CN106117354B - 一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；且所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。本发明还公开了上述全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。

Description

一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体及其应用

技术领域

本发明涉及生物免疫技术领域，尤其涉及一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，还涉及该全分子IgG抗体的DNA分子、表达载体、宿主细胞和应用。

背景技术

巨噬细胞通过吞噬作用从血液中清除病原体和受损或是衰老细胞。细胞表面的CD47可以与巨噬细胞上的信号调节蛋白α(SIRPα)相互作用，进而抑制吞噬正常的细胞。CD47是一个广泛的跨膜糖蛋白表达，含有一个免疫蛋白样结构域和5个跨膜区,它们构成了SIRPα的配体,通过NH2端的可变区样结构域结合SIRPα。SIRPα主要表达在髓细胞,包括巨噬细胞、粒细胞、髓系树突状细胞,肥大细胞,以及它们的前体,包括造血干细胞。SIRPα能够通过巨噬细胞抑制宿主细胞吞噬作用,SIRPα通过与表达在宿主靶细胞上的CD47结合形成一个抑制信号，SHP-1可以起负性调节的作用。与CD47抑制正常细胞吞噬功能的作用相一致的研究表明,它是在造血干细胞及其母细胞迁移之前的阶段暂时性调节,这些细胞上CD47的水平决定了吞噬的能力。总之CD47是抑制性受体SIRPα的胞外配体，二者结合通过产生抑制性信号降低巨噬细胞的吞噬活性，从而产生肿瘤的免疫逃逸.

目前国内抗CD47的单抗制备技术大多是鼠源，或者进行基因工程改造后进行表达，但是表达量不高或是制备繁琐。本专利采用较为先进的基因工程抗体表达系统，并在表达条件上进行了优化，获得了高特异性和CD47结合的抗体，细胞实验证明在抗体存在时可以促进巨噬细胞对血液肿瘤细胞的吞噬作用。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，基于背景技术存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体。

本发明的目的又在于提供一种编码上述全人源抗CD47的全分子IgG抗体的DNA分子。

本发明的目的又在于提供一种含有能编码上述全人源抗CD47的全分子IgG抗体的DNA分子表达载体。

本发明的目的又在于提供一种被上述的表达载体所转化的宿主细胞。

本发明的目的还在于提供上述全人源抗CD47的全分子IgG抗体的应用。

为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，包括全人源Fab噬菌体抗体库的筛选，抗CD47特异性抗体的纯化，抗CD47全分子抗体IgG的制备、表达及纯化，抗CD47全分子抗体IgG的特性分析，最终获得了一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，

(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体；

且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，或者是该序列经一个或多个氨基酸添加、删除、替换、修饰的保守性突变而获得的保守性变异体。

优选地，所述的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

本发明还提出的一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，包含轻链恒定区和重链恒定区，所述的轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，所述的重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。

本发明还提出的一种DNA分子，其编码上述全分子IgG抗体的重链或/和轻链。

优选地，其编码轻链可变区的核酸序列为SEQID NO.1所示，编码重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明还提出的一种表达载体，包含有上述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。

本发明还提出的一种宿主细胞，被上述的表达载体转化。

优选地，该宿主细胞可以是被上述的表达载体转化的293Freestyle细胞。

本发明还提出的上述全分子IgG抗体在制备与CD47相关的肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的用途。

本发明通过噬菌体抗体库技术筛选到了对CD47具有高度亲和力的人源Fab抗体，并获取了赋予所述抗体优异特性的重链和轻链可变区的氨基酸序列和核苷酸序列，并将所述抗体的重链和轻链可变区与含有抗体恒定区的表达载体连接，最终获得了具有特异的抗原结合性和在器官移植动物水平具有较好的抗排异反应。

本发明提供了一种具有高特异性、良好亲和力的抗CD47的全分子全人源单克隆抗体。CD47骨髓来源的血液疾病细胞中广泛表达,而在正常组织中不表达，因此本发明的抗CD47抗体可应用于有关CD47阳性的肿瘤的诊断、治疗中。本发明以CD47为靶分子，在噬菌体抗体库技术的基础上制备出全分子人源抗体。对制备的人源抗CD47抗体做功能鉴定，显示该抗体能够与CD47特异性结合，体外细胞实验证实抗体能够促进巨噬细胞对CD47阳性的血液肿瘤细胞的吞噬作用。

与国内现有的抗CD47鼠源单抗相比，本发明制备的是全人源IgG抗体，而且实验证明有很好的特异性及能够明显增强吞噬细胞对CD47阳性血液肿瘤细胞的吞噬作用。

本发明人通过在抗CD47抗体存在时检测骨髓来源的巨噬细胞对人早幼粒白血病细胞HL-60吞噬实验，结果证明抗CD47抗体可以明显增强巨噬细胞的吞噬作用。

附图说明

图1为本发明实施例1所得纯化全人源抗CD47的全分子IgG抗体的SDS-PAGE检测结果；其中1为蛋白分子量标准品，2为抗CD47抗体，3为抗TLR4抗体，4为细胞培养上清，5为流穿；可见使用Pro.A柱纯化抗CD47抗体纯度高。

图2为本发明实施例1所得抗CD47抗体的酶联免疫吸附试验检测结果，可见抗CD47抗体与CD47蛋白的结合能力较强。

图3为本发明实施例1所得抗CD47抗体与CD47的免疫印迹鉴定结果；其中1为抗CD47抗体与CD47阳性的人早幼粒白血病细胞HL-60；2为抗CD47抗体与CD47阴性的大鼠骨髓瘤细胞YB2/0；可见抗体与CD47蛋白有特异性结合能力。

图4为本发明实施例1所得抗CD47抗体的亲和力检测结果，KD值为3.362×10^-10M。

图5为本发明实施例1所得抗CD47抗体促进巨噬细胞吞噬作用的实验结果对比图。实验结果显示抗CD47抗体可以使80％吞噬细胞发挥吞噬作用。

具体实施方式

下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。

实施例1全人源抗CD47的全分子IgG抗体的制备

1)用CD47抗原在人源Fab噬菌体库中经过六轮“吸附-洗脱-扩增”的富集筛选，获得抗CD47的Fab抗体，然后通过PCR扩增测序获得Fab抗体的可变区序列。

2)根据已获得的抗体的重轻链可变区序列，设计引物。

3)扩增抗CD47抗体重链、轻链。

以上述制备的人源Fab模板，分别以上述涉及的重链和轻链的上下游引物扩增全分子人源抗体重链、轻链基因。

(1)PCR

反应体系如下：

反应条件如下：

(2)2％琼脂糖凝胶电泳，紫外下观察目的条带，切胶回收。

(3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。

4)双酶切IgG表达质粒

IgG表达质粒pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk(购自Invivogen公司)包含IgG1型人源的重链和轻链(Lambda)恒定区碱基编码序列。

(1)pFUSE-CHIg-hG1、pFUSE-CLIg-hk模板载体的双酶切

反应体系如下：

反应条件为：37℃酶切过夜。

(2)1％琼脂糖凝胶电泳，紫外下切胶回收。

(3)胶回收试剂盒纯化目的DNA片段，去离子水洗脱。

5)Infusion PCR重组表达质粒

反应体系如下：

反应条件为：50℃孵育15min。

取5μL反应液转化感受态细菌，铺于相应抗性的平板上，次日挑克隆送测序。将测序结果正确的克隆保存菌种并扩大培养，提取质粒。

6)抗CD47抗体的表达

(1)取50μg重组后的重链质粒于1mL的Opti-MEM培养基中，取50μg的轻链质粒于1mL的Opti-MEM培养基中，取200μL的293Fectin于2.8mL的Opti-MEM培养基中，将上述三种混合液室温静置5min；

(2)然后将两个质粒混合液混合均匀后，补加500μL的Opti-MEM培养基混合均匀后直接加入转染试剂293Fectin的混合液，混合均匀后静置20min。期间处理293F细胞，将293F细胞离心后用293F Expression Medium重悬，然后计数以及用台盼蓝计算细胞活力比，吸取1×10⁸个细胞于培养瓶中，用293F Expression Medium定容为94mL；

(3)20min结束后将6mL的DNA、293Fectin的复合物加入准备好的293F细胞中；

(4)将细胞放在摇床培养箱中培养，培养条件8％CO2，120rmp，37℃，6天后收集细胞上清。

7)抗CD47抗体的纯化

将收集的细胞上清用0.22μm的滤膜过滤，同时将平衡液和洗脱液过滤膜。用AKATA纯化仪按照Protein A纯化的标准步骤纯化，以1mL/min的速度上样，以1.5mL/min的速度洗脱。

结果成功表达并纯化抗CD47抗体。将纯化抗CD47抗体进行SDS-PAGE检测，其结果如图1所示。由图1可知纯化的抗体纯度很高，且用Pro.A柱纯化效果较好。

实施例2抗CD47抗体的功能活性鉴定

1)酶联免疫法

用包被液(0.1M碳酸盐缓冲液，pH9.6)CD47蛋白至2μg/mL包被ELISA96孔板，每孔加入100μL，4℃过夜；PBST(PBS含0.5％Tween20)5％脱脂牛奶-洗涤缓冲液封闭，37℃孵育2h；PBST洗涤5次后，每个孔中加入100μLPA21抗体(2μg/mL起始浓度，14个浓度梯度稀释)37℃2h；以1：4000稀释的羊抗人二抗100μL/孔加入到孔内，37℃孵育1h；过氧化物酶底物显色液100μL/孔，室温下10分钟后用2M硫酸中止反应，上机检测比色采用双波长450nm/690nm。

结果如图2示所示，由图2可知：抗CD47抗体能与CD47蛋白起抗原抗体反应。

2)Western blot

以不表达CD47蛋白的大鼠骨髓瘤细胞YB2/0为阴性对照，分别将高表达CD47的早幼粒细胞HL-60和不表达CD47蛋白的大鼠骨髓瘤细胞YB2/0进行10％SDS-PAGE电泳并电转到硝酸纤维膜上，将此膜与2μg/mL PA21抗体室温孵育1h，1：4000稀释HRP-羊抗人IgG(北京中杉公司)和ECL发光试剂盒(美国Pierce公司)曝光于凝胶成像系统(Bio-Rad公司)。

结果如图3所示：抗CD47抗体与HL-60表达的CD47蛋白有特异性结合。

3)亲和力检测

根据CD47的等电点以及按照BiacoreX100control soft的protocol优化偶联条件，斜率优化选择醋酸钠作为偶联稀释缓冲液。用此缓冲液稀释CD47样品稀释至25μg/mL后偶联到CM5芯片上。预设偶联水平1500RU。然后用pH7.4的Running buffer稀释CD47样品，稀释一系列浓度至0nM、5nM、10nM 20nM、40nM、80nM。设置进样时间为180s，解离时间10min，再生缓冲液用50mMpH2.2Gly-HCl。按照BiacoreX100control soft的protocol进行上机测试。

亲和力检测结果如图4所示，KD值为3.362×10^-10M。

4)抗CD47抗体促进巨噬细胞吞噬作用的实验

分别将CD47阳性的人早幼粒白血病细胞HL-60和CD47阴性的大鼠骨髓瘤细胞YB2/0用CFSE标记后与小鼠骨髓来源的巨噬细胞以4：1的比例共培养(培养基中含有10μg/mL的抗CD47抗体，同时对照组含有对照抗体)，2h后用荧光显微镜观察计数每100个吞噬细胞中发生吞噬作用的细胞数，实验重复三次。

结果见图5所示：在抗CD47抗体存在时，巨噬细胞对HL-60细胞的吞噬作用明显增强，吞噬细胞百分比达到80％，余组未见明显的吞噬作用。

上述文中M为mol/L的含义。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种全人源抗CD47的全分子IgG抗体，包含轻链可变区和重链可变区，其特征在于，

(1)所述的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；

且(2)所述的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述的轻链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ ID NO.5，SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示；所述的重链可变区的三个抗原互补区CDR的氨基酸序列为SEQ IDNO.8，SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。

2.一种根据权利要求1所述的全人源抗CD47的全分子IgG抗体，包含轻链恒定区和重链恒定区，其特征在于，所述的轻链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.11所示，所述的重链恒定区的氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示。

3.一种DNA分子，其特征在于，其编码权利要求1或2所述的全分子IgG抗体。

4.根据权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，其编码轻链可变区的核酸序列为SEQIDNO.1所示，编码重链可变区的核酸序列为SEQ ID NO.2所示。

5.一种表达载体，其特征在于，包含有权利要求3所述的DNA分子以及与该DNA分子操作性相连的表达调控序列。

6.一种宿主细胞，其特征在于，被权利要求5所述的表达载体转化。

7.权利要求1或2所述全分子IgG抗体在制备与CD47相关的肿瘤的诊断试剂或治疗药物中的用途。

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