MXPA00006122A

MXPA00006122A - Clonacion de expresion de hongos filamentosos

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Publication number: MXPA00006122A
Application number: MXPA/A/2000/006122A
Authority: MX
Inventors: Den Brink Johannes Maarten Van; Gerard Cornelis Maria Selten; Den Hombergh Johannes Petrus Theodorus Wilhelmus Van
Original assignee: Dsm Nv; Gerard Cornelis Maria Selten; Den Brink Johannes Maarten Van; Den Hombergh Johannes Petrus Theodorus Wilhelmus Van
Priority date: 1997-12-22
Filing date: 2000-06-20
Publication date: 2001-07-31

Abstract

Se proporcionan métodos para el aislamiento de ADN que codifican para proteínas con propiedades de interés por medio de la clonación de expresión en células huésped de hongos filamentosos. Las secuencias de ADN aisladas sonútiles en procesos para producir las proteínas de interés.

Description

CLONACIÓN DE EXPRESIÓN DE HONGOS FILAMENTOSOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con métodos para la identificación de secuencias de ADN que codifican para proteínas de ínteres por clonación de expresión utilizando hongos filamentosos como huespedes.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Un numero creciente de componentes proteicos con propiedades interesantes es producido por medio de la tecnología de ADN reco binante. La tecnología de producción del ADN recombinante requiere la disponibilidad de una secuencia de ADN que codifique para el componente proteico de ínteres. Los métodos convencionales de clonar secuencias de ADN que codifiquen para proteínas de ínteres tiene la desventaja de que cada componente proteico tiene que ser purificado para permitir la determinación de su secuencia de aminoácidos (parcial) o, alternativamente, para permitir la generación de anticuerpos específicos. Las secuencias de aminoácidos (parciales) pueden entonces ser utilizadas para diseñar sondas oligonucleotidicas para la separación por hibridación. De manera alternativa, los anticuerpos específicos son utilizados para mmunoseleccionar bibliotecas de expresión en E. coli , tales como por ejemplo REF. 120837 lambda-gtll. Ambos métodos requieren la purificación y caracterización de la protema de ínteres, lo cual es un proceso que consume tiempo. La clonación de componentes proteicos novedosos puede por lo tanto ser considerablemente acelerada mediante el uso de un método de separación que implica seleccionar clonas que expresan una activada proteica deseada . Tales métodos de separación basados en la clonación de expresión han sido utilizados de manera exitosa anteriormente para la identificación de productos genéticos procapoticos, en, por ejemplo Bacillus (véase la US 4,469,791) y E. coli (por ejemplo la WO 95/18219 y WO 95/34662). En algunos casos, también han sido identificados productos genéticos eucarioticos utilizando la clonación de expresión en una bacteria tal como E. coli (por ejemplo la WO 97/13853) . Sin embargo en general los procariotes son huespedes menos adecuados para la clonación de expresión de genes eucarioticos debido a que muchos de esos genes no son expresados correctamente en bacterias. Por ejemplo, los genes eucarioticos con frecuencia contienen mtrones los cuales no se empalman en bacterias. Aunque este problema de empalme puede ser evitado utilizando ADNc de genes eucapoticos para la clonación de expresión en bacterias, muchos productos genéticos eucapoticos no son producidos en forma activa en bacterias debido a que las proteínas eucarioticas no se doblan correctamente en bacterias o esas proteínas son degradadas fácilmente por proteasas bacterianas. Ademas las bacterias generalmente son incapaces de secretar eficientemente proteínas eucapoticas secretadas en forma activa y en contraste con los eucariotes, no tienen la capacidad para glicosilar proteínas. Mas recientemente un numero de esos problemas han sido superados mediante el uso de levaduras como huespedes para la expresión de clonación de genes eucarioticos . ?trasse et al. (Eur. J. Biochem. (1989)184; 699-706) han reportado la identificación de una a-amilasa micotica por clonación de expresión de ADN genomico micotico en levaduras Saccharomyces cerevisiae . De manera similar, la WO 93/11249 reporta la identificación de una célula nicótica por clonación de expresión de ADNc micotico S. cerevisiae. Las levaduras son, sin embargo conocidas por su pobre capacidad secretora, particularmente cuando se comparan con los hongos filamentosos. Un numero de proteínas heterologas secretoras son solo pobremente secretadas de las levaduras, si lo son (véase por ejemplo Kingman et al., 1987 Trends Biotechnol. 5_: 53-57). Ademas se sabe que las levaduras hiperglicosilan proteínas heterologas (Innis, 1989, En: Yeast genetic Engmeenng, Barr, Brake S Valenzuela (eds), Butter orth, Boston, pp 233-246). Tanto la pobre secreción como la hiperglicosilacion probablemente interfieran con la clonación de expresión en levaduras debido a que pueden reducir significativamente la oportunidad de detectar una secuencia de ADN dada que codifique para una protema con propiedades de ínteres. Esto se aplicara en particular a secuencias de ADN que codifican para muchas enzimas útiles que son producidas por eucariotes tales como los hongos filamentosos y que con frecuencia son secretadas y glicosiladas . Existe de este modo la necesidad de un sistema de clonación de expresión que optimice la oportunidad de detectar secuencias de ADN que codifiquen para proteínas secretadas y posiblemente glicosiladas, y que sea adecuado para la identificación de secuencias de ADN que codifiquen para proteínas y enzimas producidas por eucariotes, de los cuales en particular los hongos filamentosos. De manera alternativa, el sistema de clonación de expresión también deberá ser aplicable a la identificación de secuencias de ADN que codifiquen para proteínas eucarioticas o de hongos filamentosos que no sean secretadas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Construcción de un vector de expresión intermedio, pGBTOP8. Los detalles de esta ruta de construcción se presentan en el texto.

Figura 2: Construcción de los vectores de expresión pGBFin2 y pGBFin5. Los detalles de esta ruta de construcción se presentan en el texto. Figura 3: Mapa físico del pGBFinl2. Figura 4 : Mapa fisico del pGBFinll. Figura 5: Mapa físico del pGBFinl3. Figura 6: Mapa fisico del pGBFinl7. Figura 7: Mapa físico del pGBFinld. Figura 8: Mapa fisico del pGBFin22. Figura 9: Mapa fisico del pGBFinl9. Figura 10: Mapa fisico del pGBFin23. Figura 11: Mapa fisico del pGBFind. Figura 12: Mapa fisico del pAN8-l. Figura 13: Mapa fisico del pGBFinl4. Figura 1 : Mapa físico dei pGBFinl5.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método para aislar secuencias ADN que codifican para una o. más proteínas con propiedades de interés. El método preferiblemente comprende los pasos de: (a) preparar, en un vector de clonación adecuado, una biblioteca de ADN de un organismo que se sospecha es capaz de producir una o más proteínas con propiedades de interés; (b) transformar células huésped de hongos filamentosos con la biblioteca de ADN; (c) cultivar las células huésped obtenidas en (b) bajo condiciones que conduzcan a la expresión de la secuencia de ADN que codifica para las proteínas con propiedades de ínteres presentes en la biblioteca de ADN; y (d) separar las clonas de las células huésped transformadas que expresan una proteina con propiedades de ínteres mediante el análisis de las proteínas producidas en (c) . Cualquier vector de clonación capaz de transformar una célula huésped de hongo filamentoso y capaz de aceptar fragmentos de ADN de una biblioteca de ADN es adecuado para utilizarse en el método de la presente invención. Los vectores de clonación para utilizarse en la presente invención comprenden de este modo vectores de clonación integrables los cuales se integran al azar o en un sitio objetivo predeterminado en los cromosomas de la célula huésped de hongo filamentoso, asi como vectores de clonación mantenidos autónomamente tales como vectores basados en la secuencia AMA1. En un aspecto preferido de la invención, el vector de clonación integrable comprende un fragmento de ADN el cual es homologo a una secuencia de ADN en un sitio objetivo predeterminado en el genoma de la célula huésped de hongo filamentoso para dirigir la integración del vector de clonación a su sitio predeterminado. Para promover la integración dirigida, el vector de clonación es preferiblemente lmealizado antes de la transformación de la célula huésped. La lmealizacion se efectúa preferiblemente de modo que al menos uno pero preferiblemente cualquier extremo del vector de clonación sea flanqueado por secuencias homologas al sitio objetivo. La longitud de las secuencias homologas que flanquean el sitio objetivo es preferiblemente de al menos 0.5 kb, de manera mas preferible de al menos 1 kb, de manera mas preferible de al menos 2 kb. La integración del vector de clonación en un sitio predeterminado promoverá la uniformidad de los niveles de expresión en las clonas individuales en la biblioteca, incrementando por lo tanto la oportunidad de que cada clona en la biblioteca se exprese en un nivel deseado. En un aspecto mas preferido de la invención, la secuencia de ADN en el vector de clonación que es homologa al sitio objetivo se deriva de un gen el cual es capaz de un alto nivel de expresión en la célula huésped de hongo filamentoso. Un gen capaz de un alto nivel de expresión, es decir un gen altamente expresado, es definido aquí como un gen cuyo ARNm puede constituir al menos el 0.5% (peso/peso) del ARNm celular total, por ejemplo bajo condiciones inducidas, o alternativamente, un gen cuyo producto genético puede constituir al menos el 1% (peso/peso) de la proteina celular total, o, en el caso de un producto genético secretado, puede ser secretado a un nivel de al menos 0.1 g/1.

En otro aspecto preferido más de la invención el vector de clonación comprende un promotor para la expresión de secuencias de ADN que codifican para la pr _eina con propiedades de interés en la biblioteca, por l que este promotor se deriva preferiblemente de un gene ae hongo filamentoso altamente expresado. El experto en la técnica apreciará la posibilidad de que la secuencia de ADN homologa para la dirección y la secuencia promotora coinciden en un fragmento de ADN. Se dan un número de genes micóticos altamente expresados, preferidos, a manera de ejemplo: los genes de la amilasa, glucoamilasa, alcohol deshidrogenasa, xilanasa, gliceraldehido-fosfato deshidrogenasa o celobiohidrolasa de Aspergilli o Trichoderma . Los genes altamente expresados más preferidos para esos propósitos son un gen de glucoamilasa de Aspergill us niger, un gen de TAKA-amilasa de Aspergillus oryzae, un gen gpdA de Aspergillus nidulans o un gen de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei . Esos genes altamente expresados son adecuados como sitios objetivo para la integración de vectores de clonación y como fuente de promotores altamente expresados de los cuales se expresan fragmentos de la biblioteca. En otra modalidad preferida la uniformidad de los niveles de expresión de las clonas de bibliotecas individuales es proporcionada por el uso de un vector de clonación el cual es mantenido de manera autónoma en un hongo filamentoso. Un ejemplo de tal vector de clonación mantenido de manera autónoma se describe en el Ejemplo 8 el cual describe la construcción y uso de un vector de clonación que contiene las secuencia AMAl. El AMAl es un fragmento de ADN genom?c„ de 6.0 kb aislado de Aspergillus nidulars el cual es capaz de Mantenerse Autónomo en Aspergill us (véase por ejemplo Aleksenko y Clutterbuck (1997), Fungal Genet. Biol. 21: 373-397). Los vectores de clonación basados en AMAl para utilizarse en el método de la presente invención proporcionan la ventaja de mayores frecuencias de transformación en comparación con los vectores de clonación integrables. Los vectores de clonación basados en AMAl también proporcionan expresiones uniformes de las clonas de bibliotecas individuales o niveles razonables, los cuales permiten la fácil detección de las proteínas con propiedades de ínteres en la biblioteca. Sin embargo, los vectores de clonación basados en AMAl no requieren mantenimiento de la presión de selección durante el crecimiento de los transformantes para evitar perdida de los vectores de clonación basados en AMAl debido a su pobre segregación. El vector de clonación puede opcionalmente comprender ademas una secuencia señal ligada de manera ooerable al promotor y corriente arriba de un sitio de clonación, para permitir la secreción de las proteínas codificadas por los fragmentos de ADN en la biblioteca los cuales se insertan en el sitio de clonación. La secreción puede facilitar la detección de las proteínas. En otra modalidad de la invención el vector de clonación contiene un gen que codifica para una proteina altamente secretada, tal como p? r ejemplo el gen de la glucoamilasa de A. niger. El gen altamente secretado en el vector de clonación contiene un sitio de clonación para la inserción de fragmentos de la biblioteca los cuales están colocados de modo que la proteina codificada por los fragmentos de la biblioteca son producidos como proteínas de fusión con la proteina altamente secretada. Esto mejorara su secreción de acuerdo con la EP-A-0 429 628.

El gen marcador de selección en el vector de clonación puede ser seleccionado de un numero de genes marcadores que son útiles para la transformación de hongos filamentosos. A manera de ejemplo esos marcadores incluyen, pero no se limitan a genes de lacetamidasa) amdS, genes marcadores auxotroficos tales como los genes argB, trpC, o pyrG y la resistencia a antibióticos que proporcionan resistencia contra, por ejemplo, fleomicina, higromicina B o G418. En un aspecto preferido de la invención, el vector de clonación comprende un gen marcador de selección el cual es expresado por la célula huésped micotica a niveles suficientes durante la selección de transformantes para evitar una desviación de los transformantes en copias il múltiples del vector de clonación integrado en el genoma de la célula huésped. Un gen marcador de selección preferido para este proposito es la secuencia codificadora amdS de A . nidulans fusionada al promotor gpdA de A . nidulans . La célula huésped de la presente invención es un hongo f _amentoso, el cual es capaz de ser transformado con un vector de clonación. Para la mayoría de los hongos filamentosos probados de este modo se encontró que podrían ser transformados utilizando los protocolos de transformación desarrollados para Aspergill us (derivados de ín ter alia Tilburn et al . 1983, Gene 26 :205-221). Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la transformación exitosa de especies huésped de hongos filamentosos no se limita al uso de los vectores, sistemas marcadores de selección, promotores y protocolos de transformación específicamente ejemplificados aquí . Un hongo filamentoso se define aquí como un microorganismo eucapotico de la subdivisión Eumycotma en forma de filamentos, es decir el crecimiento vegetativo que ocurre debido al alargamiento de la hifa al inicio. Las células huésped de hongo filamentoso preferidas se seleccionan del grupo que consiste de los géneros Aspergill us , Trichoderma , Fusari um, Penicilli um, y Acremomi um En otra modalidad preferida, por ejemplo cuando la protema de ínteres es una proteina termofila, las células huésped de hongo filamentoso preferidas se seleccionan del grupo de hongos termofilicos que consiste de los géneros Talaromyces , Thielavia , Myceliophtora , Thermoascus , Sporotrichum, Chaetomi um, Ctenomyces , y Scytalidi um . En una modalidad mas preferida de la invención la célula huésped de hongo filamentoso se selecciona del grupo que consiste de A. nidulans , A oryzae, A. sojae, Aspergilli del Grupo de A. niger y Trichoderma reeseí . El Grupo de A niger se define aquí de acuerdo a Raper y Fennell (1965, En: The Genus Aspergill us, The Williams & Wilkins Company, Baltimoer, pp 293-344) y comprende todos los Aspergill us (negros) incluidos en el por esos autores. En un aspecto preferido adicional mas de la invención la célula huésped de hongo filamentoso, al menos cuando se utiliza en el método de la invención en combinación con un vector de clonación integrable que comprende un fragmento de ADN el cual es homologo a una secuencia de ADN en un sitio objetivo predeterminado, comprende copias múltiples del sitio objetivo predeterminado. De manera mas preferible la célula huésped comprende copias múltiples de un sitio objetivo que comprende un gen altamente expresado, tal como los genes micoticos altamente expresados ejemplificados anteriormente. La ventaja de Is células huésped con copias múltiples del sitio objetivo es que el uso de esas células huésped incrementa la frecuencia de transformación dirigida integrable, incrementado de este modo la oportunidad de obtener transformantes de expresión eficientes por cada clona individual en la biblioteca. El organismo que se sospecha produce una o mas proteínas con propiedades de ínteres usualmente es un aucapote, de manera preferible un hongo, del cual la mayoría es preferiblemente un hongo filamentoso. Se sabe que esos organismos producen una gran variedad de proteínas que son útiles para aplicaciones industriales. En el método de acuerdo a la invención, la biblioteca de fragmentos de ADN de un organismo que se sospecha produce una o mas proteínas con propiedades de ínteres puede ser una biblioteca genomica o una biblioteca de ADNc. Sin embargo, de manera preferible se utiliza una biblioteca de ADNc para evitar problemas con el reconocimiento de los promotores o señales de empalme en el organismo huésped. La biblioteca de ADNc se prepara preferiblemente a partir de ARNm aislado de un organismo fuente cuando crece bajo condiciones que conducen a la expresión de las proteínas con las propiedades de ínteres. El método de acuerdo a la invención puede ser aplicado al aislamiento de secuencias de ADN que codifican para cualquier protema con propiedades de ínteres si existe un ensayo disponible para la detección de la proteina cuando sea expresada por la célula huésped micótica. De manera preferible la proteina con propiedades de interés es una enzima. Los ejemplos de enzimas que pueden ser identificados por el método de la invención son carbohidrasas, por ejemplo celulasas tales como las endoglucanasas, ß-glucanasas, celobiohidrolasas o ß-glucosidasas, hemicelulasas -, o enzimas pectinoliticas tales como las xilanasas, xilosidasas, manasas, galactonasas, galactosidasas , ramnogalacturonasas, arabanasas, galacturonasas, liasas, o enzimas amiloliticas; fosfatasas tales como las fitasas, esterasas tales como las lipasas, enzimas proteoliticas, oxidorreductasas tales como las oxidasas, transferasas, o isomerasas. Después de la transformación de las células huésped de hongos filamentosos con la biblioteca de ADN las clonas transformadas son separadas para la expresión de la proteina con propiedades de interés. Dependiendo del ensayo requerido para la detección de la proteina con las propiedades de interés, las clonas transformadas son propagadas y almacenadas como colonias sobre medios sólidos tales como placas de agar o en medios líquidos, por lo que las clonas de las bibliotecas individuales se hacen crecer, almacenan y/o ensayan en pozos de placas de microtitulación.

Una gran variedad de sistemas de detección de proteínas con propiedades de ínteres son conocidos por los expertos en la técnica. Debido a que las clonas de biblioteca pueden crecer sobre medios solidos asi como líquidos, los sistemas de detección incluyen cualquier ensayo posible para la detección de proteínas o actividad enzimatica. A manera de ejemplo esos sistemas de ensayo incluyen pero no se limitan a ensayos basados en zonas claras alrededor de las colonias sobre medios solidos, asi como ensayos colopmetricos, fotometricos, turbidimetpcos, viscosimetpcos, mmunologicos, biológicos, cromatograficos y otros disponibles . El experto en la técnica comprendera que las adaptaciones usuales a los métodos de clonación conocidas en la técnica pueden igualmente aplicarse al método de la presente invención. Las adaptaciones incluyen pero no se limitan a, por ejemplo en separación de grupos de clonas de biblioteca, separación de la misma biblioteca para un numero de diferentes proteínas con propiedades de ínteres, asi como reseparacion, reaislamiento y clonación de clonas positivas para asegurar resultados mas positivos Una variedad de métodos están disponibles a los expertos en la técnica para el aislamiento de la secuencia de ADN que codifica para la proteina con propiedades de ínteres de la célula huésped transformada identificada en el método de separación, y para la caracterización subsecuente de la secuencia ae ADN aislada Las secuencias de ADN aisladas por el método de separación de la invención como se describió anteriormente se utilizan para producir, o para mejorar la producción de, una protema con propiedades de ínteres codificada por la secuencia de ADN. De manera ventajosa, la célula huésped de hongo filamentoso transformada como se aislo con el método de separación descrito anteriormente se utiliza directamente en un proceso para la producción de la proteina con propiedades de ínteres cultivando la célula huésped transformada bajo condiciones que conducen a la expresión de la protema de ínteres y, opcionalmente recuperar la proteina. Sin embargo, con frecuencia la célula huésped transformada inicial aislada en el método de separación de la invención tendrá un nivel de expresión el cual es satisfactorio para propósitos de separación pero que puede ser mejorado significativamente para propósitos de producción económica. Hasta este punto, la secuencia de ADN es insertada en un vector de expresión el cual es posteriormente utilizado para transformar una célula huésped adecuada. En el vector de expresión la secuencia de ADN esta ligada de manera operable a señales de expresión apropiadas, tales como un promotor, opcionalmente una secuencia señal y un termmador, los cuales son capaces de dirigir la expresión de la proteina en el organismo huésped.

Una célula huésped adecuada para la producción de la proteina es preferiblemente una levadura o un hongo filamentoso. Las células huésped de levadura preferidas se seleccionan del grupo que consiste de los géneros Sa ccharomyces, Kluyveromyces , Yarrowia , Pichia , y Hansenula . Las células huésped de hongos filamentosos preferidas se seleccionan del mismo genero listado anteriormente como las células huésped preferidas para el método de separación. Las células huésped de hongos filamentosos mas preferidas se seleccionan del grupo que consiste de Aspergilli del Grupo de A . niger y Tpchoderma reesei . La célula huésped adecuada se transforma con el vector de expresión por cualquiera de los diferentes protocolos disponibles aquellos expertos en la técnica. La célula huésped transformada es posteriormente utilizada en un proceso para producir la protema de ínteres cultivando la célula huésped transformada bajo condiciones que conduzcan a la expresión de la secuencia de ADN que codifica para la proteina, y recuperación de la proteina. La presente invención se ilustra mejor con los siguientes ejemplos.

EJEMPLOS Nomenclatura phyA gen phyA de A. ficuum, que codifica para la fitasa . XylA gen xylA de A. tubigensis, que codifica para la xilanasa amdS gen amdS de A. niduians, que codifica para la acetamidasa (Corrick et al . , 1987 Gene 53:63-71) . glaA gen glaA de A . niger que codifica para la glucoamilasa gpdA gen gpdA de A . nidulans , que codifica para la gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa (Punt et al . , 1988 Gene 69:49-57) Pgp ? promotor de gpdA Pgla? promotor de glaA terminador de amdS Tgla? terminador de glaA GLA proteina glucoamilasa de A. niger Abreviaciones kb kilo base Pb pares de bases oligo oligonucleótido PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa PDA Agar de Papa y Dextrosa Oligonucleótidos utilizados Los oligonucleótidos utilizados en los ejemplos 1-3 se listan en el LISTADO DE SECUENCIAS.

MATERIALES Y MÉTODOS Procedimientos Generales Las técnicas de clonación molecular estándar, tales como el aislamiento de ADN, electroforesis sobre gel, modificaciones por restricciones enzimáticas de ácidos nucleicos, análisis de Southern, transformación de E. coli , etc., se efectuaron de acuerdo a lo descrito por Sambrook et al. (1989) "Clonación Molecular: un manual de laboratorio", Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, New York e Innis et al. (1990) "Protocolos de PCR, una guia para los métodos y aplicaciones" Academic Press, San Diego. Los oligo desoxinucleótidos sintéticos se obtuvieron de ISOGEN Bioscience (Maarssen, Holanda) . Los análisis de la secuencia de ADN se efectuaron en un secuenciador de ADN Applied Biosystems 373A, de acuerdo a las instrucciones del distribuidor.

Marcador e hibridación del ADN El marcado e hibridación del ADN fueron de acuerdo a los sistemas de marcado y detección directa de ácido nucleico ECLMR (Amersham LIFE SCIENCE, Little Chalfont, Inglatera o de acuerdo a las técnicas de marcado radioactivo estándar como se describe en Sambrooke et al 1989) .

Transformación de Aspergillus niger. La transformación de A. niger se efectuó de acuerdo al método descrito por Tilburn, J. et al. (1983) Gene 26, 205- 221 y Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479 con las siguientes modificaciones: Se hicieron crecer esporas durante 16 horas a 30°C en un agitador giratorio a 300 rpm en medio mínimo para Aspergill us . El medio minimo para Aspergillus contiene por litro: 6g de NaN?3, 0.52 g de KCl, 1.52 g de KH2PO„, 1.12 mi de KOH 4 M, 0.52 g de MgSOj.7H20, 10 g de glucosa, 1 g de casaminoácidos, 22 mg de ZnS0,|.7H20, 11 mg de H3BO3, 5 mg de FeS04.7H20, 1.7 mg de CoCl2.6H20, 1.6 mg de CuS04.5H20, 5 mg de MnCl2.2H20, 1.5 mg de Na2Mo04.2H20, 50 mg de EDTA, 2 mg de riboflavina, 2 mg de tiamina-HCl, 2 mg de nicotinamida, 1 mg de pipdoxina-HCl, 0.2 mg de ácido pantoténico, 4 g de biotina, 10 mi de solución de Penicilina (5000 IU/ml) Estreptomicina (5000 GU/ml) (Gibco) . 91 Se utilizó Novozim 234MR (Novo Industries) en lugar de la helicasa para la preparación de protoplastos; después de la formación del protoplasto (60-90 minutos), se agregó amortiguador de KC (KCl 0.8 M, ácido cítrico 9.5 mM, pH 6.2) a un volumen final de 45 mi, la suspensión de protoplastos fue centrifugada durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 C en un rotor de cubo giratorio. Los protoplastos fueron resuspendidos en 20 mi de amortiguador de KC y posteriormente se les agregaron 25 mi de amortiguador de STC (sorbitol 1.2 M, Tris-HCl 10 mM, pH 7.5, CaCl2 50 mM) . La suspensión de protoplastos se centrifugó durante 10 minutos a 3000 rpm a 4 C en un rotor de cubo giratorio, se lavó en amortiguador de STC y se resuspendió en amortiguador de STC a una concentración de 108 protoplastos/ml; - a 200 1 de la suspensión de protoplastos, se agregó el fragmento de ADN, disuelto en 10 1 de amortiguador de TE (Tris-HCl 10 mM a pH 7.5, EDTA 0.1 mM) y 100 1 de una solución de PEG (PEG 4000 al 20% (Merck), sorbitol 0.8 M, Tris-HCl 10 mM a pH 7.5, CaCl2 50 mM) ; - después de la incubación de la suspensión de ADN-protoplastos durante 10 minutos a temperatura ambiente, se agregaron 1.5 mi de solución de PEG (PEG 4000 al 20% (Merck), sorbitol 0.8 M, Tris-HCl 10 mM a pH 7.5, CaCl2 50 mM) lentamente, con mezclado repetido de los tubos. Después de incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, las suspensiones se diluyeron con 5 mi de sorbitol 1.2 M, se mezclaron por inversión y se centrifugaron durante 10 minutos a 4000 rpm a temperatura ambiente. Los protoplastos fueron resuspendidos suavemente en 1 mi de sorbitol 1.2 M y cultivados sobre medio de regeneración selectivo que consistía de medio mínimo para Aspergill us sin riboflavina, tiamina.HCL, nicotmamida, piridoxma, acido pantotenico, biotina, casammoacidos y glucosa, en el caso de la selección de acetamida suplementado con acetamida 10 mM como la única fuente de nitrógeno y sucrosa 1 M como fuente osmótica y de C, o, sobre PDA suplementado con 1-30 µg/ml de fleomicina y sucrosa ÍM como osmótico en el caso de la selección de fleomicma. Las placas de regeneración fueron solidificadas utilizando 2% de agar Oxoide No. 1. Después de incubar durante 6-10 días a 30°C, las copdiosporas de transformantes fueron transferidas a placas que consistían de medio selectivo de Aspergi ll us (medio mínimo que contenía acetamida como única fuente de nitrógeno en el caso de la selección de acetamida o PDA suplementado con 1-30 µg/ml de fleomicina en el caso de la selección de la fleomicina) con 2% de glucosa en lugar de sucrosa y 1.5% de agarosa en lugar de agar y se incubo durante 5-10 días a 30°C. Se aislaron transformantes únicos y este paso de purificación selectiva se repitió una vez, después de lo cual se almacenaron los transformantes purificados .

PCR DIRECTA SOBRE EL MICELIO MICOTICO Se incubaron transformantes sobre placas que contenían PDA durante dos días a 30°C. Aproximadamente un tercio de una colonia fue incubada durante 2 horas a 37°C en 50 1 de amortiguador de KC (60 g/1 de KCl, 2 g/1 de acido cítrico, pb 6.2), suplementado con 5 mg/ml de Novozyrtí* 234. Posteriormente se agregaron 100 1 (Tris lOmM, EDTA 50 mM, NaCl 150 mM, 1% de SDS, pH 8) y 400 1 de amortiguador PB de QIAquick™ (Qiagen Inc., Chatsworth, EUA). Los extractos fueron suspendidos suavemente y cargados sobre una columna giratoria de QIAquic A Las columnas fueron centrifugadas aurante i minuto a 13000 rpm en una microcentrifuga y lavadas una vez con 500 1 de amortiguador de amortiguador PE QIAquickA Se removieron trazas de etanol con una centrifugación rápida final. El ADN cromosomico (Patrón de PCR) se eluyo de la columna mediante la adición de 50 1 de H20 y la centrifugación posterior durante 1 minuto a 13000 rpm. Las reacciones de PCR tuvieron 10 1 de amortiguador B de eL0NGaseMP (Life Technologies, Breda, Holanda), 14 1 de dNTP s (1.25 mM de cada uno), 1 1 de Mezcla Enzimatica de eLONGaseA 1 1 de patrón, y 10-30 pmol de cada oligo, en un volumen final de 50 1. La cantidad óptima de oligos se determino expepmentalmente con cada lote comprado. En promedio, se utilizaron de 10 a 30 pmol. Las reacciones se efectuaron con las siguientes condiciones del ciclo: Ix (2 minutos ' 94 °C, lOx (15 segundos a 94 A, 30 segundos a 55°C, 4 minutos a 68°C), 20x (15 segundos a 94°C, 30 segundos, 55°C durante 4 minutos, comenzando con una inclinación de 20 segundos por ciclo, a 68°C), Ix (10 minutos a 68°C). Las muestras fueron cargadas sobre geles de agarosa para analizar los productos de PCR. Fermentaciones en frascos con agitación de Aspergillus niger. Se genero un lote grande de esporas de cepas A. niger recombmante y control cultivando esporas o micelios sobre placas de medio selectivo o placas de PDA (Agar de Papa y Dextrosa, Oxoíd) , preparadas de acuerdo a las instrucciones del distribuidor. Después de crecer durante 3-7 días a 30°C las esporas fueron recolectadas después de agregar 0.01% de Tritón X-100 a las placas. Después de lavar con agua desmmeralizada estéril se inocularon aproximadamente 107 esporas de cepas transformantes control seleccionadas en matraces con agitación, que contenían 20 mi de medio de precultivo liquido que contenía por litro: 30 g de maltosa, H20, 5g de extracto de levadura, 10 g de caseína hidrolizada, 1 g de KH2P04, 0.5 g de MgS04.7H20, 0.03 g de ZnCl2, 0.02 g de CaCl2, 0.01 g de MnS04.4H20, 0.3 g de FeS04.7 H20, 3 g de Tween 80, 10 mi de penicilina (5000 IU/ml) /Estreptomicina (5000 UG/ml), pH 5.5 y 1-30 µg/ml de fleomicina en el caso de la selección de la fleomicina. Esos cultivos hicieron crecer a 34°C durante 20-24 horas, 10 mi de este cultivo se inocularon en 100 mi de un medio de fermentación de A. niger que contenía por litro: 70 g de glucosa, 25 g de caseína hidrolizada, 12.5 g de extracto de levadura, 1 g de KH2P04, 2 g de K2S04, 0.5 g de MgS04.7H20, 0.03 g de ZnCl2, 0.02 g de CaCl2, 0.01 g de MnS04.4H,0, 0.3 g de FeS04.7H,0, 10 mi de penicilina (5000 IU/ml) /Estreptomicina (5000 UG/ml), ajustados a pH 5.6 con H2S04 4N, y 1-30 µg/ml de fleomicina en el caso de la selección de la fleomicina. Esos cultivos se hicieron crecer a 34°C durante 6 días. Las muestras tomadas del caldo de fermentación fueron centrifugadas (10', 5,000 rpm en una centrifuga de cubo giratorio) y se recolecto el sobrenadante. Se efectuaron ensayos de actividad de xilanasa 0 fitasa (véase mas adelante) sobre esos sobrenadantes.

Ensayo de Actividad de Fitasa 20 µl de sobrenadante (diluido cuando fue necesario) de fermentaciones de Aspergill us niger del matraz de agitación (como referencia 20 1 de agua desmmeralizada) se agregaron a 30 1 de mezcla se substrato, que contenía amortiguador de acetato de sodio 0.25 M, pH 5.5, acido fitico 1 mM (sal sódica, Sigma P-3168), en un disco microtitulador de 96 pozos, y se incubo durante 25 minutos a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de 150 1 de mezcla de interrupción (14.6 g de FeS04.7h20 en 300 mi de 0.67% de (NH4)eMo^024.4H20, 2« de H,S04, 3.3% de acido Tricloroacetico) . Después de incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos se midió la absorbancia del color azul espectrofotometpcamente a 690 nm en un Anthosreader (Protón y Wilton) . Las mediciones son indicativas de la actividad de fitasa en el intervalo de 0-175 U/ml. La actividad de la fitasa se midió de acuerdo a lo descrito en la EPO 0 420 358 A.

Ensayo de actividad de xilanasa El sobrenadante (prediluido cuando fue necesario) se diluyo 5 veces en amortiguador de acetato de sodio 0.25 M, pH 4.5. 20 µl de sobrenadante diluido se transfirieron a los discos microtituladores y se les agregaron 50 µl de substrato (4% en peso/volumen de RBB-Xilano, Azul Brillante de Remazol, disuelto a 70°C en agua desmineralizada) y se mezclo perfectamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo. La reacción se incubo durante 30 minutos a temperatura ambiente.

La reacción se detuvo mediante la adición de 200 1 de etanol al 96% y se incubo durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Después de haber terminado la reacción las placas microtituladoras se centrifugaron durante 10 minutos a 2500 rpm en una centrifuga Beckman GPK a temperatura amoiente. Se transfirieron 100 1 del sobrenadante a un nuevo disco microtitulador y se midió la absorbancia del color azul espectrofotometricamente a 620 nm en un Anthosreader (Protón y Wilton) . La actividad especifica se calculo en una curva de calibración utilizando un estándar de xilanasa disuelto en un amortiguador de acetato de sodio 0.25 M, pH 4.5. Las mediciones son indicativas de una actividad de xilanasa en el intervalo de 0-150 EXU/ml. Las unidades de actividad de xilanasa se definieron como en la EP 0 463 706.

Aislamiento de ARN Se cultivo una cepa de A. tubigensis DS116813 (CBS323.90) en medio mínimo para Apergillus (por litro 6 g de NaN03, 0.52 g de KCl, 1.52 g de KH2P04, 1.12 mi de KOH 4 M, 0.52 g de MgS04.7H20, 22 mg de ZnS04.7H20, 11 mg de H3B03, 5 mg de FeS04.7H20, 1.7 mg de CoCl2.6H20, 1.6 mg CuS0 .5H20, 5 mg de MnCl2.2H20, 1.5 mg de Na,Mo04.2H20, 50 mg de EDTA, 10 g de glucosa) suplementado con 0.1% de extracto de levadura y 3% de xilano captado de avena (Serva) . Se inocularon 100 mi de medio con 2.10 esporas y se cultivaron en un incubador giratorio a 30 A y 300 rpm durante 48 horas. El micelio fue cosechado por filtración utilizando una envoltura de filtración Miracloth, se lavo perfectamente con agua desmxneralizada y se exprimió entre toallas de papel para remover el exceso de agua. El micelio fue congelado inmediatamente en nitrógeno liquido y triturado hasta un polvo fino utilizando un mortero y pistilo El polvo resultante fue transferido a un tupo estéril de 50 mi y pesado, después de lo cual por cada 1-1.2 g ae micelio triturado se agregaron 10 mi de reactivo TRIzol (Gioco/BRL) (un máximo de 25 mi por tubo) . El polvo de micelio fue inmediatamente solubilizado mezclando vigorosamente (formando un vórtice, 1 minuto) , seguido por una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente con mezclado ocasional. Se ut_l?zo un volumen de 0 2 (TRIzol original) de cloroformo (de este modo 2 mi por cada 10 mi de TRIzol originalmente utilizado), se agito vorticialmente y se dejo a temperatura ambiente durante 10 minutos Posteriormente, la mezcla se centrifugo a 4°C, 6000 g durante 30 minutos. La fase acuosa se transfirió a un tubo fresco y el ARN total se precipito mediante la adición de un volumen de 0.5 (TRIzol original) de alcohol isopropilico (de este modo 5 mi de alcohol isopropilico por cada 10 mi de TRIzol utilizado originalmente). Después de 10 minutos de precipitación a temperatura ambiente, el ARN fue recuperado por centrifugación durante 30 minutos a 6000 g. Tras la remoción del sobrenadante, el sedimento de ARN fue enjuagado con un volumen de etanol al 70%. Después de la remoción del etanol, el sedimento de ARN fue secado al aire. El sedimento de ARN seco fue disuelto en 3 mi de amortiguador GTS (Tris-Cl 100 mM, pH 7.5, tiocianato de guanidinio 4M, 0.5% de lauril sarcosinato de sodio. Se utilizaron 10 µl de solución de ARN para determinar la calidad y concentración de los ácidos nucleicos .

Purificación del ARN via centrifugación en solución de CsCl El ARN aislado fue purificado adicionalmente por una modificación del método descrito por Sambrooke et al. (Clonación molecular, segunda edición Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) . Se preparó una solución de CsCl/EDTA disolviendo 96 g de CsCl en 70 mi de EDTA lOmM, pH 7.5. Se agregó DEPC a una concentración final del 0.1%. La solución se dejó durante 30 minutos a temperatura ambiente posteriormente se puso en un autoclave durante 20 minutos libras por pulgada cuadrada (psi) (137.89 kPa) sobre un ciclo de liquido. Tras enfriar la solución el volumen se ajustó a 100 mi con agua tratada con DEPC. Se agregaron 1.5 mi de esta solución de CsCl/EDTA a cada tubo de ultracentrifuga Polyallomer (de 2" x 0.5" (5.8 x 1.27 cms), 5 mi de capacidad) . 3 mi de muestras de ARN (en GTS) se colocaron sobre un colchón de 1.5 mi de CsCl/EDTA. Los tubos de ultracentrifuga fueron llenados hasta 5 mm de la parte superior con GTS. Los tubos de ultracentrigufa llenos fueron equilibrados exactamente con GTS y colocados en cubos de ultracentrifuga pares. Los tubos de ultracentrifuga fueron centrifugados a 35.000 rpm durante 18 h a 20 °C con aceleración lenta y frenados para la desaceleración. Después de la centrifugación la capa superior encima del colchón de CsCl, y parte del colchón se removieron con pipetas de pasteur limpias, respectivamente (se dejaron 0.5 cm de colchón C?C1 en el tubo) . El fondo del tubo se cortó con una cuchilla rascadora caliente, después de lo cual el fluido restante fue removido. El fondo del tubo fue llenado con etanol al 70% a temperatura ambiente. El fondo del tubo fue invertido y el sedimento de ARN fue secado al aire. El sedimento ARN fue disuelto en 1 mi de TE (amortiguador de elusión del equipo de purificación de ARNm de PHARMACIA; véase aislamiento del ARNm) . Nuevamente se tomaron 10 µl para verificar la calidad y cantidad.

Aislamiento del ARNm Para el aislamiento del ARNm se utilizó un protocolo modificado (utilizando el flujo de gravedad en lugar de la centrifugación) del equipo de purificación de PHARMACIA (Cat#27-9258-02 ) .

La columna de PHARMACIA fue resuspendida completamente por inversión repetida, después de lo cual la columna fue empacada vía flujo por gravedad. La columna fue colocada a una temperatura de 50 °C y lavada con 1 mi de Amortiguador Alto en Sales. La solución de ARNm (en TE) fue calentada a 65°C durante 5 minutos, después de lo cual se agregaron 200 µl de amortiguador de muestra y la solución de ARN fue cargada sobre la columna. El flujo fue recolectado y cargado nuevamente sobre la columna. La columna fue lavada 3 veces con 0.5 mi de Amortiguador Alto en Sales y posteriormente varias veces con 0.5 de Amortiguador Bajo en Sales hasta que no se eluyo material que absorbiera UV de la columna. La pol?(A)+ARN fue eluida con Amortiguador de Elusion precalentado (65°C) del cual se recolectaron 4-5 fracciones 0.25 mi. Las concentraciones de las diferentes fracciones se determinaron espectrofotometricamente y las fracciones con una relación de O.D 260/280 de al menos 1.5 se reunieron. Se agrego 0.1 volumen de Amortiguador de Muestra y 2 volúmenes de etanol absoluto y la solución fue incubada durante la noche a -20 C.

Análisis Northen El ARN fue separado por electroforesis sobre un gel de agarosa al 1% que contenía 6% de formaldehido y utilizando 1 x MOPS (20 mM MOPS/pH7.0, EDTA 1 mM) como amortiguador de electroforesis . Las muestras (de aproximadamente 10 g de ARN total o 1 g de ARNm) se disolvieron en un volumen total de 20 1 de amortiguador de carga (concentraciones finales: MOPS 20 Mm/pH 7.0, EDTA 1 Mm, 6% de formaldehido, 50% de formamida, 0.05 g de bromuro de etidio) y se desnaturalizaron calentando a 68°C durante 10 minutos. Después de la electroforesis durante 3-4 horas a 100 Voltios, el ARN se visualizó utilizando un iluminador de UV. Para el análisis Northen el gel fue lavado durante 20 minutos en agua desmineralizada y transferido a una membrana de nylon Hybond-N+ (Amersham) por manchado capilar. El ARN fue fijado a la membrana horneando a 80°C durante 2 horas. Los transcriptos específicos fueron detectados utilizando el sistema ECLMR o técnica de marcación radiactiva estándar como se describe en Sambrooke et al. 1989.

Análisis de ADNc por electroforesis sobre un gel de agarosa alcalino Este paso de análisis de control reveló el tamaño de ADNc sintetizado y se utilizó para verificar la presencia potencial de la estructura de horquilla. Puesto que la actividad especifica de la segunda hebra sintética fue mucho menor que la de la sintesis de la primera hebra, el volumen de la síntesis de la segunda hebra utilizado fue 10 veces el de la síntesis de la primera hebra. Se preparó un gel de agarosa al 1%, delgado, fundiendo 0.6 de agarosa en 54 mi de agua, enfriando a 55°C, agregando 6 mi de 10X de amortiguador alcalino (NaOH 0.3 M, EDTA 20 mM) , mezclando y vaciando. Las muestras fueron mezcladas (1:1) con 2X de amortiguador de carga de gel alcalino (NaOH 30 mM, 20% de glicerol, 1/10 volúmenes de azul de bromofenol saturado). Las muestras fueron corridas (junto con marcadores de peso molecular marcados con 32P) en IX de amortiguador alcalino. El gel fue fijado durante 30 minutos en ácido acético en 7% y manchado sobre papel Whatman 3MM y secado. El gel seco fue expuesto a una película de rayos X el cual se reveló en un procesador de películas automático.

Sintesis del ADNc Para la síntesis del ADNc han sido utilizados tanto el sistema de elección Superscript™ (Gibco-BRL) y el equipo de Sintesis de ADNc de STRATAGENE. Cuando el ADNc fue sintetizado con el sistema de elección Superscript™ se utilizaron 5 µg de ARNm de acuerdo a las instrucciones del fabricante, excepto que se utilizó el oligonucleótido 6967 para la síntesis de la primera hebra y que los oligonucleótidos 7676 (fosforilado en la posición 5') y 7677 (no fosforilado) se utilizaron como adaptadores. El recocido de los oligonucleótidos 7676 y 7677 se logró mezclando cantidades equimolares de ambos oligonucleótidos en Tris-HCl 10 mM/pH 7.5, EDTA 1 mM, MgCl2 1 mM. La mezcla se encubó en un baño de agua a 80°C durante 10 minutos después de lo cual se permitió que el agua se enfriara lentamente hasta la temperatura ambiente. Para la sintesis del ADNc con el Equipo de Síntesis de ADNc de Strategene el protocolo tuvo que ser optimizado para clonar los vectores pGBFIN descritos. Los cambios principales fueron: 1) la cantidad de ADNc sintetizado fue cuantificado por precipitación TCA. 2) la fosforilación de los extremos de los ADNc fue omitida y los ADNc fueron ligados al ADN del vector con los extremos fosforilados . 3) el ADNc se extrajo con fenol/cloroformo después de la digestión con Xhol en lugar del fraccionamiento por tamaño. 4) el uso de ambas síntesis de la primera hebra MMVL-RT (STRATAGENE) y TERMOSCRIPT (Gibco/BRL) dio como resultado consistente ADNc con mayores longitudes que el uso de cualquier enzima sola. 5) las reacciones de control tratadas con [alpha32P] dATP (800 Ci/mmol para prevenir la interferencia con la sintesis) se efectuaron conjuntamente para el control de la calidad; Los componentes de la primera hebra y los componente de poli(A)+ARN se combinaron y mezclaron de acuerdo al protocolo y se dejaron durante 10 minutos a temperatura ambiente para permitir el recocido del patrón de cebador. Se agregaron 1.5 µl de MMLV-RT (50 U/µl) y 1 µl de THERMOSCRIPT (15 U/µl, GibcoBRL) a la reacción de la primera hebra para obtener un volumen de reacción final de 50 µl . Después de mezclar se tomaron 5 µl de la mezcla de reacción y se agregaron a 0.5 µl de [alpha32P] dATP (800 Ci/mmol) para obtener una reacción de control radiactiva de la primera hebra. Las reacciones de síntesis de la primera hebra se incubaron a 35°C durante 0.5 horas seguido por 55°C durante 0.5 horas. La reacción de sintesis no radiactiva de la primera hebra se colocó sobre hielo y se le agregaron 20 µl de 10X de am.ortiguador de la segunda hebra, 6 µl de mezcla de dNTP de la segunda hebra, 114 µl de agua destilada estéril, 2 µl de [alpha32P] dATP (800 Ci/mmol), 2 µl de RNasa H (1.5 U/µl) y 11 µl de ADN polimerasa I (9.0 U/µl). Después de mezclar la mezcla de reacción se incubó a 16°C durante 2.5 horas. Después de la incubación, se removieron y congelaron 10 µl.

Estimación de la cantidad de ADNc sintetizado por precipitación por TCA 1 µl de la reacción radioactiva (control) de la primera hebra se mezcló con 20 µl de agua. De manera similar, se mezclaron 2 µl de la reacción de sintesis de la segunda hebra con 200 µl de agua. Se mancharon 5 µl de la solución asi obtenida (4X por cada solución control) sobre filtro de fibra de vidrio Whatmann (GF/C o GF/A, 23 mm de diámetro) y se secaron al aire. Los filtros fueron transferidos a 200 mi de ácido tricloroacético (TCA) al 5% enfriado en hielo y pirofosfato de sodio 20 mM. La solución de TCA enfriado en hielo/pirofosfato de sodio se cambió 3-4 veces cada 2 minutos. Los filtros fueron enjuagados con etanol al 70% a temperatura ambiente durante 2 minutos. Cada filtro fue insertado en un frasco de destellos, se agregaron 10 mi de productor de destellos y el material radioactivo fue contado, después de lo cual se calculó la actividad especifica del ADCc.

Despuntado del extremo terminal del ADNc y ligación de adaptadores La reacción de sintesis de la segunda hebra se agregaron 23 ul de mezcla de dNTP de despuntado y 2 ul de ADN polimerasa Pfu (2.5 U/ul), después de lo cual la mezcla de reacción se incubó a 72 °C durante 30 minutos. La mezcla de reacción fue extraída con fenol/cloroformo [200 ul de solución 1:1 (volumen/volumen), pH 7-8], se extrajo con cloroformo [200 ul] y el ADNc fue precipitado mediante la adición de 20 ul de acetato de sodio 3 M y 400 ul de etanol absoluto seguido por incubación durante la noche a -20°C. El ADNc fue recolectado via centrifugación, lavado con etanol al 70% y el sedimento de ADNc obtenido fue secado con aire y resuspendido en 8 ul de solución de adaptador. Se agregó 1 ul de 10X amortiguador de ligasa, 1 ul de rATP y 1 ul de ADN ligasa T4 y la mezcla de ligación fue incubada ya sea a 8°C durante la noche o a 4°C durante 2 dias. A continuación, la ligasa fue inactivada por incubación a 70°C durante 30 minutos .

Digestión con enzima de restricción de los ADNc y fraccionamiento por tamaño Se agregaron 10 ul de agua estéril (para compensar el volumen en el paso de fosforilación omitido) , 28 ul de amortiguador de enzima de restricción y 3 ul de enzima de restricción (40 U/ul) al ADNc. La reacción se incubó a 37°C durante 1.5 horas. Después de agregar 30 ul de agua estéril y 10 ul de 10X STE la mezcla de reacción se extrajo con 100 ul de fenol/cloroformo seguido por una extracción con 100 ul de cloroformo. Los ADNc se recolectaron via centrifugación después de agregar 200 ul de etanol absoluto (y precipitación durante la noche a -20°C), se secaron y resuspendieron en 14 ul de IX STE a los cuales se habían agregado 3.5 ul de tinte de carga de columna. La matriz de SEPHAROSE CL-2B y amortiguador STE se equilibraron a temperatura ambiente, se resuspendieron y utilizaron para vaciar una columna en una pipeta de vidrio de 1 mi. Después de la sedimentación de la matriz de SEPHAROSE, la columna fue lavada con 10-15 mi de STE. La muestra fue cargada, después de lo cual se agregaron 3 mi de STE y se recolectaron fracciones de 0.3 mi (verificación de todo el proceso con contador Geiger) . La radioactividad en cada fracción se estimo mediante la medición de un contador de destellos.

Análisis por electroforesis sobre gel no desnaturalizante Se mezclaron 3 mi de 10X TBE, 5 mi de acrilamida al 30% [(peso/volumen), 29:1 de acplamida :b?s-acr?lam?da) y 22 mi de agua, se desgasificaron, después de lo cual se agregaron 150 ul de persulfato de amonio al 10% recién hecho y 20 ul de TEMED. La solución fue aplicada a los módulos de gel montados y se dejo sedimentar. Se tomaron 8 ul de cada fracción (recolectada de la columna) que contenía radioactividad y se mezclaron con 2 u de 5X de amortiguador de carga. Las muestras fueron cargadas junto con un marcador de peso molecular radioactivo y se sometieron a electroforesis Después de la electroforesis, los geles fueron fijados en 100 mi de acido acético en 7% durante 20-30 minutos, secados sobre papel Whatmann 3MM y expuestos a una película de rayos X Procesamiento de las fracciones de ADNc En base a los resultados de la electroforesis sobre gel no desnaturalizante, se reunieron las fracciones que contenían la distribución de tamaño deseada. (Normalmente, las fracciones con ADNc por encima de 0.5 kb son recolectadas. Si se desea, las subbibliotecas pueden ser reconstruidas mediante la ligación de las fracciones de diferente tamaño seleccionadas con el vector) . Se removieron y mancharon 2 ul de las fracciones reunidas sobre un filtro GF/C Whatman. El filtro fue lavado 3 veces con 10 mi de solución de TCA enfriado en hielo/pirofosfato, enjuagado con 10 mi de etanol al 70%, secado y contado con destellador liquido para estimar la cantidad de ADNc presente Las fracciones reunidas fueron precipitadas durante la noche a -20°C agregando 2 volúmenes de etanol absoluto y recolectadas vía centrifugación. La precipitación fue ayudada mediante la adición de ARNt purificado a 10 ug/ml como portadores Después de lavar, el sedimento fue secado al aire y resuspendido en TE o agua estéril a 10-20 ng/ul. Los ADNc fueron ligados al ADN del vector con un exceso a una relación molar de 5:1.

Posteriormente, la mezcla de ligación fue transformada a células bacterianas XLIO-Gold (STRATAGENE) de acuerdo al protocolo (correspondiente) .

EJEMPLO 1 1.1 Descripción y construcción del vector de expresión pGBFin 2 1.1.a Fundamento La separación por expresión en A. niger puede ser mejorada por un número de factores, los cuales cuando se utilizan en combinación probablemente producen el resultado más óptimo. El sistema de transformación efectivo es el preferido para obtener un número suficiente de transformantes micóticos. Debe tenerse cuidado en mantener los ADNc en la biblioteca intacta durante el procedimiento de clonación. Además, la separación será más exitosa cuando los niveles de expresión del producto genético del ADNc sean suficientemente altos. Por lo tanto, en los constructos de clonación de expresión las funcionalidades utilizadas para dirigir la expresión de los ADNc se derivaron de un gen que está altamente expresado. En el sistema integrable el cásete de expresión es dirigido preferiblemente a un lugar el cual está altamente expresado y el cual, de manera aún más preferible, ha sido amplificado en el genoma. En este ejemplo se eligió glaA, el cual está presente en 3 copias en el genoma de A . niger cepa DS2978 (depositada el 8 de Abril de 1997 en Centraalbureau voor Schimmelcultures, Baarn, Holanda bajo el número de acceso CBS 646.97). Varios vectores de expresión, diseñados para la dirección eficiente a este sitio y permitir diferentes estrategias de clonación de ADN fueron construidos y probados (véanse los ejemplos 1-7) . 1.1.b Diseño básico de los vectores de expresión integrables Las moléculas de ADN lineales son preferidas para la integración dirigida en el genoma de hongos filamentosos. Además, ambos extremos 5' y 3' (flanqueantes) preferiblemente consisten de homólogos de ADN al sitio de integración deseado. Los fragmentos de la transformación, por lo tanto, comprenden el cásete de expresión (el gen de interés regulado por un promotor y terminador adecuados), asi como un marcador de selección flanqueado por los dominios de dirección 5' y 3' . Esos fragmentos son clonados en un vector de E. coli para la propagación del plásmido. Los vectores de expresión resultantes son diseñados de modo que las secuencias de E . ^já?^ coli son removidas durante la linealizacion y aislamiento del fragmento de transformación. Para la selección de transformantes se utilizo el marcador de selección amdS, la expresión del cual es controlada por el promotor gpdA de A . nidulane . El uso del fuerte promotor gpdA dará como resultado predominantemente transformantes en una copia. Para lograr altos niveles de expresión el ADNc se fusiono al promotor glaA. Se introdujeron un numero de combinaciones de sitios de restricción únicos para las enzimas (corte raro) (por ejemplo pací y AscI [Ejemplo 1]), EcoRI y Xhol [Ejemplos 4 y 6] o HmdlI I y Xhol [Ejemplo 7]) e-1 un conjunto de vectores de expresión integrables en el punto inicial de transcripción propuesto del promotor glaA. Puesto que la inserción dirigida (dirección) de las moléculas de ADNr en el genoma ocurre a través de recombinacion homologa, los casetes de ADNr son preferiblemente flanqueados por fragmentos de ADN homólogos al sitio objetivo del genoma. Por lo tanto el cásete de integración es flanqueado en ambos extremos 5' y 3' por aproximadamente 2 kb de la secuencia de ADN homologa al sitio glaA. Para facilitar la remoción del ADN de E . coli del constructo, se introdujeron sitios Notl únicos (los sitios de restricción Notl son raros, reduciendo de este modo al mínimo el riesgo de la digestión indeseable del ADNc introducido) . 1.1. c Construcción de un vector de expresión intermedio, pGBTOP8 Los oligonucleotidos AB5358 y AB5359 fueron recocidos en cantidades equimolares y ligados en los sitios de restricción £coRI y fíincíIII del pTZ18R, introduciendo de este modo un polienlazante NotI-XhoI-£coRI-SnaBI-fímdIII (el sitio £coRI no fue restablecido) . El plasmido resultante fue nombrado pGBTOPl. Se aislo un fragmento XhoI-£coRI de 1.8 kb, que comprende la región promotora del gel glaA, del plasmido pAB6-l (que contiene el sitio glaA de A niger completo sobre un fragmento JíindlII de 15.5 kb, clonado en el pUC19 como se describe en una de nuestras patentes anteriores, EP-A-0 635 574) y se clono en los sitios Xhol y EcoRI del plasmido pGBTOPl, produciendo el plasmido pBGTOP2. Para mediar la dirección de constructos a la región no codificadora 3' del glaA se clonaron dos partes diferentes de esta región sobre cualquier lado del cásete de expresión. Esas partes fueron designadas como 3" glaA y 3" glaA, siendo la ultima la parte mas corriente abajo de la región El fragmento 3" glaA fue generado por PCR utilizando los oligonucleotidos AB5291 y AB5292 (el oligo AB5291 fue diseñado para perturbar un sitio de EcoRI indeseable) . El fragmento de PCR generado fue utilizado como un patrón en una segunda reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos AB5361 y AB5292, generando de este modo un sitio ?fotl en el fragmento. El fragmento de la PCR fue digerido con ?fotl y Xhol y clonado en los sitios de restricción correspondientes del plásmido pGBT0P2, produciendo el pGBT0P5. Los sitios EcoRI indeseables en la región no codificadora 3' del glaA fueron perturbados utilizando un método de PCR. Se llevó a cabo una reacción de PCR de fusión utilizando el oligo AB5288 (5'), AB5293 (3' invertido), AB5290 (interno, invertido) y AB5289 (interno, codificador) . Los oligos AB5290 y 5289 fueron oligos complementarios diseñados para perturbar el sitio £coRI en esa posición mientras que el oligo AB5293 fue diseñado para perturbar un segundo sitio £coRI . El producto de la PCR de fusión resultante fue digerido con SnaBI y HindII I y clonado en los sitios correspondientes del pGBTOP2, dando como resultado en pGBTOP6. El pGTOP6 fue utilizado como un patrón en' una segunda reacción de PCR utilizando los oligonucleótidos AB5363 y AB5567. El producto de la PCR resultante fue digerido con SnaBI y fíindIII y clonado en los sitios correspondientes del pGBTOP5, dando como resultado el plásmido pGBT0P8 (véase la Figura 1) . 1.1.a Construcción del pGBFin2. Utilizando los oligonucleótidos 6963 y 7266, y 10 ng del vector pAB6-l (EP-A-A 635 574) como patrón, se generó un fragmento de PCR específico PgiaA- Este fragmento fue digerido con EcoRi y Smal e introducido en el vector pGBTOP-8 digerido con EcoRi y SnaBI, dando como resultado el vector pGBFinl. La secuencia de fragmento PCR introducido fue confirmada por el análisis de la secuencia. Se introdujeron sitios Xhol al fragmento Pgpds-amd? por PCR. Utilizado oligonucleótidos 7423 y 7424 y el plásmido pGBAA?l (EP-A-0 635 574) como patrón se generó un fragmento de 3.1 kb. Este fragmento fue digerido con EcoRI e introducido en el sitio EcoRI del pTZ19R, dando como resultado el plásmidos pTZamdSX-1. El Xhol-Clai de 2.6 kb del pTZamdSX-1 fue reemplazado por el fragmento correspondiente del plásmido pGBAAS-1 para evitar mutaciones causadas por el proceso de la PCR. El Kpnl-Clal de 0.5 kb de pTZamdSX-1 • fue reemplazado por el fragmento correspondiente del plásmido pTZamdSX-1 para evitar las mutaciones causadas por el proceso de la PCR. El análisis de la secuencia del fragmento de 0.5 kb restante del plásmido pTZamdSX-2 resultante, reveló una sola mutación en el fragmento PgPdA- El fragmento Xhol de 3.1 kb, que comprende el cásete de selección PgpdA-amdS, fue aislado del vector PTZamdSX-2 e introducido en el sitio Xhol único del pGBFinl, dando como resultado el vector pGBFin2 (véase la Figura 2). 1.2 Expresión de la fitasa utilizado el vector de expresión pGBFin2 1.2.a Fundamento Tanto l-a dirección como la expresión eficiente del constructo al sitio glaA locí de A. niger DS2978 y un nivel de expresión suficientemente alto del ADNc de interés son preferidas para la aplicación óptima de la separación por expresión A. niger. Por lo tanto se probaron las propiedades del constructo de expresión utilizando un gen modelo, phyA, para el cual habla sido establecida previamente la producción de proteína esperada por la copia del gen integrada en un sitio glaA. 1.2.b Construcción del vector de expresión de fitasa, pGBFin5 Se generó un fragmento de phyA por PCR utilizando los oligonucleótidos 6964 y 6965 y el plásmido pAF-2S (descrito en la EP-A-0 420 358) como patrón. El fragmento de la PCR fue clonado en el sitio Smal del vector pTZ18R, dando como resultado el pTZFytl. El análisis de la secuencia del inserto del pTZFytl no reveló desviaciones de la secuencia presente en el pAF2-2S. Se aisló un fragmento Ascl-Pacl de 1.7 kb que comprende la secuencia de phyA completa, del pTZFytl y se clonó en el pGBFin2 digerido con Ascl-Pacl, dando como resultado el vector pGBFin 5 (véase la Figura 2) . 1.2.C Transformación de Aspergillus piger DS2978 con pGBFin5 El plásmido pGBFin 5 (100 g) fue digerido con Notl (150 Unidades, 4 horas a 37°C). La proteína fue removida por extracción con un volumen igual de Fenol-Cloroformo- 10 Alcoholisoamílico (24:23:1). El ADN se concentró por precipitación con alcohol y se utilizó para la transformación de A. niger DA2978 como se describió. Los transformantes fueron purificados sobre placas de medio mínimo selectivo y se almacenaron posteriormente. 15 1.2.d Análisis de los transformantes de pGBFin5 La dirección del cásete de integración del sitio glaA fue analizada para 24 transformantes independientes, utilizando los oligonucleótidos 5454 y 5456, y para la presencia del gen phyA utilizando los oligonucleótidos específicos del phyA 6964 y 665. Se encontró un producto de PCR indicativo de la dirección correcta del cásete de integración pGBFin5 a un sitio glaA en un alto número de transformantes (12 de 24 = 50%), aunque todos los transformantes mostraron un producto de la PCR indicativo de la presencia de una copia de phyA en su genomio. Se analizaron seis transformantes positivos para la producción de fitasa en un experimento de fermentación en frasco con agitación. La actividad de fitasa para todos los transformantes fue de 140-180 U/ml. Tal nivel de producción es indicativo de la integración de una copia del pGBFin5 en cada transformante. Se concluyó que ambas de las frecuencias de dirección y niveles de expresión eran suficientes para utilizar el sistema de expresión diseñado en los experimentos de clonación por expresión.

EJEMPLO 2 2.1 Construcción y análisis de una biblioteca de ADNc 2.1.a Fundamento Las bibliotecas de expresión se construyeron a partir de un conjunto de ARNm que se esperaba comprendiera los transcritos de expresión de interés. Por esta razón es preferible, aunque usualmente no se necesario, aislar el ARNm del micelio aislado de un cultivo crecido bajo condiciones inductoras. El ARNm aislado se analizó para detectar la presencia del transcripto de interés y para la calidad del ARNm. Si el ARNm está intacto y comprende el transcripto de ínteres puede ser utilizado para la síntesis de ADNc. La clonación del ADNc en el vector de expresión pGBFm2 requiere la presencia de un sitio Pací sobre el extremo 5 y de un sitio AscI en el extremo 3' del ADNc. Por lo tanto, el oligonucleotido cebador de la primera hebra y las secuencias adaptadoras utilizadas fueron diseñadas para satisfacer esos prerrequisitos . El adaptador fue diseñado de tal manera que es compatible con el sitio Pací en el pGBFm2 mientras que el sitio Pací no es restablecido después de la ligación del ADNc en el vector. Esto hace posible la discriminación entre moléculas de vector que comprenden un inserto de ADNc y moléculas de vector sin inserto. 2.2 Preparación de una biblioteca de ADNc de A. tubigensis. ARNm inducido para la actividad de xilanasa. Se hizo crecer A. tubigensis DS116813 (CBS 323.90) bajo condiciones inductores. Se tomaron muestras de medio a diferentes tiempos y se analizaron para determinar la actividad de xilanasa. Se alcanzo una actividad máxima después de 66 horas de cultivo, mientras que los niveles de actividad de xilanasa permanecieron constantes hasta 7 días después del inicio del experimento. Se tomaron muestras de micelio a diferentes tiempos y se aislo el ARN total de esas muestras. Se analizo la presencia de transcriptos específicos de xylA en un experimento de manchado Northern utilizando una sonda especifica de xilanasa. Se determinaron los niveles máximos de ARNm de xylA después de 48 horas de inducción aunque el ARNm de xylA fue aún detectable 66 horas después. Después de una incubación prolongada del micelio en medio inductor no hubo ARNm de xylA detectable. En todos los casos el transcripto específico de xylA estuvo aparentemente intacto. Del ARN total aislado después de 48 horas de inducción se aisló el ARNm. Después del análisis Northern, que muestra que el ARNm de xylA estuvo intacto, este ARNm fue utilizado para la síntesis de ADNc (de acuerdo al sistema de elección Superscript™ [Gibco-BRL] ) utilizando el oligonucleótido 6967 como un cebador para la síntesis de la primer hebra. Después del recocido de un enlazante específico de Pací, el ADNc fue digerido con AscI y separado por tamaño utilizando columnas de Sephacryl suministradas con el equipo de síntesis de ADNc [sistema de elección SuperscriptMR [GibcoBRL] ) . Ambos del ARNm y ADNc fueron analizados para determinar la presencia de xylA intacto en las muestras utilizando análisis de manchas Northern y Southern respectivamente y por análisis por PCR. El ADNc resultante fue ligado en pGBFin 2 digerido con Ascl-Pacl e introducido por electroporación en E. coli dando como resultado una biblioteca primaria de aproximadamente 17000 transformantes.

El análisis de 24 colinas al azar revelo 5 plasmidos sin inserto, mientras que los plasmidos restantes tuvieron tamaños de inserto de entre 0.5 y 2 kb. La biblioteca de E. coli fue reunida desprendiendo las placas en un volumen total de 25 mi de medio 2xTY. Se utilizaron 10 mi de medio para preparar patrones de glicerol mientras que el 2xTY se agrego al resto de la suspensión de E. coli a un volumen final de 100 mi. El ADN del plasmido fue aislado de este cultivo después de 2 horas de crecimiento a 37°C.

EJEMPLO 3 3.1 Construcción y an lisis de una biblioteca de expresión en A. niger 3.1.a Fundamento Se transformo A . niger DS2978 utilizando el ADN aislado de la biblioteca de ADNc en E. coli , como se describió en el Ejemplo 2.2 anteriormente. Los transformantes se seleccionaron por la presencia del marcador de selección amdS creciendo sobre acetamida como única fuente de N. Puesto que ambos del marcador de selección amdS y el cásete de expresión de ADNc están presentes sobre el fragmento de integración que crece sobre acetamida esto es indicativo de la presencia de un cásete de expresión de ADNc. Las conidiosporas de los transformantes positivos al amdS se --*- *"- * transfirieron a placas de medio selectivo para evitar el aislamiento de falsos positivos y posteriormente se transfirieron a placas microtituladoras que comprendían rebanadas de PDA solidificado. Esta biblioteca maestra se utilizó para la selección de la producción de enzimas de interés, por ejemplo xilanasa. Puesto que sería útil si los transformantes que producen enzimas pudieran ser utilizados directamente para la producción de enzimas a gran escala es de interés determinar los niveles de producción de enzimas en fermentaciones en frascos con agitación. 3.2 Transformación de A. niger DS2978. Se aisló el ADN de la biblioteca de ADNc de E. coli amplificada como se describió. El ADN plasmídico total (100 g) fue digerido durante 4 horas a 37°C con ?fotl (150 U) para remover las secuencias plasmídicas derivadas de E. coli y con Pací (30 U) . Después de la purificación del ADN por extracción con un volumen igual de fenol : cloroformo: alcohol ísoamílico (24:23:1) el ADN fue recuperado por precipitación con alcohol y disuelto en 100 1 de agua desmineralizada estéril. Se efectuaron transformaciones múltiples de A. niger DS2978 utilizando 2.107 protoplastos y 10 g de ADN plasmídico. Después de aproximadamente 10 días de incubación a 30°C, se retiraron 1900 transformantes y las conidiosporas fueron transferidas a placas que contenían un medio selectivo.

Después de 3 días de incubación a 30°C las conidiosporas de cada transformante fueron transferidas a pozos individuales en un disco microtitulador de 96 pozos, cada pozo conteniendo aproximadamente 100 1 de PDA solidificado. 3.3 Análisis de la biblioteca de expresión de A. niger. Las conidiosporas de transformantes individuales fueron transferidas a placas de detección de xilanasa hechas de medio mínimo para Aspergill us (6g de NaN03, 0.52 g de KCl, 1.52 g de KH2P04, 1.12 mi de KOH 4 M, 0.52 g de MgS04.7H20, 22 mg de ZnS04.7H20, 11 mg de H3B03, 5 mg de FeS04 7H20, 1.7 mg de CoCl2.6H20, 1.6 mg de CuS04.5H20, 5 mg de MnCl2.2H20, 1.5 mg de Na2Mo04.2H20, 50 mg de EDTA, 10 g glucosa) suplementado con 2% de xilano desleído de avena al 2% y agar bacteriológico #1 al 2% (Oxoíd, Inglaterra) , el cual tuvo una apariencia turbia debido a la presencia del xilano disuelto Después de 2 días de incubación a 30°C pudo observarse la formación de un halo de 10 colonias, indicando la degradación del xilano por las xilanasas. Se aislaron conidiosporas de transformantes positivos y se utilizaron para inocular placas de PDA. El ADN fue aislado de las colonias simples y analizado por PCR para la integración del plasmido de expresión en el sitio glaA ("dirección") utilizando los oligonucleotidos 5454 y 5456. 8 de las 17 colonias mostraron estar dirigidas a uno de los sitios glaA (47%). 3.4 Análisis de los niveles de producción de xilanasa en los transformantes Los transformantes que producen xilanasa, identificados en el ensayo de placa de xilanasa, se hicieron crecer en fermentación en frasco con agitación. Se tomaron muestras de medio después de 5 días de fermentación y se analizaron para determinar la actividad de la xilanasa. Los resultados se presentan en la Tabla I. 3.5 Análisis genético de las cepas que producen xilanasa 3.5.a Fundamento Han sido encontrados múltiples genes que codifican para la xilanasa en hongos. Por lo tanto, fue de ínteres determinar si cada cepa que produce xilanasa identificada en el experimento de clonación por expresión contiene un ADNc idéntico. Ademas, se encontraron diferencias claras entre las cepas individuales que producen xilanasa. Esas diferencias podrían ser causadas tanto por la presencia de diferentes genes que codifican para la xilanasa como por diferencias en la región no codificadora 5' del ADNc. Esto ultimo podría deberse a una degradación parcial del ARNm durante el ^dfita^Ui^ procedimiento de aislamiento del ARN o ARNm o debido a la síntesis incompleta de ADNc. Para investigar esto se determinaron las secuencias 5' de los ADNc introducidos. 3.5.b Análisis de las clonas que producen xilanasa. Se prepararon patrones de PCR por cada transformante que produce xilanasa como se describió. Los transformantes fueron analizados por la presencia de un constructo de expresión que comprende ADNc de xylA en un experimento de PCR utilizando los oligonucleótidos 6856 ( xylA interno) y 6963 { PgiaA) - Los transformantes #5C2 y #7A8 mostraron comprender un cásete de expresión con el gen xylA fusionado al Pg?aA . Utilizando los oligonucleótidos 6963 ( PgiaA especifico) y 6967 (específico del ADNc del extremo 3' ) se generaron fragmentos de PCR los cuales se esperaba comprendieran todo el ADNc asi como 200 pb del PgiaA- Se determinó una secuencia de ADN parcial de los fragmentos de PCR utilizando un nucleótido 6963 para seis transformantes. Se detectaron secuencias indicativas de la presencia de ambos del gen xylA (2 clonas) y el xylB (4 clonas) (las secuencias de ADN del xylA y xylB se describen en nuestras solicitudes de patente anteriores EP-A-0 463 706 y WO 94/14965, respectivamente) . Se encontraron diferentes longitudes de la región no traducida 5' . Sin embargo, no pudo observarse relación entre la longitud de la región no traducida 5' del ADNc y los niveles de producción de xilanasa de los diferentes transformantes de xylB En contraste, la región no traducida 5' corta encontrada en el transformante #SC2 positivo al xylA dio como resultado una reducción significativa en la actividad de XYIA. Sin embargo, esta claro que los niveles de producción fueron aun suficientes para identificar este transformante en un ensayo en placa.

Tabla I. Análisis de los transformantes que producen xilanasa. Los transformantes positivos fueron analizados para determinar los niveles de producción de xilanasa en un experimento de fermentación. La identidad de los genes que codifican para la xilanasa se determino secuenciando parcialmente el inserto de ADNc. Los detalles se describen en el texto.

Tabla 1 Tabla 1 (continuación) nd = no determinado EJEMPLO 4 4.1 Construcción y análisis de un vector de expresión integrable aplicable para la clonación del ADNc (pGBFINll) mediada por EcoRI-Xhol 4.1.a Fundamento Se construyeron bibliotecas de expresión de conjunto de ADNc. El ADNc que codifica para la actividad deseada se separo (detecto) vía un formato de separación descrito anteriormente. Puesto que las características exactas del ADNc (por ejemplo los sitios de enzima de restricción presentes dentro del ADNc) en la mayoría de los casos no se conocen antes de la identificación real debido a la ausencia de sitios de restricción en el ADNc. Por lo tanto, existe la posibilidad de que en la construcción como se describió en el ejemplo 2 el ADNc desea do contenga a un sitio AscI interno y de este modo sea clonado como una clona inactiva de longitud no completa que no puede ser separada.

Como una consecuencia ha sido construido el plasmido pGBFINll el cual permite la clonación de ADNc con extremos cohesivos de EcoRI-Xhol sin evitar el peligro de sitios de restricción internos. El cebador 3' utilizado para la síntesis de la primera hebra de ADNc contiene un sitio Xhol (no metilado) mientras que durante la síntesis de ADNc se utilizan dCTP metilados. Como consecuencia los ADNc pueden ser digeridos con Xhol evitando la fragmentación de los ADNc debido a los sitios Xhol internos (esos sitios Xhol están metilados y de este modo no digeridos) . El pGBFINll es un vector derivado del pGBFIN2 en el cual los sitios Xhol y EcoRI existentes han sido removidos después de lo cual el sitio de clonación del ADNc ha sido cambiado de Pacl-Ascl a EcoRI-Xhol. De este modo, todas las características y funcionalidades en el vector de expresión son idénticas excepto los sitios de restricción utilizados para la clonación de los ADNc 4.1.b Construcción de vector pGBFINll En un primer paso los Xhol, HindIII, Seal y EcoRI presentes en el extremo 5' del promotor gpdA fueron removidos vía PCR y se introdujo un sitio de corte SnaBI (raro), dando como resultado el constructo intermedio PGBFIN12 En un segundo paso de la PCR el promotor glaA existente y el sitio de clonación de ADNc fueron ajustados de tal manera que I) el sitio de clonación de ADNc Pacl-Ascl fue cambiado al sitio de clonación EcoRI-?hoI, II) al mismo tiempo el EcoRI en el promotor fue mactivado, III) al mismo tiempo el promotor fue acortado (comenzando desde el sitio Salí en la posición 6084 en el pGBFIN2 en lugar de comenzar desde el sitio Xhol en la posición 5289 en el pGBFIN2) y IV) al mismo tiempo el sitio Xhol presente en la posición 5289 fue inactivado y se introdujo una (segunda) enzima de restricción cortante rara.

El plasmido resultante (pGBFINll) se describe en la Figura 3. 4.2 Expresión de fitasa utilizando el vector pGBFINll 4.2.a Fundamento En el pGBFINll ha sido insertado un gen de prueba (por ejemplo fitasa) en una forma similar como ha sido descrito en el ejemplo 1.2 para el vector pGBFIN2. El vector resultante, pGBFIN13, ha sido probado junto con el vector pGBFIN5 para demostrar la funcionalidad de este vector tipo pGBFINll. 4.2.b Construcción de un vector de expresión de fitasa, pGBFIN13 De manera similar a la situación descrita para el vector pGBFIN2 (ejemplo 1; 1.2.b), también se probo la funcionalidad del vector pGBFINll vía el uso de un gen modelo, phyA. 4.2.C Transformación de Aspergillus niger con pGBFIN13 De manera similar a la situación descrita para el vector pGBFIN2 (ejemplo 1; 1.2.c) el vector pGBFIN13 fue digerido con ?Jotl para generar el fragmento lineal que podría ser utilizado para dirección durante la transformación.

Después de la transformación, se purificaron transformantes seleccionados aleatoriamente para permitir el análisis subsecuente . 4.2.d Análisis de los transformantes pGBFIN13 Nuevamente, de manera similar a la situación descrita para el vector pGBFIN2 (ejemplo 1; 1.2.0) fueron probados los transformantes pGBFIN13 purificados para la dirección de los constructos al sitio correcto para la expresión de la fitasa. Ambas de las frecuencias de dirección y expresión de la fitasa estuvieron en el intervalo de lo que ha sido descrito anteriormente para los transformantes de pGBFIN2. De este modo, se concluyo que para el vector pGBFINll tanto la frecuencia de dirección como los niveles de expresión fueron suficientes para el uso del sistema de expresión diseñado en la clonación por expresión de ADNc con extremos cohesivos de EcoRI-Xhol . .1.a Fundamento Tras la demostración de la funcionalidad del vector pGBFINll fue probado el sistema de clonación por expresión completa basado en este tipo de vector (extremos cohesivos de EcoRI-Xhol . Puesto que la introducción de un sitio de clonación de ADNc de EcoRI-Xhol permitió el uso del equipo de clonación de ADNc de STRATAGENE, se probo la aplicabilidad de este sistema (el cual tiene el beneficio de evitar la digestión de ADNc intactos durante la digestión por restricción para generar el sitio de clonación cohesivo 3' ) en combinación con el nuevo vector pGBFINll. De manera similar a lo que ha sido descrito en los ejemplos 2 y 3, se utilizo un conjunto de ARN derivado de A . niger con el protocolo de STRATAGENE optimizado para la clonación en vectores pGBFIN como ha sido detallado en los materiales y métodos, un conjunto de ADNc (con extremos cohesivos de EcoRI-Xhol ) . Este conjunto de ADNc fue clonado en el vector pGBFINll para generar una biblioteca de E. coli Posteriormente, se compararon las eficiencias de la clonación con la construcción previa de la biblioteca en el vector pGBFIN2. .2.b. Preparación de una biblioteca de ADNc de un cultivo de Aspergillus inducido con xilanasa El micelio, del cual (como ha sido descrito anteriormente) se sabia que expreso xilanasas al momento de la cosecha fue utilizado para sustraer el ARN total como ha sido detallado en los Materiales y Métodos. Posteriormente, el ARN total reunido fue purificado adicionalmente por centrifugación a través de un colchón de CsCl. Tras verificar la calidad del ARN, se aislo el ARNm vía un protocolo modificado con el Equipo de Purificación de Pharmacia. Para la síntesis de ADNc se utilizo el EQUIPO de Síntesis de ADN de Stratagene. El protocolo de síntesis de ADNc correspondiente fue adaptado hacia la optimizacion de la clonación en los vectores pGBFm. Las adaptaciones principales incluyeron; 1) Las cantidades de ADNc se cuantificaron vía precipitación por TCA; 2) La fosforilación de los extremos de los ADNc se omitió y los ADNc fueron ligados al ADN del vector, el cual no se desfosfoplo . Esto previene la ligación de múltiples insertos en el vector (lo cual podría prevenir la expresión de varios si no es que de todos los insertos presentes en ese vector) . 3) El ADNc fue extraído con fenol/cloroformo después de la digestión con Xhol en lugar de después del fraccionamiento por tamaño. 4) Ambos del MMLV-RT y el Thermoscppt fueron utilizados en la síntesis de la primera hebra, lo cual dio como resultado ADNc con longitudes mayores que con el uso de cualquier enzima sola 5) Las reacciones de control fueron trazadas con [alfa32P] dATP (800 Ci/mmol, para prevenir la interferencia con la síntesis) para el control de calidad. Se construyo un conjunto de ADNc de acuerdo al protocolo asi modificado. Para el pGBFmll, se preparo un conjunto de vectores pGBFinll (EcoRI-Xhol ) pobremente digerido (ligación antecedentes < 1%) . El conjunto de ADNc generado fue ligado en el vector pGBFmll y transformado a células bacterianas de E. coil XLIO-Gold para generar una biblioteca. .1.c. Análisis de la biblioteca de ADNc de E. coli (en el vector pGBFmll) El procedimiento descrito ya en este ejemplo dio como resultado un incremento significativo en la eficiencia de la ligación y transformación. Con el conjunto de ADNc aislado de acuerdo al procedimiento optimizado fue posible obtener en combinación con el conjunto de vectores pGBFmll doblemente digerido para obtener una biblioteca de E. coli de un tamaño de 106-107 comenzando con 1 ug de pGBFmll. A continuación, vía experimentos de hibridación, se estableció la frecuencia de ADNc de gpdA y xylB en la biblioteca de ADNc de E . con . Puesto que el gen gpdA representa un gen relativamente largo y el gen xylB es relativamente corto, la comparación de los porcentajes de longitud total de las clonas podría aclarar la calidad de los ADNc generados y la identidad si existieran diferencias en la eficiencia de generación de ADNc de longitud completa entre los ARNm cortos y largos. Tras la identificación de las clonas xylB y gpdA positivas, se secuencio un numero seleccionado para determinar los porcentajes de clonas con longitud completa dentro de la población de ADNc originada de esos genes particulares. Ambos ADNc de gpdA y xylB mostraron que el porcentajes de clonas de longitud completa fue superior al 85%. Ademas, el secuenciamiento mostró que ninguna de las clonas contenía insertos múltiples. De este modo, se concluyo que el protocolo de purificación de ARN, síntesis de ADNc y clonación optimizada dio como resultado una mejora considerable en la eficiencia y calidad de la construcción de la biblioteca de ADNc (en términos del tamaño y frecuencias de la bibliotecas, en términos de los porcentajes de longitud completa y en términos de la clonación únicamente un inserto de ADNc en el vector de expresión) . .1.d. Transformación de constructos de pGBFinll que contienen xylB a A. niger y separación por la actividad de xilanasa Un numero de clonas de xylB identificadas (y analizadas en 5.1.c) fueron transformadas a A. niger (de manera similar a lo que ha sido descrito para los vectores pGBFm5 y pGBFml3) . Después de la purificación de un numero seleccionado de transformantes esos transformantes fueron separados sobre placa para determinar la actividad de xilanasa. Todos los transformantes probados fueron positivos en el ensayo de placa para la xilanasa, demostrando la aplicabilidad del vector pGBFinll para propósitos de clonación por expresión en A. Niger.

EJEMPLO 6 6.1 Construcción de un segundo vector de expresión integrable aplicable para la clonación del ADNc (pGBFin22) mediada por EcóRT-Xhol 6.1.a Fundamento Durante la construcción del vector pGBFinll se secuenció el segundo fragmento de la PCR (utilizado para inactivar el sitio EcoRI en el promotor de glucoamilasa, entre las otras modificaciones listadas en el ejemplo 4) para probar la modificación correcta. Esto demostró la modificación correcta de los sitios de restricción indicados pero también mostró un número de errores de PCR pequeños en las partes más corriente arriba del promotor de la glucoamilasa. Por lo tanto en base a la región promotora de la glicoamilasa sin cambio en el pGBFinl2 se construyó un nuevo vector en el cual los errores introducidos por la PCR estuvieron ausentes y el cual fue adecuado para clonar ADNc con extremos cohesivos de EcoRI-Xhol. 6.1.b Construcción del vector de expresión pGBF?n22 En el pGBF?nl2 (Figura 3) el sitio Xnol restante fue mactivado después de la digestión con Xhol vía el llenado del extremo con ADN polimerasa T4 y la retroligacion dio como resultado el pGBFml7 (véase la Figura 6) . En el pGBF?nl7 el sitio £coRI restante fue removido de manera similar (digestión con £coRI seguida por el llenado del extremo con ADN polimerasa T4 y retroligacion) , lo cual dio como resultado el plasmido pGBFmld (véase la Figura 7). Los cebadores que contienen sitios de restricción de £coRI y Xhol y (tras el recocido juntos) que contienen extremos cohesivos para Pací y AscI fueron recocidos. Los cebadores fueron construidos de tal manera que tras la clonación de los cebadores recocidos en el pGBFml8 digerido con Pací y AscI no se genero ATG (extra) en el sitio de clonación de los ADNc. De este modo, mediante la clonación de los cebadores recocidos descritos en el pGBFinlß digerido con Pací y AscI se genero un sitio de clonación para los ADNc con los extremos cohesivos de EcoRI-Xhol . El plasmido asi obtenido fue nombrado pGBFm22 (véase la Figura 8). 6.2 Expresión de la fitasa utilizando el vector pGBFin22 6.2.a Fundamento En el vector pGBFin22 ha sido insertado un gen de prueba (por ejemplo de la fitasa) en una forma similar a la que ha sido descrita en el ejemplo 4 para el vector pGBFinll.

El vector resultante, pGBFin25, ha sido probado para la producción de fitasa asi como por su funcionalidad. 6.2.b Construcción de un vector de expresión de fitasa, pGBFin25 El pGBFinl3 fue digerido con £coRI para liberar el gen de la fitasa. Este fragmento de gen £coRI que codifica para la fitasa fue clonado en el pGBFin22. Tras la identificación de una clona con la orientación correcta del gen de la fitasa, esta clona fue designada como pGBFin25. 6.2.c Transformación de A. niger con pGBFin25 y análisis de los transformantes del pGBFin25 El pGBFin25 fue utilizado para la transformación a A . niger y el análisis subsecuente de los transformantes como ha sido detallado en los ejemplos 1 y 4 para los transformante del pGBFin5 y el pGBFinl3 respectivamente. Los resultados fueron similares como ha sido indicado para los transformantes del pGBFinl3 los cuales demuestran la aplicabilidad del vector pGBFin22 para propósitos de clonación por expresión.

EJEMPLO 7 7.1 Construcción de un vector de expresión integrable aplicable para la clonación del ADNc mediada por HipdlII-X ol, pGBFin23 7.1.a Fundamento Tras obtener el conjunto de vectores de clonación de expresión integrables descrito anteriormente se reconoció que la disponibilidad de un vector de clonación por expresión que podría ser útil para clonar ADNc con extremos cohesivos 5' del HindIII podría ser útil. Tanto en términos de poder utilizar conjuntos de ADNc que fueron ya construidos para otros propósitos de extremos cohesivos de HindlII-X oI y debido al hecho de que en este método no necesitan hacerse cambios al promotor de la glucoamilasa. 7.1.b Construcción de un vector de expresión de fitasa aplicable para la clonación de ADNc mediada por HíndIII-Xhol , pGBFin23 En el pGBFinl7 el sitio HindlII restante fue removido (digestión de fíindlll seguida por llenado del extremo con ADN polimerasa T4 y retroligación) , lo cual dio como resultado el plásmido pGBFinl9 (véase la Figura 9) . Se recocieron dos cebadores que contenían sitios de restricción HindI II y Xhol y (tras recocerlos juntos) que contenían extremos cohesivos para Pací y Ascl. Los cebadores fueron construidos de tal manera que tras la clonación de los cebadores recocidos en el pGBFinl9 digerido con Pací y AscI no se generó ATG (extra) en el sitio de clonación de los ADNc. De este modo, mediante la clonación de los cebadores recocidos descritos en el pGBFinl9 digerido con Pací y AscI se generó un sitio de clonación para los ADNc con los extremos cohesivos de HíndI I I-Xhol . El plásmido asi obtenido fue nombrado pGBFin23 (véase la Figura 10). 7.2 Expresión de fitasa utilizando el vector pGBFin23 7.2.a Fundamento En el vector pGBFin23 ha sido insertado un gen de prueba (por ejemplo de la fitasa) en una forma similar a lo que ha sido descrito en el ejemplo 4 para el vector pGBFinll. El vector resultante, pGBFin26 ha sido probado para la producción de fitasa para demostrar su funcionalidad. 7.2.b Construcción de un vector de expresión de fitasa, pGBF?n26 En este ejemplo el gen de la fitasa fue PCRed con un oligo 5' el cual contenía un sitio fíindlll y un oligo 3' que contenía un sitio X?oI . Tras la digestión con Hmdl I I y Xhol este fragmento fue clonado directamente en el pGBFm23, generando de este modo el pGBFm26. Tras el aislamiento de un numero de clonas que contenían el gen de la fitasa, los insertos de fitasa fueron secuenciados para verificar la introducción de errores de PCR putativos. Finalmente, se selecciono un plasmido pGBFm26 correcto (sin cambios en la secuencia de la proteina codificada) y se utilizo para la transformación y análisis subsecuente. 7.2.C Transformación de A niger con pGBFm26 y análisis de los transformantes del pGBFm26 El pGBFm26 fue probado para la transformación a A . niger y el análisis subsecuente de los transformantes como ha sido detallado en los ejemplos 1, 4 y 6 para los transformantes de pGBF?n5, pGBFml3 y pGBF?n25, respectivamente. Los resultados fueron similares a lo que ha sido indicado para los transformantes de pGBFml3, lo cual demostró la aplicabilidad del vector pGBFm23 para propósitos de clonación por expresión.

EJEMPLO 8 8.1 Construcción de vectores de expresión de plásmido a base de AMAl adecuados para la clonación por expresión del ADNc (pGBFin6 y pGBFinl5) 8.1.a Fundamento En otro ejemplo se utilizaron las funcionalidades para dirigir una alta expresión de los ADNc clonados y un marcador seleccionable en plásmidos los cuales contienen además una secuencia llamada AMAl. Como un resultado se generó un plásmido de clonación por expresión el cual fue mantenido de manera autónoma en Aspergillus . En este tipo de vectores de clonación de expresión se combinaron las frecuencias de transformación altamente eficientes obtenibles con vectores basados en el tipo AMAl y la funcionalidades que dirigen la alta expresión de los ADNc clonados. Se construyeron dos vectores de expresión los cuales difirieron en el gen marcador de selección utilizado para la selección de los transformantes en Aspergill us y ambos diseñados para los sistemas de clonación de expresión basados en AMAl. 8.1.b Construcción del vector pGBFin6 El pTZamdSX-2 (véase la Figura 2) fue linealizdo con HindIII después de lo cual el fragmento AMA 1 HindIII de .2 de A. nidulans (como lo descrito por Aleksenko y Clutterbuck, 1998) fue clonado en éste, dando como resultado el plásmido intermedio pAMAamdS . A continuación el pAMAamdS fue digerido con Knpl y BglII y se asisló un fragmento que contenía AMA 1 de aproximadamente 9 kb. Tras la digestión del vector pGBFin2 (véase la Figura 2) con Knpl y BglII se aisló el fragmento que contenia el promotor de glucoamilasa de 5.2 kb. El fragmetno de 5.2 kb derivado del pGBFin2 se clonó en el fragmento de 9 kb del pAMAamdS dando como resultado el plásmido de clonación de expresión basado en la selección de AMA 1 y acetamida pGBFind (véase la Figura 11) . 8.1.b Construcción del vector pGBFin 15 El pGBFin6 fue digerido con Xhol y el promotor de la glucoamilasa que contenía el fragmento fue aislado. A continuación, el plásmido pAN8-l (véase la Figura 12), que contenía el gen ble funcional (que codifica para la resistencia al a fleomicina) derivado por un promotor de gpdA A. nidulans y terminado por el terminador trpC utilizando como patrón en una reacción de PCR. Los cebadores de la PCR fueron diseñados de tal manera que se generó un fragmento que contenía un promotor de gpdA truncado (pero aún completamente funcional), el gen ble y un terminador trpC truncado (pero aún completamente funcional) el cual contenia además en ambos extremos del fragmento un sitio Xhol funcional. Además, el cebador 5" contenía un sitio HindIII el cual era necesario para los pasos de clonación adicionales (como se describe en detalle en la construcción del pGBFinl5). Tras la digestión con Xhol del procducto de PCR de aproximadamente 1.9 kb, éste fue clonado en el fragmento Xhol aislado previamente del pGBFin2. El plásmido resultante (pGBFinl4; véase la Figura 13) fue verificado por la orientación correcta vía análisis de restricción y por errores en la PCR via secuenciameiento . El pGBfínl4 fue linealizado con HindIII después de lo cual se insertó el fragmento HindIII de AMAl de 5.2 kb, dando como resultado el plásmido pGBFml5 (véase la Figura 14). 8.2 Expresión de fitasa en vectores basados en AMAl 8.2.a Fundamento Los constructos de expresión basados en AMAl fueron probados por la expresión de una fitasa de manera similar a lo que ha sido descrito para los vectores de expresión integrales. Nuevamente se insertó un gen de prueba (por ejemplo de fitasa) en una forma similar como ha sido descrito en el ejemplo 1 para el vector pGBFind. Los vectores ^^^^^ resultantes, fueron probados para la producción de fitasa para demostrar la funcionalidad y aplicabilidad ae los vectores de expresión basados en AMAl. 8.2.b Construcción del pGBFm7 y pGBF?nl6 Ambos vectores pGBFinß y pGBFinld se linealizaron vía una doble digestión con Pací y Ascl. A continuación el plasmido pGBFm5 fue digerido con Pací y AscI para liberar el fragmento que codifica para el gen de la fitasa (con extremos cohesivos de Pací y AscI) . Este fragmento de fitasa fue clonado directamente en los vectores pGBFmd y pGBFml5 digeridos para generar, pGBFm7 y pGBFinlß, respectivamente. 8.2. c Tranformación de Aspergillis niger con pGBFm7 y pGBFml6 El pGBFm7 y pGBFmlß fueron transformados a A . niger de acuerdo a los procedimientos descritos en los ejemplos previos y como se detalla mejor en Materiales y Métodos. Los transformantes de pGBFm7 fueron seleccionados sobre medios que contenían acetamida como única fuente de nitrógeno, mientras que los transformantes de pGBFml6 fueron seleccionados sobre medios que contenían fleomicina. Ambos plasmidos demostraron una secuencia de transformación significativamente incrementada en comparación con el tipo integrable de los vectores de expresión; las frecuencias de transformación de los plásmidos basados en AMAl fueron de hasta 105 transformantes por ug de plásmido. Los transformantes positivos fueron purificados sembrando nuevamente colonias únicas sobre medio selectivo y finalmente almacenando. 8.2.d Análisis de la expresión de fitasa en transformantes de pGBFinl6 Después de la purificación, 20 transformantes de pGBFinld seleccionados aleatoriamente fueron fermentados en frascos con agitación utilizando el mismo medio (en este caso suplementado con fleomicina) como ha sido descrito para los vectores integrables. Las muestras de fermentación fueron ensayadas para la producción de fitasa la cual fue demostrada en un intervalo en todos los casos (excepto para uno) de aproximadamente 40 U/ml a 60 U/ml. En un caso particular la expresión fue de 117 U/ml, la cual fue probablemente un resultado de la integración del plásmido pGBFinl6 en el genomio (véanse también los comentarios en el ejemplo 1; 1.2.d) . Esos resultados demuestran que los plásmidos basados en AMAl como se describe en este ejemplo pueden ser utilizados para dirigir la clonación por expresión en Aspergillus . Debido al uso de funcionalidad es en glaA las -aaa"-''-'J-' cuales son capaces de dirigir altos niveles de expresión de la producción de ADNc clonados, aunque reducidos en comparación con la expresión después de la integración en un sitio de alta expresión, la expresión es aun ciertamente suficientemente alta para la separación eficiente en una biblioteca de expresión que contenga AMAl, especialmente cuando se toma en cuenta la frecuencia de transformación significativamente incrementada. Una ventaja mas de los vectores basados en AMAl es proporcionada por el hecho de que la recuperación (aislamiento) de esos plasmidos de huespedes de expresión de hongos filamentosos se simplifica en comparación con los plasmidos integrables. La transformación directa de E. coli con el ADN total aislado del huésped en cuestión sera suficiente a este respecto. 7c LISTADO DE SECUENCIAS <110> Gist-brocades B.V. <120> separación por expresión en hongos filamentosos <130> 2865-p <140> <141> <160> 22 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleotido 5288 <400> 1 tagtacgtag cgcccacaat caaccattt cgctatagtt aaaggatgcg ga 52 <210> 2 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5289 <400> 2 gatcaggatc tccggatcaa tactcccggcg tat 33 <210> 3 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5290 <400> 3 atacgccgga ctattcatcc ggagatcctg ate 33 <210> 4 <211> 84 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5291 <400> 4 cggaaagctt cactgacgta accaggaccc ggcggcttat ccatcatggg aaacaacacc 60 tacaaatccg ccacaatact ctcg 84 <210> 5 <211> 45 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5292 <400> 5 gcaatcctcg aggtcccacc ggcaaacatc tgcccataga agaac 45 <210> 6 <211> 88 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5293 <400> 6 agtgaagctt tccgtggtac taagagagag gttactcacc gatggagccg tattcgccct 60 caagcaccgc gtgaccccac tattcgac 88 <210> 7 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5258 <400> 7 aatttgctcc cgcccgctcg agcggggaat tcccggtacg tacgca 46 <210> 8 <211> 46 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5359 <400> 8 agcttgcgta cgtaccggga attccccgct cgagcgggcg gccgca 46 <210> 9 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótído 5361 <400> 9 ccaggacgcg gccgcttatc catcatggga 30 <210> 10 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5361 <400> 10 tagtacgtac aatcaatcca tttcgctat 29 <210> 11 <211> 44 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5367 <400> 11 cccaagcttg cggccgcgtc ctggttacgt cagtgatgtt tccg 44 <210> 12 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5454 <400> 12 tccgcatgcc agaaagagtc accgg 25 <210> 13 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 5456 <400> 13 gcatccatcg gccaccgtca ttgga 25 <210> 14 <211> 39 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 6856 <400> 14 cggcagagta ggtgatagcg ttagaagaac cagtggtcc 39 <210> 15 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleotido 6963 <400> 15 acggaattca agctagatgc taagcgatat tgc 33 <210> 16 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleotido 6964 <400> 16 ttaattaact cataggcatc atgggcgtc 29 <210> 17 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleotido 6965 <400> 17 ggcgcgccga gtgtgattgt ttaaagggtg at 32 <210> 18 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleotido 6967 <400> 18 atcatcggcg cgcctttttt tttttttttt tt 32 <210> 19 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleotido 7423 <400> 19 ggaattctcg aggccgcaag ctcagcgtcc aattc 35 <210> 20 <211> 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 7424 <400> 20 ggaattctcg agcacgcatg gttgagtgg tatgg 35 <210> 21 <211> 17 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleótido 7676 <400> 21 taggcccatat gggccat • 17 <210> 22 <211> 15 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> oligonucleotiao 7677 <400> 22 ggcccatatg gccta 15 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la practica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Un método para aislar una secuencia de ADN que codifica para una proteína con propiedades de interés, el método se caracteriza porque comprende los pasos de: (a) preparar, en un vector de clonación adecuado, una biblioteca de ADN de un organismo que se sospecha es capaz de producir una o más proteínas con propiedades de interés; (b) transformar células huésped de hongos filamentosos con la biblioteca de ADN; (c) cultivar las células huésped obtenidas en (b) bajo condiciones que conduzcan a la expresión de la secuencia de ADN que codifica para las proteínas con propiedades de interés presentes en la biblioteca de ADN; y (d) separar las clonas de las células huésped transformadas que expresan una proteína con propiedades de interés mediante el análisis de las proteínas producidas en (c) .
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el veda- de clonación comprende un fragmento de ADN el cual es homólogo a una secuencia de ADN en un sitio objetivo predeterminado en el genoma de la célula huésped de hongo filamentoso.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el sitio objetivo predeterminado comprende un gen altamente expresado.
4. El método de conformidad con las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque la célula huésped de hongo filamentoso comprende más de una copia del sitio objetivo predeterminado.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque vector de clonación es un vector el cual es capaz de mantenerse autónomo en una célula huésped de hongo filamentoso.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el vector es capaz de mantenerse autónomo en un vector que comprende una secuencia de AMAl.
7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la secuencia de ADN que codifica para la proteína con propiedades de interés se expresa de un promotor el cual se deriva de un gen de hongo filamentoso altamente expresado.
8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la célula huésped de hongo filamentoso es de una especie del género Aspergill us o Trichoderma .
9. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la célula huésped de hongo filamentoso es de una especie del genero Aspergill us nidulans , Aspergill us oryzae, Aspergill us sojae, las especies del grupo Aspergill us y Tp choderma reesei .
10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el organismo que se sospecha es capaz de producir una o mas proteínas con las propiedades de ínteres es un eucariote.
11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el eucariote es un hongo, de manera preferible un hongo filamentoso.
12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la protema con las propiedades de ínteres es una enzima.
13. Un proceso para producir una protema con propiedades de ínteres en una célula huésped adecuada, el proceso se caracteriza porque comprende los pasos de transformar la célula huésped con una secuencia de ADN que codifica para la protema con propiedades de ínteres, la secuencia de ADN ha sido aislada por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, cultivar la célula huésped transformada ba o condiciones que conduzcan a la expresión de la secuencia de ADN que codifica para la protema, y recuperar la protema.
14. Un proceso para producir una proteína con propiedades de interés, el proceso se caracteriza porque comprende los pasos de cultivar una célula huésped transformada bajo condiciones que conduzcan a la expresión de la secuencia de ADN que codifica para la proteína, y recuperar la proteína, por lo que la célula huésped transformada es una clona que expresa la proteína con las propiedades de interés de acuerdo a lo obtenido por el método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-12.