MX2014009427A

MX2014009427A - Anticuerpos cd47 y metodos de uso de los mismos.

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Publication number: MX2014009427A
Application number: MX2014009427A
Authority: MX
Inventors: Brendan Eckelman; John Timmer; Amir Razai; Quinn Deveraux; Kyle Jones; Peter L Nguy
Original assignee: Inhibrx Llc
Priority date: 2012-02-06
Filing date: 2013-02-06
Publication date: 2015-05-11
Also published as: EA201400875A1; US20150238604A1; KR20200040897A; PT2812443T; ES2743203T3; ZA201405864B; US20160251435A1; CN104271757B; PE20141908A1; EP2812443A1; EP3578569A1; HK1205195A1; CR20140406A; IL233934B; KR102338833B1; SG10201700160RA; BR112014019331A8; ME03512B; PH12014501758B1; PL2812443T3

Abstract

Esta invención se relaciona generalmente a anticuerpos monoclonales que reconocen CD47, más específicamente a anticuerpos CD47 que no causan un nivel significativo de aglutinación de células, a métodos para generar estos anticuerpos y a métodos para usar estos anticuerpos monoclonales como agentes terapéuticos.

Description

ANTICUERPOS CD47 Y METODOS DE USO DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION Esta invención se relaciona generalmente a anticuerpos monoclonales que reconocen CD47, más específicamente a anticuerpos CD47 que no causan un nivel significativo de hemaglutinacíón de los glóbulos rojos humanos, a métodos para generar estos anticuerpos y a métodos para utilizar estos anticuerpos monoclonales como agentes terapéuticos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CD47, también conocida como proteína asociada a integrina (IAP), el antígeno de cáncer ovárico OA3, antígeno relacionado con Rh y MER6, es un receptor de transmembrana de multi-extensión que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulina. La expresión y/o actividad de CD47 se ha implicado en un número de enfermedades y trastornos. Por consiguiente, aún existe una necesidad por terapias que se dirijan a CD47.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que reconocen y enlazan a CD47, particularmente CD47 humana. Los anticuerpos de la invención son capaces de modular, por ejemplo, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o de otra manera interferir con la expresión, actividad y/o señalización de CD47, y estos anticuerpos no causan un nivel significativo de hemaglutinación de los glóbulos rojos humanos, también referidos en la presente como eritrocitos. Sin embargo, la habilidad de los anticuerpos de la presente invención para enlazar CD47 sobre la superficie celular y no causar un fenómeno de amontonamiento celular no está limitada a los glóbulos rojos. Los anticuerpos de la presente invención únicamente enlazan CD47 en una manera que no promueve el amontonamiento de células positivas de CD47. Los anticuerpos de la invención y derivados de los mismos son capaces de modular, por ejemplo, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o de otra manera interferir con la interacción entre CD47 y SIRPa (proteína reguladora de señal a) y estos anticuerpos no causan un nivel significativo de hemaglutinación de los glóbulos rojos humanos. Los anticuerpos proporcionados en la presente son referidos colectivamente como "anticuerpos CD47". Los anticuerpos CD47 de la invención son una mejora significativa sobre los anticuerpos CD47 existentes que causan hemaglutinación de los glóbulos rojos humanos (Ver, por ejemplo, Kikuchi Y, Uno S, Yoshimura- Y y colaboradores. A bivalent single-chain Fv fragment against CD47 induces apoptosis for leukemic cells. Biochem Biophys Res Com un 2004; 315: 912-8). Por ejemplo, los anticuerpos CD47 de la invención son una mejora significativa sobre los anticuerpos CD47 existentes B6H12, BRC126 y CC2C6, cada uno de los cuales bloquean SIRPa, pero causan hemaglutinación de RBCs, como es descrito en detalle enseguida. Los anticuerpos CD47 de IgG completos de la presente invención (por ejemplo, 2A1 y sus derivados humanizados incluyendo aquellos proporcionados en la Tabla 1) no aglutinan las células a un nivel significativo. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 de la invención no hemaglutinan los glóbulos rojos (RBCs). Se describe en la presente los primeros anticuerpos CD47 en un formato de IgG completo que bloquea SIRPa y no causa un nivel significativo de aglutinación.

Los anticuerpos CD47 de la invención exhiben numerosas características deseables, tales como, a manera de ejemplo no limitante, el bloqueo potente de la interacción entre CD47 y su ligando SIRPa, sin causar un nivel significativo de hemaglutinación de eritrocitos, así como actividad anti-tumor potente. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 de la invención bloquean por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 95% o por lo menos 99% de la interacción entre CD47 y SIRPa como es comparado con el nivel de interacción entre CD47 y SIRPa en la ausencia del anticuerpo CD47 descrito en la presente.

Los anticuerpos CD47 de la invención no causan un nivel significativo de aglutinación de células, por ejemplo, los anticuerpos CD47 de la invención no causan un nivel significativo de hemaglutinación de glóbulos rojos. En algunos casos, un nivel significativo de aglutinación de células se refiere al nivel de aglutinación en la presente de anticuerpos CD47 existentes. En un aspecto, el nivel de aglutinación en la presencia de los anticuerpos CD47 de la invención se reduce por al menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 99% comparado con el nivel de aglutinación en la presencia de anticuerpos CD47 existentes. En algunas modalidades, los anticuerpos CD47 de la invención no causan un nivel significativo de aglutinación si el nivel de aglutinación en la presencia de los anticuerpos CD47 de la invención se reduce por al menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 99% comparado con el nivel de aglutinación en la presencia de anticuerpos CD47 existentes. En otras modalidades, los anticuerpos CD47 de la invención no causan un nivel significativo de aglutinación si el nivel de aglutinación en la presencia de los anticuerpos CD47 de la invención se reduce por al menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 99% comparado con el nivel de aglutinación en la presencia de anticuerpo CD47, 1B4, que comprende una secuencia de cadena pesada variable y cadena ligera variable proporcionada en SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81, respectivamente. De preferencia, los anticuerpos CD47 de la invención no causan un nivel significativo de aglutinación de células en una concentración de anticuerpo de entre 10 Pm y 10 mM, por ejemplo, en una concentración de anticuerpo de 50 pM, 100 pM, 1 nM, 10 nM, 50 nM, 100 nM, 1 mM o 5 mM.

Los anticuerpos de la presente invención también son significativamente más potentes en modelos de tumor comparados con los anticuerpos conocidos en la téenica. Por ejemplo, la habilidad de los macrófagos para fagocitar células de tumor en la presencia de anticuerpos CD47 de la invención se incrementa por al menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 99% comparado con la habilidad de los macrófagos para fagocitar células de tumor en la presencia de anticuerpos CD47 existentes.

Aquellos expertos en la técnica reconocerán que es posible cuantificar, sin experimentación indebida, el nivel de aglutinación, por ejemplo, el nivel de hemaglutinación de RBCs. Por ejemplo, aquellos expertos en la técnica reconocerán que el nivel de hemaglutinación es averiguado al medir el área de un punto de RBC después de realizar un ensayo de hemaglutinación en la presencia de los anticuerpos CD47 de la invención, como es descrito en los Ejemplos enseguida. En algunos casos, el área del punto de RBC en la presencia del anticuerpo CD47 de la invención se compara con el área del punto de RBC en la ausencia de un anticuerpo CD47, es decir, en la presencia de cero hemaglutinación. De esta manera, la hemaglutinación se cuantifica con relación a un control de linea de base. Un área de punto de RBC más grande corresponde a un nivel más alto de hemaglutinación. Alternativamente, la densitometría del punto de RBC también se puede utilizar para cuantificar la hemaglutinación.

Los anticuerpos CD47 descritos en la presente son útiles en el tratamiento, retardo de la progresión de, prevención de la recaída de, o alivio de un síntoma de un cáncer u otra condición neoplásica. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 descritos en la presente son útiles en tratar malignidades hematológicas y/o tumores, por ejemplo, malignidades hematológicas y/o tumores. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 descritos en la presente son útiles en tratar tumores de CD47+. A manera de ejemplo no limitante, los anticuerpos CD47 descritos en la presente son útiles en el tratamiento de linfoma no de Hodgkin (NHL), leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia mielógena crónica (CML), mieloma múltiple (MM), cáncer de mama, cáncer ovárico, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de vejiga, melanoma, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, cáncer de pulmón, leiomioma, leiomiosarcoma, glioma, glioblastoma y asi sucesivamente. Los tumores sólidos incluyen, por ejemplo, tumores de mama, tumores ováricos, tumores de pulmón, tumores pancreáticos, tumores de próstata, tumores de melanoma, tumores colorrectales, tumores de pulmón, tumores de cabeza y cuello, tumores de vejiga, tumores esofágicos, tumores de hígado y tumores de riñón.

Como se utiliza en la presente, "cáncer hematológico" se refiere a un cáncer de la sangre, e incluye leucemia, linfoma y mieloma entre otros. "Leucemia" se refiere a un cáncer de la sangre en el cual muchos glóbulos blancos que son incapaces en atacar la infección son hechos, de esta manera resaltando las otras partes que constituyen la sangre, tales como plaquetas y glóbulos rojos. Se entiende que los casos de leucemia se clasifican como agudos o crónicos. Ciertas formas de leucemia incluyen, a manera de ejemplo no limitante, leucemia linfocítica aguda (ALL); leucemia mieloide aguda (AML); leucemia linfocítica crónica (CLL); leucemia mielógena crónica (CML); trastorno/neoplasmo Mieloproliferativo (MPDS) y síndrome de mielodisplasia . "Linfoma" puede referirse a un linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin tanto indolente como agresivo, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (célula pequeña y célula grande), entre otros. Mieloma puede referirse a mieloma múltiple (MM), mieloma de célula gigante, mieloma de cadena pesada y mieloma de cadena ligera o de Bence-Jones.

Los anticuerpos monoclonales ejemplares de la invención incluyen, por ejemplo, los anticuerpos descritos en la presente. Los anticuerpos ejemplares incluyen anticuerpos que tienen una cadena pesada variable seleccionada de SEQ ID NOs: 5-30 y una cadena ligera variable seleccionada de SEQ ID NOs: 31-47. Los anticuerpos también incluyen anticuerpos que tienen una cadena pesada variable que es por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia expuesta en por lo menos de SEQ ID NOs: 5-30 y una cadena ligera variable que es por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia expuesta en por lo menos de SEQ ID NOs: 31-47. De preferencia, los anticuerpos reconocen y enlazan a CD47 humana y no causa un nivel significativo de hemaglutinación de los glóbulos rojos humanos. Estos anticuerpos son referidos respectivamente en la presente como anticuerpos CD47. Los anticuerpos CD47 incluyen anticuerpos monoclonales completamente humanos, asi como anticuerpos monoclonales humanizados y anticuerpos quiméricos. Estos anticuerpos muestran especificidad para CD47 humana, y se han mostrado que modulan por ejemplo, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o de otra manera interfieren con la expresión, actividad y/o señalización de CD47 sin causar un nivel significativo de hemaglutinación de los glóbulos rojos.

Los anticuerpos CD47 proporcionados en la presente exhiben actividad inhibidora, por ejemplo al inhibir la expresión de CD47 (por ejemplo, al inhibir la expresión de superficie celular de CD47), actividad y/o señalización, o al interferir con la interacción entre CD47 y SIRPa. Los anticuerpos proporcionados en la presente completamente o parcialmente reducen o de otra manera modulan la expresión o actividad de CD47 en el enlace a, o de otra manera la interacción con, CD47, por ejemplo, un CD47 humana. La reducción o modulación de una función biológica de CD47 es completa, significativa o parcial en la interacción entre los anticuerpos y el polipéptido CD47 humano y/o péptido. Los anticuerpos se consideran que inhibir completamente la expresión o actividad de CD47 cuando el nivel de expresión o actividad de CD47 en presencia del anticuerpo se disminuye por al menos 95%, por ejemplo, por 96%, 97%, 98%, 99% o 100% como es comparado con el nivel de expresión o actividad de CD47 en la ausencia de interacción, por ejemplo, enlace, con el anticuerpo descrito en la presente. Los anticuerpos CD47 se consideran que inhibir significativamente la expresión o la actividad de CD47 cuando el nivel de expresión o actividad de CD47 en la presencia del anticuerpo CD47 se disminuye por al menos 50%, por ejemplo, 55%, 60%, 75%, 80%, 85% o 90% como es comparado con el nivel de expresión o actividad de CD47 en la ausencia de enlace con un anticuerpo CD47 descrito en la presente. Los anticuerpos se consideran que inhiben parcialmente la expresión o actividad de CD47 cuando el nivel de expresión o actividad de CD47 en la presencia del anticuerpo se disminuye por menor que 95%, por ejemplo, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% o 90% como es comparado con el nivel de expresión o actividad de CD47 en la ausencia de interacción, por ejemplo, enlace, con un anticuerpo descrito en la presente.

Los anticuerpos de la invención también incluyen anticuerpos monoclonales que específicamente enlazan CD47, en donde el anticuerpo no causa un nivel significativo de aglutinación, por ejemplo, hemaglutinación de glóbulos rojos ("hemaglutinación de RBC"). Los anticuerpos de la presente invención únicamente enlazan CD47 de una manera que no promueve el amontonamiento de células positivas de CD47; sin embargo, la habilidad de los anticuerpos de la presente invención para enlazar CD47 sobre la superficie celular y no causar un fenómeno de amontonamiento celular no está limitada a los glóbulos rojos.

Las composiciones f rmacéuticas de acuerdo con la invención pueden incluir un anticuerpo de la invención y un portador. Estas composiciones farmacéuticas se pueden incluir en equipos, tales como, por ejemplo, equipos de diagnóstico.

La invención proporciona anticuerpos monoclonales que enlazan a CD47 o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, en donde el anticuerpo no causa un nivel significativo de aglutinación de células después de la administración, por ejemplo, el anticuerpo no causa un nivel significativo de hemaglutinación de glóbulos rojos después de la administración. En algunas modalidades, el anticuerpo es quimérico, humanizado, o completamente humano. En algunas modalidades, los anticuerpos se enlazan a CD47 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo previene a CD47 de interactuar con SIRPa. Los anticuerpos se consideran que inhiben completamente la interacción de CD47 y SIRPa cuando el nivel de interacción de CD47/SIRPa en la presencia del anticuerpo se disminuye por al menos 95%, por ejemplo, por 96%, 97%, 98%, 99% o 100% como es comparado con el nivel de interacción de CD47/SIRPa en la ausencia de interacción con el anticuerpo, por ejemplo, el enlace con el anticuerpo. Los anticuerpos se consideran que inhiben parcialmente la interacción de CD47/SIRPa cuando el nivel de interacción de CD47/SIRPa en presencia del anticuerpo se disminuye por menor que 95%, por ejemplo, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% o 90% como es comparado con el nivel de interacción de CD47/SIRPOC en la ausencia de la interacción con el anticuerpo, por ejemplo, el enlace con el anticuerpo.

La cantidad de anticuerpo suficiente para tratar o prevenir el cáncer en el sujeto, es, por ejemplo, una cantidad que es suficiente para reducir la señalización de CD47 (Ver, por ejemplo , Yamauchi y colaboradores, 2013 Blood, Jan 4. [Epub ahead of print]; Soto-Pantoja y colaboradores, 2013 Expert Opin Ther Targets, 17:89-103; Irandoust y colaboradores, 2013 PLoS One, Epub Jan 8; Chao y colaboradores, 2012 Curr Opin Immunol, 24:225-32; Theocharides y colaboradores, 2012 J Exp Med, 209(10): 1883-99; Csányi y colaboradores, 2012 Arterioscler Thromb Vasc Biol, 32:2966-73; Maxhimer y colaboradores, 2009 Sci Transí Med, 1: 3ra7; Sarfati y colaboradores, 2008 Curr Drug Targets, 9: 842-850; Miyashita y colaboradores, 2004 Mol Biol Cell, 15: 3950-3963; E.J. Brown and W.A. Frazier, 2001 Trends Cell Biol, 11: 130-135; Oldenborg y colaboradores, 2001 J Exp Med, 193: 855-862; Blazar y colaboradores, 2001 J Exp Med, 194: 541-549; Oldenborg y colaboradores, 2000 Science, 288: 2051-2054; y Gao y colaboradores, 1996 J Biol Chem, 271: 21-24). Por ejemplo, la cantidad de anticuerpo suficiente para tratar o prevenir el cáncer en el sujeto es una cantidad que es suficiente para reducir la señal inhibidora fagocitica en macrófagos generados por la interacción de CD47/SIRPa en el eje de señalización de CD47/SIRPa es decir, el anticuerpo de la invención promueve la fagocitosis mediada por macrófago de una célula que expresa CD47. Como se utiliza en la presente, el término "reducido" se refiere a una señalización de CD47 disminuida en la presencia del anticuerpo de la invención. La señalización mediada por CD47 se disminuye cuando el nivel de señalización de CD47 en la presencia de un anticuerpo CD47 de la invención es mayor que o igual a 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 99% o 100% menor que un nivel de control de señalización de CD47 (es decir, el nivel de señalización de CD47 en la ausencia del anticuerpo). El nivel de señalización de CD47 se mide utilizando cualquiera de una variedad de téenicas estándares, tales como, a manera de ejemplo no limitante, la medición de la activación génica corriente abajo y/o ensayos de reportador de luciferasa responsivos a la activación de CD47. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que el nivel de señalización de CD47 se puede medir utilizando una variedad de ensayos, que incluyen, por ejemplo, equipos comercialmente disponibles.

En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo es un isotipo IgG. En algunas modalidades, la región constante del anticuerpo es del isotipo IgGl humano, que tiene una secuencia de aminoácidos: ASTKGPSVFP LAPSSKSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YICNVNHKPS NTKVDKKVEP KSCDKTHTCP PCPAPE|LL|GG PSVFLFPPKP KDTLMISRTP EVTCVVVDVS HEDPEVKFNW YVDGVEVHNA KTKPREEQY§ STYRVVSVLT VLHQDWLNGK EYKCKVSNKA LPAPIEKTIS KAKGQPREPQ VYTLPPSRDE LTKNQVSLTC LVKGFYPSDI AVE ESNGQP ENNYKTTPPV LDSDGSFFLY SKLTVDKSRW QQGNVFSCSV MHEALHNHYT QKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 1).

En algunas modalidades, la región constante de IgGl humana se modifica en el aminoácido Asn297 (Encuadrado, Numeración de Kabat) para prevenir la glicosilación del anticuerpo, por ejemplo Asn297Ala (N297A). En algunas modalidades, la región constante del anticuerpo se modifica en el aminoácido Leu235 (Numeración de Kabat) para alterar las interacciones del receptor de Fe, por ejemplo Leu235Glu (L235E) o Leu235Ala (L235A). En algunas modalidades, la región constante del anticuerpo se modifica en el aminoácido Leu234 (Numeración de Kabat) para alterar las interacciones del receptor de Fe, por ejemplo, Leu234Ala (L234A). En algunas modalidades, la región constante del anticuerpo se altera tanto en el aminoácido 234 como 235, por ejemplo Leu234Ala y Leu235Ala (L234A/L235A). (indice EU de Kabat y colaboradores 1991 Sequences of Ptoteins of Immunological Interest) .

En algunas modalidades, la región constante del anticuerpo es del isotipo IgG2 humano, que tiene una secuencia de aminoácidos: ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSNFGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKTVER KCCVECPPCP APPVAGPSVF LFPPKPKDTL MISRTPEVTC VVVDVSHEDP EVQFNWYVDG VEVHNAKTKP REEQFJNJSTFR VVSVLTVVHQ DWLNGKEYKC KVSNKGLPAP IEKTISKTKG QPREPQVYTL PPSREEMTKN QVSLTCLVKG FYPSDISVEW ESNGQPENNY KTTPPMLDSD GSFFLYSKLT VDKSRWQQGN VFSCSVMHEA LHNHYTQKSL SLSPGK (SEQ ID NO: 2).

En algunas modalidades, la región constante IgG2 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (Encuadrado, Numeración de Kabat) para prevenir la glicosilación del anticuerpo, por ejemplo, Asn297Ala (N297A).

En algunas modalidades, la región constante del anticuerpo es del isotipo IgG3 humano, que tiene una secuencia de aminoácidos: ASTKGPSVFP LAPCSRSTSG GTAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTQT YTCNVDHKPS NTKVDKRVEL KTPLGDTTHT CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP EPKSCDTPPP CPRCPEPKSC DTPPPCPRCP APELLGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSHED PEVQFKWYVD GVEVHNAKTK PREEQY||STF RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKALPA PIEKTISKTK GQPREPQVYT LPPSREEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESSGQPENN YKTTPPMLDS DGSFFLYSKL TVDKSRWQQG NIFSCSVMHE ALHN[|FTQKS LSLSPGK (SEQ ID NO: 3).

En algunas modalidades, la región constante IgG3 humana se modificada en el aminoácido Asn297 (Encuadrado, Numeración de Kabat) para prevenir la glicosilación del anticuerpo, por ejemplo , Asn297Ala (N297A). En algunas modalidades, la región constante IgG3 humana se modifica en el aminoácido 435 para prolongar la vida media, por ejemplo, Arg435His (R435H) (índice EU de Kabat y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest) .

En algunas modalidades, la región constante del anticuerpo es del isotipo IgG4 humano, que tiene una secuencia de aminoácidos: ASTKGPSVFP LAPCSRSTSE STAALGCLVK DYFPEPVTVS WNSGALTSGV HTFPAVLQSS GLYSLSSVVT VPSSSLGTKT YTCNVDHKPS NTKVDKRVES KYGPPCP]CP APEFgGGPSV FLFPPKPKDT LMISRTPEVT CVVVDVSQED PEVQFNWYVD GVEVHNAKTK PREEQF§STY RVVSVLTVLH QDWLNGKEYK CKVSNKGLPS SIEKTISKAK GQPREPQVYT LPPSQEEMTK NQVSLTCLVK GFYPSDIAVE WESNGQPENN YKTTPPVLDS DGSFFLYSRL TVDKSRWQEG NVFSCSVMHE ALHNTYTQKS LSLSLGK (SEQ ID NO: 4).

En algunas modalidades, la región constante IgG4 humana se modifica dentro de la región de bisagra para prevenir o reducir el intercambio de hebra, por ejemplo, Ser228Pro (S228P). En otras modalidades, la región constante IgG4 humana se modifica en el aminoácido 235 para alterar las interacciones del receptor de Fe, por ejemplo, Leu235Glu (L235E). En algunas modalidades, la región constante IgG4 humana se modifica dentro de la bisagra y en el aminoácido 235, por ejemplo, Ser228Pro y Leu235Glu (S228P/L235E). En algunas modalidades, la región constante IgG4 humana se modifica en el aminoácido Asn297 (Numeración de Kabat) para prevenir la glicosilación del anticuerpo, por ejemplo, Asn297Ala (N297A). (índice EU de Kabat y colaboradores , 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest) .

En algunas modalidades, la región constante IgG humana se modifica para aumentar en enlace de FcRn. Ejemplos de mutaciones de Fe que aumentan en enlace a FcRn son Met252Tyr, Ser254Thr, Thr256Glu (M252Y, S254T, T256E, respectivamente) (numeración de Kabat, Dall'Acqua y colaboradores, 2006, J. Biol Chem Vol 281(33)23514-23524) o Met428Leu y Asn434Ser (M428L, N434S) (Zalevsky y colaboradores, 2010 Nature Biotech, Vol 28(2) 157-159). (índice de EU de Kabat y colaboradores, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest) . En algunas modalidades, la región constante IgG humana se modifica para alterar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o citotoxicidad dependiente del complemento (CDC), por ejemplo, las modificaciones de aminoácidos descritas en Natsume y colaboradores, 2008 Cáncer Res, 68(10): 3863-72; Idusogie y colaboradores, 2001 J Immunol, 166(4): 2571-5; Moore y colaboradores, 2010 mAbs, 2(2): 181-189; Lazar y colaboradores, 2006 PNAS, 103(11): 4005-4010, Shields y colaboradores, 2001 JBC, 276(9): 6591-6604; Stavenhagen y colaboradores, 2007 Cáncer Res, 67(18): 8882-8890; Stavenhagen y colaboradores, 2008 Advan. Enzyme Regul., 48: 152-164; Alegre y colaboradores, 1992 J Immunol, 148: 3461- 3468; Reviewed in Kaneko and Niwa, 2011 Biodrugs, 25(1):1—11.

En algunas modalidades, la región constante IgG humana se modifica para inducir la heterodimerización. Por ejemplo, tener una modificación de aminoácidos dentro del dominio CH3 en Thr366, que cuando se reemplaza con un aminoácido más voluminoso, por ejemplo, Try (T366W), es capaz de emparejarse preferencialmente con un segundo dominio CH3 que tiene modificaciones de aminoácido a aminoácidos menos voluminosos en las posiciones Thr366, Leu368 y Tyr407, por ejemplo, Ser, Ala y Val, respectivamente (T366S/L368A/Y407V). La heterodimerización por la via de modificaciones de CH3 además puede ser estabilizada mediante la introducción de un enlace de disulfuro, por ejemplo al cambiar Ser354 a Cys (S354C) y Y349 a Cys (Y349C) en los dominios CH3 opuestos (Reviewed in Cárter, 2001 Journal of Immunological Methods, 248: 7-15).

La invención también proporciona composiciones farmacéuticas que incluyen uno o más anticuerpos monoclonales que enlazan a CD47 o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, en donde el anticuerpo no causa un nivel significativo de hemaglutinación de los glóbulos rojos después de la administración.

La hemaglutinación es un ejemplo de una interacción homotípica, en donde dos células que expresa CD47 se ocasionan que se agreguen o se amontonen cuando se tratan con una entidad de enlace de CD47 bivalente. La habilidad de los anticuerpos de la presente invención para enlazar CD47 sobre la superficie celular y no causar un fenómeno de amontonamiento celular no está limitada a los glóbulos rojos. Los anticuerpos de la presente invención se han observado que enlazan únicamente CD 7 de una manera que no promueve el amontonamiento de las lineas de células positivas de CD47, por ejemplo, células Daudi.

En algunos casos, el anticuerpo comprende una región de cadena pesada variable (VH) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5-30. El anticuerpo opcionalmente comprende una región de cadena ligera variable (VL) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 31-47. En algunos casos, el anticuerpo comprende una región de cadena VH seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5-30 y una región de cadena VL seleccionada de grupo que consiste de SEQ ID NOs: 31-47. Los anticuerpos de la invención también incluyen anticuerpos que tienen una cadena pesada variable que es por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia expuesta en por lo menos una de SEQ ID NOs: 5-30 y una cadena ligera variable que es por lo menos 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica a la secuencia expuesta en por lo menos una de SEQ ID NOs: 31-47. En otros aspectos, el anticuerpo comprende una región VH proporcionada en cualquiera de SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 11, 15-17, 20-22, 27-30 emparejada con una región VL proporcionadas en cualquiera de SEQ ID NOs: 31-39, 42, 43, 44, y 47. En otra modalidad, el anticuerpo comprende una región VH proporcionada en cualquiera de SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 11, 12, 15-17, 20-22 y 27-30 emparejada con una región VL proporcionadas en cualquiera de SEQ ID NOs: 31, 32, 35, 40, 41, 42, 43, 44, y 47. En todavía otro aspecto, el anticuerpo comprende una combinación de una región de cadena VH y una región de cadena VL seleccionada de las combinaciones enlistadas en la Tabla 1.

En algunas modalidades, el anticuerpo CD47 o fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una secuencia de región de determinación de complementariedad 1 (CDR1) VH expuesta en SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 o SEQ ID NO: 66, una secuencia CDR2 VH expuesta en SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 o SEQ ID NO: 76, una secuencia CDR3 VH expuesta en SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 77, una secuencia CDR1 VL expuesta en SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 67 o SEQ ID NO: 68, una secuencia CDR2 VL expuesta en SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 o SEQ ID NO: 71 y una secuencia CDR3 VL expuesta en SEQ ID NO: 55 Por ejemplo, el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una secuencia CDR1 VH expuesta en SEQ ID NO: 50, una secuencia CDR2 VH expuesta en SEQ ID NO: 51, una secuencia CDR3 VH expuesta en SEQ ID NO: 52, una secuencia CDRl VL expuesta en SEQ ID NO: 53, una secuencia CDR2 VL expuesta en SEQ ID NO: 54, y una secuencia CDR3 VL expuesta en SEQ ID NO: 55. En otro ejemplo, el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una secuencia CDRl VH expuesta en SEQ ID NO: 50, una secuencia CDR2 VH expuesta en SEQ ID NO: 72, una secuencia CDR3 VH expuesta en SEQ ID NO: 52, una secuencia CDRl VL expuesta en SEQ ID NO: 53, una secuencia CDR2 VL expuesta en SEQ ID NO: 71, y una secuencia CDR3 VL expuesta en SEQ ID NO: 55.

En una modalidad, los anticuerpos de la presente invención enlazan a CD47 en una orientación de cabeza al lado que posiciona la cadena pesada cerca de la membrana de la célula que expresa CD47, mientras que la cadena ligera ocluye el sitio de enlace SIRPa sobre CD47. En otra modalidad, los anticuerpos de la presente invención enlazan a CD47 en una orientación de cabeza al lado que posiciona la cadena ligera cerca de la membrana de la célula que expresa CD47, mientras que la cadena pesada ocluye el sitio de enlace SIRPa sobre CD47.

Los anticuerpos CD47 enlazan a un epítopo que incluye cualquiera de los residuos de aminoácidos 1-116 de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147 (es decir, SEQ ID NO: 48 excluyendo la secuencia de señal (aminoácidos 1-18)). Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención enlazan a un epitopo que incluye uno o más de los residuos de aminoácido Q31, N32, T33, T34, E35, V36, Y37, V38, K39, W40, K41, F42, K43, G44, R45, D46, 147, Y48, T49, F50, D51, G52, ?53, L54, N55, K56, S57, T58, V59, P60, T61, D62, F63, S64, S65, A66, K67, 168, E69, V70, S71, P72, L73, L74, K75, G76, D77, D78, S79, L80, K81, M82, D83, K84, S85, D86, A87, V88, S89, H90, T91, G92, N93, Y94, T95, C96, E97, V98, T99, E100, L101, T102, R103, E104, G105, E106, T107, 1108, 1109 y E110 de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147.

En algunos casos, los anticuerpos de la presente invención enlazan a un epitopo discontinuo que incluye uno o más de los residuos de amino ácido Y37, V38, K39, W40, K41, F42, K43, G44, R45, D46, 147, Y48, T49, F50, D51 y de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención enlazan a un epitopo discontinuo que comprende residuos de aminoácidos Y37, K39, K41, K43, G4 , R45, D46, D51, H90, N93, E97, T99, E104 o E106 o CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención enlazan un epitopo discontinuo que incluye por lo menos residuos del bucle KGRD (SEQ ID NO: 56) (residuos 43-46) de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención enlazan un epitopo discontinuo que incluye por lo menos los residuos Y37, K39, K41, el bucle KGRD (SEQ ID NO: 56) (residuos 43-46), D51, H90, N93, E97, T99, E104 y E106 de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención enlazan a un epitopo discontinuo que incluye los residuos Y37, K39, K41, el bucle KGRD (SEQ ID NO: 56) (residuos 43-46), D51, H90, N93, E97, T99, E104 y E106 de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147.

La región VH de los anticuerpos CD47 descritos en la presente está involucrada principalmente en el enlace al bucle KGRD (SEQ ID NO: 56) de CD47. De esta manera, el epitopo único al cual los anticuerpos de la presente invención enlazan está sobre el lado de CD47. En contraste a los anticuerpos CD47 existentes conocidos en la téenica, la orientación del dominio VH de los anticuerpos CD47 descritos en la presente en una posición próxima a la membrana es una característica crítica de estos anticuerpos que previenen el amontonamiento celular, por ejemplo, la hemaglutinación de glóbulos rojos, al restringir a los anticuerpos de que no pueden cuetear a las moléculas CD47 sobre células adyacentes. Adicionalmente, debido a que el dominio VK de los anticuerpos CD47 descritos en la presente interactúa con residuos apicales tales como Y37, T102 y E104 y que están involucrados en el enlace de SIRPa, es principalmente el dominio VK que físicamente evita el enlace de SIRPa a CD47.

También se proporciona un anticuerpo aislado o un fragmento inmunológicamente activo del mismo que compite con los anticuerpos CD47 descritos en la presente para prevenir a CD47 de la interacción con SIRPa.

La invención proporciona un polipéptido que comprende los residuos de aminoácidos Y37, K39, K41, K43, G44, R45, D46, D51, H90, N93, E97, T99, E104 y E106 de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147. También se proporciona un polipéptido que comprende cualquiera de los residuos de aminoácido 1-116 de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147. Por ejemplo, el polipéptido comprende uno o más residuos de aminoácidos Q31, N32, T33, T34, E35, V36, Y37, V38, K39, W40, K41, F42, K43, G44, R45, D46, 147, Y48, T49, F50, D51, G52, A53, L54, N55, K56, S57, T58, V59, P60, T61, D62, F63, S64, S65, A66, K67, 168, E69, V70, S71, Q72, L73, L74, K75, G76, D77, A78, S79, L80, K81, M82, D83, K84, S85, D86, A87, V88, S89, H90, T91, G92, N93, Y94, T95, C96, E97, V98, T99, E100, L101, T102, R103, E104, G105, E106, T107, 1108, 1109 y E110 de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147. También se proporcionan métodos para utilizar este polipéptido como un antígeno, por ejemplo, un antigeno que enlaza un anticuerpo CD47.

La invención también proporciona métodos para aliviar un síntoma de un cáncer u otra condición neoplásica al administrar a un sujeto en necesidad del mismo uno o más anticuerpos monoclonales que enlazan a CD47 o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, en donde el anticuerpo no causa una nivel significativo de hemaglutinación de glóbulos rojos después de la administración. El anticuerpo se administra en una cantidad suficiente para aliviar el síntoma del cáncer u otra condición neoplásica en el sujeto. En algunas modalidades, el sujeto es un humano. En algunas modalidades, el anticuerpo es quimérico, humanizado o completamente humano. En algunas modalidades, el anticuerpo enlaza a CD47 humana. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo previene a CD47 de interactuar con SIRPa. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo es un isotipo IgG seleccionado del grupo que consiste de isotipo IgGl, isotipo IgG2, isotipo IgG3 e isotipo IgG4. En algunas modalidades, el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo es un isotipo IgG seleccionado de IgG4P e IgGPE.

En algunas modalidades, los anticuerpos CD47 descritos en la presente se utilizan en conjunción con uno o más agentes adicionales o una combinación de agentes adicionales. Los agentes adicionales adecuados incluyen las terapias farmacéuticas y/o quirúrgicas actuales para una aplicación propuesta, tal como, por ejemplo, cáncer. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 se pueden utilizar en conjunción con uno o más agentes quimioterapéuticos o anti-neoplásicos adicionales. Alternativamente, el agente quimioterapéutico adicional es la radioterapia. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un agente inductor de muerte celular. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico induce una pérdida de asimetría de fosfolípidos a través de la membrana de plasma, por ejemplo causa la exposición de la superficie celular de fosfatidilserina (PS). En algunas modalidades realización, el agente quimioterapéutico induce el estrés de retículo endoplásmico (ER). En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico es un inhibidor del proteasoma. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico induce la translocación de proteínas ER a la superficie celular. En algunas modalidades, el agente quimioterapéutico induce la translocación y la exposición de superficie celular de calreticulina.

En algunas modalidades, el anticuerpo CD47 y el agente adicional se formulan en una sola composición terapéutica, y el anticuerpo CD47 y el agente adicional se administran simultáneamente. De manera alternativa, el anticuerpo CD47 y el agente adicional están separados entre si, por ejemplo, cada uno se formula en una composición terapéutica separada, y el anticuerpo CD47 y el agente adicional se administra simultáneamente, o el anticuerpo CD47 y el agente adicional se administran en diferentes tiempos durante un régimen de tratamiento. Por ejemplo, el anticuerpo CD47 se administra antes de la administración del agente adicional, el anticuerpo CD47 se administra subsecuente a la administración del agente adicional, o el anticuerpo CD47 y el agente adicional se administran de un aspecto. Como es descrito en la presente, el anticuerpo CD47 y el agente adicional se administran en una sola dosis o en múltiples dosis.

Un experto en la téenica apreciará que los anticuerpos de la invención tienen una variedad de usos. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención se utilizan como agentes terapéuticos, como reactivos en equipos de diagnóstico o como herramientas de diagnóstico, o como reactivos en ensayos de competición para generar reactivos terapéuticos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1A es un gráfica que representa el enlace de CD47 sobre células Daudi mediante anticuerpos en sobrenadantes de hibridoma como es estimado mediante la citometria de flujo. La Figura IB es un gráfica que muestra la habilidad de algunos de los anticuerpos CD47 dentro del sobrenadante de hibridoma para bloquear el enlace de SIRPa humano recombinante a CD47 humano recombinante, como es determinado mediante una ELISA.

La Figura 2 es una serie de gráficas que representan (A) el enlace de anticuerpos CD47 de murino purificados a células Raji, una linea cultivada de células linfoblastoides derivada de un linfoma de Burkitt, y (B) células CCRF-CEM, una línea de células similar al linfoblasto de célula T humana positiva de CD47, como es analizada mediante citometría de flujo. Este experimento compara el enlace de los anticuerpos de murino de la presente invención a los anticuerpos CD47 comercialmente disponibles, B6H12 y 2D3.

La Figura 3 es una serie de gráficas que representan la capacidad de los anticuerpos CD47 para bloquear el enlace de SIRPa utilizando (A) una ELISA con proteína humana recombinante, o (B) mediante la citometría de flujo utilizando células CCRF-CEM y la proteínas SIRPa humana recombinante.

La Figura 4 es una serie de fotografías, gráficas y una tabla que muestra la hemaglutinación de RBC mediante anticuerpos CD47. La hemaglutinación RBC es puesta en claro por una apariencia nebulosa en la cavidad, mientras que el RBC no aglutinado aparece como punteado. La Figura 4A muestra que el anticuerpos 2A1 no exhibe hemaglutinación en todas las concentraciones probadas. El indice de hemaglutinación se representa en la gráfica. La Figura 4B muestra que 2A1 es raro entre muchos anticuerpos CD47 en su incapacidad para aglutinar RBC. También se muestra la carencia de actividad de aglutinación mediante la versión quimérica humana de 2A1 (2Al-xi). La Figura 4C muestra que el anticuerpo monoclonal CD47 cié 2D3, que no bloquea SIRPa, no causa hemaglutinación. La Figura 4D muestra un alto intervalo de concentración de los anticuerpos CD47 en el ensayo de hemaglutinación y demuestra el efecto de pro-zona. El indice de hemaglutinación se representa en la gráfica. La Figura 4E demuestra el intervalo de concentración más reducido para la hemaglutinación por el anticuerpo CD47, 1B4, mientras que este efecto está ausente en el enlace 2A1. La Figura 4F muestra que 2A1, 2A1 quimérico (2Al-xi), y variantes humanizadas no causan hemaglutinación. En la mayoría de los experimentos el anticuerpo 9E4 y el anticuerpo B6H12 comerciales se utilizaron como controles positivos para la hemaglutinación. Otros anticuerpos comercialmente disponibles utilizados en estos ensayos fueron los anticuerpos bloqueantes de SIRPa, BRC126 y CC2C6 y el anticuerpo no bloqueante de SIRPa, 2D3.

La Figura 5 es un gráfica que muestra el enlace de 2A1 y B6H12 a células B de mono cynomolgus (cyno) y Raji, como es estimado mediante la citometría de flujo.2A1 enlaza CD47 humano y de cyno con afinidad equivalente, como lo hace B6H12, aunque con menor afinidad a CD47 tanto humano como de cyno que el 2A1.

La Figura 6 es una gráfica que representa el enlace de 2A1, 2Al-xi, y B6H12 a células Raji, como es estimado mediante citometria de flujo. De manera importante, la gráfica muestra que las secuencias de región variable de las cadenas pesada (VH) y (VL) fueron puestas en claro correctamente en la versión quimérica de 2A1.

La Figura 7A-7J es una serie de gráficas que muestra el enlace de variantes humanizados de 2A1 a células Raji. 2Al-xi se utilizó como un control interno en la mayoría de las gráficas. Numerosas combinaciones de cadenas pesada y ligera se probaron como es descrito en el Ejemplo 8.

La Figura 8A es una imagen del trazo de la cromatografía de exclusión de tamaño utilizando un ARTA FLPC con una columna superdex200. Se muestran las variantes IgGl, IgG4P e IgGPE del anticuerpo AB6.12. Todas las tres variantes están arriba de 97% monomérica. La Figura 8B es una fotografía de un gel SDS-PAGE manchado con azul de coomassie de numerosas variantes humanizadas de 2A1 bajo condiciones de reducción (R) y de no reducción (NR). — La Figura 9 es una serie de gráficas que representan la capacidad de los anticuerpos CD47 para promover la fagocitosis de líneas de células de tumor humano mediante los macrófagos derivados de monocito humano (MDM). La Figura 9A es una gráfica que muestra el indice fagocitico, en donde los anticuerpos utilizados fueron el anticuerpo comercial B6H12, el anticuerpo 2A1 de murino, un anticuerpo AB2.05 variante humanizado, y el anticuerpo comercial no bloqueante 2D3. La Figura 9B es una gráfica que muestra el indice fagocitico, en donde los anticuerpos utilizando fueron el anticuerpo comercial B6H12, el anticuerpo humanizado AB2.05 (IgGl humano) y las variantes IgGl, IgG4P e IgG4PE del anticuerpo humanizado AB6.12. Las células CCRF-CEM se utilizaron como la linea de celular objetico de CD47 en estos experimentos.

La Figura 10 es una serie de gráficas que muestran los efectos anti-tumor de los anticuerpos CD47 en un modelo de tumor Raji. La Figura 10A es un gráfica que muestra la eficacia de los anticuerpos de murino 9E4, 1B4, 2A1 y el anticuerpo comercial B6H12. La Figura 10B es un gráfica que muestra la eficacia de los isotipos IgGl, IgG4P e IgG4PE de anticuerpo humanizado AB6.12, junto con el anticuerpo 2A1 de murino. En ambos modelos, los ratones se trataron con 200pg de dosis de anticuerpo tres veces a la semana.

La Figura 11 es una representación gráfica de los complejos de co-cristal de CD47-IgV con el dominio SIRPa-IgV (A, (Referencia del Banco Datos de Proteina (PDB) No.2JJS), B6H12 (B) y 2A1 (C).2A1 y B6H12 enlazan en muy diferentes orientaciones y distintos epitopos sobre CD47, ambos de los cuales se sobreponen con el sitio de enlace de SIRPa. El anticuerpo 2A1 enlaza en una orientación de cabeza al lado sobre la proteina CD47.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que específicamente enlazan CD47, incluyendo CD47 humana. Estos anticuerpos son colectivamente referidos en la presente como anticuerpos CD47.

CD47, un receptor de transmembrana de multi-extensión que pertenece a la superfamilia de inmunoglobulina, interactúa con SIRPa (proteína-reguladora-de señal a) sobre los acrófagos y de esta manera impide la fagocitosis. Las células de cáncer que co-optan esta ruta evaden la fagocitosis. Como es descrito en detalle enseguida, este es un nuevo mecanismo de evitación inmune de tumor, y la dirección terapéuticamente de CD47 tiene aplicación difundida en numerosos cánceres.

La expresión de CD47 se correlaciona con efectos clínicos empeorados en muchas malignidades distintas que incluyen Linfo a No-de-Hodgkin (HNL), Leucemia Linfocítica Aguda (ALL), Leucemia Mielógena Aguda (AML), cáncer ovárico, glioma, glioblastoma, etc. Además, CD47 se ha identificado como un marcador de células madre de cáncer tanto en leucemias como en tumores sólidos (Jaiswal y colaboradores, 2009 Cell, 138(2): 271-85; Chan y colaboradores, 2009 Proc Nati Acad Sci USA, 106(33): 14016-21; Chan y colaboradores, 2010 Curr Opin Urol, 20(5): 393-7; Majeti R y colaboradores, 2011, Oncogene, 30(9): 1009-1019).

Los anticuerpos bloqueantes de CD47 han demostrado actividad anti-tumor múltiple en modelos de tumor in vivo. Además, estos anticuerpos se han mostrado que sinergizan con otros anticuerpos terapéuticos incluyendo Rituxan® y Herceptin® en modelos de tumor. El bloqueo de la interacción de CD47 con SIRPa es capaz de promover la fagocitosis de células que expresan CD47 mediante los macrófagos (revisado en Chao y colaboradores, 2012 Curr Opin Immunol, 24(2): 225-32). Los ratones que carecen de CD47 son notablemente resistentes a la terapia de radiación, sugiriendo una función para dirigirse a CD47 en combinación con la radioterapia (Isenberg y colaboradores, 2008 Am J Pathol, 173(4): 1100-1112; Maxhimer y colaboradores, 2009 Sci Med Transí, 1(3): 3ra7). Además, los modelos de tumor singeneicos en estos ratones exhiben metástasis de hueso disminuida comparada con los ratones de tipo silvestre (Uluckan y colaboradores, 2009 Cáncer Res, 69(7): 3196-204).

De manera más importante, muchos de los anticuerpos CD47 se ha reportado que causan hemaglutinación de eritrocitos humanos. La hemaglutinación es un ejemplo de una interacción homotípica, en donde dos células que expresan CD47 se ocasionan que se agreguen o se amontonen cuando se tratan con una entidad de enlace de CD47 bivalente. Por ejemplo, el anticuerpo CD47, MABL, como una IgG completa o F(ab')2, se ha reportado que causa hemaglutinación de eritrocitos, y, únicamente cuando MABL se alteró en una scFv o scFv bivalente, este efecto fue aminorado. ( Ver, por ejemplo, Uno S, Kinoshita Y, Azuma Y y colaboradores. Antitumor activity of a monoclonal antibody against CD47 in xenograft models of human leukemia. Oncol Rep 2007; 17: 1189-94; Kikuchi Y, Uno S, Yoshimura Y y colaboradores. A bivalent single-chain Fv fragment against CD47 induces apoptosis for leukemic cells. Biochem Biophys Res Commun 2004; 315: 912-8). Otros anticuerpos CD47 conocidos que incluyen B6H12, BRC126 y CC2C6 también causan hemaglutinación de RBCs, como es descrito en detalle enseguida. De esta manera, la agregación de células representa una limitación mayor de dirigir terapéuticamente CD47 con anticuerpos IgG completa existentes.

Por otra parte, una característica importante de los anticuerpos CD47 y la habilidad para bloquear la interacción de CD47 y SIRPa con el fin de promover la fagocitosis de células que expresan CD47 mediantes macrófagos. Muchos anticuerpos CD47 existentes bloquean SIRPa; sin embargo, antes de la invención descrita en la presente, los anticuerpos existentes que bloquearon SIRPa causaron el efecto secundario de hemaglutinación, que, como es descrito en lo anterior, es indeseable. Otros anticuerpos existentes, tal como 2D3, no causan hemaglutinación; sin embargo, estos anticuerpos también no bloquean SIRPa, volviéndolos ineficaces en la promoción de fagocitosis. De esta manera, previo a la invención descrita en la presente, hubo una necesidad apremiante por identificar anticuerpos CD47 que bloquearan SIRPa sin causar amontonamiento celular.

Los anticuerpos CD47 de la presente invención evitan el efecto indeseable de hemaglutinación, para de esta manera incrementar la eficacia de la dirección terapéuticamente CD47, y mantener la habilidad para bloquear la interacción de CD47 con SIRPa, para de esta manera promover la fagocitosis de células que expresan CD47. Específicamente, los anticuerpos CD47 de IgG completa de la presente invención (por ejemplo, 2A1 y sus derivados humanizados incluyendo aquellos proporcionados en la Tabla 1) no aglutinan las células en un nivel significativo. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 de la invención no hemaglutinan RBCs en un nivel significativo. Se describe en la presente los primeros anticuerpos CD47 en un formato de IgG completa que bloquean SIRPa y no causan un nivel significativo de hemaglutinación. Tomados conjuntamente, los anticuerpos de la invención (por ejemplo, el anticuerpo 2A1 y sus derivados humanizados) son únicos entre los anticuerpos CD47 existentes en su habilidad para bloquear SIRPa, pero no causan un nivel significativo de hemaglutinación.

Los anticuerpos CD47 de la invención exhiben numerosas características deseables, tal como, a manera de ejemplo no limitante, bloqueo potente de la interacción entre CD47 y su ligando SIRPa, sin causar un nivel significativo o de otra manera modular la hemaglutinación de eritrocitos, así como potente actividad anti-tumor. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 de la invención bloquean por lo menos 40%, por lo menos 45%, por lo menos 50%, por lo menos 55%, por lo menos 60%, por lo menos 65%, por lo menos 70%, por lo menos 75%, por lo menos 80%, por lo menos 85%, por lo menos 95% o por lo menos 99% de la interacción entre CD47 y SIRPa domo es comparado con el nivel de interacción entre CD47 y SIRPa en la presencia del anticuerpo CD47 descrito en la presente. Los anticuerpos CD47 de la invención no causan un nivel significativo de aglutinación de células, por ejemplo, los anticuerpos CD47 de la invención no causan un nivel significativo de hemaglutinación de glóbulos rojos. Por ejemplo, el nivel de aglutinación en la presencia de los anticuerpos CD47 de la invención se reduce por al menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 99% comparado con el nivel de aglutinación en la presencia de los anticuerpos CD47 existentes. En algunas modalidades, los anticuerpos CD47 de la invención no causan un nivel significativo de aglutinación si el nivel de aglutinación en la presencia de los anticuerpos CD47 de la invención se reduce por al menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 99% comparado con el nivel de aglutinación en la presencia de anticuerpo CD47, 1B4, que comprende una secuencia de cadena pesada variable y de cadena ligera variable proporcionada en SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 81, respectivamente. Los anticuerpos de la presente invención también son significativamente más potentes en modelos de tumores comparados con los anticuerpos conocidos en la téenica. Por ejemplo, la habilidad de los macrófagos para fagocitar las células de tumor en la presencia de anticuerpos CD47 de la invención se incrementa por al menos 5%, por lo menos 10%, por lo menos 20%, por lo menos 30%, por lo menos 40%, por lo menos 50%, por lo menos 60%, por lo menos 70%, por lo menos 80%, por lo menos 90% o por lo menos 99% comparado con la habilidad de los macrófagos para fagocitar las células de tumor en la presencia de anticuerpos CD47 existentes.

Aquellos expertos en la técnica reconocerán que es posible cuantificar, sin experimentación indebida, el nivel de aglutinación, por ejemplo, el nivel de hemaglutinación de RBCs. Por ejemplo, aquellos expertos en la téenica reconocerán que el nivel de hemaglutinación se averigua al medir el área de un punto de RBC después de realizar un ensayo de hemaglutinación en la presencia de los anticuerpos CD47 de la invención, como es descrito en los Ejemplos enseguida. En algunos casos, el área del punto RBC en la presencia del anticuerpo CD47 de la invención se compara con el punto de RBC en la ausencia de un anticuerpo CD47, es decir, en la presencia de cero hemaglutinación. De esta manera, la hemaglutinación se cuantifica con relación a un control de linea de base. Un área de punto de RBC más grande corresponde a un nivel más alto de hemaglutinación. Alternativamente, la densitometria del punto de RBC también se puede utilizar para cuantificar la hemaglutinación.

Los anticuerpos CD47 de la invención enlazan a CD47 humana y bloquean su interacción con SIRPa (Figuras IB, 3 y 7J). Estos anticuerpos no causan un nivel significativo de hemaglutinación de eritrocitos humanos (Figura 4). Estos anticuerpos son capaces de promover la fagocitosis de células de tumor mediante macrófagos (Figura 9). Además, los anticuerpos CD47 exhiben potente actividad anti-tu or en un modelo de ratón de linfoma humano (Figura 10). De esta manera los anticuerpos CD47 de la invención evitan un factor limitante mayor para la dirección terapéutica de CD47. Por consiguiente, los anticuerpos CD47 de la invención se establecen que son de gran importancia en el tratamiento de una multitud de cánceres.

Los anticuerpos de la invención que específicamente enlazan a CD47 humana, bloquean, inhiben, interrumpen o de otra manera modulan la interacción entre CD47 humana y SIRPa humana, sin causar un nivel significativo o de otra manera modular la hemaglutinación de eritrocitos.

Los anticuerpos de la presente invención enlazan a un epítopo CD47 con una constante de enlace de equilibrio (Kd) de £1 mM, por ejemplo, £ 100 nM, de preferencia £ 10 nM, y más de preferencia £1 nM. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 proporcionados en la presente exhiben una Kd en el intervalo de aproximadamente entre £1 nM a aproximadamente 1 pM.

Los anticuerpos CD47 de la invención sirven para modular, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o de otra manera interferir con la actividad funcional de CD47 ampliamente distribuido. Las actividades funcionales de CD47 incluyen, por ejemplo, la señalización por la vía de la interacción con SIRPa, la modulación, por ejemplo, incremento de concentración de calcio intracelular en la adhesión de célula a la matriz extracelular, interacción con el dominio de enlace de célula C-terminal de trombospondina, interacción con fibrinógeno e interacción con varias integrinas. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 completamente o parcialmente inhiben la actividad funcional de CD47 al parcial o completamente modular, bloquear, inhibir, reducir antagonista, neutralizar o de otra manera interferir con el enlace de CD47 a SIRPa.

Los anticuerpos CD47 se consideran que completamente, modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o de otra manera interfieren con la actividad funcional de CD47 cuando el nivel de actividad funcional de CD47 en la presencia de anticuerpo CD47 se disminuye por al menos 95%, por ejemplo, por 96%, 97%, 98%, 99% o 100% como es comparado con el nivel de actividad funcional de CD47 en la ausencia de enlace con un anticuerpo CD47 descrito en la presente. Los anticuerpos CD47 se consideran que significativa bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o de otra manera interfieren con la actividad funcional de CD47 cuando el nivel de la actividad de CD47 en presencia del anticuerpo CD47 se disminuye por al menos 50%, por ejemplo, 55%, 60%, 75%, 80%, 85% o 90% como es comparado con el nivel de actividad de CD47 en la ausencia de enlace con un anticuerpo CD47 descrito en la presente. Los anticuerpos CD47 se consideran que parcialmente modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o de otra manera interfieren con la actividad funcional de CD47 cuando el nivel de actividad de CD47 en la presencia del anticuerpo CD47 se disminuye por menor que 95%, por ejemplo, 10%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 80%, 85% o 90% como es comparado con el nivel de actividad de CD47 en la ausencia de enlace con un anticuerpo CD47 descrito en la presente. Definiciones A menos que se defina de otra manera, los términos científicos y téenicos utilizados en relación con la presente invención tendrán los significados que son comúnmente entendidos por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Además, a menos que se requiera de otra manera por el contexto, los términos singulares incluirán pluralidades y los términos plurales incluirán lo singular. Generalmente, las nomenclaturas utilizadas en relación con, y técnicas de, cultivo de células y de tejido, biología molecular y química de proteínas y oligo- o polinucleótido e hibridación descritas en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en la técnica. Las técnicas estándar se utilizan para DNA recombinante, síntesis de oligonucleótido y cultivo y transformación de tejido (or ejemplo, electroporación, lipofección). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con la especificación del fabricante o como comúnmente realizados en la técnica o como es descrito en la presente. Las técnicas y procedimientos anteriores se realizan generalmente de acuerdo con métodos convencionales bien conocidos en la técnica y como es descrito en varias referencias generales y más especificas que se citadas y discutidas por toda la presente especificación. Ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed., Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1989)). Las nomenclaturas utilizadas en relación con, y los procedimientos de laboratorio y téenicas de, química analítica, química orgánica sintética y química medicinal y farmacéutica descrita en la presente son aquellas bien conocidas y comúnmente utilizadas en el arte. Las técnicas estándar se utilizan para síntesis químicas, análisis químicos, preparación farmacéutica, formulación y suministro, y tratamiento de pacientes.

Como se utiliza de acuerdo con la presente descripción, los siguientes términos, a menos que se indique de otra manera, serán entendidos que tienen los siguientes significados: Como se utiliza en la presente, los términos CD47, proteína asociadas a integrina (IAP), antígeno de cáncer ovárico OA3, antígeno relacionado con Rh y MER6 son sinónimos y se pueden utilizar intercambiablemente.

Los términos glóbulos(s) rojos y eritrocitos(s) son sinónimos y se utilizan intercambiablemente en la presente.

El término aglutinación se refiere el amontonamiento celular, mientras que el término hemaglutinación se refiere al amontonamiento de un subconjunto específico de celulas, es decir, glóbulos rojos. De esta manera, la he aglutinación es un tipo de aglutinación.

Como se utiliza en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina (Ig), es decir, moléculas que contienen un sitio de enlace de antígeno que específicamente enlaza (inmunorreacciona con) un antígeno. Por "específicamente enlaza" o "inmunorreacciona con" o "dirigido contra" se propone que el anticuerpo reacciona con una o más determinantes antigénicas del antígeno deseado y no reacciona con otros polipéptidos o enlaza en una afinidad mucho más baja (Kd >10-6). Los anticuerpos incluyen, pero no están limitados a, policlonales, monoclonales, quiméricos dAb (anticuerpo de dominio), de una sola cadena, fragmentos Fab, Fab y F(ab')2 Fv, scFvs, y una librería de expresión de Fab.

La unidad estructural de anticuerpo básica se conoce que comprende un tetrámero. Cada tetrámero está compuesto de dos pares idénticos de cadenas de polipéptido, cada par que tiene una cadena "ligera" (aproximadamente 25 kDa) y una cadena "pesada" (aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 110 o más aminoácidos principalmente responsable para el reconocimiento del antigeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable para la función efectora. En general, las moléculas de anticuerpo obtenidas de humanos se relacionan a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren entre si por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases tienen subclases también, tales como IgGi, IgG2, y otras. Además, en humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.

El término "anticuerpo monoclonal" (MAb) o "composición de anticuerpo monoclonal", como se utiliza en la presente, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen únicamente una especie molecular de molécula de anticuerpo que consisten de un producto génico de cadena ligera único y un producto génico de la cadena pesada único. En particular, las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) del anticuerpo monoclonal son idénticas en todas las moléculas de la población. Los MAbs contienen un sitio de enlace de antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epitopo particular del antigeno caracterizado por una afinidad de enlace única para este.

En general, las moléculas de anticuerpos obtenidas de humanos se relacionan a cualquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE e IgD, que difieren una de la otra por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Ciertas clases tienen subclases también, tales como IgGi, IgG2, y otras. Además, en humanos, la cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda.

El término "sitio de enlace de antigeno" o "porción de enlace" se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en el enlace de antigeno. El sitio de enlace de antigeno se forma por residuos de aminoácido de las regiones N-terminal variables ("V") de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres estiramientos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, preferidas como "regiones hipervariables" se interponen entre más estiramientos flanqueantes conservados conocidos como "regiones de estructura" o "FRs". De esta manera, el término "FR" se refiere a secuencias de aminoácido que naturalmente se encuentran entre, y adyacentes a, regiones hipervariables en inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de la cadena pesada se disponen con relación entre sí en espacio tridimensional para formar una superficie de enlace de antígeno. La superficie de enlace de antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno enlazado, y las tres regiones hipervariables cada una de las cadenas pesada y ligera son referidas como "regiones de determinación de complementariedad" o "CDRs". La asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de las Secuencias de Proteína de Interés Inmunológico de Kabat (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)), o Chothia y Lesk J. Mol. Biol.196: 901-917 (1987), Chothia y colaboradores. Nature 342: 878-883 (1989).

Como se utiliza en la presente, el término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz del enlace específico a una inmunoglobulina o fragmento de la misma, o un receptor de células T. El término "epítopo" incluye cualquier determinante de proteína capaz del enlace especifico a una inmunoglobulina o receptor de células T. Las determinantes epitópicas usualmente consisten de agrupamientos de superficie químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar y usualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas. Un anticuerpo se dice que enlaza específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es £ 1 mM; por ejemplo, £ 100 nM, de preferencia < 10 nM y más de preferencia £ 1 nM.

Tal como se utiliza en la presente, los términos "enlace inmunológico" y "propiedades de enlace inmunológico" se refieren a las interacciones no covalentes del tipo que se presentan entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el cual la inmunoglobulina es específica. La concentración o afinidad de interacciones de enlace inmunológico se pueden expresar en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en donde una Kd más pequeña representa una afinidad más grande. Las propiedades de enlace inmunológico de polipéptidos seleccionados se pueden cuantificar utilizando métodos bien conocidos en la téenica. Un métodos de tal clase comprende medir las proporciones de formación y disociación del sitio de enlace de antigeno/complejo de antigeno, en donde esas proporciones dependen de las concentraciones de los asociados del complejo, la afinidad de la interacción, y los parámetros geométricos que influencian igualmente la proporción en ambas direcciones. De esta manera, tanto la "constante de proporción activada" (kon) y la "constante de proporción desactivada" (k0ff) se pueden determinar mediante el cálculo de las concentraciones y las proporciones reales de asociación y disociación. ( Ver Nature 361: 186-87 (1993)). La relación de k0ff/k0n permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es igual a la constancia de disociación Kd. (Ver, generalmente, Davies y colaboradores, (1990) Annual Rev Biochem 59:439-473). Un anticuerpo de la presente invención se dice que enlaza específicamente a CD47, cuando la constante de enlace de equilibrio (Kd) es £1 mM, de preferencia £ 100 nM, más de preferencia <10 nM y mucho más de preferencia < 100 pM a aproximadamente 1 pM, como se mide mediante ensayos tales como ensayos de enlace de radioligando, resonancia de plasmón de superficie (SPR), ensayo de enlace de citometria de flujo, o ensayos similares conocidos para aquellos expertos en la téenica.

El término "polinucleótido aislado" como se utiliza en la presente significará un polinucleótido de origen genómico, de cDNA, o sintético o algunas combinaciones de los mismos, que en virtud de su origen el "polinucleótido aislado" (1) no está asociado con todo o una porción de un polinucleótido en el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) se enlaza operativamente a un polinucleótido que no está enlazado en la naturaleza, o (3) no se presenta en la naturaleza como parte de una secuencia más grande.

El término "proteína aislada" referida en la presente significa una proteína de cDNA, RNA recombinante o de origen sintético o algunas combinaciones de los mismos, que en virtud de su origen, o fuente de derivación la "proteína aislada" (1) no está asociada con proteínas encontradas en la naturaleza, (2) está libre de otras proteínas de la misma fuente, por ejemplo, libre de proteínas marinas, (3) se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no se presenta en la naturaleza.

El término "polipéptido" se utiliza en la presente como un término genérico para referirse a la proteina nativa, fragmentos o análogos de una secuencia de polipéptido. Por consiguiente, los fragmentos de proteina nativa, y análogos son especies del género del polipéptido.

El término "que ocurre naturalmente" como se utiliza en la presente como es aplicado a un objeto se refiere al hecho de que un objeto se puede encontrar en la naturaleza. Por ejemplo, un polipéptido o secuencia de polinucleótido que está presente en un organismo (incluyendo virus) que se puede aislar de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionadamente por el hombre en el laboratorio o de otra manera está ocurriendo naturalmente.

El término "operablemente enlazado" como se utiliza en la presente se refiere a las posiciones de los componentes de esta manera descritos que está en una relación que les permite funcionar en su manera propuesta. Una secuencia de control "operablemente enlazada" a una secuencia de codificación se liga de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias de control.

El término "secuencia de control" como se utiliza en la presente, se refiere a secuencias de polinucleótido que son necesarias para efectuar la expresión y procesamiento de secuencias de codificación a las cuales se ligan. La naturaleza de tales secuencias de control difiere dependiendo el organismo hospedero en procariotas, tales secuencias de control generalmente incluyen un promotor, sitio de enlace de ribosomal y secuencia de terminación de transcripción en eucariotas, generalmente, tales secuencias de control incluyen promotores y la secuencia de terminación de transcripción. El término "secuencias de control" se propone para incluir, en un mínimo, todos los componentes cuya presencia es esencial para la expresión y procesamiento, y también puede incluir componentes adicionales cuya presencia es ventajosa, por ejemplo, secuencias de guía y secuencias de asociado de fusión. El término "polinucleótido", como es referido en la presente, se refiere a un núcleo polimérico de nucleótidos de por lo menos 10 bases en longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de una sola y de doble hebra de DNA.

El término "oligonucleótido" referido en la presente incluye nucleótidos que ocurren naturalmente y modificados conjuntamente al ocurrir naturalmente, y enlaces de oligonucleótidos que no ocurren naturalmente. Los oligonucleótidos son un subconjunto de polinucleótidos que comprende generalmente una longitud de 200 bases o menos. De preferencia los oligonucleótidos son de 10 a 60 bases de longitud y mucho más de preferencia 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 a 40 bases en longitud. Los oligonucleótidos son usualmente de una sola hebra, por ejemplo, para las sondas, aunque los oligonucleótidos pueden ser de doble hebra, por ejemplo, para el uso en la construcción de un mutante génico. Los oligonucleótidos de la invención son ya sea oligonucleótidos de sentido o de antisentido.

El término "nucleótidos que ocurren naturalmente" referidos en la presente incluye deoxiribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados" referidos en la presente incluye nucleótidos con grupos de azúcar modificados o sustituidos y los similares. El término "enlaces de oligonucleótido" referidos en la presente incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselerloato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforoaniladato, fosforonmidato y los similares. Ver, por ejemplo, LaPlanche y colaboradores. Nucí. Acids Res.14:9081 (1986); Stec y colaboradores. J. Am. Chem. Soc. 106:6077 (1984), Stein y colaboradores . Nucí. Acids Res. 16:3209 (1988), Zon y colaboradores . Anti Cáncer Drug Design 6:539 (1991); Zon y colaboradores. Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, Ed., Oxford University Press, Oxford England (1991)); Stec y colaboradores. Patente de los Estados Unidos No.5,151,510; Uhlmann and Pcyman Chemical Reviews 90:543 (1990). Si se desea un oligonucleótido puede incluir una marca para detección.

El término "selectivamente hibridar" referido en la presente significa enlazar detectablemente y específicamente. Los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de acuerdo con la invención selectivamente hibridan a hebras de ácido nucleico bajo condiciones de hibridación y lavado que minimizan cantidades apreciables de enlace detectable a ácidos nucleicos no específicos. Las condiciones de alta severidad pueden utilizar para lograr las condiciones de hibridación selectivas como es conocido en la téenica y discutido en la presente. Generalmente, la homología de secuencia de ácido nucleico entre los polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de la invención y una secuencia de ácido nucleico de interés será por lo menos 80%, y más típicamente con homologías incrementadas de preferencia de por lo menos 85%, 90%, 95%, 99% y 100%. Dos secuencias de aminoácido son homologas si hay una identidad parcial o completa entre sus secuencias. Por ejemplo, 85% de homología significa que 85% de los aminoácidos son idénticos cuando se alinean dos secuencias para la correspondencia máxima. Los espacios (en cualquiera de las dos secuencias que son correspondientes) se dejan en longitudes de espacio de correspondencia máxima de 5 o menos se prefieren con 2 o menos que son más preferidas. Alternativamente y de preferencia, dos secuencias de proteínas (o secuencias de polipéptidos derivadas de estas de por lo menos 30 aminoácidos en longitud) son homologas, ya que este término se utiliza en la presente, si tienen un registro de alineación de más de 5 (en unidades de desviación estándar) utilizando el programa ALIGN con la matriz de datos de mutación y una sanción de espacio de 6 o más grande. Ver Dayhoff, M.O., in Atlas of Protein Sequence and Structure, pp. 101-110 (Volumen 5, National Biomedical Research Foundation (1972)) and Supplement 2 para este volumen, pp. 1-10. Las dos secuencias o partes de las mismas son más de preferencia homologas si sus aminoácidos son mayores que o igual a 50% idénticos cuando se alinean óptimamente utilizando el programa ALIGN. El término "corresponde a" se utiliza en la presente para dar a entender que una secuencia de polinucleótido es homologa (es decir, es idéntica, no estrictamente evolucionariamente relacionada) o toda o una porción de una secuencia de polinucleótido de referencia, o que una secuencia de polipéptido es idéntica a una secuencia de polipéptido de referencia. En contra distinción, el término "complementario a" se utiliza en la presente para dar a entender que la secuencia complementaria es homologa a toda o una porción de una secuencia de polinucleótido de referencia. Para ilustración, la secuencia de nucleótidos "TATAC" corresponde a una secuencia de referencia "TATAC" y es complementaria a una secuencia de referencia "GTATA".

Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más secuencias de polinucleótido o de aminoácidos: "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para una comparación de secuencia con una secuencia de referencia que puede ser un subconjunto de una secuencia más grande, por ejemplo, como un segmento de la secuencia de cDNA o génica de longitud completa dada en un listado de secuencia o puede comprender una secuencia de cDNA o génica completa. Generalmente, una secuencia de referencia es de por lo menos 18 nucleótidos o 6 aminoácidos en longitud, frecuentemente por lo menos 24 nucleótidos u 8 aminoácidos en longitud, y frecuentemente por lo menos 48 nucleótidos o 16 aminoácidos en longitud. Puesto que dos polinucleótidos o secuencias de aminoácido cada una (1) puede comprender una secuencia ( es decir, una porción de la secuencia de polinucleótido o de aminoácido completa) que es similar entre las dos moléculas y (2) además puede comprender una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos o secuencias de aminoácido, comparaciones de secuencia entre dos (o más) moléculas se realizan típicamente al comparar las secuencias de las dos moléculas sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar las regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación", como se utiliza en la presente, se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 18 posiciones de nucleótidos contiguos o 6 aminoácidos en donde una secuencia de polinucleótido o secuencia de aminoácido se pueden comparar con una secuencia de referencia de por lo menos 18 nucleótidos contiguos o secuencias de 6 aminoácidos y en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones, supresiones, sustituciones y los similares (es decir, espacio) de 20 por ciento o menos como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación se puede conducir mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman Adv. Appl. Math.2:482 (1981), mediante el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970), mediante la búsqueda del método de similitud de Pearson y Lipman Proc. Nati. Acad. Sci. (Ü.S.A.) 85:2444(1988), mediante las implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, (Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.), Geneworks, o Mac Vector software packages), o mediante la inspección y la mejor alineación (es decir, que da por resultado el porcentaje más alto de homología sobre la ventana de comparación) generado por varios métodos es seleccionada.

El término "identidad de secuencia" significa que dos polinucleótidos o secuencias de aminoácido son idénticas (es decir, en una base de nucleótido por nucleótido o residuo por residuo) sobre la ventana de comparación. El término "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, al determinar el número de posiciones en los cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, U o I) o residuo ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones correspondientes, al dividir el número de posiciones correspondientes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de ventana) y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. Los términos "identidad sustancial" como se utiliza en la presente denota una característica de una secuencia de polinucleótido o aminoácido, en donde el polinucleótido o aminoácido comprende una secuencia que tiene por lo menos 85 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 90 a 95 por ciento de identidad de secuencia, más usualmente por lo menos 99 por ciento de identidad de secuencia como es comparado a una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de por lo menos 18 nucleótidos (6 aminoácidos) posiciones, frecuentemente sobre una ventana de por lo menos 24-48 posiciones de nucleótidos (8-16 aminoácidos), en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula al comparar la secuencia de referencia a la secuencia que puede incluir supresiones o adiciones que totalizan el 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia sobre la ventana de comparación. La secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más grande.

Como se utiliza en la presente, los veinte aminoácidos convencionales y sus abreviaciones siguen la utilización convencional. Ver Immunology - A Synthesis (2nd Edition, E.S. Golub and D.R. Gren, Eds., Sinauer Associates, Sunderland7 Mass. (1991)). Los estereoisómeros (por ejemplo, D-aminoácidos) de los veinte aminoácidos convencionales, aminoácidos no naturales tales como aminoácidos a-,a-disustituidos, N-alquil aminoácidos, ácido láctico y otros aminoácidos no convencionales también pueden ser componentes adecuados para polipéptidos de la presente invención. Ejemplos de aminoácidos no convencionales incluyen: 4-hidroxiprolina, g-carboxiglutamato, e-N,N,N-trimetillisina, e-N-acetillisina, 0-fosfoserina, N-acetilserina, N-formilmetionina, 3-metilhistidina, 5-hidroxilisina, o-N-metilarginina y otros aminoácidos similares e imino ácidos (por ejemplo, 4-hidroxiprolina). En la notación de polipéptidos utilizada en la presente, la dirección de lado izquierdo es la dirección amino terminal y la dirección de lado derecho es la dirección carboxi-terminal, de acuerdo con la utilización estándar y la convención.

De manera similar, a menos que se especifique de otra manera, el extremo de lado izquierdo de las secuencias de polinucleótido de una sola hebra es el extremo 5' y la dirección de lado izquierdo de las secuencias de polinucleótidos doble hebra es referida como la dirección 51. La dirección de la adición de 5' a 3' del transcrito de RNA nacientes es referida como las regiones de secuencia de dirección de transcripción en la hebra de DNA que tienen la misma secuencia como el RNA y que son 5' al extremo 5' del transcrito de RNA referidos como "secuencias corriente arriba", regiones de secuencia sobre la hebra de DNA que tiene la misma secuencia como el RNA y que son 3' al extremo 3' del transcrito de RNA son referidas como "secuencias corriente abajo".

Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial" significa que dos secuencias de péptido, cuando se alinean óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT utilizando ponderaciones de espacio de error, comparten por lo menos 80 por ciento de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 90 por ciento de identidad de secuencia, más de preferencia por lo menos 95 por ciento de identidad de secuencia y mucho más de preferencia por lo menos 99 por ciento de identidad de secuencia.

De preferencia, las posiciones de residuos que no son idénticas difieren por sustituciones de aminoácido conservativas.

Las sustituciones de aminoácido conservativas se refieren a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas-hidroxilo es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteina y metionina. Los grupos de sustitución de aminoácidos conservativos preferidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, . alanina valina, glutámico-aspártico y asparagina-gluta ina.

Como se discute en la presente, variaciones menores en las secuencias de aminoácido de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se contemplan como que son abarcadas por la presente invención, proporcionando que las variaciones en la secuencia de aminoácidos mantengan por lo menos 75%, más de preferencia por lo menos 80%, 90%, 95% y muchos más de preferencia 99%. En particular, se contemplan reemplazos de aminoácidos conservativos. Los reemplazos conservativos son aquellos que toman lugar dentro de una familia de aminoácidos que están relacionados en sus cadenas laterales. Los aminoácidos genéticamente codificados generalmente viven en familias: (1) aminoácidos acidicos son aspartato, glutamato; (2) aminoácidos básicos son lisina, arginina, histidina; (3) aminoácidos no polares son alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano y (4) aminoácidos polares no cargados son glicina, asparagina, glutamina, cisteina, serina, treonina, tirosina. Los aminoácidos hidrófilos incluyen arginina, asparagina, aspartato, glutamina, glutamato, histidina, lisina, serina y treonina. Los aminoácidos hidrofóbicos incluyen alanina, cisteina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, triptófano, tirosina y valina. Otras familias de aminoácidos incluyen (i) serina y treonina, que son de la familia alifática-hidroxi; (ii) asparagina y la glutamina, que son de la familia que contiene amida; (iii) alanina, valina, leucina e isoleucina, que son de la familia alifática; y (iv) fenilalanina, triptófano y tirosina, que son la familia aromática. Por ejemplo, es razonable esperar que un reemplazo aislado de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructuralmente relacionado no tendrá un efecto mayor sobre el enlace o las propiedades de la molécula resultante, especialmente si el reemplazo no involucra un aminoácido dentro de un sitio de la estructura. Si un cambio de aminoácido da por resultado un péptido funcional fácilmente se puede determinar al ensayar la actividad especifica del derivado de polipéptido. Los ensayos se describen en detalle en la presente. Los fragmentos o análogos de anticuerpos o moléculas de inmunoglobulina se pueden preparar fácilmente por aquellos de habilidad ordinaria en la téenica. Los amino- y carboxi-terminales preferidos de fragmentos o análogos se presentan cerca de los limites de los dominios funcionales. Los dominios estructurales y funcionales se pueden identificar mediante la comparación de la secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos de los datos a las bases de datos de secuencias del público o patentadas. De preferencia, los métodos de comparación computarizados se utilizan para identificar motivos de secuencia o dominios de conformación de proteina predicha que se presenta en otras proteínas de estructura y/o función conocida. Los métodos para identificar secuencias de proteína que se pliegan en una estructura tridimensional conocida, son conocidos. Bowie y colaboradores. Science 253:164(1991). De esta manera, los ejemplos anteriores demuestran que aquellos de habilidad en la téenica pueden reconocer motivos de secuencia y conformaciones estructurales que pueden utilizar para definir dominios estructurales y funcionales de acuerdo con la invención.

Las sustituciones de aminoácido preferidas son aquellas que: (1) reducen la susceptibilidad a la proteólisis, (2) reducen la susceptibilidad a la oxidación, (3) alteran la afinidad de enlace para la formación de complejos de proteina, (4) alteran las afinidades de enlace y (4) confieren o modifican otra propiedades fisicoquímicas o funcionales de tales análogos. Los análogos pueden incluir varias muteínas de una secuencia diferente de la secuencia del péptido que ocurre naturalmente. Por ejemplo, las sustituciones de un solo o múltiples aminoácidos (de preferencia sustituciones de aminoácido conservativas) se pueden hacer en una secuencia que ocurre naturalmente (de preferencia en la porción del polipéptido fuera del dominio(s) que forman los contactos intermoleculares. Una sustitución de aminoácidos conservativa no debe cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia parental ( por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe de realizar.la ruptura de una hélice que ocurre en la secuencia parental, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia parental). Ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidas en la téenica se describen en Proteins, Structures and Molecular Principies (Creighton, Ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); Introduction to Protein Structure (C. Branden and J. Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N.Y. (1991)); and Thornton y colaboradores. Nature 354:105 (1991).

El término "fragmento de polipéptidol" como se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia que ocurre naturalmente deducida, por ejemplo, de una secuencia de cDNA de longitud completa. Los fragmentos típicamente son por lo menos 5, 6, 8 o 10 aminoácidos de largo, de preferencia por lo menos 14 aminoácidos de largo más de preferencia por lo menos 20 aminoácidos de largo, usualmente por lo menos 50 aminoácidos de largo, y aún más de preferencia por lo menos 70 aminoácidos de largo. El término "análogo" como se utiliza en la presente, se refiere a polipéptidos que están comprendidos de un segmento de por lo menos 25 aminoácidos que tiene una identidad sustancial a una porción de secuencia de aminoácidos deducida y que tiene enlace específico a CD47, bajo condiciones de enlace adecuadas. Típicamente, los análogos de polipéptido comprenden una sustitución de aminoácido conservativa (o adición o supresión) con respecto a la secuencia que ocurre naturalmente. Los análogos típicamente son de por lo menos 20 aminoácidos de largo, de preferencia por lo menos 50 aminoácidos de largo o más largos, y frecuentemente pueden ser tan largos como un polipéptido que ocurre naturalmente de longitud completa.

Los análogos de péptido se utilizan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no de péptido con propiedades análogas a aquellas del péptido de plantilla. Estos tipos de compuesto no péptido son llamados "miméticos de péptido" o "peptidomiméticos". Fauchere, J. Adv. Drug Res. 15:29 (1986), Veber and Freidinger TINS p.392 (1985); and Evans y colaboradores. J. Med. Chem. 30: 1229 (1987). Tales compuestos frecuentemente se desarrollan con la ayuda de la modelación molecular computarizada. Los miméticos de péptidos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles se pueden utilizar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los peptidomiméticos son estructuralmente similares a un polipéptido de paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una propiedad bioquímica o actividad farmacológica), tal como el anticuerpo humano, pero tienen uno o más enlaces de péptido opcionalmente reemplazados por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: — CH2NH— , — CH2S-, — CH2-CH2— , --CH=CH--(cis y trans); --COCH2--, CH(0H)CH2— , y CH2S0— , por métodos bien conocidos en la téenica. La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia consensual con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede utilizar para generar péptidos más estables. Además, los péptidos restringidos que comprenden una secuencia consensual o una variación de secuencia consensual sustancialmente idéntica se pueden generar por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch Ann Rev. Biochem 61:387 (1992)); por ejemplo, al adicionar residuos de cisteina internos capaces de formar puentes de disulfuro intramoleculares con la cielisación de péptido.

El término "agente" se utiliza en la presente para denotar un compuesto químico, una mezcla de compuestos químicos, una macromolécula biológica o un extracto hecho a partir de materiales biológicos.

Como se utiliza en la presente, los términos "marcar" o "marcado" se refiere a la incorporación de un marcador detectadle, por ejemplo, mediante la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión a un polipéptido de porciones de biotinilo que se puede detectar mediante la avidina marcada ( por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática se puede detectar por métodos ópticos o colorimétricos). En ciertas situaciones, la marca o marcador también puede ser terapéutico. Varios métodos para marcar polipéptidos y glicoproteinas son conocidos en la téenica y pueden ser utilizados. Ejemplos de marcas para polipéptidos incluyen, pero no están limitados a, los siguientes: radioisótopos o radionúclidos (por ejemplo, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 1:L1In, i25j, marcas fluorescentes (por ejemplo, FITC, rodamina, lantánido fósforos), marcar enzimáticas (por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, p-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), quimioluminiscente, grupos biotinilo, epitopos de polipéptido predeterminados reconocidos por un reportador secundario (por ejemplo, secuencias de par de cremallera de leucina, sitios de enlace para anticuerpos secundarios, dominios de enlace de metal, marcas de epitopo). En algunas modalidades, las marcas se unen por brazos espaciadores de varias longitudes para reducir el impedimento estérico potencial. El término "agente o fármaco farmacéutico" como se utiliza en la presente se refiere a un compuesto químico o composición capaz de inducir un efecto terapéutico deseado cuando se administra apropiadamente a un paciente.

El término "agente antineoplásico" se utiliza en la presente para referirse a agentes que tienen la propiedad funcional de inhibir un desarrollo o progresión de un neoplasma en un humano, particularmente una lesión maligna (cancerosa), tal como un carcinoma, sarcoma, linfoma o leucemia. La inhibición de la metástasis es frecuentemente una propiedad de los agentes antineoplásicos.

Otros términos de química en la presente se utilizan de acuerdo con la utilización convencional en la téenica, como es ejemplificado por The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms (Parker, S., Ed., McGraw-Hill, San Francisco (1985)).

Como se utiliza en la p.resente, "sustancialmente puro" significa una especie de objeto que es la especie predominante presente es decir, una base molar es más abundante que cualquier otra especie individual en la composición) y de preferencia una fracción sustancialmente purificada es una composición en donde la especie de objeto comprende por lo menos aproximadamente 50 por ciento (en una base molar) de todas las especies macromoleculares presentes.

Generalmente, una composición sustancialmente pura comprenderá más de aproximadamente 80 por ciento de todas las especies macromoleculares presentes en la composición, más de preferencia más que aproximadamente 85%, 90%, 95% y 99%, más de preferencia, la especie objetivo se purifica ha homogeneidad esencial (las especies contaminantes no se pueden detectar en la composición mediante métodos de detección convencionales) en donde la composición consiste esencialmente de una sola especie macromolecular.

Anticuerpos CD47 Los anticuerpos monoclonales de la invención tienen la habilidad para enlazar CD47, para inhibir el enlace de SIRPa a CD47, disminuir la señalización mediada por CD47-SIRPa, promover la fagocitosis e inhibir el crecimiento y/o migración de tumor. La inhibición se determina, por ejemplo, utilizando el ensayo celular descrito en la presente en los Ejemplos.

Los anticuerpos ejemplares de la invención incluyen el anticuerpo 2A1, la versión quimérica de 2A1 y variantes humanizadas de 2A1. Los anticuerpos ejemplares de la invención incluyen un anticuerpo que tiene una cadena pesada variable (VH) seleccionada de SEQ ID NOs: 5-30, y que tiene una cadena ligera variable (VL) seleccionada de SEQ ID NOs: 31-47. Específicamente, los anticuerpos ejemplares incluyen aquellos proporcionados en la Tabla 1.

Tabla 1 También se incluyen en la invención anticuerpos que enlazan al mismo epitopo como los anticuerpos CD47 descritos en la presente. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención específicamente enlazan a un epitopo que incluye uno o más residuos de aminoácido en CD47 humana { ver, por ejemplo, Acceso de GenBank No. Q08722.1).

La secuencia de aminoácidos de un CD47 humana ejemplar se proporciona enseguida (Acceso de GenBank No. Q08722.1 (GI:1171879), incorporada en la presente por referencia). La secuencia de señal (aminoácidos 1-18) está subrayada. 1 mwplvaalll gsaccqsaql lfnktksvef tfendtvvip cfvtnmeaqn ttevyvkwkf 61 kgrdiytfdg alnkstvptd fssakievsq llkgdaslkm dksdavshtg nytcevtelt 121 regetiielk yrvvswfspn enilivifpi faillf gqf giktlkyrsg gmdektiall 181 vaglvitviv ivgailfvpg cyslknatgl glivtstgil illhyyvfst aigltsfvia 241 ilviqviayi lavvglslci aacipmhgpl lisglsilal aqllglvymk fvasnqktiq 301 pprkaveepl nafkeskgmm nde (SEQ ID NO: 48) Por claridad, la secuencia de aminoácidos de una CD47 humana ejemplar excluyendo la secuencia de señal se proporciona enseguida. 1 qllfnktksv eftfcndtvv ipcfvtnmea qnttevyvkw kfkgrdiytf dgalnkstvp 61 tdfssakiev sqllkgdasl kmdksdavsh tgnytcevte ltregetiie lkyrvvswfs 121 pnenilivif pifaillfwg qfgiktlkyr sggmdektia llvaglvitv ivivgailfv 181 pgeyslknat glglivtstg ilillhyyvf staigltsfv iailviqvia yilavvglsl 241 ciaacipmhg pllisglsil alaqllglvy mkfvasnqkt iqpprkavee plnafkeskg 301 mmnde (SEQ ID NO: 147) La secuencia de aminoácidos de un dominio CD47-IgV humano ejemplar se proporciona enseguida: 19 qllfnktksv eftfendtvv ipcfvtnmea qnttevyvkw kfkgrdiytf dgalnkstvp 79 tdfssakiev sqllkgdasl kmdksdavsh tgnytcevte ltregetiie lkyrvv (SEQ ID NO: 49) Los anticuerpos monoclonales ejemplares de la invención incluyen, por ejemplo, anticuerpos humanizados que tienen una región de cadena pesada variable (VH) y/o región ligera variable (VL) mostrada en las secuencias enseguida.

Las regiones de cadena pesada variable (VH) de los anticuerpos CD47 se proporcionan enseguida. Las regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de la cadena VH de los anticuerpos CD47 son resaltados enseguida. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de CDR1 de VH es GFNIKDYYLH (SEQ ID NO: 50), GYTFTYYYLH (SEQ ID NO: 57), GFTFTYYYLH (SEQ ID NO: 58), GYNFTYYYLH (SEQ ID NO: 59), GYTITYYYLH (SEQ ID NO: 60), GYTFKYYYLH (SEQ ID NO: 61), GYTFTDYYLH (SEQ ID NO: 62), GFTFTDYYLH (SEQ ID NO: 63), GFTITDYYLH (SEQ ID NO: 64), GYTFKDYYLH (SEQ ID NO: 65) o GFTFKDYYLH (SEQ ID NO: 66). En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de VH es WIDPDNGDTE (SEQ ID NO: 51), WIDPDQGDTE (SEQ ID NO: 72), WIDPDYGDTE (SEQ ID NO: 73), WIDPDSGDTE (SEQ ID NO: 74), WIDPDNADTE (SEQ ID NO: 75), o WIDPDNTDTE (SEQ ID NO: 76). En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de VH es NAAYGSSSYPMDY (SEQ ID NO: 52) o NAAYGSSPYPMDY (SEQ ID NO: 77). Í : . Í .

: ; : QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKAS||I||||1||WVRQAPGQALEMG||||||Í|1ÍYAQKFQDRVTITRDR SMSTAYMELSSLRSEDTAMYYC|AÍ|Í||ÍÍÍÍWGQGTTVTV (SEQ ID NO: 23) QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFTITDYYLHWVRQAPGQALENKGWIDPDKGDTEYAQKFQDRVTITRDR 5MSTAYMEIG5L,RSEDTAMYYCt-!AAyGSSSYPKUYKGQGTTVTV (SEQ ID NO: 24) QMQLVQSGAEVKKTGS3VKV3CKAs||f§Íf||ÍWRQAPGQALEWMGÍl|l|Í|fI|YAQKFQDRVTITRDR SMSTAYMELSSLRSEDTAMYYC|¾Í1|||||I|ÍWGQGTTVTV (SEQ ID NO: 25) QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFTFKDYYl/HKVRQAPGQAÍ.EWMGWIDPDNGDTEYAQKFODRVTITRDR SMSTAYMELSSLRSEDTAMYYC§§||§||||ÍwGQGTTVTV (SEQ ID NO: 26) QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKAS|ÍÍÍÍ|||1|WVRQAPGQALEWMGÍ|||DI1|||YAQKFQDRVTITRDR SMSTAYÍQISCLRSEDTAMYYCA YGSSSYPMDYKGQGTTVTV (SEQ ID NO: 27) QMQLVQSGAEVKKTGSSVKVSCKASGFNIKDYYLHKVROAPGQALENMGWIDPDNGDTEYAQKFQDRVTTTRDR SMSTAYHELSSLTSEDTAVYYCNAAYGSSSYPMDYKGQGTTVTV (SEQ ID NO: 28) Las regiones de cadena ligera variable (VL) de los anticuerpos CD47 se proporcionan enseguida. Las CDRs de la cadena VL de los anticuerpos CD47 se resaltan enseguida. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de CDRl de VL es KASQD1HRYLS (SEQ ID NO: 53), RASQD1HRYLA (SEQ ID NO: 67) o RARQGIHRYLS (SEQ ID NO: 68). En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de VL es RANRLVD (SEQ ID NO: 54), RANRLQS (SEQ ID NO: 69), RANRRAT (SEQ ID NO: 70), o RANRLVS (SEQ ID NO: 71). En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de VL es LQYDEFPYT (SEQ ID NO: 55). , ' : . i : : , i : NIQMTQSPSAMSASVGDRVIITCKASQDIHRYLSKFOQKPGKVPKLLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTEFTLT ISSLQPEDFATYYCIQYDEFPYTFGGGTKVEIK (SEQ ID NO: 45) NIQMTQSPSAMSASVGDRVTITc!!!!|Íi!! Í|WFQQKPGKVPKLLIYÍÍÍ!!!|SGVPSRFSGSGSGTEFTLT ISSL.QPFDFATYYCLQYDEFPYTFGGGTKVFTK (SEQ ID NO: 46) NiQMTQSPSAMSASVGDRVTITCRA QGIHRYlSWFQQKPGKVPKLLlYRANRLVSGVPSRFSGSGSGTEFTlT I SSI.QPEDFATYYC LQYDEFP YTFGGGTKVE : K (SEQ ID NO: 47) En algunos casos, los anticuerpos CD47 descritos en la presente comprenden una región de cadena pesada variable seleccionada de SEQ ID NOs: 5-30 y una región de cadena ligera variable seleccionada de SEQ ID NOs: 31-47. Un anticuerpo CD47 ejemplar comprende una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 5 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 31; una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 7 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 35; una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 11 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 42, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 5 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 32, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 7 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 33, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 7 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 34, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 7 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 36, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 7 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 37, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 7 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 38, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 29 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 35, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 30 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 35, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 7 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 43, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 11 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 43, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 11 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 47, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 15 y una región de cadena ligera variable en SEQ ID NO: 43, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 15 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 44, una región de cadena pesada variable en SEQ ID NO: 11 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 44, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 22 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 35, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 7 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 39, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 8 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 39, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 16 y una región de cadena ligera variable expuesta en la SEQ ID NO: 35, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 20 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 35, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 21 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 35, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 17 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 35, una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 28 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 35 o una región de cadena pesada variable expuesta en SEQ ID NO: 27 y una región de cadena ligera variable expuesta en SEQ ID NO: 35.

Los anticuerpos CD47 descritos en la presente comprenden cualquiera de las regiones VH proporcionadas en SEQ ID NOs: 5-30 emparejadas con cualquiera de las regiones VL proporcionadas en SEQ ID NO: 31-47. Específicamente, los anticuerpos CD47 descritos en la presente comprenden cualquiera de las regiones VH proporcionada en SEQ ID NO: 5, 7, 8, 11, 15-17, 20-22, 27-30 emparejadas con cualquiera de las regiones VL proporcionadas en SEQ ID NO: 31-39, 42, 43, 44, y 47.

Los anticuerpos CD47 descritos en la presente comprenden cualquiera de las regiones CDR1 de VH proporcionadas en SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 y SEQ ID NO: 66, cualquiera de las regiones CDR2 de VH proporcionadas en SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75, y SEQ ID NO: 76, cualquiera de las regiones CDR3 de VH proporcionadas en SEQ ID NO: 52, y SEQ ID NO: 77, cualquiera de las regiones CDR1 de VL proporcionadas en SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 67, y SEQ ID NO: 68, cualquiera de las regiones CDR2 de VL proporcionadas en SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70, y SEQ ID NO: 71, y la región CDR3 de VL proporcionadas en SEQ ID NO: 55.

Aquellos expertos en la téenica reconocerán que es posible determinar, sin experimentación indebida, si un anticuerpo monoclonal tiene la misma especificidad como un anticuerpo monoclonal de la invención ( por ejemplo, el anticuerpo 2A1, o un anticuerpo que tiene una cadena pesada variable seleccionada de SEQ ID NOs: 5-31 y una cadena ligera variable seleccionada de SEQ ID NOs: 31-47) al averiguar si el primero previene al último del enlace CD47. Si el anticuerpo monoclonal que es probado compite con el anticuerpo monoclonal de la invención, como es mostrado por una disminución en el enlace mediante el anticuerpo monoclonal de la invención, entonces los dos anticuerpos monoclonales enlazan al mismo, o una estrechamente relacionado, epitopo.

Un método alternativo para determinar si un anticuerpo monoclonal tiene la especificidad del anticuerpo monoclonal de la invención es pre-incubar el anticuerpo monoclonal de la invención con proteina CD47 soluble (con la cual es normalmente reactivo), y luego adicionar el anticuerpo monoclonal que es probando para determinar si el anticuerpo monoclonal que es probado es inhibido en su habilidad para enlazar CD47. Si el anticuerpo monoclonal que es probado es inhibido entonces, en toda la probabilidad, tiene la misma, o funcionalmente equivalente, especificidad epitópica como el anticuerpo monoclonal de la invención.

Anticuerpos de la Presente Invención La clasificación de anticuerpos monoclonales de la invención, también se puede llevar a cabo, por ejemplo, al medir la señalización mediada por CD47- y/o CD47/SIRPa, y al determinar si el anticuerpo monoclonal de prueba es capaz de modular, bloquear, inhibir, reducir, antagonizar, neutralizar o de otra manera interferir con la señalización mediada por CD47- y/o CD47/SIRPa. Estos ensayos pueden incluir ensayos de enlace competitivos. Adicionalmente, estos ensayos pueden medir una lectura biológica, por ejemplo la habilidad para promover fagocitosis de una célula que expresa CD47 mediante un macrófago, como es descrito en el Ejemplo 9 (Figura 9).

Varios procedimientos conocidos dentro de la téenica se pueden utilizar para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra CD47, o contra derivados, fragmentos, análogos, homólogos u ortólogos del mismo. (Ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow E, and Lañe D, 1988, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, NY, incorporada en la presente por referencia). Los anticuerpos completamente humanos son moléculas de anticuerpo en los cuales la secuencia completa de tanto la cadena ligera como la cadena pesada, incluyendo las CDRs, surgen de genes humanos. Tales anticuerpos son llamados "anticuerpos humanos" o "anticuerpos completamente humanos" en la presente. Los anticuerpos monoclonales humanos se preparan, por ejemplo, utilizando los procedimientos descritos en los Ejemplos proporcionados enseguida. Los anticuerpos monoclonales humanos también se pueden preparar al utilizar la téenica del trioma; la técnica del hibridoma de células B humanas (ver Kozbor, y colaboradores, 1983 Imunol Today 4: 72); y la técnica de hibridoma de EBV para producir anticuerpos monoclonales humanos (ver Colé, y colaboradores, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. -Liss, Inc., pp. 77-96). Los anticuerpos monoclonales humanos se pueden utilizar y se pueden producir al utilizar en hibridomas humanos (ver Cote, y colaboradores, 1983, Proc Nati Acad Sci USA 80: 2026-2030) o al transformar las células B humanas con el Virus de Epstein Barr in vi tro (ver Colé, y colaboradores, 1985 In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp.77-96).

Los anticuerpos se purifican por técnicas bien conocidas, tal como cromatografía de afinidad utilizando proteína A o proteína G, que proporciona principalmente la fracción IgG del suero inmune. De manera subsecuente, o alternativamente, el antigeno especifico que es el objetivo de la búsqueda de inmunoglobulina, o un epitopo del mismo, se puede inmovilizar en una columna para purificar el anticuerpo especifico inmune mediante la cromatografía de inmunoafinidad. La purificación de inmunoglobulinas se discute, por ejemplo, por D. Wilkinson (The Scientist, publicado por The Scientist, Inc., Philadelphia PA, Vol.14, No. 8 (17 de Abril del 2000), pp.25-28).

Los anticuerpos CD47 de la invención son anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales que modulan, bloquean, inhiben, reducen, antagonizan, neutralizan o de otra manera interfieren con la señalización de célula mediada por CD47- y/o CD47/SIRPa se generan, por ejemplo, al inmunizar en animal con CD47 enlazado a la membrana y/o soluble, tal como, por ejemplo, CD47 humana o un fragmento in unogénico, derivado o variante de la misma. Alternativamente, el animal se inmuniza con células transíectadas con un vector que contiene una molécula de ácido nucleico que codifica CD47, tal que CD47 se expresa y se asocia con la superficie de las células transfectadas. Alternativamente, los anticuerpos se obtienen al clasificar una librería que contiene anticuerpo o secuencias de dominio de enlace de antígeno para el enlace a CD47. La librería se prepara, por ejemplo, en bacteriófago como fusiones de proteínas o péptidos a una proteína de cubrimiento de bacteriófago que se expresa en la superficie de las partículas de fago ensambladas y las secuencias de DNA de codificación contenidas dentro de las partículas de fago (es decir, "librería exhibida de fago"). Los hibridomas que resultan de las fusiones de mieloma/célula B luego se clasifican para la reactividad CD47.

Los anticuerpos monoclonales se preparan, por ejemplo, utilizando métodos de hibridoma, tales como aquellos descritos por Kohler y ilstein, Nature, 256:495 (1975). En un método de hibridoma, un ratón, hámster u otro animal hospedero apropiado, típicamente se inmuniza con un agente inmunizante para inducir a los linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que específicamente enlazan al agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vi tro.

El agente inmunizante típicamente incluirá el antígeno de proteína, un fragmento del mismo o una proteína de fusión del mismo. Generalmente, cualquiera de los linfocitos de sangre periférica, se utilizan si se desean células de origen humano, o células del bazo o células del ganglio linfático se utilizan si se desean fuentes mamíferas no de humano. Los linfocitos luego se fusionan con una línea de células inmortalizada utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103.)· Las líneas de células inmortalizadas usualmente se transforman en células mamíferas, particularmente células de mieloma de origen de roedor bovino y humano. Usualmente, se emplean líneas de células de mieloma de rata o ratón. Las células de hibridoma se pueden cultivar en un medio de cultivo adecuado que de preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas, no fusionadas. Por ejemplo, si las células parentales carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferasa (HGPRT I o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT") las sustancias que previenen el crecimiento de células de excipiente de HGPRT.

Las líneas de células inmortalizadas preferidas son aquellas que se fusionan eficientemente, soportan la expresión a alto nivel estable del anticuerpo mediante las células que producen anticuerpo seleccionado, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Las líneas de células inmortalizadas más preferidas son líneas de mieloma de murino, que se pueden obtener, por ejemplo, del Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas de células de mieloma humano y heteromieloma de ratón- humano también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales. ( Ver Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur y colaboradores, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp.51-63)).

El medio de cultivo en el cual las células de hibridoma son cultivadas luego se pueden ensayar para la presencia de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. De preferencia, la especificidad de enlace de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma se determina mediante inmunoprecipitación o mediante un ensayo de enlace in vit ro, tal como radioinmunoensayo (RIA) o ensayo inmunoabsorbente enlazado de enzimas (ELISA). Tales téenicas y ensayos son conocidos en el arte. La afinidad de enlace del anticuerpo monoclonal, por ejemplo, se puede determinar mediante el análisis de Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980). Por otra parte, en aplicaciones terapéuticas del anticuerpo monoclonales, es importante identificar anticuerpos que tengan un alto grado de especificidad y una alta afinidad de enlace para el antigeno objetivo.

Después de que se identifican las células de hibridoma deseadas, los clones pueden ser subclonados al limitar los procedimientos de dilución y al cultivar mediante métodos estándares. (Ver Goding Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, (1986) pp.59-103).

El medio de cultivo adecuado para este propósito incluye, por ejemplo, el medio de Eagle Modificado de Dulbecco y el medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de hibridoma pueden ser cultivadas in vivo como ascitis en un mamífero.

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se pueden aislar o purificar del medio de cultivo o fluido de ascitis mediante procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales tales como, por ejemplo, A-Sefarosa de proteina, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden hacer por métodos de DNA recombinante, tales como aquellos descritos en la patente de los Estados Unidos No.4,816,567. El DNA que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede ser fácilmente aislado y secuenciado utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, al utilizar sondas de oligonucleótidos que son capaces de enlazar específicamente a genes que codifican las cadenas pesada y ligera de anticuerpos de murino). Las células de hibridoma de la invención sirven como una fuente preferida de tal DNA. Una vez aislado, el DNA puede ser colocado en vectores de expresión, que luego se transfectan en células de hospedero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de Riñón Embriónico Humano (HEK) 293, células de simio COS, PER.C6®, células NSO, SP2/0, YB2/0, o células de mieloma que de otra manera no producen proteina de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes. El DNA también se puede modificar, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación o dominios constantes de cadena pesada y ligera en lugar de las secuencias de murino homologas (ver la patente de Estados Unidos No.4,816,567; Morrison, Nature 368, 812-13 (1994)) o al unir covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido no de inmunoglobulina. Tal polipéptido no de inmunoglobulina puede ser sustituido por los dominios constantes de un anticuerpo de la invención, o puede ser sustituido por los dominios variables de un sitio de combinación de antígeno de un anticuerpo de la invención para crear un anticuerpo bivalente quimérico.

Anticuerpos Humanos y Humanización de Anticuerpos Los anticuerpos monoclonales de la invención incluyen anticuerpos completamente humanos o anticuerpos humanizados. Estos anticuerpos son adecuados para la administración a humanos sin engendrar una respuesta inmune por el humano contra la inmunoglobulina administrada.

Un anticuerpo CD47 se genera como por ejemplo, utilizando los procedimientos descritos en los Ejemplos proporcionados enseguida. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 de tal invención se identifican utilizando una estrategia de inmunización RIMMS (Sitios Múltiples de Inmunización Repetitivas) modificada en ratones y la generación de hibridoma subsecuente.

En otros métodos alternativos, un anticuerpo CD47 se desarrolla, por ejemplo, utilizando métodos de exhibición de fago utilizando anticuerpos que contienen solamente secuencias humanas. Tales procedimientos son bien conocidos en la téenica, por ejemplo, en W092/01047 y la patente de los Estados Unidos No. 6,521,404, que se incorporan en la presente por referencia. En este procedimiento, una librería combinatoria de pares aleatorios que llevan fago de las cadenas ligeras y pesadas se clasifican utilizando la fuente natural o recombinante de cd47 o fragmentos de la misma. En otro procedimiento, un anticuerpo CD47 se puede producir mediante un proceso en donde por lo menos una etapa del proceso incluye inmunizar un animal no humano, transgénico con la proteína CD47 humana. En este procedimiento, algunos de los loci de cadena pesada y/o cadena ligera kappa endógenos de este animal no humano xenogénico se han deshabilitado y son incapaces del rearreglo requerido para generar genes que codifican inmunoglobulinas en respuesta a un antígeno. Además, por lo menos un locus de cadena pesada humana y por lo menos un locus de cadena ligera humana se han transfectado establemente en el animal. De esta manera en respuesta a un antígeno administrado, los loci humanos se rearreglan para proporcionar genes que codifican regiones variables humanas inmunoespecificas para el antigeno. En la inmunización, por lo tanto, el Xenoratón produce células B que secretan inmunoglobulinas completamente humanas.

Una variedad de téenicas son bien conocidas en el arte para producir animales no humanos xenogénicos. Por ejemplo, ver las Patentes de los Estados Unidos No.6,075,181 y No. 6,150,584, que se incorporan en la presente por referencia en su totalidad. Esta estrategia general se demostró en relación con la generación de las primeras razas XenoMouse™ como es publicaron en 1994. Ver Green y colaboradores. Nature Genetics 7:13-21 (1994), que es incorpora en la presente por referencia en su totalidad. Ver también, las Patentes de los Estados Unidos Nos.6,162,963; 6,150,584; 6,114,598; 6,075,181; y 5,939,598 y las Patentes Japonesas No.3 068 180 B2, 3068 506 B2 y 3068 507 B2 y la Patente Europea No. EP 0 463 151 Bl y las Solicitudes de Patente Internacionales No. WO 94/02602, WO 98/24893, WO 00/76310 y miembros de familia relacionados.

En8 un procedimiento alternativo, otros han utilizado un procedimiento de "minilocus" en el cual un locus de Ig exógeno se imita a través de la inclusión de piezas (genes individuales) del locus Ig. De esta manera, uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH, una región constante mu, y una segunda región constante (de preferencia una región constante gamma) se forman en un constructo para la inserción en un animal. Ver, por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,545,806; 5,545,807; 5,591,669; 5,612,205; 5,625,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,643,763; 5,661,016; 5,721,367; 5,770,429; 5,789,215; 5,789,650; 5,814,318; 5,877; 397; 5,874,299; 6,023,010; y 6,255,458; y la Patente Europea No. 0 546 073 Bl; y las Solicitudes de Patentes Internacionales Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, y WO 98/24884 y miembros de familia relacionados.

La generación de anticuerpos humanos a partir de ratones en los cuales, a través de la fusión de microcelda, piezas grandes de cromosomas, o cromosomas completos, se han introducido, también se ha demostrado. Ver las Solicitudes de Patentes Europeas Nos.773 288 y 843961.

Las respuestas de anticuerpo anti-ratón humano (HAMA) han conducido en la industria a preparar anticuerpos quiméricos o de otra manera humanizados. Mientras que los anticuerpos quiméricos tienen una región constante humana y una región variable inmune, se espera que ciertas respuestas del anticuerpo anti-quimérico humano (HACA) sean observadas, particularmente en utilizaciones crónicas o de múltiples dosis del anticuerpo. De esta manera, seria deseable proporcionar anticuerpos completamente humanos contra CD47 con el fin de viciar o de otra manera mitigar los problemas y/o efectos de la respuesta de HAMA o HACA.

La producción de anticuerpos con inmunogenicidad reducida también se realiza por la vía de las téenicas de humanización, quimerización y exhibición utilizando librerías apropiadas. Será apreciado que los anticuerpos de murino o anticuerpos de otra especie pueden humanizados o primatizados utilizando técnicas bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Winter y Harris Immunol Today 14:43 46 (1993) y Wright y colaboradores. Crit, Reviews in Immunol.12125-168 (1992). El anticuerpo de interés se puede diseñar mediante técnicas de DNA recombinante para sustituir el CH1, CH2, CH3, dominios de bisagra y/o el dominio de estructura con la secuencia humana correspondiente (ver WO 92102190 y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,761; 5,693,792; 5,714,350; y 5,777,085). También, el uso de cDNA de Ig para la construcción de genes de inmunoglobulina quiméricos es conocido en la técnica (Liu y colaboradores, P.N.A.S.84:3439 (1987) y J. Immunol 139:3521 (1987)). El mRNA se aisla de un hibridoma u otra célula que produce el anticuerpo y se utiliza para producir cDNA. El cDNA de interés se puede amplificar mediante la reacción en cadena de polimerasa usando cebadores específicos (Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,683,195 y 4,683,202). Alternativamente, una librería se hace y se clasifica para aislar la secuencia de interés. La secuencia de DNA que codifica la región variable del anticuerpo luego se fusiona a las secuencias de región constante humanas. Las secuencias de genes de regiones constantes humanas se pueden encontrar en Kabat y colaboradores. (1991) Sequences of Proteins of inmunological Interest, N.I.H. publicación no. 91-3242. Los genes de región C humana son fácilmente disponibles de clones conocidos. La elección del isotipo será guiada por las funciones efectoras deseadas, tal como la fijación de complemento, o la actividad en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo. Los isotipos preferidos son IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4. Cualquiera de las regiones cortantes de cadena ligera humanas, kappa o lambda, se pueden utilizar. El anticuerpo humanizado, quimérico luego se expresa por métodos convencionales.

Los fragmentos de anticuerpo, tales como Fv, F(ab')2 y Fab se pueden preparar por mediante la segmentación de la proteina intacta, por ejemplo, mediante la segmentación con proteasa o química. Alternativamente, se diseña un gen truncado. Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una porción del fragmento F(ab')2 incluirá las secuencias de DNA que codifiquen el dominio CHl y la región de bisagra de la cadena H, seguido por un codón de detención traduccional para producir la molécula truncada.

Las secuencias consensúales de las regiones H y LJ se pueden utilizar para diseñar oligonucleótidos para el uso como cebadores para producir sitios de restricción útiles en la región J para el enlace subsecuente de segmentos de región V a segmentos de región C humanos. El cDNA de región C se puede modificar mediante la mutagénesis dirigida al sitio para colocar un sitio de restricción en la posición análoga en la secuencia humana.

Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, YACs, episomas derivados de EBV y los similares. Un vector conveniente es uno que codifica una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con los sitios de restricción apropiados diseñados de modo que cualquier secuencia VH o VL se puede insertar y expresar fácilmente. En tales vectores, el empalme usualmente ocurre entre el sitio donador de empalme en la región J insertada y el sitio aceptor de empalme que precede la región C humana, y también en las regiones de empalme que ocurren dentro de los exones CH humanos. La poliadenilación y terminación de transcripción ocurre en los sitios cromosómicos nativos corriente abajo de las regiones de codificación. El anticuerpo quimérico resultante se puede unir a cualquier promotor fuerte, incluyendo LTRs retrovirales, por ejemplo, el promotor temprano SV-40, (Okayama y colaboradores, Mol.

Cell. Bio. 3:280 (1983)), virus del sarcoma de Rous LTR (Gorman y colaboradores, P.N.A.S.79:6777 (1982)), y virus de leucemia de murino de moloncy LTR (Grosschedl y colaboradores , Cell 41:885 (1985)). También, como será apreciado, se pueden utilizar promotores de Ig nativos y los similares.

Además, los anticuerpos humanos o anticuerpos de otras especies se pueden generar a través de teenologías de tipo exhibición, que incluyen, sin limitación, la exhibición en fagos, exhibición retroviral, exhibición ribosomal y otras técnicas, utilizando técnicas bien conocidas en el arte y las moléculas resultantes se pueden someter a la maduración adicional, tal como la maduración de afinidad, ya que tales técnicas son bien conocidas en el arte. Wright y colaboradores, Crit, Reviews in Immunol. 12125-168 (1992), Hanes and Plückthun PNAS USA 94:4937-4942 (1997) (ribosomal display), Parmley and Smith Gene 73:305-318 (1988) (phage display), Scott, TIBS, vol. 17:241-245 (1992), Cwirla y colaboradores , PNAS USA 87:6378-6382 (1990), Russel y colaboradores, Nucí. Acids Research 21:1081-1085 (1993), Hoganboom y colaboradores, Immunol. Reviews 130:43-68 (1992), Chiswell and McCafferty TIBTECH; 10:80-8A (1992), y la Patente No. 5,733,743. Si se utilizan tecnologías de exhibición para producir anticuerpos que no son humanos, tales anticuerpos se pueden humanizar como es descrito en lo anterior.

Utilizando estas téenicas, se pueden generar anticuerpos a células que expresan CD47, formas solubles de CD47, epitopos o péptidos de los mismos, y librerías de expresión a los mismos ( Ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 5,703,057), que después se pueden clasificar como es descrito en lo anterior para las actividades descritas en la presente.

Los anticuerpos CD47 de la invención se pueden expresar mediante por un vector que contiene un segmento de DNA que codifica el anticuerpo de una sola cadena descrita en lo anterior.

Estos pueden incluir vectores, liposomas, DNA desnudo, DNA asistido con adyuvante, pistola génica, catéteres, etc. Los vectores incluyen conjugados químicos tal como es descrito en el documento WO 93/64701, que tiene la porción de dirección (por ejemplo, un ligando a un receptor superficie celular) y una porción de enlace de ácido nucleico (por ejemplo polilisina), vector viral (por ejemplo, un vector viral de DNA o RNA), proteínas de fusión tal como es descrito en PCT/US95/02140 (WO 95/22618) que es una proteína de fusión que contiene un porción objetivo (por ejemplo, un anticuerpo específico para una célula objetivo) y una porción de enlace de ácido nucleico (por ejemplo, una protamina), plásmidos, fagos, etc. Los vectores pueden ser cromosómicos, no cromosómicos o sintéticos.

Los vectores preferidos incluyen vectores virales, proteínas de fusión y conjugados químicos. Los vectores retrovirales incluyen virus de leucemia de murino de Moloncy. Se prefieren los vectores virales de DNA. Estos vectores incluyen vectores pox tales como vectores ortopox o avipox, vectores de herpes virus tal como un virus de herpes simple I (HSV) (ver Geller, A. I. y colaboradores, J. Neurochem, 64:487 (1995); Lim, F., y colaboradores, in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford Univ. Press, Oxford England) (1995); Geller, A. I. y colaboradores, Proc Nati. Acad. Sci.: U.S.A. 90:7603 (1993); Geller, A. I., y colaboradores, Proc Nati. Acad. Sci USA 87:1149 (1990), Vectores de Adenovirus (ver LeGal LaSalle y colaboradores, Science, 259:988 (1993); Davidson, y colaboradores, Nat.

Genet 3:219 (1993); Yang, y colaboradores, J. Virol.69:2004 (1995) y Vectores de Virus Adeno-asociados (ver Kaplitt, M. G., y colaboradores., Nat. Genet.8:148 (1994).

Los vectores virales pox introducir el gen en el citoplasma de células. Los vectores de virus avipox dan por resultado solamente una expresión a corto plazo del ácido nucleico. Los vectores de adenovirus, vectores de virus adeno-asociados y vectores de virus de herpes simple (HSV) se prefieren para introducir el ácido nucleico en células neuronales. El vector de adenovirus da por resultado una expresión de más corto plazo (aproximadamente 2 meses) el virus adeno-asociado (aproximadamente 4 meses) que a su vez es más corto que los vectores HSV. El vector particular elegido dependerá de la célula objetivo y la condición que es tratada. La introducción puede ser mediante téenicas estándares, por ejemplo, infección, transfección, transducción o transformación. Ejemplos de modos de transferencia génica incluyen, por ejemplo, DNA desnudo, precipitación con CaP04, DEAE dextrano, electroporación, fusión de protoplastos, lipofección, microinyección de células y vectores virales.

El vector se puede emplear para dirigir esencialmente cualquier célula objetivo deseada. Por ejemplo, la inyección estereotáxica se puede utilizar para dirigir los vectores (por ejemplo, adenovirus, HSV) a una ubicación deseada. Adicionalmente, las partículas se pueden suministrar mediante infusión intracerebroventricular (icv) utilizando un sistema de infusión de minibomba, tal como un Sistema de Infusión SynchroMed. Un método en base al flujo de volumen, llamado convección, también se ha probado efectivo en el suministro de moléculas grandes a áreas extendidas del cerebro y puede ser útil en suministrar el vector a la célula objetivo. ( Ver Bobo y colaboradores, Proc Nati Acad Sci USA 91:2076-2080 (1994); Morrison y colaboradores, Am J. Physiol 266:292-305 (1994)). Otros métodos que se pueden utilizar incluyen catéteres, inyección intravenosa, parenteral, intraperitoneal y subcutánea, y oral u otra ruta administración conocidas.

Estos vectores se pueden utilizar para expresar cantidades grandes de anticuerpos que se pueden utilizar en una variedad de maneras. Por ejemplo, para detectar la presencia de CD47 en una muestra, el anticuerpo también se puede utilizar para tratar de enlazar e interrumpir la interacción de CD47- y/o CD47/SIRPa y la señalización mediada por CD47/SIRPa.

Se pueden adaptar téenicas para la producción de anticuerpos de una sola cadena específicos a una proteína antigénica de la invención (ver, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos No. 4,946,778). Además, se pueden adaptar métodos para la construcción de librerías de expresión de Fab (ver por ejemplo, Huse, y colaboradores, 1989 Science 246: 1275-1281) para permitir una identificación rápida y efectiva de fragmentos Fab monoclonales con la especificidad deseada para una proteína o derivados, fragmentos, análogos u homólogos de la misma. Los fragmentos de anticuerpo que contienen los idiotipos a un antígeno de proteína se pueden producir por técnicas conocidas en el arte incluyendo, pero no limitadas a: (i) un fragmento F(ab')2 producido mediante la digestión de pepsina de una molécula de anticuerpo; (ii) un fragmento Fab generado al reducir los puentes de disulfuro de un fragmento F{ah- ) 2; (iii) un fragmento Fab generado por el tratamiento de la molécula de anticuerpo con papaina y un agente de reducción y (iv) fragmentos de Fv.

La invención también incluye los fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')2 CD47, anticuerpos CD47, en una sola cadena, anticuerpos de un solo dominio ( por ejemplo, nanocuerpos o VHHs), anticuerpos CD47 biespecificos y anticuerpos CD47 heteroconjugados.

Los anticuerpos biespecificos son anticuerpos que tienen especificidades de enlace para por lo menos dos antigenos diferentes. En el caso presente, una de las especificidades de enlace es para CD47. El segundo objetivo de enlace es cualquier otro antigeno, y ventajosamente es una proteina de superficie celular o receptor o subunidad de receptor.

Métodos para hacer anticuerpos biespecificos son conocidos en la téenica. Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos biespecificos se basa en la co-expresión de dos pares de cadena pesada/cadena ligera de inmunoglobulina, donde las dos cadenas pesadas tienen diferentes especificidades (Milstein y Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). Debido a la clasificación aleatoria de las cadenas pesadas ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de diez moléculas de anticuerpo diferentes, de las cuales solamente una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta usualmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen en WO 93/08829, publicada el 13 de mayo de 1993, y en Traunecker y colaboradores, EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Los dominios variables de anticuerpo con las especificidades de enlace deseadas (sitios que combinan anticuerpo-antigeno) se pueden fusionar a la secuencias de dominio constante de inmunoglobulina. La fusión de preferencia es con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de la bisagra, región de CH2 y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de cadena ligera presente en por lo menos una de las fusiones. Los DNAs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si es deseado, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan en un organismo hospedero adecuado. Para detalles adicionales para generar anticuerpos biespecificos ver, por ejemplo, Suresh y colaboradores, Methods in Enzymology, 121:210 (1986).

De acuerdo con procedimiento descrito en WO 96/27011, la interfase entre un par de moléculas de anticuerpo se puede diseñar para maximizar el porcentaje de heterodimeros que son recuperados del cultivo de célula recombinante. La interfase preferida comprende por lo menos una parte de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales de aminoácidos pequeñas desde la interfase de la primera molécula de anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes ( por ejemplo, tirosina o triptófano). Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la cadena(s) de lado grande se crean en la interfase de la segunda molécula de anticuerpo mediante al reemplazar las cadenas laterales de aminoácidos grandes con unas más pequeñas ( por ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodimero sobre otros productos finales indeseados tales como homodimeros.

Los anticuerpos biespecificos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F(ab' ) ) · Las téenicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos se pueden preparar utilizando el enlace químico. Brennan y colaboradores, Science 229:81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos se segmentan proteoliticamente para generar fragmentos F(ab')2· Estos fragmentos se reducen en la presencia del agente de formación de complejo de ditiol, arsenito de sodio para estabilizar los ditioles vecinales y prevenir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados luego se convierten a tionitrobenzoato (TNB). Uno de los derivados de Fab'-TNB luego se reconvierte a Fab'-tiol mediante la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado de Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecifico. Los anticuerpos biespecificos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

Adicionalmente, los fragmentos Fab' se pueden recuperar directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecificos. Shalaby y colaboradores, J. Exp. Med. 175:217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo F(ab')2 biespecífica completamente humanizada. Cada fragmento Fab' se secretó por separado de E. coli y se sometió al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecif ico. El anticuerpo biespecífico de esta manera formado fue capaz de enlazar a células que sobreexpresan el receptor de ErbB2 y las células T humanas normales, así como actividad la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra los objetivos de tumores de mama humano.

Varias téenicas para hacer y aislar fragmentos de anticuerpo biespecificos directamente a partir del cultivo de células recombinantes también se han descrito. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos se han producido utilizando cremalleras de leucina. Kostelny y colaboradores, J. Immunol. 148 (5):1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se enlazaron a las porciones Fab' de dos diferentes anticuerpos mediante fusión génica. Los homodimeros de anticuerpo se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros y luego se re-oxidaron para formar los heterodimeros de anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de homodimeros de anticuerpo. La teenología de "diacuerpo" descrita por Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448(1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpos biespecificos. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios sobre la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento se forzan a emparejarse con los dominios de VL y VH complementarios de otro fragmento, para de esta manera formando dos sitios de enlace de antigeno. Otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpos biespecificos mediante el uso de los dimeros Fv(sFv) de una sola cadena también se ha reportado. Ver, Gruber y colaboradores, J. Immunol. 152 : 5368 ( 1994 ) .

Los anticuerpos con más de dos valencias son contemplados. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos. Tutt y colaboradores, J. Imunol. 147:60(1991).

Los anticuerpos biespecificos ejemplares pueden enlazar a dos diferentes epítopos, por lo menos uno de los cuales se origina en el antigeno de proteina de la invención. Alternativamente, un brazo anti-antigénico de una molécula de inmunoglobulina se puede combinar con un brazo que enlaza a una molécula de activación sobre un leucocito tal como una molécula de receptor de célula T ( por ejemplo CD2, CD3, CD28 o B7), o receptores de Fe para IgG (FcyR), tal como FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) para enfocar los mecanismos de defensa celular a la célula que expresa el antígeno particular. Los anticuerpos biespecificos también se pueden utilizar para dirigir agentes citotóxicos a células que expresan un antígeno particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de enlace de antigeno y un brazo que enlaza en agente citotóxico o un agente quelante de radionúclido, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA o TETA. Otro anticuerpo biespecífico de interés enlaza el antígeno de proteína descrito en la presente y además se enlaza el factor de tejido (TF).

Los anticuerpos heteroconjugados también están dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos heteroconjugados están compuestos de dos anticuerpos covalentemente unidos. Tales anticuerpos, por ejemplo, se han propuesto para dirigir las células del sistema inmune a la célula indeseadas ( ver la Patente de los Estados Unidos No. 4,676,980) y para el tratamiento de la infección de HIV (ver WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089). Se contempla que los anticuerpos se pueden preparar in vitro utilizando métodos conocidos en la química de proteínas sintéticas, incluyendo aquellos que involucran agentes de reticulación. Por ejemplo, las inmunotoxinas se pueden construir utilizando una reacción de intercambio de disulfuro o al formar un enlace de tioéter. Ejemplos de reactivos adecuados para este propósito incluyen iminotiolato y metil-4-mercaptobutirimidato de aquellos descritos, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos No. 4,676,980.

Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, para aumentar, por ejemplo, la efectividad del anticuerpo en tratar enfermedades y trastornos asociados con la señalización de CD47 aberrante. Por ejemplo, el residuo(s) de cisteína se puede introducir en la región Fe, para de esta manera permitir la formación de enlaces de disulfuro de intercadena en esta región. El anticuerpo homodimérico de esta manera generado puede tener capacidad de internalización mejorada y/o determinación de célula mediada por complemento incrementada y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). ( Ver Carón y colaboradores, J. Exp Med, 176: 1191-1195 (1992) y Shopes, J. Immunol., 148: 2918-2922 (1992)). Alternativamente, un anticuerpo se puede diseñar de modo que tiene regiones Fe dobles de esta manera puede haber aumentado la lisis de complemento y las capacidades de ADCC. (Ver Stevenson y colaboradores, Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989)).

La invención también pertenece a inmunoconjugados que comprenden un anticuerpo conjugado en un agente citotóxico tal como una toxina ( por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, planta o animal (o fragmentos de la misma) o un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).

Los toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de las mismas se pueden utilizar incluyen la cadena de difteria A, fragmentos activos no de enlace de toxina de difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudo onas aeruginosa), cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Fitolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de momordica carantia, curcina, crotina, inhibidor de saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, eno icina y los tricotecenos. Una variedad de radionúclidos están disponibles para la producción de anticuerpos radioconjugados. Ejemplos incluyen 212Bi, 131I, 131In, 90Y y 186Re.

Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico se hacen utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales tal como propionato de N-succinimidil-3- (2-piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como HCL de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo), aldehidos (tal como glutaraldehído), compuestos de bis-azido (tal como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados de bis-diazonio (tal como bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiamina), diisocianatos (tal como 2,6-diisocianato de tolueno) y compuestos de flúor bis-activos (tal como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina se puede preparar como es descrito en Vitetta y colaboradores, Science 238: 1098(1987). El ácido l-isotiocianatobencil-3-metildietilen triaminapentacético marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un agente quelante ejemplar para la conjugación del radionúclido al anticuerpo. ( Ver W094/11026).

Aquellos de habilidad ordinaria en la téenica reconocerán que una gran variedad de porciones posibles se puede acoplar a los anticuerpos resultantes de la invención. ( Ver, por ejemplo, "Conjúgate Vaccines", Contributions to Microbiology and Immunology, J. M. Cruse and R. E. Lewis, Jr(eds), Carger Press, New York, (1989), los contenidos completos de la cual se incorporan en la presente por referencia).

El acoplamiento se puede realizar mediante cualquier reacción química que enlazará las dos moléculas, mientras que el anticuerpo y la otra porción retienen sus actividades respectivas. Este enlace puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo enlace covalente, enlace de afinidad, intercalación, enlace coordinado y formación de complejo. El enlace preferido es, sin embargo, el enlace covalente. El enlace covalente se puede lograr ya sea mediante la condensación directa de las cadenas laterales existentes o mediante la incorporación de moléculas de puenteo externas. Muchos agentes de enlace bivalentes o polivalentes, son útiles en el acoplamiento de moléculas de proteínas, tales como los anticuerpos de la presente invención, a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos tales como tioésteres, carbodiimidas, ásteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehído, diazobenzenos y hexametilen diaminas. Este listado no se propone para ser exhaustivo de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la téenica sino, más bien, es ejemplar de los agentes de acoplamiento más comunes. (Ver Killen and Lindstrom, Jour. Im un. 133:1335-2549 (1984); Jansen y colaboradores, Iimnunological Reviews 62:185-216 (1982); and Vitetta y colaboradores, Science 238:1098 (1987).

Los enlazadores preferidos se describen en la literatura. { Ver, por ejemplo, Ramakrishnan, S. y colaboradores, Cáncer Res.44:201-208 (1984) que describe el uso de MBS (éster M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Ver también, la Patente de los Estados Unidos No.5,030,719, que describe el uso de un derivado de acetil hidrazida halogenado, acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador de oligopéptido. Los enlazadores particularmente preferidos incluyen: (i) EDC (clorhidrato de l-etil-3-(3-dimetilamino-propil)carbodiimida; (ii) SMPT (4-succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem Co., Cat (21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6[3-(2-piridilditio)propionamido]hexanoato (Pierce Chem Co., Cat #21651G); (iv) sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidil 6 [3—(2-piridilditio)-propianamida]hexanoato (Pierce Chem Co. Cat #2165-G), y (v) sulfo-NHS(N-hidroxisulfo-succinimida: Pierce Chem Co. #24510) conjugado a EDC.

Los enlazadores descritos en lo anterior contienen componentes que tienen diferentes atributos, para conducir de esta manera a conjugados con diferentes propiedades fisico químicas. Por ejemplo, los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos de alquilo son más estables que los ésteres sulfo-NHS de carboxilatos aarroommááttiiccooss.. Los enlazadores que contienen NHS-éster son menos solubles que los ásteres sulfo-NHS. Además, el énlazador SMPT contiene un enlace de disulfuro estéricamente impedido y puede formar conjugados con estabilidad incrementada. Los enlaces de disulfuro, son en general por lo menos estables que otros enlaces debido que el enlace de disulfuro se segmenta in vitro, dando por resultado menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede amentar la estabilidad de los acoplamientos de carbodiimida. Los acoplamientos de carbodiimida tal como (EDC) cuando se utilizan en conjunción con sulfo-NHS, forma ásteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodiimida sola.

Los anticuerpos descritos en la presente también se pueden formular como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la téenica, tal como un descrito en Epstein y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82: 3688(1985); Hwang y colaboradores, Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); y las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,485,045 y 4,544,545. Los liposomas con tiempo de circulación aumentados se describen en la Patente de los Estados Unidos No. 5,013,556.

Los liposomas particularmente útiles se pueden generar mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición de lípido que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas como es descrito en Martin y colaboradores, J. Biol. Chem, 257:286-288 (1982) por la vía de una reacción de intercambio de disulfuro.

Uso de anticuerpos contra CD47 Será apreciado que la administración de entidades terapéuticas de acuerdo con la invención, serán administradas con portadores, excipientes y otros agentes adecuados que se incorporan en formulaciones para proporcionar transferencia, suministro, tolerancia mejorada y los similares. Una multitud de formulaciones apropiadas se puede encontrar en el formulario conocido para todos los químicos farmacéuticos: Remington's Pharmaceutical Sciences (15th ed, Mack Publishing Company, Easton, PA (1975)), particularmente el capítulo 87 por Blaug, Scymour, en el mismo. Estas formulaciones incluyen, por ejemplo, polvos, pastas, ungüentos, jales, ceras, aceites, lípidos, vesículas que contienen lípido (catiónico o aniónico) (tal como Lipofectin™), conjugados de DNA, pastas de absorción anhidras, emulsiones de aceite en agua y agua-en-aceite, emulsiones carbowax (polietilenglicoles de varios pesos moleculares), geles semi-sólidos, y mezclas semi-sólidas que contienen carbowax. Cualquiera de las mezclas anteriores puede ser apropiada en tratamientos y terapias de acuerdo con la presente invención, con la condición de que el ingrediente activo en la formulación no sea inactivado por la formulación y la formulación sea fisiológicamente compatible y tolerable con la ruta de administración. Ver Baldrick P. "Pharmaceutical excipient development: the need for preclinical guidance". Regul. Toxicol Pharmacol. 32(2):210-8(2000), Wang W. "Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals". Int. J. Pharm.203 (1-2):1-60(2000), Charman WN "Lipids, lipophilic drugs, and oral drug delivery-some emerging concepts". J Pharm Sci.89(8)-.967-78 (2000), Powell y colaboradores , "Compendium of excipients for parenteral formulations" PDA J Pharm Sci Technol. 52:238-311 (1998) y las citas en las mismas para información adicional relacionada con formulaciones, excipientes y portadores bien conocidos para los químicos farmacéuticos.

En una modalidad, los anticuerpos de la invención, que incluyen un anticuerpo monoclonal de la invención, se pueden utilizar como agentes terapéuticos. Tales agentes generalmente serán empleados para diagnosticar, pronosticar, monitorear, tratar, aliviar y/o prevenir una enfermedad o patología asociada con la expresión, actividad y/o señalización de CD47 aberrante en un sujeto. Un régimen terapéutico se lleva a cabo al identificar a un sujeto, por ejemplo, un paciente humano que sufre de (o en riesgo de desarrollar) una enfermedad o trastorno asociado con la expresión y/o actividad o señalización de CD47 aberrante, por ejemplo, un cáncer u otro trastorno neoplásico, utilizando los métodos estándares. Una preparación de anticuerpo, de preferencia una que tiene alta especificidad y alta afinidad por su antigeno objetivo, se administra al sujeto y generalmente tendrá un efecto debido a su enlace con el objetivo. La administración del anticuerpo puede anular o inhibir o interferir con la expresión, actividad y/o función de señalización del objetivo (por ejemplo, CD47). La administración del anticuerpo puede anular o inhibir o interferir con el enlace del objetivo (por ejemplo, CD47) con un ligando endógeno (por ejemplo, SIRPa) al cual enlaza naturalmente. Por ejemplo, el anticuerpo enlaza al objetivo y modula, bloquea, inhibe, reduce, antagoniza, neutraliza o de otra manera interfiere con la expresión, actividad y/o señalización de CD47.

Las enfermedades o trastornos relacionados con la expresión, actividad y/o señalización de CD47 aberrante incluyen, a manera de ejemplo no limitante, cáncer hematológico y/o tumores sólidos. Los cánceres hematológicos incluyen, por ejemplo, leucemia, linfoma y mieloma. Ciertas formas de leucemia incluyen, a manera de ejemplo no limitante, leucemia linfocitica aguda (ALL); leucemia mieloide aguda (AML); leucemia linfocitica crónica (CLL); leucemia mielógena crónica (CML); trastorno/neoplasma Mieloproliferativo (MPDS); y síndrome de mielodisplasia. Ciertas formas de linfoma incluyen, a manera de ejemplo no limitante, linfoma de Hodgkin, linfoma no de Hodgkin tanto indolente como agresivo, linfoma de Burkitt y linfoma folicular (célula pequeña y célula grande). Ciertas formas de mieloma incluyen, a manera de ejemplo no limitante, mieloma múltiple (MM), mieloma de células gigantes, mieloma de cadena pesada y mieloma de cadena ligera o Bence-Jones. Los tumores sólidos incluyen, por ejemplo, tumores de mama, tumores ováricos, tumores de pulmón, tumores pancreáticos, tumores de próstata, tumores de melanoma, tumores colorrectales, tumores de pulmón, tumores de cabeza y cuello, tumores de vejiga, tumores esofágicos, tumores de hígado y tumores de riñón.

Los síntomas asociados con los cánceres y otros trastornos neoplásicos incluyen, por ejemplo, inflamación, fiebre, malestar general, fiebre, dolor, frecuentemente localizado al área inflamada, pérdida de apetito, pérdida de peso, edema, dolor de cabeza, fatiga, comezón, anemia, debilidad muscular, fatiga muscular y síntomas abdominales tales como, por ejemplo, dolor abdominal, diarrea o estreñimiento.

Una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo de la invención se relaciona generalmente a la cantidad necesaria para lograr un objetivo terapéutico. Como es mencionado en lo anterior, esta puede una interacción de enlace entre el anticuerpo y su antigeno objetivo que, en ciertos casos, interfiere con el funcionamiento del objetivo. La cantidad requerida para ser administrada además dependerá de la afinidad de enlace del anticuerpo para su antigeno especifico, y también dependerá de la proporción en la cual un anticuerpo administrado se agota del volumen libre de otro sujeto al cual se administra. Los intervalos comunes para la dosificación terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención pueden ser, a manera de ejemplo no limitante, de aproximadamente 0.1 mg/kg de peso corporal a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal. Las frecuencias de dosificación comunes pueden variar, por ejemplo, de dos veces al dia a una vez a la semana.

La capacidad de eficacia y el tratamiento se determina en asociación con cualquier método conocido para diagnosticar o tratar el trastorno relacionado con el estado inflamatorio particular. El alivio de uno o más síntomas del trastorno relacionado con el estado inflamatorio indica que el anticuerpo confiere un beneficio clínico.

Métodos para clasificación de anticuerpos que poseen la especificidad deseada incluyen, pero no están limitados a, ensayo inmunoabsorbente enlazado de enzimas (ELISA) y otras téenicas inmunológicamente mediadas conocidos dentro de la técnica.

En otra modalidad, los anticuerpos dirigidos contra CD47 se pueden utilizar en métodos conocidos en la técnica relacionados con la localización y/o cuantificación de CD47 (por ejemplo, para el uso en medir niveles de CD47 y/o tanto CD47 como SIRPa dentro de muestras fisiológicas apropiadas, para el uso en métodos de diagnóstico, para el uso en la formación de imágenes de la proteina y los similares). En una modalidad dada, los anticuerpos específicos al CD47, o derivado, fragmento, análogo y homólogo del mismo, que contienen el dominio de enlace de antigeno derivado de anticuerpo, se utilizan como compuestos farmacológicamente activos (referidos después en la presente como "agentes Terapéuticos").

En otra modalidad, un anticuerpo específico para CD47 se puede utilizar para aislar un polipéptido CD47, mediante técnicas estándares, tal como inmunoafinidad, cromatografía o inmunoprecipitación. Los anticuerpos dirigidos contra la proteína CD47 (o un fragmento de la misma) se pueden utilizar diagnósticamente para monitorear los niveles de proteína en el tejido como parte de procedimiento de prueba clínico, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección se puede facilitar al acoplarse ( es decir, enlazar físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Ejemplos de sustancias detectables incluyen varias enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Ejemplos de enzimas adecuadas incluyen la peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, b-galactosidasa o acetilcolinesterasa; ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 125I, 131I, 35S o 3H.

En todavía otra modalidad, un anticuerpo de acuerdo con la invención se puede utilizar como un agente para detectar la presencia de CD47 y/o tanto CD47 como la proteína SIRPa (o un fragmento de proteína del mismo) en una muestra. En algunas modalidades, el anticuerpo contiene una marca detectable. Los anticuerpos son policlonales, o más de preferencia, monoclonales. Un anticuerpo intacto, o un fragmento del mismo (por ejemplo, Fab, scFv o F(ab')2), es utilizado. El término "marcado", con respecto a la sonda o anticuerpo, se propone para abarcar la marcación directa de la sonda o anticuerpo mediante acoplamiento (es decir, enlace físicamente) de una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como la marcación indirecta de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que es directamente marcado. Ejemplos de la marcación indirecta incluyen la detección de un anticuerpo primario utilizando un anticuerpo secundario marcado fluorescentemente y la marcación de extremo de una sonda de DNA con biotina tal que se puede detectar con estreptavidina fluorescentemente marcada. El término "muestra biológica" se propone para incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un sujeto, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un sujeto. Incluido dentro de la utilización del término "muestra biológica", por lo tanto, está la sangre y una fracción o componente de la sangre incluyendo suero sanguíneo, plasma sanguínea, o linfa. Es decir, el método de detección de la invención se puede utilizar para detectar un mRNA de analito, una proteína o DNA genómico en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las téenicas in vitro para detección de un mRNA de analito incluyen las hibridaciones de Northern y las hibridaciones in si tu . Las técnicas in vi tro para la detección de una proteína de analito incluyen los ensayos inmunosorbentes enlazados en enzima (ELISAs), manchados de Western, inmunoprecipitaciones e inmunofluorescencia. Las téenicas in vitro para la detección de DNA genómico de analito incluyen las hibridaciones de Southern. Los procedimientos para conducir inmunoensayos se describen, por ejemplo, en "ELISA: Theory and Practice: Methods in Molecular Biology", Vol.42, J. R.

Cro ther (Ed.) Human Press, Totowa, NJ, 1995; "Immunoassay", E. Diamandis and T. Christopoulus, Academic Press, Iric., San Diego, CA, 1996; and "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", P. Tijssen, Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1985. Además, las técnicas in vivo para detección de una proteina de analito incluyen la introducción en un sujeto de un anticuerpo de proteína anti-analito marcado. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser marcado con un marcador radiactivo cuya presencia y ubicación en un sujeto se puede detectar mediante técnicas de formación de imágenes estándares.

Administración Terapéutica y Formulaciones de Anticuerpos CD47 Los anticuerpos de la invención (también referidos en la presente como "compuestos activos"), y derivados, fragmentos, análogos y homólogos de los mismos, se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas a la administración. Los principios y consideraciones involucrados en la preparación de tales composiciones, así como la guía en la elección de componentes se proporcionan, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences: The Science And Practice Of Pharmacy 19th ed. (Alfonso R. Gennaro, y colaboradores, editors) Mack Pub. Co., Easton, Pa.: 1995; Drug Absorption Enhancement: Concepts, Possibilities, Li itations, And Trends, Harwood Academic Publishers, Langhorne, Pa.; 1994; and Peptide And Protein Drug Delivery (Advances In Parenteral Sciences, Vol.4), 1991, M. Dekker, New York.

Tales composiciones típicamente comprenden el anticuerpo y un portador farmacéuticamente aceptable. Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpo, el fragmento inhibidor más pequeño que específicamente enlaza el dominio de enlace de la proteína objetivo es preferido. Por ejemplo, en base a las secuencias de región variables de un anticuerpo, moléculas de péptidos se pueden diseñar de modo que retienen la habilidad para enlazar la secuencia de proteína objetivo. Tales péptidos se pueden sintetizar químicamente y/o producir mediante la teenología de DNA recombinante. ( Ver, por ejemplo, Marasco y colaboradores, Proc Nati Acad Sci USA, 90:7889-7893 (1993)).

Como se utiliza en la presente, el término "portador farmacéuticamente aceptable" se propone para incluir cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retardo de absorción, y los similares, compatibles con la administración farmacéutica. Los portadores adecuados son descritos en la edición más reciente de Remington's Pharmaceutical Sciences, un texto de referencia estándar en el campo, que se incorpora en la presente por referencia. Ejemplos preferidos de tales portadores o diluyentes incluyen, pero no están limitados a, agua, solución salina, soluciones de Ringer, solución de dextrosa y albúmina de suero humano al 5%. Los liposomas y vehículos no acuosos tales como aceites fijos también pueden ser utilizados. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la téenica. Excepto hasta donde cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones.

Las formulaciones para ser utilizadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se realiza fácilmente mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su ruta de administración propuesta. Ejemplos de rutas de administración incluyen la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica ( es decir, tópica), transmucosal y rectal. Las soluciones o suspensiones utilizadas para la aplicación parenteral, intradérmica o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros solventes sintéticos; agentes antibacterianos tal como alcohol bencílico o metil parabenos; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tal como ácido etilendiaminotetraacético (EDTA); soluciones amortiguadoras tales como acetatos, citratos o fosfatos, y agentes para el ajuste de tonicidad tal como cloruro sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede envasar en ampolletas, jeringas desechables o frasquitos de múltiples dosis hechos de vidrio o de plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (donde es soluble en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los portadores adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremofor EL™ (BASF, Parsippany, NJ) o soluciones salina amortiguada de fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida al grado de que exista fácil capacidad de aplicación con jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe ser preservada contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol liquido, y los similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante varios agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y los similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede originar al incluir en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar al incorporar el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados en lo anterior, como sea requerido, seguido la esterilización filtrada. Generalmente, las dispersiones se preparan al incorporar el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y el requerido de otros ingredientes enumerados en lo anterior. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, métodos para preparación son el secado al vacío y el secado por congelación que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril del mismo.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un portador comestible. Ellos pueden ser encerrados en cápsulas de gelatina o comprimidos en tabletas. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y utilizar en la forma de tabletas, trociscos o cápsulas. Las composiciones orales también se pueden preparar utilizando un portador fluido para el uso como un lavado bucal, en donde el compuesto en el portados fluido se aplica oralmente y se vacía y se expectora o se traga. Los agentes de enlace farmacéuticamente compatibles y/o materiales adyuvantes se pueden incluirse como parte de la composición. Las tabletas, píldoras, cápsulas, trociscos y los similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa, un agente desintegrante tal como ácido alginico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio o Sterotes; un agente deslizamiento tal como dióxido de silicio coloidal; un agente de adulzamiento tal como sacarosa o sacarina; o un agente saborizante tal como menta, salicilato de metilo o sabor de naranja.

Para la administración mediante inhalación, los compuestos se suministran en forma de un rocío en aerosol a partir de un recipiente o dispensador presurizado que contiene un propelente adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono o un nebulizador.

La administración sistémica también puede ser por medios transmucosales o transdérmicos. Para la administración transmucosal o transdérmica, los penetrantes apropiados a la barrera que son permeados se utilizan en la formulación. Tales penetrantes son generalmente conocidos en la téenica, e incluyen, por ejemplo, la administración transmucosal, detergentes, sales biliares y derivados de ácido fusídico. La administración transmucosal se puede realizar a través del uso de rocíos nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los compuestos activos se formulan en ungüentos, lociones, geles o cremas como es generalmente conocido en la técnica.

Los compuestos también se pueden preparar en la forma de supositorios (por ejemplo, con bases de supositorio convencionales tales como mantequilla de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para el suministro rectal.

En una modalidad, los compuestos activos se preparan con portadores que protegerán al compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tales como formulaciones de liberación sostenida/controlada, incluyendo implantes y sistemas de suministro icroencapsulados. Se pueden utilizar polímeros biocompatibles, biodegradable tales como etileno acetato de vinilo, polianhidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de tales formulaciones serán evidentes para aquellos expertos en la téenica.

Por ejemplo, los ingredientes activos se pueden atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o cápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-particulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones.

Se puede preparar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, las matrices que están en la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli(alcohol vinilico)), polilactidas (Patente de los Estados Unidos. No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de gamma etilo, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradables tal como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas del copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Mientras que los polímeros tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas por arriba de 100 días, ciertos hidrogeles liberan las proteínas durante períodos de tiempo más cortos.

Los materiales también se pueden obtener comercialmente de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales a antígenos virales) se pueden utilizar como portadores farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos para aquellos expertos en la téenica, por ejemplo, como es descrito en la Patente de los Estados Unidos No.4,522,811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma unitaria de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se utiliza en la presente se refiere a unidades físicamente discretas como dosificaciones unitarias para el sujeto que es tratado; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico requerido. La especificación de las formas unitarias de dosificación de la invención son dictadas por y directamente dependientes de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que es logrado, y las limitaciones inherentes en la téenica de composición de tal compuesto activo para el tratamiento de individuos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, paquete o dispensador junto con instrucciones para la administración.

La formulación también puede contener más de un compuesto activo como es necesario para la indicación particular que es tratada, de preferencia aquella con actividades complementarias que no afectan adversamente entre sí. Alternativamente, o además, la composición puede comprender un agente que aumenta su función, tal como, por ejemplo, un agente citotóxico, citoquina, agente quimioterapéutico o agente inhibidor de crecimiento. Tales moléculas son adecuadamente presentes en cantidades de combinación que son eficaces para el propósito propuesto.

En una modalidad, los compuestos activos se administran en terapia de combinación, es decir, combinados con otros agentes, por ejemplo, agentes terapéuticos, que son útiles para tratar condiciones o trastornos patológicos, tales como varias formas de cáncer, trastornos autoinmunes y enfermedades inflamatorias. El término "en combinación" en este contexto significa que los agentes serán de manera sustancial contemporáneamente, ya sea de manera simultáneamente o secuencialmente. Si se dan secuencialmente, en el inicio de la administración del segundo compuesto, el primero de los dos compuestos de preferencia es todavía detectable en concentraciones efectivas en el sitio del tratamiento.

Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir uno o más anticuerpos de la invención co-formulados con y/o co-administrados con, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más inhibidores de citoquinas y de factor de crecimiento, inmunosupresores, agentes antiinflamatorios, inhibidores metabólicos, inhibidores de enzimas y/o agentes citotóxicos o citostáticos, como es descrito en más detalle enseguida. Tales terapias de combinación ventajosamente pueden utilizar dosificaciones menores de los agentes terapéuticos administrados, para de esta manera evitar las posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.

Los agentes terapéuticos preferidos utilizados en combinación con un anticuerpo de la invención son aquellos agentes que interfieren en diferentes etapas en una respuesta inflamatoria. En una modalidad, uno o más anticuerpos descritos en la presente se pueden co-formular con, y/o co-administrarse con, uno o más agentes adicionales tales como otros antagonistas de citoquina o de factor de crecimiento (por ejemplo, receptores solubles, inhibidores de péptido, moléculas pequeñas, fusiones de ligando); o anticuerpos o fragmentos que enlazan a antigeno de los mismos que se enlazan a otros objetivos (por ejemplo, anticuerpos que enlazan a otras citoquinas o factores de crecimiento, sus receptores u otras moléculas de superficie de las células); y citoquinas anti-inflamatorias o agonistas de las mismas.

En otra modalidad, los anticuerpos de la invención se utilizan como adyuvantes de vacunas contra trastornos autoinmunes, enfermedades inflamatorias, etc. La combinación de adyuvantes para el tratamiento de estos tipos de trastornos son adecuados para el uso en combinación con una amplia variedad de antígenos a partir de los auto-antígenos dirigidos, es decir, autoantígenos, involucrados en la autoinmunidad, por ejemplo, proteína básica de mielina; auto-antígenos inflamatorios, por ejemplo, proteina de péptido amiloide o antígenos de trasplante, por ejemplo, aloantígenos. El antigeno puede comprender péptidos o polipéptidos derivados de proteínas, así como fragmentos de cualquiera de los siguientes: sacáridos, proteínas, polinucleótidos u oligonucleótidos, autoantígenos, proteína péptido amiloide, antígenos de trasplante, alérgenos u otros componentes macromoleculares. En algunos casos, más de un antígeno se incluye en la composición antigénica.

Diseño y Generación de Otros Agentes Terapéuticos De acuerdo con la presente invención y basada en la actividad de los anticuerpos que se producen y se caracterizan en la presente con respecto a CD47, se facilita el diseño de otras modalidades terapéuticas más allá de las porciones de anticuerpo. Tales modalidades incluyen, sin limitación, agentes terapéuticos de anticuerpo avanzados, tales como anticuerpos biespecificos, inmunotoxinas y agentes terapéuticos radiomarcados, generación de agentes terapéuticos de péptido, terapias génicas, particularmente intracuerpos, agentes terapéuticos de antisentido y moléculas pequeñas.

Por ejemplo, en relación con anticuerpos biespecificos, los anticuerpos biespecificos se pueden generar de modo que comprenden (i) dos anticuerpos - uno con especificidad a CD47 y otro a una segunda molecula que son conjugados conjuntamente (ii) un solo anticuerpo que tiene una cadena específica CD47 y una segunda cadena específica a una segunda molécula, o (iii) un anticuerpo de una sola cadena que tiene especificidad a CD47 y una segunda molécula. Tales anticuerpos biespecífíeos se generan utilizando téenicas que son bien conocidas por ejemplo, en relación con (i) y (ii) Ver, por ejemplo, Fanger y colaboradores. Immunol Methods 4:72-81 (1994) y Wright y colaboradores. Crit, Reviews in Immunol.12125-168 (1992), y en relación con (iii) Ver, por ejemplo, Traunecker y colaboradores. Int. J. Cáncer (Suppl.) 7:51-52 (1992).

En relación con inmunotoxinas, los anticuerpos se pueden modificar para actuar como inmunotoxinas utilizando técnicas que son bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Vitetta Immunol Today 14:252 (1993). Ver también la Patente de los Estados Unidos No. 5,194,594. En relación con la preparación de anticuerpos radio arcados, tales anticuerpos modificados también se pueden preparar fácilmente utilizando técnicas que son bien conocidas en el arte. Ver, por ejemplo, Junghans y colaboradores, in Cáncer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2d edition, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)). Ver también las Patentes de los Estados Unidos Nos. 4,681,581, 4,735,210, 5,101,827, 5,102,990 (RE 35,500), 5,648,471 y 5,697,902. Cada una de las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas probablemente exterminarían células que expresan CD47.

En relación con la generación de péptidos terapéuticos, a través de la utilización de la información estructural relacionada con CD47 y anticuerpos a la misma, tal como los anticuerpos de la invención o la clasificación de librerías de péptidos, péptidos terapéuticos se pueden generar que son dirigidos contra CD47. El diseño y clasificación de agentes terapéuticos de péptidos se discuten relación con Houghten y colaboradores. Biotechniques 13:412-421 (1992), Houghten PNAS USA 82:5131-5135 (1985), Pinalla y colaboradores. Biotechniques 13:901-905 (1992), Blake and Litzi-Davis BioConjugate Chem. 3:510-513 (1992). Las inmunotoxinas y moléculas radiomarcadas también se pueden preparar, y en una manera similar, en relación con porciones peptídicas como es discutido en lo anterior en relación con los anticuerpos. Asumiendo que la molécula CD47 (o una forma, tal como una variante de empalme o forma alterna) es funcionalmente activa en -un proceso de enfermedad, también será posible diseñar agentes terapéuticos génicos y de antisentido a los mismos a través de téenicas convencionales. Tales modalidades se pueden utilizar para modular la función de CD47. En relación con lo mismo los anticuerpos de la presente invención facilitan el diseño y el uso de ensayos funcionales relacionados con los mismos. Un diseño y estrategia para agente terapéutico de antisentido se discute en detalle en la Solicitud de Patente Internacional No. WO 94/29444. El diseño y estrategias para la terapia génica son bien conocidos. Sin embargo, en particular, el uso de téenicas terapéuticas génicas que involucran intracuerpos se podrían probar que son particularmente ventajosas. Ver, por ejemplo, Chen y colaboradores. Human Gene Therapy 5:595-601 (1994) and Marasco Gene Therapy 4:11-15 (1997). El diseño general y las consideraciones relacionadas a los agentes terapéuticos génicos también se discute en la Solicitud de Patente Internacional No. WO 97/38137.

El conocimientos obtenidos de la estructura de la molécula CD47 y sus interacciones con otras moléculas de acuerdo con la presente invención, tal como SIRPa y/o los anticuerpos de la invención, y otros se puede utilizar para el diseño razonado con las modalidades terapéuticas adicionales. A este respecto, las técnicas de diseño de fármacos razonado, tal como cristalografía de rayos X, modelación molecular ayudada (o asistida) por computadora (CAMM), la relación de estructura-actividad cuantitativa o cualitativa (QSAR), y tecnologías similares se pueden utilizar para enfocar los esfuerzos de descubrimiento de fármaco. El diseño razonado permite la predicción de estructuras de proteína o sintética que pueden interactuar con la molécula o formas específicas de la misma que se pueden utilizar para modificar o modular la actividad de IL-6RC. Tales estructuras se pueden sintetizarse químicamente o expresar en sistemas biológicos. Este procedimiento se ha revisado en Capscy y colaboradores. Genetically Engineered Human Therapeutic Drugs (Stockton Press, NY (1988)). Además, las librerías combinatorias se pueden diseñar y sintetizar y utilizar en programas de clasificación, tales como esfuerzos de clasificación de alto rendimiento.

Metodos de Clasificación La invención proporciona métodos (también referidos en la presente como "ensayos de clasificación") para identificar moduladores, es decir, compuestos o agentes candidatos o de prueba (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u otros fármacos) que modulan o de otra manera interfieren con el enlace de CD47 a SIRPa, o compuestos o agentes candidatos o de prueba que modulan o de otra manera interfieren con la función de señalización de CD47 y/o CD47-SIRPa. También se proporcionan métodos para identificar compuestos útiles para tratar trastornos asociados con la expresión, actividad y/o señalización aberrante de CD47 y/o CD47-SIRPa. Los métodos de clasificación pueden incluir aquellos conocidos utilizados en la téenica o aquellos descritos en la presente. Por ejemplo, CD47 se puede inmovilizar sobre una placa de microtítulo e incubar con un compuesto candidato de prueba, por ejemplo, un anticuerpo CD47, en la presencia de SIRPa. Subsecuentemente, la SIRPa enlazada se puede detectar utilizando un anticuerpo secundario, y la absorbencia se puede detectar en un lector de placa.

También se proporcionan métodos para identificar compuestos capaces de promover la fagocitosis de células de tumor mediante macrófagos. Estos métodos pueden incluir aquellos conocidos o utilizados en la téenica o aquellos descritos en la presente. Por ejemplo, los macrófagos se incuban con células de tumor marcadas en la presencia de un compuesto candidato, por ejemplo, un anticuerpo CD47. Después de un periodo de tiempo, los macrófagos se pueden observar para la internalización de la marca de tumor para identificar la fagocitosis. Detalles adicionales se consideran estos métodos, por ejemplo, ensayos de bloqueo de SIRPa y ensayos de fagocitosis, se proporcionan en los ejemplos.

La invención también incluye compuestos identificados en los ensayos de clasificación descritos en la presente.

En una modalidad, la invención proporciona ensayos para clasificar compuestos candidatos o de prueba que modulan la función de señalización de CD47. Los compuestos de prueba de la invención se pueden obtener utilizando cualquiera de los numerosos procedimientos en métodos de librería combinatoria conocidos en la técnica, incluyendo: librerías biológicas; librerías de fase sólida o fase de solución paralelas espacialmente dirigibles; métodos de librería sintética que requieren desconvolución; el método de librería de "una-cuenta un-compuesto" y métodos de librería sintética utilizando la selección de cromatografía de afinidad. El procedimiento de librería biológica se limita a librerías de péptido, mientras que los otros cuatro procedimientos son aplicables al oligómero de péptido, no de péptido o librerías de molécula pequeña de compuestos. { Ver, por ejemplo, Lam, 1997, Anticancer Drug Design 12:145).

Una "molécula pequeña", como se utiliza en la presente, se propone para referirse a una composición que tiene un peso molecular de menor que.aproximadamente 5 D y mucho más de preferencia menor que aproximadamente 4 kD. Las moléculas pequeñas pueden ser, por ejemplo, ácidos nucleicos, péptidos, polipéptidos, peptidomiméticos, carbohidratos, lípidos u otras moléculas orgánicas o inorgánicas. Las librerías de mezclas químicas y/o biológicas, tales como extractos fúngicos, bacterianos o de algas, son conocidas en la téenica y se pueden clasificar con cualquiera de los ensayos de la invención.

Ejemplos de métodos para la síntesis de librerías moleculares se pueden encontrar en la técnica, por ejemplo en: in: DeWitt, y colaboradores, 1993. Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909; Erb, y colaboradores, 1994. Proc. Nati. Acad.

Sci. U.S.A. 91:11422; Zuckermann, y colaboradores, 1994. J. Med. Chem. 37:2678; Cho, y colaboradores, 1993. Science 261:1303; Carrell, y colaboradores, 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2059; Carell, y colaboradores, 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061; and Gallop, y colaboradores, 1994. J. Med. Chem.37:1233.

Las librerías de compuestos se pueden presentar en solución (ver, por ejemplo, Houghten, 1992, Biotechnigues 13:412-421), o sobre cuentas (ver Lam, 1991, Nature 354:82-84), en chips (véase Fodor, 1993, Nature 364: 555-556), bacteria (ver la Patente de los Estados Unidos No. 5.223.409), esporas (ver la Patente de los Estados Unidos 5.233.409), plásmidos (ver Culi, y colaboradores, 1992, Proc Nati Acad Sci USA 89:1865-1869) o sobre fago (ver Scott y S ith, 1990, Science 249:386-390; Devlin, 1990, Science 249:404-406; Cwirla, y colaboradores, 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 87:6378-6382; Felici, 1991, J. Mol. Biol. 222:301-310; y la Patente de los Estados Unidos No. 5,233,409.).

En una modalidad, un compuesto candidato se introduce a un complejo de anticuerpo-antígeno y se determina si el compuesto candidato interrumpe el complejo de anticuerpo-antígeno, en donde una interrupción de este complejo indica que el compuesto candidato modula la función de señalización de CD47 y/o interacción entre CD47 y SIRPa.

En otra modalidad, un CD47 soluble y/o una proteina tanto de CD47 y SIRPa de la invención se proporciona y se expone a por lo menos un anticuerpo monoclonal neutralizante. La formación de un complejo de anticuerpo-antigeno se detecta, y uno o más compuestos candidatos se introducen al complejo. Si el complejo de anticuerpo-antigeno se interrumpe después de la introducción del uno o más compuestos candidatos, los compuestos candidato son útiles para tratar trastornos asociados con la señalización de CD47 y/o CD47-SIRPcc aberrante.

La determinación de la habilidad del compuesto de prueba para interferir con o interrumpir el complejo de anticuerpo-antigeno se puede realizar, por ejemplo, al acoplar el compuesto de prueba con un radioisótopo o marca enzimática tal que el enlace del compuesto de prueba al antigeno o porción biológicamente activa del mismo se puede determinar al detectar el compuesto marcado en un complejo. Por ejemplo, los compuestos de prueba se pueden marcar con 125I, 35S, 14C o 3H, ya sea directa o indirectamente, y el radioisótopo detectado por el conteo directo de radioemisión o por el conteo de centelleo. Alternativamente, los compuestos de prueba pueden ser marcados enzimáticamente con, por ejemplo, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina o luciferasa, y la marca detectada mediante la determinación de la conversión de un sustrato apropiado al producto.

En una modalidad, el ensayo comprende poner en contacto un complejo de anticuerpo-antígeno con un compuesto de prueba, y determinar la habilidad del compuesto de prueba para interactuar con el antígeno o de otra manera interrumpir el complejo de anticuerpo-antigeno existente. En esta modalidad, la determinación de la habilidad del compuesto de prueba para interaccionar con el antígeno y/o interrumpir el complejo de anticuerpo-antígeno comprende determinar la habilidad del compuesto de prueba para enlazar preferencialmente al antígeno o una porción biológicamente activa del mismo, como es comparado con el anticuerpo.

En otra modalidad, el ensayo comprende poner en contacto un complejo de anticuerpo-antígeno con un compuesto de prueba y determinar la habilidad del compuesto de prueba para modular el complejo de anticuerpo-antígeno. La determinación de la habilidad del compuesto de prueba para modular el complejo de anticuerpo-antígeno se puede realizar, por ejemplo, determinar la habilidad del antígeno para enlazar o interactuar con el anticuerpo, en la presencia del compuesto de prueba.

Aquellos expertos en la téenica reconocerán que, en cualquiera de los métodos de clasificación descritos en la presente, el anticuerpo puede ser un anticuerpo neutralizante, que modula o de otra manera interfiere con la actividad y/o señalización de CD47.

Los métodos de clasificación descritos en la presente se pueden realizar como un ensayo a base de células o como un ensayo libre de células. Los ensayos libres de células de la invención están disponibles para el uso de ya sea la forma soluble o la forma enlazada a la membrana de CD47 y fragmentos del mismo. En el caso de ensayos libres de células que comprenden la forma enlazada unida a la membrana de CD47, puede ser deseable utilizar un agente solubilizante tal que la forma enlazada a la membrana de las proteínas se mantienen en solución. Ejemplos de tales agentes solubilizantes incluyen detergentes no iónicos tales como n-octil-glucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octanoil-N-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Tritón® X-100, Tritón® X-114, Thesit®, Isotridecipoli(éter de etilenglicol)n, sulfonato de N-dodecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propano, sulfonato de 3-(3-colamidopropil)dimetilamminiol-1-propano (CHAPS), o sulfonato de 3— (3— colamidopropil)dimetilamminiol-2-hidroxi-1-propano (CHAPSO).

En más de una modalidad, puede ser deseable inmovilizar ya sea el anticuerpo o el antígeno para facilitar la separación de las formas en complejo de las no formadas en complejo de uno o ambos después de la introducción del compuesto candidato, así como ajustar la automatización del ensayo. La observación del complejo anticuerpo-antígeno en la presencia y ausencia de un compuesto candidato se puede realizar en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Ejemplos de tales recipientes incluyen placas de microtitulo, tubos de prueba y tubos de micro-centrífuga. En una modalidad, una proteína de fusión que adiciona un dominio que permite que una o ambas de las proteínas, sea enlazada a una matriz, puede ser proporcionada. Por ejemplo, las proteínas de fusión de GST-anticuerpo o las proteínas de fusión de GST-antígeno se puede adsorber sobre cuentas de glutationa sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulo derivadas de glutationa, que luego se combinan con el compuesto de prueba, y la mezcla se incuba bajo condiciones conducentes a la formación de complejo ( por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH). Después de la incubación, las cuentas o cavidades de la placa de microtitulo se lavan para remover cualquier de los componentes no enlazados, la matriz inmovilizada en el caso de cuentas, el complejo determinado ya sea directamente o indirectamente. Alternativamente, los complejos se pueden disociar de la matriz, y el nivel de formación de complejo de anticuerpo-antígeno se puede determinar utilizando téenicas estándar.

Otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices también se pueden utilizar en los ensayos de clasificación de la invención. Por ejemplo, ya sea el anticuerpo (por ejemplo, el anticuerpo 2A1, o un anticuerpo que tiene una cadena pesada variable seleccionada de SEQ ID NOs: 5-30 y una cadena ligera variable seleccionada de SEQ ID NOs: 31-47) o el antigeno (por ejemplo, proteina CD47) se puede inmovilizar utilizando la conjugación de biotina y estreptavidina. El anticuerpo o biotinilado o moléculas de antigenos se pueden preparar a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) utilizando téenicas bien conocidas dentro del arte (por ejemplo, equipo de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, 111) y la inmovilización en las cavidades de placas de 96 cavidades recubiertas con estreptavidina (Pierce Chemical). Alternativamente, otros anticuerpos reactivos con el anticuerpo o antigeno de interés, pero que no interfieren con la formación del complejo de anticuerpo-antigeno de interés, se pueden derivar a las cavidades de la placa, y el anticuerpo no enlazado o antigeno atrapado en las cavidades mediante la conjugación del anticuerpo. Métodos para detectar tales complejos, además de aquellos descritos en lo anterior para los complejos inmovilizados en GST, incluyen en la inmunodetección de complejos utilizando otros anticuerpos reactivos con el anticuerpo o antigeno.

La invención además pertenece a agentes novedosos identificados por cualquiera de los ensayos de clasificación mencionados en lo anterior y uso de los mismos para los tratamientos como es descrito en la presente.

Formulaciones de Diagnóstico y Profilácticas Los MAbs de CD47 de la invención se utilizan en formulaciones de diagnóstico y profilácticas. En una modalidad, un MAb CD47 de la invención se administra a pacientes que están en riesgo de desarrollar una o más de las enfermedades mencionadas en lo anterior, tal como por ejemplo, sin limitación, cáncer u otra condición neoplásica. Una predisposición del paciente o del órgano a uno o más de los cánceres mencionados en lo anterior u otras condiciones neoplásicas se pueden determinar utilizando marcadores genotipicos, serológicos o bioquímicos.

En otra modalidad de la invención, el anticuerpo CD47 se administra a individuos humanos diagnosticados con una indicación clínica asociada con una o más de las enfermedades mencionadas en lo anterior, tal como por ejemplo, sin limitación, cáncer u otra condición neoplásica. En la diagnosis, el anticuerpo CD47 se administra para mitigar o revertir los efectos de la indicación clínica asociados con una o más de las enfermedades mencionadas en lo anterior.

Los anticuerpos de la invención también son útiles en la detección de CD47 y/o SIRPa en muestras de paciente y por consiguiente son útiles como herramientas de diagnóstico. Por ejemplo, los anticuerpos CD47 de la invención se utilizan en ensayos in vitro, por ejemplo, ELISA, para detectar los niveles de CD47 y/o SIRPa en una muestra del paciente.

En una modalidad, un anticuerpo CD47 de la invención se inmoviliza sobre un soporte sólido (por ejemplo, la cavidad(s) de una placa de microtitulo). El anticuerpo inmovilizado sirve como un anticuerpo de captura para cualquier CD47 y/o SIRPa que puede estar presente en una muestra de prueba. Antes del contacto con el anticuerpo inmovilizado con una muestra del paciente, el soporte sólido se enjuaga y se trata con un agente bloqueante tal como proteina de leche o albúmina para prevenir la adsorción no específica del analito.

Subsecuentemente, las cavidades se tratan con una muestra de prueba que se sospecha de contener el antígeno, o con una solución que contiene una cantidad estándar del antígeno. Tal muestra es, por ejemplo, una muestra de suero de un sujeto que se sospecha de tener niveles de antígeno circulante considerados que son de diagnóstico de una patología. Después del enjuague de la muestra de prueba o estándar, el soporte sólido se trata con un segundo anticuerpo que es marcado detectablemente. El segundo anticuerpo marcado sirve como un anticuerpo de detección. El nivel de la marca detectadle se mide, y la concentración de CD47 y/o SIRPa en la muestra de prueba se determina mediante la comparación con una curva estándar desarrollada a partir de las muestras estándares.

Será apreciado que en base a los resultados obtenidos utilizando los anticuerpos CD47 de la invención en un ensayo de diagnóstico in vitro, es posible detectar una enfermedad (por ejemplo, una indicación clínica asociada con isquemia, un trastorno inmune inflamatorio) en un sujeto en base a los niveles de expresión de CD47 y/o SIRPa. Para una enfermedad dada, se toman muestras de sangre de los sujetos diagnosticados como que están en varias etapas en la progresión de la enfermedad, y/o en varios puntos del tratamiento terapéutico de la enfermedad. Utilizando una población de muestras que proporciona resultados estadísticamente significativos para cada estado de progresión o terapia, se designa un intervalo de concentraciones del antígeno que se puede considerar característico de cada etapa.

Todas las publicaciones y documentos de patente citados en la presente se incorporan aquí por referencia como si tal publicación o documento fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada en la presente por referencia. La cita de publicaciones y documentos de patentes no se propone como una admisión de que es cualquier téenica previa pertinente, ni constituye cualquier admisión en cuanto a los contenidos o fecha de las mismas. La invención habiéndose ahora descrito a manera de descripción descrita, aquellos de habilidad en la técnica reconocerán que la invención se puede llevar a la práctica en una variedad de modalidades y que la descripción anterior y los ejemplos siguientes son para propósitos de ilustración y no de limitación de las reivindicaciones que siguen.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos, incluyendo los experimentos conducidos y los resultados logrados se proporcionan para propósitos ilustrativos únicamente y no se van a considerar como limitantes de la presente invención. EJEMPLO 1: Generación y Selección de Anticuerpos CD47 Los anticuerpos CD47 se generaron al inmunizar ratones con una proteina recombinante que representa CD47-IgV (tipo variable similar a inmunoglobulina), al implementar una estrategia de inmunización rápida modificada en sitios múltiples (Kilpatric y colaboradores, (1997) Rapid development of affinity matured monoclonal antibodies using RIMMS. Hybridoma 16,381-389). Además, la mitad de los ratones en el grupo inmunizado recibieron una sola inyección del anticuerpo agonista de GITR anti-ratón, DTA-1. Después del programa de inmunización, los ganglios linfáticos de todos los ratones (tratados con DTA-1 y no tratados) se recolectaron y se disociaron, para de esta manera permitir el aislamiento de células B y la fusión subsecuente a una linea de células de mieloma de ratón. Los sobrenadantes de hibridoma se clasificaron para el enlace a CD47 mediante ELISA y mediante la citometría de flujo sobre células Daudi (ATCC# CCL-213) (Figura 1A). Los sobrenadantes de hibridoma también se analizaron para la habilidad para bloquear la interacción de CD47-SIRPa (Figura IB). El CD47 recombinante se inmovilizó sobre una placa de microtítulo MediSorp (NUNC) y subsecuentemente se incubó con los sobrenadantes de hibridoma en la presencia de SIRPa-ECD humano recombinante fusionado a un dominio Fe de IgG humana. El SIRPa enlazado se detectó utilizando un anticuerpo secundario especifico de Fe IgG anti-humano conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch) y la absorbancia en 650 nm se detectó en el lector de placa. EJEMPLO 2: Caracterización de los Anticuerpos CD47 Anticuerpos CD47 de murino ejemplares de la presente invención se muestran en la Figura 2. La clasificación de afinidad de los anticuerpos CD47 que bloquean SIRPa se condujo mediante la citometría de flujo sobre células Raji (ATCC# CCL-86) (Figura 2A) y CCRF-CEM (ATCC# CCL-119) (Figura 2B). Los anticuerpos CD47 enlazado se detectaron utilizando un anticuerpo secundario de IgG anti-ratón conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch). El anticuerpo CD47 conocido en la téenica, B6H12, se incluyó como un control positivo (Ver, por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos 5,057,604). En la Figura 2B, tanto el B6H12 como el 2D3, un anticuerpo no bloqueante de SIRP.a comercialmente disponible, se compararon con los anticuerpos generados aquí. Los anticuerpos de la presente invención exhiben afinidad más alta hacia la forma endógena (superficie de célula) de CD47 comparado con los anticuerpos B6H12 y 2D3. EJEMPLO 3: Actividad Bloqueante de SIRPot de los Anticuerpos CD47 La potencia del bloqueo de SIRPa mediante los anticuerpos CD47 se midió mediante una ELISA en donde CD47-IgV etiquetado con His recombinante se inmovilizó sobre una placa de microtitulo MediSorp. El enlace de SIRPa recombinante fusionado a un dominio Fe de IgG humano se monitorio en la presencia de cantidades incrementadas de los anticuerpos CD47. La SIRPa enlazada se determinó utilizando un anticuerpo secundario (especifico de Fe) IgG anti-humano conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch). Los anticuerpos de la presente invención exhiben potencia aumentada del bloqueo de SIRPa comparado con el anticuerpo B6H12. La Figura 3A muestra datos representativos del ensayo de bloqueo de SIRPa en base a ELISA.

Los anticuerpos CD47 se analizaron mediante la citometria de flujo para su habilidad para bloquear el enlace SIRP recombinante a CD47 de la superficie de célula. La células CCRF-CEM (ATCC#CCL-119) se utilizaron como la fuente de CD47 en el ensayo y el enlace de SIRPa recombinante fusionada a un dominio Fe de IgG humana se monitorio en la presencia de cantidades incrementadas del anticuerpo CD47. El SIRPa enlazados se determinó utilizando un anticuerpo secundario (especifico de Fe) IgG anti-humano conjugado con APC (Jackson ImmunoResearch) (Figura 3B). B6H12 y el anticuerpo 2D3 de CD47 no bloqueante de SIRPa comercialmente disponible se utilizaron como controles positivos y negativos respectivamente.

EJEMPLO 4: Interacciones Homotípicas Mediadas por el Anticuerpo CD47 Los anticuerpos CD47 bloqueantes de SIRPa se analizaron por su habilidad para inducir el amontonamiento celular, como es conocido como interacciones homotípicas, entre las células positivas CD47. Células Daudi y Raji se utilizaron como líneas de células que expresan CD47 candidatas. Entre los anticuerpos examinados, el anticuerpo 2A1 de la presente invención fue el único anticuerpo bloqueante de SIRPa que no promovió las interacciones homotípicas de células que expresan CD47.

EJEMPLO 5: Actividad de hemoaglutinación de los Anticuerpos CD47 Un ejemplo de una interacción homotípica es la hemaglutinación, como es puesto en claro con la agregación de RBC. Los anticuerpos CD47 se clasificaron para la aglutinación de RBC, como es observado por la habilidad de un anticuerpo para prevenir el asentamiento de RBCs humanos. Inesperadamente, el anticuerpo 2A1 se encontró que es único entre otros anticuerpos CD47 por su incapacidad para promover la hemaglutinación, mientras que tiene alta afinidad y la habilidad para bloquear SIRPa. Otros anticuerpos que exhibieron hemaglutinación reducida no bloquearon el enlace de SIRPa a CD47.

Para evaluar la capacidad de hemoaglutinación de los anticuerpos CD47, RBCs humanos se diluyeron a 10% en PBS y se incubaron a 37°C durante 2-6 horas con una titulación de anticuerpos CD47 en una placa de 96 cavidades de fondo redondo. La evidencia de hemaglutinación se demuestra por la presencia de RBCs no asentados, que aparecen como una nebulosidad comparando con un punto rojo puntualizado de RBCs no hemaglutinado. Inesperadamente, como se muestra en la Figura 4A, los anticuerpos CD47 de la invención, particularmente el anticuerpo referido en la presente como 2A1, no exhibió actividad de hemoaglutinación. La gráfica muestra la cuantificación del ensayo de hemaglutinación, denotado "índice de hemaglutinación" determinado al cuantificar el área de pelotilla de RBC en la presencia del anticuerpo, normalizada con aquella en la ausencia del anticuerpo.

El anticuerpo 9E4 de murino causó la hemaglutinación más profunda en todas las concentraciones probadas. De esta manera, el anticuerpo 9E4 enlaza CD47 y bloquea la interacción de CD47 con SIRPa; sin embargo, el anticuerpo 9E4 causa hemaglutinación profunda.

La región de cadena VH del anticuerpo 9E4 se proporciona enseguida.

EVQLRQSGPELVKPGASVKISCKASGYSFTDYYMYWVKQSRVRSLAWIGRINPYTGATGYD QNFKDKASLIVDKSSSTAYMELRSLTSEDSAVYYCARGRNRYDGWFAYWGQGLTLVTV (SEQ ID NO: 78) La región de cadena VL del anticuerpo 9E4 se proporciona enseguida.

EIQMTQTTSSLSASLGDRVTISGRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSR FSGSGSGTDYSLTISNLDQEDIATYFCQQGNALPPTFGGGTNLEIK (SEQ ID NO: 79) El anticuerpo de control B6H12 causó hemaglutinación como es esperado para los anticuerpos CD47 que bloquean SIRPa.

Con el fin de investigar la unicidad de la actividad de no hemoaglutinación del anticuerpo 2A1, otros numerosos anticuerpos CD47 se clasificaron en el ensayo de hemaglutinación de RBC (Figura 4B). Incluido en este ensayo fue la versión quimérica del anticuerpo 2A1 (2Al-xi), que consiste de la región de cadena pesada variable de murino de 2A1, la región de cadena ligera variable de murino de 2A1 modificado en el aminoácido 106 (es decir, M106I) y las regiones constantes de IgGl humana e Igkappa humana. Las secuencias de región VH y VL del anticuerpo 2A1 y el anticuerpo 2Al-xi se proporcionan en la Tabla 1 Los anticuerpos se probaron en 12.5, 25, 50 y lOOnM.

Inesperadamente, 2A1 es raro entre los anticuerpos CD47 examinados en la Figura 4B, en que fue el único anticuerpo en la Figura 4B con actividades de hemaglutinación ausentes o reducidos. La Figura 4E muestra que 2A1, 2A1 quimérico (2Al-xi) y las variantes humanizadas no causan hemoaglutinación.

La Figura 4C muestra los resultados de la clasificación de anticuerpos CD47 adicionales en el ensayo de hemaglutinación de RBC. Como se muestra en la Figura 4C, el anticuerpo monoclonal 2D3 de CD47 comercialmente disponible, que no bloquea SIRPa, no causó hemaglutinación. Sin embargo, otros anticuerpos CD47 comercialmente disponibles ( por ejemplo, CC2C6, BRC126 y B6H12) que bloquean SIRPa causaron hemaglutinación (Figura 4C). De esta manera, previo a la invención descrita en la presente, los anticuerpos existentes que bloquearon SIRPa causaron hemaglutinación, mientras que los anticuerpos existentes, tal como 2D3, que no bloquearon SIRPa no causaron hemaglutinación. Tomados conjuntamente, los anticuerpos de la invención (por ejemplo, el anticuerpo 2A1 y sus derivados humanizados) son únicos entre los anticuerpos CD47 existentes en su habilidad para bloquear SIRPa, pero no causan hemoaglutinación.

Un intervalo de alta concentración de anticuerpos CD47 selectos se volvió a probar en el ensayo de hemaglutinación (Figura 4D). Este ensayo reveló un efecto de pro-zona de hemoaglutinación mediante B6H12 y 9E4, en donde la hemaglutinación se redujo en los extremos alto y bajo del intervalo de concentración probado. La representación gráfica del indice de hemaglutinación también resalta el efecto de pro-zona. El efecto de pro-zona también fue evidente en las Figuras 4C y 4E. De manera importante, los anticuerpos 2A1 de ratón y CD47 2A1 quiméricos estuvieron libres de actividad hemaglutinación en todas las concentraciones.

Como se muestra en la Figura 4E, el anticuerpo 1B4 de murino exhibió un intervalo reducido de hemaglutinación.

La región de cadena VH del anticuerpo 1B4 se proporciona enseguida.

QIQLQQSGPELVKPGASVKISCKASGYTFTDYY1HWVQRPGQGLEWIGWIYPGSGNTKYNE RFKGKATLTVATSSSTAYMQLSSLTSEDTAVYFCARREEDYFDYWGQGTLVTV (SEQ ID NO: 80) La región de cadena VL del anticuerpo 1B4 se proporciona enseguida.

DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTMSCKSSQSLLYSSNCfKNYLTWYQQKPGQSPKLLIY ASTRE SGVPDRFTGSGSGTDFTLTISSVKAEDLAVYYCQQYYSYPLTFGAGTKLEIK (SEQ ID NO: 81) La capacidad de hemaglutinación de los anticuerpos humanizados derivados del 2A1 de murino se probó como en lo anterior. De manera importante, el anticuerpo humanizado representativo AB6.12 en numerosos isotipos de IgG humana (IgGl, IgG4-S228P, e IgG4-S228P/L235E) no causó alguna hemaglutinación de RBC. 2A1 y 2Al-xi se utilizaron como controles para anticuerpos de no hemaglutinación, mientras que B6H12 y 9E4 se incluyeron como controles positivos para hemaglutinación (Figura 4F).

EJEMPLO 6: Enlace a CD47 de Mono Cynomolqus La habilidad de 2A1 de murino para enlazar a CD47 de mono cynomolgus es (cyno) se estimó. El anticuerpo B6H12 se ha reportado previamente que es reactivo cruzadamente con CD47 de cyno y se utilizó como un control positivo para la presencia de CD47 de cyno en el ensayo. El experimento para medir el enlace de 2A1 a CD47 de mono cynomolgus se diseñó para comparar el enlace de 2A1 a CD47 en células B de mono cynomolgus y células humanas, en donde la linea de células Raji se utilizó como una célula positiva de CD47 humana. Las células mononucleares de sangre periférica de cynomolgus (PBMCs) se aislaron de la sangre entera de cynomolgus mediante la centrifugación de gradiente de ficoll-paque. Las células B de cynomolgus y humanas (Raji) se marcaron con el anticuerpo CD20 humano ofatumumab (Arzerra) en 10 qg/ml, y se hicieron reaccionar con una serie de dilución del anticuerpo CD47 de murino 2A1 o B6H12. Las células B marcadas con anticuerpos CD20 de humano se detectaron con el anticuerpo anti-humano policlonal conjugado a DyLite 649, mientras que los anticuerpos de murino CD47 se detectaron con el anticuerpo anti-ratón policlonal conjugado a DyLite 488. Las células se analizadas mediante citometría de flujo, primero confinadas en células vivas mediante FSC y SSC, luego sobre células positivas para FL4 (CD20 positivo) y por último se midió la FL1 de media (CD47 positivo). Los datos se normalizaron al dividir la señal en cada concentración entre la señal máxima para cada anticuerpo sobre cada población de células. Los resultados normalizados mostrados en la Figura 5 revelan que 2A1 reaccionan cruzadamente con CD47 de cyno y tiene afinidad idéntica como es comparado con CD47 humana. Consistente con los resultados presentados en lo anterior, B6H12 tuvo afinidad más baja para CD47 de superficie de célula sobre las células B tanto de Raji como de cynomolgus comparados con los anticuerpos de la presente invención.

EJEMPLO 7: Generación de Anticuerpo Quimérico Con el fin de identificar las secuencias de las regiones variables de las cadenas pesadas (VH) y ligeras (VL) del anticuerpo 2A1 de urino, se aisló ácido ribonucleico (RNA) del hibridoma y se utilizó en la reacción de cadena y polimerasas de transcripción inversa (RT-PCR) (Equipo de RT-PCR Phusion Thermo Scientific) para generar cDNA de primera hebra. Un conjunto de cebadores degenerativos que cubre el repertorio completo de murino de las secuencias día de anticuerpos de tanto VH como VL se utilizó en una PCR en donde el cDNA de primera hebra sirvió como la plantilla.

Los cebadores delanteros (guía de IgG de murino) se proporcionan enseguida.

Nombre Secuencia VH1-1 CACTGCAGGTRTCCACTCC (SEQ ID NO: 82) VH1-2 CATAGCAGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 83) VH1-3 CRCTACAGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 84) VH1-4 GCYACAGMTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 85) VH1-5 CACTGCAGGTGTCCWMTCC (SEQ ID NO: 86) VH1-6 CRCTRCAGGTGTKCACTCC (SEO ID NO: 87) VHl-7 GCTAWMGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 88) VH1-8 CCTCAGGTGTCCACTCC (SEQ ID NO: 89) VHl-9 GCTACAGGTGCTCAC TCC (SEQ ID NO: 90) VH 1-10 CACTGCAGGTGTCCTCTCT (SEQ ID NO: 91) VH1-11 CAYTGCAGGTGTCCAYTGC (SEQ ID NO: 92) VHl-12 GCTAMMGGTGTCCACTTC (SEQ ID NO: 93) VH 1-13 CTCCTGTCAKTAACTKCAGGT (SEQ ID NO: 94) VH 1-14 CAACTGCAGGTGTCTCTCT (SEQ ID NO: 95) VH 1-15 CRCTRCAGGYGTCCACTCT (SEQ ID NO: 96) VH2-1 CCAAGCTGTATCCTTTCC (SEQ ID NO: 97) VH2-2 CCAAGCTGTGTCCTRTCC (SEQ ID NO: 98) VH3-1 CTTGACAGYCVTTCCKGGT (SEQ ID NO: 99) VH3-2 CTTCACAGCCTTTCCTGGT (SEQ ID NO: 100) VH4 CTTAAAAGGGGTCCAGTGT (SEQ ID NO: 101) VH5-1 CAYTTTAAAARGTGTCMAGTGT (SEQ ID NO: 102) VH5-2 GTTTTAAAAGGTGTCCTGTG (SEQ ID NO: 103) VH6 CTYTTAAAAGGKGTCCAGWG (SEQ ID NO: 104) VH7-1 CYTTTAMATGGTATCCAGTGT (SEQ ID NO: 105) VH7-2 CTTTTACATGGTTTCAAGTGT (SEQ ID NO: 106) VH8 GTCCCTGCATATGTCYT (SEQ ID NO: 107) VH9 GATGGCAGCWGCYCAAAG (SEQ ID NO: 108) VHl0 CTATCAAGGTGTGCATTGT (SEQ ID NO: 109) VH11 CTTTTAAAAGWTGTCCAGKGT (SEQ ID NO: 110) VHl2 GTGACAGTCCTTCCTGGTAG (SEQ ID NO: 111) VHl4 CTTCCTGATGGCAGTGGTT (SEQ ID NO: 112) VHl5 GCTACAGGTATCCAATCC (SEQ ID NO: 113) El cebador trasero (constante de IgG de murino) se proporciona enseguida.

Nombre Secuencia GCGTCTAGAAYCTCCACACACAGGRRCCAGTGGATAGAC (SEQ HC-Rev ID NO: 114) Los cebadores delanteros (guia de Igkappa murino) se proporcionan enseguida.

Nombre Secuencia - CTGWTGTTCTGGATTCCTG (SEQ ID NO: 115) GGTCAGACAGTCAGCAGT (SEQ ID NO: 116) GTGCTCTGGATTCGGGAA (SEQ ID NO: 117) CAGCTTCYTGC TAATCAGTG (SEQ ID NO: 118) CTAATCAGTGCTTCAGGA (SEQ ID NO: 119) GTGGGTATCTGGTRCSTGTG (SEQ ID NO: 120) - GGAAATTTAAAAGTACCTGTGGG (SEQ ID NO: 121) GGTTTCMAGGTRCCAGATGT (SEQ ID NO: 122) - CTCTGGTTYCCAGGTATC (SEQ ID NO: 123) CTGTTTTCAAGGTRCCAGATGT (SEQ ID NO: 124) GTTGTAATGTCCAGAGGA (SEQ ID NO: 125) CTTACAGGTGCCAGATGT (SEQ ID NO: 126) CTCAATTGTAGRTGCCAGATGT (SEQ ID NO: 127) CACAGTAGGTGTCAGATGT (SEQ ID NO: 128) GTCGTAGTTGTCAGATGT (SEQ ID NO: 129) CCTCCTTCTTGGCCAAGA (SEQ ID NO: 130) - CTTATATGGAGCTGATGGG (SEO ID NO: 1311 VK19/28-2 GTGTCTGGTGCTCATGGG (SEQ ID NO: 132) VK19/28-3 CTSTGGTTGTCTGGTGTTGA (SEQ ID NO: 133) VK20 GTCTCTGATTCTAGGGCA (SEQ ID NO: 134) VK21-1 CTKCKCTGGGTTCCAG (SEQ ID NO: 135) VK21-2 GCAGGTGTTGACGGA (SEQ ID NO: 136) VK22-1 CAGGTGCCTCGTGCAC (SEQ ID NO: 137) VK22-2 CTCTGGTGCCTGTGCA (SEQ ID NO: 138) VK23 CTGGAYTYCAGCCTCCAGA (SEQ ID NO: 139) VK24/25-1 GWTCTCTRGAGTCAGTGGG (SEQ ID NO: 140) VK24/25-2 CTGGATCCCTGGAKCYACT (SEQ ID NO: 141) VK32 GTTCTGCTTTTTAGGTGTG (SEQ ID NO: 142) VK33/34 GATCCCAGGCATGATATGT (SEQ ID NO: 143) VK31/38C CTTCATGGTGCTCAGTGT (SEQ ID NO: 144) VKRF CCATATCAGGTGCCCAGTGT (SEQ ID NO: 145) El cebador trasero (constante de Igkappa de murino) se proporciona enseguida.

Nombre Secuencia GCGTCTAGAACTGGATGGTGGGAAGATGG (SEQ ID NO: LC -rev 146) VH y VL amplificadas se clonaron subsecuentemente en la estructura en vectores que contienen secuencias de secreción en anticuerpo apropiadas y las regiones constante de IgGl e Igkappa humanas, respectivamente, para generar constructos de DNA quiméricos de murino: humanos. Estos constructos se co-transfectaron con células 293Freestyle (Life Technologies) y el anticuerpo resultante se purificó del sobrenadante de cultivo de células mediante la cromatografía de Proteína-A. Para determinar que se han identificado las secuencias de VH y VL correctas, el 2A1 quimérico (denotado 2Al-xi) se comparó con el anticuerpo 2A1 parental de murino y el ensayo de enlace de CD47 mediante la citometría de flujo sobre células Raji (Figura 6). La B6H12 también se incluyó como control positivo en este ensayo. La 2Al-xi enlazado se detectó utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG humana conjugado con FITC. 2A1 y B6H12 enlazados se detectaron utilizando un anticuerpo secundario anti-IgG de ratón conjugado con FITC. Las afinidades aparentes se determinaron mediante ajustes no lineales (Software Prism GraphPad) de las intensidades de fluorescencia medias de varias concentraciones de anticuerpos (Tabla 2). El anticuerpo 2Al-xi tiene una afinidad de enlace similar como el anticuerpo 2A1 de murino hacia CD47 de superficie de célula, demostrando que las secuencias VH y VL se han identificado apropiadamente.

Tabla 2.

EJEMPLO 8: Humanización del Anticuerpo El anticuerpo CD47 de 2A1 de murino se humanizó para reducir el potencial de inmunogenicidad cuando se administró al paciente humano. Las secuencias de la región VH y VL de 2A1 se compararon con las secuencias de anticuerpo humano en el banco de datos IMGT. Subsecuentemente, se generó un modelo estructural de las regiones VH y VL de 2A1 utilizando las estructuras conocidas de los anticuerpos humanizados y humanos más estrechamente relacionados en el Banco de Datos de Proteína (PDB). Las 3 regiones de determinación complementarias (CDR) en ambas de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 2A1 se fijaron en las estructuras de murino se reemplazaron con numerosas estructuras humanas que tuvieron la posibilidad más alta de mantener la orientación apropiada de las CDRs. Los constructos correspondientes a cada una de las variantes 2A1 humanizadas se generaron mediante la síntesis génica y se clonaron en la estructura en vectores que contienen una secuencia de secreción apropiada y regiones constantes de IgGl e Igkappa humanas. Varias combinaciones de cadenas pesada y ligera humanizadas se co-transfectaron en las células 293Freestyle (Life Technologies) y los anticuerpos resultantes se purificaron del sobrenadante del cultivo de células mediante la cromatografía de Proteína-A.

Los anticuerpos humanizados se probaron por su habilidad para enlazar células Raji mediante la citometría de flujo (Figura 7). El anticuerpo 2Al-xi se utilizó como un control en la mayoría de estos ensayos para ajustar la marca de referencia para la afinidad de enlace. Los anticuerpos humanizados además se optimizaron para aumentar la expresión y reducir los sitios problemáticos que incluyen la isomerización potencial y los sitios de desamidación. Un ejemplo de un anticuerpo humanizado optimizado, derivado del anticuerpo 2A1 de murino se denota como anticuerpo AB6.12, que exhibe afinidad de enlace muy similar como el anticuerpo 2Al-xi (Figura 7H, Tabla 3). Las afinidades aparentes se determinaron mediante ajustes no lineales (Software Prism GraphPad) de las intensidades de fluorescencia media en varias concentraciones de anticuerpos.

Tabla 3.

El anticuerpo AB6.12 se convirtió subsecuentemente de un IgGl a otros isotipos de IgG humanos al reemplazar el dominio constante de la cadena pesada. Como se muestra en la Figura 71, el cambio del isotipo IgG a una versión estabilizada en bisagra de IgG4 (IgG4P: S228P), y la variante de enlace de receptor de Fe reducido del IgG4 estabilizado en bisagra (IgG4PE: S228P/L235E) no alteró la afinidad de enlace del anticuerpo humanizado hacia CD47 de superficie de células (Figura 71, Tabla 4). Las afinidades aparentes se determinaron mediante ajustes no lineales (Software de Prism GraphPad) de las intensidades de fluorescencia media en varias concentraciones de anticuerpo.

Tabla 4.

Por todo el proceso de humanización, los anticuerpos CD47 se probaron para asegurar que estuvo intacta la funcionalidad bloqueante de SIRPa. Como se muestra en la Figura 7J, múltiples isotipos IgG del anticuerpo humanizado, AB6.12, bloquearon la interacción de SIRPa:CD47, utilizando el método a base de citometria de flujo descrito en lo anterior en el Ejemplo 3. Los anticuerpos CD47 ejemplares y su región VH y región VL correspondientes incluyen aquellos proporcionados en la Tabla 1.

Durante el proceso de humanización, se determinó que en algunos modalidades, un motivo de secuencia de aminoácidos, "NA" en el inicio de CDR3 de VH (SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 77) es importante para el enlace de los anticuerpos CD47 descritos en la presente. En algunas modalidades, en la ausencia de los residuos de aminoácidos "NA" en el inicio de CDR3 de VH (SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 77), los anticuerpos CD47 de la invención no enlazan a su objetivo o enlazan a su objetivo con menor afinidad que estaría en la presencia de los residuos de aminoácidos "NA". Por ejemplo, cuando el motivo "NA" se cambió a motivos más canónicos "AR" o "AT" se redujo sustancialmente el enlace (es decir, mayor que diez veces). En otras modalidades, en la ausencia de los residuos de aminoácidos "NA" en el inicio de CDR3 de VH (SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 77), los anticuerpos CD47 de la invención enlazan a su objetivo con afinidad equivalente comparado con el enlace en la presencia de los residuos de aminoácidos "NA".

Aquellos expertos en la téenica reconocerán que es posible determinar, sin experimentación indebida, si una sustitución de aminoácido en las secuencias de los anticuerpos CD47 de la invención dará por resultado un anticuerpo con sustancialmente la misma función, por ejemplo, una anticuerpo CD47 con la habilidad para bloquear SIRPa y no causa un nivel significativo de hemaglutinación.

Una imagen del trazo de la cromatografía de exclusión de tamaño utilizando un ARTA FLPC con una columna Superdex200 se muestra en la Figura 8A. Las variantes IgGl, IgG4P e IgGPE del anticuerpo AB6.12 son mostradas. Todas las tres variantes están arriba de 98% monomérica. La Figura 8B es una fotografía de un gel SDS-PAGE machado con azul de coomassie de numerosas variantes humanizadas de 2A1 bajo condiciones de reducción (R) y de no reducción (NR).

EJEMPLO 9: Los Anticuerpos CD47 Promueven la Fagocitosis de Líneas de Células de Tumor CD47 es un receptor de superficie de célula que es regulado hacia arriba sobre células de tumor y también se cree que contribuye a la inmuno evasión a través de su interacción con su ligando natural SIRPa. La ligación de CD47 SIRPa sobre macrófagos da resultado la actividad fagocitica disminuida. Como es descrito en detalle enseguida, se determinó si el enlace de CD47 y la actividad bloqueante de SIRPa del anticuerpo 2A1, y variaciones de los mismos, promueven la fagocitosis de células de tumor en la presencia de macrófagos humanos.

Se aislaron PBMCs de sangre humana, y los monocitos se diferenciaron en macrófagos al incubarlos en el medio AIM-V (Life Technologies) durante 7 dias. Los macrófagos derivados de monocito (MDMs) llegan a ser adherentes permitiendo que otras células sean deslavadas. Los MDMs se rasparon y re-colocaron en placa en cajas de 12 cavidades y se dejaron adherir durante 24 horas. La línea de células de tumor humano CCRF-CEM se eligió como un tipo de célula objetivo debido a su alta expresión de CD47. Las células CCRF-CEM se marcaron con CFSE 0.3 mM a 37°C durante 15 minutos, luego se lavaron y se adicionaron a MDMs en una relación de 4:1 células de tumor por fagocito, y el anticuerpo CD47 se adicionó en varias concentraciones. La fagocitosis de células objetivos se dejó durante 3 horas. Subsecuentemente, las células objetivo no fagocitosadas se deslavaron con PBS. Los fagocitos restantes se rasparon, se mancharon con un anticuerpo al marcador de macrófagos CD14 conjugado con DyLite 649 (Biolegend) y se analizaron mediante citometría de flujo. La fagocitosis se midió al confinar en células vivas que fueron positivas de FL4 (CD14+) y luego al estimar el porciento de células positivas de FL1 (CFSE+).

La Figura 9 muestra que el anticuerpo 2A1 de CD47 y sus variantes humanizadas demostraron un incremento dependiente de la dosis en la fagocitosis de células de tumor mediante MDMs. El anticuerpo 2A1 y la variante humanizada AB2.05 fueron en su habilidad para inducir fagocitosis de células en tumor en 66.7 pM, mientras que B6H12 no tuvo actividad en esa concentración (Figura 9A). La Figura 9B muestra cómo 2A1, y las variantes humanizadas AB2.05, AB6.12-IgGl, AB6.12-IgG4P y AB6.12-IgG4PE todas inducen fagocitosis máxima en 0.3 mg/ml o 2 nM, mientras que B6H12 requiere concentraciones más altas. Estos datos demuestran que el anticuerpo CD47, 2A1 (y variantes humanizadas derivadas de este) inducen la fagocitosis mediada por macrófago de las células de tumor positivas de CD47. En este ejemplo, las células CCFR-CEM se utilizaron como la célula objetivo positiva de CD47.

EJEMPLO 10: Actividad Antitumor de los Anticuerpos CD47 La actividad anti-tumor de los anticuerpos CD47 de murino se evaluó en un modelo de linfoma de Raji. Las células Raji se implantaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID, y se aleatorizaron en 5 grupos (10 ratones por grupo, día 0). Grupo 1: Vehículo (solución amortiguadora únicamente); Grupo 2: B6H12 (control positivo); Grupo 3: 1B4; Grupo 4: 2A1 y Grupo 5: 9E4. El tratamiento con cada anticuerpo o vehículo (solución amortiguadora únicamente) comenzó cuando los tumores fueron palpables (50 mm3, día 13) y los ratones se eutanizaron cuando sus volúmenes de tumor alcanzaron -1500 mm3. Los volúmenes de tumor se midieron 3 veces por semana. Los anticuerpos se dosificaron intravenosamente (IV) con 200pg 3 veces por semana durante 3 semanas (9 dosis totales por ratón). El tratamiento inicio en el día 13 y finalizó en el día 32.

Como se muestra en la Figura 10A, los anticuerpos CD47 de la invención, particularmente el anticuerpo 2A1, demostró actividad anti-tumor en el modelo de animal de linfoma. Para alcanzar un volumen de tumor de 1500 mm3, el Grupo 1 (vehículo únicamente) requirió -25 días; Grupo 2 (B6H12.2) requirió -45 días; Grupo 3 (1B4) requirió -37 días; Grupo 4 (2A1) requirió -85 días; y Grupo 5 (9E4) requirió -40 días para alcanzar un volumen de tumor de -1500 mm3. Estos datos indican que el anticuerpo 2A1 fue significativamente más potente que todos los anticuerpos de enlace de CD47 probados, incluyendo B6H12 que se sabe que enlaza CD47, bloquea la interacción de CD47 con SIRPa, y suprime la formación de tumor en modelos de ratón de cáncer humano. Inesperadamente, la actividad de supresión tumoral de estos anticuerpos CD47 no se correlacionó con su potencia de enlace de CD47 o la interacción de CD47 bloqueante con SIRPa, que seria de esperado en base a los datos publicados.

Como es descrito en los Ejemplos 2 y 3, 2A1, 1B4 y 9E4 tienen afinidad similar para CD47 y potencia similar para bloquear la interacción de CD47 con SIRPa. Además, la eficacia aumentada de 2A1 no puede ser explicada por diferencias en el dominio de Fe de los anticuerpos descritos puesto que todos los anticuerpos utilizados en este estudio estuvieron comprendidos de dominios de IgGl de ratón idénticos. De esta manera, además de la composición de materia única, el anticuerpo 2A1 posee características inesperadas y únicas que incluyen la incapacidad para inducir interacciones homotípicas entre las células que expresan CD47, por ejemplo, glóbulos rojos, y actividad de supresión de tumor aumentada que no se puede explicar por enlace aumentado a CD47 o una habilidad aumentada para bloquear la interacción de CD47 con SIRPa.

Para confirmar que los anticuerpos 2A1 humanizados mantuvieron su actividad anti-tumor, se condujo un estudio de tumor Raji similar. El diseño del estudio fue el mismo como es descrito en lo anterior. Las células Raji se implantaron subcutáneamente en ratones NOD/SCID y se aleatorizaron en 5 grupos (10 ratones por grupo, día 0). En este estudio, los anticuerpos se dosificaron intraperitonealmente (IP) con 200pg 3 veces por semana durante 3 semanas (9 dosis totales por ratón) y los volúmenes de tumor se midieron 3 veces por semana. Sin embargo, para este estudio, el anticuerpo 2A1 de IgGl de ratón (grupo 2) se comparó con un derivado humanizado, DB6.12. Para este estudio, AB6.12 se construyó (como es descrito en el EJEMPLO 8) en IgGl humano (Grupo 3), IgG4P humana (Grupo 4) e IgG4PE humana (Grupo 4). De esta manera, este experimento se diseñó para dirigirse a la influencia de la humanización de 2A1 en su actividad de supresión de tumor y la función potencial de la función efectora del dominio Fe que es conocido en la téenica que contribuye a las actividades anti-tumor de muchos anticuerpos. Ha sido bien documentado que IgGl humana posee una función efectora significativamente mayor comparada con IgG4P humana. IgG4PE se desarrolló para reducir adicionalmente la función efectora. Como se puede observar la Figura 10B, la humanización de 2A1 no disminuyó la actividad anti-tumor de 2A1, y de hecho puede haberla aumentado. AB6.12-hIgGl, AB6.12-hIgG4P y AB6.12-hIgG4PE todos mostraron actividad anti-tumor similar que se presenta significativamente mayor que el 2A1 de ratón (2AlmIgG). Este resultado es inesperado puesto que 2AlmIgGl, AB6.12-hIgGl, AB6.12-hIgG4P y AB6.12-hIgG4PE tienen actividades de enlace de CD47 y bloqueante de SIRPa similares. Además, puesto que AB6.12-hIgGl, AB6 .12-hIgG4P y AB6.12-hIgG4PE tienen una actividad anti-tumor similares, se presenta que la función efectora no desempeña una función en la eficacia del anticuerpo 2A1 humanizado, AB6.12.

EJEMPLO 11: Co-cristalización de anticuerpos CD47 con CD47 CD47 es una proteina de transmembrana de 5 pasos con un dominio IgV extracelular individual (tipo de variable similar a inmunoglobulina) que es altamente glicosilada en 6 sitios. La estructura del dominio CD47-lgV se ha resuelto en complejo con el dominio IgV de SIRPa, su ligando natural (Referencia de Banco de Datos de Proteina (PDB) No.2JJS; Hatherlcy y colaboradores, 2008 Mol Cell, 25;31(2): 266-77 (Figura 11A)). La estructura muestra el enlace de SIRPa-IgV a CD47-IgV en un epitopo apical que incluye el piroglutamato N-terminal de CD47. Esta estructura explica lo suficiente de cómo ambas de las proteínas de transmembrana de superficie de célula pueden interactuar productivamente a partir de células adyacentes en una orientación de cabeza a cabeza. La estructura cristalográfica por rayos X de CD47-IgV en complejo con el Fab de B6H12 se presenta en la Figura 11B. Por claridad, las regiones constantes del Fab (CHl y CL) se omitieron en la Figura, y solamente se presenta el Fv (VH y VL). Esto reveló un sitio de enlace apical, que posiciona este anticuerpo en una superficie extremadamente distante de la membrana de célula (Figura 11B). El mecanismo de SIRPa que se bloque por B6H12 es aparente a partir de esta estructura. Los propósitos de orientación con relación a la ubicación de la membrana de célula se representan como una linea de guiones en la Figura 11.

Con el fin de determinar el epitopo objetivo de los anticuerpos de la presente invención, la estructura cristalográfica por rayos X del co-complejo del dominio CD47-IgV y el Fab de 2Al-xi (anticuerpo quimérico con dominios CH1 y CL humanos) se determinó (Figura 11C). Por claridad, las regiones constantes del Fab (CH1 y CL) se omitieron en la Figura, y únicamente se presenta el Fv (VH y VL). Distinto a la estructura previamente determinada de CD47 que enlaza SIRPa en una orientación de cabeza a cabeza (Figura 11A) y el anticuerpo B6H12 que es posicionado apicalmente lejos de la membrana (Figura 11B), la estructura de 2A1 en complejo con CD47 reveló en enlace del anticuerpo a CD47 cerca de la membrana en una orientación de cabeza al lado inesperada y única (Figura 11C). El epitopo 2A1 sobre CD47 es discontinuo, e incluye los residuos Y37, K39, K41, el bucle de KGRD (SEQ ID NO: 56) (residuos 43-46), D51, H90, N93, E97, T99, E104 y E106 de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147 (es decir, SEQ ID NO: 48 es que excluye la secuencia de señal (aminoácidos 1-18)). La estructura de 2A1 enlazadas a CD47 también revela que el VH es principalmente involucrada en el enlace al bucle de KGRD (SEQ ID NO: 56) de CD47, mientras que el dominio de VK interactúa con los residuos apicales que incluyen Y37, T102, y E104, que están involucrados en el enlace de SIRPa. Por lo tanto, es principalmente el dominio de VK que físicamente evita el enlace de SIRPa a CD47. Estos estudios estructurales sugieren que el epitopo único que 2A1 enlaza a este sobre el lado de CD47. En contraste a los anticuerpos CD47 conocidos en la téenica, la orientación en la región VH de 2A1 en una posición próxima a la membrana son características críticas de este anticuerpo que previene un nivel significativo de hemaglutinación de glóbulos rojos al restringir el anticuerpo tal que no puede puentear a las moléculas CD47 sobre células adyacentes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal aislado, caracterizado porque enlaza a CD47 o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, en donde el anticuerpo no causa un nivel significativo de aglutinación de células después de la administración.

2. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo es quimérico, humanizado o completamente humano

3. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el CD47 es CD47 humano.

4. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo previene a CD47 de interactuar con la proteina reguladora de señal a (SIRPa).

5. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo promueve la fagocitosis mediada por macrófago de una célula que expresa CD47.

6. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo es un isotipo IgG seleccionado del grupo que consiste de isotipo IgGl, isotipo IgG2, isotipo IgG3 y isotipo IgG4.

7. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una región de cadena pesada variable (VH) seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5-30.

8. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una región de cadena ligera variable (VL) seleccionada el grupo que consiste de SEQ ID NOs: 31-47.

9. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una región VH proporcionada en cualquiera de SEQ ID NOs: 5-30 y una región VL proporcionadas en cualquiera de SEQ ID NOs: 31-47.

10. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una región VH proporcionada en cualquiera de SEQ ID NOs: 5, 7, 8, 11, 12, 15-17, 20-22 y 27-30 emparejada con una región VL proporcionadas en cualquiera de SEQ ID NOs: 31, 32, 35, 40, 41, 42, 43, 44, y 47.

11. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 9, ccaarraacctteerriizzaaddoo ppoorrqquuee eell anticuerpo comprende una combinación de una región de cadena VH y una región de cadena VL seleccionada de las combinaciones listadas en la Tabla 1.

12. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una secuencia de región de determinación de complementariedad 1 (CDR1) de VH expuesta en SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 57, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 60, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 65 o SEQ ID NO: 66, una secuencia de CDR2 de VH expuesta en SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 72, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 74, SEQ ID NO: 75 o SEQ ID NO: 76, una secuencia CDR3 de VH expuesta en SEQ ID NO: 52 o SEQ ID NO: 77, una secuencia CDR1 de VL expuesta en SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 67, o SEQ ID NO: 68, una secuencia CDR2 de VL expuesta en SEQ ID NO: 54, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 70 o SEQ ID NO: 71 y una secuencia CDR3 de VL expuesta en SEQ ID NO: 55.

13. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo comprende una secuencia CDR1 de VH expuesta en SEQ ID NO: 50, una secuencia de CDR2 de VH expuesta en SEQ ID NO: 51, una secuencia de CDR3 de VH expuesta en SEQ ID NO: 52, una secuencia de CDR1 de VL expuesta en SEQ ID NO: 53, una secuencia de CDR2 de VL expuesta en SEQ ID NO: 54 y una secuencia de CDR3 de VL expuesta en SEQ ID NO: 55.

14. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento in unológicamente activo del mismo comprende una secuencia CDR1 de VH expuesta en SEQ ID NO: 50, una secuencia CDR2 de VH expuesta en SEQ ID NO: 72, una secuencia de CDR3 de VH expuesta en SEQ ID NO: 52, una secuencia de CDRl de VL expuesta en SEQ ID NO: 53, una secuencia de CDR2 de VL expuesta en SEQ ID NO: 71 y una secuencia de CDR3 de VL expuesta en SEQ ID NO: 55.

15. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a CD47 en una orientación de cabeza al lado, en donde una cadena VH del anticuerpo se posiciona cerca de la membrana de una célula que expresa CD47, y en donde una cadena VL del anticuerpo ocluye un sitio de enlace de SIRPa sobre CD47.

16. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza CD 7 en una orientación de cabeza al lado, en donde una cadena VL del anticuerpo se posiciona cerca de la membrana de una célula que expresa CD47, y en donde una cadena VH del anticuerpo ocluye un sitio de enlace de SIRPa sobre CD47.

17. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a un epítopo discontinuo sobre CD47.

18. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo enlaza a un bucle de CD47 que comprende la SEQ ID NO: 56.

19. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el epítopo discontinuo comprende los residuos de aminoácidos Y37, K39, K41, K43, G44, R45, D46, D51, H90, N93, E97, T99, E104, E106 o de CD47 cuando se numeran de acuerdo con SEQ ID NO: 147.

20. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo no causa un nivel significativo de hemaglutinación de glóbulos rojos después de la administración.

21. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo es un isotipo IgG seleccionado de IgG4P e IgGPE.

22. Un anticuerpo aislado o un fragmento inmunológicamente activo del mismo, caracterizado porque el anticuerpo compite con el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para prevenir que CD47 interactué con SIRPa.

23. un polipéptido, caracterizado porque comprende los residuos de aminoácido Y37, K39, K41, K43, G44, R45, D46, D51, H90, N93, E97, T99, E104 y E106 de CD47 cuando se numera de acuerdo con SEQ ID NO: 147.

24. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo de la reivindicación 1 o un fragmento inmunológicamente activo del mismo y un portador.

25. Un método para aliviar un síntoma de un cáncer u otra condición neoplásica, el método caracterizado porque comprende administrar el anticuerpo de la reivindicación 1 y un fragmento inmunológicamente activo del mismo a un sujeto en necesidad del mismo en una cantidad suficiente para aliviar el síntoma del cáncer u otra condición neoplásica en el sujeto.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el sujeto es un humano.

27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo es quimérico, humanizado o completamente humano.

28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el CD47 es CD47 humano.

29. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo previene a CD47 de interactuar con SIRPa.

30. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo es un isotipo IgG seleccionado del grupo que consiste de isotipo IgGl, isotipo IgG2, isotipo IgG3 e isotipo IgG4.

31. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el anticuerpo o fragmento inmunológicamente activo del mismo es un isotipo IgG seleccionado de IgG4P e IgGPE.

32. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque que además comprende la administración de quimioterapia.

33. El método de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque la quimioterapia es radioterapia.