MXPA02001514A

MXPA02001514A - Gen de streptomyces avermitilis que dirige la relacion de avermectinas b2:b1.

Info

Publication number: MXPA02001514A
Application number: MXPA02001514A
Authority: MX
Inventors: Jonelle Stutzman-Engwall Kim
Original assignee: Pfizer Prod Inc
Priority date: 1999-08-12
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2002-07-02
Also published as: US20030134313A1; US20030129636A1; US20010016350A1; JP2005198658A; WO2001012822A1; KR20020022809A; SK1382002A3; NO20020665L; NO20020665D0; HUP0202517A2; IL147562A0; DE60016231T2; US7029887B2; IS6249A; US20030129635A1; BR0013093A; AU5702100A; PT1200605E; EP1200605A1; PE20010697A1

Abstract

La presente invencion se refiere a moleculas polinucleotidicas que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican un producto genico AveC, moleculas polinucleotidicas que pueden usarse para alterar la relacion o cantidad de avermectinas de clases 2:1 producidas en cultivos de fermentacion de S. avermitilis. La presente invencion se refiere ademas a vectores, celulas huesped y cepas mutantes de S. avermitilis en las que el gen aveC se ha inactivado o mutado para cambiar la relacion-o. cantidad de avermectinas de clases 2:1 producidas.

Description

GEN DE STREPTOMYCES AVERMITILIS QUE DIRIGE LA RELACIÓN DE AVERMECTINAS B2:B1 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para producir avermectinas y, principalmente, se refiere al campo de la salud animal. Más particularmente, la presente invención se refiere a moléculas polinucleotídicas que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican un producto génico AveC, que puede usarse para modular la relación de avermectinas de clases.2:1 producidas por la fermentación de cultivos de Streptomyces avermitilis, y a composiciones y procedimientos para seleccionar tales moléculas polinucleotídicas. La presente invención además se refiere a vectores, células huésped transformadas y nuevas cepas mutantes de S. avermitilis en las que el gen aveC se ha mutado para modular la relación de avermectinas de clase 2:1 producidas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Avermectinas Las especies de Streptomyces producen una amplia diversidad de metabolitos secundarios, incluyendo las avermectinas, que comprenden una serie de ocho lactonas macrocíclicas de dieciséis miembros relacionadas que tienen una potente actividad antihelmíntica e insecticida. Los ocho compuestos distintos pero muy relacionados se denominan A1a, A1b, A2a, A2b, B1a, B1b, B2a y B2b. La serie "a" de compuestos se refiere a la avermectina natural en la que el sustituyente en la posición C25 es (S) -sec- butilo y la serie "b" se refiere a los compuestos en los que el sustituyente en la posición C25 es isopropilo. Las denominaciones "A" y "B" se refieren a avermectinas en las que el sustituyente en la posición C5 es metoxi e hidroxi, respectivamente. El número "1" se refiere a avermectinas en las que está presente un doble enlace en la posición C22, 23 y el número "2 se refiere a avermectinas que tienen un hidrógeno en la posición C22 y un hidroxi en la posición C23. Entre las avermectinas relacionadas, el tipo B1 de avermectinas se reconoce como el que tiene la actividad antiparasitaria y pesticida más eficaz y, por lo tanto, es la avermectina más deseable desde el punto de vista comercial. En las Patentes de Estados Unidos 4.310.519 y 4.429.042 se describen las avermectinas, y su producción mediante fermentación aerobia de cepas de S. avermitilis. Se cree que la biosíntesis de las avermectinas naturales se inicia endógenamente a partir de los análogos del tioéster de CoA del ácido isobutírico y del ácido S-(+)-2-metil butírico. Una combinación de la mejora de cepas mediante mutagénesis aleatoria y el uso de ácidos grasos suministrados exógenamente, ha conducido a la producción eficaz de análogos de avermectina. Los mutantes 'r de S. avermitilis que son deficientes en la 2-oxo ácido deshidrogenasa de cadena ramificada (mutantes deficientes en bkd), sólo puede producir avermectinas cuando las fermentaciones se suplementan con ácidos grasos. En la Patente europea (EP) 276103, se describe la selección y aislamiento de mutantes deficientes en la actividad de deshidrogenasa de cadena ramificada (por ejemplo, S. avermitilis, ATCC 53567). La fermentación de tales mutantes en presencia de ácidos grasos suministrados exógenamente, da como resultado la producción de sólo las cuatro avermectinas que corresponden al ácido graso empleado. Así pues, la suplementación de las fermentaciones de S. avermitilis (ATCC 53567) con ácido S-(+) -2-metilbutírico, da como resultado la producción de las avermectinas naturales A1a, A2a, B1a y B2a; la suplementación de las fermentaciones con ácido isobutírico, da como resultado la producción de las avermectinas naturales A1b, A2b, B1 b y B2b; y la suplementación de las fermentaciones con ácido ciclopentanocarboxílico da como resultado la producción de las cuatro nuevas ciclopentilavermectinas A1. A2, B1 y B2. Si se suplementa con otros ácidos grasos, se producen nuevas avermectinas. Mediante la selección entre más de 800 precursores potenciales, se han identificado más de 60 nuevas avermectinas distintas. (Véase, por ejemplo, Dutton y col., 1991 , J. Antibiot. 44:357-365; y. Banks y col., 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). Además, los mutantes de S. avermitilis deficientes en la actividad de 5-O-metiltransferasa producen esencialmente sólo las avermectinas del análogo B. Por consiguiente, los mutantes de S. avermitilis que carecen de las actividades de 2-oxo ácido deshidrogenasa de cadena ramificada y 5-O-metil-transferasa producen sólo las avermectinas B que corresponden al ácido graso empleado para suplementar la fermentación. Así pues, cuando se suplementan tales dobles mutantes con el ácido S-(+) -2-metilbutírico, se obtiene la producción sólo de las avermectinas naturales B1a y B2a, mientras que la suplementación con el ácido isobutírico o el ácido ciclopentanocarboxílico da como resultado la producción de las avermectinas naturales B1b o B2b o las nuevas ciclopentil avermectinas B1 y B2, respectivamente. La suplementación de la cepa mutante doble con ácido ciciohexano carboxílico es un procedimiento preferido para producir la nueva avermectina importante desde el punto de vista comercial, ciclohexilavermectina B1 (doramectina). En el documento EP 276103 se describe el aislamiento y las características de tales dobles mutantes, por ejemplo, S. avermitilis (ATCC 53692). 2.2 Genes Implicados en la Biosíntesis de Avermectinas En muchos casos, los genes implicados en la producción de metabolitos secundarios y los genes que codifican un antibiótico particular, se encuentran agrupados en el cromosoma. Tal es el caso, por ejemplo, del grupo de genes de la policeturo sintasa (PKS) de Streptomyces (véase Hopwood y Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:37-66). Así pues, una estrategia para clonar genes en una ruta biosintética ha sido aislar un gen de resistencia a fármacos y después ensayar las regiones adyacentes del cromosoma con respecto a otros genes relacionados con la biosíntesis de ese antibiótico particular. Otra estrategia para la clonación de genes implicados en la biosíntesis de metabolitos importantes ha sido la complementación de mutantes. Por ejemplo, se introducen porciones de una biblioteca de ADN procedente de un organismo capaz de producir un metabolito particular, en un mutante no productor y se seleccionan los transformantes con respecto a la producción del metabolito. Además, se ha usado la hibridación de una biblioteca usando sondas derivadas de otras especies de Streptomyces para identificar y clonar genes en rutas biosintéticas. Los genes implicados en la biosíntesis de avermectinas (genes ave), de la misma forma que los genes necesarios para la biosíntesis de otros metabolitos secundarios de Streptomyces (por ejemplo, PKS), se encuentran agrupados en el cromosoma. Se han clonado satisfactoriamente varios genes ave usando vectores para complementar mutantes de S. avermitilis bloqueados en la biosíntesis de avermectinas. La clonación de tales genes se describe en la Patente de Estados Unidos 5.252.474. Además, Ikeda y col., 1995, J. Antibiot. 48:532-534, describe la localización de una región cromosómica que implica la etapa de deshidratación C22, 23 (aveC) en un fragmento BamHl de 4,82 Kb de S. avermitilis, así como mutaciones en el gen aveC que dan como resultado la producción de un productor de B2a de un solo componente. Como la ivermectina, un potente compuesto antihelmíntico, puede producirse químicamente a partir de la avermectina B2a, tal productor de un solo componente de avermectina B2a se considera particularmente útil para la producción comercial de ivermectina. La identificación de mutaciones en el gen aveC que minimizan la complejidad de la producción de avermectinas; tales como, por. ejemplo, mutaciones que reducen la relación B2:B1 de avermectinas, simplificaría la producción y purificación de las avermectinas importantes desde el punto de vista comercial.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una molécula polinucleotídica aislada que comprende la ORF completa de aveC de S. avermitilis o una porción sustancial de la misma, molécula polinucleotídica aislada que carece de la siguiente ORF completa que se localiza cadena abajo de la ORF de aveC in situ en el cromosoma de S. avermitilis. La molécula polinucleotídica aislada de la presente invención preferiblemente comprende una secuencia de nucleótidos que es igual que la secuencia que codifica el producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o es la misma que la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1) o una porción sustancial de la misma. La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica aislada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o una variante degenerada de la misma. La presente Invención proporciona además una molécula -^-*- * • — ..^j ^^ . ^*¡¿* ^^^á¿Í?A polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que es homologa a la secuencia codificante del producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604), a la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC presentada en la FIGURA 1 (SEC ID NO:1 ) o a una porción sustancial de la misma. La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es homologa a la" secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia que codifica el producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604), la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SE,C ID NO:2) o una porción sustancial de la misma. La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico homólogo a AveC. En una realización preferida, la molécula polinucleotídica aislada comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico homólogo a AveC de S. hygroscopicus, producto génico homólogo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:4 o una porción sustancial de la misma. En una realización preferida, la molécula polinucleotídica aislada de la presente invención que codifica el producto génico homólogo a AveC de S. hygroscopicus, comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3 o una porción sustancial de la misma.

La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que es homologa a la secuencia de nucleótidos de S. hygroscopicus de la SEC ID NO:3. La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es homólogo al producto génico homólogo a AveC de S. hygroscopicus que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4. La presente invención proporciona además oligonucleótidos que hibridan con una molécula polinucleotídica que tiene la secuencia de nucleótidos de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1 ) o SEC ID NO:3, o con una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que es el complemento de la secuencia de nucleótidos de la FIGURA 1 (SEC ID NO:1) o SEC ID NO: 3. . La presente invención proporciona además vectores de clonación y vectores de expresión recombinantes que son útiles en la clonación o expresión de un polinucleótido de la presente invención, incluyendo moléculas polinucleotídicas que comprenden la ORF de aveC de S. avermitilis o una ORF homologa de aveC. En una realización no limitante, la presente invención proporciona el plásmido pSE186 (ATCC 209604), que comprende la ORF entera del gen aveC de S. avermitilis. La presente invención proporciona además células huésped transformadas que comprenden una molécula polinucleotídica o un vector recombinante de la ..¿¡¿4 invención, y nuevas cepas o líneas celulares derivadas de las mismas. La presente invención proporciona además un producto génico AveC expresado de forma recombinante, un producto génico homólogo a AveC o una porción sustancial de los mismos, que se ha purificado o aislado sustancialmente, así como homólogos de los mismos. La presente invención proporciona además un procedimiento para producir un producto génico AveC recombinante, que comprende cultivar una célula huésped transformada con un vector de expresión recombinante, comprendiendo dicho vector de expresión recombinante una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia ,de, nucleótidos que codifica un producto génico AveC o un producto génico homólogo a AveC, molécula polinucleotídlca que está en asociación operativa con uno o más elementos reguladores que controlan la expresión de la molécula polinucleotídica en la célula huésped, en condiciones que conducen a la producción del producto génico AveC recombinante o el producto génico homólogo a AveC, y recuperar el producto génico AveC o el producto génico homólogo a AveC del cultivo de células. La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que por lo demás es igual a la del alelo AveC de S. avermitilis, o la secuencia que codifica el producto génico Avec del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o una variante degenerada de la misma, o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como se presenta en la FIGURA 1 (SEC ID NO:1) o una variante degenerada de la misma, pero que comprende además una o más mutaciones, de forma que las células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis en las que el alelo aveC de tipo silvestre se ha inactivado y expresa la molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mutada, producen una relación o cantidad diferente de avermectinas que la producida por células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis que en su lugar expresan sólo el alelo aveC de tipo silvestre. De acuerdo con la presente invención, tales moléculas polinucleotídicas pueden usarse para producir nuevas cepas de S. avermitilis que presentan un cambio detestable en la producción de avermectinas en comparación con la misma cepa que en su lugar expresa sólo el alelo aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, tales moléculas polinucleotídicas son útiles para producir nuevas cepas de S. avermitilis que producen avermectinas en una relación reducida de clases 2:1 en comparación con la de la misma cepa que en su lugar expresa sólo el alelo aveC de tipo silvestre. En otra realización preferida, tales moléculas polinucleotídicas son útiles para producir nuevas cepas de S. avermitilis que producen mayores niveles de avermectinas en comparación con la misma cepa que en su lugar expresa sólo el alelo aveC de tipo silvestre. En otra realización preferida, tales moléculas polinucleotídicas son útiles para producir nuevas cepas de S. avermitilis en las que se ha inactivado el gen aveC. La presente invención proporciona procedimientos para identificar mutaciones de la ORF de aveC de S. avermitilis capaces de alterar la relación y/o cantidad de avermectinas producidas. En una realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar ÉÉÉ il í luí ?*-*-faj^t ¿-.»A^~ mutaciones de la ORF de aveC capaces de alterar la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas, que comprende: (a) determinar la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por células de una cepa de S. avermitilis en las que se ha inactivado el alelo de aveC nativo, y dentro de las cuales se ha introducido y se está expresando una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico AveC mutado; (b) determinar la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por células de la misma cepa de S. avermitilis que en la etapa (a) pero que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, la ORF de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1 ) o una secuencia de nucleótidos que es homologa a la misma; y (c) comparar la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (a) con la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (b); de tal forma que si la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (a) es diferente de la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (b), entonces se ha identificado una mutación de la ORF de aveC capaz de alterar la relación de avermectinas de clases 2:1. En una realización preferida, la relación de avermectinas de clases 2:1 se reduce por la mutación. En otra realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar mutaciones de la ORF de aveC ó construcciones genéticas que comprenden la ORF de aveC, capaces de "-"*'^J" -'-* "*•* --^^^^-^-ü|^ |fHgÜ|ÜÍ| alterar la cantidad de avermectinas producidas, que comprende: (a) determinar la cantidad de avermectinas producidas por las células de una cepa de S. avermitilis en la que se ha inactivado el alelo aveC nativo, y dentro de la cual se ha introducido y se está expresando una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico AveC mutado o que comprende una construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico AveC; (b) determinar la cantidad de avermectinas producidas por las células de ia misma cepa de S. avermitilis que en la etapa (a) pero que en su lugar expresan sólo un alelo de aveC que tiene la secuencia de nucleótidos de la ORF de la FIGURA 1 (SEC ID NO:1) o una secuencia de nucleótidos que es homologa a la misma; y (c) comparar la cantidad de avermectinas producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (á) con la cantidad de avermectinas producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (b); de tal forma que si la cantidad de avermectinas producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (a) es diferente de la cantidad de avermectinas producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (b), entonces se ha identificado una mutación de la ORF de aveC o una construcción genética capaz de alterar la cantidad de avermectinas. En una realización preferida, la cantidad de avermectinas producidas se aumenta por la mutación. La presente invención proporciona además vectores recombinantes que son útiles para fabricar nuevas cepas de S. avermitilis que tienen alterada la producción de avermectinas. Por ejemplo, la presente íiíríÁ.-Ú. -Ák¿_..íkil1¡Í ,&..*____ ^^^^ á ^^^ invención proporciona vectores que pueden usarse para dirigir cualquiera de las moléculas polinucleotídicas que comprenden las secuencias de nucleótidos mutadas de la presente invención, al sitio del gen aveC del cromosoma de S. avermitilis, para insertar o reemplazar el alelo de aveC, la ORF o una porción de la, misma mediante recombinación homologa. Sin embargo, de acuerdo con la presente invención, una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos mutada de la presente invención proporcionada por la misma también puede actuar modulando la biosíntesis de avermectina cuando se inserta en el cromosoma de S. avermitilis en un sitio distinto del gen aveC, o cuando se mantiene episomalmente en las células de S. avermitilis. Así pues, la presente invención también proporciona vectores que comprenden una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos mutada de la presente invención, vectores que pueden usarse para insertar la molécula polinucleotídica en un sitio en el cromosoma de S. avermitilis distinto del gen aveC o para que se mantenga episomalmente. En una realización preferida, la presente invención proporciona vectores de reemplazo génico que pueden usarse para insertar un alelo de aveC mutado en el cromosoma de S. avermitilis para generar nuevas cepas de células que producen avermectinas en una relación reducida de clase 2:1 en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo aveC de tipo silvestre. La presente invención proporciona además procedimientos para obtener nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que expresan un alelo de aveC mutado y que producen relaciones y/o cantidades alteradas de avermectinas en comparación con las células de la misma cepa de S. avermitilis que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para fabricar nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que expresan un alelo aveC mutado y que producen una relación alterada de avermectinas de clases 2:1 en comparación con las células de la misma cepa de S. avermitilis que en su lugar expresan sólo un alelo de aveC de tipo silvestre, que comprende transformar las células de una cepa de S. avermitilis con un vector que lleva un alelo de aveC mutado y que codifica un producto génico que altera la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo mutado en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, y seleccionar las células transformadas que producen avermectinas en una relación alterada de clases 2:1 en comparación con la relación de clases 2:1 producida por las células de la cepa que en su lugar expresan el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas se reduce en las células de la nueva cepa. En otra realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para fabricar nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que producen cantidades alteradas de avermectina, que comprende transformar células de una cepa de S. avermitilis con un vector que lleva un alelo de aveC mutado o una construcción genética que comprende el alelo de aveC, cuya expresión da como resultado una cantidad alterada de avermectinas producidas por las células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo de aveC mutado o la construcción genética en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, y seleccionar, las células transformadas que producen avermectinas en una cantidad alterada en comparación con la cantidad de avermectinas producidas por las células de la cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, En una realización preferida, la cantidad, de avermectinas producidas se aumenta en las células de la nueva cepa. En otra realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener nuevas cepas de S. avermitilis, cuyas células comprenden un alelo de aveC ¡nactivado, que comprende transformar, células de una cepa de S. avermitilis que expresan cualquier alelo de aveC con un vector que inactiva el alelo de aveC, y seleccionar las células transformadas en las que se ha inactivado el alelo de aveC. La presente invención proporciona además nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que se han transformado con cualquiera de las moléculas polinucleotídicas o vectores que comprenden una secuencia de nucleótidos mutada de la presente invención. En una realización preferida, la presente invención proporciona nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que expresan un alelo de aveC mutado en lugar de o además del alelo de aveC de tipo silvestre, donde las células de la nueva cepa producen avermectinas en una relación alterada de clases 2:1 en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo aveC de tipo silvestre. En una realización más preferida, las células de la nueva cepa producen avermectinas en una relación reducida de clases 2:1 en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. Tales nuevas cepas son útiles en la producción a gran escala de avermectinas deseables desde el punto de vista comercial, tales como la doramectina En otra realización preferida, la presente invención proporciona nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que expresan una alelo de aveC mutado, o una construcción genética que comprende el alelo de aveC, en lugar de o además del alelo de aveC nativo, que da como resultado la producción por las células de una cantidad alterada de avermectinas en comparación con la cantidad de avermectinas producidas por las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, las nuevas células producen una mayor cantidad de avermectinas. En otra realización preferida, la presente invención proporciona nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células en las que se ha inactivado el gen aveC. Tales cepas son útiles para el diferente espectro de avermectinas que producen en comparación con la cepa de tipo silvestre, y en ensayos de selección de complementación como los descritos en este documento, para determinar si la mutagénesis dirigida o aleatoria del gen aveC afecta a la producción de avermectinas. La presente invención proporciona además un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar células de una cepa de S. avermitilis, células que expresan un alelo de aveC mutado que codifica un producto génico que altera la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo de aveC mutado en comparación con las células de la misma cepa que no expresan el alelo de aveC mutado sino que en su lugar expresan sólo el alelo aveC de tipo silvestre, en un medio de cultivo en condiciones que permiten o inducen la producción de avermectinas, y recuperar dichas avermectinas del cultivo. En una realización preferida, se reduce la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por células que expresan la mutación. Esté procedimiento proporciona una mayor eficacia en la producción de avermectinas valiosas desde el punto de vista comercial, tales como la doramectina. La presente invención proporciona además un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar células de una cepa de S. avermitilis, células que expresan un alelo de aveC mutado o una construcción genética que comprende un alelo de aveC que da como resultado la producción de una cantidad alterada de avermectinas producidas por las células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo de aveC mutado o una construcción genética, en comparación con las células de la misma cepa ? que no expresan el alelo de aveC mutado o la construcción genética sino que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, en un medio de cultivo en condiciones que permiten o inducen la producción de avermectinas, y recuperar dichas avermectinas del cultivo. En una realización preferida, se aumenta la cantidad de avermectinas producidas por las células que expresan la mutación o la construcción genética. La presente invención proporciona además una nueva composición de avermectinas producidas por una cepa de S. avermitilis que expresa un alelo de aveC mutado de la presente invención, donde las avermectinas se producen en una relación reducida de clases 2:1 en comparación con la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por células de la misma cepa de S. avermitilis que no expresan el alelo de aveC mutado sino que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. La nueva composición de avermectinas puede estar presente según se produce en el fluido de cultivo de fermentación o puede recogerse a partir de dicho fluido y puede purificarse parcial o sustancialmente a partir del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS FIGURA 1. Secuencia de ADN (SEC ID NO: 1 ) que comprende la ORF de aveC de S. avermitilis y la secuencia de aminoácidos deducida (SEC ID NO:2). FIGURA 2. Vector plasmídico pSE186 (ATCC 209604) que comprende la ORF entera del gen aveC de S. avermitilis.

FIGURA 3. Vector de reemplazo génico pSE180 (ATCC 209605) que comprende el gen ermE de Sacc. erythraea insertado en la ORF de aveC de S. avermitilis. FIGURA 4. Mapa de restricción BamHl del grupo de genes de la policeturo sintasa de avermectina de S. avermitilis con cinco clones de cósmidos solapantes identificados (es decir, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68 y pSE69). También se indica la relación de pSE118 y pSE119. FIGURA 5. Análisis de HPLC de los productos de fermentación producidos por las cepas de S. avermitilis. La cuantificación de los picos se realizó por comparación con cantidades patrón de ciciohexil B1. El tiempo de retención de ciciohexil B2 fue de 7,4-7,7 minutos; el tiempo de retención de ciciohexil B1 fue de 11 ,9-12,3 min..FIG. 5A. Cepa SE180-11 de S. avermitilis con una ORF de aveC inactivada. FIG. 5B. Cepa SE180-11 de S. avermitilis transformada con pSE186 (ATCC 209604). PIG..5C. Cepa SE18011 de S. avermitilis transformada con pSE187. FIG. 5D. Cepa SE180-11 de S. avermitilis transformada con pSE188. FIGURA 6. Comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas codificadas por la ORF de aveC de S. avermitilis (SEC ID NO: 2), una ORF parcial homologa a aveC de S. griseochromogenes (SEC ID NO: 5) y la ORF homologa a aveC de S. hygroscopicus (SEC ID NO: 4). El resto de valina en negritas es el supuesto sitio de iniciación para la proteína. Los restos conservados se muestran en letras mayúsculas para mostrar la homología en las tres secuencias y en letras minúsculas para mostrar la homología en 2 de ^^^^^•,-r.r...^.,....,...^.. . ,. s,. . - ft -v f ?r ^flt^iMálí^ití^^ÉM iMrm las 3 secuencias. Las secuencias de aminoácidos contienen aproximadamente un 50% de identidad de secuencia. FIGURA 7. Construcción de un plásmido híbrido que contiene un fragmento BsaAl/Kpnl de 564 pb del gen homólogo de aveC de S. hygroscopicus insertado en el sitio BsaAl/Kpnl en la ORF de aveC de S. avermitilis.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a la identificación y caracterización de moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias de nucleótidos que codifican el producto génico AveC de Streptomyces avermitilis, a la construcción de nuevas cepas de S. avermitilis que pueden usarse para seleccionar los productos génicos AveC mutados con respecto a su efecto sobre la producción de avermectinas, y al descubrimiento de que ciertos producto génicos AveC mutados pueden reducir la relación de avermectinas B2:B1 producidas por S. avermitilis. A modo de ejemplo, la invención se describe en las secciones mostradas más adelante en relación con una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que es igual a la secuencia que codifica el producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o la secuencia de nucleótidos de la ORF de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1), y en relación con moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias de nucleótidos mutadas derivadas de las mismas y variantes degeneradas de las mismas. Sin embargo, los principios indicados en la presente invención pueden aplicarse análogamente a otras moléculas polinucleotídicas, incluyendo genes homólogos a aveC de otras especies de Streptomyces que incluyen, por ejemplo, S. hygroscopicus y S. griseochromogenes, entre otros.

Moléculas Polinucleotídicas que Codifican el Producto Génico AveC de S. avermitilis La presente invención proporciona una molécula polinucleotídica aislada que comprende la ORF de aveC completa de S. avermitilis o una porción sustancial de la misma, molécula polinucleotídica aislada que carece de la siguiente ORF completa que está localizada cadena abajo de la ORF de aveC in situ en el cromosoma de S. avermitilis. La molécula polinucleotídica aislada de la presente invención preferiblemente comprende una secuencia de nucleótidos que es igual que la secuencia que codifica el producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o que es la misma que la secuencia de nucleótidos de la ORF de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1 ) o una porción sustancial de la misma. Como se usa en este documento, una "porción sustancial" de una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico AveC de S. avermitilis significa una molécula polinucleotídica aislada que comprende al menos aproximadamente un 70% de la secuencia completa de la ORF de aveC -• J- J - -»-- - --- • - r?itt [Titiiifilitti^^^ mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1 ), y que codifica un producto génico AveC funcionalmente equivalente. A este respecto, un producto génico AveC "funcionalmente equivalente" se define como un producto génico que, cuando se expresa en la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis en la que se ha inactivado el alelo de aveC nativo, produce sustancialmente la misma relación y cantidad de avermectinas que las producidas por la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis que en su lugar expresa sólo el alelo de aveC funcional de tipo silvestre nativo para la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis. Además de la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC, la molécula polinucleotídica aislada de la presente invención puede comprender adicionalmente secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural el gen aveC in situ en S. avermitilis, tales como las que flanquean las secuencias de nucleótidos mostradas en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1 ). La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica aislada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 1 o una variante degenerada de la misma. Como se usa en este documento, los términos "molécula polinucleotídica", "secuencia polinucleotídica", "secuencia codificante", "fase de lectura abierta" y "ORF", pretenden hacer referencia tanto a las moléculas de ADN como a las moléculas de ARN, que pueden ser de una sola cadena o de doble cadena y que pueden transcribirse y traducirse (ADN) o traducirse (ARN) en un producto génico AveC o, como se describe más adelante, en un, producto génico homólogo a AveC, o en un polipéptido que es homólogo a un ^i^,^ ...... , **^> .^^^^.^.^^^^^^^^^ ^ producto génico AveC o un producto génico homólogo a AveC, en un sistema de expresión de células huésped apropiado, cuando se ponen bajo el control de los elementos reguladores apropiados, Una secuencia codificante puede incluir, pero sin limitación, secuencias procariótas, secuencias de ADNc, secuencias de ADN genómico y secuencias de ADN y ARN sintetizadas químicamente. La secuencia de nucleótidos mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1) comprende cuatro codones GTG diferentes en las posiciones de pb 42, 174, 177 y 180. Como se describe en la Sección 9 mostrada más adelante, se construyeron deleciones múltiples de la región 5' de la ORF de aveC (FIGURA 1 ; SEC ID NO: 1 ) para ayudar a definir cuáles de estos codones podían funcionar en la ORF (le aveC como sitios de iniciación para la expresión de la proteína. La deleción del primer sitio GTG en el pb 42 no eliminó la actividad de AveC. Una deleción adicional de todos los codones GTG en las posiciones de pb 174, 177 y 180 eliminó totalmente la actividad de AveC, indicando que esta región es necesaria para la expresión de la proteína. Por lo tanto, la presente invención abarca ORF de aveC de longitud variable. La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que es homologa a la secuencia codificante del producto génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o a la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC presentada en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1) o una porción sustancial de la misma. El término "homólogo", cuando se usa para hacer referencia a una molécula polinucleotídica que es homologa a una secuencia codificante del producto génico AveC de S. avermitilis, significa una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos: (a) que codifica el mismo producto génico AveC que la secuencia codificante del producto .génico AveC de S. avermitilis del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o que codifica el mismo producto génico AveC que la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC presentada en: la FIGURA 1 (SEC. ID NO: 1 ), pero que incluye uno o más cambios silenciosos en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético (es decir, una variante degenerada) ; o (b) que hibrida con el complemento de una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia que codifica el producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 2), en condiciones moderadamente rigurosas, es decir, hibridación con ADN unido a filtro en NaHP04 0,5 M, dodecil sulfato sódico (SDS) al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,2 x SSC/SDS al 0,1% a 42°C (véase Ausubel y col., (eds.) , 1989, Current Protocols in Molecular Bioloqv, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., Nueva York, en la pág. 2.10.3), y codifica un producto génico AveC funcionalmente equivalente como se ha definido anteriormente. En una realización preferida, la molécula polinucleotídica homologa hibrida con el complemento de la secuencia de nucleótidos que codifica el producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o con el complemento de la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1) o una porción sustancial de la misma, en condiciones muy rigurosas, es decir, hibridación con ADN unido a un filtro en NaHP04 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65°C, y lavado en 0,1 x SSC/SDS al 0,1 % a 68°C (Ausubel y col., 1989, mencionado anteriormente), y codifica un producto génico AveC funcionalmente equivalente como se ha definido anteriormente. La actividad de un producto génico AveC y los equivalentes funcionales potenciales del mismo pueden determinarse mediante el análisis de HPLC de los productos de fermentación, como se describe en los ejemplos de más adelante. Las moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias de nucleótidos que codifican equivalentes funcionales del producto génico AveC de S. avermitilis ¡ncluyen genes aveC que se producen de forma natural presentes en otras cepas de S. avermitilis, genes homólogos a aveC presentes en otras especies de Streptomyces y alelos de aveC mutados, se produzcan de forma natural o se obtengan por ingeniería genética. La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es homologa a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante del producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1. (SEC ID NO: 2) o una porción sustancial de la misma. Como se usa en este documento, una "porción sustancial" de la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 2) significa un polipéptido que comprende al menos aproximadamente un 70% de la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 2), y que constituye un producto génico AveC funcionalmente equivalente como se ha definido anteriormente. Como se usa en este documento para hacer referencia a secuencias de aminoácidos que son homologas a la secuencia de aminoácidos de un producto génico AveC de S. avermitilis, el término "homólogo" se refiere a un polipéptido que por lo demás tiene la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 2), pero en el que uno o más restos de aminoácidos se han sustituido de forma conservativa con un resto de aminoácido diferente, donde: dicha secuencia de aminoácidos tiene una identidad de secuencia de al menos un 70%, más preferiblemente de al menos aproximadamente un 80% y, aún más. preferiblemente, de al menos aproximadamente un 90% con el polipéptido codificado por" la secuencia codificante del producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 2), determinada por cualquier algoritmo convencional de identidad de secuencias de aminoácidos, tal como el algoritmo BLASTP (GENBANK, NCBI), y donde tal sustitución conservativa da lugar a un producto génico funcionalmente equivalente, como se ha definido anteriormente. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son bien conocidas en la técnica. Las reglas para obtener tales sustituciones ¡ncluyen las descritas por Dayhof, M.D., 1978, Nat. ÍA? ?. Í?, &*M& ...l A- *t t.*?e..

Biomed. Res. Found., Washington, D.C., Vol. S, Sup. 3, entre otras. Más específicamente, las sustituciones de aminoácidos conservativas son las que generalmente se producen dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en acidez o polaridad. Los aminoácidos codificados genéticamente generalmente se dividen en cuatro grupos: (1 ) ácidos = aspartato y glutamato; (2) básicos = lisina, arginina e histidina; (3) no polares = alanina, valina, leucina, ¡soleucina, prolina, fenilalanina, metionina y triptófano; y (4) polares sin carga = glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina y tirosina. La fenilalanina, el triptófano y la tirosina también se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. Uno o más reemplazos dentro de cualquier grupo particular, por ejemplo, de una leucina por una isoleucina o valina, del un aspartato por un glutamato, de una treonina por una serina, o de cualquier otro resto de aminoácido por un resto de aminoácido estructuralmente relacionado, por ejemplo, un resto de aminoácido con una acidez o polaridad similar o con analogías en alguna combinación de los mismos, generalmente tendrá un efecto insignificante sobre la función del polipéptido. La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico homólogo a AveC. Como se usa en este documento, un "producto génico homólogo a AveC" se define como un producto génico que tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos el 50% con un producto génico AveC de S. avermitilis que comprende ""f tJHfciJUliirin í? *f>- *¿***?kM¡»?*..*4 la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia que codifica el producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o la secuencia de aminoácidos mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 2), determinada por cualquier algoritmo convencional de identidad de secuencias de aminoácidos, tal como el algoritmo BLASTP (GENBANK, NCBI). En una realización no limitante, el producto génico homólogo a AveC procede de S. hygroscopicus (descrito en la solicitud de patente EP 0298423; depósito FERM BP-1901) y comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4 o una porción sustancial de la misma. Una "porción sustancial" de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4 significa un polipéptido que comprende al menos aproximadamente un 70% de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO:4 y que constituye un producto génico homólogo a AveC funcionalmente equivalente. Un producto génico homólogo a AveC "funcionalmente equivalente" se define como un producto génico que, cuando se expresa en la cepa FERM BP-1901 de S. hygroscopicus en la que se ha inactivado el alelo homólogo a aveC nativo, produce sustancialmente la misma relación y cantidad de milbemicinas que las producidas por la cepa FERM BP-1901 de S. hygroscopicus que expresa en su lugar sólo el alelo homólogo a aveC funcional, de tipo silvestre, nativo en la cepa FERM. BP-1901 de S. hygroscopicus. En una realización no limitante, la molécula polinucleotídica aislada de la presente invención que codifica el producto génico homólogo a AveC de S. hygroscopicus comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3 o una porción sustancial de la misma. A este respecto, una "porción sustancial" de la molécula polinucleotídica aislada que comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3 significa una molécula polinucleotídica aislada que comprende al menos aproximadamente un 70% de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3 y que codifica un producto génico homólogo a AveC funcionalmente equivalente, como se acaba de definir. La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que es homologa a la secuencia de nucleótidos de S. hygroscopicus de la SEC ID NO: 3. El término "homólogo", cuando se usa para hacer referencia a una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que es homologa a la secuencia codificante del producto génico homólogo a AveC de S. hygroscopicus de la SEC ID NO: 3, significa una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos: (a) que codifica el mismo producto génico que la secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 3, pero que incluye uno o más cambios silenciosos en la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la degeneración del código genético (es decir, una variante degenerada); o (b) que hibrida con el complemento de una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4, en condiciones moderadamente rigurosas, es decir, hibridación con ADN unido a un filtró en NaHP04 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65°C y lavado en 0,2 x SSC/0,1% SDS a 42°C (véase Ausubel y col., mencionado anteriormente), y codifica un producto génico homólogo a AveC funcionalmente equivalente como se ha definido anteriormente. En una realización preferida, la molécula polinucleotídica homologa hibrida con el complemento de la secuencia de nucleótidos codificante del producto génico homólogo a AveC de la SEC ID NO: 3 en condiciones muy rigurosas, es decir, hibridación con ADN unido al filtro en NaHP04 0,5 M, SDS al 7%, EDTA 1 mM a 65°C y lavado en 0,1 x SSC/SDS al 0,1 % a 68°C (Ausubel y col., 1989, mencionado anteriormente), y codifica un producto génico homólogo a AveC funcionalmente equivalente como se ha definido anteriormente. La presente invención proporciona además una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que es homólogo al producto génico homólogo a AveC de S. Hygroscopicus. Como se usa en este documento para hacer referencia a polipéptidos que son homólogos al producto génico homólogo a AveC de la SEC ID NO: 4 procedente de S. Hygroscopicus, el término "homólogo" significa un polipéptido que, por lo demás, tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4, pero en la que se han sustituido conservativamente uno o más restos de aminoácidos por un resto de aminoácido diferente, como se ha definido anteriormente, donde dicha secuencia de aminoácidos tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente un 70%, mis preferiblemente de al menos aproximadamente un 80% y, aún más preferiblemente, de al menos aproximadamente un 90%, con el polipéptido de la SEC ID NO: 4, determinada por cualquier algoritmo convencional de ti *tßtM?¡ ¡p- <*-; - identidad de secuencias de aminoácidos, tal como el algoritmo BLASTP x (GENBANK, NCBI), y donde tal sustitución conservativa produce un producto génico homólogo a AveC funcionalmente equivalente, como se ha definido anteriormente. La presente invención proporciona además oligonucleótidos que hibridan con una molécula polinucleotídica que tiene la secuencia de nucleótidos de la FIGURA 1 (SEC ID NO:1) o la SEC ID NO: 3, o con una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que es el complemento de la secuencia de nucleótidos de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1 ) o la SEC ID NO: 3. Tales oligonucleótidos tienen una longitud de al menos aproximadamente. 10. nucleótidos y preferiblemente una longitud de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos, e hibridan con una de las moléculas polinucleotídicas mencionadas anteriormente en condiciones muy rigurosas, es decir, lavado en. 6 x SSC/pirofosfato sódico al 0,5% a ~37°C para los oligos de -14 bases, a ~48°C para los oligos de -17 bases, a ~55°C para los oligos de -20 bases y a ~60°C para, los oligos de -23 bases. En una realización preferida, los oligonucleótidos son complementarios a una porción de una de las moléculas polinucleotídicas mencionadas anteriormente. Estos oligonucleótidos son útiles para una diversidad de fines incluyendo para codificar o actuar como moléculas antisentido útiles en la regulación génica o como cebadores en la amplificación de moléculas polinucleotídicas que codifican aveC u homólogos de aveC. Usando las moléculas polinucleotídicas o los oligonucleótidos IMA¡?- >*&<* descritos en este documento junto con técnicas conocidas, pueden identificarse otros genes homólogos de aveC en otras especies o cepas de Streptomyces. Por ejemplo, una molécula oligonucleotídica que comprende una porción de la secuencia de nucleótidos de S. avermitilis de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1) o una porción de la secuencia de nucleótidos de S. hygroscopicus de la SEC ID NO: 3, puede marcarse de forma detectable y usarse para rastrear una biblioteca genómica construida a partir del ADN derivado del organismo de interés. La rigurosidad de las condiciones de hibridación se selecciona basándose en la relación del organismo de referencia, en este ejemplo S. avermitilis o S. hygroscopicus, con el organismo de interés. Los requisitos para las diferentes condiciones de rigurosidad son bien conocidos para los especialistas en la técnica y tales condiciones variarán predeciblemente dependiendo de los organismos específicos de los que proceden la biblioteca y las secuencias marcadas. Preferiblemente, tales oligonucleótidos tienen una longitud de al menos aproximadamente 15 nucleótidos e incluyen, por ejemplo, los descritos en los ejemplos mostrados más adelante. La amplificación de los genes homólogos puede realizarse usando estos y otros oligonucleótidos y aplicando técnicas convencionales tales como la reacción en cadena con polimerasa (PCR), aunque también pueden usarse otras técnicas de amplificación conocidas en la técnica, por ejemplo, la reacción en cadena con ligasa. Los clones identificados como clones que contienen secuencias de nucleótidos homologas a aveC, pueden ensayarse con respecto a su capacidad de codificar un producto génico homólogo a AveC funcional. Para este fin, los clones pueden someterse a análisis de secuencia para identificar una fase de lectura adecuada, así como señales de iniciación y terminación. Como alternativa o adicionalmente, la secuencia de ADN clonada puede insertarse en un vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante de la proteína insertada. Puede usarse cualquiera de una diversidad de sistemas de huésped/vector como se ha descrito más adelante, incluyendo, pero sin limitación, sistemas bacterianos tales como vectores de expresión plásmidos, bacteriófagos o cósmidos. Las células huésped apropiadas transformadas con tales vectores que comprenden secuencias codificantes homologas a aveC potenciales después pueden analizarse con respecto a la actividad de tipo AveC usando procedimientos tales como análisis de HPLC de los productos de fermentación, como se describe, por ejemplo, en la Sección 7 mostrada más adelante. La producción y manipulación de las moléculas polinucleotídicas descritas en este documento están dentro de la experiencia en la técnica y pueden realizarse de acuerdo con técnicas recombinantes descritas, por ejemplo, en Maniatis, y col., 1989, Molecular Cloninq. A Laboratorv Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel, y col., 1989, Current Protocols In Molecular Bioloqy. Greene Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring i 1 Harbor, NY; Innis y col. (eds.), 1995, PCR Strategies, Academic .Press, Inc., San Diego; y Erlich (eó),1992, PCR Technology. Oxford University Press, Nueva York, todos los cuales se incorporan aquí por referencia. Los clones polinucleotídicas que: codifican productos génicos AveC o productos génicos homólogos a AveC pueden identificarse usando cualquier procedimiento conocido en la técnica incluyendo, pero sin limitación, los procedimientos indicados en la Sección 7 mostrada más adelante. Pueden rastrearse bibliotecas de ADN genómico con respecto a las secuencias codificantes aveC y homologas a aveC usando técnicas tales como los procedimientos indicados en Benton y Davis, 1977, Science 196:180, para bibliotecas de bacteriófagos, y en Grunstein y Hogness, 1975, Proc., Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961-3965, para bibliotecas de plásmidos. Las moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias de nucleótidos que se sabe que incluyen la ORF de aveC, como la presente, por ejemplo, en el plásmido pSE186 (ATCC 209604), o en el plásmido pSE199 (descrito en la Sección 7, mostrada más adelante), pueden usarse como sondas en estos experimentos de selección. Como alternativa, pueden sintetizarse sondas oligonucleotídicas que corresponden a las secuencias de nucleótidos deducidas a partir de las secuencias de aminoácidos parciales o completas del producto génico homólogo a AveC purificado. » sez ?&.. ?.U J t Sistemas Recombinantes Vectores de Clonación v Expresión La presente invención proporciona además vectores de clonación y vectores de expresión recombinantes que son útiles en la clonación o expresión de moléculas polinucleotídicas de la presente invención que comprenden, por ejemplo, la ORF de aveC de S. avermitilis o cualquier ORF homologa a aveC. En una realización no limitante, la presente invención proporciona el plásmido pSE186 (ATCC 209604), que comprende la ORF completa del gen aveC de S. avermitilis. Toda la siguiente descripción relacionada con la ORF de aveC de S. avermitilis, una molécula polinucleotídica que comprende la ORF de aveC de S. avermitilis o una porción de la misma, o un producto génico AveC de S. avermitilis, también se refiere a homólogos de aveC y a productos génicos homólogos a AveC, a menos que se indique explícitamente o por el contexto. Se ha creado una diversidad de vectores diferentes para uso específico en Streptomyces, incluyendo fagos, plásmidos de alto número de copias, plásmidos de bajo número de copias y vectores lanzadera de E. coli -Streptomyces, entre otros, y cualquiera de éstos puede usarse para poner en práctica la presente invención. También se han clonado varios genes de resistencia a fármacos de Streptomyces, y varios de estos genes se han incorporado en vectores como marcadores selectivos. Se presentan ejemplos ?A.Ú. i i. ttttJ.>^,...Jfi¡LM?. de vectores actuales para uso en Streptomyces, entre otros sitios, en Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169-190. Los vectores recombinantes de la presente invención, particularmente los vectores de expresión, preferiblemente se construyen de forma que la secuencia codificante para la molécula polinucleotídica dula invención esté en asociación operativa con uno o más elementos reguladores necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante para producir un polipéptido. Como se usa en este documento, el término "elemento regulador" incluye, pero sin limitación, secuencias de nucleótidos que codifican promotores inducibles y no inducibles, intensificadores, operadores y otros elementos conocidos en la técnica que sirven para dirigir y/ o regular la expresión de secuencias que codifican polinucleótidos. Además, como se usa en este documento, la secuencia codificante está en "asociación operativa" con uno o más elementos reguladores, donde los elementos reguladores regulan eficazmente y permiten la transcripción de la secuencia codificante, la traducción de su ARNm o ambas cosas. Los vectores plasmídicos típicos que pueden modificarse por ingeniería genética para que contengan una molécula polinucleotídica de la presente invención, incluyen pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen),, pGEM3Zf (Promega) y el vector lanzadera pWHM3 (Vara y col., 1989, J. Bact. 171 ;5872- 5881 ), entre otros muchos. En la técnica, son bien conocidos procedimientos para construir vectores recombinantes que contienen secuencias codificantes particulares en asociación operativa con elementos reguladores apropiados, y éstos pueden usarse para poner en práctica la presente invención. Estos procedimientos ¡ncluyen técnicas recombinantes in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y col., 1989, mencionado anteriormente; Ausubel y col., 1989, mencionado anteriormente; Sambrook y col., 1989, mencionado anteriormente; Innis y col., 1995, mencionado anteriormente; y Erlich, 1992, mencionado anteriormente. Los elementos reguladores de estos vectores pueden variar en resistencia y especificidades. Dependiendo del sistema huésped/vector utilizado, puede usarse cualquiera de varios elementos adecuados para la transcripción y la traducción. Los ejemplos no limitantes de las regiones reguladoras de la transcripción o promotores para bacterias incluyen el promotor ß-gal, el promotor T7, el promotor TAC, los promotores ?? izquierdo y derecho, promotores trp y lac, promotores de fusión trp-lac y, más específicamente para Streptomyces, los promotores ermE, melC, tipA, etc. En una realización especifica descrita en la Sección 11 mostrada, más adelante, se generó un vector de expresión que contenía la ORF de aveC clonada adyacente al promotor ermE fuerte constitutivo de Saccharopolyspora erythraea. El vector se utilizó para transformar S. avermitilis y el posterior análisis de HPLC de los productos de fermentación indicó una mayor concentración de avermectinas producidas en comparación con la producción por la misma cepa pero que en su lugar expresaba el alelo de aveC de tipo silvestre.

Pueden usarse vectores de expresión de proteínas de fusión para expresar una proteína de fusión del producto génico AveC. La proteína de fusión purificada puede usarse para activar antisuero contra el producto génico AveC, para estudiar las propiedades bioquímicas del producto génico AveC, para obtener por ingeniería genética proteínas de fusión de AveC con diferentes actividades bioquímicas o para ayudar a la identificación o purificación del producto génico AveC expresado. Los posibles vectores de expresión, de proteínas de fusión ¡ncluyen, pero sin limitación, vectores que incorporan secuencias que codifican fusiones de ß-galactosidasa y trpE, fusiones de proteínas de unión a maltosa, fusiones de glutatión-S-transferasa y fusiones de polihistidina (regiones portadoras). En una realización alternativa, puede fusionarse un producto génico AveC o una porción del mismo con un producto génico homólogo a AveC o a una porción del mismo, procedente de otra especie o cepa de Streptomyces, tal como, por ejemplo, S. hygroscopicus o S. griseochromogenes. En una realización particular descrita en la Sección 12, mostrada más adelante y representada en la FIGURA 7, se construyó un plásmido quimérico que contenía una región de 564 pb de la ORF homologa a aveC de S. hygroscopicus que reemplazaba a una región de 564 pb homologa de la ORF de aveC de S. avermitilis. Tales vectores híbridos pueden utilizarse para transformar células de S. avermitilis y ensayarse para determinar su efecto, por ejemplo, sobre la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas. Las proteínas de fusión de AveC pueden modificarse por ingeniería genética para que comprendan una región útil para la purificación. Por ejemplo, las proteínas de fusión AveC-proteína de unión a maltosa pueden purificarse usando resina de amilosa; las fusiones AveC-proteínas de fusión de glutatión-S-transferasa pueden purificarse usando perlas de glutatión-agarosa; y las fusiones de AveC-polihistidina pueden purificarse usando una resina de níquel divalente. Como alternativa, pueden usarse anticuerpos contra una proteína o péptido portador para realizar la purificación por cromatografía de afinidad de la proteína de fusión. Por ejemplo, puede introducirse por ingeniería genética una secuencia de nucleótidos que codifica para el epítopo diana de un anticuerpo monoclonal, en el vector de expresión, en asociación operativa con los elementos reguladores, y situarse de forma que el epítopo expresado se fusione con el polipéptido AveC. Por ejemplo, puede insertarse por técnicas convencionales una secuencia de nucleótidos que codifica para la marca de epitopo FLAG™ (International Biotechnologies Inc.), que es un péptido marcador hidrófilo, en el vector de expresión en un punto correspondiente, por ejemplo, al extremo carboxilo terminal del polipéptido AveC. El producto de fusión polipéptido AveC-epítopo FLAG™ después puede detectarse y purificarse por afinidad usando anticuerpos anti-FLAG™ adquiribles en el mercado. El vector de expresión que codifica la proteína de fusión AveC también puede modificarse por ingeniería genética para que contenga secuencias de poliengarce que codifican sitios de escisión específicos de proteasas, de forma que el polipéptido AveC expresado pueda liberarse de la región portadora o de la molécula de fusión por tratamiento con una proteasa específica. Por ejemplo, el vector de la proteína de fusión puede incluir secuencias de ADN que codifican sitios de escisión por trombina o por el factor Xa, entre otros. Mediante ingeniería genética también puede introducirse una secuencia señal cadena arriba y en la misma fase de lectura que la ORF de ayeC, en el vector de expresión, por procedimientos conocidos, para dirigir el tráfico y la secreción del producto génico expresado. Los ejemplos no limitantes de las secuencias señal incluyen los que proceden del factor a, inmunoglobulinas, proteínas de la membrana extema, penicilinasa y receptores de células T, entre otros. Para ayudar en la selección de las células huésped transformadas o transfectadas con los vectores de clonación o expresión de la presente invención, el vector puede modificarse por ingeniería genética para que comprenda además una secuencia codificante para un producto génico reportero u otro marcador selectivo. Tal secuencia codificante preferiblemente está en asociación operativa con las secuencias que codifican los elementos reguladores, como se ha descrito anteriormente. Los genes reporteros que son útiles en la invención son bien conocidos en la técnica e incluyen los que codifican la proteína fluorescente verde, luciferasa, xy1 E y tirosinasa, entre otras. Las secuencias de nucleótidos que codifican marcadores selectivos son bien conocidas en la técnica e incluyen las que codifican productos génicos que confieren resistencia a antibióticos o anti-metabolitos, o que proporcionan un requisito auxotrófico. Los ejemplos de tales secuencias incluyen las que codifican resistencia a eritromicina, tiostrepton o kanamicina, entre otras muchas.

Transformación de Células Huésped La presente invención proporciona además células huésped transformadas que comprenden una molécula polinucleotídica o vector recombinante de la invención, y nuevas cepas o líneas celulares derivadas de las mismas. Las células huésped útiles en la práctica de la invención son preferiblemente células de Streptomyces, aunque también pueden usarse otras células procariotas o eucariotas. Tales células huésped transformadas típicamente incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias transformadas con ADN recombinante de bacteriófago, ADN plasmídico o ADN de cósmido, o levaduras transformadas con vectores recombinantes, entre otras. Las moléculas polinucleotídicas de la presente Invención están destinadas a actuar en células de Streptomyces, pero también pueden transformar a otras células bacterianas o eucariotas, por ejemplo, con fines de clonación o expresión. Típicamente, puede usarse urna cepa de E. coli, tal como, por ejemplo, la cepa DHSa, adquirible de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (No. de Acceso 31343), y de fuentes comerciales (Stratagene). Las células huésped eucariotas preferidas incluyen células de levadura, aunque también pueden utilizarse eficazmente células de mamífero o células de insectos. El vector de expresión recombinante de la invención preferiblemente transforma o transfecta a una o más células huésped de un cultivo sustancialmente homogéneo de células. El vector de expresión generalmente se introduce en las células huésped de acuerdo con técnicas conocidas tales como, por ejemplo, transformación de protoplastos, precipitación con fosfato calcico, tratamiento con cloruro calcico, microinyección, electroporación, transfección por contacto, con un virus recombinado, transfección mediada por liposomas, transfección con DEAE- dextrano, transfección, conjugación o bombardeo con microproyectiles. La selección de los transformantes puede realizarse mediante procedimientos convencionales, tales como mediante la selección de células que expresan un marcador selectivo, por ejemplo, resistencia a antibióticos, asociado con el vector recombinante, como se ha descrito anteriormente. Una vez introducido el vector de expresión en la célula huésped, la integración y mantenimiento de la secuencia codificante aveC en el cromosoma de la célula huésped o episomalmente puede confirmarse por técnicas convencionales, por ejemplo, mediante análisis de hibridación de Southern, análisis de enzimas de restricción, análisis de PCR, incluyendo PCR con transcriptasa inversa (rt-PCR), o mediante ensayo inmunológico para detectar el producto génico esperado. Las células huésped que contienen y/o expresan la secuencia codificante aveC recombinante pueden identificarse por cualquiera de al menos cuatro procedimientos generales que son bien conocidos en la técnica, incluyendo: (i) hibridación ADN-ADN, ADN- ARN o ARN-ARN antisentido; (ii) detección de la presencia de funciones de genes "marcadores"; (¡ii) evaluación del nivel de transcripción medido por la expresión de transcritos de ARNm específico de aveC en la célula huésped; y (iv) detección de la presencia del producto polipeptídico maduro medido, por ejemplo, por inmunoensayo o por la presencia de la actividad biológica de AveC (por ejemplo, la producción de relaciones y cantidades específicas de avermectinas indicativas de la actividad de AveC en, por ejemplo, células huésped de S. avermitilis). 5.2.3. Expresión v Caracterización de un Producto Génico AveC Recombinante Una vez que la secuencia codificante aveC se ha introducido de forma estable en una célula huésped apropiada, la célula huésped transformada se propaga por clonación y las células resultantes pueden cultivarse en condiciones que conducen a la producción máxima del producto génico AveC. Tales condiciones típicamente incluyen cultivar las células hasta que se obtenga una alta densidad. Cuando el vector de expresión comprende un promotor inducible, se emplean condiciones de inducción apropiadas tales como, por ejemplo, el cambio de la temperatura, el agotamiento de nutrientes, la adición de inductores innecesarios (por ejemplo, análogos de carbohidratos, tales como isopropil-ß-D-tiogalactopiranósido (IPTG), la acumulación de subproductos metabólicos en exceso, o similares, cuando sea necesario, para inducir la expresión. Cuando el producto génico AveC expresado queda retenido dentro de las células huésped, las células se recogen y se lisan y el producto se aisla y purifica del lisado en condiciones de extracción conocidas en la técnica para reducir la degradación de proteínas, tales como, por ejemplo, una temperatura de 4°C, en presencia de inhibidores de proteasas, o ambas cosas. Cuándo el producto génico AveC expresado se secreta por las células huésped, simplemente puede recogerse el medio nutriente agotado y el producto aislarse del mismo. El producto génico AveC expresado puede aislarse o purificarse sustancialmente de los lisados celulares o del medio de cultivo, según sea apropiado, usando procedimientos convencionales que incluyen, pero sin limitación, cualquier combinación de los siguientes procedimientos: precipitación con sulfato de amonio, fraccionamiento por tamaños, cromatografía de intercambio iónico, HPLC, centrifugación de densidad y cromatografía de afinidad. Cuando el producto génico AveC expresado presenta actividad biológica, puede controlarse el aumento de pureza de la preparación en cada etapa del procedimiento de purificación mediante el uso de un ensayo apropiado. Presente o no actividad biológica el producto génico AveC expresado, puede detectarse basándose, por ejemplo, en el tamaño o en la reactividad con un anticuerpo por lo demás específico para AveC, o por la presencia de una marca de fusión. Como se usa en este documento, un producto génico AveC está "purificado sustancialmente" cuando el producto constituye más de aproximadamente un 20% en peso de la proteína en una preparación particular. Además, como se usa en este documento, un producto génico AveC está "aislado" cuando el producto constituye al menos aproximadamente un 80% en peso de la proteína en una preparación particular. Por lo tanto, la presente invención proporciona un producto génico AveC de S. avermitilis expresado de forma recombinante, aislado o purificado sustancialmente, que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia codificante del producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604), o la secuencia de aminoácidos de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 2) o una porción sustancial de la misma, y homólogos del mismo. La presente invención proporciona además un producto génico homólogo a AveC de S. hygroscopicus expresado de forma recombinante, aislado o purificado sustancialmente, que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 4 o una porción sustancial de la misma, y homólogos del mismo. La presente invención proporciona además un procedimiento para producir un producto génico AveC, que comprende cultivar una célula huésped transformada con una vector de expresión recombinante, comprendiendo dicho vector una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico AveC, molécula polinucleotídica que está en asociación operativa con uno o más elementos reguladores que controlan la expresión de la molécula polinucleotídica en la célula huésped, en condiciones que conducen a la producción del producto génico AveC recombinante, y recuperar el producto génico AveC del cultivo de células. El producto génico AveC de S. avermitilis expresado de forma recombinante es útil para una diversidad de fines, incluyendo la selección de compuestos que alteran la función del producto génico AveC y, por lo tanto, modulan la biosíntesis de avermectinas, y para la activación de anticuerpos dirigidos contra el producto génico AveC Una vez que se ha obtenido un producto génico AveC de suficiente pureza, puede caracterizarse por procedimientos convencionales, incluyendo SDS-PAGE, cromatografía de exclusión molecular, análisis de la secuencia de aminoácidos, actividad biológica en la producción de los productos apropiados en la ruta biosintética de las avermectinas, etc. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del producto génico AveC puede determinarse usando técnicas convencionales de secuenciación de péptidos. El producto génico AveC puede caracterizarse adicionalmente usando análisis de hidrofilia (véase, por ejemplo, Hopp y Woods, 1981 , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824), o algoritmos de software análogos, para identificar las regiones hidrófobas e hidrófilas del producto génico AveC. El análisis estructural puede realizarse para identificar regiones del producto génico AveC que asumen estructuras secundarias específicas. Pueden usarse procedimientos biofísicos tales como cristalografía de rayos X (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11 : 7-13), creación de modelos por ordenador (Fletterick y Zoller (eds), 1986, en: Current Communications in Molecular Biologv. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) y resonancia magnética nuclear (RMN) , para localizar y estudiar los sitios de interacción entre el producto génico AveC y su sustrato. La información obtenida de estos estudios puede usarse para seleccionar nuevos sitios para la mutación en la ORF de aveC para ayudar a crear nuevas cepas de S. avermitilis que tengan características de producción de avermectinas más deseables. 5.3. Construcción y Uso de Mutantes de AveC La presente invención proporciona una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que por lo demás es igual que el alelo aveC de S. avermitilis o una variante degenerada del mismo, a la secuencia codificante del producto génico AveC del plásmido p,SE186 (ATCC 209604) o una variante degenerada de la misma, o a la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como se presenta en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1) o una variante degenerada de la misma, pero que además comprende una o más mutaciones,, de forma que las células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis en las que se ha ¡nactivado el alelo aveC de tipo silvestre y que expresan la molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mutada o la variante degenerada de la misma, producen una relación o cantidad diferente de avermectinas que la producida por las células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. . .^--¡-¿---.l.^^ ...^,-. ....^.^^.^.¿^^Bt^^ De acuerdo con la presente invención, tales moléculas polinucleotídicas pueden usarse para producir nuevas cepas de S. avermitilis que presentan un cambio detectable en la producción de avermectinas en comparación con la misma cepa que en su lugar expresa sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, tales moléculas polinucleotídicas son útiles para producir nuevas cepas de S. avermitilis que producen avermectinas en una relación reducida de clases 2:1 en comparación con la misma cepa que en su lugar expresa sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En otra realización preferida, tales moléculas polinucleotídicas son útiles para producir nuevas cepas de S. avermitilis que producen mayores niveles de avermectinas en comparación con la misma cepa que en su lugar expresa sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En otra realización preferida, tales moléculas polinucleotídicas son útiles para producir nuevas cepas de S. avermitilis en las que se ha inactivado el gen aveC. Las mutaciones en el alelo o en la secuencia codificante de aveC incluyen cualquier mutación que introduzca una o más deleciones, adiciones o sustituciones de aminoácidos en el producto génico AveC, que produzca el truncamiento del producto génico AveC, o cualquier combinación de las mismas, y que produzca el resultado deseado. Se pretende que tales secuencias de alelos de aveC mutados incluyan cualquier variante degenerada de las mismas. Por ejemplo, la presente invención proporciona moléculas polinucleotídicas que comprenden la secuencia de nucleótidos del alelo de aveC o una variante degenerada de la misma, la secuencia codificante del producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o una variante degenerada de la misma, o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis como se presenta en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1 ) o una variante degenerada de la misma, pero que además comprenden una o más mutaciones que codifican la sustitución de un resto aminoácido por un resto aminoácido diferente en las posiciones seleccionadas en el producto génico AveC. En varias realizaciones no limitantes, de las que varias se ejemplifican más adelante, tales sustituciones pueden realizarse en cualquiera de las posiciones de aminoácidos del producto génico AveC que correspondan a las posiciones de aminoácidos 38, 48, 55, 89, 99, 111 , 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 ó 298 de la SEC ID NO: 2, o alguna combinación de las mismas. Las mutaciones de la secuencia codificante aveC se realizan por cualquiera de una diversidad de procedimientos conocidos, incluyendo el uso de una PCR propensa a error o de mutagénesis de cassette. Por ejemplo, puede emplearse mutagénesis dirigida a oligonucleótidos para alterar la secuencia del alelo o de la ORF de aveC de una forma definida, tal como, por ejemplo, para introducir uno o más sitios de restricción, o un codón de terminación, en regiones específicas dentro del alelo o la ORF de aveC. También pueden usarse procedimientos tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos 5.605.793, en la Patente de Estados Unidos 5.830.721 y en la Patente de Estados Unidos 5.837.458, que implican fragmentación aleatoria, ciclos repetidos de mutagénesis y redistribución de nucleótidos, para generar grandes bibliotecas de polinucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos que codifican mutaciones de aveC. Las mutaciones deseadas pueden ser útiles, particularmente cuando sirven para alterar uno o más restos aminoácidos conservados en el producto génico AveC. Por ejemplo, una comparación de las secuencias de aminoácidos deducidas de los productos génicos AveC y los productos génicos homólogos a AveC de S. avermitilis (SEC ID NO: 2), S. griseochromogenes (SEC ID NO: 5) y S. hygroscopicus (SEC ID NO: 4), como se presenta en la FIGURA 6, indica sitios de conservación significativa de restos aminoácidos entre estas especies. La mutagénesis deseada que conduce a un cambio en uno o más de estos restos aminoácidos conservados puede ser particularmente eficaz para producir nuevas cepas mutantes que presentan alteraciones deseables en la producción de avermectinas. La mutagénesis aleatoria también puede ser útil y puede realizarse por exposición de las células de S. avermitilis a la radiación ultravioleta o a rayos X, o a mutágenos químicos tales como N-metil-N'- nitrosoguanidina, etil metano sulfonato, ácido nitroso o mostazas nitrogenadas véase, por ejemplo, Ausubel, 1989, mencionado anteriormente, para una revisión de las técnicas de mutagénesis. Una vez generadas las moléculas polinucleotídicas mutadas, se analizan para determinar si pueden modular la biosíntesis de avermectinas en S. avermitilis. En una realización preferida, una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos mutada se ensaya mediante complementación de una cepa de S. avermitilis en la que el gen aveC se ha inactivado para dar un efecto de fondo negativo a aveC (aveC). En un procedimiento no limitante, la molécula polinucleotídica mutada se ajusta a un plásmido de expresión en asociación operativa con uno o más elementos reguladores, plásmido que también comprende preferiblemente uno o más genes de resistencia a fármacos para permitir la selección de las células transformadas. Después, este vector se utiliza para transformar células huésped aveC usando técnicas conocidas y las células transformadas se seleccionan y cultivan en un medio de fermentación apropiado en condiciones que permiten o inducen la producción de avermectinas. Después, los productos de fermentación se analizan por HPLC para determinar la capacidad de la molécula polinucleotídica mutada para complementar la célula huésped. En la Sección 8.3, mostrada más adelante, se ilustran varios vectores que llevan moléculas polinucleotídicas mutadas capaces de reducir la relación de avermectinas B2:B1 , incluyendo pSE188, pSE199, pSE231 , pSE239 y pSE290 a pSE297. La presente invención proporciona procedimientos para identificar mutaciones de la ORF de aveC de S. avermitilis capaces de alterar la relación y/o cantidad de avermectinas producidas. En una realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar mutaciones de la ORF de aveC capaces de alterar la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas, que comprende: (a) determinar la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de una cepa de S. i élt lltliÍ?ateALatiaiMiaai"itÉi mi ?? i rn Ü"-^~ - --*•*-- *~-»*> *^.***>»-*-¿*- - -""tÜftÉ??tí lirttlwhi il avermitilis en la que se ha inactivado el alelo de aveC nativo, y en la que se ha introducido y se está expresando una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico AveC mutado; (b) determinar la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de la misma cepa de S. avermitilis que en la etapa (a), pero que en su lugar expresan sólo un alelo de aveC de tipo silvestre o un alelo de aveC que tiene la secuencia de nucleótidos de la ORF de la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1) o una secuencia de nucleótidos que es homologa a la misma; y (c) comparar la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (a) con la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (b) ; de tal forma que si la relación de avermectinas de las clases 2:1 producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (a) es diferente de la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (b) , entonces se ha identificado una mutación de la ORF de aveC capaz de alterar la relación de avermectinas de clases 2:1. En una realización preferida, la relación de avermectinas de clases 2:1 se reduce por la mutación. En otra realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para identificar mutaciones de la ORF de aveC o construcciones genéticas que comprenden la ORF de aveC capaces de alterar la cantidad de avermectinas producidas, que comprende: (a) determinar la cantidad de avermectinas producidas por células de una cepa de S. avermitilis en la que se ha inactivado el alelo de aveC nativo, y en la que L. ^,^ ^^ Ái?Á se ha introducido y se está expresando una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico AveC mutado o que comprende una construcción genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico AveC; (b) determinar la cantidad de avermectinas producidas por las células de la misma cepa de S. avermitilis que en la etapa (a) , pero que en su lugar expresan sólo un alelo de aveC de tipo silvestre o una secuencia de nucleótidos que es homologa al mismo; y (c) comparar la cantidad de avermectinas producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (a) con la cantidad de avermectinas producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (b) ; de tal forma que si la cantidad de avermectinas producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (a) es diferente de la cantidad de avermectinas producidas por las células de S. avermitilis de la etapa (b), entonces se ha identificado una mutación de la ORF de aveC o una construcción genética capaz de alterar la cantidad de avermectinas. En una realización preferida, la cantidad de avermectinas producidas se aumenta por la mutación. Cualquiera de los procedimientos mencionados anteriormente para identificar mutaciones se realiza usando un medio de cultivo de fermentación, preferiblemente suplementado con ácido ciciohexano carboxílico, aunque también pueden usarse otros precursores de ácidos grasos apropiados, tales como uno cualquiera de los precursores de ácidos grasos presentados en la cuadro 1.

Una vez que se ha identificado una molécula polinucleotídica mutada que modula la producción de avermectinas en una dirección deseable, puede determinarse la localización de la mutación en la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un producto génico AveC mutado, puede aislarse por PCR y someterse a un análisis de la secuencia de ADN usando procedimientos conocidos. Comparando la secuencia de ADN del alelo de aveC mutado con la del alelo de aveC de tipo silvestre, pueden determinarse las mutaciones responsables de la alteración de la producción de avermectinas. En realizaciones específicas, aunque no limitantes de la presente invención, los productos génicos AveC de S. avermitilis que comprendían sustituciones de un solo aminoácido en cualquiera de los restos 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T) o 230 (G230D), o sustituciones dobles en las posiciones 138 (S138T) y 139 (A139T o A139F), produjeron cambios en la función del producto génico AveC, de tal forma que se alteró la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas (véase la Sección 8, mostrada más adelante), correspondiendo las posiciones de aminoácidos mencionadas a las presentadas en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 2). Además, se ha demostrado que cada una de las siguiente siete combinaciones de mutaciones reduce eficazmente la relación de avermectinas de clases 2:1 : (1) D48E/A89T; (2) S138T/A139T/G179S; (3) Q38P/L136P/E238D; (4) F99S/S138T/A139T/G179S; (5) A139T/M228T; (6) G111V/P289L; (7) A139T/K154E/Q298H. Como se usa en este documento, las designaciones mencionadas anteriormente, tales como A139T, indican el resto de aminoácido original mediante una sola letra, que en este ejemplo es la alanina (A), en la posición indicada, que en este ejemplo es la posición 139 (haciendo referencia a la SEC ID NO: 2) del polipéptido, seguido del resto de aminoácido que reemplaza al resto de aminoácido original, que en este ejemplo es la treonina (T). Por consiguiente, la presente invención incluye las moléculas polinucleotídicas que tienen secuencias de nucleótidos que codifican los productos génicos AveC de S. avermitilis mutados que comprenden sustituciones o deleciones de aminoácidos en una o más de las posiciones de aminoácidos 38, 48, 55, 89, 99, 111 , 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 o 298 (véase la FIGURA 1 ), o cualquier combinación de las mismas. En una realización preferida, tales mutaciones codifican sustituciones de aminoácidos seleccionadas entre una o más del grupo compuesto por: (a) el resto de aminoácido Q en la posición 38 reemplazado por P o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para P; (b) el resto de aminoácido D en la posición 48 reemplazado por E o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para E; (c) el resto de aminoácido A en la posición 89 reemplazado por T o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para T; (d) el resto de aminoácido F en la posición 99 reemplazado por S o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para S; (e) el resto de aminoácido G en la posición 111 reemplazado por V o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para V; (f) el resto de aminoácido L en la posición 136 reemplazado por P o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para P; (g) el resto de aminoácido S en la posición 138 reemplazado por T o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para T; (h) el resto de aminoácido A en la posición 139 reemplazado por T o F o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para T o F; (i) el resto de aminoácido K en la posición 154 reemplazado por E o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para E; (j) el resto de aminoácido G en la posición 179 reemplazado por S o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para S; (k) el resto de aminoácido M en la posición 228 reemplazado por T o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para T; (I) el resto de aminoácido E en la posición 238 reemplazado por D o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para D; (m) el resto de aminoácido P en la posición 289 reemplazado por L o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para L; (n) el resto de aminoácido Q en la posición 298 reemplazado por H o por un aminoácido que es una sustitución conservativa para H; siendo las sustituciones de aminoácidos conservativas como se han definido anteriormente en la Sección 5.1. En otra realización preferida, tales mutaciones codifican una combinación de sustituciones, de aminoácidos, seleccionándose la combinación de restos de aminoácidos sustituidos entre el grupo compuesto por: (a) los restos de aminoácidos S138 y A139; (b) los restos de aminoácidos D48 y A89; (c) los restos de aminoácidos S138, A139 y G179; (d) los restos de aminoácidos Q38, L136 y E238; (e) los restos de aminoácidos F99, 5138, A139 y G179; (f) los restos de aminoácidos A139 y M228; (g) los restos de aminoácidos G111 y P289; y (h) los restos de aminoácidos A139, K154 y Q298. En otra realización preferida, las combinaciones específicas de mutaciones en el alelo de aveC útiles para reducir eficazmente la relación de avermectinas de clases 2:1 de acuerdo con la presente invención se seleccionan entre una o más del grupo compuesto por: (a) S138T/A139T; (b) S138T/A139F; (c) D48E/A89T; (d) S138T/A139T/G179S; (e) Q38P/L136P/E238D; (f) F99S/S138T/A139T/G179S; (g) A139T/M228T; (h) G111/P289L; y (i) A139T/K154E/Q298H. La presente invención proporciona además composiciones para obtener nuevas cepas de S. avermitilis, cuyas células contienen un alelo de aveC mutado que da como resultado la alteración de la producción de avermectinas. Por ejemplo, la presente invención proporciona vectores recombinantes que pueden usarse para dirigir cualquiera de las moléculas polinucleotídicas que comprenden secuencias de nucleótidos mutadas de la presente invención, al sitio del gen aveC del cromosoma de S. avermitilis para insertar o reemplazar la ORF de aveC o una porción de la misma mediante recombinación homologa. De acuerdo con la presente invención, sin embargo, una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos mutada de la presente invención proporcionada aquí, también puede funcionar modulando la biosíntesis de avermectinas cuando se inserta en el cromosoma de S. avermitilis en un sitio distinto del gen aveC o cuando se mantiene episomalmente en las células de S. avermitilis. Así pues, la presente invención también proporciona vectores que comprenden una molécula polinucleotídica que comprende una secuencia de nucleótidos mutada de la presente invención, vectores que pueden usarse para insertar la molécula polinucleotídica en un sitio del cromosoma de S. avermitilis distinto del gen aveC o para mantenerse episomalmente. En una realización preferida, la presente invención proporciona vectores de reemplazo génico que pueden usarse para insertar un alelo de aveC mutado o una variante degenerada del mismo en células de una cepa de S. avermitilis, con lo que se generan nuevas cepas de S. avermitilis, cuyas células producen avermectinas en una relación alterada de clases 2:1 en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, se reduce la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células. Tales vectores de reemplazo génico pueden construirse usando moléculas polinucleotídicas mutadas presentes en vectores de expresión proporcionados aquí, tales como, por ejemplo, pSE188, pSE199 y pSE231 , vectores de expresión que se ejemplifican en la Sección 8 mostrada más adelante. En otra realización preferida, la presente invención proporciona vectores que pueden usarse para insertar un alelo de aveC mutado o una variante degenerada del mismo en células de una cepa de S. avermitilis para generar nuevas cepas de células que producen cantidades alteradas de avermectinas en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, se aumenta la cantidad de avermectinas producidas por las células. En una realización específica, aunque no limitante, tal vector comprende además un promotor fuerte como se conoce en la técnica, tal como, por ejemplo, el promotor ermE fuerte constitutivo de Saccharopolyspora erythraea; que se sitúa cadena arriba y en asociación operativa con el alelo de aveC. Tal vector puede ser el plásmido pSE189, descrito en el Ejemplo 11 mostrado más adelante, o puede construirse mediante el uso del alelo de aveC mutado del plásmido pSE189.

En otra realización preferida, la presente invención proporciona vectores de reemplazo génico que son útiles para inactivar el gen aveC en una cepa de tipo silvestre de S. avermitilis. En una realización no limitante, tales vectores de reemplazo génico pueden construirse usando la molécula polinucleotídica mutada presente en el plásmido pSE180 (ATCC 209605), que se ejemplifica en la Sección 8.1 mostrada más adelante (FIGURA 3). La presente invención proporciona además vectores de reemplazo génico que comprenden una molécula polinucleotídica que comprende o consta de secuencias de nucleótidos que flanquean de forma natural al gen aveC in situ en el cromosoma de S. avermitilis, incluyendo, por ejemplo, las que flanquean las secuencias de nucleótidos mostradas en la FIGURA 1 (SEC ID NO:1), vectores que pueden usarse para delecionar la ORF de aveC de S. avermitilis. La presente invención proporciona además procedimientos para obtener nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que expresan un alelo de aveC mutado y que producen una relación y/o cantidad de avermectinas alterada en comparación con las células de la misma cepa de S. avermitilis que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que expresan un alelo de aveC mutado y que producen una relación alterada de avermectinas de clases 2:1 en comparación con las células de la misma cepa de S. avermitilis que en su lugar expresan sólo un alelo de aveC de tipo silvestre, que comprende transformar células de una cepa de S. avermitilis con un vector que lleva un alelo de aveC mutado que codifica un producto génico que altera la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo de aveC mutado en, comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo un alelo de aveC de tipo silvestre, y seleccionar las células transformadas que producen avermectinas en una relación de clases 2:1 alterada en comparación con la relación de clases 2:1 producida por células de la cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización más preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para fabricar una nueva cepa de S. avermitilis, que comprende transformar células de una cepa de S. avermitilis con un vector capaz de introducir una mutación en el alelo de aveC de tales células, donde la mutación del alelo de aveC ocasiona la sustitución en el producto génico AveC codificado de un resto de aminoácido diferente en una o más posiciones de aminoácidos que corresponden a los restos de aminoácidos 38, 48, 55, 89, 99, 111 , 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 ó 298 d la SEC ID NO: 2, de tal forma que las células de la cepa e S. avermitilis en las que el alelo de aveC se ha mutado de esta forma producen una relación de avermectinas de clases 2:1 que es diferente de la relación producida por las células de la misma cepa de S. avermitilis que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, la relación alterada de avermectina de clases 2:1 se reduce. Como se usa en este documento, cuando se dice que un resto -? » de aminoácido codificado por un alelo de aveC en el cromosoma de S. avermitilis, o en un vector o molécula de polinucleótido aislada de la presente invención, "corresponde" a un resto de aminoácido particular de la SEC ID NO: 2, o cuando se dice que una sustitución de aminoácidos se produce en una posición particular "que corresponde" a la de un resto de aminoácido numerado específico de la SEC ID NO: 2, se pretende hacer referencia al resto de aminoácido en la misma localización relativa en el producto génico AveC, la cual puede determinarse rápidamente por el especialista en la técnica mediante referencia a la secuencia de aminoácidos presentada en este documento como SEC ID NO: 2. La presente invención proporciona además procedimientos para obtener nuevas cepas en las que las mutaciones específicas en el alelo de aveC que codifican mutaciones particulares se mencionan como cambios de bases en posiciones de nucleótidos especificas en el alelo de aveC "que corresponden" a posiciones de nucleótidos particulares como se muestran en la SEC ID NO: 1. Como se ha indicado anteriormente con respecto a las posiciones de aminoácidos correspondientes, cuando se dice que una posición de nucleótido en el alelo de aveC "corresponde" a una posición de nucieótido particular de la SEC ID NO: I, se pretende hacer referencia al nucleótido en la misma localización relativa en la secuencia de nucleótidos aveC, la cual puede determinarse rápidamente por el especialista en la técnica mediante referencia a la secuencia de nucleótidos presentada en este documento como SEC ID NO: 1. En otra realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que producen cantidades alteradas de avermectinas, que comprende transformar las células de una cepa de S. avermitilis con un vector que lleva un alelo de aveC mutado o una construcción genética que comprende el alelo de aveC, cuya expresión da como resultado una alteración de la cantidad de avermectinas producidas por las células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo de aveC mutado o una construcción genética en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, y seleccionar las células transformadas que producen avermectinas en una cantidad alterada en comparación con la cantidad de avermectinas producidas por las células de la cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, se aumenta la cantidad de avermectinas producidas en las células transformadas. En otra realización preferida, la presente invención proporciona un procedimiento para obtener nuevas cepas de S. avermitilis, cuyas células comprenden un alelo de aveC inactivado, que comprende transformar células de una cepa de S. avermitilis que expresan cualquier alelo de aveC con un vector que inactiva el alelo de aveC, y seleccionar las células transformadas en las que el alelo de aveC se ha inactivado. En una realización preferida, aunque no limitante, se transforman las células de una cepa de S. avermitilis con un vector de reemplazo génico que lleva un alelo de aveC que se inactivado por mutación o reemplazo de una porción del alelo de aveC con una secuencia génica heteróloga, y se seleccionan las células transformadas en las que el alelo de aveC nativo se ha reemplazado por el alelo de aveC inactivado. La inactivación del alelo de aveC puede determinarse por análisis de HPLC de los productos de fermentación como se describe más adelante. En una realización especifica, aunque no limitante, descrita en la Sección 8.1 mostrada más adelante, el alelo de aveC se inactiva mediante inserción del gen ermE de Saccharopolyspora erythraea en la ORF de aveC. La presente invención proporciona además nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que se han transformado con cualquiera de las moléculas polinucleotídicas o vectores de la presente invención. En una realización preferida, la presente invención proporciona nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que expresan un alelo de aveC mutado o una variante degenerada del mismo en lugar de o además del alelo de aveC de tipo silvestre, donde las células de la nueva cepa producen avermectinas en una relación alterada de clases 2:1 en comparación con la relación de avermectinas de clases 2:1 producida por las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, la relación alterada de clases 2:1 producida por las nuevas células se reduce. Tales nuevas cepas son útiles en la producción a gran escala de avermectinas deseables desde el punto de vista comercial, tales como doramectina. En una realización más preferida, la presente invención proporciona células de S. avermitilis que comprenden cualquiera de las mutaciones o combinaciones de mutaciones mencionadas anteriormente en el alelo de aveC en las posiciones de nucleótidos correspondientes a las presentadas anteriormente o bien que codifican cualquiera de las sustituciones de aminoácidos mencionadas anteriormente en el producto génico AveC. Aunque tales mutaciones pueden estar presentes en tales células en un elemento extracromosómico, tal como un plásmido, se prefiere que tales mutaciones estén presentes en el alelo de aveC localizado en el cromosoma de S. avermitilis. En una realización preferida, la presente invención proporciona una cepa de Streptomyces avermitilis que comprende células que fienen una mutación en el alelo de aveC que codifica un producto génico AveC que tiene una sustitución en una o más posiciones de aminoácidos correspondientes a los restos de aminoácidos 38, 48, 55, 89, 99, 111 , 136, 138, 139, 1.54, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 o 298 de la SEC ID NO: 2, donde la célula produce una relación de avermectinas de clases 2:1 que es diferente de la relación producida por una célula de la misma cepa de S. avermitilis que expresa el alelo de aveC de tipo silvestre. Es un objetivo principal de los ensayos de selección descritos en este documento, identificar alelos mutados del gen aveC cuya expresión, en células de S. avermitilis, altere y, más particularmente, reduzca la relación de avermectinas de ciases 2:1 producidas. En una realización preferida, ia relación de avermectinas B2:B1 producidas por las células de una nueva cepa de S. avermitilis de la presente invención que expresa un alelo de aveC mutado, o una variante degenerada del mismo, de la presente invención es aproximadamente 1 ,6:1 o menor. En una realización más preferida, la relación iiklk?**?-''tfu * •*'&****'*t< ^.t^¡iia¿~*riM)>u«t-. Ai&i*? *?i*- -*. *i«Mi<i*ak* es aproximadamente 1 :1 o menor. En una realización más preferida, la relación es aproximadamente 0,84:1 o menor. En una realización más preferida, la relación es aproximadamente 0, 80: 1 o menor. En una realización más preferida, la relación es aproximadamente 0,75:1 o menor. En una realización más preferida, la relación es aproximadamente 0,73:1 o menor. En una realización más preferida, la relación es aproximadamente 0,68:1 o menor. En una realización aún más preferida, la relación es aproximadamente 0,67:1 o menor. En una realización más preferida, la relación es aproximadamente 0,57:1 o menor. En una realización aún más preferida, la relación es aproximadamente 0,53:1 o menor. En una realización aún más preferida, la relación es aproximadamente 0,42:1 o menor. En una realización aún más preferida, la relación es aproximadamente 0,40:1 o menor. En una realización específica descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación menor de 1 ,6:1. En una realización especifica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0,94:1. En otra realización específica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0,88:1. En otra realización específica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en tÉÉát ÉÉÉi feiMfc ttti • • *_- • • TfriÉM ?t **- SÍ--» ***** Jutaam^^J^^a. una relación de aproximadamente 0,84:1. En otra realización específica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0,75:1. En otra realización especifica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0,73:1. En otra realización específica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0,68:1. En otra realización específica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0,67:1. En otra realización especifica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0,57:1. En otra realización especifica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciclohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0,53:1. En otra realización especifica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0,42:1. En otra realización especifica diferente descrita más adelante, las nuevas células de la presente invención producen ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0,40:1. En otra realización preferida, la presente invención proporciona nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células que expresan un alelo de aveC mutado o una variante degenerada del mismo, o una construcción genética que comprende un alelo de aveC o una variante degenerada del mismo, en lugar de o además del alelo de aveC de tipo silvestre, donde las células de la nueva cepa producen una cantidad alterada de avermectinas en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. En una realización preferida, la nueva cepa produce una mayor cantidad de avermectinas. En una realización no limitante, la construcción genética comprende además un promotor fuerte, tal como el promotor ermE fuerte constitutivo de Saccharopolyspora erythraea, cadena arriba y en asociación operativa con la ORF de aveC. En otra realización preferida, la presente invención proporciona nuevas cepas de S. avermitilis que comprenden células en las que se ha inactivado el gen aveC. Tales cepas son útiles para el espectro diferente de avermectinas que producen en comparación con la cepa de tipo silvestre, y en ensayos de selección de complementación como se describen en este documento, para determinar si la mutagénesis dirigida o aleatoria del gen aveC afecta a la producción de avermectinas. En una realización especifica descrita más adelante, se modificaron por ingeniería genética células huésped de S. avermitilis para que contuvieran un gen aveC inactivado. Por ejemplo, se generó la cepa SE180-11 descrita en los ejemplos mostrados más adelante, usando el plásmido de reemplazo génico pSE180 (ATCC 209605) (FIGURA 3), que se construyó para inactivar el gen aveC de S. avermitilis por inserción del gen de resistencia ermE en la región codificante de aveC. La presente invención proporciona además productos génicos AveC de S. avermitilis mutados, expresados de forma recombinante, codificados por cualquiera de las moléculas polinucleotídicas mencionadas anteriormente de la invención, y procedimientos para prepararlos. La presente invención proporciona además un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar células de una cepa de S. avermitilis, células que expresan un alelo de aveC mutado que codifica un producto génico que altera la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de una cepa de S. avermitilis que expresa el alelo de aveC mutado en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, en un medio de cultivo en condiciones que permiten o inducen la producción de avermectinas, y recuperar dichas avermectinas del cultivo. En una realización preferida, la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas en el cultivo por las células que expresan el alelo de aveC mutado se reduce. Este procedimiento proporciona una mayor eficacia en la producción de avermectinas valiosas desde el punto de vista comercial, tales como la doramectina. La presente invención proporciona además un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar las células de una cepa de S. avermitilis, células que expresan un alelo de aveC mutado o una construcción genética que comprende un alelo de aveC que da como resultado la producción de una cantidad alterada de avermectinas producidas *J8t^ »...».. ¿^.? r..^ttf^*j *?lBt?Ét-¿Í JL..MMM?*. i i> por las células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo de aveC mutado o una construcción genética, en comparación con las células de la misma cepa que no expresan el alelo de aveC mutado ó la construcción genética, sino que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, en un medio de cultivo en condiciones que permiten o inducen la producción de avermectinas, y recuperar dichas avermectinas del cultivo. En una realización preferida, aumenta la cantidad de avermectinas producidas en el cultivo por las células que expresan el alelo de aveC mutado, la variante degenerada o la construcción genética. La presente invención proporciona además una nueva composición de avermectinas producidas por una cepa de S. avermitilis que expresa un alelo de aveC mutado o una variante degenerada del mismo, que codifica un producto génico que reduce la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo de aveC mutado o la variante degenerada en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, donde las avermectinas de la nueva composición se producen en una relación reducida de clases 2:1 en comparación con la relación de avermectinas de ciases 2:1 producidas por las células de la misma cepa de S. avermitilis que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. La nueva composición de avermectinas puede estar presente según se produce en el fluido de cultivo de fermentación agotado o puede recogerse del mismo. La nueva composición de avermectinas puede purificarse parcial o f*iit JL?^j¡^?»á?iáÉÍtaßí^a ^t?¡í^l^^'~^- A.«.a» ^^á..^fc.*^*JUMn.^*«.^...^..-- J- --*«*£* sustancialmente del fluido de cuttivo por técnicas bioquímicas conocidas de purificación, tales como precipitación con sulfato de amonio, diálisis, fraccionamiento por tamaños, cromatografía de intercambio iónico, HPLC, etc.

Usos de las Avermectinas Las avermectinas son agentes antiparasitarios muy activos que tienen utilidad particular como antihelmínticos, ectoparasiticidas, insecticidas y acaricidas. Los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con los procedimientos de la presente invención son útiles para cualquiera de estos fines. Por ejemplo, los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención son útiles para tratar diversas enfermedades o afecciones en los seres humanos, particularmente cuando estas enfermedades o afecciones están provocadas por infecciones de parásitos, como se sabe en la técnica. Véase, por ejemplo, Ikeda y Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7): 2591-2609. Más particularmente, los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención son eficaces en el tratamiento de una diversidad de enfermedades o afecciones provocadas por endoparásitos, tales como nematodos parásitos, que pueden infectar a los seres humanos, animales domésticos, cerdos, ovejas, aves de corral, caballos o vacas. Más específicamente, los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención, son eficaces contra nematodos que infectan a los seres humanos, así como contra los que infectan diversas especies de animales. Tales nematodos incluyen parásitos gastrointestinales tales como Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Tríchinella, Capillaria, Trichurís, Enterobius, Dirofilaria y parásitos que se encuentran en la sangre o en otros tejidos u órganos, tales como gusanos filáricos y los estados intestinales extractos de Strongyloides y Trichinella. Los compuestos de avermectina producidos, de acuerdo con la presente invención también son útiles en el tratamiento de infecciones por ectoparásitos, incluyendo, por ejemplo, infestaciones de mamíferos y aves provocadas por artrópodos, originadas por garrapatas, ácaros, piojos, pulgas, moscardas, insectos mordedores o larvas de dípteros migratorias que pueden afectar a las vacas y a los caballos, entre otros. Los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención también son útiles como insecticidas contra plagas domésticas tales como, por ejemplo, cucarachas, polillas, derméstidos de las alfombras y mosca doméstica, entre otras, así como plagas de insectos del grano almacenado y de plantas agrícolas, plagas que incluyen la araña roja, áfidos, orugas y ortópteros tales como langostas, entre otros. Los animales que pueden tratarse con los compuestos de avermectina producidos de acuerdo con la presente invención incluyen ovejas, vacas, caballos, ciervos, cabras, cerdos, aves, incluyendo aves de corral, perros y gatos. Un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención se administra en una formulación apropiada para el uso específico pretendido, la especie particular de animal huésped a tratar y el parásito o insecto implicado. Para uso como un parasiticida, un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención puede administrase por vía oral en forma de una cápsula, bolo, comprimido o poción liquida o, como alternativa, puede administrarse en forma de una composición de vertido, de inyección o como un implante. Tales formulaciones se preparan de una forma convencional de acuerdo con la práctica veterinaria estándar. Así pues, las cápsulas, bolos o comprimidos pueden prepararse mezclando el ingrediente activo con un diluyente o vehículo finamente dividido adecuado que contiene además un agente disgregante y/o aglutinante, tal como almidón, lactosa, talco, estearato de magnesio, etc. Una formulación de poción puede prepararse dispersando el ingrediente activo en una solución acuosa junto con un agente de dispersión o humectante, etc. Las formulaciones inyectables pueden prepararse en forma de una solución estéril que puede contener otras sustancias, tales como, por ejemplo, suficientes sales y/o glucosa como para hacer la solución isotónica con la sangre. Tales formulaciones variarán con respecto al peso del compuesto activo dependiendo del paciente o especie de animal huésped a tratar, de la gravedad y tipo de infección y del peso corporal del huésped. Generalmente, para la administración oral es satisfactoria una dosis de compuesto activo de aproximadamente 0,001 a 10 mg por kg de peso corporal del paciente o del animal, administrada en forma de una sola dosis o en dosis divididas, durante un periodo de 1 a 5 días. Sin embargo, puede haber casos en los que estén indicadas dosis superiores o inferiores, lo que determinará, por ejemplo, un médico o veterinario, basándose en los síntomas clínicos. Como alternativa, un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención puede administrarse junto con el pienso del animal y, para este fin, puede prepararse un aditivo alimentario concentrado o premezcla para mezclar con el pienso normal del animal. Para el uso como un insecticida y para el tratamiento de plagas agrícolas, un compuesto de avermectina producido de acuerdo con la presente invención puede aplicarse en forma de una pulverización, polvo fino, emulsión y similar, de acuerdo con la práctica agrícola convencional.

EJEMPLO: Fermentación de Streptomvces Avermitilis y análisis de avermectínas B2:B1 Las cepas que carecen de las actividades de 2-oxo ácido deshidrogenasa de cadena ramificada y 5-O-metiltransferasa no producen avermectinas si el medio de fermentación no se suplementa con ácidos grasos. Este ejempio demuestra que en tales mutantes, puede obtenerse un amplio intervalo de relaciones B2:B1 de avermectinas cuando la biosíntesis se inicia en presencia de diferentes ácidos grasos.

Materiales v Procedimientos Se almacenó Streptomyces avermitilis ATCC 53692 a -70°C como un caldo entero preparado en medio de siembra que constaba de: Almidón (Nadex, Laing National) - 20 g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) - 15 g; Ardamine pH (Yeast Products Inc) - 5 g; carbonato calcico -1 g. El volumen final se ajustó a 1 litro con agua corriente, el pH se ajustó a 7,2 y el medio se esterilizó en un autoclave a 121°C durante 25 minutos. Se usaron 2 ml de una suspensión descongelada de la preparación anterior para inocular un matraz que contenía 50 ml del mismo medio. Después de 48 horas de incubación a 28°C en un agitador rotatorio a 180 rpm, se usaron 2 ml del caldo para inocular un matraz que contenía 50 ml de un medio de producción que constaba de: Almidón - 80 g; carbonato calcico - 7 g; Pharmamedia - 5 g; fosfato ácido dipotásico - 1 g; sulfato de magnesio - 1 g; ácido glutámico - 0,6 g; sulfato ferroso heptahidratado - 0,01 g; sulfato de cinc - 0,001 g; y sulfato manganoso - 0,001 g. El volumen final se ajustó a 1 litro con agua corriente, el pH se ajustó a 7,2 y el medio se esterilizó en autoclave a 121°C durante 25 minutos. Se disolvieron diversos ácidos carboxílicos sustratos (véase la cuadro 1 ) en metanol y se añadieron al caldo de fermentación 24 horas después de la inoculación para dar una concentración final de 0,2 g/litro. El caldo de fermentación se incubó durante 14 días a 28°C, después se centrifugó (2.500 rpm durante 2 minutos) y se desechó el sobrenadante. El _^fc^^-S^ ^ *-.lt¿ÍB&_tt. sedimento miceliano se extrajo con acetona (15 ml) y después con diclorometano (30 ml) y la fase orgánica se separó, se filtró y después se evaporó a sequedad. El residuo se recogió en metanol (1 ml) y se analizó por HPLC con un cromatógrafo líquido Hewlett-Packard 1090A equipado con un detector de exploración de ordenación de diodos fijado a 240 nm. La columna usada fue una columna de 4,6 mm x 25 cm, 5 Mm, C-18 de Beckman Ultrasphere, mantenida a 40°C. Se inyectaron 25 µl de la solución de metanol anterior en la columna. La elución se realizó con un gradiente lineal de metanol-agua de 80:20 a 95:5 durante 40 minutos a 0,85 ml/min. Se usaron dos concentraciones patrón de ciciohexil B1 para calibrar la respuesta del detector y se midieron las áreas bajo las curvas para las avermectinas B2 y B1.

Resultados Los tiempos de retención de HPLC observados para las avermectinas B2 y B1 y las relaciones 2:1 se muestran en la cuadro 1.

CUADRO 1 Los datos presentados en la cuadro 1 demuestran un intervalo extremadamente amplio de relaciones de productos de avermectinas B2:B1, lo que indica una diferencia considerable en los resultados de la conversión deshidratante de los compuestos de clase 2 en compuestos de clase 1, dependiendo de la naturaleza de la cadena lateral de ácido graso de la unidad iniciadora suministrada. Esto indica que los cambios en las relaciones de B2:B1 que resultan de las alteraciones en la proteína AveC, pueden ser específicos para sustratos particulares. Por consiguiente, la selección de mutantes que presentan cambios en la relación B2:B1 obtenida con un sustrato particular necesita realizarse en presencia de ese sustrato. Los ejemplos descritos más delante usan ácido ciclohexanocarboxílico como sustrato de selección. Sin embargo, este sustrato se usa simplemente para ilustrar el potencial y no pretende limitar la aplicabilidad de la presente invención.

EJEMPLO: Aislamiento del gen aveC Este ejemplo describe el aislamiento y caracterización de una región del cromosoma de Streptomyces avermitilis que codifica el producto génico AveC. Como se demuestra más adelante, el gen aveC se identificó como un gen capaz de modificar la relación entre las ciclohexil-B2 y las ciclohexil-B1 (B2:B1 ) avermectinas producidas.

Materiales y Procedimientos Crecimiento de Streptomvces para el Aislamiento del ADN Se siguió el siguiente procedimiento para cultivar Streptomyces.

Se aislaron colonias individuales de S. avermitilis ATCC 31272 (aislado n° 2 de colonias individuales) en YDP-6 de concentración media que contenía: Extracto de Levadura de Difco - 5 g; Bacto-peptona de Difco - 5 g; dextrosa - AflÉ¿ÉááÉftiÍ?>-J'ilt,M»*- -*^^-«- t ..j. «.?-J»^J.^t^Ji»?^?M JU^II^É^ 2,5 g; MOPS - 5 g; y Bacto altar de Difco - 15 g. El volumen final se ajustó a 1 litro con H20 destilada, el pH se ajustó a 7,0 y el medio se esterilizó en un autoclave a 121 °C durante 25 minutos. Los micelios desarrollados en el medio anterior se usaron para inocular 10 ml de medio TSB (Difco Tryptic Soy Broth - 30 g, en 1 litro de H20 destilada, esterilizado en autoclave a 121 °C durante 25 minutos) en un tubo de 25 mm x 150 mm que se mantuvo con agitación (300 rpm) a 28°C durante 48-72 horas.

Aislamiento de ADN Cromosómico de Streptomvces Se pusieron alícuotas (de 0,25 ml a 0,5 ml) de los micelios desarrollados como se ha descrito anteriormente en tubos de microcentrífuga de 1 ,5 ml y las células se concentraron por centrifugación a 12.000 x g durante 60 seg. El sobrenadante se desechó y las células se resuspendieron. en 0,25 ml de tampón TSE (20 ml de sacarosa 1 ,5 M, 2,5 ml de Tris-HCl 1 M, pH 8,0, 2,5 ml de EDTA 1 M, pH 8,0 y 75 ml de H20 desfilada) que contenía 2 mg/ml de lisozima. Las muestras se incubaron a 37°C durante 20 minutos con agitación, se cargaron en un instrumento automático de aislamiento de ácidos nucleicos AutoGen 540™ (Integrated Separation Systems, Natick, MA) y se aisló el ADN genómico usando Cycle 159 (software del equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como alternativa, se pusieron 5 ml de micelio en un tubo de 17 mm x 100 mm, las células se concentraron por centrifugación a 3.000 rpm durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 1 ml de tampón TSE, se concentraron por centrifugación a 3.000 rpm durante 5 minutos y se retiró el sobrenadante. Las células se resuspendieron en 1 ml de tampón TSE que contenía 2 mg/ml de lisozima y se incubaron a 37°C con agitación durante 30-60 minutos. Después de la incubación, se añadieron 0,5 ml dodecil sulfato sódico (SDS) al 10% y las células se incubaron a 37°C hasta que se completó la lisis. El lisado se incubó a 65°C durante 10 minutos, se enfrió a temperatura ambiente, se dividió en dos tubos Eppendorf de 1 ,5 ml y se extrajo 1 vez con 0,5 ml de fenol/cloroformo (50% de fenol previamente equilibrado con Tris 0,5 M, pH 8,0; 50% de cloroformo). La fase acuosa se retiró y se extrajo de 2 a 5 veces con cloroformo: alcohol isoamílico (24:1 ). El ADN se precipitó mediante la adición de 1/10 volúmenes de acetato sódico 3 M, pH 4,8, incubación de la mezcla en hielo durante 10 minutos, centrifugación de la mezcla a 15.000 rpm a 5°C durante 10 minutos y separación del sobrenadante poniéndolo en un tubo limpio al que se añadió 1 volumen de isopropanol. La mezcla de sobrenadante más isopropanol después se incubó en hielo durante 20 minutos, se centrifugó a 15.000 rpm durante 20 minutos a 5°C, el sobrenadante se retiró y el sedimento de ADN se lavó una vez con etanol al 70%. Después de secar el sedimento, el ADN se resuspendió en tampón TE (Tris 10 mM, EDTA 1 MM, pH 8,0).

Aislamiento del ADN Plasmídico de Streptomvces Se puso una alícuota (1 ,0 m) de micelio en tubos de microcentrífuga de 1 ,5 ml y las células se concentraron por centrifugación a 12.000 x g durante 60 segundos. El sobrenadante se desechó, las células se resuspendieron en 1 ,0 ml de sacarosa al 10,3%, se concentraron por centrifugación a 12.000 x g durante 60 segundos y el sobrenadante se desechó. Las células después se resuspendieron en 0,25 ml de tampón TSE que contenía 2 mg/ml de lisozima, se incubaron a 37°C durante 20 minutos con agitación y se cargaron en el instrumento automático de aislamiento de ácido nucleico AutoGen 540™. El ADN plasmídico se aisló usando Cycle 106 (software del equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Como alternativa, se pusieron 1 , 5 ml de micelio en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml y las células se concentraron por centrifugación a 12.000 x g durante 60 segundos. El sobrenadante se desechó, las células se resuspendieron en 1 ,0 ml de sacarosa al 10,3% y se concentraron por centrifugación a 12.000 x g durante 60 segundos y el sobrenadante se desechó. Las células se resuspendieron en 0,5 ml de tampón TSE que contenía 2 mg/ml de lisozima y se incubaron a 37°C durante 15-30 minutos. Después de la incubación, se añadieron 0,25 ml de SDS alcalino (NaOH 0,3 N, SDS al 2%) y las células se incubaron a 55°C durante 15-30 minutos o hasta que la solución fue transparente. Se añadió acetato sódico (0,1 ml, 3 M, pH 4,8) a la solución de ADN; la cual después se incubó en hielo durante 10 minutos. Las muestras de ADN se centrifugaron a 14.000 rpm durante 10 minutos a 5°C. El sobrenadante se retiró a un tubo limpio, se añadieron 0,2 ml de fenol cloroformo (501 de fenol: 50% de cloroformo) y se mezclaron suavemente. La solución de ADN se centrifugó a, 14.000 rpm durante 10 minutos a 5°C y la capa superior se retiró en un tubo Eppendorf limpio. Se añadió isopropanol (0,75 ml), la solución se mezcló suavemente y después se incubó a temperatura ambiente durante 20 minutos. La solución de ADN se centrifugó a 14.000 rpm durante 15 minutos a 5°C, el sobrenadante se retiró y el sedimento de ADN se lavó con etanol al 70%, se secó y se resuspendió en tampón TE.

Aislamiento de ADN Plasmídico de E. coli. Se inoculó una colonia de E. coli transformada individual en 5 ml de medio Luria-Bertani (LB) (BactoTriptona - 10 g; Extracto de Bacto levadura - 5 g; y NaCI -10 gen 1 litro de H20 destilada, pH 7, 0, esterilizado en autoclave a 121°C durante 25 minutos y suplementado con 100 µg/ml de ampicilina). El cultivo se incubó durante una noche y se puso una alícuota de 1 ml en un tubo de microcentrífuga de 1 ,5 ml. Las muestras de cultivo se cargaron en el instrumento automático de aislamiento de ácidos nucleicos AutoGen 540™ y se aisló el ADN plasmídico usando el Cycle 3 (software del equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Preparación v Transformación de Protoplastos de S. avermitilis. Se aislaron colonias individuales de S. avermitilis en YPD-6 de concentración media. Los micelios se usaron para inocular 10 ml de medio TSB en un tubo de 25 mm x 150 mm que después se incubó con agitación (300 rpm) a 28°C durante 48 horas. Se usó 1 ml de micelio para inocular 50 ml de medio YEME. El medio YEME contiene, por litro: Extracto de Levadura de Difco - .3 g; Bacto-peptona de Difco - 5 g; Extracto de Malta de Difco - 3 g; Sacarosa - 300 g. Después de la esterilización en autoclave a 121 °C durante 25 minutos, se añadió lo siguiente: MgCI2 • 6 H20 2,5 M (esterilizado por separado en un autoclave a 121 °C durante 25 min) - 2 ml; y glicina (20%) (esterilizado por filtración) - 25 ml. Los micelios se desarrollaron a 30°C durante 48-72 horas y se recogieron por centrifugación en un tubo de centrífuga de 50 ml (Falcon) a 3.000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante se desechó y los micelios se resuspendieron en tampón P, que contiene: sacarosa - 205 g; K2S04 - 0,25 g; MgCI2 - 6H20 - 2,02 g; H20 - 600 ml; K2P04 (0,5%) - 10 ml; solución de oligoelementos - 20 ml; CaCI2 - 2H20 (3, 68%) - 100 ml; y tampón MES (1 ,0 M, pH 6,5) - 10 ml. (* La solución de oligoelementos contiene por litro: ZnCI2 -40 mg; FeCI3 • 6H20 - 200 mg; CUCI2 • 2H20 - 10 mg; MnCI2 • 4 H20 - 10 mg; Na2B407 • 10H2O - 10 mg; (NH4)6 • M07024 • 4H20 - 10 mg) . El pH se ajustó a 6, 5, el volumen final se ajustó a 1 litro y el medio se filtró en caliente a través de un filtro de 0,45 micrómetros. Los micelios se reunieron a 3.000 rpm durante 20 min., el * *— ••'"'— ""— • - •" - -'""- A-'í?lf?Ili¡?iiraiiltÜÉIÍlii"fflÉtÍ¡Tl áÜit-Jíl sobrenadante se desechó y los micelios sé resuspendieron en 20 ml de tampón P que contenía 2 mg/ml de lisozima. Los micelios se incubaron a 35°C durante 15 minutos con agitación y se comprobaron microscópicamente para determinar el grado de formación de protoplastos. Cuando se completó la formación de protoplastos, los protoplastos se centrifugaron a 8.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se retiró y los protoplastos se resuspendieron en 10 ml de tampón P. Los protoplastos se centrifugaron a 8.000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se retiró, los protoplastos se resuspendieron en 2 ml de tampón P y se distribuyeron aproximadamente 1 x 109 protoplastos en viales criogénicos de 2,0 ml (Nalgene). Un vial que contenía 1 x 109 protoplastos se centrifugó a 8.000 rpm durante 10 minutos, el sobrenadante se retiró y los protoplastos se resuspendieron en 0,1 ml de tampón P. Se añadieron de 2 a 5 µg de ADN transformante a los protoplastos, seguido inmediatamente por la adición de 0,5 ml de tampón T de trabajo. La base de tampón T contiene: PEG1000 (Sigma) - 25 g; sacarosa - 2,5 g; H20 - 83 ml. El pH se ajustó a 8,8 con NaOH 1 N (esterilizado por filtración) y la base de tampón T se esterilizó por filtración y se almacenó a 4°C. El tampón T de trabajo, hecho el mismo día del uso, era base de tampón T - 8, 3 ml; K2P04 (4 mM) - 1 , 0 ml; CaCI2 • 2H20 (5 M) - 0,2 ml; y TES (1 M, pH 8) - 0,5 ml. Cada componente del tampón T de trabajo se esterilizó por filtración individualmente. Dentro de un período de 20 segundos desde la adición del tampón T a los protoplastos, también se añadió 1 ml de tampón P y los protoplastos se centrifugaron a 8.000 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se desechó y los protoplastos se resuspendieron en 0,1 ml de tampón P. Los protoplastos después se aplicaron en placas en medio RM14 que contiene: sacarosa - 205 g; K2S04 - 0,25 g; MgCI2 • 6H20 - 10,12 g; glucosa - 10 g; Casaminoácidos de Difco - 0,1 g; Extracto de Levadura de Difco - 5 g; Agar de Harina de Avena de Difco - 3 g; Bacto Agar de Difco - 22 g; H20 destilada - 800 ml. La solución se esterilizó en un autoclave a 121 °C durante 25 min. Después del tratamiento en autoclave, se añadieron soluciones madre estériles de lo siguiente: K2P04 (0,5 1 ) 10 ml; CaCI2 • 2H20 (5 M) - 5 m1 ; L-prolina (205) - 15 ml; tampón MES (1 ,0 M, pH 6,5) - 10 ml; solución de oligoelementos (la misma que se ha descrito anteriormente) - 2 ml; solución madre de cicloheximida (25 mg/ml) - 40 ml; y NaOH 1 N - 2 ml. Se aplicaron alícuotas de 25 ml de medio RM14 por placa y las placas se secaron durante 24 horas antes del uso. Los protoplastos se incubaron con una humedad del 95% a 30°C durante 20-24 horas. Para seleccionar los transformantes resistentes a tiostrepton, se extendió uniformemente 1 ml de tampón de recubrimiento que contenía 125 µg x ml de tiostrepton sobre las placas de regeneración de RM14. Los tampones de recubrimiento contienen por 100 ml: sacarosa - 10,3 g; solución de oligoelementos (la misma que se ha descrito anteriormente) - 0,2 ml; y MES (1 M pH 6,5) - 1 ml. Los protoplastos se incubaron con una humedad del 95% a 30°C durante 7-14 días hasta que fueron visibles las colonias resistentes a tiostrepton (Thior).

Transformación de Protoqlastos de Streptomyces lividans En algunos casos, se usó S. lítiidans TK64 (proporcionado por John Innes Institute, Norwich, Reino Unido.) para las transformaciones. Los procedimientos y composiciones para el desarrollo, la obtención de protoplastos y la transformación de S. lividans se describen en Hopwood y col., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, Reino Unido y se realizaron como se describe en este documento. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes de S. lividans como se describe en la Sección 7.1.3 anterior.

Análisis de Fermentación de Cenas de S. avermitilis Se inocularon micelios de S. avermitilis desarrollados en YPD-6 de, concentración media durante 4-7 días en tubos de 2,54 x 15,24 cm que contenían 8 ml de medio de preformación y dos perlas de vidrio de 5 mm. El medio de preformación contiene:, almidón soluble (almidón hervido fino o KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) - 20 g/1 ; Pharmamedia - 15 g/l; Ardamine pH - 5 g/l (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaC03 - 2 g/1 ; 2 x befa ("befa" se refiere a ácidos grasos de cadena ramificada) que contiene una concentración final en el medio :de 50 ppm de ácido 2-(+/-)-metil butírico, 60 ppm de ácido isobutírico y 20 ppm de ácido isovalérico. El pH se ajustó a 7,2 y el medio se trató en un autoclave a 121°C, durante 25 min. El tubo se agitó con un ángulo de 17° a 215 rpm a 29°C durante 3 días. Se usó una alícuota de 2 ml del cultivo de siembra para inocular un matraz Erlenmeyer de 300 ml que contenía 25 ml de medio de producción que contiene: almidón (almidón hervido fino o KOSO) - 160 g/l; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) - 10 g/l; Ardamine pH - 10 g/l; K2P04 - 2 g/l; MgS04 • 4 H20 - 2 g/l; FeS04 • 7H20 - 0, 02 g/1 ; MnCI2 - 0,002 g/l; ZnS04 -7H20 - 0,002 g/l; CaC03 - 14 g/l; 2x befa (como se ha indicado anteriormente); y ácido ciciohexano carboxílico (CHC) (preparado como una solución al 20% a pH 7,0) - 800 ppm. El pH se ajustó a 6,9 y el medio se esterilizó en un autoclave a 121 °C durante 25 minutos. Después de la inoculación, el matraz se incubó a 29°C durante 12 días con agitación a 200 rpm. Después de la incubación, se extrajo una muestra de 2 ml del matraz, se diluyó con 8 ml de metanol, se mezcló y la mezcla se centrifugó a 1.250 x g durante 10 minutos para sedimentar los residuos. Después, el sobrenadante se ensayó por HPLC usando una columna ODS Beckman Ultrasphere (25 cm x 4,6 mm DI) con un caudal de 0,75 ml/min y detección por absorbancia a 240 nm. La fase móvil fue metanol/agua/acetonitrilo 86/8,9/5,1. 7.1.8. Aislamiento de Genes PKS de S. avermitilis. Se preparó una biblioteca de cósmidos del ADN cromosómico de S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2) y se híbrido con una sonda de cetosintasa (KS) obtenida a partir de un fragmento del gen de la policeturo sintasa (PKS) de Saccharopolyspora erythraea. Puede encontrarse una descripción detallada de la preparación de bibliotecas de cósmidos en Sambrook y col., 1989, mencionado anteriormente. En Hopwood y col., 1985, indicado iU^l ^ anteriormente, se presenta una descripción detallada de la preparación de bibliotecas de ADN cromosómico de Streptomyces. Los clones de los cósmidos que contenían regiones que hibridaban con la cetosintasa se identificaron por hibridación con un fragmento Ndel/Eco47lll de 2,7 kb procedente de pEX26 (suministrado amablemente por el Dr. P. Leadlay, Cambridge, Reino Unido). Se digirieron aproximadamente 5 ng de pEX26 usando Ndel y Eco47lll. La mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa GTG SeaPlaque al 0,8% (FMC BioProducts, Rockland, ME). El fragmento Ndel/Eco47lll de 2,7 kb se escindió del gel después de la electroforesis y el ADN se recuperó del gel usando GELase™ de Epicentre Technologies, usando el Protocolo Rápido. El fragmento Ndel/Eco47lll de 2,7 kb se marcó con [a32p ] dCTP (desoxicitidina 5' -trifosfato, sal de tetra (trietilamonio), [alfa- 32P] -) (NEN-Dupont, Boston, MA) usando el Sistema de Traducción con Mella BRL (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se realizó una reacción típica en un volumen de 0,05 ml. Después de la adición de 5 pl de tampón de detención, el ADN marcado se separó de los nucleótidos no incorporados usando una columna G-25 Sephadex Quick Spin™ (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del proveedor. Se seleccionaron aproximadamente 1 .800 clones de cósmidos por hibridación de colonias. Se identificaron 10 clones que hibridaban fuertemente con la sonda KS de Sacc. erythraea. Las colonias de E. colí que contenían el ADN del cósmido se desarrollaron en medio líquido LB y el ADN del cósmido se aisló de cada cultivo en el instrumento automático de aislamiento de ácidos nucleicos AutoGen 540™ usando el Cycle 3 (software del equipo) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El mapeo con endonucleasas de restricción y los análisis de hibridación con transferencia de Southern revelaron que cinco de los clones contenían regiones cromosómicas solapantes. Se construyó un mapa de restricción BamHl del genoma de S. avermitilis de los cinco cósmidos (es decir, pSE65, pSE66, pSE67, pSE68 y pSE69) mediante análisis de los cósmidos solapantes e hibridaciones (FIGURA 4).

Identificación de ADN qué Modula las Relaciones de Avermectinas B2:BI e Identificación de una ORF de aveC Se usaron los siguientes procedimientos para ensayar fragmentos subclonados derivados del clon cosmídico pSE66 con respecto á su capacidad de modular las relaciones de avermecfinas B2:B1 en los mutantes AveC. pSE66 (5 µg) Se digirió con Sacl y BamHl. La mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa SeaPlaque™ GTG al 0,8% ,(FMC BioProducts), se escindió un fragmento Sacl/BamHI de 2,9 kb del gel después de la electroforesis y el ADN se recuperó del gel usando GELase™ (Epicentre Technologies) usando el Protocolo Rápido. Se digirieron aproximadamente 5 µg del vector lanzadera pWHM3 (Vara y col., 1989, J. Bacteriol. 171 :5872-5881 ) con Sacl y BamHl. Se mezclaron aproximadamente 0, 5 µg del inserto de 2, 9 kb y 0,5 µg del pWHM3 digerido y se incubaron durante una noche con . **, una unidad de ligasa (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) a 15°C, en un volumen total de 20 µl, de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la incubación, se incubaron 5 µl de la mezcla de ligación a 70°C durante 10 minutos, se enfriaron a temperatura ambiente y se usaron para transformar células DH5a de E. coli competentes (BRL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto Sacl/BamHI de 2,9 kb por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE119. Se prepararon los protoplastos de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis (cepa interna de Pfizer) y se transformaron con pSE119 como se ha descrito en la sección 7.1.5 anterior. La cepa 1100-SC38 es un mutante que produce significativamente más de la forma de ciciohexil avermectina B2 que de la forma ciciohexil avermectina-B1 cuando se suplementa con ácido ciciohexano carboxílico (B2:B1 de aproximadamente 30:1 ). Se aisló pSE119 usado para transformar protoplastos de S. avermitilis de la cepa de E. coli GM2163 (Obtenida de Dr. B. J. Bachmann, Curator, E. colí Genetic Stock Center, Yale University), la cepa DM1 de E. Coli (BRL), o la cepa TK64 de S. lividans. Se aislaron transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa 1100-SC38 y se analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. Los transformantes de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis que contenían pSE119 produjeron una relación alterada de ciciohexil avermectina-B2:ciclohexil avermectina-B1 de aproximadamente 3,7:1 (cuadro 2). Habiendo establecido que pSE119 era capaz de modular las relaciones de avermectinas B2:B1 en un mutante de AveC, se secuenció el inserto de ADN. Se aislaron aproximadamente 10 µg de pSE119 usando el equipo de aislamiento de ADN plasmídico (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante y se secuenció usando un secuenciador de ADN automático ABI 373A (Perkin Elmer, Foster City, CA). Los datos de la secuencia se recopilaron y editaron usando programas Genetic Computer Group (GCG, Madison, Wl). La secuencia de ADN y la ORF de aveC se presentan en la figura 1 (SEC ID NO:1 ). Se construyó un nuevo plásmido, denominado pSE118, como se indica a continuación. Se digirieron aproximadamente 5 µg de pSE66 con Sphl y BamHl. La mezcla de reacción se cargó en un gel de agarosa SeaPlaque GTG al 0,8% (FMC BieProducts), se escindió un fragmento Sphl/BamHI de 2,8 kb del gel después de la electroforesis y el ADN se recuperó del gel usando GELase™ (Epicentre Technologies) usando el Protocolo Rápido. Se digirieron aproximadamente 5 µg del vector lanzadera pWHM3 con Sphl y BamHl. Se mezclaron aproximadamente 0,5 µg del inserto de 2,8 kb y 0,5 µg de pWHM3 digerido y se incubaron durante una noche con una unidad de ligasa (New England Biolabs) a 15°C en un volumen total de 20 µl de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Después de la incubación, se incubaron 5 µl de la mezcla de ligación a 70°C durante 10 minutos, se enfriaron a temperatura ambiente y se usaron para transformar células DH5a de E. coli competentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto Sphl/BaMHI de 2,8 kb por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE118. El ADN del inserto en pSE118 y pSE119 solapa en aproximadamente 838 nucleótidos (FIGURA 4). Los protoplastos de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis se transformaron con pSE118 como se ha indicado anteriormente. Los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa 1100-SC38 se aislaron y analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. Los transformantes de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis que contenían pSE118 no se alteraron en las relaciones de ciciohexil avermectina-B2:ciclohexil avermectina-B1 en comparación con la cepa 1100-SC38 (cuadro 2).

Amplificación por PCR del Gen aveC a partir del ADN Cromosómico de S. avermitilis Se aisló un fragmento de - 1 ,2 kb que contenía la ORF de aveC del ADN cromosómico de S. avermitilis por amplificación por PCR, usando cebadores diseñados basándose en la secuencia de nucleótidos de aveC obtenida anteriormente. Los cebadores de PCR se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador hacia la derecha fue: 5'-TCACGAAACCGGACACAC-3' (SEC ID NO: 6); y el cebador hacia la izquierda fue: d'-CATGATCGCTGAACCGAG-S' (SEC ID NO: 7) . La reacción por PCR se realizó con polimerasa Deep Vent™ (New England Biolabs) en tampón proporcionado por el fabricante y en presencia de dNTP 300 µM, glicerol al 10%, 200 pmoles de cada cebador, 0,1 µg de molde y 2,5 unidades de enzima en un volumen final de 100 µl, usando un aparato de ciclos térmicos Perkin-Elmer Cetus. El perfil térmico del primer ciclo fue de 95°C durante 5 minutos (etapa de desnaturalización), 60°C durante 2 minutos (etapa de reasociación) y 72°C durante 2 minutos (etapa de extensión). Los 24 ciclos posteriores tuvieron un perfil térmico similar con la excepción de que la etapa de desnaturalización se acortó a 45 segundos y la etapa de reasociación se acortó a 1 minuto. El producto de PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se detectó una sola banda'de ADN de - 1 ,2 kb. Este ADN se purificó del gel y se ligó a 25 µg de vector romo pCR-Blunt linealizado (Invitrogen) en una relación de vector a inserto 1 :10 molar, siguiendo las instrucciones del fabricante. La mezcla de ligación se usó para transformar células E. coli competentes One Shot™ (Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto de - 1 ,2 kb mediante análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE179. El ADN del inserto de pSE179 se aisló mediante digestión con BamHI/Xbal, se separó por electroforesis, se purificó del gel y se ligó al vector lanzadera pWHM3, que también se había digerido con BamHI/Xbal, en una concentración total de ADN de 1 µg en una relación de vector a inserto de 1 :5 molar. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH5a de E. coli competentes de acuerdo con las instrucciones' del fabricante. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto de - 1 ,2 kb mediante análisis de restricción. Este plásmido, que se denominó pSE186 (FIGURA 2, ATCC 209604) se utilizó para transformar DM1 de E coli, y el ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina.

Resultados Se identificó un fragmento Sacl/BamHI de 2,9 kb de pSE119 que, cuando se utilizaba para transformara la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis, alteraba significativamente la relación de producción de avermectinas B2:B1. La cepa 1100SC38 de S. avermitilis normalmente tiene una relación B2:B1 de aproximadamente 30:1 , pero cuando se transforma con un vector que comprende el fragmento Sacl/BamHI de 2,9 kb, la relación de avermectinas B2:B1 se reduce a aproximadamente 3,7:1. El análisis de los cultivos de transformantes después de la fermentación verificó la presencia del ADN transformante. Se secuenció el fragmento pSE119 de 2,9 kb y se identificó una ORF de - 0,9 kb (FIGURA 1 ) (SEC ID NO: 1) que incluye un fragmento Pstl/Sphl que previamente se había mutado para producir sólo productos B2 (Ikeda y col., 1995, mencionado anteriormente). Una comparación de esta ORF o su correspondiente polipéptido deducido, con bases de datos conocidas (GenEMBL, SWISS-PROT) no mostró ninguna homología fuerte con el ADN o las secuencias proteicas conocidas. El cuadro 2 presenta el análisis de fermentación de la cepa ?it1»?l m?tJlÉt'jl"*-*4h**' 1100-SC38 de S. avermitilis transformada con diversos plásmidos.

CUADRO 2 EJEMPLO: Construcción de mutantes de AveC de S. Avermitilis Este ejemplo describe la construcción de varios mutantes diferentes de AveC de S. avermitilis usando las composiciones y procedimientos descritos anteriormente. Kieser y Hopwood, 1991 , Meth. Enzym. 204:430-458 exponen una descripción general de técnicas para introducir mutaciones en ungen de Streptomyces. Anzai y col., 1988, J. Antibiot. XLI (2) :226-233 y Stutzman-Engwail y col., 1992, J. Bacteriol. 174(1 ): 144-154 proporcionan una descripción más detallada. Estas referencias se incorporan aquí por referencia en su totalidad. i í¿ &M?*«, fO*k^^*>kl kM¡»t&* ítíiMá?tMátUi Inactivación dfl Gen aveC de S. avermitih's Se construyeron mutantes de AveC que contenían genes aveC inactivados, usando varios procedimientos, como se detalla a continuación. En el primer procedimiento se reemplazó un fragmento Sphl/Pstl de 640 pb interno al gen aveC en pSE119 (plásmido descrito en la sección 7.1.9, anterior) por el gen ermE (para resistencia a eritromicina) de Sacc. erythraea. El gen ermE se aisló de plJ4026 (proporcionado por John Innes Institute, Norwich, Reino Unido; véase también Bibb y col., 1985, Gene 41 :357-368) mediante digestión con enzimas de restricción, con Bglll y EcoRI, seguido por electroforesis, y se purificó del gel. Este fragmento de - 1 ,7 kb se ligó a pGEM7Zf (Promega) que se había digerido con BamHl y EcoRI y la mezcla de ligación se utilizó para transformar células DH5a de E. coli competentes siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto de - 1 ,7 kb se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE27. pSE118 (descrito en la Sección 7.1.9 anterior) se digirió con Sphl y BamHl, el producto de digestión se sometió a electroforesis y el inserto Sphl/BamHI de - 2,8 kb se purificó del gel. pSE119 se digirió con Pstl y EcoRI, el producto de digestión se sometió a electroforesis y el inserto Pstl/EcoRI de - 1 ,5 kb se purificó del gel. El vector lanzadera pWHM3 se digirió con BamHl y EcoRl. pSE27 se digirió con Pstl y Sphl, el producto de digestión se sometió a electroforesis y el inserto Pstl/Sphl de - 1 ,7 kb se purificó del gel. Los cuatro fragmentos (es decir, de - 2,8 kb, ~ 1 ,5 kb, - 7,2 kb y - 1 ,7 kb) se ligaron entre sí en una. ligación de cuatro vías. La mezcla de ligación se utilizó para transformar células DH5a de E coli competentes siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE180 (FIGURA 3; ATCC 209605). pSE180 se utilizó para transformar TK64 de S. lividans y las colonias transformadas se identificaron por resistencia a tiostrepton y eritromicina. pSE180 se aisló de S. lividans y se usó para transformar protoplastos de S. avermitilis. Se identificaron cuatro transformantes de S. avermitilis resistentes a tiostrepton y los protoplastos se prepararon y cultivaron en placas en condiciones no selectivas en medio RM14. Después de regenerar los protoplastos, se seleccionaron colonias individuales con respecto a la presencia de resistencia a eritromicina y la ausencia de resistencia a tiostrepton, indicando la integración cromosómica del gen aveC inactivado y la pérdida del replicón libre. Se identificó un transformante Ermr Thios y se denominó cepa SE180-11. El ADN cromosómico total se aisló de la cepa SE18011 , se digirió con las enzimas de restricción BamHl, Híndll, Pstl o Sphl, se resolvió por electroforesis en un gel de agarosa al 0,8%, se transfirió a membranas de nailon y se hibridó con la sonda ermE. Estos análisis demostraron que la integración cromosómica del gen 'de resistencia ermE y la deleción conjunta del fragmento Pstl/Sphl de 640 pb se había producido por un acontecimiento cruzado doble. El análisis de HPLC de los productos de fermentación de la cepa SE180-11 , demostró que ya no se producían avermectinas normales (FIGURA 5A) . En un segundo procedimiento para inactivar el gen aveC, el gen ermE de 1 ,7 kb se retiró del cromosoma de la cepa SE180-11 de S. avermitilis, dejando una deleción Pstl/Sphl de 640 pb en el gen aveC. Se construyó un plásmido de reemplazo génico como se indica a continuación: se digirió parcialmente pSE180 con Xbal y se purificó un fragmento de 11 ,4 kb del gel. La banda de - 11 ,4 kb carece del gen de resistencia ermE de 1 ,7 kb. Después, el ADN se ligó y transformó a células DH5a de E coli. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó mediante análisis de restricción. Este plásmido, que se denominó pSE184, se utilizó para transformar DM1 de E coli y el ADN plasmídico se aisló a partir de los transformantes resistentes a ampicilina. Este plásmido se usó para transformar protoplastos de la cepa SE180-11 de S. avermitilis. Los protoplastos se prepararon a partir de los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa SE180-11 y se cultivaron en placas como colonias individuales en RM14. Después de regenerar los protoplastos, se seleccionaron colonias individuales con respecto a la ausencia de resistencia a eritromicina y resistencia a tiostrepton, indicando integración cromosómica del gen aveC inactivado y pérdida del replicón libre que contenía el gen ermE. Se identificó un transformante Erms Thios y se denominó SE184-1-13. El análisis de fermentación de SE184-1-13 demostró que no se producían avermectinas normales y que SE 184-1 -13 tenía el mismo perfil de fermentación que SE180-11. En un tercer procedimiento para inactivar el gen aveC, se introdujo un desplazamiento de fase en el gen aveC cromosómico añadiendo dos G después de la C en la posición de nucleótido 471 usando PCR, con lo que se creaba un sitio BspE1 : La presencia del sitio BspEl, obtenido por ingeniería genética, era útil para detectar el acontecimiento del reemplazo génico. Los cebadores de PCR se diseñaron para introducir una mutación de desplazamiento de fase en el gen aveC y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. El cebador hacia la derecha fue: 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEC ID NO: 8) y el cebador hacia la izquierda fue: 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEC ID NO: 9). Las condiciones de PCR fueron como se describe en la Sección 7.1.10 antepor. El producto de PCR de 666 pb se digirió con Sphl para dar dos fragmentos de 278 pb y 388 pb, respectivamente. El fragmento de 388 pb se purificó del gel. El plásmido de reemplazo génico se construyó como se indica a continuación: se digirió el vector lanzadera pWHM3 con EcoRI y BamHl. pSE119 se digirió con BamHl y Sphl, el producto de digestión se sometió a electroforesis y se purificó un fragmento de - 840 pb del gel. pSE119 se digirió con EcoRI y Xmnl, el producto de digestión se resolvió por electroforesis y se purificó un fragmento de - 1 ,7 kb del gel. Los cuatro fragmentos (es decir, -7,2 kb, - 840 pb, 1 ,7 kb y 388 pb) se ligaron entre si en una ligación de cuatro vías. La mezcla de ligación se utilizó para transformar células DH5a de E. coli . ts, OrMk?±&?í?Mte l riiilí?rijfi Éá nil competentes. El ADN plasmídico se aisló cae los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto correcto mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este plásmido, que se denominó pSE185, se utilizó para transformar DM1 de E coli y se aisló el ADN plasmídico a partir de los transformantes resistentes a ampicilina. Este plásmido se usó para transformar protoplastos de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis. Los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa 1100-SC38 se aislaron y analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. pSE185 no alteraba significativamente las relaciones de avermectinas B2:B1 cuando se utilizaba para transformar la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis (cuadro 2). pSE185 se usó para transformar protoplastos de S. avermitilis para generar una mutación de desplazamiento de fase en el gen aveC cromosómico. Se prepararon protoplastos a partir de transformantes resistentes a tiostrepton y se cultivaron en placas como colonias individuales en RM14. Después de regenerar los protoplastos, se seleccionaron las colonias individuales con respecto a la ausencia de resistencia a tiostrepton. Se aisló el ADN cromosómico a partir de las colonias sensibles a tiostrepton y se seleccionó por PCR con respecto a la presencia de mutación de desplazamiento de fase integrada en el cromosoma. Los cebadores de PCR se diseñaron basándose en la secuencia de nucleótidos de aveC y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador de PCR hacia la derecha fue: 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEC ID NO: 10) y el tt_ ^^»^--'^^A^w*-*'*>**-*«»»*' ni ti iu tg imi átf cebador de PCR hacia la izquierda fue: 5'-GAA000ACCGCCTGATAC-3' (SEC ID NO: 11) y las condiciones de PCR fueron como se han descrito anteriormente en la Sección 7.1.10. El producto de PCR obtenido tenía 543 pb y, cuando se digirió con BspEl, se observaron tres fragmentos de 368 pb, 96 pb y 79 pb, indicando integración cromosómica del gen aveC inactivado y pérdida del replicón libre. El análisis de fermentación de los mutantes de S. avermitilis que contenían la mutación de desplazamiento de fase en el gen de aveC demostró que ya no se producían avermectinas normales, y que estos mutantes tenían el mismo perfil de fermentación de HPLC que las cepas SE180-11 y SE184-1-13. Se identificó un transformante Thios y se denominó cepa SE185-5a. Además, se produjo una mutación en el gen aveC que cambia el nucleótido en posición 520 de G a A, lo cual ocasiona un cambio del codón que codifica un triptófano (W) en la posición 116 a un codón de terminación. Una cepa de S. avermitilis con esta mutación no producía avermectinas normales y tenía el mismo perfil de fermentación que las cepas SE180-11 , SE184-1-13 y SE185-5a. Además, se produjeron mutaciones en el gen aveC que cambian (i) el nucleótido en posición 970 de G a A, que cambia el aminoácido en posición 256 de una glicina (G) a un aspartato (D) y (ii) el nucleótido en posición 996 de T a C, que cambia el aminoácido en posición 275 de tirosina (Y) a histidina (H). Una cepa de S. avermitilis con estas mutaciones (G256D Y275H) no producía avermectinas normales y tenía el mismo perfil de , _ ^ k A.r. ~¿*á?á?*ljL k¡* ák¿ ii fermentación que las cepas SE18011, SE184-1-13 y SE185-5a. Las cepas mutantes de inactivación de S. avermitilis SE180-11 , SE184-1-13, SE185-5a y otras proporcionadas en este documento, proporcionan herramientas de selección para evaluar el impacto de otras mutaciones en el gen aveC. pSE186, que contiene una copia de tipo silvestre del gen aveC, se utilizó para transformar DM1 de E co// y el ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina. Este ADN de pSE186 se usó para transformar protoplastos de la cepa SE180-11 de S. avermitilis. Se aislaron los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa SE180-11 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y se analizaron los transformantes Thior Ermr por análisis de HPLC de los productos de fermentación. La presencia del gen aveC funcional en trans pudo restaurar la producción normal de avermectinas en la cepa SE180-11 (FIGURA 5B).

Análisis de Mutaciones en el Gen aveC que Alteran las Relaciones de Clases B2:B1 Como se ha descrito anteriormente, la cepa SE180-11 de S. avermitilis que contenía un gen aveC inactivo se complementó mediante transformación con un plásmido que contenía un gen aveC funcional (pSE186). La cepa SE180-11 también se utilizó como cepa huésped para caracterizar otras mutaciones en el gen aveC como se describe más adelante. Se aisló ADN cromosómico de la cepa 1100-SC38 y se usó como molde para la amplificación por PCR del gen aveC. La ORF de 1 , 2 kb se aisló por amplificación por PCR usando cebadores diseñados basándose en la secuencia de nucleótidos de aveC. El cebador hacia la derecha fue la SEC ID NO: 6 y el cebador hacia la izquierda fue la SEC ID NO: 7 (véase la Sección 7.1.10., anterior). Las condiciones de PCR y de subclonación fueron las descritas en la sección 7.1.10. El análisis de la secuencia de ADN de la ORF de 1 ,2 kb muestra una mutación en el gen aveC que cambia el nucleófido en posición 337 de C a T, que cambia el aminoácido en la posición 55 de serina (S) a fenilalanina (F). El gen aveC que contiene la mutación S55F se subclonó en pWHM3 para producir un plásmido que se denominó pSE187 y que se usó para transformar protoplastos de la cepa SE180-11 de S. avermitilis. Se aislaron los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa SE180-11 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y se analizaron los transformantes Thior Ermr por análisis de HPLC, de los productos de fermentación. La presencia del gen aveC que codificaba un cambio en el resto aminoácido 55 (S55F) pudo restaurar la producción normal de avermecfinas en la cepa SE180-11 (FIG. 5C) ; sin embargo, la relación de ciciohexil B2:ciclohexil B1 fue de aproximadamente 26:1 , en comparación con la cepa SE180-11 transformada con pSE186, que tenía una relación de B2:B1 de aproximadamente 1 ,6:1 (cuadro 3), lo que indica que la mutación sencilla (S55F) modula la cantidad de ciciohexil B2 producida con respecto a ciciohexil B1. Se identificó otra mutación en el gen aveC que cambia el nucleótido en posición 862 de G a A, que cambia el aminoácido en posición .. a- ;¿_, - — *-~¡a?t aafeafaat.a 230 de glicina (G) a aspartato (D). Una cepa de S. avermitilis que tiene esta mutación (G230D) produce avermectinas en una relación B2:B1 de aproximadamente 30:1.

Mutaciones que Reducen la Relación 82:51 Se construyeron varias mutaciones que reducían la cantidad de ciclohexil-B2 producida con respecto a ciclohexil-B1 , como se indica a continuación. Se identificó una mutación en el gen aveC que cambia el nucleótido en posición 588 de G a A, que cambia el aminoácido en posición 139 de alanina (A) a treonina (T). El gen aveC que contenía la mutación A139T se subclonó en pWHM3 para producir un plásmido que se denominó pSE188 y que se usó para transformar protoplastos de la cepa SE180-11 de S. avermitilis. Se aislaron transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa SE180-11 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. La presencia del gen aveC mutado que codificaba un cambio en el resto aminoácido 139 (A139T) pudo restaurar la producción de avermectinas en la cepa SE180-11 (FIGURA 5D); sin embargo, la relación B2:B1 fue de aproximadamente 0,94:1 , indicando que esta mutación reduce la cantidad de ciclohexil-B2 producida con respecto a ciclohexil-B1. Este resultado era inesperado porque los resultados publicados, así como los resultados de las mutaciones descritas anteriormente, solo han demostrado inactivación del gen aveC o un aumento de la producción de la forma B2 de la avermectina con respecto a la forma B1 (cuadro 3). Como la mutación A139T alteraba las relaciones B2:B1 en la dirección B1 más favorable, se construyó una mutación que codificaba una treonina en lugar de una cerina en el aminoácido en posición 138. Así pues, pSE186 se digirió con EcoRI y se clonó en pGEM3Zf (Promega) que se había digerido con EcoRl. Este plásmido, que se denominó pSE186a, se digirió con Apal y Kpnl, los fragmentos de ADN se separaron en un gel de agarosa, y se purificaron del gel dos fragmentos de - 3,8 kb y - 0,4 kb. El ADN del inserto de - 1 ,2 kb procedente de pSE186 se usó como molde de PCR para introducir un cambio de una sola base en el nucleótido en posición 585. Los cebadores de PCR se diseñaron para introducir una mutación en el nucleótido en posición 585 y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador de PCR hacia la derecha fue: 5*-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEC ID NO: 12) ; y el cebador de PCR hacia la izquierda fue: 5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEC ID NO:13). La reacción de PCR se realizó usando un equipo de PCR genómico Advantage GC (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) en tampón proporcionado por el fabricante en presencia de dNTP 200 µM, 200 pmol de cada cebador, 50 ng de ADN molde, GC-Melt 1 ,0 M y una unidad de Klen Taq Polymerase Mix en un volumen final de 50 µl. El perfil térmico del primer ciclo fue de 94°C durante 1 min.; seguido por 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos y 68°C durante 2 minutos; y 1 ciclo ¿te A a 68°C durante 3 minutos. Se digirió un producto PCR de 295 pb con Apal y Kpnl para liberar un fragmento de 254 pb que se resolvió por electroforesís y se purificó del gel. Los tres fragmentos (-3, 8 kb, - 0, 4 kb y 254 pb) se ligaron entre sí de una forma de tres vías. La mezcla de ligación se utilizó para transformar células DH5a de E coli competentes. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto correcto mediante análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE198. pSE198 se digirió con EcoRI, se clonó en pWHM3 que se había digerido con EcoRI y se utilizó para transformar células DH5a de E coli. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto correcto mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este ADN plasmídico se utilizó para transformar DM1 de E. coli, el ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto correcto por análisis de restricción. Este plásmido, que se denomino pSE199, se usó para transformar protoplastos de la cepa SE180-11 de S. avermitilis. Se aislaron los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa SE180-11 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. La presencia del gen aveC mutado que codificaba un cambio en el resto aminoácido 138 (S138T) pudo restaurar la producción normal de avermectinas de la cepa SE180-11; sin embargo, la relación B2:B1 era de 0,88:1 , lo que indica que esta mutación reduce la cantidad de ciclohexil-B2 producida con respecto a ciclohexil-B1 (cuadro 3). Esta relación de B2:B1 es incluso menor que la relación de 0,94:1 observada con la mutación A139T producida por la transformación de la cepa SE180-11 con pSE188, como se ha descrito anteriormente. Se construyó otra mutación para introducir una treonina en las posiciones de aminoácidos 138 y 139. Se usó ADN del inserto de - 1 ,2 kb de pSE186 como molde de PCR. Los cebadores de PCR se diseñaron para introducir mutaciones en los nucleótidos en las posiciones 585 y 588 y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador de PCR hacia la derecha fue: 5'- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC- 3' (SEC ID NO: 14); y el cebador de PCR hacia la izquierda fue: 5'- GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEC ID NO: 15). La reacción de PCR se realizó usando las condiciones que se acaban de describir en esta Sección. Un producto PCR de 449 pb se digirió con Apal y Kpnl para liberar un fragmento de 254 pb que se resolvió por electroforesis y se purificó del gel. pSE186a se digirió con Apal y Kpnl, los fragmentos de ADN se separaron del gel de agarosa y se purificaron dos fragmentos de - 3,8 kb y - 0,4 kb del gel. Los tres fragmentos (-3,8 kb, -0,4 kb y 254 pb) se ligaron entre sí en una ligación de tres vías y la mezcla de ligación se utilizó para transformar células de DH5a E. coli competentes. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto correcto mediante análisis de restricción. El plásmido se denominó pSE230. pSE230 se digirió con EcoRI, se clonó en pWHM3 que se había digerido con EcoRI y se utilizó para transformar células DH5a de E. coli. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto correcto mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este ADN plasmídico se utilizó para transformar DM1 de E. coli, el ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y se confirmó la presencia del inserto correcto por análisis de restricción. Este plásmido, que se denominó pSE231 , se usó para transformar protoplastos de la cepa SE180-1 1 de S. avermitilis. Se aislaron los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa SE180-1 1 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron por fermentación. La presencia del gen aveC mutado doble que codificaba S138T/A139T pudo restaurar la producción normal de avermectinas en la cepa SE180-1 1 ; sin embargo, la relación B2:B1 era de 0,84:1 , lo que demuestra que esta mutación reduce adicionalmente la cantidad de ciclohexil-B2 producida con respecto a ciclohexil-B1 (cuadro 3), con respecto a, las reducciones proporcionadas por la transformación de la cepa SE180-1 1 con pSE188 o pSE199, como se ha descrito anteriormente. Sé construyó otra mutación para reducir adicionalmente la cantidad de ciclohexil-B2 producida con respecto a cidohexil-BI. Como las mutaciones S138T/A139T alteraban las relaciones B2:B1 en la dirección más favorable a B1 , se construyó una mutación para introducir una treonina en la •iíí.**.,bU r¿.^.r-Ma.r:„Jrr.-. r,l:¡, ?XI»»k^*i ?* ^»lÁt ?^-?^^^t«i tlllV ÍÍílM? í posición de aminoácido 138 y una fenilalanina en la posición de aminoácido 139. El ADN del inserto de - 1 ,2 kb de pSE186 se usó como molde de PCR. Los cebadores de PCR se diseñaron para introducir mutaciones en las posiciones de nucleótido 585 (cambiando una T por A), 588 (cambiando una G por T) y 589 (cambiando una C por T), y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas). El cebador de PCR hacia la derecha fue 5- GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3' (SEC ID NO: 25); y el cebador de PCR hacia la izquierda fue: 5'- GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEC ID NO: 15). La reacción de PCR se realizó usando un equipo de PCR genómico Advantage GC (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) en tampón proporcionado por el fabricante en presencia de dNTP 200 µM, 200 pmoles de cada cebador, 50 ng de ADN molde; acetato de Mg 1 ,1 mM, GC-Melt 1 ,0 M y 1 unidad de ADN Polimerasa Tth en un volumen final de 50 µl. El perfil térmico del primer ciclo fue de 94°C durante 1 minuto; seguido por 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos y 68°C durante 2 minutos; y 1 ciclo a 68°C durante 3 minutos. Un producto de PCR de 449 pb se digirió con Apal y Kpnl para liberar un fragmento de 254 pb, que se resolvió por electroforesis y se purificó del gel. Los tres fragmentos' (-3,8 kb, -0,4 kb y 254 pb) se ligaron entre sí en una forma de 3 vías. La mezcla de ligación se utilizó para transformar células DH5a de E coli competentes. Se aisló ADN plasmídico a partir de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido se denominó pSE238. pSE238 se digirió con EcoRI, se clonó en pWHM3, que se había digerido con EcoRl., y se utilizó para transformar células DH5a de E coli. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este ADN plasmídico se utilizó para transformar DM1 de E. coli, el ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este plásmido, que se denominó pSE239, se usó para transformar protoplastos de la cepa SE180-11 de S. avermitilis. Se aislaron los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa SE180-11 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y los transformantes Thior Ermr se analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. La presencia del gen aveC doble mutado que codificaba S138T/A139F pudo restaurar la producción normal de avermectina en la cepa SE180-11 ; sin embargo, la relación B2:B1 era de 0,75:1 , demostrando que esta mutación reducía adicionalmente la cantidad de ciclohexil-B2 producida con respecto a ciclohexil-B1 (cuadro 3) con respecto a las reducciones proporcionadas por la transformación de la cepa SE180-11 con pSE188, pSE199 o pSE231 como se ha descrito anteriormente. ^^j^^?fiAÉjI ^^??^^ jÉ CUADRO 3 Se construyeron otras mutaciones para reducir adicionalmente la cantidad de ciclohexil-B2 producida con respecto a ciclohexil-B1 usando la técnica de redistribución de ADN como se describe en Stemmer, 1994, Nature 370:389-391; y Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747-10751 ; y como se describe adicionalmente en las Patentes de Estados Unidos 5605793, 5811238, 5830721 y 5837458. Se utilizaron plásmidos con ADN redistribuido que contenían genes aveC mutados para transformar células E coli. dam dem competentes. El ADN plasmídico se aisló a partir de transformantes resistentes a ampicilina y se usó para transformar protoplastos de la cepa SE180-11 de S. avermitilis. SE aislaron los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa SE180-11 y se seleccionaron con respecto a la producción de avermectinas con una relación de ciclohexil-B2:ciclohexil-B1 de 1 :1 o menor. Se determinó la secuencia de ADN del ADN plasmídico de los transformantes SE180-11 que producían avermectinas con una relación B2:B1 de 1 :1 o menor. Se identificaron ocho transformantes que producían cantidades reducidas de ciclohexil-B2 con respecto a ciclohexil-B1. La menor relación B2:B1 conseguida entre estos transformantes fue de 04:1 (cuadro 4). El ADN plasmídico se aisló de cada uno de los ocho transformantes y la secuencia de ADN se determinó para identificar las mutaciones en el gen aveC. Las mutaciones son las siguientes. pSE290 contiene 4 mutaciones de nucleótidos: en la posición de nucleótido 317 de T a A, en la posición de nucleótido 353 de C a A, en la posición de nucleótido 438 de G a A y en la posición de nucleótido 1155 de T a A. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 317 cambia el aminoácido en la posición AA 48 de D a E y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 438 cambia el aminoácido en la posición AA 89 de A a T. La relación de. B2:B1 producidas por las células que llevaban este plásmido fue de 0,42:1 (cuadro 4). pSE291 contiene 4 mutaciones de nucleótidos: en la posición de nucleótido 272 de G a A, en la posición de nucleótido 585 de T a A, en la posición de nucleótido 588 de G a A, y en la posición de nucleótido 708 de G a A. El cambio de nucleótido en la posición de nucleófido 585 cambia el aminoácido en la posición AA 138 de S a T, el cambio del nucleótido en la posición de nucleótido 588 cambia el aminoácido en la posición AA 139 de A a T, y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 708 cambia el aminoácido en la posición AA 179 de G a S. La relación de B2:B1 producidas por las células que llevaban este plásmido fue de 0,57:1 (cuadro 4). pSE292 contiene las mismas cuatro mutaciones de nucleótidos que pSE290. La relación de B2:B1 producidas por las células que llevaban este plásmido fue de 0,4:1 (cuadro 4). pSE293 contiene 6 mutaciones de nucleótidos: en el nucieótido 24 de A a G, en la posición de nucleótido 286 de A a C, en la posición de nucleótido 497 de T a C, en la posición de nucleótido 554 de C a T, en la posición de nucleótido 580 de T a C y en la posición de nucleótido 886 de A a T. El cambio de nucleótidos en la posición de nucleótido 286 cambia el aminoácido en la posición AA 38 de Q a P, el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 580 cambia el aminoácido en la posición AA 136 de L a P y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 886 cambia el aminoácido en la posición AA 238 de E a D. La relación de B2:B1 producidas por las células que llevaban este plásmido fue de 0,68:1 (cuadro 4). pSE294 contiene 6 mutaciones de nucleótidos: en nucleótido 469 de T a C, en la posición de nucleótido 585 de T a A, en la posición de nucleótido 588 de G a A, en la posición de nucleótido 708 de G a A, en la posición de nucleótido 833 de C a T y en la posición de nucleótido 1184 de G a A. Además, los nucleótidos en la posiciones 173, 174 y 175 están delecionados. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 469 cambia el aminoácido en la posición AA 99 de F a S, el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 585 cambia el aminoácido en la posición AA 138 de S a T, el cambio de nucleótido en la posición de nucleófido 588 cambia el aminoácido en la posición AA 139 de A a T y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 708 cambia el aminoácido de la posición AA 179 de G a S. La relación de B2:B1 producidas por las células que llevaban este plásmido fue de 0,53: (cuadro 4). pSE295 contiene 2 mutaciones de nucleótidos: en el nucleótido 588 de G a A y en el nucleófido 856 de T a C. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 588 cambia el aminoácido en la posición AA 139 de A a T y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 856 cambia el aminoácido en la posición AA 228 de M a T. La relación de B2:B1 producidas por las células que llevaban este plásmido fue de 0,80:1 (cuadro 4). pSE296 contiene 5 mutaciones de nucleótidos: en la posición de nucleótido 155 de T a C, en la posición de nucleótido 505 de G a T, en la posición de nucleótido 1039 de C a T, en la posición de nucleótido 1202 de C a T y en la posición de nucleótido 1210 de T a C. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 505 cambia el aminoácido en la posición AA 111 de G a V y el cambio del nucleófido en la posición de nucleótido 1039 cambia el aminoácido en la posición AA 289 de P a L. La relación de B2:B1 producidas por las células que llevaban este plásmido fue de 0,73:1 (cuadro 4) . pSE297 contiene 4 mutaciones de nucleótidos: en la posición de nucleótido 377 de G á T, en la posición de nucleófido 588 de G a A, en la posición de nucleófido 633 de A a G y en la posición de nucleótido 1067 de A a T. El cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 588 cambia el aminoácido en la posición AA 139 de A a T, el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 633 cambia el aminoácido en la posición AA 154 de K a E y el cambio de nucleótido en la posición de nucleótido 1067 cambia el aminoácido en la posición AA 298 de Q a H. La relación de B2:B1 producidas por las células que llevaban este plásmido fue de 0,67:1 (cuadro 4).

CUADRO 4 EJEMPLO: Construcción de mutantes de delecion 5' Como se ha explicado en la Sección 5.1 anterior, la secuencia de nucleótidos de S. avermitilis mostrada en la FIGURA 1 (SEC ID NO: 1 ) comprende cuatro codones GTG diferentes en las posiciones de pb 42, 174, 177 y 180, que son sitios de iniciación potenciales. Esta sección describe la -¿ — ^ '-tÉÉilÉJÉÍT construcción de múltiples deleciones de la región 5' de la ORF de aveC (FIGURA 1 ; SEC ID NO: 1) para ayudar a definir cuáles de estos codones podrían funcionar como sitios de iniciación en la ORF de aveC para la expresión proteica. Se aislaron fragmentos del gen aveC delecionados de diversas formas en el extremo 5' y se aislaron del ADN cromosómico de S. avermitilis por amplificación por PCR. Los cebadores se PCR se diseñaron basándose en la secuencia de ADN de aveC y se suministraron por Genosys Biotechnologies, Inc. Los cebadores hacia la derecha fueron 5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3', (SEC' ID NO: 16) (D1 F1 ); 5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEC ID NO: 17) (DIF2); 5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3" (SEC ID 'NO: 18) (D1 F3); y 5'-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3' (SEC ID NO: 19) (D2F2). Los cebadores hacia la izquierda fueron 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3' (SEC ID NO: 20); 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEC ID NO: 21 ); y 5'-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEC ID NO: 22). La reacción de PCR se realizó como se ha descrito anteriormente en la Sección 8.3. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y se detectaron bandas de ADN individuales de - 1 ,0 kb o -1 ,1 kb. Los productos de PCR se purificaron del gel y se ligaron a 25 ng del vector pCR2.1 linealizado (Invitrogen) en una relación de vector a inserto de 1 :10 molar siguiendo las instrucciones del fabricante. Las mezclas de ligación se usaron para transformar células E coli competentes One Shot™ l^^k^ .^ ^.^ *?¡¿ ^.J>k^.*~^*^.'****.

(Invitrogen) siguiendo las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto se confirmó mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Estos plásmidos se denominaron pSE190 (obtenido con el cebador D1 F1 ), pSE191 (obtenido con el cebador D1 F2), pSE192 (obtenido con el cebador D1 F3) y pSE193 (obtenido con el cebador D2F2). Cada ADN del inserto se digirió con BamHI/Xbal, se separó por electroforesis, se purificó del gel y se ligó por separado al vector lanzadera pWHM3, que se había digerido con BamHI/Xbal, en una concentración total de ADN de 1 µg y en una relación de vector a inserto de 1 :5 molar. Las mezclas de ligación se usaron para transformar células DH5a de E coli competentes. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto se confirmó mediante análisis de restricción. Estos plásmidos, que se denominaron pSE194 (DIFI), pSE195 (D1 F2), pSE196 (D1 F3) y pSE197 (D2F2), se utilizaron por separado para transformar la cepa DM1 de E. coli, el ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó por análisis de restricción. Este ADN se usó para transformar protoplastos de la cepa SE180-11 de S. avermitilis. Se aislaron los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa SE180-11 , se determinó la presencia de resistencia a eritromicina y se analizaron los transformantes Thior Ermr por análisis de HPLC de los productos de fermentación para determinar los sitios GTG que eran necesarios para la expresión de aveC. Los resultados indican que el codón GTG en ia posidón 42 puede eliminarse sin afectar a la expresión de aveC, ya que pSE194, pSE195 y pSE196, careciendo del sitio GTG en la posición 42, pero conteniendo los tres sitios GTG en las posiciones 174, 177 y 180, podían restaurar la producción normal de avermectinas cuando se utilizaban para transformar SE180-1 1. La producción normal de avermectinas no se restauraba cuando la cepa SE 180-11 se transformaba con pSE197, que carece de los cuatro sitios GTG (cuadro 5).

CUADROS EJEMPLO: Clonación de homólogos aveC de S. Hvaroscopicus y S. Griseochromogenes La presente invención permite identificar y clonar genes fílmrtÜfeiffÜ * "*"8"" -***^*~^ ^¡¡¡¿¿t homólogos de aveC de otras especies que producen avermectinas o milbemicina de Streptomyces. Por ejemplo, se híbrido una biblioteca de cósmidos de ADN genómico de S. hygroscopicus (FERM BP-1901) con la sonda de aveC de 1 ,2 kb de S. avermitilis, descrita anteriormente. Se identificaron varios clones de cósmidos que hibridaron fuertemente. Se aisló el ADN cromosómico de estos cósmidos y se identificó un fragmento Kpnl de 4,9 kb que hibridaba con la sonda de aveC. Este ADN se secuenció y se identificó una ORF (SEC ID NO: 3) que tenía una homología significativa con la ORF de aveC de S. avermitilis. En la FIGURA 6 se presenta una secuencia de aminoácidos (SEC ID NO: 4) deducida de la ORF homologa a aveC de S. hygroscopicus. Además, se híbrido una biblioteca de cósmidos del ADN genómico de S. griseochromogenes con la sonda de aveC de 1 ,2 kb anterior de S. avermitilis descrita anteriormente. Se identificaron varios clones cosmídicos que hibridaban fuertemente. Se aisló el ADN cromosómico de estos cósmidos y se identificó un fragmento Pstl de 5,4 kb que hibridaba con la sonda de aveC. Este ADN se secuenció y se identificó una ORF parcial homologa a aveC que tenía una homología significativa con la ORF de aveC de S. avermitilis. En la FIGURA 6 se presenta una secuencia de aminoácidos parcial deducida (SEC ID NO: 5). El análisis del ADN y de la secuencia de aminoácidos de los homólogos de aveC de S. hygroscopicus y de S. griseochromogenes indica que estas regiones comparten una homología significativa (identidad de secuencia a nivel de los aminoácidos -50%) tanto entre sí como con la ORF de aveC de S. avermitilis y con el producto génico AveC (FIGURA 6).

EJEMPLO: Construcción de un plasmido con el gen aveC detras del promotor ermE Se subclonó la ORF de aveC de 1 ,2 kb procedente de pSE186 en pSE34, que es el vector lanzadera pWHM3 que tiene el promotor ermE de 300 pb insertado como un fragmento Kpnl/BamHI en el sitio Kpnl/BamHI de pWHM3 (véase Ward y col., 1986, Mol. Gen. Genet. 203:468-478). pSE186 se digirió con BamHl e Hindlll, el producto de digestión se resolvió por electroforesis y el fragmento de 1 ,2 kb se aisló del gel de agarosa y se ligó a pSE34, que se había digerido con BamHl e Hindlll. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH5a de E coli competentes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto de 1 ,2 kb se confirmó mediante análisis de restricción. Este plásmido, que se denominó pSE189, se utilizó para transformar a DM1 de E coli y el ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina. Los protoplastos de la cepa 1100- SC38 de S. avermitilis se transformaron con pSE189. Los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa 1100-SC38 se aislaron y analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. Los transformantes de la cepa 1100-SC38 de S. avermitilis que ?. contenían pSE189 se habían alterado en las relaciones de ciclohexil-B2 avermectina: ciclohexil-B1 avermectina producida (aproximadamente 3:1 ) en comparación con la cepa 1100-SC38 (aproximadamente 34:1 ), y la producción total de avermectinas aumentó aproximadamente 2,4 veces en comparación con la cepa 1100-SC38 transformada con pSE119 (cuadro 6). pSE189 también se utilizó para transformar protoplastos de una cepa de S. avermitilis de tipo silvestre. Los transformantes resistentes a tiostrepton se aislaron y analizaron por análisis de HPLC de los productos de fermentación. Las avermectinas totales producidas por el tipo silvestre de S. avermitilis transformado con pSE189 aumentaron aproximadamente 2,2 veces en comparación con S. avermitilis de tipo silvestre transformado con pSE119 (cuadro 6).

CUADRO 6 EJEMPLO: Plasmido guimerico gue contiene secuencias de la orf de aveC S. Avermitilis y el homologo de aveC de S. Hyoroscopicus Se construyó un plásmido híbrido denominado pSE350 que confiene una porción de 564 pb del homólogo de aveC de S. hygroscopicus reemplazando a una porción homologa de 564 pb de la ORF de aveC de S. avermitilis (FIGURA 7) como se indica a continuación. Se construyó pSE350 usando un sitio de restricción BsaAl que se conserva en las dos secuencias (aveC posición 225) y un sitio de restricción Kpnl que está presente en el gen aveC de S. avermitilis (aveC posición 810). El sitio Kpnl se introdujo en el ADN de S. hygroscopicus por PCR usando el cebador hacia la derecha 5'-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' (SEC ID NO: 23) y el cebador hacia la izquierda 5'-GAACTGGTACCAGTGCCC-3' (SEC ID NO: 24) (suministrado por Genosys Biotechnologies), usando las condiciones de PCR descritas en la Sección 7.1.10 anterior. El producto de PCR se digirió con BsaAl y Kpnl, los fragmentos se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1 % y el fragmento de BsaAl/Kpnl de 564 pb se aisló del gel. pSE179 (descrito en la Sección 7.1.10 anterior) se digirió con Kpnl e Hindlll, los fragmentos se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se aisló un fragmento de - 4,5 kb del gel. pSE179 se digirió con Hindlll y BsaAl, los fragmentos se separaron por electroforesis en un gel de agarosa al 1% y se aisló del gel un fragmento de BsaAl/HindIII de - 0,2 kb. El fragmento Hindll/Kpnl de - 4,5 kb, el fragmento BsaM/HindIII de - 0,2 kb y el fragmento BsaAl/Kpnl de 564 pb de S. hygroscopicus se ligaron entre sí en una ligación de 3 vías y la mezcla de ligación se utilizó para transformar células DH5a de E. coli competentes. El ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó mediante análisis de restricción usando Kpnl y Aval. Este plásmido se digirió con Hindlll y Xbal para liberar el inserto de 1 ,2 kb, que después se unió con pWHM3 que se había digerido con Hindlll y Xbal. La mezcla de ligación se usó para transformar células DH5a de E. coli competentes, el ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó mediante análisis de restricción usando Hindlll y Aval. Este ADN plasmídico se utilizó para transformar DM1 de E coli, el ADN plasmídico se aisló de los transformantes resistentes a ampicilina y la presencia del inserto correcto se confirmó mediante análisis de restricción y análisis de la secuencia de ADN. Este plásmido se denominó pSE350 y se usó para transformar protoplastos de la cepa SE180-11 de S. avermitilis. Se aislaron los transformantes resistentes a tiostrepton de la cepa SE180-11 , se determinó la presencia de eritromicina y se analizaron los transformantes Thior Ermr mediante análisis de HPLC de los productos de fermentación. Los resultados muestran que los transformantes que contienen el plásmido híbrido de S. avermitilis/S. hygroscopicus, tienen una relación media B2:B1 de aproximadamente 109:1 (cuadro 7).

,^ CUADRO 7 DEPOSITO DE MATERIALES BIOLÓGICOS El siguiente material biológico se depositó en la American Type Culture Collection (ATCC) en 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA, el 29 de Enero de 1998, y recibió los siguientes números de acceso: Plásmido No. de Acceso plásmido pSE180 209605 plásmido pSE186 209604 Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones citadas anteriormente, se incorporan aquí por referencia en su totalidad. La presente invención no se limita en alcance por las realizaciones específicas descritas en este documento, que deben considerarse simples ilustraciones de aspectos individuales de la invención, y están dentro del alcance de la invención procedimientos y componentes funcionalmente equivalentes. De hecho, diversas modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en este documento, serán evidentes para los especialistas en la técnica a partir de la descripción anterior y los dibujos adjuntos. Tales modificaciones pretenden incluirse dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

LISTA DE SECUENCIAS <110> PFIZER PRODUCTS INC. <120> GEN EE STREP CMYCES AVEMITILIS QUE DIRIGE IA RELACIÓN EE JM?ME riNñS B2:B1 <130> PC10649A <140> PC10649 <141> 1999-08-12 <150> 60/074, 636 <151> 1998-02-13 <150> PCT/IB99/00130 <151> 1999-01-25 <160> 25 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1229 <212> AEN <213> Strftapyces avept?tilis <220> <221> CDS <222> (174) .. (1085) <400> 1 tcacgaaacc ggacacacca cacacacgaa ggtgagacag cgtgaaccca tcsgagocgc 60 tcggcctgsc caacgaacgt gtagtagaca sccgaccgtc cgatgccaog ctctcasccg 120 —*** -*~| i i (lililí tilffiÉlrtM aggccggcct gaacaggtca ggagcgctgc ccogtgaact gctgtsgfcg cag: gtg 176 1 gtg gtg tgg gsc ggg gtc ggc ctg ctg ttt ctg gsc ctg cag gcg tac 224 Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala Tyr 5 10 15 gtg ttc age cgc tgg gog gsc gac ggt ggc tac cgg ctg ate gag acg 272 Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu He Glu Thr 20 25 30 gcg ggc sag ggt cag. ggc ggc age aag gat acg ggg act acc gat gtg 320 Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Aep Thr Gly Thr Thr Asp Val 35 40 45 gtc tat eco gtg att toe gtc gtc tgc ate acc gsc gsg gog gag tgg 368 Val Tyr Pro Val lie Ser Val Val Cys He ?hr Ala Ala Ala Ala Trp 50 55 60 65 etc ttc cgg agg tgc cgt gtc gaa cga cgg ctg ctg ttc gac gsc ctt 416 Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Phe Asp Ala Leu 70 75 80 oto tts ote ggg ctg ctg ttc gcg age tgg cag age ccg etc atg aac 464 Leu Phe Leu Gly Leu Leu Phe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met Asn 85 90 95 tgg ttc cat tcc gtt etc gtc tcs aac gcg agt gtg tgg ggc gsg gtg 512 Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala Val 100 105 110 ggt tsc tgg ggt ssg tat gtg csc ggc tgg cag ggg gsg ggc csg ggt 560 Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro Gly 115 120 125 gcg gag gsg gaa atg ssg ctg gcg tcg gcc tsc gtc tgs atg tsg get 608 Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser Ala 130 135 140 145 ctg ate gtc acc gtg ctg tgc age aag gca ctg ggg tgg ate aag gcc 656 Leu He Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp He Lys Ala 150 155 160 cgc cgg csg gsa tgg sgg asc tgg sgg ctg gtc ctg gcc gtg ttc ttc 704 Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Ete Ehe 165 170 175 -•— «*"* « ate ggc ate gtg etc ggt ctg tsc gag ccg ctg ccg too gsc tcc ggg 752 He Gly He Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Pro Ser Ala Ser Gly 180 185 190 ate age gta tgg gac aga gsg stg oso gag gtg ass ttg tgg agt ggs 800 He Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Trp Ser Gly 195 200 205 gag tgg tas cag ttc ccc gtg tat cag gsg gts ggt too ggc ctg gtc 848 Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr GOn Ala Val Gly Ser Gly Leu Val 210 215 220 225 tgc tgc atg ctg ggc teg ctg cgc ttc ttc cgc gac gaa cgc gat gag 896 Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Phe Phe Arg Asp Glu Arg Asp Glu 230 235 240 tcg tgg gtg gaa cgg gga gee tgg cgg ttg csg saa sgg gsa gsg aac 944 Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala Asn 245 250 255 tgg gcg cgt ttc oto gcc gtg gtc ggt ggg gtg aat gss gtg atg tto 992 Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met Phe 260 265 270 etc tac aas tgt ttc cat ate etc ctg tcc etc gtc ggt gga cag csg 1040 Leu Tyr Thr Cys Phe His He Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln Pro 275 280 285 sss gao saa stg ssg gao tsc tts saa gcg csg gcs get tas tga 1085 Pro Asp Gln Leu Pro Asp Ser Phe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 gttcagggca ggtsggagga gacggagaag gggaggcgac cggagttccg gtcacctccc 1145 ctttgtgcat gggtggasgg ggatsasgst occatggcgg sgggctcetc cagaogcacc 1205 acactcctcg gttcagcgat catg 1229 <210> 2 <211> 303 <212> PRT <213> Strptanyces avermitilis ????? ?M* ^ X?IMÜ ^ >4/¿Í.***Í * .... ^ ^^,..^. ?*^ *? -iM?^L. <400> 2 Val Val Val Trp Ala Gly Val Gly Leu Leu Phe Leu Ala Leu Gln Ala 1 5 10 15 Tyr Val Phe Ser Arg Trp Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Arg Leu He Glu 20 25 30 Thr Ala Gly Gln Gly Gln Gly Gly Ser Lys Asp Thr Gly Thr Thr Af 35 40 45 Val Val Tyr Pro Val He Ser Val Val Cys He Thr Ala Ala Ala Ala 50 55 60 Trp Leu Phe Arg Arg Cys Arg Val Glu Arg Arg Leu Leu Ríe Asp Ala 65 70 75 80 Leu Leu Phe Leu Gly Leu Leu Ehe Ala Ser Trp Gln Ser Pro Leu Met 85 90 95 Asn Trp Phe His Ser Val Leu Val Ser Asn Ala Ser Val Trp Gly Ala 100 105 110 Val Gly Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln Gly Ala Gly Pro 115 120 125 Gly Ala Glu Ala Glu Met Pro Leu Ala Ser Ala Ser Val Cys Met Ser 130 135 140 Ala Leu He Val Thr Val Leu Cys Ser Lys Ala Leu Gly Trp He Lys 145 150 155 160 Ala Arg Arg Pro Ala Trp Arg Thr Trp Arg Leu Val Leu Ala Val Phe 165 170 175 Hie He Gly He Val Leu Gly Leu Ser Glu Pro Leu Eto Ser Ala Ser 180 185 190 Gly He Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Pro Glu Val Thr Leu Tf Ser 195 200 205 Gly Glu Trp Tyr Gln Phe Pro Val Tyr GLn Ala Val Gly Ser Gly Leu 210 215 220 Val Cys Cys Met Leu Gly Ser Leu Arg Ehe Phe Arg Asp Glu Arg Asp 225 230 235 240 Glu Ser Trp Val Glu Arg Gly Ala Trp Arg Leu Pro Gln Arg Ala Ala 245 250 255 Asn Trp Ala Arg Phe Leu Ala Val Val Gly Gly Val Asn Ala Val Met 260 265 270 Ehe Leu Tyr Thr Cys Pte His He Leu Leu Ser Leu Val Gly Gly Gln 275 280 285 Pro Pro Asp Gln Leu Pro f Ser Ehe Gln Ala Pro Ala Ala Tyr 290 295 300 <210> 3 <211> 1150 <212> AESST <213> Streptapyces hygrossopicus <220> <221> CDS <222> (58).. (990) <400> 3 gtcgasgaag assggsogga ggssgtsggc agggacgata cogtaogcgg sctgsgg 57 gtg ttc asc ctt ccs gta acá ctg tgg gsg tgt gts ggs gsg ctg gtg 105 Val Ete Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val 1 5 10 15 ctg gga ctt cag gtg tac gtg ttc gss gsc tgg etc goc gac age ggc 153 Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Pte Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 tac cgc ate gag aag gsg tss osg gss agg ggs ggt ggg gao tsg gag 201 Tyr Arg He Glu Lys Ala Ser Ero Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 cgg ate gcc gat gtg ctg ate ccg ctg ctg too gtg gtg gga gsg gtg 249 Arg He Ala Asp Val Leu He Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val 50 55 60 gts sts gsa gtg tgt stg tas sgg agg tgt sgg goc agg agg cgg ctg 297 Val Leu Ala Val Cys Leu Tyr Arg Arg Cys Arg Ala Arg Arg Arg Leu 65 70 75 80 acg ttc gac gcg tcg oto ttc ate ggg ctg stg tog gsc agt tgg cag 345 Thr Pte Asp Ala Ser Leu Pte He Gly Leu Leu Ser Ala Ser Trp GIXL 85 90 95 agt eco ttg atg aac tgg ate aat ccg gtg etc gcg tea aac gtc aat 393 Ser Pro Leu Mst Asn Trp He Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn 100 105 110 gtg ttc gga gsg gtg gcc tog tgg ggg ccg tat gtg ccc ggt tgg cag 441 Val Ete Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln 115 120 125 ggg gog ggg gsg cae cag gag gac gag ctg ccg ctg gcg asc ctg age 489 Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 ate tgt atg aog gcc atg atg gcc goc gtg gcc tgc ggc aag ggc atg 537 He Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160 ggt ctt gcc gsc gcs sgg tgg sog sgg ctg ggg ccg etc cgg ctg ate 585 Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu He 165 170 175 gcg cts ggs ttt stg sts gts gtg sts sts gac ate gcs gag ssg stg 633 Ala Leu Gly Pte Leu Leu Val Val Leu Leu A=p He Ala Glu Pro Leu 180 185 190 gtg too ttc gsg ggc gtc tcc gtg tgg aog cgg gca gtg ccc gag ctg 681 Val Ser Pte Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu 195 200 205 acc ate tgg agt ggg cae tgg tat cag ttc ceg ctg tat cag atg gtg 729 Thr He Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Pte Pro Leu Tyr Gln Met Val 210 215 220 gct teg gsg sts tts ggs gss tet ttg ggg goc gog cgc cae ttt sgc 777 Ala Ser Ala Leu Pte Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Phe Arg 225 230 235 240 aac cgg cgc ggc gaa acg tgt ctg gag tcc ggg gog goc etc cta ccg 825 Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 255 gag ggc csg agg oca tgg gto cgg ctg ctg gcg gtg gtg ggc ggg gcc 873 Glu Gly Ero Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 aac ate age ato gsc cts tas asc ggc gca cae gge gca cae ate ctg 921 Asn He Ser He Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His He Leu 275 280 285 ttc tcg ctg atg gac ggc get ccc csg gac cgg etc ccc gaa ttc ttc 969 Ete Ser Leu Met Aep Gly Ala Pro Pro 2\sp Arg Leu Pro Glu Ete Ete 290 295 300 cgt ccg gcg gac ggc tac tga gaccgcsggc acsacecacg tacecgatgt 1020 Arg Pro Ala Ala Gly Tyr 305 310 gcgcgatgtg cctgatgsgc stgatgtass aggggtgtca taggstsass tgtggcgsst 1080 catgsggtga gcgctccgcc tegtcsttgt tsoggctsct gggctscacg accatacgga 1140 gcggcsgggg 1150 <210> 4 <211> 310 <212> FRT <213> Strftc?rpees hygroseopicus <400> 4 Val Pte Thr Leu Pro Val Thr Leu Trp Ala Cys Val Gly Ala Leu Val 1 5 10 15 Leu Gly Leu Gln Val Tyr Val Pte Ala Ala Trp Leu Ala Asp Ser Gly 20 25 30 Tyr Arg He Glu Lys Ala Ser Pro Ala Arg Gly Gly Gly Asp Ser Glu 35 40 45 Arg He Ala Asp Val Leu He Pro Leu Leu Ser Val Val Gly Ala Val 50 55 60 yai iaj Aia Val C^ i ? T e l^ i^g C 5 ^g Aia Arg A£g Arg l«u 65 70 75 80 Thr Phe Aep Ala Ser: Leu Pte lie Gly Leu Leu §€ Ala Ser Trp Gto 85 90 95 Ser Pro Leu Met Asn Trp He Asn Pro Val Leu Ala Ser Asn Val Asn 100 105 110 Val Pte Gly Ala Val Ala Ser Trp Gly Pro Tyr Val Pro Gly Trp Gln 115 120 125 Gly Ala Gly Ala His Gln Glu Ala Glu Leu Pro Leu Ala Thr Leu Ser 130 135 140 He Cys Met Thr Ala Met Met Ala Ala Val Ala Cys Gly Lys Gly Met 145 150 155 160 Gly Leu Ala Ala Ala Arg Trp Pro Arg Leu Gly Pro Leu Arg Leu He 165 170 175 Ala Leu Gly Ete Leu Leu Val Val Lea Leu Af He Ala Glu Pro Leu 180 185 190 Val Ser Ete Ala Gly Val Ser Val Trp Thr Arg Ala Val Pro Glu Leu 195 200 205 Thr He Trp Ser Gly His Trp Tyr Gln Pte Pro Leu Tyr Gln Met Val 210 215 220 Ala Ser Ala Leu Pte Gly Ala Ser Leu Gly Ala Ala Arg His Pte Arg 225 230 235 240 Asn Arg Arg Gly Glu Thr Cys Leu Glu Ser Gly Ala Ala Leu Leu Pro 245 250 255 Glu Gly Eto Arg Pro Trp Val Arg Leu Leu Ala Val Val Gly Gly Ala 260 265 270 Asn He Ser He Ala Leu Tyr Thr Gly Ala His Gly Ala His He Leu 275 280 285 Phe Ser Leu Met Asp Gly Ala Pro Eto Asp Arg Leu Eto Glu Phe Pte 290 295 300 Arg Eto) Ala Ala Gly Tyr 305 310 <210> 5 <211> 215 <212> PRT <213> Streptapyces griseochranogenes <400> 5 Val He Gly Trp Ala Ala Leu Gly Ala Val Ete Leu Val Leu Gln Val 1 5 10 15 Tyr Val Phe Ala Arg Trp Thr Ala Asp Gly Gly Tyr His Leu Ala Af 20 25 30 Val Ser Gly Eto Af Gly Arg Glu Eto Gly His Arg Arg He He Af 35 40 45 Val Leu Leu Eto Ala Leu Ser Met Ala Gly Val Val Gly Leu Ala Pte 50 55 60 Trp Leu Val Arg Arg Trp Arg Ala Glu Arg Arg Leu Ser Pte Af Ala 65 70 75 80 Leu Leu Pte Thr Gly Val Leu Pte Ala Gly Trp Leu Ser Eto Leu Met 85 90 95 Asn Trp Ete His Pro Val Leu Met Ala Asn Thr His Val Trp Gly Ala 100 105 110 Val Gly Ser Trp Gly Eto Tyr Val Eto Gly Trp Arg Gly Leu Pro Eto 115 120 125 Gly Lys Glu Ala Glu Leu Pro Leu Val Thr Ete Ser Leu Gly Ser Thr 130 135 140 Val Leu Leu Gly Val Leu Gly Cys Cys Gln Val Met Ser Arg Val Arg 145 150 155 160 Glu Arg Trp Eto Gly Val Arg Eto Trp Gln Leu Val Gly Leu Ala Pte 165 170 175 Leu Thr Ala Val Ala Ete Af Leu Ser Glu Pro Ete He Ser Pte Ala 180 185 190 Gly Val Ser Val Trp Ala Arg Ala Leu Eto Thr Val Thr Leu Trp Arg 195 200 205 Gly Ala Trp Tyr Arg Ala Arg 210 215 <210> 6 <211> 18 <212> ACN <213> Streptapyces avern tilis <400> 6 tsasgaaass ggacacac 18 <210> 7 <211> 18 <212> ACN <213> Strftanyces avermitilis <400> 7 catgatcgst gaaccgag 18 <210> 8 <211> 20 <212> AEN <213> Strftapyces avermitilis <400> 8 ggttccggat gccgttctcg 20 <210> 9 <211> 21 <212>AEN <213> Strftcp^ces avermitilis <400> 9 aactccggtc gastsssctt s 21 <210> 10 <211> 19 <212> AEN <213> Strfta?yces avermitilis <400> 10 gsaaggatas ggggastas 19 <210> 11 <211> 18 <212> AEN <213> Strftapyces avermitilis <400> 11 gaacsgaccg cctgatac 18 <210> 12 <211> 43 <212> AEN <213> Strftcmyces avermitilis <400> 12 gggggagggs ssgggtgcgg aggcggaaat gcssstggsg asg 43 <210> 13 <211> 20 <212> AEN <213> Strftapyces aveunitilis <400> 13 ggaassgass gsstgataca 20 <210> 14 <211> 46 <212> AEN <213> Strftaryces avemitilis <400> 14 gggggogggc ccgggtgcgg aggsggaaat gcegetggcg aegace 46 <210> 15 <211> 20 <212> AEN <213> Strftanyces avemitilis <400> 15 ggaacatcac ggcattcacc 20 <210> 16 <211> 18 <212> AEN <213> Strftapyces avermitilis <400> 16 aacssatsog agsogctc 18 <210> 17 <211> 17 <212> AEN <213> Strftaryces avermitilis <400> 17 tcggcctgcc aaegaac 17 <210> 18 <211> 18 <212> AEN <213> Stoft pyces avermitilis <400> 18 ccaacgaasg tgtagtag 18 <210> 19 <211> 20 <212> AEN <213> Strftanyces avermitilis .JUuák~t?.?*. ,ti* ?A¡ Jfct Üla^fc <400> 19 tgcaggogta cgtgttcagc 20 <210> 20 <211> 17 <212> AEN <213> Streptanyces avermitilis <400> 20 catgatcgct gaaccga 17 <210> 21 <211> 20 <212> AEN <?13> avprmi ti 1 i s <400> 21 catgatcgct gaassgagga 20 <210> 22 <211> 20 <212> AEN <213> Strftapyses avermitilis <400> 22 aggagtgtgg tgsgtstgga 20 <210> 23 <211> 19 <212> AEN <213> Streptapyces avermitilis <400> 23 cttcaggtgt asgtgttcg 19 <210> 24 <211> 18 <212> AEN <213> Strftapyses avermitilis <400> 24 gaastggtas sagtgsss 18 <210> 25 <211> 46 <212> AEN <213> Strftapyses avermitilis <400> 25 gggggsgggc ssgggtgsgg aggoggaaat gccgctggcg asgttc 46

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una molécula polinucleotídica comprende una secuencia de nucleótidos del alelo de aveC de Streptomices avermitilis o la secuencia codificante del producto génico AveC del plásmido pSE186 (ATCC 209604) o la secuencia de nucleótidos de la ORF de aveC de S. avermitilis presentada en la figura 1 (SEC ID NO: 1), o una variante degenerada de la misma, pero comprendiendo además al menos una primera mutación que codifica una sustitución de aminoácido a partir de serina o treonina en un resto de aminoácido del producto génico AveC que corresponde a la posición de aminoácido 138 en la SEC ID NO:2 y una segunda mutación que codifica una sustitución de amino ácido de alanina a fenilalanina en un resto aminoácido del producto génico AveC que corresponde a la posición de aminoácido 139 en SEC ID NO:2; de manera que las células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilís en las que el alelo de aveC de tipo silvestre se ha inactivado y expresan la molécula polinucleotídica que comprende la secuencia de nucleótidos mutada, producen una, relación de avermectinas de clases 2:1 que es reducida en comparación con la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por células de la cepa ATCC 53692 de S. avermitilis que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre. i?^Sk^Á^i^ f. f ^fr^l

2.- La molécula polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque las avermectinas de clases 2:1 son ciciohexil B2: ciciohexil B1 avermectinas.

3.- La molécula polinucleotídica de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la relación reducida de ciciohexil B2:ciclohexilB1 es 0.75:1 o menor.

4.- Un vector recombinante caracterizado porque comprende la molécula polinucleotídica de la reivindicación 1.

5.- Un vector recombinante capaz de mutar el alelo de aveC de Streptomyces avermitiiis mediante la introducción de al menos una primera mutación que codifica una sustitución de aminoácido de serina a treonina en un resto de aminoácido del producto génico AveC que corresponde a la posición de aminoácido 138 en la SEC ID NO:2 y una segunda mutación que codifica una sustitución de aminoácido de alanina a fenilalanina en un resto de aminoácido del producto génico AveC que corresponde a la posición de aminoácido 139 en la SEC ID NO:2, que comprende una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica tal mutación.

6.- El vector recombinante de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque comprende la molécula polinucleotídica de la reivindicación 1 o el vector recombinante de la reivindicación 4 ó 5.

7.- Una célula huésped de Streptomyces que comprende la molécula polinucleotídica de la reivindicación 1 o el vector recombinante de la reivindicación 4 ó 5.

8.- Un método para elaborar una nueva cepa de Streptomyces avermi'tilis que comprende células que expresan un alelo de aveC mutado y que produce una relación reducida de avermectinas de clases 2:1 en comparación con las células de la misma cepa de S. avermitilis que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, que comprende: (a) introducir una molécula polinucleotídica en una célula de una cepa de S. avermitilis con una molécula polinucleotídica que lleva un alelo de aveC mutado, o una variante degenerada del mismo, que codifica un producto génico AveC que tiene al menos una primera sustitución de aminoácido de serina a treonina en un resto de aminoácido que corresponde a la posición de aminoácido 138 en la SEC ID NO:2 y una segunda sustitución de aminoácido de alanina a fenilalanina en un resto de aminoácido que corresponde a la posición de aminoácido 139 en la SEC ID NO:2, en donde la expresión del producto génico da como resultado una reducción de la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por las células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo de aveC mutado o la variante degenerada del mismo en comparación con las células de la misma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, y seleccionar las células que producen avermectinas en una relación reducida de clases 2:1 en comparación con la relación de clases 2:1 producida por células de la cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre; o (b) introducir una o más moléculas polinucleotídicas en una célula de una cepa de S. avermitilis, cuyas moléculas polinucleotídicas son capaces de introducir una o más mutaciones en el alelo de aveC de forma que tales células codifican un producto génico AveC que tiene al menos una primera sustitución de aminoácido de serina a treonina en un resto de aminoácido que corresponde a la posición de aminoácido 138 en la SEC ID NO:2 y una segunda sustitución de aminoácido de alanina a fenilalanina en un resto aminoácido que corresponde a la posición de aminoácido 139 en la SEC ID NO: 2, en donde la expresión del producto génico da como resultado una reducción de la relación de avermectinas de clases 2:1 producidas por células de una cepa de S. avermitilis que expresan el alelo de aveC mutado en comparación con células de la -asHsma cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, y seleccionar las células que producen avermectinas en una relación reducida de clases 2:1 en comparación con la relación de clases 2:1 producida por células de la cepa que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque las avermectinas de clases 2:1 son ciciohexil B2: ciciohexil B1 avermectinas.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado además porque la relación reducida de ciciohexil B2: ciciohexil B1 es de aproximadamente 0.75:1 o menor.

11.- Una célula de Streptomyoes avermitilis que comprende uñ *-alelo de aveC mutado que comprende una primera mutación que codifica una sustitución de aminoácido de serina a treonina en el resto de aminoácido correspondiente a la posición de aminoácido 138 en la SEC ID NO:2 y una segunda mutación que codifica una sustitución de aminoácido de alanina a fenilalanina en un resto de aminoácido que corresponde a la posidón de aminoácido 139 en la SEC ID NO: 2.

12.- La célula de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada además porque produce una relación reducida de avermectinas de clases 2:1 en comparación con una célula de la misma cepa de Streptomyces avermitilis que en su lugar comprende sólo el alelo de aveC de tipo silvestre.

13.- La célula de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque las avermectinas de clases 2:1 son ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectmas.

14.- La célula de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque la relación reducida de ciciohexil B2: ciciohexil B1 es de aproximadamente 0.75:1 o menor.

15.- Un procedimiento para producir avermectinas, que comprende cultivar células de la reivindicación 11 en medio de cultivo en condiciones que permiten o inducen la producción de avermectinas en dicho medio y recuperar dichas avermectinas del cultivo.

16.- Una composición de ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas "k**4-- -» - - - -"-•*- *-?Afa k^** -^**~ ~~~ -**± *--~'' producida por células de Streptomyces avermitilis que comprende las ciciohexil B2: ciciohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0.75:1 o menor en el medio en el que se han cultivado las células.

17.- Una composición de ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas producida por células de una cepa de Streptomyces avermitilís que expresan un alelo de aveC mutado que codifica un producto génico que da como resultado la reducción de la relación de clases 2:1 de ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas producidas por las células en comparación con células de la misma cepa de S. avermitilis que no expresan el alelo de aveC mutado sino que en su lugar expresan sólo el alelo de aveC de tipo silvestre, comprendiendo la composición las ciciohexil B2:ciclohexil B1 avermectinas en una relación de aproximadamente 0.75:1 o menor en el medio en el que se han cultivado las células.