DE60016231T2

DE60016231T2 - Streptomyces avermitilis gen zum regulieren des verhältnisses der b2:b1 avermectinen

Info

Publication number: DE60016231T2
Application number: DE60016231T
Authority: DE
Inventors: Kim Jonelle Stutzman-Engwall
Original assignee: Pfizer Products Inc
Current assignee: Pfizer Products Inc
Priority date: 1999-08-12
Filing date: 2000-07-19
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2020-07-20
Also published as: JP2003507018A; EP1200605A1; CZ2002297A3; PL353770A1; IL147562A0; TNSN00170A1; JP3688640B2; US6511841B2; HRP20020131A2; BR0013093A; PT1200605E; AU779756B2; HUP0202517A2; SK1382002A3; EA004569B1; US20050196777A1; BG106478A; KR100486006B1; ATE283363T1; CN1370239A

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist auf Zusammensetzungen und Verfahren zur Herstellung von Avermectinen gerichtet und sie liegt primär auf dem Gebiet der Tiergesundheit. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Polynucleotidmoleküle, die für ein AveC-Genprodukt codierende Nucleotidsequenzen umfassen, die zur Modulation des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen, die durch Fermentation von Kulturen von Streptomyces avermitilis produziert wurden, verwendet werden können, und Zusammensetzungen und Verfahren zum Screening derartiger Polynucleotidmoleküle. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Vektoren, transformierte Wirtszellen und neue mutierte Stämme von S. avermitilis, in denen das aveC-Gen so mutiert wurde, dass das Klasse-2:1-Verhältnis der gebildeten Avermectine moduliert wird.
2. Hintergrund der Erfindung
2.1 Avermectine
Streptomyces-Arten produzieren eine breite Vielzahl sekundärer Metaboliten, die die Avermectine umfassen, die eine Reihe von acht verwandten 16-gliedrigen makrocyclischen Lactonen mit starker anthelmintischer und insektizider Aktivität umfassen. Die acht unterschiedlichen, jedoch eng verwandten Verbindungen werden als A1a, A1b, A2a, A1b, B1a, B1b, B2a und B2b bezeichnet. Die "a"-Reihe der Verbindungen bezeichnet das natürliche Avermectin, in dem der Substituent an der C25-Position (S)-sek-Butyl ist, und die "b"-Reihe bezeichnet die Verbindungen, in denen der Substituent an der C25-Position Isopropyl ist. Die Bezeichnungen "A" und "B" beziehen sich auf Avermectine, in denen der Substituent an der C5-Position Methoxy bzw. Hydroxy ist. Die Zahl "1" bezeichnet Avermectine, in denen eine Doppelbindung an der C22,23-Position vorhanden ist, und die Zahl "2" bezeichnet Avermectine mit einem Wasserstoff an der C22-Position und einem Hydroxy and der C23-Position. Unter den verwandten Avermectinen wurde ermittelt, dass der B1-Typ von Avermectin die wirksamste Antiparasiten- und Pestizidaktivität aufweist, und es ist daher das kommerziell am stärksten gewünschte Avermectin.
Die Avermectine und deren Produktion durch aerobe Fermentation von Stämmen von S. avermitilis sind in den US-Patenten 4 310 519 und 4 429 042 beschrieben. Es wird angenommen, dass die Biosynthese von natürlich vorkommenden Avermectinen endogen von den CoAC-Thioesteranaloga von Isobuttersäure und S-(+)-2-Methylbuttersäure initiiert wird.
Eine Kombination aus sowohl einer Stammverbesserung durch Zufallsmutagenese als auch der Verwendung exogen zugeführter Fettsäuren führte zur effizienten Produktion von Avermectinanaloga. Mutanten von S. avermitilis, denen verzweigtkettige-2-Oxo-säure-Dehydrogenase fehlt (bkd-defiziente Mutanten), können Avermectine nur produzieren, wenn Fermentationen mit Fettsäuren ergänzt werden. Screening und Isolierung von Mutanten, denen verzweigte-Kette-Dehydrogenaseaktivität fehlt (beispielsweise S. avermitilis, ATCC 53567) sind im Europäischen Patent EP 276103 beschrieben. Die Fermentation derartiger Mutanten in Gegenwart von exogen zugeführten Fettsäuren führt zur Produktion von nur den vier Avermectinen, die der verwendeten Fettsäure entsprechen. Daher führt die Ergänzung von Fermentationen von S. avermitilis (ATCC 53567) mit S-(+)-2-Methylbuttersäure zur Produktion der natürlich vorkommenden Avermectine A1a, A2a, B1a und B2a; die Ergänzung von Fermentationen mit Isobuttersäure zur Produktion der natürlich vorkommenden Avermectine A1b, A2b, B1b und B2b; und die Ergänzung von Fermentationen mit Cyclopen tancarbonsäure zur Produktion der vier neuen Cyclopentylavermectine A1, A2, B1 und B2.
Bei Ergänzung mit anderen Fettsäuren werden neue Avermectine produziert. Durch Screening von 800 möglichen Vorläufern wurden mehr als 60 andere neue Avermectine identifiziert (siehe beispielsweise Dutton et al., 1991, J. Antibiot. 44:357–365; und Banks et al., 1994, Roy. Soc. Chem. 147:16-26). Außerdem ergeben Mutanten von S. avermitilis, denen 5-O-Methyltransferaseaktivität fehlt, im Wesentlichen nur die B-Analogon-Avermectine. Folglich produzieren Mutanten von S. avermitilis, denen sowohl verzweigtkettige-2-Oxo-säure-Dehydrogenase- als auch 5-O-Methyltransferaseaktivität fehlt, nur die B-Avermectine, die der zur Ergänzung der Fermentation verwendeten Fettsäure entsprechen. Daher führt eine Ergänzung derartiger doppelter Mutanten mit S-(+)-2-Methylbuttersäure zur Produktion von nur den natürlich vorkommenden Avermectinen B1a und B2a, während eine Ergänzung mit Isobuttersäure oder Cyclopentancarbonsäure zur Produktion der natürlich vorkommenden Avermectine B1b und B2b oder der neuen Cyclopentyl-B1- bzw. -B2-Avermectine führt. Die Ergänzung des doppelt mutierten Stamms mit Cyclohexancarbonsäure ist ein bevorzugtes Verfahren zur Produktion des kommerziell wichtigen neuen Avermectins Cyclohexylavermectin B1 (Doramectin). Die Isolierung und Eigenschaften derartiger doppelter Mutanten, beispielsweise S. avermitilis (ATCC 53692), ist in EP 276103 beschrieben.
2.2 An der Biosynthese von Avermectin beteiligte Gene
In vielen Fällen werden an der Produktion sekundärer Metaboliten beteiligte Gene und ein spezielles Antibiotikum codierende Gene auf dem Chromosom zusammengeschart gefunden. Dies ist beispielsweise der Fall bei dem Streptomyces-Polyketidsynthase-Gencluster (PKS) (siehe Hopwood und Sherman, 1990, Ann. Rev. Genet. 24:37–66). Daher bestand eine Strategie zur Klonierung von Genen auf einem Biosyntheseweg darin, ein Drogenresistenzgen zu isolieren und dann angrenzende Regionen des Chromosoms auf andere Gene, die mit der Biosynthese des speziellen Antibiotikums in Verbindung stehen, zu testen. Eine andere Strategie zur Klonierung von an der Biosynthese von wichtigen Metaboliten beteiligten Genen war die Komplementierung von Mutanten. Beispielsweise werden Teile einer DNA-Bibliothek von einem Organismus, der einen speziellen Metaboliten produzieren kann, in eine nichtproduzierende Mutante eingeführt und Transformanten auf die Produktion des Metabolits durchmustert. Ferner wurde die Hybridisierung einer Bibliothek unter Verwendung von von anderen Streptomyces-Arten abgeleiteten Sonden zur Identifizierung und Klonierung von Genen auf Biosynthesewegen verwendet.
An der Biosynthese von Avermectin beteiligte Gene (aveC-Gene) finden sich wie die zur Biosynthese anderer sekundärer Metaboliten von Streptomyces erforderlichen Gene (beispielsweise PKS) auf dem Chromosom zusammengeschart bzw. als Cluster. Eine Zahl von aveC-Genen wurde unter Verwendung von Vektoren zur Komplementierung von S. avermitilis-Mutanten, die hinsichtlich der Avermectin-Biosynthese geblockt waren, erfolgreich kloniert. Die Klonierung derartiger Gene ist im US-Patent 5 252 474 beschrieben. Ferner beschreiben Ikeda et al., 1995, J. Antibiot. 48:532–534 die Lokalisierung einer Chromosomenregion, die die C22,23-Dehydratationsstufe (aveC) zu einem 4,82-kb-BamHI-Fragment von S. avermitilis umfasst, sowie Mutationen in dem aveC-Gen, die zur Produktion eines Produzenten einer einzigen Komponente B2a führen. Da Ivermectin, eine starke anthelmintische Verbindung, chemisch aus Avermectin B2a produziert werden kann, wird ein derartiger Produzent einer einzigen Komponente von Avermectin B2a als zur kommerziellen Produktion von Avermectin besonders geeignet angesehen.
Die Identifizierung von Mutationen in dem aveC-Gen, die die Komplexität der Avermectinproduktion minimieren, beispiels weise Mutationen, die das B2:B1-Verhältnis von Avermectinen verringern, würde die Produktion und Reinigung kommerziell wichtiger Avermectine vereinfachen.
3. Zusammenfassung der Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines isolierten Polynucleotidmoleküls, das das vollständige aveC-ORF von S. avermitilis oder einen wesentlichen Teil desselben umfasst, wobei dem isolierten Polynucleotidmolekül das nächste vollständige ORF, das strangabwärts des aveC-ORF in situ in dem S. avermitilis-Chromosom lokalisiert ist, fehlt. Das isolierte Polynucleotidmolekül der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise eine Nucleotidsequenz, die gleich der das S. avermitilis-AveC-Genprodukt codierenden Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) oder gleich der Nucleotidsequenz des aveC-ORF von 1 (SEQ ID NO: 1) oder einem wesentlichen Teil derselben ist. Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines isolierten Polynucleotidmoleküls, das die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder eine degenerierte Variante derselben umfasst.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines isolierten Polynucleotidmoleküls mit einer Nucleotidsequenz, die zu der das S. avermitilis-AveC-Genprodukt codierenden Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) oder der Nucleotidsequenz des aveC-ORF, die in 1 dargestellt ist (SEQ ID NO: 1), oder einem wesentlichen Teil derselben homolog ist.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines isolierten Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid codiert, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die homolog zu der durch die das AveC-Genprodukt codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) codierten Aminosäuresequenz oder der Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2) oder einem wesentlichen Teil derselben ist.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines isolierten Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein AveC-Homologgenprodukt umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Polynucleotidmolekül eine Nucleotidsequenz mit Codierung für das AveC-Homologgenprodukt von S. hygroscopicus, wobei das Homologgenprodukt die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 oder einen wesentlichen Teil derselben umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Polynucleotidmolekül der vorliegenden Erfindung, das das AveC-Homologgenprodukt von S. hygroscopicus codiert, die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 3 oder einen wesentlichen Teil derselben.
Durch die vorliegenden Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines isolierten Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die homolog zu der S. hygroscopicus-Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 3 ist. Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines isolierten Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid codiert, das homolog zu dem AveC-Homologgenprodukt von S. hygroscopicus mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Oligonucleotide bereit, die mit einem Polynucleotidmolekül mit der Nucleotidsequenz von 1 (SEQ ID NO: 1) oder SEQ ID NO: 3 oder mit einem Polynucleotidmolekül mit einer Nucleotidsequenz, die das Komplement der Nucleotidsequenz von 1 (SEQ ID NO: 1) oder SEQ ID NO: 3 ist, hybridisieren.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung von rekombinanten Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren, die zur Klonierung oder Expression eines Poly nucleotids der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, die Polynucleotidmoleküle enthalten, die das aveC-ORF von S. avermitilis oder ein aveC-Homolog-ORF umfassen. In einer nicht beschränkenden Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung das Plasmid pSE186 (ATCC 209604) bereit, das das gesamte ORF des aveC-Gens von S. avermitilis umfasst. Die vorliegende Erfindung stellt ferner transformierte Wirtszellen, die ein Polynucleotidmolekül oder einen rekombinanten Vektor gemäß der Erfindung umfassen, und neue Stämme oder davon abgeleitete Zelllinien bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein rekombinant exprimiertes AveC-Genprodukt oder AveC-Homologgenprodukt oder einen wesentlichen Teil desselben, das wesentlich gereinigt oder isoliert wurde, sowie Homologe derselben bereit. Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten AveC-Genprodukts bereit, das das Kultivieren einer mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformierten Wirtszelle, wobei der rekombinante Expressionsvektor ein Polynucleotidmolekül mit einer Nucleotidsequenz mit Codierung für ein AveC-Genprodukt oder AveC-Homologgenprodukt umfasst, wobei das Polynucleotidmolekül mit einem oder mehreren regulatorischen Elementen, die die Expression des Polynucleotidmoleküls in der Wirtszelle steuern, in operativer Verbindung ist, unter zur Produktion des rekombinanten AveC-Genprodukts oder aveC-Homologgenprodukts führenden Bedingungen und das Gewinnen des AveC-Genprodukts oder AveC-Homologgenprodukts und aus der Zellkultur umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Polynucleotidmolekül bereit, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ansonsten die gleiche wie das S. avermitilis-AveC-Allel oder die das AveC-Genprodukt codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) oder eine degenerierte Variante derselben oder die Nucleotidsequenz des aveC-ORF von S. avermitilis, das in 1 angegeben ist (SEQ ID NO: 1) oder eine degenerierte Variante desselben ist, die jedoch ferner eine oder mehrere Mutationen derart umfasst, dass Zellen des S. avermitilis-Stamms ATCC 53692, in dem das aveC-Allel des Wildtyps inaktiviert wurde und der das die mutierte Nucleotidsequenz umfassende Polynucleotidmolekül exprimiert, ein unterschiedliches Verhältnis oder eine unterschiedliche Menge von Avermectinen produzieren als sie von Zellen des S. avermitilis-Stamms ATCC 53692, der stattdessen nur das avec-Allel des Wildtyps exprimiert, produziert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung können derartige Polynucleotidmoleküle zur Produktion neuer Stämme von S. avermitilis, die eine nachweisbare Veränderung der Avermectinproduktion im Vergleich zum gleichen Stamm, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, zeigen, verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform sind derartige Polynukleotidmoleküle zur Produktion neuer Stämme von S. avermitilis verwendbar, die Avermectine in einem verringerten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu dem des gleichen Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produzieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind derartige Polynucleotidmoleküle zur Produktion neuer Stämme von S. avermitilis verwendbar, die erhöhte Mengen von Avermectinen im Vergleich zum gleichen Stamm, der stattdessen nur ein einziges aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produzieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind derartige Polynukleotidmoleküle zur Produktion neuer Stämme von S. avermitilis, in denen das AveC-Gen inaktiviert wurde, verwendbar.
Die vorliegenden Erfindung stellt Verfahren zur Identifizierung von Mutationen des aveC-ORF von S. avermitilis mit der Fähigkeit der Änderung des Verhältnisses und/oder der Menge der produzierten Avermectine bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Mutationen des aveC-ORF mit der Fähigkeit zur Änderung des Klasse-2:1-Verhältnisses der gebildeten Avermectine bereit, das umfasst:
(a) das Bestimmen des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, in dem das hierzu native aveC-Allel inaktiviert wurde und in den ein Polynucleotidmolekül, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein mutiertes AveC-Genprodukt umfasst, eingeführt wurde und darin exprimiert wird, produziert wurden;
(b) das Bestimmen des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen, die von Zellen des gleichen Stamms von S. avermitilis wie in Stufe (a), die jedoch stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps oder das ORF von 1 (SEQ ID NO: 1) oder eine hierzu homologe Nucleotidsequenz exprimieren, produziert wurden; und (c) Vergleichen des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (a) produziert wurden, mit dem Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (b) produziert wurden, derart, dass, wenn das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (a) produziert wurden, von dem Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (b) produziert wurden, verschieden ist, dann eine Mutation des aveC-ORF mit der Fähigkeit zur Änderung des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen identifiziert wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen durch die Mutation verringert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von Mutationen des aveC-ORF oder von das aveC-ORF umfassenden Genkonstrukten mit der Fähigkeit der Änderung der Menge der produzierten Avermectine bereit, das umfasst: (a) Bestimmen der Menge von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, in dem das hierzu native aveC-Allel inaktiviert wurde und in den ein Polynucleotidmolekül, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein mutiertes AveC-Genprodukt umfasst oder ein eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein AveC-Genprodukt umfassendes Genkonstrukt um fasst, eingeführt wurde und exprimiert wird, produziert wurde; (b) das Bestimmen der Menge von Avermectinen, die durch Zellen des gleichen Stamms von S. avermitilis wie in Stufe (a), die jedoch stattdessen nur ein einziges aveC-Allel mit der Nucleotidsequenz des ORF von 1 (SEQ ID NO: 1) oder einer Nucleotidsequenz, die hierzu homolog ist, exprimieren, produziert wurde; und (c) Vergleichen der Menge von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (a) produziert wurde, mit der Menge von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (b) produziert wurde, derart, dass, wenn die Menge der Avermectine, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (a) produziert wurde, verschieden von der Menge der Avermectine, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (b) produziert wurde, ist, dann eine Mutation des aveC-ORF oder eines Genkonstrukts mit der Fähigkeit der Änderung der Menge der Avermectine identifiziert wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge der gebildeten Avermectine durch die Mutation erhöht.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner rekombinante Vektoren bereit, die zur Herstellung neuer Stämme von S. avermitilis mit geänderter Avermectinproduktion verwendbar sind. Beispielsweise stellt die vorliegende Erfindung Vektoren bereit, die zur Zielausrichtung von einem der Polynucleotidmoleküle, das die mutierte Polynucleotidsequenzen der vorliegenden Erfindung umfasst, auf den Ort des aveC-Gens des S. avermitilis-Chromosoms zum entweder Insertieren in das aveC-Allel oder ORF oder einen Teil derselben oder Substituieren derselben durch homologe Rekombination verwendet werden können. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedoch ein hierdurch bereitgestelltes, eine mutierte Nucleotidsequenz umfassendes Polynucleotidmolekül gemäß der vorliegenden Erfindung auch eine Modulation der Avermectinbiosynthese bewirken, wenn es in das S. avermitilis-Chromosom an einem anderen Ort als auf dem aveC-Gen insertiert wurde oder wenn es episomal in S. avermitilis-Zellen erhalten bleibt. Daher stellt die vorliegende Erfindung auch Vektoren bereit, die ein eine mutierte Nucleotidsequenz umfassendes Polynucleotidmolekül gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, wobei die Vektoren zur Insertion des Polynucleotidmoleküls an einem anderen Ort in dem S. avermitilis-Chromosom als in dem aveC-Gen oder zum episomalen Beibehalten verwendet werden können. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung Gensubstitutionsvektoren bereit, die zur Insertion eines mutierten aveC-Allels in das S. avermitilis-Chromosom zur Erzeugung neuer Stämme von Zellen, die Avermectine in einem verringerten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu den Zellen des gleichen Stamms, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produzieren, verwendet werden können.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner Verfahren zur Herstellung neuer Stämme von S. avermitilis bereit, die Zellen umfassen, die ein mutiertes aveC-Allel exprimieren und die geänderte Verhältnisse und/oder Mengen von Avermectinen im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms von S. avermitilis, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung neuer Stämme von S. avermitilis bereit, die Zellen umfassen, die ein mutiertes aveC-Allel exprimieren und die ein verändertes Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms von S. avermitilis, die stattdessen nur ein aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produzieren, wobei das Verfahren das Transformieren von Zellen eines Stamms von S. avermitilis mit einem Vektor, der ein mutiertes aveC-Allel trägt, das für ein Genprodukt codiert, das das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, die das mutierte Allel exprimieren, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produziert wurden, ändert und das Selektieren transformierter Zellen, die Avermectine in einem geänderten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu dem Klasse-2:1-Verhältnis, das durch Zellen des gleichen Stamms, die stattdessen das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produziert wurde, produzieren, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Klasse-2:1-Verhältnis von produzierten Avermectinen in Zellen des neuen Stamms verringert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung neuer Stämme von S. avermitilis bereit, die Zellen umfassen, die geänderte Mengen von Avermectin produzieren, das das Transformieren von Zellen eines Stamms von S. avermitilis mit einem Vektor, der ein mutiertes aveC-Allel oder ein das aveC-Allel umfassendes Genkonstrukt trägt, deren Expression zu einer geänderten Menge von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, der das mutierte aveC-Allel oder Genkonstrukt exprimiert, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produziert werden, führt, und das Selektieren transformierter Zellen, die Avermectine in einer geänderten Menge im Vergleich zu der Menge von Avermectinen, die durch Zellen des Stamms, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produziert wurden, produzieren, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge der produzierten Avermectine in Zellen des neuen Stamms erhöht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung neuer Stämme von S. avermitilis, deren Zellen ein inaktiviertes aveC-Allel umfassen, bereit, das das Transformieren von Zellen eines Stamms von S. avermitilis, die ein beliebiges aveC-Allel exprimieren, mit einem Vektor, der das aveC-Allel inaktiviert, und das Selektieren transformierter Zellen, in denen aveC-Allel inaktiviert wurde, umfasst.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner neue Stämme von S. avermitilis bereit, die Zellen umfassen, die mit einem der Polynucleotidmoleküle oder Vektoren, die eine mutierte Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfassen, transformiert wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung neue Stämme von S. avermitilis bereit, die Zellen umfassen, die ein mutiertes aveC-Allel anstelle von oder zusätzlich zu dem aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, wobei die Zellen des neuen Stamms Avermectine in einem geänderten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produzieren. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform produzieren die Zellen des neuen Stamms Avermectine in einem verringerten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren. Derartige neue Stämme sind bei der Großproduktion kommerziell gewünschter Avermectine, wie Doramectin, verwendbar.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung neue Stämme von S. avermitilis bereit, die Zellen umfassen, die ein mutiertes aveC-Allel oder ein das aveC-Allel umfassendes Genkonstrukt anstelle von oder zusätzlich zu dem hierzu nativen aveC-Allel exprimieren, was zur Produktion einer geänderten Menge von Avermectinen im Vergleich zu der Menge von Avermectinen, die durch Zellen des gleichen Stamms, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produziert wurde, durch die Zellen führt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung neue Stämme von S. avermitilis bereit, die Zellen umfassen, in denen aveC-Gen inaktiviert wurde. Derartige Stämme sind sowohl wegen des unterschiedlichen Spektrums von Avermectinen, das sie im Vergleich zum Stamm des Wildtyps produzieren, als auch in Komplementierung-Screening Assays, die hier beschrieben sind, um zu bestimmen, ob eine gezielte oder Zufallsmutagenese des aveC-Gens die Avermectinproduktion beeinflusst, verwendbar.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Produktion von Avermectinen bereit, das das Züchten von Zellen eines Stamms von S. avermitilis, wobei die Zellen ein mutiertes aveC-Allel, das ein Genprodukt codiert, das das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, der das mutierte aveC-Allel exprimiert, produziert wurden, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, die das mutierte aveC-Allel nicht exprimieren, sondern stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, ändert, exprimieren, in Kulturmedien unter Bedingungen, die die Produktion von Avermectinen aus diesen gestatten oder induzieren, und das Gewinnen der Avermectine aus der Kultur umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch die Mutation exprimierende Zellen produziert wurden, verringert. Dieses Verfahren stellt eine erhöhte Effizienz bei der Produktion von kommerziell nutzbaren Avermectinen, wie Doramectin, bereit.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Produktion von Avermectinen bereit, das das Kultivieren von Zellen eines Stamms von S. avermitilis, wobei die Zellen ein mutiertes aveC-Allel oder ein ein aveC-Allel umfassendes Genkonstrukt exprimieren, das zur Produktion einer geänderten Menge von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, die das mutierte aveC-Allel oder Genkonstrukt exprimieren, produziert wurde, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, die das mutierte aveC-Allel oder Genkonstrukt nicht exprimieren, jedoch stattdessen nur dass aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, führt, in Kulturmedien unter Bedingungen, die die Produktion von Avermectinen aus diesen gestatten oder induzieren, und das Gewinnen der Avermectine aus der Kultur umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge der Avermectine, die durch die Mutation oder das Genkonstrukt exprimierenden Zellen produziert wurde, erhöht.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner eine neue Zusammensetzung von Avermectinen, die durch einen Stamm von S. avermitilis, der ein mutiertes aveC-Allel gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, produziert wurden, wobei die Avermectine in einem verringerten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu dem Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch Zellen des gleichen Stamms von S. avermitilis, die das mutierte aveC-Allel nicht exprimieren, sondern stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produziert wurden, produziert wurden. Die neue Avermectin-Zusammensetzung kann wie in Fermentationskulturfluid produziert vorhanden sein oder aus diesem geerntet werden und sie kann daraus teilweise oder wesentlich auf gereinigt sein.
4. Kurze Beschreibung der Figuren
1. DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 1), die das aveC-ORF von S. avermitilis umfasst, und abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID No: 2).
2. Plasmidvektor pSE186 (ATCC 209604), der das gesamte ORF des aveC-Gens von S. avermitilis umfasst.
3. Gensubstitutionsvektor pSE 180 (ATCC 209605), der das ermE-Gen von Sacc. erythraea in das aveC-ORF von S. avermitilis insertiert umfasst.
4. BamHI-Restriktionskarte des Avermectin-Polyketidsynthase-Genclusters von S. avermitilis mit fünf identifizierten überlappenden Cosmidclonen (d. h. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69). Die Beziehung von pSE118 und pSE119 ist ebenfalls angegeben.
5. HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten, die durch S. avermitilis-Stämme produziert wurden. Die quantitative Bestimmung der Peaks wurde durch Vergleich mit Standardmen gen von Cyclohexyl B1 durchgeführt. Die Retentionszeit von Cyclohexyl B2 betrug 7,4 – 7,7 min; die Retentionszeit von Cyclohexyl B1 betrug 11,9 – 12,3 min. 5A. S. avermitilis-Stamm SE180-11 mit einem inaktivierten aveC-ORF. 5B. S. avermitilis-Stamm SE180-11 transformiert mit pSE186 (ATCC 209604). 5C. S. avermitilis-Stamm SE180-11 transformiert mit pSE187. 5D. S. avermitilis-Stamm SE180-11 transformiert mit pSE188.
6. Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen, die durch das aveC-ORF von S. avermitilis (SEQ ID NO: 2), ein aveC-homologes partielles ORF von S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) und das aveC-Homolog-ORF von S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4) codiert wurden. Der Valinrest in Fettdruck ist der vermutliche Startort für das Protein. Konservierte Reste sind in Großbuchstaben bei Homologie in allen drei Sequenzen und in Kleinbuchstaben bei Homologie in zwei der drei Sequenzen angegeben. Die Aminosäuresequenzen enthalten etwa 50 Sequenzidentität.
7. Hybridplasmidkonstrukt, das ein 564-bp-BsaAI/KpnI-Fragment aus dem aveC-Homologgen von S. hygroscopicus in die BsaAI/KpnI-Stelle im aveC-ORF von S. avermitilis insertiert enthält.
5. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung und Charakterisierung von Polynucleotidmolekülen mit Nucleotidsequenzen, die das AveC-Genprodukt von S. avermitilis codieren, die Konstruktion neuer Stämme von S. avermitilis, die zum Screening mutierter AveC-Genprodukte auf deren Wirkung auf die Avermectinproduktion verwendet werden können, und die Feststellung, dass bestimmte mutierte AveC-Genprodukte das Verhältnis von B2:B1-Avermectinen, die durch S. avermitilis produziert werden, verringern können. Als Beispiel wird die Erfindung in den folgenden Abschnitten für ein Polynucleotidmolekül, das entweder eine Nucleotidsequenz, die die gleiche wie die das AveC-Genprodukt von S. avermitilis codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) ist, oder die Nucleotidsequenz des ORF von 1 (SEQ ID NO: 1) aufweist, und für Polynucleotidmoleküle mit davon abgeleiteten mutierten Nucleotidsequenzen und degenerierten Varianten derselben beschrieben. Jedoch können die in der vorliegenden Erfindung angegebenen Prinzipien analog auf andere Polynucleotidmoleküle angewandt werden, die aveC-Homologgene von anderen Streptomyces-Arten, die unter anderem beispielsweise S. hygroscopicus und S. griseochromogenes umfassen, umfassen.
5.1 Codierung von Polynucleotidmolekülen
Das AveC-Genprodukt von S. avermitilis
Die vorliegende Erfindung stellt ein isoliertes Polynucleotidmolekül bereit, das das vollständige aveC-ORF von S. avermitilis oder einen wesentlichen Teil desselben umfasst, wobei dem isolierten Polynucleotidmolekül das nächste vollständige ORF, das strangabwärts des aveC-ORF in situ in dem S. avermitilis-Chromosom lokalisiert ist, fehlt.
Das isolierte Polynucleotidmolekül der vorliegenden Erfindung umfasst vorzugsweise eine Nucleotidsequenz, die die gleiche wie die das AveC-Genprodukt von S. avermitilis codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) ist, oder die die gleiche wie die Nucleotidsequenz des ORF von 1 (SEQ ID NO: 1) oder ein wesentlicher Teil derselben ist. Der hier verwendete Ausdruck "wesentlicher Teil" eines isolierten Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für das AveC-Genprodukt von S. avermitilis umfasst, bedeutet ein isoliertes Polynucleotidmolekül, das mindestens etwa 70 % der vollständigen aveC-ORF-Sequenz, die in 1 angegeben ist, (SEQ ID NO: 1) umfasst und das ein funktional äquivalentes AveC-Genprodukt codiert. Im Hinblick darauf ist ein "funktional äquivalentes" AveC-Genprodukt als ein Genprodukt definiert, das, wenn es in dem S. avermitilis-Stamm ATCC 53692, in dem das native aveC-Allel inaktiviert wurde, exprimiert wird, zur Produktion von im Wesentlichen dem gleichen Verhältnis und der gleichen Menge von Avermectinen, die durch den S. avermitilis-Stamm ATCC 53692, der stattdessen nur das funktionale aveC-Allel des Wildtyps, das für den S. avermitilis-Stamm ATCC 53692 nativ ist, produziert wurden, führt.
Zusätzlich zu der Nucleotidsequenz des aveC-ORF kann das isolierte Polynucleotidmolekül der vorliegenden Erfindung ferner Nucleotidsequenzen umfassen, die von Natur aus das aveC-Gen in situ in S. avermitilis flankieren, wie die flankierenden Nucleotidsequenzen, die in 1 (SEQ ID NO: 1) angegeben sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein isoliertes Polynucleotidmolekül bereit, das die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 1 oder eine degenerierte Variante derselben umfasst.
Die hier verwendeten Ausdrücke "Polynucleotidmolekül", "Polynucleotidsequenz", "codierende Sequenz", "offenes Leseraster" und "ORF" sollen sich sowohl auf DNA- als auch RNA-Moleküle beziehen, die entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein können, und die in ein AveC-Genprodukt oder, wie im Folgenden beschrieben, in eine AveC-Homologgenprodukt oder in ein Polypeptid, das zu einem AveC-Genprodukt oder AveC-Homologgenprodukt homolog ist, in einem geeigneten Wirtszellexpressionssystem transkribiert und translatiert (DNA) oder translatiert (RNA) werden, wenn sie unter die Kontrolle geeigneter regulatorischer Elemente gestellt werden. Eine codierende Sequenz kann, ohne hierauf beschränkt zu sein, prokaryotische Sequenzen, cDNA-Sequenzen, Genom-DNA-Sequenzen und chemisch synthetisierte DNA- und RNA-Sequenzen umfassen.
Die in 1 gezeigte Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) umfasst vier unterschiedliche GTG-Codons an den bp-Positionen 42, 174, 177 und 180. Wie im folgenden Abschnitt 9 beschrieben, wurden mehrfache Deletionen der 5'-Region des aveC-ORF (1; SEQ ID NO: 1) konstruiert, um festlegen zu können, welche dieser Codons in dem aveC-ORF als Startstellen für die Proteinexpression fungieren können. Die Deletion der ersten GTG-Stelle bei bp 42 beseitigte die AveC-Aktivität nicht. Die weitere Deletion aller GTG-Codons an den bp-Positionen 174, 177 und 180 zusammen beseitigte die AveC-Aktivität, was anzeigt, dass diese Region zur Proteinexpression notwendig ist. Die vorliegende Erfindung umfasst daher aveC-ORFs variabler Länge.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines Polynucleotidmoleküls mit einer Nucleotidsequenz, die homolog zu der das S. avermitilis-AveC-Genprodukt codierenden Sequenz des Plasmids pSEl86 (ATCC 209604) oder der in 1 dargestellten Nucleotidsequenz des aveC-ORF (SEQ ID NO: 1) oder einem wesentlichen Teil derselben ist. Der Ausdruck "homolog" bedeutet, wenn er zur Bezeichnung eines Polynucleotidmoleküls, das zu einer das S. avermitilis-AveC-Genprodukt codierenden Sequenz homolog ist, verwendet wird, ein Polynucleotidmolekül mit einer Nucleotidsequenz:
(a) die das gleiche AveC-Genprodukt wie die das S. avermitilis-AveC-Genprodukt codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) codiert oder das gleiche AveC-Genprodukt wie die in 1 dargestellte Nucleotidsequenz des aveC-ORF (SEQ ID NO: 1) codiert, das jedoch eine oder mehrere stille Änderungen der Nucleotidsequenz gemäß der Entartung des genetischen Codes umfasst (d. h. eine degenerierte Variante); oder (b) die mit dem Komplement eines Polynucleotidmoleküls mit einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz, die von der das AveC-Genprodukt codierenden Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) codiert wird, oder die in 1 gezeigte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) codiert, unter mäßig stringenten Bedingungen, d. h. eine Hybridisierung mit filtergebundener DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65 °C und Waschen in 0,2×SSC/0,1 SDS bei 42 °C (siehe Ausubel et al. (Hrsg.), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Band I, Green Publishing Associates, Inc. und John Wiley & Sons, Inc., New York auf S. 2.10.3), hybridisiert und ein wie oben definiertes funktional äquivalentes AveC-Genprodukt codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert das homologe Polynucleotidmolekül mit dem Komplement der das AveC-Genprodukt codierenden Nucleotidsequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) oder dem Komplement der in 1 dargestellten Nucleotidsequenz des aveC-ORF (SEQ ID NO: 1) oder eines wesentlichen Teils derselben unter hochstringenten Bedingungen, d, h. eine Hybridisierung mit filtergebundener DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7 % SDS, 1 mM EDTA bei 65 °C und Waschen in 0,1×SSC/0,1 % SDS bei 68 °C (Ausubel et al., 1989, oben) und es codiert für ein wie oben definiertes funktional äquivalentes Genprodukt.
Die Aktivität eines AveC-Genprodukts und potentieller funktionaler Äquivalente desselben können durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten gemäß der Beschreibung in den folgenden Beispielen bestimmt werden. Polynucleotidmoleküle mit Nucleotidsequenzen, die funktionale Äquivalente des S. avermitilis-AveC-Genprodukts codieren, umfassen natürlich vorkommende aveC-Gene, die in anderen Stämmen von S. avermitilis vorhanden sind, aveC-Homologgene, die in anderen Arten von Streptomyces vorhanden sind, und mutierte aveC-Allele, die entweder natürlich vorkommen oder technisch verändert wurden.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz codiert, die zu der Aminosäuresequenz, die durch die das AveC-Genprodukt codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) codiert wird, oder der Aminosäuresequenz von Figur (SEQ ID NO: 2) oder einem wesentlichen Teil derselben homolog ist. Der hier verwendete Ausdruck "wesentlicher Teil" der Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2) bedeutet ein Polypeptid, das mindestens etwa 70 % der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2) umfasst und ein wie oben definiertes funktional äquivalentes AveC-Genprodukt bildet.
Der hier zur Bezeichnung von Aminosäuresequenzen, die zur Aminosäuresequenz eines AveC-Genprodukts von S. avermitilis homolog sind, verwendete Ausdruck "homolog" bezeichnet ein Polypeptid, das ansonsten die Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2) aufweist, in dem jedoch einer oder mehrere Aminosäurereste durch einen unterschiedlichen Aminosäurerest konservativ substituiert sind, wobei die Aminosäuresequenz mindestens etwa 70 %, zweckmäßigerweise mindestens etwa 80 % und vorzugsweise mindestens etwa 90 % Aminosäuresequenzidentität mit dem Polypeptid, das durch die das AveC-Genprodukt codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) codiert wird, oder der Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2) gemäß der Bestimmung durch einen Standard-Aminosäuresequenzidentitätsalgorithmus, wie den BLASTP-Algorithmus (GENBANK, NCBI), aufweist und wobei eine derartige konservative Substitution zu einem funktional äquivalenten Genprodukt gemäß der obigen Definition führt. Konservative Aminosäuresubstitutionen sind einschlägig bekannt. Vorschriften zur Herstellung derartiger Substitutionen umfassen unter anderem die von M. D. Dayhof, 1978, Nat. Biomed. Res. Found., Washington, D. C., Band 5, Sup. 3 beschriebenen. Genauer gesagt, sind konservative Aminosäuresubstitutionen diejenigen, die allgemein innerhalb einer Familie von Aminosäuren stattfinden, die hinsichtlich Acidität oder Polarität verwandt sind. Gentechnisch codierte Aminosäuren werden allgemein in vier Gruppen eingeteilt: (1) saure = Aspartat, Glutamat; (2) basische = Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolare = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladene polare = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. Phenylalanin, Tryptophan und Tyrosin werden auch gemeinsam als aromatische Aminosäuren klassifiziert. Eine oder mehrere Substitutionen innerhalb einer speziellen Gruppe, beispielsweise ein Leucin durch ein Isoleucin oder Valin, oder ein Aspartat durch ein Glutamat oder ein Threonin durch ein Serin, oder jeder andere Aminosäurerest durch eine strukturell verwandten Aminosäurerest, beispielsweise einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Acidität oder Polarität oder mit Ähnlichkeit bei einer Kombination derselben ergibt allgemein eine nichtsignifikante Wirkung auf die Funktion des Polypeptids.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines isolierten Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein aveC-Homologgenprodukt umfasst. Das hier verwendete "aveC-Homologgenprodukt" ist als ein Genprodukt mit mindestens etwa 50 Aminosäuresequenzidentität zu einem AveC-Genprodukt von S. avermitilis, das die Aminosäuresequenz, die durch die das AveC-Genprodukt codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) codiert wird, umfasst oder der in 1 gezeigten Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 2), was durch einen beliebigen Standard-Aminosäuresequenzidentitätsalgorithmus, beispielsweise den BLASTP-Algorithmus (GENBANK, NCBI) bestimmt wurde, definiert. In einer nicht beschränkenden Ausführungsform stammt das aveC-Homologgenprodukt von S. hygroscopicus (Beschreibung in der EP-Anmeldung 0298423; Hinterlegung FERM BP-1901) und es umfasst die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 oder einen wesentlichen Teil derselben. Ein "wesentlicher Teil" der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 4 bedeutet ein Polypeptid, das mindestens etwa 70 % der Sequenz SEQ ID NO: 4 umfasst und das ein funktional äquivalentes aveC-Homologgenprodukt bildet. Ein "funktional äquivalentes" AveC-Homologgenprodukt ist als ein Genprodukt definiert, das, wenn es in dem S. hygroscopicus-Stamm FERM BP-1901, in dem das native aveC-Homologallel inaktiviert wurde, expri miert wird, zur Produktion von im Wesentlichen dem gleichen Verhältnis und der gleichen Menge von Milbemycinen wie sie von dem S. hygroscopicus-Stamm FERM BP-1901, der stattdessen nur das für den S. hygroscopicus-Stamm FERM BP-1901 native funktionale aveC-Homologallel des Wildtyps exprimiert, produziert werden, führt. In einer nicht beschränkenden Ausführungsform umfasst das isolierte Polynucleotidmolekül der vorliegenden Erfindung, das das S. hygroscopicus-aveC-Homologgenprodukt codiert, die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 3 oder einen wesentlichen Teil derselben. In dieser Hinsicht bedeutet ein "wesentlicher Teil" des isolierten Polynucleotidmoleküls, dass die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 3 umfasst, ein isoliertes Polynucleotidmolekül, das mindestens etwa 70 der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 3 umfasst und das ein funktional äquivalentes AveC-Homologgenprodukt, wie unmittelbar vorher angegeben, codiert.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die homolog zu der S. hygroscopicus-Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 3 ist. Der Ausdruck "homolog" bedeutet, wenn er zur Bezeichnung eines Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die homolog zu der das S. hygroscopicus-aveC-Homologgenprodukt codierenden Sequenz SEQ ID NO: 3 ist, verwendet wird, ein Polynucleotidmolekül mit einer Nucleotidsequenz: (a) die das gleiche Genprodukt wie die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 3 codiert, jedoch eine oder mehrere stille Änderungen der Nucleotidsequenz entsprechend der Entartung des genetischen Codes umfasst (d. h. eine degenerierte Variante); oder (b) die mit dem Komplement eines Polynucleotidmoleküls mit einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 codiert, unter mäßig stringenten Bedingungen, d. h. Hybridisierung mit filtergebundener DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7 % SDS, 1 mM EDTA bei 65 °C und Waschen in 0,2×SSC/0,1 % SDS bei 42 °C (siehe Ausubel et al. oben), hybridisiert und ein wie oben definiertes funktional äquivalentes AveC-Homologgenprodukt codiert. In einer bevorzugten Ausführungsform hybridisiert das homologe Polynucleotidmolekül mit dem Komplement der das RveC-Homologgenprodukt codierenden Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 3 unter hochstringenten Bedingungen, d. h. Hybridisierung mit filtergebundener DNA in 0,5 M NaHPO₄, 7 % SDS, 1 mM EDTA bei 65 °C und Waschen in 0,1×SSC/0,1 % SDS bei 68 °C (Ausubel et al., 1989, oben), und es codiert ein funktional äquivalentes aveC-Homologgenprodukt gemäß der obigen Definition.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ein Polypeptid, das homolog zu dem S. hygroscopicus-aveC-Homologgenprodukt ist, codiert. Der Ausdruck "homolog", der hier zur Bezeichnung von Polypeptiden, die homolog zu dem aveC-Homologgenprodukt der SEQ ID NO: 4 von S. hygroscopicus sind, verwendet wird, bezeichnet ein Polypeptid, das ansonsten die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 besitzt, in dem jedoch eine oder mehrere Aminosäurereste durch einen unterschiedlichen Aminosäurerest, wie oben definiert, konservativ substituiert sind, wobei die Aminosäuresequenz mindestens etwa 70, zweckmäßigerweise mindestens etwa 80 % und vorzugsweise mindestens etwa 90 % Aminosäuresequenzidentität zu dem Polypeptid der SEQ ID NO: 4, die durch einen beliebigen Standard-Aminosäuresequenzidentitätsalgorithmus, beispielsweise den BLASTP-Algorithmus (GENBANK, NCBI) bestimmt wurde, aufweist und wobei eine derartige konservative Substitution zu einem funktional äquivalenten AveC-Homologgenprodukt gemäß der obigen Definition führt.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung von Oligonucleotiden, die mit einem Polynucleotidmolekül mit der Nucleotidsequenz von 1 (SEQ ID NO: 1) oder SEQ ID NO: 3 oder mit einem Polynucleotidmolekül mit einer Nucleotidsequenz, die das Komplement der Nucleotidsequenz von 1 (SEQ ID NO: 1) oder SEQ ID NO: 3 ist, hybridisieren. Derartige Oligonucleotide weisen eine Länge von mindestens etwa 10 Nucleotiden und vorzugsweise von etwa 15 bis etwa 30 Nucleotiden auf und sie hybridisieren mit einem der im Vorhergehenden genannten Polynucleotidmoleküle unter hochstringenten Bedingungen, d. h. Waschen in 6×SSC/0,5 % Natriumpyrophosphat bei ~37 °C für Oligos von ~14 Basen, bei ~48 °C für Oligos von ~17 Basen, bei ~55 °C für Oligos von ~20 Basen und bei ~60 °C für Oligos von ~23 Basen. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Oligonucleotide komplementär zu einem Teil von einem der im Vorhergehenden genannten Polynucleotidmoleküle. Diese Oligonucleotide sind für eine Vielzahl von Zwecken verwendbar, die die Codierung oder Wirkung als Antisensemoleküle, die zur Genregulation verwendbar sind, oder als Primer bei der Amplifikation von aveC oder aveC-Homolog codierenden Polynucleotidmolekülen umfassen.
Weiter aveC-Homologgene können in anderen Arten oder Stämmen von Streptomyces unter Verwendung der hier offenbarten Polynucleotidmoleküle oder Oligonucleotide in Verbindung mit bekannten Techniken identifiziert werden. Beispielsweise kann ein Oligonucleotidmolekül, das einen Teil der Streptomyces avermitilis-Nucleotidsequenz von 1 (SEQ ID NO: 1) oder einen Teil der S. hygroscopicus-Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 3 umfasst, detektierbar markiert und zur Durchmusterung einer Genombibliothek, die aus von dem interessierenden Organismus stammender DNA konstruiert wurde, verwendet werden. Die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen wird auf der Basis der Beziehung des Referenzorganismus, in diesem Beispiel S. avermitilis oder S. hygroscopicus, zu dem interessierenden Organismus gewählt. Die Anforderungen für Bedingungen unterschiedlicher Stringenz sind dem Fachmann bekannt und diese Bedingungen variieren vorhersagbar in Abhängigkeit von den speziellen Organismen, von denen die Bibliothek und die markierten Sequenz abgeleitet sind. Derartige Oligonucleotide weisen vorzugsweise eine Länge von mindestens etwa 15 Nucleotiden auf und sie umfassen beispielsweise die in den folgenden Beispielen beschriebenen. Die Amplifi kation von Homologgenen kann unter Verwendung dieser und anderer Oligonucleotide durch Verwendung von Standardverfahren, wie die Polymerasekettenreaktion (PCR), durchgeführt werden, obwohl andere einschlägig bekannte Amplifikationsverfahren, beispielsweise die Ligasekettenreaktion, ebenfalls verwendet können.
Klone, von denen festgestellt wurde, dass sie aveC-Homolognucleotidsequenzen enthalten, können auf deren Fähigkeit zur Codierung eines funktionalen AveC-Homologgenprodukts getestet werden. Zu diesem Zweck können die Klone einer Sequenzanalyse unterzogen werden, um ein geeignetes Leseraster sowie Initiations- und Terminationssignale zu identifizieren. Alternativ oder zusätzlich kann die klonierte DNA-Sequenz in einen geeigneten Expressionsvektor, d. h. einen Vektor, der die notwendigen Elemente für die Transkription und Translation der insertierten proteincodierenden Sequenz enthält, insertiert werden. Ein beliebiges einer Vielzahl von Wirt/Vektor-Systemen kann wie im Folgenden beschrieben verwendet werden, wobei diese, ohne hierauf beschränkt zu sein, Bakteriensysteme, wie Plasmid-, Bakteriophagen- oder Cosmidexpressionsvektoren, umfassen. Geeignete Wirtszellen, die mit derartigen Vektoren, die potentielle ein aveC-Homolog codierende Sequenzen umfassen, transformiert sind, können dann unter Verwendung von Verfahren wie eine HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten, die beispielsweise im folgenden Abschnitt 7 beschrieben sind, auf Aktivität des AveC-Typs analysiert werden.
Die Herstellung und Manipulation der hier offenbarten Polynucleotidmoleküle ist dem Fachmann geläufig und sie kann gemäß gentechnischen Verfahren, die beispielsweise bei Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates & Wiley Interscience, NY; Sambrook, et al. 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring, Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Innis et al. (Hrsg.), 1995, PCR Strategies, Academic Press, Inc., San Diego; und Erlich (Hrsg.), 1992, PCR Technology, Oxford University Press, New York, die alle hier als Bezug aufgenommen sind, beschrieben sind, durchgeführt werden. Polynucleotidklone mit Codierung für AveC-Genprodukte oder AveC-Homologgenprodukte können unter Verwendung eines beliebigen einschlägig bekannten Verfahrens einschließlich der im folgenden Abschnitt 7 angegeben Verfahren, ohne auf diese beschränkt zu sein, identifiziert werden. Genom-DNA-Bibliotheken können auf aveC- und aveC-Homolog-Codierungssequenzen unter Verwendung von Techniken wie die bei Benton und Davis, 1977, Science 196:180, für Bakteriophagenbibliotheken und bei Grunstein und Hogness, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:3961–3965 für Plasmidbibliotheken angegebenen Verfahren durchmustert werden. Polynucleotidmoleküle mit Nucleotidsequenzen, die bekanntermaßen das aveC-ORF umfassen, die beispielsweise in dem Plasmid pSE186 (ATCC 209604) oder in dem Plasmid pSE119 (Beschreibung im folgenden Abschnitt 7) vorhanden sind, können als Sonden in diesen Screeningexperimenten verwendet werden. Alternativ können Oligonucleotidsonden synthetisiert werden, die Nucleotidsequenzen entsprechen, die von partiellen oder vollständigen Aminosäuresequenzen des gereinigten AveC-Homologgenprodukts abgeleitet sind.
5.2 Rekombinante Systeme
5.2.1 Klonierungs- und Expressionsvektoren
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung von rekombinanten Klonierungsvektoren und Expressionsvektoren, die zur Klonierung oder Expression von Polynucleotidmolekülen der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, die beispielsweise das aveC-ORF von S. avermitilis oder beliebige aveC-Homolog-ORFs umfassen. In einer nichtbeschränkenden Ausführungsform stellt die vorliegende Erfin dung das Plasmid pSE186 (ATCC 209604) bereit, das das vollständige ORF des aveC-Gens von S. avermitilis umfasst.
Die gesamte folgende Beschreibung im Hinblick auf das aveC-ORF von S. avermitilis oder ein Polynucleotidmolekül, das das aveC-ORF von S. avermitilis oder einen Teil desselben umfasst, oder ein S. avermitilis-AveC-Genprodukt bezieht sich auch auf aveC-Homologa und AveC-Homologgenprodukte, falls nicht explizit oder durch den Zusammenhang anders angegeben.
Eine Vielzahl unterschiedlicher Vektoren wurde zur speziellen Verwendung in Streptomyces entwickelt, wobei diese unter anderem einen Phagen, Plasmide mit hoher Kopienzahl, Plasmide mit niedriger Kopienzahl und E. coli-Streptomyces-Shuttlevektoren umfassen, und jeder von diesen kann zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Eine Zahl von Drogenresistenzgenen wurde ebenfalls ausgehend von Streptomyces kloniert, und mehrere dieser Gene wurden als selektierbare Marker in Vektoren eingebaut. Beispiele für bestehende Vektoren zur Verwendung in Streptomyces werden unter anderem bei Hutchinson, 1980, Applied Biochem. Biotech. 16:169–190 präsentiert.
Rekombinante Vektoren der vorliegenden Erfindung, insbesondere Expressionsvektoren, werden vorzugsweise so konstruiert, dass die Codierungssequenz für das Polynucleotidmolekül der Erfindung in operativer Verbindung mit einem oder mehreren regulatorischen Elementen, die zur Transkription und Translation der Codierungssequenz zur Produktion eines Polypeptids notwendig sind, steht. Der hier verwendete Ausdruck "regulatorisches Element" umfasst, ohne hierauf beschränkt zu sein, Nucleotidsequenzen, die induzierbare und nicht-induzierbare Promotoren, Enhancer, Operatoren und andere einschlägig bekannte Elemente, die der Steuerung und/oder Regulierung der Expression von Polynucleotidcodierungssequenzen dienen, codieren. Ferner steht, wie dies hier verwendet wird, die Codierungssequenz in "operativer Verbindung" mit einem oder mehreren regulatorischen Elementen, wobei die regulatorischen Elemente die Transkription der Codierungssequenz oder die Translation von deren mRNA oder beides wirksam regulieren und ermöglichen.
Typische Plasmidvektoren, die technisch so verändert werden können, dass sie ein Polynucleotidmolekül der vorliegenden Erfindung enthalten, umfassen pCR-Blunt, pCR2.1 (Invitrogen), pGEM3Zf (Promega) und den Shuttle-Vektor pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bact. 171:5872–5881) unter vielen anderen.
Verfahren zur Konstruktion rekombinanter Vektoren, die spezielle Codierungssequenzen in operativer Verbindung mit passenden regulatorischen Elementen enthalten, sind einschlägig bekannt, und diese können zur Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese Verfahren umfassen in-vitro-Rekombinationstechniken, -Synthesetechniken und genetische Rekombination in vivo. Siehe beispielsweise die Techniken, die bei Maniatis et al., 1989, aaO; Ausubel et al. (1989, aaO; Sambrook et al., 1989, aaO; Innis et al., 1995, aaO; und Erlich, 1992, aaO, beschrieben sind.
Die regulatorischen Elemente dieser Vektoren können hinsichtlich ihrer Stärke und Spezifitäten variieren. In Abhängigkeit von dem verwendeten Wirt/Vektor-System kann ein beliebiges einer Zahl von geeigneten Transkriptions- und Translationselementen verwendet werden. Nichtbeschränkende Beispiele für regulatorische Regionen oder Promotoren der Transkription für Bakterien umfassen den β-gal-Promotor, den T7-Promotor, den TAC-Promotor, linke und rechte λ-Promotoren, trp- und lac-Promotoren, trp-lac-Fusionspromotoren und insbesondere für Streptomyces die Promotoren ermE, melC und tipA und dergleichen. In einer speziellen Ausführungsform, die im Folgenden Abschnitt 11 beschrieben ist, wurde ein Expressionsvektor erzeugt, der das aveC-ORF angrenzend an den starken konstitutiven ermE- Promotor von Saccharopolyspora erythraea kloniert enthielt. Der Vektor wurde in S. avermitilis transformiert, und die anschließende HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten zeigte einen erhöhten Titer produzierter Avermectine im Vergleich zur Produktion durch den gleichen Stamm, der jedoch stattdessen das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert.
Fusionsproteinexpressionsvektoren können zur Expression eines AveC-Genprodukt-Fusionsproteins verwendet werden. Das gereinigte Fusionsprotein kann zur Bildung von Antiseren gegen das AveC-Genprodukt, zur Untersuchung der biochemischen Eigenschaften des AveC-Genprodukts, zur technischen Veränderung von AveC-Fusionsproteinen mit unterschiedlichen biochemischen Aktivitäten oder zur Unterstützung der Identifizierung oder Reinigung des exprimierten AveC-Genprodukts verwendet werden. Mögliche Fusionsproteinexpressionsvektoren umfassen, ohne hierauf beschränkt zu sein, Vektoren, in denen Sequenzen eingebaut sind, die β-Galactosidase- und trpE-Fusionen, maltosebindendes-Protein-Fusionen, Glutathion-S-Transferasefusionen und Polyhistidinfusionen (Trägerregionen) codieren. In einer alternativen Ausführungsform kann ein AveC-Genprodukt oder ein Teil desselben an ein aveC-Homologgenprodukt oder ein Teil desselben, das von einer anderen Art oder einem anderen Stamm von Streptomyces, beispielsweise S. hygroscopicus oder S. griseochromogenes, stammt, fusioniert werden. In einer speziellen Ausführungsform, die im folgenden Abschnitt 12 beschrieben und in 7 angegeben ist, wurde ein chimäres Plasmid konstruiert, das eine 564-bp-Region des S. hygroscopicus-aveC-Homolog-ORF unter Substitutionen einer homologen 564-bp-Region des S. avermitilis-aveC-ORF enthält. Derartige Hybridvektoren können in S. avermitilis-Zellen transformiert werden und zum Bestimmen von deren Wirkung auf beispielsweise das gebildete Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen getestet werden.
AveC-Fusionsproteine können technisch so verändert werden, dass sie eine zur Reinigung verwendbare Region umfassen.
Beispielsweise können AveC-maltosebindendes-Protein-Fusionen unter Verwendung eines Amyloseharzes gereinigt werden; AveC-Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine unter Verwendung von Glutathion-Agaroseperlen gereinigt werden; und AveC-Polyhistidin-Fusionen unter Verwendung eines Harzes mit zweiwertigem Nickel gereinigt werden. Alternativ können Antikörper gegen ein Trägerprotein oder -peptid zur Reinigung des Fusionsproteins durch Affinitätschromatographie verwendet werden. Beispielsweise kann ein Nucleotidsequenz mit Codierung für das Zielepitop eines monoklonalen Antikörpers in den Expressionsvektor in operativer Verbindung mit den regulatorischen Elementen und in einer derartigen Position, das das exprimierte Epitop an das AveC-Polypeptid fusioniert ist, technisch eingebaut werden. Beispielsweise kann eine Nucleotidsequenz mit Codierung für das FLAG^TM-Epitoptag (International Biotechnologies Inc.), das ein hydrophiles Markerpeptid ist, durch Standardtechniken in den Expressionsvektor an einem entsprechenden Punkt, beispielsweise dem Carboxylterminus des AveC-Polypeptids, insertiert werden. Das exprimierte AveC-Polypeptid- FLAG^TM-Epitop-Fusionsprodukt kann dann unter Verwendung von im Handel erhältlichen Anti-FLAG^TM-Antikörpern detektiert und affinitätsgereinigt werden.
Der Expressionsvektor mit Codierung für das AveC-Fusionsprotein kann technisch auch so verändert werden, dass er Polylinkersequenzen enthält, die spezifische Proteaseschnittstellen so codieren, dass das exprimierte AveC-Polypeptid durch Behandlung mit einer spezifischen Protease aus der Trägerregion oder von dem Fusionspartner freigesetzt werden kann. Beispielsweise kann der Fusionsproteinvektor unter anderem DNA-Sequenzen mit Codierung für Thrombin- oder Faktor-Xa-Schnittstellen umfassen.
Eine Signalsequenz kann strangaufwärts des und im Leseraster mit dem aveC-ORF durch bekannte Verfahren in den Expressionsvektor technisch eingebaut werden, um die Nutzung und Sekretion des exprimierten Genprodukts zu dirigieren. Nicht beschränkende Beispiele für Signalsequenzen umfassen unter anderem die von α-Faktor, Immunglobulinen, Proteinen der äußeren Membran, Penicillinase und T-Zellrezeptoren.
Zur Unterstützung der Selektion von Wirtszellen, die mit Klonierungs- oder Expressionsvektoren der vorliegenden Erfindung transformiert oder transfiziert sind, kann der Vektor technisch so verändert werden, dass er ferner eine Codierungssequenz für ein Reportergenprodukt oder einen anderen selektierbaren Marker umfasst. Eine derartige Codierungssequenz steht, wie oben beschrieben, vorzugsweise in operativer Verbindung mit einem regulatorischen Element codierenden Sequenzen. Reportergene, die in der Erfindung verwendbar sind, sind einschlägig bekannt, und sie umfassen unter anderem diejenigen mit Codierung für grün fluoreszierendes Protein, Luciferase, xylE und Tyrosinase. Nucleotidsequenzen mit Codierung für selektierbare Marker sind einschlägig bekannt und sie umfassen diejenigen, die Genprodukte codieren, die Resistenz gegenüber Antibiotika oder Antimetaboliten verleihen oder die eine Auxotrophieforderung stellen. Beispiele für derartige Sequenzen umfassen unter vielen anderen diejenigen, die Resistenz gegenüber Erythromycin, Thiostrepton oder Kanamycin codieren.
5.2.2 Transformation von Wirtszellen
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung von transformierten Wirtszellen, die ein Polynucleotidmolekül oder einen rekombinanten Vektor gemäß der Erfindung umfassen, und davon abgeleiteten neuen Stämmen oder Zelllinien. Bei der praktischen Durchführung der Erfindung verwendbare Wirtszellen sind vorzugsweise Streptomyces-Zellen, obwohl andere prokaryotische Zellen oder eukaryotische Zellen ebenfalls verwendet werden können. Derartige transformierte Wirtszellen umfassen unter anderem typischerweise, ohne hierauf beschränkt zu sein, Mikroorganismen, wie Bakterien, die mit rekombinanten Bakteriophagen-DNA-, Plas-mid-DNA- oder Cosmid-DNA-Vektoren transformiert wurden, oder Hefe, die mit rekombinanten Vektoren transformiert wurde.
Die Polynucleotidmoleküle der vorliegenden Erfindung sollen in Streptomyces-Zellen funktionieren, können jedoch auch in andere Bakterien- oder Eukaryotenzellen, beispielsweise für Klonierungs- oder Expressionszwecke, transformiert werden. Ein Stamm von E. coli kann typischerweise verwendet werden, beispielsweise der DH5α-Stamm, der von der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, USA (Hinterlegungs-Nr. 31343) und von Handelslieferanten (Stratagene) erhältlich ist. Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen umfassen Hefezellen, obwohl Säugetierzellen oder Insektenzellen ebenfalls wirksam verwendet werden können.
Der rekombinante Expressionsvektor der Erfindung wird vorzugsweise in eine oder mehrere Wirtszellen einer im Wesentlichen homogenen Zellkultur transformiert oder transfiziert. Der Expressionsvektor wird allgemein in Wirtszellen gemäß bekannter Verfahren, beispielsweise durch Protoplastentransformation, Calciumphosphatpräzipitation, Calciumchloridbehandlung, Mikroinjektion, Elektroporation, Transfektion durch Kontakt mit einem rekombinierten Virus, liposomvermittelte Transfektion, DEAE-Dextran-Transfektion, Transdektion, Konjugation oder Mikroprojektilbeschuss, eingeführt. Die Selektion von Transformanten kann durch Standardverfahren, beispielsweise durch Selektieren von Zellen, die einen selektierbaren Marker, beispielsweise Antibiotikaresistenz, der mit dem rekombinanten Vektor verbunden ist, exprimieren, wie oben beschrieben durchgeführt werden.
Sobald der Expressionsvektor in die Wirtszelle eingeführt ist, können die Integration und das Beibehalten der aveC-Codierungssequenz entweder im Wirtszellchromosom oder episomal durch Standardverfahren, beispielsweise durch Southern-Hybridisierungsanalyse, Restriktionsenzymanalyse, PCR- Analyse einschließlich von Reverse-Transkriptase-PCR (rt-PCR) oder durch einen immunologischen Test zur Detektion des erwarteten Genprodukts festgestellt werden. Wirtszellen, die die rekombinante aveC-Codierungssequenz enthalten und/oder exprimieren, können durch einen von mindestens vier allgemeinen Ansätzen, die einschlägig bekannt sind, identifiziert werden, wobei diese umfassen: (i) DNA-DNA-, DNA-RNA- oder RNA-Antisense-RNA-Hybridisierung; (ii) Detektieren des Vorhandenseins von "Marker"-Genfunktionen; (iii) Feststellen des Transkriptionsgrades, der durch die Expression von AveCspezifischen mRNA-Transkripten in der Wirtszelle ermittelt wird; und (iv) Detektieren des Vorhandenseins von reifem Polypeptidprodukt, was beispielsweise durch einen Immunoassay oder durch das Vorhandensein von biologischer AveC-Aktivität (beispielsweise die Produktion spezifischer Verhältnisse und Mengen von Avermectinen, die ein AveC-Aktivität in beispielsweise S. avermitilis-Wirtszellen anzeigen) ermittelt wird.
5.2.3 Expression und Charakterisierung eines rekombinanten AveC-Genprodukts
Sobald die AveC-Codierungssequenz stabil in eine passende Wirtszelle eingeführt wurde, wird die transformierte Wirtszelle klonal vermehrt, und die gebildeten Zellen können unter Bedingungen, die zur maximalen Produktion des AveC-Genprodukts führen, gezüchtet werden. Derartige Bedingungen umfassen typischerweise das Züchten von Zellen zu hoher Dichte. Wenn der Expressionsvektor einen induzierbaren Promotor umfasst, werden passende Induktionsbedingungen, beispielsweise eine Temperaturverschiebung, die Erschöpfung von Nährstoffen, die Zugabe freiwilliger Induktoren (beispielsweise Analoga von Kohlehydraten, wie Isopropyl-2β-D-thiogalactopyranosid (IPTG)), die Ansammlung überschüssiger Stoffwechselnebenprodukte oder dergleichen, nach Bedarf zur Induktion der Expression verwendet.
Wenn das exprimierte AveC-Genprodukt im Inneren der Wirtszellen zurückgehalten wird, werden die Zellen geerntet und lysiert und das Produkt aus dem Lysat unter Extraktionsbedingungen, von denen einschlägig bekannt ist, dass sie einen Proteinabbau minimieren, beispielsweise bei 4 °C oder in Gegenwart von Proteaseinhibitoren oder mit beiden, isoliert und gereinigt. Wenn das exprimierte AveC-Genprodukt aus den Wirtszellen sezerniert wird, kann das erschöpfte Nährmedium einfach gewonnen und das Produkt aus diesem isoliert werden.
Das exprimierte AveC-Genprodukt kann aus Zelllysaten oder gegebenenfalls Kulturmedium unter Verwendung von Standardverfahren, die, ohne hierauf beschränkt zu sein, eine beliebge Kombination der folgenden Verfahren umfassen: Ammoniumsulfatfällung, Größenfraktionierung, Ionenaustauschschromatographie, HPLC, Dichtezentrifugation und Affinitätschromatographie, isoliert oder substanziell gereinigt werden. Wenn das exprimierte AveC-Genprodukt biologische Aktivität zeigt, kann die zunehmende Reinheit der Zubereitung in jeder Stufe des Reinigungsverfahrens unter Verwendung eines geeigneten Tests überwacht werden. Ungeachtet dessen, ob das exprimierte AveC-Genprodukt biologische Aktivität zeigt oder nicht, kann es auf der Basis von beispielsweise der Größe oder Reaktivität mit einem ansonsten für AveC-spezifischen Antikörper oder durch das Vorhandensein eines Fusionstags detektiert werden. Wie dies hier verwendet wird, ist ein AveC-Genprodukt "substanziell gereinigt", wenn das Produkt mehr als etwa 20 Gew.-% des Proteins in einer speziellen Zubereitung bildet. Ferner ist, wie dies hier verwendet wird, ein AveC-Genprodukt "isoliert", wenn das Produkt mindestens etwa 80 Gew.-% des Proteins in einer speziellen Zubereitung bildet.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt daher die Bereitstellung eines rekombinant exprimierten isolierten oder substanziell gereinigten S. avermitilis-AveC-Genprodukts, das die durch die das AveC-Genprodukt codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) codierte Aminosäuresequenz oder die Aminosäuresequenz von 1 (SEQ ID NO: 2) oder einen wesentlichen Teil derselben umfasst, und von Homologa desselben.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines rekombinant exprimierten isolierten oder substanziell gereinigten S. hygroscopicus-aveC-Homologgenprodukts, das die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 4 oder einen wesentlichen derselben umfasst, und von Homologa desselben.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines AveC-Genprodukts, das das Kultivieren einer mit einem rekombinanten Expressionsvektor transformierten Wirtszelle, wobei der Vektor ein Polynucleotidmolekül mit einer Nucleotidsequenz mit Codierung für das AveC-Genprodukt umfasst, wobei das Polynucleotidmolekül in operativer Verbindung mit einem oder mehreren regulatorischen Elementen, die die Expression des Polynucleotidmoleküls in der Wirtszelle steuern, ist, unter Bedingungen, die zur Produktion des rekombinanten AveC-Genprodukts führen, und das Gewinnen des AveC-Genprodukts aus der Zellkultur umfasst.
Das rekombinant exprimierte S. avermitilis-AveC-Genprodukt ist für eine Vielzahl von Zwecken verwendbar, die das Screening von Verbindungen, die die Funktion des AveC-Genprodukts ändern und dadurch die Avermectin-Biosynthese modulieren, und die Bildung von Antikörpern, die gegen das AveC-Genprodukt gerichtet sind, umfassen.
Sobald ein AveC-Genprodukt ausreichender Reinheit erhalten wurde, kann es durch Standardverfahren, die SDS-PAGE, Größenausschlusschromatographie, Aminosäuresequenzanalyse, biologische Aktivität zur Herstellung passender Produkte im Avermectin-Biosyntheseweg und dergleichen umfassen, charak terisiert werden. Beispielsweise kann die Aminosäuresequenz des AveC-Genprodukts unter Verwendung von Standardpeptidsequenzierungstechniken bestimmt werden. Das AveC-Genprodukt kann ferner unter Verwendung von Hydrophilieanalyse (siehe beispielsweise Hopp und Woods, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:3824) oder analoger Softwarealgorithmen zur Identifizierung von hydrophoben und hydrophilen Regionen des AveC-Genprodukts charakterisiert werden. Eine Strukturanalyse kann zur Identifizierung von Regionen des AveC-Genprodukts, die spezifische Sekundärstrukturen annehmen, durchgeführt werden, Biophysikalische Methoden, wie Röntgenkristallographie (Engstrom, 1974, Biochem. Exp. Biol. 11: 7–13), Computermodellierung (Fletterick und Zoller (Hrsg.), 1986 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) und Kernresonanz (NMR), können zur Kartierung und Untersuchung von Stellen einer Wechselwirkung zwischen dem AveC-Genprodukt und dessen Substrat verwendet werden. Die aus diesen Untersuchungen erhaltene Information kann zur Wahl neuer Stellen für eine Mutation in dem aveC-ORF verwendet werden, um die Entwicklung neuer Stämme von S. avermitilis mit günstigeren Avermectin-Produktionseigenschaften zu unterstützen.
5.3. Konstruktion und Verwendung von AveC-Mutanten
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt die Bereitstellung eines Polynucleotidmoleküls, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die ansonsten die gleiche wie das S. avermitilisaveC-Allel oder eine degenerierte Variante desselben oder die das AveC-Genprodukt codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) oder eine degenerierte Variante derselben oder die Nucleotidsequenz des aveC-ORF von S. avermitilis, die in 1 dargestellt ist (SEQ ID NO: 1), oder eine degenerierte Variante derselben ist, die jedoch des Weiteren eine oder mehrere Mutationen derart umfasst, dass Zellen des S. avermitilis-Stamms ATCC 53692, in dem das aveC-Allels des Wildtyps inaktiviert wurde und der das die mu tierte Nucleotidsequenz oder eine degenerierte Variante derselben umfassende Polynucleotidmolekül exprimiert, ein unterschiedliches Verhältnis oder eine unterschiedliche Menge von Avermectinen produzieren, als sie von Zellen des S. avermitilis-Stamms ATCC 53692, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produziert werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können derartige Polynucleotidmoleküle zur Produktion neuer Stämme von S. avermitilis verwendet werden, die eine nachweisbare Änderung der Avermectin-Produktion im Vergleich zum gleichen Stamm, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, zeigt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind derartige Polynucleotidmoleküle zur Produktion neuer Stämme von S. avermitilis verwendbar, die Avermectine in einem verringerten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zum gleichen Stamm, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produzieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind derartige Polynucleotidmoleküle zur Produktion neuer Stämme von S. avermitilis verwendbar, die erhöhte Mengen von Avermectinen im Vergleich zum gleichen Stamm, der stattdessen nur ein einziges aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produzieren. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind derartige Polynucleotidmoleküle zur Produktion neuer Stämme von S. avermitilis verwendbar, in denen das AveC-Gen inaktiviert wurde.
Mutationen des aveC-Allels oder der Codierungssequenz umfassen beliebige Mutationen, die eine oder mehrere Aminosäuredeletionen, -additionen oder -substitutionen in das AveC-Genprodukt einführen oder die zu einer Verkürzung des AveC-Genprodukts führen, oder eine Kombination derselben, und die das gewünschte Ergebnis ergeben. Derartige mutierte aveC-Allel-Sequenzen sollen auch degenerierte Varianten derselben umfassen. Beispielsweise erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Polynucleotidmolekülen, die die Nucleotidsequenz des aveC-Allels oder einer degenerier ten Variante desselben oder die das AveC-Genprodukt codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) oder eine degenerierte Variante derselben oder die Nucleotidsequenz des aveC-ORF von S. avermitilis, die in 1 dargestellt ist (SEQ ID NO: 1), oder eine degenerierte Variante derselben umfassen, die jedoch des Weiteren eine oder mehrere Mutationen umfassen, die die Substitution eines Aminosäurerests durch einen unterschiedlichen Aminosäurerest an ausgewählten Positionen im AveC-Genprodukt codieren. In mehreren nicht beschränkenden Ausführungsformen, die im Folgenden als Beispiele angegeben sind, können derartige Substitutionen an beliebigen Aminosäurepositionen des AveC-Genprodukts, die den Aminosäurepositionen 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 oder 298 von SEQ ID NO: 2 oder einer Kombination derselben entsprechen, durchgeführt werden.
Mutationen der aveC-Codierungssequenz werden durch eines einer Vielzahl bekannter Verfahren, die die Verwendung von fehlerfreundlicher PCR oder Kassettenmutagenese umfassen, durchgeführt. Beispielsweise kann eine Oligonucleotiddirigierte Mutagenese verwendet werden, um die Sequenz des aveC-Allels oder -ORF in definierter Weise, beispielsweise durch Einführung von einer oder mehreren Restriktionsstellen oder eines Terminationscodons in spezifische Regionen in dem aveC-Allel oder -ORF, zu ändern. Methoden, die beispielsweise in US-Patent 5 605 793, US-Patent 5 830 721 und US-Patent 5 837 458 beschrieben sind, die Zufallsfragmentierung, wiederholte Mutagenesecyclen und Nucleotid-Shuffling umfassen, können ebenfalls zur Erzeugung großer Polynucleotidbibliotheken mit Nucleotidsequenzen mit Codierung für aveC-Mutationen verwendet werden.
Zielgerichtete Mutationen können verwendbar sein, insbesondere wenn sie zur Änderung von einem oder mehreren konservierten Aminosäureresten in dem AveC-Genprodukt dienen. Beispielsweise zeigt ein Vergleich von abgeleiteten Aminosäure sequenzen von AveC-Genprodukten und aveC-Homologgenprodukten von S. avermitilis (SEQ ID NO: 2), S. griseochromogenes (SEQ ID NO: 5) und S. hygroscopicus (SEQ ID NO: 4), der in 6 angegeben ist, stellen signifikanter Konservierung von Aminosäureresten zwischen diesen Spezies. Eine zielgerichtete Mutagenese, die zu einer Änderung von einem oder mehreren dieser konservierten Aminosäuresereste führt, kann besonders wirksam zur Produktion neuer mutierter Stämme, die gewünschte Änderungen der Avermectin-Produktion zeigen, sein.
Zufallsmutagenese kann ebenfalls verwendbar sein, und sie kann durch Einwirken von Ultraviolettstrahlung oder Röntgenstrahlung oder chemischer Mutagene, wie N-Methyl-N'-nitrosoguanidin, Ethylmethansulfonat, salpetrige Säure oder Stickstofflostverbindungen, auf Zellen von S. avermitilis durchgeführt werden. Siehe beispielsweise Ausubel, 1989, aaO, für eine Übersicht über Mutagenesetechniken.
Sobald mutierte Polynucleotidmoleküle erzeugt sind, werden sie durchmustert, um zu bestimmen, ob sie die Avermectin-Biosynthese in S. avermitilis modulieren können. In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Polynucleotidmolekül mit einer mutierten Nucleotidsequenz durch Komplementierung eines Stamms von S. avermitilis, in dem das aveC-Gen inaktiviert wurde, um einen aveC-negativen (aveC^–) Hintergrund zu erhalten, getestet. In einem nicht-beschränkenden Verfahren wird das mutierte Polynucleotidmolekül in ein Expressionsplasmid in operativer Verbindung mit einem oder mehreren regulatorischen Elementen gespleißt, wobei das Plasmid ferner vorzugsweise ein oder mehrere Drogenresistenzgene umfasst, um die Selektion transformierter Zellen zu ermöglichen. Dieser Vektor wird dann in aveC^– -Wirtszellen unter Verwendung bekannter Techniken transformiert, und transformierte Zellen werden selektiert und in passenden Fermentationsmedien unter Bedingungen, die die Avermectin-Produktion ermöglichen oder induzieren, kultiviert. Die Fermentationsprodukte werden dann durch HPLC analysiert, um die Fähigkeit des mutierten Polynucleotidmoleküls zur Komplementierung der Wirtszelle zu bestimmen. Mehrere Vektoren, die mutierte Polynucleotidmoleküle tragen, die das B2:B1-Verhältnis von Avermectinen verringern können, die pSE188, pSE199, pSE231, pSE239 und pSE290 bis pSE297 umfassen, sind im folgenden Abschnitt 8.3 als Beispiele angegeben.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt die Bereitstellung von Verfahren zur Identifizierung von Mutationen des S. avermitilis-aveC-ORF mit der Fähigkeit zur Änderung des Verhältnisses und/oder der Menge der produzierten Avermectine. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von Mutationen des aveC-ORF mit der Fähigkeit zur Änderung des Klasse-2:1-Verhältnisses der produzierten Avermectine, das umfasst: (a) Bestimmen des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis produziert wurden, in dem das hierfür native aveC-Allel inaktiviert wurde und in den ein Polynucleotidmolekül, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein mutiertes AveC-Genprodukt umfasst, eingeführt wurde und darin exprimiert wird; (b) Bestimmen des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen, die durch die Zellen des gleichen Stamms von S. avermitilis wie in Stufe (a) produziert wurden, der jedoch stattdessen nur ein aveC-Allel des Wildtyps oder ein aveC-Allel mit der Nucleotidsequenz des ORF von 1 (SEQ ID NO: 1) oder einer hierzu homologen Nucleotidsequenz exprimiert; und (c) Vergleichen des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (a) produziert wurden, mit dem Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch S. avermitilis-Zellen von Stufe (b) produziert wurden, derart, dass, wenn das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (a) produziert wurden verschieden von dem Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (b) produziert wurden, ist, dann eine Mutation des aveC-ORF mit der Fähigkeit zur Änderung des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen identifiziert wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen durch die Mutation verringert.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von Mutationen des aveC-ORF oder von genetischen Konstrukten, die das aveC-ORF umfassen, mit der Fähigkeit zur Änderung der Menge der produzierten Avermectine, das umfasst: (a) Bestimmen der Menge von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis produziert wurden, in dem das hierfür native aveC-Allel inaktiviert wurde und in den ein Polynucleotidmolekül, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein mutiertes AveC-Genprodukt umfasst, oder ein Genkonstrukt, das eine Nucleotidsequenz mit Codierung für ein AveC-Genprodukt umfasst, eingeführt wurde und darin exprimiert wird; (b) Bestimmen der Menge von Avermectinen, die durch die Zellen des gleichen Stamms von S. avermitilis wie in Stufe (a) produziert wurden, der jedoch stattdessen nur ein aveC-Allel des Wildtyps oder eine hierzu homologe Nucleotidsequenz exprimiert; und (c) Vergleichen der Menge von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (a) produziert wurden, mit der Menge von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (b) produziert wurden, derart, dass, wenn die Menge von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (a) produziert wurden, verschieden von der Menge von Avermectinen, die durch die S. avermitilis-Zellen von Stufe (b) produziert wurden, ist, dann eine Mutation des aveC-ORF oder eines Genkonstrukts mit der Fähigkeit zur Änderung der Menge von Avermectinen identifiziert wurde. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge der produzierten Avermectine durch die Mutation erhöht.
Jedes der im Vorhergehenden genannten Verfahren zur Identifizierung von Mutationen kann unter Verwendung von Fermentationskulturmedien durchgeführt werden, die vorzugsweise mit Cyclohexancarbonsäure ergänzt sind, obwohl andere geeignete Fettsäurevorläufer, wie ein beliebiger der in Tabelle 1 aufgelisteten Fettsäurevorläufer, ebenfalls verwendet werden können.
Sobald ein mutiertes Polynucleotidmolekül, das die Avermectin-Produktion in einer gewünschten Richtung moduliert, identifiziert wurde, kann der Ort der Mutation in der Nucleotidsequenz bestimmt werden. Beispielsweise kann ein Polynucleotidmolekül mit einer ein mutiertes AveC-Genprodukt codierenden Nucleotidsequenz durch PCR isoliert und unter Verwendung bekannter Verfahren einer DNA-Sequenzanalyse unterzogen werden. Durch Vergleich der DNA-Sequenz des mutierten aveC-Alleis mit der des aveC-Alleis des Wildtyps können die für die Änderungen der Avermectin-Produktion verantwortliche(n) Mutation (en) bestimmt werden. In speziellen, obgleich nicht-beschränkenden Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ergaben S. avermitilis-AveC-Genprodukte, die entweder einzelne Aminosäuresubstitutionen an einem der Reste 55 (S55F), 138 (S138T), 139 (A139T) oder 230 (G230D) oder doppelte Substitutionen an den Positionen 138 (S138T) und 139 (A139T oder A139F) umfassten, Änderungen der Funktion des AveC-Genprodukts derart, dass das Klasse-2:1-Verhältnis der produzierten Avermectine geändert wurde (siehe der folgende Abschnitt 8), wobei die angegebenen Aminosäurepositionen den in 1 (SEQ ID NO: 2) angegebenen entsprechen.
Ferner wurde gezeigt, dass die folgenden sieben Kombinationen von Mutationen jeweils wirksam das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen verringern: (1) D48E/A89T; (2) 5138T/A139T/G179S; (3) Q38P/L136P/E238D; (4) F99S/S138T/A139T/G179S; (5) A139T/M228T; (6) G111V/P289L; (7) A139T/K154E/Q298H. Die hier verwendeten im Vorhergehen den genannten Bezeichnungen, wie A139T geben den ursprünglichen Aminosäurerest durch die Ein-Buchstaben-Bezeichnung, der in diesem Beispiel Alanin (A) ist, an der angegebenen Position, die in diesem Beispiel die Position 139 (bezugnehmend auf SEQ ID NO: 2) des Polypeptids ist, und anschließend den Aminosäurerest, der den ursprünglichen Aminosäurerest ersetzt, der in diesem Beispiel Threonin (T) ist, an. Daher werden Polynucleotidmoleküle mit Nucleotidsequenzen, die mutierte S. avermitilis-AveC-Genprodukte, die Aminosäuresubstitutionen oder -deletionen an einer oder mehreren der Aminosäurepositionen 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 oder 298 (siehe 1) oder eine Kombination derselben umfassen, codieren, von der vorliegenden Erfindung umfasst.
In einer bevorzugten Ausführungsform codieren derartige Mutationen Aminosäuresubstitutionen, die ausgewählt sind aus einer oder mehreren aus der Gruppe von:

(a) Substitution des Aminosäurerests Q an Position 38 durch P oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für P ist;
(b) Substitution des Aminosäurerests D an Position 48 durch E oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für E ist;
(c) Substitution des Aminosäurerests A an Position 89 durch T oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für T ist;
(d) Substitution des Aminosäurerests F an Position 99 durch S oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für S ist;
(e) Substitution des Aminosäurerests G an Position 11 durch V oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für V ist;
(f) Substitution des Aminosäurerests L an Position 136 durch P oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für P ist;
(g) Substitution des Aminosäurerests S an Position 138 durch T oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für T ist;
(h) Substitutian des Aminosäurerests A an Position 139 durch T oder F oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für T oder F ist;
(i) Substitution des Aminosäurerests K an Position 154 durch E oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für E ist;
(j) Substitution des Aminosäurerests G an Position 179 durch S oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für S ist;
(k) Substitution des Aminosäurerests M an Position 228 durch T oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für T ist;
(l) Substitution des Aminosäurerests E an Position 238 durch D oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für D ist;
(m) Substitution des Aminosäurerests P an Position 289 durch L oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für L ist;
(n) Substitution des Aminosäurerests Q an Position 298 durch H oder eine Aminosäure, die ein konservative Substitution für H ist;

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform codieren derartige Mutationen eine Kombination von Aminosäuresubstitutionen, wobei die Kombination von substituierten Aminosäureresten ausgewählt ist aus der Gruppe von:

(a) den Aminosäureresten 5138 und A139;
(b) den Aminosäureresten D48 und A89;
(c) den Aminosäureresten 5138, A139 und G179;
(d) den Aminosäureresten Q38, L136 und E238;
(e) den Aminosäureresten F99, S138, A139 und G179;
(f) den Aminosäureresten A139 und M228;
(g) den Aminosäureresten G111 und P289; und
(h) den Aminosäureresten A139, K154 und Q298.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform sind spezielle Kombinationen von Mutationen in dem aveC-Allel, die zur wirksamen Verringerung des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, ausgewählt aus einer oder mehreren aus der Gruppe von:

(a) S138T/A139T;
(b) S138T/A139F;
(c) D48E/A89T;
(d) S138T/A139T/G179S;
(e) Q38P/L136P/E238D;
(f) F99S/S138T/A139T/G179S;
(g) A139T/M228T;
(h) G111V/P289L; und
(i) A139T/K154E/Q298H.

Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung von Zusammensetzungen zur Herstellung neuer Stämme von S. avermitilis, deren Zellen ein mutiertes aveC-Allel enthalten, das zur Änderung der Avermectin-Produktion führt. Beispielsweise stellt die vorliegende Erfindung rekombinante Vektoren bereit, die zur Zielausrichtung von einem der Polynucleotidmoleküle, das mutierte Sequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst, auf die Stelle des aveC-Gens des S. avermitilis-Chromosoms, an der entweder das aveC-ORF oder ein Teil desselben durch homologe Rekombination insertiert oder substituiert werden soll, verwendet werden können. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedoch ein Polynucleotidmolekül, das eine mutierte Nucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung, die hierdurch bereitgestellt wird, umfasst, auch die Funktion einer Modulierung der Avermectin-Biosynthese zeigen, wenn es in das S. avermitilis-Chromosom an einer anderen Stelle als das aveC-Gen insertiert wird oder wenn es episomal in S. avermitilis-Zellen beibehalten wird. Daher stellt die vorliegende Erfindung auch Vektoren bereit, die ein Polynucleotidmolekül umfassen, das eine mutierte Polynucleotidsequenz der vorliegenden Erfindung umfasst, wobei diese Vektoren zur Insertion des Polynucleotidmoleküls an einer von dem aveC-Gen verschiedenen Stelle in dem S. avermitilis-Chromosom oder zum episomalen Beibehalten verwendet werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Gensubstitutionsvektoren, die zur Insertion eines mutierten aveC-Allels oder einer degenerierten Variante desselben in Zellen eines Stamms von S. avermitilis verwendet werden können, wodurch neue Stämme von S. avermitilis erzeugt werden, deren Zellen Avermectine in einem geänderten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Klasse-2:1-Verhältnis von durch die Zellen produzierten Avermectinen verringert. Derartige Gensubstitutionsvektoren können unter Verwendung mutierter Polynucleotidmoleküle, die in damit ausgestatteten Expressionsvektoren, beispielsweise pSE188, pSE199 und pSE231, vorhanden sind, konstruiert werden, wobei diese Expressionsvektoren im folgenden Abschnitt 8 als Beispiele angegeben sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Vektoren, die zur Insertion eines mutierten aveC-Allels oder einer degenerierten Variante desselben in Zellen eines Stamms von S. avermitilis verwendet werden können, wobei neue Stämme von Zellen erzeugt werden, die geänderte Mengen von Avermectinen im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge der durch die Zellen produzierten Avermectine erhöht. In einer speziellen, obgleich nicht-beschränkenden Ausführungsform umfasst ein derartiger Vektor fernen einen einschlägig bekann ten starken Promotor, beispielsweise den starken konstitutiven ermE-Promotor von Saccharopolyspora erythraea, der strangaufwärts des und in operativer Verbindung mit dem aveC-Allel positioniert ist. Ein derartiger Vektor kann das Plasmid pSE189, das im folgenden Beispiel 11 beschrieben ist, sein oder er kann unter Verwendung des mutierten aveC-Allels des Plasmids pSE189 konstruiert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Gensubstitutionsvektoren, die zur Inaktivierung des aveC-Gens in einem Stamm von S. avermitilis des Wildtyps verwendbar sind. In einer nicht beschränkenden Ausführungsform können derartige Gensubstitutionsvektoren unter Verwendung des in dem Plasmid pSE180 (ATCC 209605) vorhandenen mutierten Polynucleotidmoleküls, das im folgenden Abschnitt 8.1 als Beispiel angegeben ist (3), konstruiert werden. Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung von Gensubstitutionsvektoren, die ein Polynucleotidmolekül umfassen, das Nucleotidsequenzen, die natürlicherweise das aveC-Gen in situ in dem S. avermitilis-Chromosom flankieren, die beispielsweise die in 1 (SEQ ID NO: 1) gezeigten flankierenden Nucleotidsequenzen umfassen, umfasst oder aus diesen besteht, wobei diese Vektoren zur Deletion des S. avermitilis-aveC-ORF verwendet werden können.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung neuer Stämme von S. avermitilis, die Zellen umfassen, die ein mutiertes aveC-Allel exprimieren und ein geändertes Verhältnis und/oder eine geänderte Menge von Avermectinen im Vergleich zu Zellen des Stamms von S. avermitilis, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung neuer Stämme von S. avermitilis, die Zellen umfassen, die ein mutiertes aveC-Allel exprimieren und ein geändertes Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms von S. avermitilis, die stattdessen nur ein aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produzieren, wobei das Verfahren das Transformieren von Zellen eines Stamms von S. avermitilis mit einem Vektor, der ein mutiertes aveC-Allel trägt, das ein Genprodukt codiert, das das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, der das mutierte aveC-Allel desselben exprimiert, produziert wurden, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, der stattdessen nur ein aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, ändert und das Selektieren transformierter Zellen, die Avermectine in einem geänderten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu dem Klasse-2:1-Verhältnis, das durch Zellen des Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produziert wurde, produzieren. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung eines neuen Stamms von S. avermitilis, das das Transformieren von Zellen eines Stamms von S. avermitilis mit einem Vektor mit der Fähigkeit zur Einführung einer Mutation in das aveC-Allel derartiger Zellen umfasst, wobei die Mutation des aveC-Alleis zur Substitution eines unterschiedlichen Aminosäurerests an einer oder mehreren Aminosäurepositionen, die den Aminosäureresten 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 oder 298 von SEQ ID NO: 2 entsprechen, in dem codierten AveC-Genprodukt führt, derart, dass Zellen des S. avermitilis-Stamms, in dem das aveC-Allel so mutiert wurde, ein Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen produzieren, das von dem durch Zellen des gleichen S. avermitilis-Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produzierten Verhältnis verschieden ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das geänderte Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen verringert.
Wenn, wie dies hier verwendet wird, ein durch ein aveC-Allel codierter Aminosäurerest in dem S. avermitilis-Chromosom oder in einem Vektor oder isolierten Polynucleotidmolekül der vorliegenden Erfindung als einem speziellen Aminosäurerest von SEQ ID NO: 2 "entsprechend" bezeichnet wird oder wenn eine Aminosäuresubstitution als an einer speziellen Position "entsprechend" einem speziellen nummerierten Aminosäurerest von SEQ ID NO: 2 auftretend bezeichnet wird, soll dies den Aminosäurerest am gleichen relativen Ort in dem AveC-Genprodukt bezeichnen, den der erfahrene Fachmann rasch unter Bezug auf die hier als SEQ ID NO: 2 dargestellte Aminosäuresequenz bestimmen kann.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung neuer Stämme, wobei spezifische Mutationen in dem aveC-Allel mit Codierung für spezielle Mutationen als Basenänderungen an spezifischen Nucleotidpositionen in dem aveC-Allel "entsprechend" speziellen Nucleotidpositionen, die in SEQ ID NO: 1 angegeben sind, angeführt werden. Wie oben soll im Hinblick auf entsprechende Aminosäurepositionen, wenn eine Nucleotidposition in dem aveC-Allel als "entsprechend" einer speziellen Nucleotidposition in SEQ ID NO: 1 bezeichnet wird, dies das Nucleotid an dem gleichen relativen Ort in der aveC-Nucleotidsequenz, den der erfahrene Fachmann rasch unter Bezug auf die hier als SEQ ID NO: 1 angegebene Nucleotidsequenz bestimmen kann, bezeichnen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung neuer Stämme von S. avermitilis, die Zellen umfassen, die geänderte Mengen von Avermectin produzieren, wobei das Verfahren die Transformation von Zellen eines Stamms von S. avermitilis mit einem Vektor, der ein mutiertes aveC-Allel oder ein Genkonstrukt, das das aveC-Allel umfasst, dessen Expression zu einer Änderung der Menge von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, der das mutierte aveC-Allel oder Genkonstrukt exprimiert, produziert werden, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, der stattdessen nur ein einziges aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, führt, trägt, und das Selektieren transformierter Zellen, die Avermectine in einer geänderten Menge im Vergleich zur Menge von Avermectinen, die durch Zellen des Stamms, der stattdessen nur das einzige aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produziert wird, produzieren, umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge von in den transformierten Zellen produzierten Avermectinen erhöht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung neuer Stämme von S. avermitilis, deren Zellen ein inaktiviertes aveC-Allel umfassen, das die Transformation von Zellen eines Stamms von S. avermitilis, der ein beliebiges aveC-Allel exprimiert, mit einem Vektor, der das aveC-Allel inaktiviert, und die Selektion transformierter Zellen, in denen das aveC-Allel inaktiviert wurde, umfasst. In einer bevorzugten, obgleich nicht-beschränkenden Ausführungsform werden Zellen eines Stamms von S. avermitilis mit einem Gensubstitutionsvektor transformiert, der ein aveC-Allel trägt, der durch Mutation oder durch Substitution eines Teils des aveC-Alleis mit einer heterologen Gensequenz inaktiviert wurde, und transformierte Zellen, in denen das ansonsten hierfür native aveC-Allel durch das inaktivierte aveC-Allel ersetzt wurde, werden selektiert. Die Inaktivierung des aveC-Alleis kann durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten wie im Folgenden beschrieben bestimmt werden. In einer im folgenden Abschnitt 8.1 beschriebenen speziellen, obgleich nichtbeschränkenden Ausführungsform ist das aveC-Allel durch Insertion des ermE-Gens von Saccharopolyspora erythraea in das aveC-ORF inaktiviert.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung neuer Stämme von S. avermitilis, die Zellen umfassen, die mit einem der Polynucleotidmoleküle oder Vektoren der vorliegenden Erfindung transformiert wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung neuer Stämme von S. avermitilis, die Zellen umfassen, die ein mutiertes aveC-Allel oder eine degenerierte Variante desselben anstelle des oder zusätzlich zu dem aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, wobei die Zellen des neuen Stamms Avermectine in einem geänderten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu dem Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch Zellen des gleichen Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produziert wurden, produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das durch die neuen Zellen produzierte geänderte Klasse-2:1-Verhältnis verringert. Derartige neue Stämme sind bei der Produktion von kommerziell gewünschten Avermectinen, wie Doramectin, verwendbar. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung von Zellen von S. avermitilis, die eine der im Vorhergehenden genannten Mutationen oder Kombinationen von Mutationen in dem aveC-Allel an Nucleotidpositionen, die den im Vorhergehenden angegebenen entsprechen, oder die ansonsten eine der im Vorhergehenden genannten Aminosäuresubstitutionen in dem AveC-Genprodukt codieren, umfassen. Obwohl derartige Mutationen in derartigen Zellen eines extrachromosomalem Elements, beispielsweise eines Plasmids, vorhanden sein können, sind derartige Mutationen vorzugsweise in dem aveC-Allel, das auf dem S. avermitilis-Chromosom lokalisiert ist, vorhanden. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung eines Stamms von Streptomyces avermitilis, der Zellen mit einer Mutation in dem aveC-Allel, die ein AveC-Genprodukt mit einer Substitution an einer oder mehreren Aminosäurepositionen entsprechend dem Aminosäureresten 38, 48, 55, 89, 99, 111, 136, 138, 139, 154, 179, 228, 230, 238, 266, 275, 289 oder 298 von SEQ ID NO: 2 codiert, umfasst, wobei die Zelle ein Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen produziert, das von dem durch eine Zelle des gleichen S. avermitilis-Stamms, der das aveC- Allel des Wildtyps exprimiert, produzierten Verhältnis verschieden ist.
Eine Hauptaufgabe der hier beschriebenen Screening-Tests ist die Identifizierung mutierter Allele des aveC-Gens, deren Expression in S. avermitilis-Zellen das Klasse-2:1-Verhältnis produzierter Avermectine ändert und insbesondere verringert. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis von B2:B1-Avermectinen, die durch Zellen eines neuen S. avermitilis-Stamms der vorliegenden Erfindung, der ein mutiertes aveC-Allel oder eine degenerierte Variante desselben gemäß der vorliegenden Erfindung exprimiert, produziert werden, etwa 1,6:1 oder weniger. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 1:1 oder weniger. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 0,84:1 oder weniger. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 0,80:1 oder weniger. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 0,75:1 oder weniger. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 0,73:1 oder weniger. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 0,68:1 oder weniger. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 0,67:1 oder weniger. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 0,57:1 oder weniger. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 0,53:1 oder weniger. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 0,42:1 oder weniger. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform beträgt das Verhältnis etwa 0,40:1 oder weniger.
In einer im Folgenden beschriebenen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von weniger als 1,6:1. In einer im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von etwa 0,94:1. In einer weiteren im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von etwa 0,88:1.
In einer weiteren im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von etwa 0,84:1. In einer noch weiteren im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-BZ:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von etwa 0,75:1. In einer noch weiteren im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von etwa 0,73:1. In einer noch weiteren im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von etwa 0,68:1. In einer noch weiteren im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-81-Avermectine in einem Verhältnis von etwa 0,67:1. In einer noch weiteren im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von etwa 0,57:1. In einer noch weiteren im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von 0,53:1. In einer noch weiteren im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen spe ziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von etwa 0,42:1. In noch einer weiteren im Folgenden beschriebenen unterschiedlichen speziellen Ausführungsform produzieren neue Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine in einem Verhältnis von etwa 0,40:1.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung neuer Stämme von S. avermitilis, die Zellen umfassen, die ein mutiertes aveC-Allel oder eine degenerierte Variante desselben oder ein Genkonstrukt, das ein aveC-Allel oder eine degenerierte Variante desselben umfasst, anstelle des oder zusätzlich zu dem aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, wobei die Zellen des neuen Stamms eine geänderte Menge von Avermectinen im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produzieren. In einer bevorzugten Ausführungsform produziert der neue Stamm eine erhöhte von Menge von Avermectinen. In einer nichtbeschränkenden Ausführungsform umfasst das Genkonstrukt ferner einen starken Promotor, wie den starken konstitutiven ermE-Promotor von Saccharopolyspora erythraea, strangaufwärts und in operativer Verbindung mit dem aveC-ORF.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfolgt durch die vorliegende Erfindung die Bereitstellung neuer Stämme von S. avermitilis, die Zellen umfassen, in denen das aveC-Gen inaktiviert wurde. Derartige Stämme sind sowohl wegen des unterschiedlichen Spektrums von Avermectinen, die sie im Vergleich zum Stamm des Wildtyps produzieren, als auch bei den hier beschriebenen Komplementierung-Screening-Assays zur Bestimmung, ob eine zielgerichtete oder Zufallsmutagenese des aveC-Gens die Avermectin-Produktion beeinflusst, verwendbar. In einer im Folgenden beschriebenen speziellen Ausführungsform wurden S. avermitilis-Wirtszellen gentechnisch so verändert, dass sie ein inaktiviertes aveC-Gen enthalten. Beispielsweise wurde der in den folgenden Beispielen beschriebene Stamme SE180-11 unter Verwendung des Gensubstitutionsplasmids pSE180 (ATCC 209605) (3), das derart konstruiert wurde, dass es das S. avermitilis-aveC-Gen durch Insertion des ermE-Resistenzgens in die aveC-Codierungsregion inaktiviert, erzeugt.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung von rekombinant exprimierten mutierten S. avermitilis-AveC-Genprodukten, die durch eines der im Vorhergehenden genannten Polynucleotidmoleküle gemäß der Erfindung codiert werden, und Verfahren zur Herstellung derselben.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von Avermectinen, das das Kultivieren von Zellen eines Stamms von S. avermitilis, wobei die Zellen ein mutiertes aveC-Allel exprimieren, das ein Genprodukt codiert, das das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, der das mutierte aveC-Allel exprimiert, produziert werden, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, ändert, in Kulturmedium unter Bedingungen, die die Produktion von Avermectinen ausgehend von diesen gestatten oder induzieren, und das Gewinnen der Avermectine aus der Kultur umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die in der Kultur durch das mutierte aveC-Allel exprimierende Zellen produziert werden, verringert. Dieses Verfahren stellt eine erhöhte Effizienz bei der Produktion von kommerziell nutzbaren Avermectinen, wie Doramectin, bereit.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung eines Verfahrens zur Produktion von Avermectinen, das das Kultivieren von Zellen eines Stamms von S. avermitilis, wobei die Zellen ein mutiertes aveC-Allel oder ein ein aveC-Allel umfassendes Genkonstrukt, das zur Produktion einer geänderten Menge von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, der das mutierte aveC-Allel oder die Genkonstrukte exprimiert, produziert werden, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, die das mutierte aveC-Allel oder Genkonstrukt nicht exprimieren, sondern stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, führt, exprimieren, in Kulturmedium unter Bedingungen, die die Produktion von Avermectinen ausgehend von diesem gestatten oder induzieren, und das Gewinnen der Avermectine aus der Kultur umfasst. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Menge von Avermectinen, die in der Kultur durch Zellen, die das mutierte aveC-Allel, eine degenerierte Variante oder ein Genkonstrukt exprimieren, produziert werden, erhöht.
Durch die vorliegende Erfindung erfolgt ferner die Bereitstellung einer neuen Zusammensetzung von Avermectinen, die durch einen Stamm von S. avermitilis, der ein mutiertes aveC-Allel oder eine degenerierte Variante desselben, das ein Genprodukt codiert, das das Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, der das mutierte aveC-Allel oder eine degenerierte Variante exprimiert, produziert werden, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, verringert, exprimiert, produziert werden, wobei die Avermectine in der neuen Zusammensetzung in einem verringerten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu dem Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, die durch Zellen des gleichen Stamms von S. avermitilis, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produziert werden, produziert werden. Die neue Avermectin-Zusammensetzung kann produziert in der erschöpften Fermentationskulturflüssigkeit vorliegen oder aus dieser geerntet werden. Die neue Avermectin-Zusammensetzung kann aus der Kulturflüssigkeit durch bekannte biochemische Reinigungsverfahren, wie Ammoniumsulfatfällung, Dialyse, Größenfraktionierung, Ionenaustausch chromatographie, HPLC und dergleichen, partiell oder substanziell gereinigt werden.
5.4. Verwendungszwecke von Avermectinen
Avermectine sind hochaktive Antiparasitenmittel mit spezieller Verwendbarkeit als Anthelmintika, Ektoparasitizide, Insektizide und Akarizide. Avermectinverbindungen, die gemäß den Verfahren der vorliegenden Erfindung produziert wurden, sind für jeden dieser Zwecke verwendbar. Beispielsweise sind Avermectinverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurden, zur Behandlung verschiedener Erkrankungen oder Zustände bei Menschen, insbesondere wenn diese Erkrankungen oder Zustände durch Parasiteninfektionen verursacht sind, wie einschlägig bekannt ist, verwendbar. Siehe beispielsweise Ikeda und Omura, 1997, Chem. Rev. 97(7):2591-2609. Insbesondere sind Avermectinverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurden, zur Behandlung einer Vielzahl von Erkrankungen oder Zuständen, die durch Endoparasiten, wie parasitische Nematoden, die Menschen, Haustiere, Schweine, Schafe, Geflügel, Pferde oder Rinder infizieren können, verursacht sind, wirksam.
Insbesondere sind Avermectinverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurden, gegen Nematoden, die Menschen infizieren, sowie diejenigen, die verschiedene Tierarten infizieren, wirksam. Derartige Nematoden umfassen Magen-Darm-Parasiten, wie Ancylostoma, Necator, Ascaris, Strongyloides, Trichinella, Capillaria, Trichuris, Enterobius, Dirofilaria, und Parasiten, die im Blut oder in anderen Geweben oder Organen gefunden werden, wie Fadenwürmer und die Extrakt-Darmstadien von Strongyloides und Trichinella.
Die Avermectinverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden, sind auch zur Behandlung von Ektoparasiteninfektionen, die beispielsweise Arthropodenin festationen von Säugern und Vögeln, die durch Zecken, Milben, Läuse, Flöhe, Schmeißfliegen, stechende Insekten oder wandernde zweiflügelige Larven, die unter anderem Rinder und Pferde betreffen können, verursacht sind, umfassen, verwendbar.
Die Avermectinverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden, sind auch als Insektizide gegen Haushaltsschädlinge, beispielsweise unter anderem Küchenschaben, Kleidermotten, Teppichkäfer und Hausfliegen, sowie Insektenschädlinge von gelagertem Getreide und Agrarpflanzen, wobei die Schädlinge Spinnmilben, Aphiden, Raupen und Orthoptera, wie Heuschrecken, unter anderem umfassen, verwendbar.
Tiere, die mit den Avermectinverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert werden, behandelt werden können, umfassen Schafe, Rinder, Pferde, Rotwild, Ziegen, Schweine, Vögel einschließlich von Geflügel und Hunde und Katzen.
Eine Avermectinverbindung, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurde, wird in einer Formulierung verabreicht, die für den speziellen geplanten Verwendungszweck, die spezielle behandelte Wirtstierart und den beteiligten Parasiten oder das beteiligte Insekt passend ist. Zur Verwendung als Parasitizid kann eine Avermectinverbindungen, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurde, oral in der Form einer Kapsel, eines Bolus, einer Tablette oder eines Flüssigtranks verabreicht werden oder alternativ als Aufguss oder durch Injektion oder als Implantat verabreicht werden. Derartige Formulierungen werden auf herkömmliche Weise gemäß der veterinärmedizinischen Standardpraxis hergestellt. So können Kapseln, Bolusse oder Tabletten durch Mischen des Wirkstoffs mit einem geeigneten fein zerteilen Verdünnungsmittel oder Träger, das ferner ein den Zerfall förderndes Mittel und/oder ein Bindemittel, wie Stärke, Lac tose, Talkum, Magnesiumstearat und dergleichen enthält, hergestellt werden. Eine Trankformulierung kann durch Dispergieren des Wirkstoffs in einer wässrigen Lösung zusammen mit einem Dispergiermittel oder Befeuchtungsmittel und dergleichen hergestellt werden. Injizierbare Formulierungen können in der Form einer sterilen Lösung, die andere Substanzen, beispielsweise ausreichende Salze und/oder Glukose, um die Lösung zu Blut isotonisch zu machen, enthalten kann, hergestellt werden.
Derartige Formulierungen variieren im Hinblick auf das Gewicht der aktiven Verbindung in Abhängigkeit vom Patienten oder der Art des behandelten Wirtstiers, der Schwere und Art der Infektion und dem Körpergewicht des Wirts. Allgemein ist zur oralen Verabreichung eine Dosis der aktiven Verbindung von etwa 0,001 bis 10 mg pro kg Körpergewicht des Patienten oder Tiers, die als Einzeldosis oder in Teildosen über einen Zeitraum von 1 bis 5 Tagen gegeben wird, ausreichend. Jedoch können Fälle auftreten, bei denen höhere oder niedrigere Dosierungsbereiche indiziert sind, was beispielsweise durch einen Arzt oder Tierarzt auf der Basis der klinischen Symptome bestimmt wird.
Als Alternative kann eine Avermectinverbindung, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurde, in Kombination mit Tierfutter verabreicht werden, und für diesen Zweck kann ein konzentrierter Futterzusatz oder ein Premix zum Mischen mit dem normalen Tierfutter hergestellt werden.
Zur Verwendung als Insektizid und zur Behandlung von Agrarschädlingen kann eine Avermectinverbindung, die gemäß der vorliegenden Erfindung produziert wurde, als Spray, Staub, Emulsion und dergleichen gemäß der landwirtschaftlichen Standardpraxis appliziert werden.
6. Beispiel: Fermentation von Streptomyces avermitilis und B2:81-Avermectinanalyse
Stämme, in denen sowohl verzweigtkettige-2-Oxo-säure-Dehydrogenase- als auch 5-O-Methyltransferase-Aktivität fehlt, produzieren keine Avermectine, wenn das Fermentationsmedium nicht durch Fettsäuren ergänzt wird. Dieses Beispiel belegt, dass in derartigen Mutanten ein breiter Bereich von B2:B1-Verhältnissen von Avermectinen erhalten werden kann, wenn die Biosynthese in Gegenwart unterschiedlicher Fettsäuren initiiert wird.
6.1. Materialien und Verfahren
Streptomyces avermitilis ATCC 53692 wurde bei –70 °C als Vollbrühe, die in Impfmedium hergestellt wurde, das aus: Stärke (Nadex, Laing National) – 20 g; Pharmamedia (Trader's Protein, Memphis, TN) – 15 g; Ardamin pH (Yeast Products Inc.) – 5 g; Calciumcarbonat – 1 g bestand, aufbewahrt. Das Endvolumen wurde mit Leitungswasser auf 1 1 eingestellt, der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt und das Medium wurde 25 min bei 121 °C autoklavbehandelt.
2 ml einer aufgetauten Suspension der obigen Zubereitung wurden zum Beimpfen eines Kolbens, der 50 ml des gleichen Mediums enthielt, verwendet. Nach 48 stündiger Inkubation bei 28 °C auf einer Drehschüttelvorrichtung mit 180 Umin^–1 wurden 2 ml der Brühe zum Beimpfen eines Kolbens verwendet, der 50 ml eines Produktionsmediums enthielt, das aus: Stärke - 80 g; Calciumcarbonat – 7 g; Pharmamedia – 5 g; Dikaliumhydrogenphosphat – 1 g; Magnesiumsulfat – 1 g; Glutaminsäure – 0,6 g; Eisen(II)-sulfatheptahydrat – 0,01 g; Zinksulfat - 0,001 g; Mangan(II)-sulfat – 0,001 g bestand. Das Endvolumen wurde mit Leitungswasser auf 1 l eingestellt, der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt, und das Medium wurde 25 min bei 121 °C autoklavbehandelt.
Verschiedene Carbonsäuresubstrate (siehe Tabelle 1) wurden in Methanol gelöst und 24 h nach dem Beimpfen zu der Fermen tationsbrühe gegeben, wobei eine Endkonzentration von 0,2 g/l erhalten wurde. Die Fermentationsbrühe wurde 14 Tage bei 28 °C inkubiert, und dann wurde die Brühe zentrifugiert (2500 Umin^–1 während 2 min) und der Überstand verworfen. Das Mycelpellet wurde mit Aceton (15 ml) und dann mit Dichlormethan (30 ml) extrahiert, und die organische Phase wurde abgetrennt, filtriert und dann zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde in Methanol (1 ml) aufgenommen und durch HPLC mit einem Hewlett-Packard 1090A Liquid Chromatograph, der mit einem auf 240 nm eingestellten Scanning Diode-Array Detektor ausgestattet war, analysiert. Die verwendete Säule war eine bei 40 °C gehaltene Beckmann Ultrasphere C-18, 5 μm, 4,6 mm × 25 cm-Säule. 25 μl der obigen Methanollösung wurden auf die Säule injiziert. Die Elution wurde mit einem linearen Gradienten von Methanol-Wasser von 80:20 bis 95:5 über 40 min mit 0,85/ml min durchgeführt. Zwei Standardkonzentrationen von Cyclohexyl-B1 wurden zur Eichung des Detektoransprechens verwendet, und die Fläche unter den Kurven für B2- und B1-Avermectine wurde ermittelt.
6.2. Ergebnisse
Die für die B2- und B1-Avermectine beobachteten HPLC-Retentionszeiten und die 2:1-Verhältnisse sind in Tabelle 1 angegeben.
Tabelle 1
Die in Tabelle 1 angegebenen Daten belegen einen extrem weiten Bereich von B2:B1-Avermectinproduktverhältnissen, was einen beträchtlichen Unterschied hinsichtlich der Ergebnisse der Dehydratationsumwandlung von Klasse-2-Verbindungen in Klasse-1-Verbindungen in Abhängigkeit von der Natur der zugeführten Fettsäurenseitenkette-Startereinheit anzeigt. Dies zeigt an, dass von Änderungen des AveC-Proteins herrührende Änderungen der B2:B1-Verhältnisse für spezielle Substrate spezifisch sein können. Folglich muss ein Screening auf Mutanten, die Änderungen hinsichtlich des B2:B1-Verhältnisses, das mit einem speziellen Substrat erhalten wurde, zeigen, in Gegenwart dieses Substrats erfolgen. Die im Folgenden beschriebenen folgenden Beispiele verwenden Cyclohexancarbonsäure als das Screening-Substrat. Dieses Substrat wird jedoch nur als Beispiel für das Potential verwendet und es soll die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung nicht beschränken.
7. Beispiel: Isolierung des aveC-Gens
Dieses Beispiel beschreibt die Isolierung und Charakterisierung einer Region des Streptomyces avermitilis-Chromosoms, die das AveC-Genprodukt codiert. Wie im Folgenden gezeigt, wurde festgestellt, dass das aveC-Gen das Verhältnis produzierte Cyclohexyl-B2/Cyclohexyl-B1(B2:B1)-Avermectine modifizieren kann.
7.1. Materialien und Verfahren
7.1.1. Zucht von Streptomyces zur DNA-Isolierung
Das folgende Verfahren wurde zum Züchten von Streptomyces verfolgt. Einzelkolonien von S. avermitilis ATCC 31272 (Ein zelkolonieisolat Nr. 2) wurden auf YPD-6 von 1/2-Konzentration, das Difco Yeast Extract – 5 g; Difco Bacto-Peptone – 5 g; Dextrose – 2,5 g; MOPS – 5 g; Difco Bacto Agar – 15 g enthielt, isoliert. Das Endvolumen wurde mit dH₂O auf 1 l eingestellt, der pH-Wert wurde auf 7,0 eingestellt, und das Medium wurde 25 min bei 121 °C autoklavbehandelt.
Das in dem obigen Medium gewachsene Mycel wurde zum Beimpfen von 10 ml TSB-Medium (Difco Tryptic Soy Broth – 30 g, in 1 l dH₂O, 25 min bei 121 °C autoklavbehandelt) in einem Röhrchen von 25 mm × 150 mm verwendet, das 48 – 72 h unter Schütteln (300 Umin^–1) bei 28 °C gehalten wurde.
7.1.2. Chromosom-DNA-Isolierung von Streptomyces
Aliquots (0,25 ml oder 0,5 ml) des wie oben gewachsenen Mycels wurden in Mikrozentrifugenröhrchen von 1,5 ml gegeben, und die Zellen wurden durch Zentrifugation mit 12000 × g während 60 s konzentriert. Der Überstand wurde verworfen, und die Zellen wurden in 0,25 ml TSE-Puffer (20 ml 1,5 M Saccharose, 2,5 ml 1 M Tris-HCl, pH-Wert 8,0, 2,5 ml 1 M EDTA, pH-Wert 8,0 und 75 ml dH₂O), der 2 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert. Die Proben wurden 20 min unter Schütteln bei 37 °C inkubiert, in ein automatisiertes Nucleinsäureisolierungsinstrument AutoGen 540^TM (Integrated Separation Systems, Natick, MA) geladen und die Genom-DNA wurde unter Verwendung von Cycle 159 (Anlagen-Software) gemäß den Vorschriften des Herstellers isoliert.
Alternativ wurden 5 ml Mycel in ein Röhrchen von 17 mm × 100 mm gegeben, die Zellen durch Zentrifugation mit 3000 Umin^–1 während 5 min konzentriert und der Überstand entfernt. Die Zellen wurden in 1 ml TSE-Puffer resuspendiert, durch Zentrifugation mit 3000 Umin^–1 während 5 min konzentriert, und der Überstand wurde entfernt. Die Zellen wurden in 1 ml TSE-Puffer, der 2 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert und 30 – 60 min unter Schütteln bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,5 ml 10 % Natriumdodecylsulfat (SDS) zugegeben und die Zellen bei 37 °C inkubiert, bis die Lyse vollständig war. Das Lysat wurde 10 min bei 67 °C inkubiert, auf Raumtemperatur gekühlt, in zwei Eppendorf-Röhrchen von 1,5 ml aufgeteilt und 1 × mit 0,5 ml Phenol/Chloroform (50 Phenol, das zuvor mit 0,5 M Tris, pH-Wert 8,0 equilibriert wurdet 50 % Chloroform) extrahiert. Die wässrige Phase wurde entfernt und 2- bis 5-mal mit Chloroform:Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Die DNA wurde durch Zugabe von 1/10 des Volumens 3 M Natriumacetat, pH-Wert 4,8, Inkubation des Gemischs auf Eis während 10 min, Zentrifugieren des Gemischs mit 15000 Umin^–1 bei 5 °C während 10 min und Entfernen des Überstands in ein sauberes Röhrchen, zu dem ein Volumen Isopropanol gegeben wurde, gefällt. Das Gemisch von Überstand plus Isopropanol wurde dann 20 min auf Eis inkubiert, 20 min bei 5 °C mit 15000 Umin^–1 zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, und das DNA-Pellet wurde einmal mit 70 % Ethanol gewaschen. Nachdem das Pellet trocken war, wurde die DNA in TE-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH-Wert 8,0) resuspendiert.
7.1.3. Plasmid-DNA-Isolierung von Streptomyces
Ein Aliquot (1,0 ml des Mycels wurde in Mikrozentrifugenröhrchen von 1,5 ml gegeben, und die Zellen wurden durch Zentrifugation mit 12000 × g während 60 s konzentriert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen wurden in 1,0 ml 10,3 Saccharose resuspendiert und durch Zentrifugation mit 12000 × g während 60 s konzentriert, und der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden dann in 0,25 ml TSE-Puffer, der 2 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert und 20 min unter Schütteln bei 37 °C inkubiert und in das automatisierte Nucleinsäureisolierungsinstrument AutoGen 540^TM geladen. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Cycle 106 (Anlagen-Software) gemäß den Vorschriften des Herstellers isoliert.
Alternativ wurden 1,5 ml Mycel in Mikrozentrifugenröhrchen von 1,5 ml gegeben und die Zellen durch Zentrifugation mit 12000 × g während 60 s konzentriert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen wurden in 1,0 ml 10,3 % Saccharose resuspendiert und durch Zentrifugation mit 12000 × g während 60 s konzentriert, und der Überstand wurde verworfen. Die Zellen wurden in 0,5 ml TSE-Puffer, der 2 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert und 15 – 30 min bei 37 °C inkubiert. Nach der Inkubation wurden 0,25 ml alkalische SDS-Lösung (0,3 N NaOH, 2 % SDS) zugegeben und die Zellen 15 -30 min oder bis die Lösung klar war, bei 55 °C inkubiert. Natriumacetat (0,1 ml, 3 M, pH-Wert 4,8) wurde zu der DNA-Lösung gegeben, die dann 10 min auf Eis inkubiert wurde. Die DNA-Proben wurden 10 min bei 5 °C mit 14000 Umin^–1 zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein sauberes Röhrchen entfernt, und 0,2 ml Phenol/Chloroform (50 % Phenol/50 % Chloroform) wurden zugegeben und sanft eingemischt. Die DNA-Lösung wurde 10 min bei 5 °C mit 14000 Umin^–1 zentrifugiert, und die obere Schicht wurde in ein sauberes Eppendorf-Röhrchen entfernt. Isopropanol (0,75 ml) wurde zugegeben, und die Lösung wurde sanft gemischt und dann 20 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die DNA-Lösung wurde bei 5 °C 15 min mit 14000 Umin^–1 zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und das DNA-Pellet wurde mit 70 % Ethanol gewaschen, getrocknet und in TE-Puffer resuspendiert.
7.1.4. Plasmid-DNA-Isolierung von E. coli
Eine einzige transformierte E. coli-Kolonie wurde in 5 ml Luria-Bertani(LB)-Medium (Bacto-Trypton – 10 g, Bacto-Hefeextrakt – 5 g und NaCl – 10 g in 1 l dH₂O, pH-Wert 7,0, 25 min bei 121 °C autoklavbehandelt und mit 100 μg/ml Ampicillin ergänzt) überimpft. Die Kultur wurde über Nacht inkubiert und ein 1-ml-Aliquot wurde in ein Mikrozentrifugenröhrchen von 1,5 ml gegeben. Die Kulturproben wurden in das automatisierte Nucleinsäureisolierungsinstrument AutoGen 540^TM geladen und Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Cycle 3 (Anlagen-Software) gemäß den Vorschriften des Herstellers isoliert.
7.1.5. Herstellung und Transformation von S. avermitilis-Protoplasten
Einzelkolonien von S. avermitilis wurden auf YPD-6 von 1/2-Konzentration isoliert. Das Mycel wurde zur Beimpfung von 10 ml TSB-Medium in einem Röhrchen von 25 mm × 150 mm verwendet, das dann 48 h bei 28 °C unter Schütteln (300 Umin^–1) inkubiert wurde. 1 ml Mycel wurde zur Beimpfung von 50 ml YEME-Medium verwendet. YEME-Medium enthält pro 1: Difco Yeast Extract – 3 g; Difco Bacto-Peptone – 5 g; Difco Malt Extract – 3 g; Saccharose – 300 g. Nach einer Autoklavbehandlung bei 121 °C während 25 min wurde folgendes zugegeben: 205 M MgCl₂ · 6H₂O (getrennte Autoklavbehandlung bei 121 °C während 25 min) – 2 ml; und Glycin (20 %) (filtrationssterilisiert) – 25 ml.
Das Mycel wurde 48 – 72 h bei 30 °C wachsen gelassen und durch Zentrifugation in einem Zentrifugenröhrchen von 50 ml (Falcon) mit 3000 Umin^–1 während 20 min geerntet. Der Überstand wurde verworfen und das Mycel wurde in P-Puffer, der Saccharose – 205 g; K₂SO₄ – 0, 25 g; MgCl₂ · 6H₂O – 2,02 g; H₂O - 600 ml; K₂PO₄ (0,5 %) – 10 ml; Spurenelementlösung* – 20 ml; CaCl₂ · 2H₂O (3,68 %) – 100 ml und MES-Puffer (1,0 M, pH-Wert 6,5) – 10 ml enthält, resuspendiert (*Spurenelementlösung enthält pro l: ZnCl₂ – 40 mg; FeCl₃ · 6H₂O – 200 mg; CuCl₂ · 2H₂O – 10 mg; MnCl₂ · 4H₂O – 10 mg; Na₂B₄O – 10H₂O – 10 mg; (NH₄)₆Mo₇O₂₄ · 4H₂O – 10 mg). Der pH-Wert wurde auf 6,5 eingestellt, das Endvolumen wurde auf 1 l eingestellt und das Medium wurde heiß über ein 0,45-μm-Filter filtriert.
Das Mycel wurde 20 min mit 3000 Umin^–1 pelletisiert, der Überstand wurde verworfen und das Mycel wurde in 20 ml P-Puffer, der 2 mg/ml Lysozym enthielt, resuspendiert. Das My cel wurde unter Schütteln 15 min bei 35 °C inkubiert und mikroskopisch überprüft, um das Ausmaß der Protoplastenbildung zu bestimmen. Wenn die Protoplastenbildung vollständig war, wurden die Protoplasten 10 min mit 8000 Umin^–1 zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und die Protoplasten wurden in 10 ml P-Puffer resuspendiert. Die Protoplasten wurden 10 min mit 8000 Umin^–1 zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt, die Protoplasten wurden in 2 ml P-Puffer resuspendiert und etwa 1 × 10⁹ Protoplasten wurden auf 2,0-ml-Kryoampullen (Nalgene) verteilt.
Eine Ampulle, die 1 × 10⁹ Protoplasten enthielt, wurde 10 min mit 8000 Umin^–1 zentrifugiert, der Überstand wurde entfernt und die Protoplasten wurden in 0,1 ml P-Puffer resuspendiert. 2 bis 5 μg transformierender DNA wurde zu den Protoplasten gegeben und unmittelbar anschließend wurden 0,5 ml Arbeits-T-Puffer zugegeben. T-Puffer-Grundlage enthält: PEG-1000 (Sigma) – 25 g; Saccharose – 2,5 g; H₂O – 83 ml. Der pH-Wert wurde mit l N NaOH (filtrationssterilisiert) auf 8,8 eingestellt, und die T-Puffer-Grundlage wurde filtrationssterilisiert und bei 4 °C aufbewahrt. Arbeits-T-Puffer, der am Tag der Verwendung hergestellt wurde, bestand aus T-Puffer-Grundlage – 8,3 ml; K₂PO₄ (4 mM)- 1,0 ml; CaCl₂ · 2H₂O (5 M) – 0,2 ml; und TES (1 M, pH-Wert 8) – 0,5 ml. Jede Komponente des Arbeits-T-Puffers wurde individuell filtrationssterilisiert.
Innerhalb von 20 s der Zugabe von T-Puffer zu den Protoplasten wurde 0,1 ml P-Puffer ebenfalls zugegeben, und die Protoplasten wurden 10 min mit 8000 Umin^–1 zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, und die Protoplasten wurden in 0,1 ml P-Puffer resuspendiert. Die Protoplasten wurden dann auf RM14-Medium, das Saccharose – 205 g; K₂SO₄ – 0,25 g; MgCl₂ · 6H₂O – 10,12 g; Glukose – 10 g; Difco Casamino Acids – 0,1 g; Difco Yeast Extract – 5 g; Difco Oatmeal Agar – 3 g; Difco Bacto Agar – 22 g; dH₂O 800 ml enthält, ausplattiert. Die Lösung wurde 25 min bei 121 °C autoklavbehandelt. Nach der Autoklavbehandlung wurden sterile Stammlösungen des folgenden zugegeben: K₂PO₄ (0,5 %) – 10 ml; CaCl₂ · 2H₂O (5 M) - 5 ml; L-Prolin (20 %) – 15 ml; MES-Puffer (1,0 M, pH-Wert 6,5) – 10 ml; Spurenelementlösung (wie oben) – 2 ml; Cycloheximidstammlösung (25 mg/ml) – 40 ml; und l N NaOH – 2 ml. 25 ml RM14-Medium wurden in Aliquots pro Platte zugegeben und die Platten wurden vor der Verwendung 24 h getrocknet.
Die Protoplasten wurden 20 – 24 h bei 30 °C bei einer Luftfeuchtigkeit von 95 % inkubiert. Zur Selektion von Thiostrepton-resistenten Transformanten wurde 1 ml Überschichtungspuffer, der 125 μg Thiostrepton pro ml enthielt, gleichmäßig über den RM14-Regenerationsplatten verteilt. Überschichtungspuffer enthält pro 100 ml: Saccharose – 10,3 g; Spurenelementlösung (die gleiche wie oben) – 0,2 ml; und MES (1M, pH-Wert 6,5) 1 ml. Die Protoplasten wurden 7 – 14 Tage bei 30 °C bei einer Luftfeuchtigkeit von 95 % inkubiert, bis Thiostrepton-resistente (Thio^r)-Kolonien sichtbar waren.
7.1.6. Transformation von Streptomyces lividans-Protoplasten
S. lividans TK64 (von John Innes Institute, Norwich, UK bereitgestellt) wurde in einigen Fällen zu Transformationen verwendet. Die Verfahren und Zusammensetzungen zur Zucht, Protoplasten-Bildung und Transformation von S. lividans sind bei Hopwood et al., 1985, Genetic Manipulation of Streptomyces, A Laboratory Manual, John Innes Foundation, Norwich, UK, beschrieben und wurden wie dort beschrieben durchgeführt. Plasmid-DNA wurde aus S. lividans-Transformanten gemäß der Beschreibung in obigem Abschnitt 7.1.3 durchgeführt.
7.1.7. Fermentationsanalyse von S. avermitilis-Stämmen
S. avermitilis-Mycel, das auf YPD-6 von 1/2-Konzentration 4 - 7 Tage gezüchtet wurde, wurde in Röhrchen von 1 × 6 inch, die 800 ml Preformmedium und 2 Glasperlen von 5 mm enthielten, überimpft. Preformmedium enthält: lösliche Stärke (entweder dünne Siedestärke oder KOSO, Japan Corn Starch Co., Nagoya) – 20 g/l, Pharmamedia – 15 g/l; Ardamine pH -5 g/l (Champlain Ind., Clifton, NJ); CaCO₃ – 2 g/l; 2x bcfa ("bcfa" bezeichnet verzweigtkettige Fettsäuren), das eine Endkonzentration im Medium von 50 ppm 2-(+/–)-Methylbuttersäure, 60 ppm Isobuttersäure und 20 ppm Isovaleriansäure enthält. Der pH-Wert wurde auf 7,2 eingestellt, und das Medium wurde 25 min bei 121 °C autoklavbehandelt.
Das Röhrchen wurde 3 Tage bei 29 °C mit 215 Umin^–1 mit einem Winkel von 17° geschüttelt. Ein 2-ml-Aliquot der Impfkultur wurde zur Beimpfung eines Erlenmeyer-Kolbens von 300 ml, der 25 ml Produktionsmedium enthielt, verwendet, wobei das Produktionsmedium Stärke (entweder dünne Siedestärke oder KO-SO) – 160 g/l; Nutrisoy (Archer Daniels Midland, Decatur, IL) – 10 g/l; Ardamine pH – 10 g/l; K₂PO₄ – 2 g/l; MgSO₄ · 4H₂O - 2 g/l; FeSO₄ · 7H₂O – 0,02 g/l; MnCl₂ – 0,002 g/l; ZnSO₄ · 7H₂O - 0,002 g/l; CaCO₃ – 14 g/l; 2x bcfa (wie oben); und Cyclohexancarbonsäure (CHC) (hergestellt als 20 %ige Lösung bei pH 7,0) – 800 ppm enthält. Der pH-Wert wurde auf 6,9 eingestellt, und das Medium wurde 25 min bei 121 °C autoklavbehandelt.
Nach der Beimpfung wurde der Kolben 12 Tage bei 29 °C unter Schütteln mit 200 Umin^–1 inkubiert. Nach der Inkubation wurde eine 2-ml-Probe aus dem Kolben gezogen, mit 800 ml Methanol verdünnt, gemischt, und das Gemisch wurde 10 min mit 1250 × g zentrifugiert, um Zellabfälle zu pelletisieren. Der Überstand wurde dann durch HPLC unter Verwendung einer Beckmann Ultrasphere ODS-Säule (25 cm × 4,6 mm ID) mit einer Durchflussrate von 0,75 ml/min und Detektion durch die Extinktion bei 240 nm getestet. Die mobile Phase war 86/8,9/5,1 Methanol/Wasser/Acetonitril.
7.1.8. Isolierung von S. avermitilis PKS-Genen
Eine Cosmidbibliothek von S. avermitilis (ATCC 31272, SC-2)-Chromosom-DNA wurde hergestellt und mit einer Ketosynthase (KS)-Sonde, die aus einem Fragment des Saccharopolyspora erythraea-Polyketidsynthase(PKS)-Gens hergestellt wurde, hybridisiert. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von Cosmidbibliotheken findet sich bei Sambrook et al., 1989, aaO. Eine detaillierte Beschreibung der Herstellung von Streptomyces-Chromosom-DNA-Bibliotheken ist bei Hopwood et al., 1985, aaO, angegeben. Cosmidklone, die mit Ketosynthase hybridisierende Regionen enthalten, wurden durch Hybridisierung mit einem 2,7-kb-NdeI/Eco47III-Fragment von pEX26 (freundlicherweise von Dr. P. Leadlay, Cambridge, UK) zur Verfügung gestellt) identifiziert. Etwa 5 ng pEX26 wurden unter Verwendung von NdeI und Eco47III verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde auf ein 0,8 % SeaPlaque-GTG-Agarosegel (FMC BioProducts, Rockland, ME) geladen. Das 2,7-kb-NdeI/Eco47III-Fragment wurde aus dem Gel nach der Elektrophorese ausgeschnitten und die DNA wurde aus dem Gel unter Verwendung von GELase^TM von Epicentre Technologies unter Verwendung des Fast Protocol gewonnen. Das 2,7-kb-NdeI/Eco47III-Fragment wurde mit [α-³²P]dCTP ([α-³²P]-Desoxycytidin-5'-triphosphattetra(triethylammonium)salz) (NEN-Dupont, Boston, MA) unter Verwendung des BRL Nick Translation System (BRL Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) gemäß der Vorschriften des Lieferanten markiert. Eine typische Reaktion wurde in einem Volumen von 0,05 ml durchgeführt. Nach der Zugabe von 5 μl-Stoppuffer wurde die markierte DNA von nicht-eingebauten Nucleotiden unter Verwendung einer G-25-Sephadex Quick Spin^TM-Säule (Boehringer Mannheim) nach den Vorschriften des Lieferanten abgetrennt.
Etwa 1800 Cosmidklone wurden durch Koloniehybridisierung durchmustert. 10 Klone, die stark mit der Sacc. erythraea-KS-Sonde hybridisierten, wurden identifiziert. Die E. coli-Kolonien, die Cosmid-DNA enthielten, wurden in LB- Flüssigmedium gezüchtet und Cosmid-DNA wurde aus jeder Kultur in dem automatisierten Nucleinsäureisolierungsinstrument AutoGen 540^TM unter Verwendung von Cycle 3 (Anlagensoftware) gemäß den Vorschriften des Herstellers isoliert. Restriktionsendonucleasekartierung- und Southern-Blot-Hybridisierungsanalysen ergaben, dass fünf der Klone überlappende Chromosomenregionen enthielten. Eine S. avermitilis-Genom-BamHI-Restriktionskarte der fünf Cosmide (d. h. pSE65, pSE66, pSE67, pSE68, pSE69) wurde durch Analyse von überlappenden Cosmiden und Hybridisierungen konstruiert (4).
7.1.9. Identifizierung von DNA, die Avermectin-B2:B1-Verhältnisse moduliert und Identifizierung eines aveC-ORF
Die folgenden Verfahren wurden verwendet, um subklonierte Fragmente, die von dem pSE66-Cosmidklon abgeleitet waren, auf deren Fähigkeit zur Modulierung von Avermectin-B2:B1-Verhältnissen in AveC-Mutanten zu testen. pSE66 (5 μg) wurde mit SacI und BamHI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde auf ein 0,8 % SeaPlaque^TM GTG-Agarosegel (FMC BioProducts) geladen, ein 2,9-kb-SacI/BamHI-Fragment aus dem Gel wurde nach der Elektrophorese ausgeschnitten, und die DNA wurde aus dem Gel unter Verwendung von GELase^TM (Epicentre Technologies) unter Verwendung des Fast Protocol gewonnen. Etwa 5 μg des Shuttlevektors pWHM3 (Vara et al., 1989, J. Bacteriol. 171:5872–5881) wurden mit SacI und BamHI verdaut. Etwa 0,5 μg des 2,9-kb-Inserts und 0,5 μg von verdautem pWHM3 wurden gemischt und über Nacht mit einer Einheit Ligase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA) bei 15 °C in einem Gesamtvolumen von 20 μl gemäß den Vorschriften des Lieferanten inkubiert. Nach der Inkubation wurden 5 μl des Ligationsgemischs 10 min bei 70 °C inkubiert, auf Raumtemperatur gekühlt und zur Transformation kompetenter E. coli-DH5α-Zellen (BRL) gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des 2,9-kb- SacI/BamHI-Inserts wurde das durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid wurde als pSE119 bezeichnet.
Protoplasten des S. avermitilis-Stamms 1100-SC38 (hauseigener Stamm von Pfizer) wurden hergestellt und mit pSE119 transformiert, wie im obigen Absatz 7.1.5 beschrieben wurde. Der Stamm 1100-SC38 ist eine Mutante, die signifikant mehr der Avermectin-Cyclohexyl-B2-Form im Vergleich zur Avermectin-Cyclohexyl-B1-Form produziert, wenn er mit Cyclohexancarbonsäure ergänzt wird (B2:B1 etwa 30:1). Das zur Transformation von S. avermitilis-Protoplasten verwendete pSE119 wurde aus entweder dem E. coli-Stamm GM2163 (erhalten von Dr. B. J. Bachmann, Curator, E. coli Genetic Stock Center, Yale University), dem E. coli-Stamm DM1 (BRL) oder dem S. lividans-Stamm TK 64 isoliert. Thiostrepton-resistente Transformanten des Stamms 1100-SC38 wurden isoliert und durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert. Transformanten des S. avermitilis-Stamms 1100-SC38, die pSE119 enthielten, ergaben ein geändertes Verhältnis von Avermectin-Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1 von etwa 3,7:1 (Tabelle 2).
Nach der Feststellung, dass pSE119 Avermectin-B2:B1-Verhältnisse in einer AveC-Mutante modulieren kann, wurde die Insert-DNA sequenziert. Etwa 10 μg von pSE119 wurden unter Verwendung eines Plasmid-DNA-Isolation-Kit (Qiagen, Valencia, CA) nach den Vorschriften des Herstellers isoliert und unter Verwendung eines API 373A Automated DNA Sequencer (Perkin Elmer, Foster City, CA) sequenziert. Die Sequenzdaten wurden unter Verwendung von Genetic Computer Group-Programmen (GCG, Madison, WI) gesammelt und editiert. Die DNA-Sequenz und das aveC-ORF sind in 1 angegeben (SEQ ID NO: 1).
Ein neues Plasmid, das als pSE118 bezeichnet wurde, wurde wie folgt konstruiert. Etwa 5 μg von PSE66 wurden mit SphI und BamHI verdaut. Das Reaktionsgemisch wurde auf ein 0,8 % SeaPlaque-GTG-Agarosegel (FMC BioProducts) gegeben, ein 2,8-kb-SphI/BamHI-Fragment wurde aus dem Gel nach der Elektrophorese ausgeschnitten, und die DNA wurde aus dem Gel unter Verwendung von GELase^TM (Epicentre Technologies) unter Verwendung des Fast Protocol gewonnen. Etwa 5 μg des Shuttlevektors pWHM3 wurden mit SphI und BamHI verdaut. Etwa 0,5 μg des 2,8-kb-Inserts und 0,5 μg des verdauten pWHM3 wurden gemischt und bei 15 °C in einem Gesamtvolumen von 20 μl über Nacht mit einer Einheit Ligase (New England Biolabs) gemäß den Vorschriften des Lieferanten inkubiert. Nach der Inkubation wurden 5 μl des Ligationsgemischs 10 min bei 70 °C inkubiert, auf Raumtemperatur gekühlt und zur Transformation von kompetenten E. coli-DH5α-Zellen gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des 2,8-kb-SphI/BamHI-Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid wurde als pSE118 bezeichnet. Die Insert-DNA in pSE118 und pSE119 überlappt um etwa 838 Nucleotide (4).
Protoplasten des S. avermitilis-Stamms 1100-SC38 wurden mit pSE118 wie oben transformiert. Thiostrepton-resistente Transformanten des Stamms 1100-SC38 wurden isoliert und durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert. Transformanten des S. avermitilis-Stamms 1100-SC38, die pSE118 enthielten, waren hinsichtlich des Verhältnisses Avermectin-Cyclohexyl-B2:Avermectin-Cyclohexyl-B1 im Vergleich zu Stamm 1100-SC38 nicht verändert (Tabelle 2).
7.1.10. PCR-Amplifikation des aveC-Gens von S. avermitilis-Chromosom-DNA
Ein ~1,2-kb-Fragment, das das aveC-ORF enthielt, wurde aus S. avermitilis-Chromosom-DNA durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von auf der Basis der oben erhaltenen aveC-Nucleotidsequenz gestalteten Primern isoliert. Die PCR-Primer wurden von Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas) er halten. Der rechtsseitige Primer war: 5'-TCACGAA.ACCGGACACAC-3' (SEQ ID NO: 6); und der linksseitige Primer war: 5'-CATGATCGCTGAACCGAG-3' (SEQ ID NO: 7). Die PCR-Reaktion wurde mit Deep Vent^TM-Polymerase (New England Biolabs) in vom Hersteller geliefertem Puffer und in Gegenwart von 300 μM dNTP; 10 % Glycerin, 200 pmol jedes Primers, 0,1 μg Templat und 2,5 Einheiten Enzym in einem Endvolumen von 100 μl unter Verwendung eines Perkin-Eimer Cetus Thermal Cycler durchgeführt. Das Wärmeprofil des ersten Zyklus war 95 °C während 5 min (Denaturierungsstufe), 60 °C während 2 min (Renaturierungsstufe) und 72 °C während 2 min (Verlängerungsstufe). Die folgenden 24 Zyklen hatten ein ähnliches Wärmeprofil, wobei jedoch die Denaturierungsstufe auf 45 s und die Renaturierungsstufe auf 1 min verkürzt wurde.
Das PCR-Produkt wurde in einem 1 % Agarosegel einer Elektrophorese unterzogen, und es wurde eine einzige DNA-Bande von ~1,2 kb detektiert. Diese DNA wurde aus dem Gel gereinigt und mit 25 ng von linearisiertem stumpfendigem pCR-Bluntvektor (Invitrogen) in einem Vektor/Insert-Molverhältnis von 1/10 nach den Vorschriften des Herstellers ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von One Shot^TM Competent-E. coli-Zellen (Invitrogen) nach den Vorschriften des Herstellers verwendet. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des ~1,2-kb-Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid wurde als pSE179 bezeichnet.
Die Insert-DNA von pSE179 wurde durch Verdau mit BamHI/XbaI isoliert, durch Elektrophorese getrennt, aus dem Gel gereinigt und mit dem Shuttlevektor pWHM3, der ebenfalls mit BamHI/ XbaI verdaut worden war, in einer Gesamt-DNA-Konzentration von 1 μg in einem Vektor/Insert-Molverhältnis von 1/5 ligiert. Das Ligationsgemisch wurde zur Transformation von kompetenten E. coli-DH5α-Zellen nach den Vorschrif ten des Herstellers verwendet. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des ~1,2-kb-Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid, das als pSE186 bezeichnet wurde (2, ATCC 209604) wurde in E. coli-DM1 transformiert, und Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert.
7.2. Ergebnisse
Ein 2,9-kb-SacI/BamHI-Fragment von pSE119, das, wenn es in den S. avermitilis-Stamm 1100-SC38 transformiert wurde, das B2:B1-Avermectin-Produktionsverhältnis signifikant änderte, wurde identifiziert. Der S. avermitilis-Stamm 1100-SC38 weist normalerweise ein B2:B1-Verhältnis von etwa 30:1 auf, doch verringerte sich das Verhältnis von B2:B1-Avermectin auf etwa 3,7:1, wenn er mit einem das 2,9-kb-SacI/BamHI-Fragment umfassenden Vektor transformiert wurde. Eine Postfermentationsanalyse von Transformantenkulturen verifizierte das Vorhandensein der transformierenden DNA.
Das 2,9-kb-pSE119-Fragment wurde sequenziert, und ein ORF von ~0,9 kb wurde identifiziert (1) (SEQ ID NO: 1), das ein PstI/SphI-Fragment umfasst, das bereits an anderer Stelle so mutiert wurde, dass es nur B2-Produkte produziert (Ikeda et al., 1995, aaO). Ein Vergleich von diesem ORF oder von dessen entsprechendem abgeleiteten Polypeptid mit bekannten Datenbanken (GenEMBL, SWISS-PROT) zeigte keine starke Homologie mit bekannter DNA oder bekannten Proteinsequenzen.
Tabelle 2 zeigt die Fermentationsanalyse des S. avermitilis-Stamms 1100-SC38, der mit verschiedenen Plasmiden transformiert wurde.
Tabelle 2
8. Beispiel: Konstruktion von S. avermitilis-AveC-Mutanten
Dieses Beispiel beschreibt die Konstruktion mehrerer unterschiedlicher S. avermitilis-AveC-Mutanten unter Verwendung der oben beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren. Eine allgemeine Beschreibung von Techniken zur Einführung von Mutationen in ein Gen in Streptomyces ist bei Kieser und Hopwood, 1991, Meth. Enzym. 204:430–458 beschrieben. Eine detailliertere Beschreibung wird bei Anzai et al., 1988, J. Antibiot. XLI(2):226–233 und bei Stutzman-Engwall et al., 1992, J. Bacteriol. 174(1):144–154 gegeben. Diese Literaturstellen sind hier in ihrer Gesamtheit als Bezug aufgenommen.
8.1. Inaktivierung des S. avermitilis-aveC-Gens
AveC-Mutanten, die inaktivierte aveC-Gene enthalten, wurden unter Verwendung mehrerer Verfahren, die im Folgenden detailliert angegeben sind, konstruiert.
Bei dem ersten Verfahren wurde ein 640-bp-SphI/PstI-Fragment, das sich in dem aveC-Gen in pSE119 (im obigen Abschnitt 7.1.9. beschriebenes Plasmid) befindet, durch das ermE-Gen (für Erythromycin-Resistenz) von Sacc. erythraea ersetzt. Das ermE-Gen wurde aus pIJ4026 (von John Innen In stitute, Norwich, UK bereitgestellt; siehe auch Bibb et al., 1985, Gene 41:357–368) durch Restriktionsenzymverdau mit BglII und EcoRI und anschließende Elektrophorese isoliert und aus dem Gel gereinigt. Dieses Fragment von ~1,7 kb wurde in pGEM7Zf (Promega), das mit BamHI und EcoRI verdaut worden war, ligiert, und das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli-DH5α-Zellen nach den Vorschriften des Herstellers transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des Inserts von ~1,7 kb wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid wurde als pSE27 bezeichnet.
pSE118 (Beschreibung im obigen Abschnitt 7.1.9) wurde mit SphI und BamHI verdaut, der Verdau wurde einer Elektrophorese unterzogen, und das ~2,8-kb-SphI/BamHI-Insert wurde aus dem Gel gereinigt. pSE119 wurde mit PstI und EcoRI verdaut, der Verdau wurde einer Elektrophorese unterzogen, und das ~1,5-kb-PstI/EcoRI-Insert wurde aus dem Gel gereinigt. Der Shuttlevektor pWHM3 wurde mit BamHI und EcoRI verdaut. pSE27 wurde mit PstI und SphI verdaut, der Verdau wurde einer Elektrophorese unterzogen, und das ~1,7-kb-PstI/SphI-Insert wurde aus dem Gel gereinigt. Alle vier Fragmente (d. h. ~2,8 kb, ~1,5 kb, ~7,2 kb, ~1,7 kb) wurden in einer 4-Wege-Ligation zusammenlegiert. Das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli-DH5α-Zellen nach den Vorschriften des Herstellers transformiert. Dieses Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid wurde als pSE180 bezeichnet (3; ATCC 209605).
pSE180 wurde in S. lividans TK64 transformiert, und transformierte Kolonien wurden durch Resistenz gegenüber Thiostrepton und Erythromycin identifiziert. pSE180 wurde aus S. lividans isoliert und zur Transformation von S. avermitilis-Protoplasten verwendet. Vier Thiostrepton-resistente S. avermitilis-Transformanten wurden identifiziert, und Proto plasten wurden hergestellt und unter nicht-selektiven Bedingungen auf RM14-Medium ausplattiert. Nach der Regeneration der Protoplasten wurden Einzelkolonien auf das Vorhandensein von Erythromycin-Resistenz und das Nichtvorhandensein von Thiostrepton-Resistenz, was die Chromosomintegration des inaktivierten aveC-Gens und den Verlust des freien Replikons anzeigt, durchmustert. Eine Erm^r-Thio^s-Transformante wurde identifiziert und als Stamm SE180-11 bezeichnet. Die gesamte Chromosom-DNA wurde aus dem Stamm SE180-11 isoliert, mit den Restriktionsenzymen BamHI, HindIII, PstI oder SphI verdaut, durch Elektrophorese auf einem 0,8 % Agarosegel aufgetrennt, auf Nylonmembranen übertragen und mit der ermE-Sonde hybridisiert. Diese Analysen zeigten, dass eine Chromosomintegration des ermE-Resistenzgens und die gleichzeitige Deletion des 640-bp-PstI/SphI-Fragments durch ein doppeltes Crossing-Over erfolgt waren. Die HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten des Stamms SE180-11 zeigte, dass normale Avermectine nicht mehr produziert wurden (5A).
In einem zweiten Verfahren zur Inaktivierung des aveC-Gens wurde das 1,7-kb-ermE-Gen aus dem Chromosom des S. avermitilis-Stamms SE180-11 entfernt, wobei eine 640-bp-PstI/SphI-Deletion im aveC-Gen zurückblieb. Ein Gensubstitutionsplasmid wurde wie folgt konstruiert: pSE180 wurde partiell mit Xbal verdaut, und ein 11,4-kb-Fragment wurde aus dem Gel gereinigt. Der 11,4-kb-Bande fehlt das 1,7-kb-ermE-Resistenzgen. Die DNA wurde dann ligiert und in E. coli-DH5α-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid, das als pSE184 bezeichnet wurde, wurde in E. coli-DM1 transformiert, und Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert. Diese Plasmid wurde zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms SE180-11 verwendet. Protoplasten wurden aus Thiostrepton-resistenten Transformanten des Stamms SE180-11 hergestellt und als Einzelkolonien auf RM14 aus plattiert. Nach der Regeneration der Protoplasten wurden Einzelkolonien auf das Nichtvorhandensein von sowohl Erythromycin-Resistenz als auch Thiostrepton-Resistenz, was die Chromosomintegration des inaktivierten aveC-Gens und den Verlust des freien Replikons, das das ermE-Gen enthält, anzeigt, durchmustert. Eine Erm^s-Thio^s-Transformante wurde identifiziert und als SE184-1-13 bezeichnet. Die Fermentationsanalyse von SE184-1-13 zeigte, dass keine normalen Avermectine produziert wurden, und dass SE184-1-13 das gleiche Fermentationsprofil wie SE180-11 besaß.
In einem dritten Verfahren zur Inaktivierung des aveC-Gens wurde eine Rasterverschiebung in das chromosomale aveC-Gen durch Hinzufügen von zwei Gs nach dem C an der Nucleotidposition 471 unter Verwendung von PCR eingeführt, wodurch eine BspE1-Stelle erzeugt wurde. Das Vorhandensein der technisch veränderten BspE1-Stelle war zur Detektion des Gensubstitutionsereignisses günstig. Die PCR-Primer wurden zur Einführung einer Rasterverschiebungsmutation in das aveC-Gen gestaltet und von Genosys Biotechnologies Inc. erhalten. Der rechtsseitige Primer war: 5'-GGTTCCGGATGCCGTTCTCG-3' (SEQ ID NO: 8) und der linksseitige Primer war: 5'-AACTCCGGTCGACTCCCCTTC-3' (SEQ ID NO: 9). Die PCR-Bedingungen waren wie im obigen Abschnitt 7.1.10 beschrieben. Das 666-bp-PCR-Produkt wurde mit SphI verdaut, wobei zwei Fragmente von 278 bp bzw. 388 bp erhalten wurden. Das 388-bp-Fragment wurde aus dem Gel gereinigt.
Das Gensubstitutionsplasmid wurde wie folgt konstruiert: der Shuttlevektor pWHM3 wurde mit EcoRI und BamHI verdaut. pSE119 wurde mit BamHI und SphI verdaut, der Verdau wurde einer Elektrophorese unterzogen, und ein Fragment von 840 bp wurde aus dem Gel gereinigt. pSE119 wurde mit EcoRI und XmnI verdaut, der Verdau wurde durch Elektrophorese aufgetrennt und ein Fragment von ~1,7 kb wurde aus dem Gel gereinigt. Alle vier Fragmente (d. h. ~7,2 kb, ~840 bp, ~1,7 kb und 388 bp) wurden in einer 4-Wege-Ligation zusammenligiert.
Das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli-DH5α-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzanalyse festgestellt. Dieses Plasmid, das als pSE185 bezeichnet wurde, wurde in E. coli-DM1 transformiert, und Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert. Dieses Plasmid wurde zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms 1100-SC38 verwendet. Thiostrepton-resistente Transformanten des Stamms 1100-SC38 wurden isoliert und durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert. pSE185 änderte, wenn es in den S. avermitilis-Stamm 1100-SC38 transformiert wurde, die B2:B1-Avermectin-Verhältnisse nicht signifikant (Tabelle 2).
pSE185 wurde zur Transformation von Protoplasten von S. avermitilis zur Erzeugung einer Rasterverschiebungsmutation in dem chromosomalen aveC-Gen verwendet. Protoplasten wurden aus Thiostrepton-resistenten Transformanten hergestellt und als Einzelkolonien auf RM14 ausplattiert. Nach der Regeneration der Protoplasten wurden Einzelkolonien auf das Nichtvorhandensein von Thiostrepton-Resistenz durchmustert. Chromosom-DNA von gegenüber Thiostrepton empfindlichen Kolonien wurde isoliert und durch PCR auf das Vorhandensein der in das Chromosom integrierten Rasterverschiebungsmutation durchmustert. Die PCR-Primer wurden auf der Basis der aveC-Nucleotidsequenz gestaltet und von Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas) erhalten. Der rechtsseitige PCR-Primer war: 5'-GCAAGGATACGGGGACTAC-3' (SEQ ID NO: 10) und der linksseitige PCR-Primer war: 5'-GAACCGACCGCCTGATRC-3' (SEQ ID NO: 11), und die PCR-Bedingungen waren wie im obigen Abschnitt 7.1.10 beschrieben. Das erhaltene PCR-Produkt bestand aus 543 bp, und wenn es mit BspE1 verdaut wurde, wurden drei Fragmente von 368 bp, 96 bp und 79 bp beobachtet, was eine Chromosomintegration des inaktivierten aveC-Gens und den Verlust des freien Replikons anzeigt.
Die Fermentationsanalyse von S. avermitilis-Mutanten, die die Rasterverschiebungsmutation in dem aveC-Gen enthielten, zeigte, dass normale Avermectine nicht mehr produziert wurden und dass diese Mutanten das gleiche Fermentations-HPLC-Profil wie die Stämme SE1880-11 und SE184-1-13 hatten. Eine Thios-Transformante wurde identifiziert und als Stamm SE185-5a bezeichnet.
Ferner wurde eine Mutation in dem aveC-Gen, die die Nucleotidposition 520 von G zu A ändert, was zu einer Änderung des Codons mit Codierung für ein Tryptophan (W) an Position 116 zu einem Terminationscodon führt, produziert. Ein S. avermitilis-Stamm mit dieser Mutation produzierte keine normalen Avermectine und hatte das gleiche Fermentationsprofil wie die Stämme SE180-11, SE184-1-13 und SE185-5a.
Ferner wurden Mutationen im den aveC-Gen produziert, die sowohl (i) die Nucleotidposition 970 von G zu A ändern, was die Aminosäure an Position 266 von einem Glycin (G) zu einem Aspartat (D) ändert, als auch (ii) die Nucleotidposition 996 von T zu C ändern, was die Aminosäure an Position 275 von Thyrosin (Y) zu Histidin (H) ändert. Ein S. avermitilis-Stamm mit diesen Mutationen (G256D/Y275H) produzierte keine normalen Avermectine und hatte das gleiche Fermentationsprofil wie die Stämme SE180-11, SE184-1-13 und SE185-5a.
Die S. avermitilis-aveC-Inaktivierung-Mutantenstämme SE-180-11, SE184-1-13, SE185-5a und andere hiermit bereitgestellte ergeben Screeningwerkzeuge zur Feststellung des Einflusses bzw. der Auswirkung anderer Mutationen in dem aveC-Gen. pSE186, das eine Wildtypkopie des aveC-Gens enthält, wurde in E. coli DM1 transformiert, und Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert. Diese pSE186-DNA wurde zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms SE180-11 verwendet. Thiostreptonresistente Transformanten des Stamms SE180-11 wurden isoliert, das Vorhandensein von Erythromycin-Resistenz wurde bestimmt, und Thio^r-Erm^r-Transformanten wurden durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert. Das Vorhandensein des funktionalen aveC-Gens in trans konnte die normale Avermectinproduktion für den Stamm SE180-11 wiederherstellen (5B).
8.2. Analyse von Mutationen in dem aveC-Gen, die Klasse-B2:B1-Verhältnisse ändern
Wie im Vorhergehenden beschrieben, wurde der S. avermitilis-Stamm SE180-11, der ein inaktives aveC-Gen enthielt, durch Transformation mit einem Plasmid, das ein funktionales aveC-Gen enthielt, (pSE186) komplementiert. Der Stamm SE180-11 wurde auch als Wirtsstamm zur Charakterisierung anderer Mutationen in dem aveC-Gen verwendet, was im Folgenden beschrieben wird.
Chromosom-DNA wurde aus Stamm 1100-SC38 isoliert und als Templat zur PCR-Amplifikation des aveC-Gens verwendet. Das 1,2-kb-ORF wurde durch PCR-Amplifikation unter Verwendung von auf der Basis der aveC-Nucleotidsequenz gestalteten Primern isoliert. Der rechtsseitige Primer war die SEQ ID NO: 6, und der linksseitige Primer war die SEQ ID NO: 7 (siehe obiger Abschnitt 7.1.10). Die PCR- und Subklonierungsbedingungen waren wie in Abschnitt 7.1.10 beschrieben. Die DNA-Sequenzanalyse des 1,2-kb-ORF zeigt eine Mutation in dem aveC-Gen, die die Nucleotidposition 337 von C zu T ändert, die die Aminosäure an Position 55 von Serin (S) zu Phenylalanin (F) ändert. Das aveC-Gen, das die S55F-Mutation enthält, wurde in PWHM3 subkloniert, wobei ein Plasmid produziert wurde, das als pSE187 bezeichnet wurde, und das zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms SE180-11 verwendet wurde. Thiostrepton-resistente Transformanten des Stamms SE180-11 wurden isoliert, das Vorhandensein von Erythromycin-Resistenz wurde bestimmt, und Thio^r-Erm^r-Transformanten wurden durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert. Das Vorhandensein des aveC-Gens mit Codierung für eine Änderung am Aminosäurerest 55 (S55F) konnte eine normale Avermectinproduktion für den Stamm SE180-11 wiederherstellen (5C); jedoch betrug das Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Verhältnis etwa 26:1 im Vergleich zu dem Stamm SE180-11, der mit pSE186 transformiert war, der ein B2:B1-Verhältnis von etwa 1,6:1 aufwies (Tabelle 3), was anzeigt, dass die Einzelmutation (S55F) die produzierte Menge von Cyclohexyl-B2 gegenüber Cyclohexyl-B1 moduliert.
Eine weitere Mutation in dem aveC-Gen, die die Nucleotidposition 862 von G zu A ändert, die die Aminosäure an Position 230 von Glycin (G) zu Aspartat (D) ändert, wurde identifiziert. Ein S. avermitilis-Stamm mit dieser Mutation (G230D) produziert Avermectine mit einem B2:B1-Verhältnis von etwa 30:1.
8.3. Mutationen, die das B2:B1-Verhältnis verringern
Mehrere Mutationen, die die produzierte Menge von Cyclohexyl-B2 gegenüber Cyclohexyl-B1 verringern, wurden wie folgt konstruiert.
Eine Mutation in dem aveC-Gen, die die Nucleotidposition 588 von G zu A ändert, was die Aminosäure an Position 139 von Alanin (A) zu Threonin (T) ändert, wurde identifiziert. Das die A139T-Mutation enthaltende aveC-Gen wurde in pWHM3 subkloniert, wobei ein Plasmid produziert wurde, das als pSE188 bezeichnet wurde und das zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms SE180-11 verwendet wurde. Thiostrepton-resistente Transformanten des Stamms SE180-11 wurden isoliert, das Vorhandensein von Erythromycin-Resistenz wurde bestimmt, und Thio^r-Erm^r-Transformanten wurden durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert. Das Vorhandensein des mutierten aveC-Gens mit Codierung für eine Änderung an Aminosäurerest 139 (A139T) konnte die Avermectinproduktion für den Stamm SE180-11 wiederherstellen (5D); jedoch betrug das B2:B1-Verhältnis etwa 0,94:1, was anzeigt, dass diese Mutation die produzierte Menge von Cyclohexyl-B2 gegenüber Cyclohexyl-B1 verringert. Dieses Verhältnis war unerwartet, da veröffentlichte Ergebnisse sowie die oben beschriebenen Ergebnisse von Mutationen nur entweder eine Inaktivierung des aveC-Gens oder eine erhöhte Produktion der B2-Form von Avermectin gegenüber der B1-Form zeigten (Tabelle 3).
Da die A139T-Mutation die B2:B1-Verhältnisse in der günstigeren B1-Richtung änderte, wurde eine Mutation konstruiert, die ein Threonin anstelle eines Serins an der Aminosäureposition 138 codiert. Daher wurde pSE186 mit EcoRI verdaut und in pGEM3Zf (Promega), das mit EcoRI verdaut worden war, kloniert. Dieses Plasmid, das als pSE186a bezeichnet wurde, wurde mit ApaI und KpnI verdaut, die DNA-Fragmente wurden auf einem Agarosegel getrennt und zwei Fragmente von ~3,8 kb und ~0,4 kb wurden aus dem Gel gereinigt. Die ~1,2-kb-Insert-DNA von pSE186 wurde als PCR-Templat zur Einführung einer Einzelbasenänderung an der Nucleotidposition 585 verwendet. Die PCR-Primer wurden zur Einführung einer Mutation an der Nucleotidposition 585 gestaltet und von Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas) erhalten. Der rechtsseitige PCR-Primer war: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCCCTGGCGACG-3' (SEQ ID NO: 12); und der linksseitige PCR-Primer war: 5'-GGAACCGACCGCCTGATACA-3' (SEQ ID NO: 13). Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung eines Advantage GC Genomic PCR Kit (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) in vom Hersteller geliefertem Puffer in Gegenwart von 200 μM dNTPs, 200 pmol jedes Primers, 50 ng Templat-DNA, 1,0 M GC-Melt und 1 Einheit KlenTaq Polymerase Mix in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt. Das Wärmeprofil des ersten Zyklus war 94 °C während 1 min; anschließend 25 Zyklen mit 94 °C während 30 s und 68 °C während 2 min; und 1 Zyklus bei 68 °C während 3 min. Ein PCR-Produkt von 295 bp wurde mit ApaI und KpnI verdaut, wobei ein Fragment von 254 bp freigesetzt wurde, das durch Elektrophorese aufgetrennt und aus dem Gel gereinigt wurde. Alle drei Fragmente (~3,8 kb, ~0,4 kb und 254 bp) wurden in einer 3-Wege-Ligation zusammenligiert. Das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli-DH5α-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid wurde als pSE198 bezeichnet.
pSE198 wurde mit EcoRI verdaut, in pWHM3, das mit EcoRI verdaut worden war, kloniert und in E. coli-DH5α-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzanalyse festgestellt. Diese Plasmid-DNA wurde in E. coli DM1 transformiert, Plasmid-DNA wurde aus Ampicillinresistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid, das als pSE199 bezeichnet wurde, wurde zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms SE180-11 verwendet. Thiostreptonresistente Transformanten des Stamms SE180-11 wurden isoliert, das Vorhandensein von Erythromycin-Resistenz wurde bestimmt, und Thio^r-Erm^r-Transformanten wurden durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert. Das Vorhandensein des mutierten aveC-Gens mit Codierung für eine Änderung an Aminosäurerest 138 (S138T) konnte eine normale Avermectin-Produktion für den Stamm SE180-11 wiederherstellen; jedoch betrug das B2:B1-Verhältnis 0,88:1, was anzeigt, dass diese Mutation die produzierte Menge von Cyclohexyl-B2 gegenüber Cyclohexyl-B1 verringert (Tabelle 3). Dieses B2:B1-Verhältnis ist noch niedriger als das 0,94:1-Verhältnis, das mit der A139T-Mutation, die durch Transformation des Stamms SE180-11 mit pSE188 produziert wurde, wie oben beschrieben wurde, beobachtet wurde.
Eine weitere Mutation wurde zur Einführung eines Threonins an den beiden Aminosäurepositionen 138 und 139 konstruiert. Die ~1,2 kb-Insert-DNA von pSE186 wurde als PCR-Templat ver wendet. Die PCR-Primer wurden zur Einführung von Mutationen an den Nucleotidpositionen 585 und 588 gestaltet und von Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas) erhalten. Der rechtsseitige PCR-Primer war: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGACC-3' (SEQ ID NO: 14); und der linksseitige PCR-Primer war: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO: 15). Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung der unmittelbar vorher in diesem Abschnitt beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Ein PCR-Produkt von 449 bp wurde mit ApaI und KpnI verdaut, wobei ein Fragment von 254 bp freigesetzt wurde, das durch Elektrophorese aufgetrennt und aus dem Gel gereinigt wurde pSE186a wurde mit ApaI und KpnI verdaut, und zwei Fragmente von ~3,8 kb und ~0,4 kb wurden aus dem Gel gereinigt. Alle drei Fragmente (~3,8 kb, ~0,4 kb und 254 bp) wurden in einer 3-Wege-Ligation zusammenlegiert, und das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli-DH5α-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid wurde als pSE230 bezeichnet.
pSE230 wurde mit EcoRI verdaut, in pWHM3, das mit EcoRI verdaut worden war, kloniert, und in E, coli-DH5α-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzanalyse festgestellt. Diese Plasmid-DNA wurde in E. coli-DM1 transformiert, Plasmid-DNA wurde aus Ampicillinresistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid, das als pS231 bezeichnet wurde, wurde zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms SE180-11 verwendet. Thiostrepton-resistente Transformanten von SE180-11 wurden isoliert, das Vorhandensein von Erythromycin-Resistenz wurde bestimmt, und Thio^r-Erm^r-Transformanten wurden durch Fermentation analysiert.
Das Vorhandensein des doppelt mutierten aveC-Gens mit Codierung für S138T/A139T konnte eine normale Avermectin-Produktion für den Stamm SE180-11 wiederherstellen; jedoch betrug das B2:B1-Verhältnis 0,84:1, was zeigt, dass diese Mutation die produzierte Menge von Cyclohexyl-B2 gegenüber Cyclohexyl-B1 über die Verringerungen, die durch die Transformation des Stamms SE180-11 mit pSE188 oder pSE199 erhalten wurden, wie oben beschrieben ist, hinaus weiter verringert (Tabelle 3).
Eine weitere Mutation wurde zur weiteren Verringerung der gebildeten Menge von Cyclohexyl-B2 gegenüber Cyclohexyl-B1 konstruiert. Da die S138T/A139T-Mutationen die B2:B1-Verhältnisse in der günstigeren B1-Richtung änderten, wurde eine Mutation zur Einführung eines Threonins an der Aminosäureposition 138 und eines Phenlyalanins an der Aminosäureposition 139 konstruiert. Die ~1,2-kb-Insert-DNA von pSE186 wurde als PCR-Templat verwendet. Die PCR-Primer wurden zur Einführung von Mutationen an den Nucleotidpositionen 585 (Änderung eines T zu A), 588 (Änderung eines G zu T) und 589 (Änderung eines C zu T) gestaltet und von Genosys Biotechnologies, Inc. (Texas) erhalten. Der rechtsseitige PCR-Primer war: 5'-GGGGGCGGGCCCGGGTGCGGAGGCGGAAATGCCGCTGGCGACGTTC-3' (SEQ ID NO: 25); und der linksseitige PCR-Primer war: 5'-GGAACATCACGGCATTCACC-3' (SEQ ID NO: 15). Die PCR-Reaktion wurde unter Verwendung eines Advantage GC Genomic PCR Kit (Clontech Laboratories, Palo Alto, CA) in vom Hersteller geliefertem Puffer in Gegenwart von 200 μM dNTPs, 200 pmol jedes Primers, 50 ng Templat-DNA, 1,1 mM Mg-Acetat, 1,0 M GC-Melt und 1 Einheit Tth-DNA-Polymerase in einem Endvolumen von 50 μl durchgeführt. Das Wärmeprofil des ersten Zyklus war 94 °C während 1 min; anschließend 25 Zyklen mit 94 °C während 30 s und 68 °C während 2 min; und 1 Zyklus bei 68 °C während 3 min. Ein PCR-Produkt von 449 bp wurde mit ApaI und KpnI verdaut, wobei ein Fragment von 254 bp freigesetzt wurde, das durch Elektrophorese aufgetrennt und aus dem Gel gereinigt wurde. Alle drei Fragmente (~3,8 kb, ~0,4 kb und 254 bp) wurden in einer 3-Wege-Ligation zusammenligiert. Das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli-DH5α-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillinresistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid wurde als pSE238 bezeichnet.
pSE1238 wurde mit EcoRI verdaut, in pWHM3, das mit EcoRI verdaut worden war, kloniert und in E. coli-DH5α-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzanalyse festgestellt. Diese Plasmid-DNA wurde in E. coli DM1 transformiert, Plasmid-DNA wurde aus Ampicillinresistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid, das als pSE239 bezeichnet wurde, wurde zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms SE180-11 verwendet. Thiostreptonresistente Transformanten des Stamms SE180-11 wurden isoliert, das Vorhandensein von Erythromycin-Resistenz wurde bestimmt, und Thio^r-Erm^r-Transformanten wurden durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert. Das Vorhandensein des doppeltmutierten aveC-Gens mit Codierung für S138T/A139F konnte eine normale Avermectin-Produktion für den Stamm SE180-11 wiederherstellen; jedoch betrug das B2:B1-Verhältnis 0,75:1, was zeigt, dass diese Mutation die produzierte Menge von Cyclohexyl-B2 gegenüber Cyclohexyl-B1 über die Verringerungen, die durch die Transformation von Stamm SE180-11 mit pSE188, pSE199 oder pSE231 bereitgestellt wurden, wie im Vorhergehenden beschrieben, hinaus weiter verringert.
Tabelle 3
Weitere Mutationen wurden zur weiteren Verringerung der produzierten Menge von Cyclohexyl-B2 gegenüber Cyclohexyl-B1 unter Verwendung des Verfahrens des DNA-Shuffling gemäß der Beschreibung bei Stemmer, 1994, Nature 370:389–391; und Stemmer, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:10747–10751; und ferner gemäß der Beschreibung in den US-Patenten 5605793, 5811238, 5830721 und 5837458 konstruiert.
Durch DNA-Shuffling erhaltene Plasmide, die mutierte aveC-Gene enthalten, wurden in kompetente dam-dcm-E. coli-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten reduziert und zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms SE180-11 verwendet. Thiostrepton-resistente Transformanten des Stamms SE180-11 wurden isoliert und auf die Produktion von Avermectinen mit einem Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Verhältnis von 1:1 oder weniger durchmustert. Die DNA-Sequenz von Plasmid-DNA von SE180-11-Transformanten, die Avermectine mit einem B2:B1-Verhältnis von 1:1 oder weniger produzieren, wurde bestimmt.
Acht Transformanten, die verringerte Mengen von Cyclohexyl-B2 gegenüber Cyclohexyl-B1 produzierten, wurden identifiziert. Das niedrigste B2:B1-Verhältnis, das von diesen Transformanten erreicht wurde, war 0,4:1 (Tabelle 4). Plasmid-DNA wurde von jeder der acht Transformanten isoliert, und die DNA-Sequenz wurde bestimmt, um die Mutationen in dem aveC-Gen zu identifizieren. Die Mutationen sind die folgenden:
pSE290 enthält 4 Nucleotidmutationen an der Nucleotidposition 317 von T zu A, an der Nucleotidposition 353 von C zu A, an der Nucleotidposition 438 von G zu A und an der Nucleotidposition 1155 von T zu A. Die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 317 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 48 von D zu E, und die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 438 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 89 von A zu T. Das B2:B1-Verhältnis, das durch dieses Plasmid tragende Zellen produziert wurde, betrug 0,42:1 (Tabelle 4).
pSE291 enthält 4 Nucleotidmutationen an der Nucleotidposition 272 von G zu A, an der Nucleotidposition 585 von T zu A, an der Nucleotidposition 588 von G zu A und an der Nucleotidposition 708 von G zu A. Die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 585 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 138 von S zu T, und die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 588 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 139 von A zu T und die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 708 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 179 von G zu S. Das B2:B1-Verhältnis, das durch dieses Plasmid tragende Zellen produziert wurde, betrug 0,57:1 (Tabelle 4).
pSE292 enthält die gleichen 4 Nucleotidmutationen wie pSE290. Das B2:B1-Verhältnis, das durch dieses Plasmid tragende Zellen produziert wurde, betrug 0,40:1 (Tabelle 4).
pSE293 enthält 6 Nucleotidmutationen an der Nucleotidposition 24 von A zu G, an der Nucleotidposition 286 von A zu C, an der Nucleotidposition 497 von T zu C, an der Nucleotidposition 554 von C zu T, an der Nucleotidposition 580 von T zu C und an der Nucleotidposition 886 von A zu T. Die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 286 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 38 von Q zu P, die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 580 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 136 von L zu P, und die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 886 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 238 von E zu D.
Das B2:B1-Verhältnis, das durch dieses Plasmid tragende Zellen produziert wurde, betrug 0,68:1 (Tabelle 4).
pSE294 enthält b Nucleotidmutationen an der Nucleotidposition 469 von T zu C, an der Nucleotidposition 585 von T zu A, an der Nucleotidposition 588 von G zu A, an der Nucleotidposition 708 von G zu A, an der Nucleotidposition 833 von C zu T und an der Nucleotidposition 1184 von G zu A. Zusätzlich sind die Nucleotide an den Positionen 173, 174 und 175 deletiert. Die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 469 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 99 von F zu S, die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 585 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 138 von S zu T, die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 588 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 139 von A zu T, und die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 708 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 179 von G zu S. Das B2:B1-Verhältnis, das durch dieses Plasmid tragende Zellen produziert wurde, betrug 0,53:1 (Tabelle 4).
pSE295 enthält 2 Nucleotidmutationen am Nucleotid 588 von G zu A und am Nucleotid 856 von T zu C. Die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 588 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 139 von A zu T, und die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 856 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 228 von M zu T. Das B2:B1-Verhältnis, das durch dieses Plasmid tragende Zellen produziert wurde, betrug 0,80:1 (Tabelle 4).
pSE296 enthält 5 Nucleotidmutationen an der Nucleotidposition 155 von T zu C, an der Nucleotidposition 505 von G zu T, an der Nucleotidposition 1039 von C zu T, an der Nucleotidposition 1202 von C zu T und an der Nucleotidposition 1210 von T zu C. Die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 505 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 111 von G zu V, und die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 1039 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 289 von P zu L. Das B2:B1-Verhältnis, das durch dieses Plasmid tragende Zellen produziert wurde, betrug 0,73:1 (Tabelle 4).
pSE297 enthält 4 Nucleotidmutationen an der Nucleotidposition 377 von G zu T, an der Nucleotidposition 588 von G zu A, an der Nucleotidposition 633 von A zu G und an der Nucleotidposition 1067 von A zu T. Die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 588 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 139 von A zu T, und die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 633 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 154 von K zu E, und die Nucleotidänderung an der Nucleotidposition 1067 ändert die Aminosäure an der Aminosäureposition 298 von Q zu H. Das B2:B1-Verhältnis, das durch dieses Plasmid tragende Zellen produziert wurde, betrug 0,67:1 (Tabelle 4).
Tabelle 4
9. Beispiel: Konstruktion von 5'-Deletionsmutanten
Wie im obigen Abschnitt 5.1 erklärt, umfasst die in 1 gezeigte S. avermitilis-Nucleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) vier unterschiedliche GTG-Codons an den bp-Positionen 42, 174, 177 und 180, die potentielle Startstellen sind. Dieser Abschnitt beschreibt die Konstruktion mehrfacher Deletionen der 5'-Region des aveC-ORF (1; SEQ ID NO: 1), um die Festlegung, welche dieser Codons als Startstellen der Proteinexpression in dem aveC-ORF fungieren könnten, zu unterstützen.
Fragmente des aveC-Gens, die am 5'-Ende in verschiedener Weise deletiert sind, wurden durch PCR-Amplifikation aus S. avermitilis-Chromosom-DNA isoliert. Die PCR-Primer wurden auf der Basis der aveC-DNA-Sequenz gestaltet und von Genosys Biotechnologies, Inc. erhalten. Die rechtsseitigen Primer waren:5'-AACCCATCCGAGCCGCTC-3' (SEQ ID NO: 16) (D1F1); 5'-TCGGCCTGCCAACGAAC-3' (SEQ ID NO: 17) (D1F2); 5'-CCAACGAACGTGTAGTAG-3' (SEQ ID NO: 18) (D1F3) und 5'-TGCAGGCGTACGTGTTCAGC-3' (SEQ ID NO: 19) (D2F2). Die linksseitigen Primer waren 5'-CATGATCGCTGAACCGA-3' (SEQ ID NO: 20); 5'-CATGATCGCTGAACCGAGGA-3' (SEQ ID NO: 21) und 5'-AGGAGTGTGGTGCGTCTGGA-3' (SEQ ID NO: 22). Die PCR-Reaktion wurde wie im obigen Abschnitt 8.3 beschrieben durchgeführt.
Die PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in einem 1 % Agarosegel getrennt und Einzel-DNA-Banden von entweder ~1,0 kb oder ~1,1 kb wurden detektiert. Die PCR-Produkte wurden aus dem Gel gereinigt und mit 25 ng eines linearisierten pCR2.1-Vektors (Invitrogen) in einem Vektor/Insert-Molverhältnis von 1/10 gemäß den Vorschriften des Herstellers ligiert. Die Ligationsgemische wurden zur Transformation von One Shot^TM Competent-E. coli-Zellen (Invitrogen) gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des Inserts wurde Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzanalyse festgestellt. Diese Plasmide wurden als pSE190 (mit dem Primer D1F1 erhalten), pSE191 (mit dem Primer D1F2 erhalten), pSE192 (mit dem Primer D1F3 erhalten) und pSE193 (mit dem Primer D2F2 erhalten) bezeichnet.
Die Insert-DNAs wurden jeweils mit BamHI/Xbal verdaut, durch Elektrophorese getrennt, aus dem Gel gereinigt und getrennt mit dem Shuttlevektor pWHM3, der mit BamHI/Xbal verdaut worden war, in einer Gesamt-DNA-Konzentration von 1 μg in einem Vektor/Insert-Molverhältnis von 1/5 ligiert. Die Ligationsgemische wurden zur Transformation kompetenter E. coli-DH5α-Zellen verwendet. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillinresistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des Inserts wurde Restriktionsanalyse festgestellt. Diese Plasmide, die als pSE194 (D1F1), pSE195 (D1F2), pSE196 (D1F3) und pSE197 (D2F2) bezeichnet wurden, wurden jeweils getrennt in den E. coli-Stamm DM1 transformiert, Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Diese DNA wurde zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms SE180-11 verwendet. Thiostrepton-resistente Transformanten des Stamms SE180-11 wurden isoliert, das Vorhandensein von Erythromycin-Resistenz wurde bestimmt, und Thio^rErm^r-Transformanten wurden durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert, um zu bestimmen, welche GTG-Stellen zur aveC-Expression notwendig waren. Die Ergebnisse zeigen, dass das GTG-Codon an Position 42 ohne Beeinflussung der aveC-Expression eliminiert werden kann, da pSE194, pSE195 und pSE196, denen jeweils die GTG-Stelle an Position 42 fehlt, die jedoch alle die drei GTG-Stellen an den Positionen 174, 177 und 180 enthalten, eine normale Avermectin-Produktion wiederherstellen konnten, wenn sie in SE180-11 transformiert wurden. Eine normale Avermectin-Produktion wurde nicht wiederhergestellt, wenn der Stamm SE180-11 mit pSE197, dem alle vier GTG-Stellen fehlen, transformiert wurde (Tabelle 5).
Tabelle 5
10. Beispiel: Klonierung von aveC-Homologa von S. hygroscopicus und S. griseochromogenes
Die vorliegende Erfindung ermöglicht die Identifizierung und Klonierung von aveC-Homologgenen von anderen Avermectin oder Milbemycin produzierenden Arten von Streptomyces. Beispielsweise wurde eine Cosmidbibliothek von S. hygroscopicus (FERM BP-1901)-Genom-DNA mit der oben beschriebenen 1,2-kb-aveC-Sonde von S. avermitilis hybridisiert. Mehrere Cosmidklone, die stark hybridisierten, wurden identifiziert. Chromosom-DNA wurde aus diesen Cosmiden isoliert, und ein 4,9-kb-KpnI-Fragment, das mit der aveC-Sonde hybridisierte, wurde identifiziert. Diese DNA wurde sequenziert, und ein ORF (SEQ ID NO: 3), das signifikante Homologie mit dem aveC-ORF von S. avermitilis aufwies, wurde identifiziert. Eine von dem S. griseochromogenes-aveC-Homolog-ORF abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 4) ist in 6 dargestellt.
Ferner wurde eine Cosmidbibliothek von S. griseochromogenes-Genom-DNA mit der oben beschriebenen 1,2-kb-aveC-Sonde von S. avermitilis hybridisiert. Mehrere Cosmidklone, die stark hybridisierten, wurden identifiziert. Chromosom-DNA wurde aus diesen Cosmiden isoliert, und ein 5,4-kb-PstI-Fragment, das mit der aveC-Sonde hybridisiert, wurde identifiziert. Diese DNA wurde sequenziert und ein partielles aveC-Homolog-ORF, das signifikante Homologie mit dem aveC-ORF von S. avermitilis aufwies, wurde identifiziert. Eine abgeleitete partielle Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 5) ist in 6 dargestellt.
Die DNA- und Aminosäuresequenzanalyse der aveC-Homologa von S. hygroscopicus und S. griseochromogenes zeigt, dass diese Regionen eine signifikante Homologie (~50 % Sequenzidentität auf der Aminosäureebene) sowohl zueinander als auch zu dem S. avermitilis-aveC-ORF und -AveC-Genprodukt gemeinsam haben (6).
11. Beispiel: Konstruktion eines Plasmids mit dem aveC-Gen hinter dem ermE-Promotor
Ein 1,2-kb-aveC-ORF von pSE186 wurde in pSE34, das der Shuttlevektor pWHM3, der den 300-bp-ermE-Promotor als KpnI/BamHI-Fragment an der KpnI/BamHI-Stelle von pWHM3 insertiert aufweist, ist (siehe Ward et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 203:468–478), subkloniert. pSE186 wurde mit BamHI und HindIII verdaut, der Verdau wurde Elektrophorese aufgetrennt, und das 1,2-kb-Fragment wurde aus dem Agarosegel isoliert und mit pSE34, das mit BamHI und HindIII verdaut worden war, ligiert. Das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli-DH5α-Zellen gemäß den Vorschriften des Herstellers transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillinresistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des 1,2-kb-Inserts wurde durch Restriktionsanalyse festgestellt. Dieses Plasmid, das als pSE189 bezeichnet wurde, wurde in E. coli DM1 transformiert, und Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert. Protoplasten des S. avermitilis-Stamms 1100-SC38 wurden mit pSE189 transformiert. Thiostrepton-resistente Transformanten des Stamms 1100-SC38 wurden isoliert und durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert.
Transformanten des S. avermitilis-Stamms 1100-SC38, die pSE189 enthielten, waren hinsichtlich der produzierten Avermectin-Cyclohexyl-B2:Avermectin-Cyclohexyl-B1-Verhältnisse (etwa 3:1) im Vergleich zu Stamm 1100-SC38 (etwa 34:1) verändert, und die Gesamt-Avermectinproduktion war im Vergleich zu Stamm 1100-SC38, der mit pSE119 transformiert war, auf das etwa 2,4-fache erhöht (Tabelle 6).
pSE189 wurde ferner in Protoplasten eines S. avermitilis-Stamms des Wildtyps transformiert. Thiostrepton-resistente Transformanten wurden isoliert und durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert. Die Gesamtmenge von Avermectinen, die durch den mit pSE189 transformierten S. aver mitilis-Wildtyp produziert wurde, war im Vergleich zu S. avermitilis des Wildtyps, das mit pSE119 transformiert, wurde, auf das etwa 2,2-fache erhöht (Tabelle 6).
Tabelle 6
12. Beispiel: Chimäres Plasmid, das Sequenzen von sowohl S. avermitilis-aveC-ORF als auch S. hygroscopicus-aveC-Homolog enthält
Ein Hybridplasmid der Bezeichnung pSE350, das einen Teil von 564 bp des S. hygroscopicus-aveC-Homolog unter Ersetzen eines homologen Teils von 564 bp des S. avermitilis-aveC-ORF enthält (7), wurde wie folgt konstruiert. pSE350 wurde unter Verwendung einer BsaAT-Restriktionsstelle, die in beiden Sequenzen konserviert ist (aveC-Position 225), und einer KpnI- Restriktionsstelle, die in dem S. avermitilisaveC-Gen vorhanden ist (aveC-Position 810), konstruiert. Die KpnI-Stelle wurde in die S. hygroscopicus-DNA durch PCR unter Verwendung des rechtsseitigen Primers 5'-CTTCAGGTGTACGTGTTCG-3' (SEQ ID NO: 23) und des linksseiti gen Primers 5'-GAACTGGTRCCRGTGCCC-3' (SEQ ID NO: 24) (erhalten von Genosys Biotechnologies) unter Verwendung der im obigen Abschnitt 7.1.10 beschriebenen PCR-Bedingungen eingeführt. Das PCR-Produkt wurde mit BsaAI und KpnI verdaut, die Fragmente wurden durch Elektrophorese in einem 1 % Agarosegel getrennt, und das BsAI/KpnI-Fragment von 564 bp wurde aus dem Gel isoliert. pSE179 (Beschreibung im obigen Abschnitt 17.1.10) wurde mit KpnI und HindIII verdaut, die Fragmente wurden durch Elektrophorese in einem 1 % Agarosegel getrennt, und ein Fragment von ~4,5 kb wurde aus dem Gel isoliert. pSE179 wurde mit HindIII und BsaAI verdaut, die Fragmente wurden durch Elektrophorese in einem 1 % Agarosegel getrennt, und ein BsAI/HindIII-Fragment von ~0,2 kb wurde aus dem Gel isoliert. Das HindIII/ KpnI-Fragment von ~4,5 kb, das BsAI/HindIII-Fragment von ~0,2 kb und das BsAl/KpnI-Fragment von 564 bp aus S. hygroscopicus wurden in einer 3-Wege-Ligation zusammenligiert, und das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli-DH5α-Zellen transformiert. Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von KpnI und AvaI festgestellt. Dieses Plasmid wurde mit HindIII und XbaI verdaut, wobei das 1,2-kb-Insert freigesetzt wurde, das dann mit pWHM3, das mit HindIII und XbaI verdaut worden war, ligiert wurde. Das Ligationsgemisch wurde in kompetente E. coli-DH5α-Zellen transformiert, Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse unter Verwendung von HindIII und AvaI festgestellt. Diese Plasmid-DNA wurde in E. coli DM1 transformiert, Plasmid-DNA wurde aus Ampicillin-resistenten Transformanten isoliert, und das Vorhandensein des korrekten Inserts wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzanalyse festgestellt. Dieses Plasmid wurde als pSE350 bezeichnet und zur Transformation von Protoplasten des S. avermitilis-Stamms SE180-11 verwendet. Thiostrepton-resistente Transformanten des Stamms SE180-11 wurden isoliert, das Vorhandensein von Erythromycin-Resistenz wurde bestimmt und Thio^r-Erm^r-Transformanten wurden durch HPLC-Analyse von Fermentationsprodukten analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass Transformanten, die das S. avermitilis/S. hygroscopicus-Hybridplasmid enthalten, ein durchschnittliches B2:B1-Verhältnis von etwa 109:1 aufweisen (Tabelle 7).
Hinterlegung biologischer Materialien
Das folgende biologische Material wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) in 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, 20852, USA am 29. Januar 1998 hinterlegt und erhielt die folgenden Hinterlegungsnummern zugeordnet:

Plasmid Hinterlegungs-Nr.

Plasmid pSE180 209605

Plasmid pSE186 209604
Die vorliegende Erfindung soll durch die hier beschriebenen speziellen Ausführungsformen, die einzelne Erläuterungen individueller Aspekte der Erfindung sein sollen, hinsichtlich des Umfangs nicht beschränkt sein, und funktional äquivalente Verfahren und Komponenten liegen innerhalb des Umfangs der Erfindung. Tatsächlich sind verschiedene Modifikationen der Erfindung zusätzlich zu den hier angegebenen und beschriebenen dem Fachmann aus der vorhergehenden Beschreibung und den beigefügten Zeichnungen offensichtlich. Derartige Modifikationen sollen in den Schutzumfang der beigefügten Ansprüche fallen.
Sequenzprotokoll

Claims

Polynucleotidmolekül, das die Nucleotidsequenz des aveC-Allels von Streptomyces avermitilis oder die das AveC-Genprodukt codierende Sequenz des Plasmids pSE186 (ATCC 209604) oder die Nucleotidsequenz des aveC-ORF von S. avermitilis, die in 1 dargestellt ist, (SEQ ID NO: 1) oder eine Variante derselben, die eine oder mehrere stille Änderungen der Nucleotidsequenz gemäß der Entartung des genetischen Codes enthält, umfasst, das jedoch ferner mindestens eine erste Mutation, die eine Aminosäuresubstitution von Serin zu Threonin bei einem der Aminosäureposition 138 in SEQ ID NO: 2 entsprechenden Aminosäurerest des AveC-Genprodukts codiert, und eine zweite Mutation, die eine Aminosäuresubstitution vom Alanin zu Phenylalanin bei einem der Aminosäureposition 139 in SEQ ID NO: 2 entsprechenden Aminosäurerest des AveC-Genprodukts codiert, derart umfasst, dass Zellen vom S. avermitilis Stamm ATCC 53692, in denen das aveC-Allel des Wildtyps inaktiviert wurde und die das die mutierte Nucleotidsequenz umfassende Polynucleotidmolekül exprimieren, ein Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen produzieren, das im Vergleich zu dem Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen, das durch Zellen vom S. avermitilis Stamm ATCC 53692, die stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimieren, produziert wurde, verringert ist.
Polynucleotidmolekül nach Anspruch 1, wobei die Klasse-2:1-Avermectine Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine sind.
Polynucleotidmolekül nach Anspruch 2, wobei das verringerte Verhältnis von Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1 0,75:1 oder weniger beträgt.
Rekombinanter Vektor, der das Polynucleotidmolekül nach Anspruch 1 umfasst.
Rekombinanter Vektor mit der Fähigkeit zur Mutation des aveC-Allels von Streptomyces avermitilis durch Einführen von mindestens einer ersten Mutation, die eine Aminosäuresubstitution von Serin zu Threonin bei einem der Aminosäureposition 138 in SEQ ID NO: 2 entsprechenden Aminosäurerest des AveC-Genprodukts codiert, und einer zweiten Mutation, die eine Aminosäuresubstitution von Alanin zu Phenylalanin bei einem der Aminosäureposition 139 in SEQ ID NO: 2 entsprechenden Aminosäurerest des AveC-Genprodukts codiert, der ein Polynucleotidmolekül mit einer eine derartige Mutation codierenden Nucleotidsequenz umfasst.
Rekombinanter Vektor nach Anspruch 5, der das Polynucleotidmolekül nach Anspruch 1 umfasst.
Streptomyces-Wirtszelle, die das Polynucleotidmolekül nach Anspruch 1 oder den rekombinanten Vektor nach Anspruch 4 oder 5 umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines neuen Stamms von Streptomyces avermitilis, der Zellen umfasst, die ein mutiertes aveC-Allel exprimieren und ein verringertes Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms von S. avermitilis, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, produzieren, wobei das Verfahren umfasst: (a) Einführen eines Polynucleotidmoleküls in eine Zelle eines Stamms von S. avermitilis, wobei das Polynucleotid molekül ein mutiertes aveC-Allel oder eine Variante desselben, die eine oder mehrere stille Änderungen der Nucleotidsequenz gemäß der Entartung des genetischen Codes enthält, trägt, das ein AveC-Genprodukt codiert, das mindestens eine erste Aminosäuresubstitution von Serin zu Threonin bei einem der Aminosäureposition 138 in SEQ ID NO: 2 entsprechenden Aminosäurerest und eine zweite Aminosäuresubstitution von Alanin zu Phenylalanin bei einem der Aminosäureposition 139 in SEQ ID NO: 2 entsprechenden Aminosäurerest umfasst, wobei die Expression des Genprodukts zu einer Verringerung des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, die das mutierte aveC-Allel oder eine entartete Variante desselben exprimieren, produziert wurden, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, führt, und Selektieren von Zellen, die Avermectine in einem verringerten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu dem Klasse-2:1-Verhältnis, das durch Zellen des Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, erhalten wurde, produzieren; oder (b) Einführen von einem oder mehreren Polynucleotidmolekülen in eine Zelle eines Stamms von S. avermitilis, wobei die Polynucleotidmoleküle zum Einführen von mindestens zwei Mutationen in das aveC-Allel derart, dass diese Zellen ein AveC-Genprodukt mit mindestens einer ersten Aminosäuresubstitution von Serin zu Threonin bei einem der Aminosäureposition 138 in SEQ ID NO: 2 entsprechenden Aminosäurerest und einer zweiten Aminosäuresubstitution von Alanin zu Phenylalanin bei einem der Aminosäureposition 139 in SEQ ID NO: 2 entsprechenden Aminosäurerest codieren, fähig sind, wobei die Expression des Genprodukts zu einer Verringerung des Klasse-2:1-Verhältnisses von Avermectinen, die durch Zellen eines Stamms von S. avermitilis, die das mutierte aveC-Allel exprimieren, produziert wurden, im Vergleich zu Zellen des gleichen Stamms, der stattdessen nur das aveC- Allel des Wildtyps exprimiert, führt, und Selektieren von Zellen, die Avermectine in einem verringerten Klasse-2:1-Verhältnis im Vergleich zu dem Klasse-2:1-Verhältnis, das durch Zellen des Stamms, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps exprimiert, erhalten wurde, produzieren.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Klasse-2:1-Avermictine Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine sind.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei das verringerte Verhältnis von Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1 0,75:1 oder weniger beträgt.
Streptomyces avermitilis-Zelle, die ein mutiertes aveC-Allel umfasst, das eine erste Mutation, die eine Aminosäuresubstitution von Serin zu Threonin bei einem der Aminosäureposition 138 in SEQ ID NO: 2 entsprechenden Aminosäurerest codiert, und eine zweite Mutation, die eine Aminosäuresubstitution von Alanin zu Phenylalanin bei einem der Aminosäureposition 139 in SEQ ID NO: 2 entsprechenden Aminosäurerest codiert, umfasst.
Zelle nach Anspruch 11, die ein verringertes Klasse-2:1-Verhältnis von Avermectinen im Vergleich zu einer Zelle des gleichen Stamms von Streptomyces avermitilis, der stattdessen nur das aveC-Allel des Wildtyps umfasst, produziert.
Zelle nach Anspruch 12, wobei die Klasse-2:1-Avermectine Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1-Avermectine sind.
Zelle nach Anspruch 13, wobei das verringerte Verhältnis von Cyclohexyl-B2:Cyclohexyl-B1 0,75:1 oder weniger beträgt.
Verfahren zur Herstellung von Avermectinen, das das Kultivieren von Zellen nach Anspruch 11 in Kulturmedien unter Bedingungen, die die Produktion von Avermectinen aus diesen gestatten oder induzieren, und das Gewinnen der Avermectine aus der Kultur umfasst.