 1080 accaagcaaa gccatgatat ttccatggaa atgtcagagc acccagaggg acttatggaa 1140 catcttcaag ttgtgggggt ggacaatgct ctgttgtgat ttcctggcac atcatggaac 1200 cgactgctgg acttaccatt attctgaaaa acccatgaac tggcaaaggg ctagaagatt 1260 ctgccgagac aattacacag atttagttgc catacaaaac aaggcggaaa ttgagtatct 1320 ggagaagact ctgcctttca gtcgttctta ctactggata ggaatccgga agataggagg 1380 aatatggacg tgggtgggaa ccaacaaatc tcttactgaa gaagcagaga actggggaga 1440 tggtgagccc aacaacaaga agaacaagga ggactgcgtg gagatctata tcaagagaaa 1500 caaagatgca ggcaaatgga acgatgacgc ctgccacaaa 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aataaagata ggggggcaat taaaggaagc tctattagat acaggagcag atgatacagt 3000 attagaagaa atgaatttgc caggaagatg gaaaccaaaa atgatagggg gaattggagg 3060 ttttatcaaa gtaggacagt atgatcagat actcatagaa atctgcggac ataaagctat 3120 aggtacagta ttagtaggac ctacacctgt caacataatt ggaagaaatc tgttgactca 3180 gattggctgc actttaaatt ttcccattag tcctattgag actgtaccag taaaattaaa 3240 gccaggaatg gatggcccaa aagttaaaca atggccattg acagaagaaa aaataaaagc 3300 attagtagaa atttgtacag aaatggaaaa ggaaggaaaa atttcaaaaa ttgggcctga 3360 aaatccatac aatactccag tatttgccat aaagaaaaaa gacagtacta aatggagaaa 3420 attagtagat ttcagagaac ttaataagag aactcaagat ttctgggaag ttcaattagg 3480 aataccacat cctgcagggt taaaacagaa aaaatcagta acagtactgg atgtgggcga 3540 tgcatatttt tcagttccct tagataaaga cttcaggaag tatactgcat ttaccatacc 3600 tagtataaac aatgagacac cagggattag atatcagtac aatgtgcttc cacagggatg 3660 gaaaggatca ccagcaatat tccagtgtag catgacaaaa atcttagagc cttttagaaa 3720 acaaaatcca gacatagtca tctatcaata catggatgat ttgtatgtag gatctgactt 3780 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360 365 Glu Tyr Ser Lys Ala Pro Glu Leu Leu Trp Ser Gln Trp Phe Asp Phe 370 375 380 Gly Pro Phe Lys Ile Gly Pro Asn Gly Leu Leu His Thr Gly Lys Thr 385 390 395 400 Phe Lys Phe Pro Leu Tyr Leu Ile Gly Ala Gly Ile Ile Asp Glu Asp 405 410 415 Leu His Glu Leu Asp Glu Ala Ala Pro Ile Asp His Pro Gln Met Pro 420 425 430 Asp Ala Lys Ser Val Leu Pro Glu Asp Glu Glu Ile Phe Phe Gly Asp 435 440 445 Thr Gly Val Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Ile Gln Gly Trp Phe Ser 450 455 460 Asn Trp Arg Glu Ser Val Met Ala Ile Val Gly Ile Val Leu Leu Ile 465 470 475 480 Val Val Thr Phe Leu Ala Ile Lys Thr Val Arg Val Leu Asn Cys Leu 485 490 495 Trp Arg Pro Arg Lys Lys Arg Ile Val Arg Gln Glu Val Asp Val Glu 500 505 510 Ser Arg Leu Asn His Phe Glu Met Arg Gly Phe Pro Glu Tyr Val Lys 515 520 525 Arg

Claims (67)

1. 조혈모세포를 형질도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스로서, 상기 재조합 렌티바이러스는 i) 이종 전이유전자, ii) 바이러스 외피 단백질 및 iii) CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질을 포함하는 재조합 렌티바이러스.
   
2. 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 베지큘로바이러스 외피 단백질인 재조합 렌티바이러스.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 베지큘로바이러스 외피 단백질은 수포성 구내염 바이러스 G(VSV-G), 모레톤(Morreton), 마라바(Maraba), 코칼(Cocal), 알라고아(Alagoa) 및 카라자스(Carajas)로 구성되는 군으로부터 선택되는 베지큘로바이러스 종으로부터 유래하는 재조합 렌티바이러스.
   
4. 제 1 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 아레나바이러스 외피 단백질인 재조합 렌티바이러스.
   
5. 제 4 항에 있어서, 상기 아레나바이러스 외피 단백질은 마츄포(Machupo) 바이러로부터 유래하는 재조합 렌티바이러스.
   
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행되는 재조합 렌티바이러스.
   
7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 렌티바이러스.
   
8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43의 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 재조합 렌티바이러스.
   
9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43의 아미노산 서열로 구성되는 재조합 렌티바이러스.
   
10. 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 도 4에 표시된 CD34 세포 형질도입 결정자 내 이들의 각 위치의 31 개 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 재조합 렌티바이러스.
    
11. 제 1 항 내지 제 3 항 또는 제 6 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 도 4에 표시된 CD34 세포 형질도입 결정자 내 이들의 각 위치의 31 개 아미노산 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 개 전부를 포함하는 재조합 렌티바이러스.
    
12. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 서열번호 41의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행되는 재조합 렌티바이러스.
    
13. 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 렌티바이러스.
    
14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈모세포는 인간 세포인 재조합 렌티바이러스.
    
15. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈모세포는 인간 CD34+ 세포인 재조합 렌티바이러스.
    
16. 제 1 항 내지 제 15 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 벡터를 더 포함하며, 상기 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 이종 전이유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스.
    
17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스가 자체 활성화(SIN) LTR을 포함하는 재조합 렌티바이러스.
    
18. 제 1 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 전이유전자가 인간 단백질을 암호화하는 재조합 렌티바이러스.
    
19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 전이유전자가 인간 헤모글로빈 단백질을 암호화하는 재조합 렌티바이러스.
    
20. 제 1 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질은 상기 재조합 렌티바이러스의 표면에 존재하는 재조합 렌티바이러스.
    
21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서,상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 상기 단백질은 L-셀렉틴인 재조합 렌티바이러스.
    
22. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질은 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행되는 재조합 렌티바이러스.
    
23. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질은 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 재조합 렌티바이러스.
    
24. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질은 서열번호 39의 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 재조합 렌티바이러스.
    
25. 제 1 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질은 서열번호 39의 아미노산 서열로 구성되는 재조합 렌티바이러스.
    
26. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 상기 외피 단백질을 발현하는 벡터와 L-셀렉틴을 발현하는 상기 벡터의 농도비가 1:2 내지 1:5 범위인 세포에 의해 생산되는 재조합 렌티바이러스.
    
27. 제 1 항 내지 제 25 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외피 단백질과 L-셀렉틴의 농도비가 1:2 내지 1:5 범위인 재조합 렌티바이러스.
    
28. (i) 이종 전이유전자; (ii) 바이러스 외피 단백질; 및 (iii) CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질;을 포함하는 재조합 렌티바이러스를 상기 조혈모세포에 형질도입하는 단계를 포함하는 조혈모세포 내로 이종 전이유전자를 도입하는 방법.
    
29. 제 28 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 베지큘로바이러스 외피 단백질인 방법.
    
30. 제 29 항에 있어서, 상기 베지큘로바이러스 외피 단백질은 수포성 구내염 바이러스 G(VSV-G), 모레톤(Morreton), 마라바(Maraba), 코칼(Cocal), 알라고아(Alagoa) 및 카라자스(Carajas)로 구성되는 군으로부터 선택되는 베지큘로바이러스 종으로부터 유래하는 것인 방법.
    
31. 제 28 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 아레나바이러스 외피 단백질인 방법.
    
32. 제 31 항에 있어서, 상기 아레나바이러스 외피 단백질은 마츄포(Machupo) 바이러스로부터 유래하는 것인 방법.
    
33. 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행되는 방법.
    
34. 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질이 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
    
35. 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43의 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 방법.
    
36. 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36 또는 43의 아미노산 서열로 구성되는 방법.
    
37. 제 28 항 내지 제 30 항 또는 제 33 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 도 4에 표시된 CD34 세포 형질도입 결정자 내 이들의 각 위치의 31 개 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 방법.
    
38. 제 28 항 내지 제 30 항 또는 제 33 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 도 4에 표시된 CD34 세포 형질도입 결정자 내 이들의 각 위치의 31 개 아미노산 중 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30 또는 31 개 전부를 포함하는 방법.
    
39. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 서열번호 41의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행되는 방법.
    
40. 제 31 항 또는 제 32 항에 있어서, 상기 바이러스 외피 단백질은 서열번호 41의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
    
41. 제 28 항 내지 제 40 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈모세포가 인간 세포인 방법.
    
42. 제 28 항 내지 제 41 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈모세포가 인간 CD34+ 세포인 방법.
    
43. 제 28 항 내지 제 42 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러는 벡터를 포함하며, 상기 벡터는 프로모터에 작동 가능하게 연결된 상기 이종 전이유전자를 포함하는 방법.
    
44. 제 28 항 내지 제 43 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스가 자체 활성화(SIN) LTR을 포함하는 방법.
    
45. 제 28 항 내지 제 44 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이종 전이유전자가 인간 헤모글로빈 단백질을 암호화하는 방법.
    
46. 제 28 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질이 상기 재조합 렌티바이러스의 표면에 존재하는 방법.
    
47. 제 28 항 내지 제 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질이 L-셀렉틴인 방법.
    
48. 제 28 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질이 서열번호 39의 아미노산 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하며, 상기 서열 비교는 두 서열의 전체 길이에 걸쳐 수행되는 방법.
    
49. 제 28 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질이 서열번호 39의 아미노산 서열을 포함하는 방법.
    
50. 제 28 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질이 서열번호 39의 아미노산 서열로 본질적으로 구성되는 방법.
    
51. 제 28 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인간 CD34+ 세포 결합용 리간드인 단백질이 서열번호 39의 아미노산 서열로 구성되는 방법.
    
52. 제 28 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합 렌티바이러스는 상기 외피 단백질을 발현하는 벡터와 L-셀렉틴을 발현하는 상기 벡터의 농도비가 1:2 내지 1:5 범위인 세포에 의해 생산되는 방법.
    
53. 제 28 항 내지 제 52 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 외피 단백질과 L-셀렉틴의 농도비가 1:2 내지 1:5 범위인 방법.
    
54. 제 28 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 단계가 부착성 조혈모세포 상에서 수행되는 방법.
    
55. 제 28 항 내지 제 53 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질도입 단계가 부유 상태의 조혈모세포 상에서 수행되는 방법.
    
56. 조혈모세포를 형질도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스로서, 상기 재조합 렌티바이러스는 이종 전이유전자; 및 수포성 구내염 바이러스 G(VSV-G), 모레톤(Morreton), 마라바(Maraba), 코칼(Cocal), 알라고아(Alagoa) 및 카라자스(Carajas)로 구성되는 군으로부터 선택되는 베지큘로바이러스 종으로부터 유래하는 바이러스 외피 단백질;을 포함하는 재조합 렌티바이러스.
    
57. 조혈모세포를 형질도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스로서, 상기 재조합 렌티바이러스는 이종 전이유전자; 및 도 4에 표시된 CD34 세포 형질도입 결정자 내 이들의 각 위치의 31 개 아미노산 중 적어도 하나를 포함하는 바이러스 외피 단백질;을 포함하는 재조합 렌티바이러스.
    
58. 조혈모세포를 형질도입할 수 있는 재조합 렌티바이러스로서, 상기 재조합 렌티바이러스는 이종 전이유전자; 및 제1형 트랜스페린 수용체(TfnR1)를 사용하여 세포를 감염시킬 수 있는 아레나바이러스 종으로부터 유래하는 바이러스 외피 단백질;을 포함하는 재조합 렌티바이러스.
    
59. 제 58 항에 있어서, 상기 아레나바이러스 외피 단백질은 마츄포(Machupo) 바이러스로부터 유래하는 재조합 렌티바이러스.
    
60. 제 1 항 내지 제 27 항 또는 제 56 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 렌티바이러스; 및 약학적으로 허용되는 담체;를 포함하는 조성물.
    
61. 제 1 항 내지 제 27 항 또는 제 56 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 렌티바이러스 또는 제 60 항에 따른 조성물로 형질도입된 조혈모세포를 투여하는 단계를 포함하는 이상혈색소 증상의 치료방법.
    
62. 제 61 항에 있어서, 상기 이상혈색소 증상은 겸상 적혈구성 빈혈 또는 지중해 빈혈인 방법.
    
63. 이상혈색소 증상을 치료하기 위한 약제의 제조를 위한, 제 1 항 내지 제 27 항 또는 제 56 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 렌티바이러스 또는 제 60 항에 따른 조성물로 형질도입된 조혈모세포의 용도.
    
64. 제 63 항에 있어서, 상기 이상혈색소 증상은 겸상 적혈구성 빈혈 또는 지중해 빈혈인 용도.
    
65. 없음
    
66. 제 1 항 내지 제 27 항 또는 제 56 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 렌티바이러스로 형질도입된 조혈모세포를 포함하는 이상혈색소 증상 치료용 조성물.
    
67. 제 66 항에 있어서, 상기 이상혈색소 증상은 겸상 적혈구성 빈혈 또는 지중해 빈혈인 조성물.

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