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MX2013005746A - Preparacion y/o formulacion de proteinas reticuladas con polisacaridos. - Google Patents

Preparacion y/o formulacion de proteinas reticuladas con polisacaridos.

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Publication number
MX2013005746A
MX2013005746A MX2013005746A MX2013005746A MX2013005746A MX 2013005746 A MX2013005746 A MX 2013005746A MX 2013005746 A MX2013005746 A MX 2013005746A MX 2013005746 A MX2013005746 A MX 2013005746A MX 2013005746 A MX2013005746 A MX 2013005746A
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MX
Mexico
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protein
composition
cross
residue
saccharide
Prior art date
Application number
MX2013005746A
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MX349070B (es
Inventor
Jens Sommer-Knudsen
Original Assignee
Elastagen Pty Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Elastagen Pty Ltd filed Critical Elastagen Pty Ltd
Publication of MX2013005746A publication Critical patent/MX2013005746A/es
Publication of MX349070B publication Critical patent/MX349070B/es

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Abstract

Se proporcionan las composiciones y/o formulaciones terapéuticas que contienen: al menos una matriz de proteína reticulada, en donde la al menos una matriz de proteína reticulada contiene al menos un residuo de proteína y al menos un residuo que contiene sacárido, y los métodos para producir éstas. La matriz de proteína reticulada puede obtenerse a partir de la reticulación de una proteína de longitud completa o de longitud considerablemente completa, como puede ser tropoelastina, elastina, albúmina, colágena, monómeros de colágena, inmunoglobulinas, insulina y/o derivados o combinaciones de éstas, con un sacárido que contenga un agente reticulador, como puede ser un agente reticulador polisacárido obtenido de, por ejemplo, ácido hialurónico o un derivado de celulosa. Las composiciones terapéuticas se pueden administrar por vía tópica o por inyección. La presente divulgación también proporciona los métodos, sistemas y/o kits para la preparación y/o formulación de las composiciones que se describen en la presente. (ver Fórmulas).

Description

PREPARACIÓN Y/O FORMULACIÓN DE PROTEÍNAS RETICULADAS CON POLI SACÁRI DOS REFERENCIA CRUZADA A LAS SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud se refiere a la Solicitud Provisional US: 61/3444,940, presentada el 23 noviembre 2010; la cual se incorpora en la presente para referencia en su totalidad .
CAMPO La presente divulgación se refiere a y puede ser aplicada a la preparación y/o formulación de proteínas reticuladas con polisacáridos .
ANTECEDENTE Los implantes inyectables actualmente se utilizan para abultar o aumentar tejidos en aplicaciones médicas que abarcan desde la reconstrucción de las cuerdas vocales, incontinencia fecal y urinaria, hasta los tratamientos estéticos para arrugas. Los implantes actuales se fabrican de una gama de materiales como puede ser ácido hialurónico, proteínas como colágena, polímeros como el poli ácido láctico y biomateriales como hidroxiapatita .
Por ejemplo, el ácido hialurónico ("HA") algunas veces mencionado como hialuronano o hialuronato, es un mucopolisacárido que se encuentra en, por ejemplo, liquido sinovial, como arbitrio, paredes de los vasos sanguíneos y cordón umbilical y en otros tejidos conectivos. El polisacáridos consiste en residuos N-acetil-D-glucosamina y ácido D-glucurónico alternantes unidos por enlaces ß-?-3-glucuronídico y ß-1-4-glucosaminídico alternantes. Los productos que contienen ácido hialurónico son reticulados utilizando una variedad de métodos como pueden ser, por ejemplo, químicos como BDDE y divinilsulfano . El ácido hialurónico reticular o luego se microniza para permitir administrarlo por inyección (por ejemplo Restilane® y Juvéderm®) . Los implantes de ácido hialurónico producen su efecto ajustando el tejido y reteniendo la humedad en el implante y son reabsorbidos lentamente por el cuerpo.
Otro ejemplo son los implantes a base de colágena que han sido basados en con la colágena extraída de tejidos animales o humanos, además han sido reticulados (por ejemplo, glutaraldehído (Zyplast®) o reticulaciones a base de ribosa (Evolence®) o homogeneizados y luego suspendidos en salina lista para implantación. Los implantes de colágena producen su efecto abultando el tejido en una forma semejante a los productos que contienen ácido hialurónico; no obstante, estos también permiten mayor infiltración celular hacia el implante y la producción de material colágena naciente.
Los abordajes que emplean polímeros como el poli ácido láctico (por ejemplo, Sculptra®) y biomateriales como hidroxiapatita (por ejemplo, Radiesse®) se han basado en la producción de una suspensión de material particulado en un gel inyectable, por lo regular un polisacárido como puede ser ácido hialurónico o carboximetil celulosa. Los implantes particulados producen su efecto induciendo una respuesta a cuerpo extraño frente a las partículas, lo cual da origen a la encapsulación de las partículas con fibroblastos y la producción de colágena - abultando el tejido mediante la acumulación de más tejido.
Un problema con los enfoques actuales para los agentes abultadores de tejido es que no permiten la entrega de biomateriales los cuales se basan en, o incorporan proteínas de longitud completa o proteínas de longitud casi completa. Las formulaciones que se basan en, o incorporan material proteína de longitud completa o de longitud casi completa, semejantes a los que se encuentran en estado natural en el cuerpo, tienden más a retener los niveles de biocompatibilidad y auto-reconocimiento deseables para muchas de las aplicaciones propuestas. El proceso de reticulación química por lo regular da origen a enlaces cruzados intramoleculares considerables los cuales pueden romper la estructura natural de la molécula; las técnicas de micronización u homogeneización que se utilizan para permitir inyectar el producto no conducen a mantener una estructura molecular proteínica de longitud completa o casi completa. Además, los agentes reticuladores químicos que se utilizan para reticular ácido hialurónico y proteínas tienen toxicidad conocida y pueden ocasionar irritación, inflamación o llevar riesgos cancerígenos.
La presente divulgación se dirige, en parte, a ofrecer formulaciones inyectables de biomateriales coherentes los cuales se basan en o derivan de proteínas, y permiten que los residuos de proteína incorporados retengan su estructura de longitud completa o casi completa, y también permiten a los residuos de proteína ser protegidos de la rápida resorción y/o degradación debida a, por ejemplo, proteólisis. Además, la presente divulgación se dirige, en parte, a biomateriales a base de, y derivados de, proteínas de longitud completa o de longitud casi completa, las cuales pueden manejarse para inyectarlas con aguja, retienen una estructura coherente, se reticulan suficientemente para la lenta resorción in vivo, o combinaciones de 'éstos. Además, la presente divulgación se dirige, en parte, a los biomateriales que están drásticamente desprovistos de agentes reticuladores químicos, tóxicos. La presente divulgación también ofrece, en parte, los métodos, sistemas y/o paquetes o Kits para la preparación y/o formulación de al menos una matriz de proteína reticulada, que contiene al menos un residuo de proteína y al menos un residuo de agente reticulador biomolécula, en donde al menos una molécula de proteína es reticuladas con al menos un agente reticulador biomolécula para formar la matriz de proteína reticulada. Además, la presente divulgación también proporciona, en parte, sistemas y/o Kits para la preparación y/o formulación de al menos una matriz de proteína reticulada, que consiste en al menos un residuo de proteína y al menos un residuo polisacárido, en donde las moléculas de proteína, como pueden ser las moléculas de proteína de longitud casi completa o las moléculas de proteína de longitud completa, son reticuladas con agentes reticuladores polisacáridos para formar la al menos una matriz de proteina reticuladas. Existe la necesidad de las composiciones, los métodos, sistemas y/o kits descritos en la presente .
COMPENDIO En ciertas modalidades, la composición inyectable puede ser al menos una matriz de proteina reticulada, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada consiste en: i) al menos un residuo de proteina; y ii) al menos un residuo reticulador que contenga sacárido.
En ciertas modalidades, la composición inyectable puede ser una composición considerablemente soluble en un medio acuoso y/o fisiológico. En ciertas modalidades, la composición indispensable puede ser prácticamente soluble, parcialmente soluble o prácticamente insoluble en un medio acuoso y/o fisiológico.
En ciertas modalidades, la composición inyectable puede contener al menos un residuo que contenga sacárido derivado de al menos una molécula reticuladora que contenga sacárido que pueda ser considerablemente biodisponible, considerablemente biodegradable, considerablemente bioabsorbible y/o considerablemente bioresorbible . En ciertos aspectos, el al menos un residuo que contiene sacárido puede contener al menos un residuo polisacárido, al menos un residuo oligosacárido o combinaciones de éstos. En ciertos aspectos, la composición inyectable puede contener al menos un polisacárido, en donde al menos un residuo polisacárido consiste en un residuo polisacárido de peso molecular bajo, medio y/ alto. En ciertos aspectos, la composición inyectable puede contener al menos un residuo polisacárido que tenga un peso molecular de entre 500 a aproximadamente 500,000 Dalton. En ciertos aspectos, la composición inyectable puede contener al menos un residuo que contenga sacárido, contener al menos un residuo polisacárido o al menos un residuo oligosacárido que contenga uno o más grupos funcionales con carga negativa y/o uno o más grupos funcionales con carga positiva. En ciertos aspectos, la composición inyectable puede contener al menos un residuo polisacárido polianiónico al menos un residuo oligosacárido polianiónico. En ciertos aspectos, la composición inyectable puede contener al menos un residuo polisacárido que se derive de, o contenga el residuo de ácido hialurónico, un derivado de celulosa, carboxicelulosa, carboximetil celulosa, hidroximetil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxipropil celulosa, carboximetil amilosa, goma de xantano, goma guar, a-glucano, ß-glucano, ß-1 , -glucano, ß-1 , 3-glucano, alginatos, carboximetil dextrano, un derivado de glucosaminoglucano, 6 sulfato de condroitina, sulfato de dermatina, heparina, sulfato de heparina o biomateriales como el poliácido láctico, poliácido glicólico, poliácido ( láctico-co-glicólico) , fosfato tricálcico, 1-hidroxiapatita y/o las sales aceptadas para uso farmacéutico, derivados y combinaciones de éstos. En ciertos aspectos, la composición inyectable puede contener al menos una matriz de proteínas reticuladas que contenga al menos un residuo que contenga sacárido en una concentración de aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 30%.
En ciertas modalidades, la composición inyectable puede tener al menos un residuo de proteína que se obtenga de o que contenga el residuo de una proteína de longitud completa. En ciertos aspectos, la composición inyectable puede contener al menos un residuo de proteína que contenga un residuo cadena lateral portador de amina, que contenga al menos un residuo de lisina y/o al menos un residuo de arginina. En ciertos aspectos, la composición inyectable puede tener al menos un residuo de proteína que se obtenga de o que contenga el residuo de tropoelastina, elastina, albúmina, colágena, monómeros de colágena, inmunoglobulinas , insulina y/o derivados o combinaciones de estos.
En ciertas modalidades, la composición inyectable puede contener al menos una matriz de proteina reticulada que pueda ser extruida a al menos o aproximadamente 10 cm. En ciertas modalidades, la composición inyectable es extrusionable . En ciertas modalidades, la composición inyectable es extrusionable a una longitud de entre aproximadamente 5 cm a aproximadamente 30 cm. En ciertas modalidades, la composición inyectable puede tener al menos una matriz de proteina reticulada que contenga aproximadamente o al menos alrededor de 25 mg/mL del residuo de proteina. En ciertas modalidades, la composición inyectable puede contener al menos una matriz de proteina reticulada que contenga entre aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 250 mg/mL del residuo de proteina.
En ciertas modalidades, la composición inyectable puede contener al menos una matriz de proteina reticulada que se prepara empleando: i) un agente activador y/o agente de acoplamiento o copulador; y ii) un agente modificador y/o agente de acoplamiento auxiliar; para formar uno o más enlaces y/o enlaces cruzados.
En ciertas modalidades, la composición inyectable puede emplearse para fines terapéuticos, que consisten en cirugía, estética, abultamiento de tejidos, para tratar incontinencia, en productos de reemplazo dérmico, dermatología, cirugía dermatológica, cirugía ocular, reumatología , farmacología y/o en el campo de la cosmética .
En ciertas modalidades, se describen los métodos de preparación de la composición, que consisten en reticular al menos una molécula de proteína con al menos una molécula reticuladora que contenga sacárido. En ciertas modalidades, los métodos de preparación de la composición consisten en: i) modificar moléculas que contengan al menos un sacárido para que contengan al menos un grupo químico reactivo que sea complementario a un grupo químico reactivo en la al menos una molécula de proteína, ; ii) combinar la molécula que contenga al menos un sacárido, modificada con la al menos una molécula de proteína; y iii) formar al menos un enlace entre la al menos una molécula de proteína y la molécula que contenga al menos un sacárido, modificada.
En ciertas modalidades, los métodos de preparación de la composición, consisten en: i) modificar la molécula que contenga al menos un sacárido para que contenga al menos un grupo químico reactivo; ii) combinar la molécula que contenga al menos un sacárido, modificada, con la al menos una molécula de proteína, en donde la al menos una molécula de proteína contenga al menos un grupo químico reactivo complementario con el grupo reactivo de la molécula que contenga al menos un sacárido, modificada; y iii) formar al menos un enlace covalente entre la al menos una molécula de proteína y la molécula que contenga al menos un sacárido, modificada.
En ciertos aspectos, la molécula que contenga al menos un sacárido, modificada, puede consistir en una molécula de polisacárido modificada que haya sido preparada uniendo al menos una porción que contenga un grupo ligador reactivo capaz de conjugarse a una molécula de proteína o molécula de proteina modificada durante la síntesis del polisacárido en fase sólida. En ciertos aspectos, la al menos una porción puede estar unida por un enlace covalente. Más aún, la al menos una porción puede consistir en un grupo separador. Además, el grupo separador puede consistir en un óxido de etileno polimerizado . El grupo separador también puede ser PEG o PEO.
En ciertas modalidades, el conjugado puede formarse con un enlace covalente. Además, en ciertas modalidades, el enlace covalente puede seleccionarse del grupo que consiste en: una amida, una oxima, una hidrazona, un sulfuro, un éter, una amina, como puede ser amina secundaria o terciaria, un éter de enol, un tioléter, un éster, un triazol y un disulfuro. En ciertos aspectos, el enlace covalente puede comprender una amida o una hidrazona .
En ciertas modalidades, los métodos que se describen pueden ser robustos, más eficientes, eficaces en función del costo, sencillo y/o combinaciones de estos.
En ciertas modalidades, la matriz de proteina reticulada puede contener uno o más residuos de proteina o residuos de proteina modificados. En ciertas modalidades, la matriz de proteina reticulada puede contener dos residuos de proteina o residuos de proteina modificados diferentes.
En ciertas modalidades, la matriz de proteina reticulada puede contener uno o más residuos polisacáridos o residuos polisacáridos modificados. En ciertas modalidades, la matriz de proteina reticulada puede contener dos residuos polisacáridos o residuos polisacáridos modificados diferentes.
En ciertas modalidades, la matriz de proteina reticulada puede ser una composición inyectable.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Los dibujos acompañantes facilitan la comprensión de las diversas modalidades de esta divulgación. Las modalidades ejemplares de los procesos, sistemas, kits, preparaciones, métodos, purificaciones o combinaciones de estos, ahora serán descritos con mayor detalle por medio de ejemplo solamente, con referencia a las figuras acompañantes, en las cuales: La FIG. 1 muestra, de acuerdo con ciertas modalidades, una estructura repetida ideal del ácido hialurónico. El ácido hialurónico es un polisacárido que consiste en unidades disacáridas de [1, 3] -ß-D-N-acetil-glucosamina del ácido ß-D-glucurónico, que contienen un grupo carboxilo por unidad disacárido, las cuales pueden ser activadas y reticuladas.
La FIG. 2 ilustra, de acuerdo con algunas modalidades, una reacción mediada por EDC y NHS con una molécula que contiene carboxilato (1) y una amina (2), las estructuras intermedias posibles ilustradas incluyen un éster de O-acilisourea y un intermedio éster NHS, formados a partir de un agente modificador, como puede ser N-hidroxisuccinimida (NHS), para formar un producto intermedio carboxilato activado con NHS capaz de reaccionar con un grupo amino primario (1) para formar un enlace amida.
La FIG. 3 muestra, de acuerdo con ciertas modalidades, una electroforesis en gel SDS PAGE de la proteína extraída de la formulación del Ejemplo 5 que fue macerada en PBS, y que contiene las siguientes franjas: Marcador (franja M) ; sobrenadante (franjas A y B) ; y TE puro (franja de TE) .
DESCRIPCIÓN DETALLADA Se proporciona la siguiente descripción respecto a las diversas modalidades las cuales pueden compartir características y peculiaridades comunes. Debe entenderse que una o más peculiaridades de una modalidad pueden combinarse con una o más peculiaridades de las otras modalidades. Además, una sola peculiaridad o combinación de peculiaridades en ciertas modalidades puede constituir modalidades adicionales.
En esta especificación, el término "que contiene" debe entenderse en su sentido "abierto", es decir, en el sentido de "que incluye", y de este modo no se limita a su sentido "cerrado", es decir, el sentido de "consiste únicamente en" . Un significado correspondiente ha de ser atribuido a los términos correspondientes "contiene", "compuesto" y "contiene" donde estos aparecen.
Los encabezados que se utilizan en la descripción detallada se incluyen solamente para facilitar la referencia del lector y no deben utilizarse para limitar el tema que se encuentra a lo largo de la divulgación o las reivindicaciones. Los encabezados no deben ser utilizados para interpretar el alcance de las reivindicaciones o las limitaciones de las cláusulas.
A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos que se utilizan en la presente tienen el mismo significado que el comúnmente comprendido por un experto en la técnica.
El término "activado" puede incluir una forma intermedia de una molécula que puede ser susceptible y/o vulnerable al ataque nucleofilico y/o la sustitución nucleofilica por un compuesto nucleofilico. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una molécula que contenga un grupo carboxilo, como puede ser una molécula que contenga un sacárido que contenga un grupo carboxilo, por ejemplo, un polisacárido que contenga un grupo carboxilo, puede ser activado cuando, por ejemplo, este sea tratado con un agente activador para formar un producto intermedio activado, como puede ser un éster activado, en donde el producto intermedio activado puede ser susceptible y/o vulnerable al ataque nucleofilico y/o la sustitución nucleofilica por un compuesto nucleofilico, como puede ser una amina, para formar un enlace entre la molécula que contiene el grupo carboxilo y el compuesto nucleofilico, como puede ser un enlace amida. En ciertas modalidades, una molécula que contiene hidroxilo, como puede ser una molécula que contiene sacárido que contiene un grupo hidroxilo, por ejemplo, un polisacárido que contenga un grupo hidroxilo, puede ser activado cuando, por ejemplo, se trate con un agente activador para formar un producto intermedio activado, como puede ser un grupo reactivo epoxi o halohidrina, en donde el producto intermedio activado puede ser capaz de reaccionar con un compuesto, como puede ser una amina, para formar un enlace entre la molécula que contiene un grupo hidroxilo y el compuesto, como puede ser un enlace amina secundaria o terciaria.
El término "aminoácido" puede referirse a los o¡-aminoácidos los cuales son racémicos, o de la configuración D- o L-. En ciertas modalidades, un aminoácido puede ser un aminoácido natural o un aminoácido no natural, como pueden ser un aminoácido obtenido por métodos sintéticos, no natural. La denominación "d" que antecede a la denominación de un aminoácido (p. ej . , dAla, dSer, dVal, etc.) se refiere al isómero D del aminoácido. La denominación "di" que precede a la designación de un aminoácido (p. ej . , dlSer) se refiere a una mezcla de los isómeros L- y D- del aminoácido .
El término sustancia "biocompatible" , puede incluir la capacidad de un material para funcionar con una respuesta apropiada del hospedero en un caso especifico, por ejemplo, uno que no tenga efectos tóxicos o nocivos inaceptables para uso médico en la función biológica.
El término "biocon ugado" puede referirse a un conjugado obtenido de al menos dos biomoléculas , a partir de al menos dos biopolímeros, o de al menos una biomolécula y al menos otro biopolímero. El bioconjugado también puede incluir un conjugado obtenido de tres o más biomoléculas, biopolímeros y/o combinaciones de estos, de modo que al menos una de las biomoléculas y/o biopolimeros se conjugue con más de una biomolécula y/o biopolímero, teniendo con ello enlaces cruzados intermoleculares . El bioconjugado también puede incluir uno o más enlaces entre componentes individuales que hayan sido conjugados, como puede ser un enlace cruzado intramolecular. En ciertas modalidades, el bioconjugado puede tener uno o más enlaces cruzados intermoleculares, por ejemplo, el bioconjugado puede se reticulado o tener enlaces cruzados intermoleculares solamente o puede ser reticulado o tener enlaces cruzados considerable o principalmente intermoleculares. En ciertas modalidades, el bioconjugado puede tener uno o más enlaces cruzados intramoleculares, por ejemplo, el bioconjugado puede ser reticulado o tener enlaces cruzados solamente intramoleculares, o puede ser reticulado o tener enlaces cruzados considerable o principalmente intramoleculares. En ciertas modalidades, el bioconjugado puede tener enlaces cruzados intermoleculares y enlaces cruzados intramoleculares. El bioconjugado puede también incluir uno o más grupos separadores entre uno o más enlaces uniendo el uno o más componentes individuales, o el grupo separador puede estar entre el componente individual y el enlace. Por ejemplo, el grupo separador puede incluir, más no se limita a, una porción óxido de etileno, un polímero formado a partir de porciones -(-CH2-CH2 -)-repetidas, polietilen glicol (PEG) , polióxido de etileno (PEO) y/o derivados de éstos.
El término "biomolécula" puede referirse a un compuesto que se encuentre en la naturaleza, un derivado de un compuesto que se encuentre en la naturaleza (es decir, una molécula natural) , un análogo modificado por métodos sintéticos de un compuesto que se encuentre en la naturaleza, un análogo manipulado por métodos genéticos de un compuesto que se encuentre en la naturaleza o un análogo manipulado por métodos genéticos, modificado de un compuesto que se encuentre en la naturaleza. Por ejemplo, una biomolécula puede ser, más no se limita a, un aminoácido, péptido, péptido bio-activo, péptido manipulado por métodos genéticos, proteína, glicoproteína, proteína bio-activa, proteína parcialmente digerida, proteína en su forma pro-activa, proteína manipulada por métodos genéticos, enzima, anticuerpo, anticuerpo manipulado por métodos genéticos, sacárido, disacárido, trisacárido, oligosacárido, polisacárido, oligonucleótido, RNA, DNA, péptido-ácido nucleico (PNA), antígeno, oligosacárido, sustrato para una enzima, sustrato para un receptor nuclear y/o derivados o combinaciones de estos.
El término "biopolimero" puede referirse a un compuesto que se encuentre en la naturaleza, un derivado de un compuesto que se encuentre en la naturaleza, un análogo modificado por métodos sintéticos de un compuesto que se encuentre en la naturaleza, un análogo manipulado por métodos genéticos de un compuesto que se encuentre en la naturaleza, un análogo manipulado por métodos genéticos, modificado, de un compuesto que se encuentre en la naturaleza, en donde el biopolimero puede estar constituido de unidades monoméricas. Por ejemplo, los biopolimeros pueden incluir, más no se limitan a, péptidos, péptido-ácidos nucleicos (los ???) , oligonucleótidos , RNA, DNA, proteínas, enzimas, anticuerpos, glicoproteínas, trisacáridos, oligosacáridos , polisacáridos y/o derivados de estos. En ciertas modalidades, el biopolimero puede ser lineal o ramificado o puede ser de diseño tridimensional específico, como puede ser una estructura de estrella (starburst) o estructura tipo matriz. Los ejemplos de las unidades monoméricas pueden ser, más no se limitan a, aminoácidos, derivados de aminoácidos, monosacáridos , disacáridos, trisacáridos, derivados de azúcar, monómeros PNA, nucleótidos, nucleósidos y/o derivados o combinaciones de los anteriores.
En ciertas modalidades, los compuestos que se proporcionan en la presente pueden contener centros quirales. Tales centros quirales pueden ser de configuración (R) o (S) , o pueden ser mezclas de estos. Por ejemplo, los compuestos que se proporcionan en la presente pueden ser enantiómeros puros, diasterómeros puros o estereoisómeros puros. En ciertas modalidades, los compuestos que se proporcionan en la presente pueden ser mezclas estereoisoméricas o mezclas diasteroméricas . Por ejemplo, en el caso de los residuos de aminoácidos, cada residuo puede ser de forma L o D. Por ejemplo, la configuración preferida de los residuos de aminoácidos naturales es L.
El término "grupos reactivos complementarios" representa aquellos grupos que, cuando reaccionan entre si, forman un enlace covalente. Por ejemplo, un grupo reactivo amino puede referirse a una porción que puede reaccionar directamente con la porción que contiene el amino reactivo para formar un enlace amida o un enlace amina. Por ejemplo, un grupo reactivo tiol puede referirse a una porción que puede reaccionar directamente con un grupo que contenga sulfhidrilo reactivo para formar un enlace sulfuro estable. Por ejemplo, un grupo amino puede ser complementario con un derivado carboxilo.
Por ejemplo, un grupo amino puede ser complementario a un derivado hidroxilo. Por ejemplo, un grupo hidrazino puede ser complementario para un derivador carbonilo. Por ejemplo, un grupo oxiamino también puede ser complementario a un derivado carbonilo.
El término "conjugado" puede representar un compuesto que contenga al menos dos o más componentes que se liguen entre si, como puede ser al menos dos o más biomoléculas y/o biopolimeros que se unan entre si. Cada uno de los componentes puede ligarse entre si directamente a través de uno o más enlaces covalentes, uno o más enlaces iónicos, por quelación y/o mezclas o combinaciones de estos enlaces. En ciertas modalidades, el conjugado puede contener enlaces directos entre cada uno de los componentes, como puede ser enlaces iónicos o enlaces covalentes, por ejemplo, enlaces amida, directamente uniendo las al menos dos o más biomoléculas y/o biopolimeros entre si. Por ejemplo, el conjugado puede tener un primer componente, como puede ser una proteina, que puede estar ligada directamente a través de uno o más enlaces covalentes a un segundo componente, como puede ser un polisacárido, para formar un conjugado, p. ej . , un conjugado proteina-polisacárido . En ciertas modalidades, el conjugado puede tener un grupo separador entre cada uno de los componentes, en donde el conjugado contiene al menos dos enlaces a través del grupo separador para unir a cada uno de los dos componentes entre si. Por ejemplo, una primera biomolécula puede formar un primer enlace con un grupo separador y una segunda biomolécula puede formar un segundo enlace con el grupo separador. El conjugado puede incluir uno o más grupos separadores entre el uno o más enlaces que unen los dos o más componentes individuales entre si, o puede estar entre cada componente y el enlace. Por ejemplo, el grupo separador puede incluir, más no se limita a, una porción glicol, una porción óxido de etileno, un polímero formado a partir de porciones repetidas de - (-CH2-CH2-O-) -, como puede ser polietilen glicol (PEG) , o polióxido de etileno (PEO), una poliamina, un poliol y/o derivados o combinaciones de estos.
El término "matriz de proteína reticulada" puede referirse a uno o más residuos de proteína que contengan al menos uno o más enlaces cruzados a al menos uno o más residuos de la molécula, como puede ser uno o más residuos de biomoléculas y/o uno o más residuos de biopolímero o derivados o combinaciones de estos.
El término "residuo" puede referirse a aquella parte del material molecular o material molecular residual que queda en un producto de reacción. Por ejemplo, la porción del material molecular proteina que queda en un producto de reacción, como puede ser un producto reticulado derivado de la reacción de una molécula de proteina y un agente reticulador, se denomina un residuo de proteina. Por ejemplo, la porción de un material molecular que contenga sacárido que queda en un producto de reacción, como puede ser un producto reticulado derivado de la reacción de una molécula que contenga sacárido y una molécula de proteina, se denomina un residuo que contiene sacárido .
Los términos "aguja fina" o "aguja de calibre fino" o "inyección con aguja fina" pueden referirse a, más no se limitan a, el uso de una aguja de un tamaño de aproximadamente 25G o más pequeño. En ciertas aplicaciones también es posible utilizar agujas de calibre más ancho como se menciona en otra parte de la presente .
El término "ácido hialurónico" o "HA" puede incluir ácido hialurónico y cualquiera de sus sales hialuronato, como pueden ser, por ejemplo, hialuronato de sodio (la sal sódica) , hialuronato de potasio, hialuronato de magnesio y hialuronato de calcio. Es posible utilizar en la presente ácido hialurónico de diversos orígenes. Por ejemplo, el ácido hialurónico puede ser extraído de tejidos animales, puede ser cosechado como producto de la fermentación bacteriana, o puede ser producido en cantidades comerciales por tecnología de bioprocesos.
El término "enlace" puede referirse a la conexión o unión entre dos componentes moleculares individuales que se unen entre sí. En ciertas modalidades, los componentes moleculares individuales que pueden unirse entre sí pueden ser, más no se limitan a, biopolímeros , biopolímeros modificados, como pueden ser los biopolímeros modificados por métodos biológicos y/o sintéticos, biomoléculas , biomoléculas modificadas, como puede ser las biomoléculas modificadas por métodos biológicos y/o sintéticos. Por ejemplo, la conexión o unión entre dos biomoléculas, entre una biomolécula y un grupo separador, entre dos biopolímeros, entre un biopolímero y un grupo separador, entre dos moléculas modificadas, y/o derivados o combinaciones de estos. En ciertas modalidades, el enlace puede ser estable a la termólisis o a la hidrólisis o a ambos. En ciertas modalidades, el enlace puede ser biocompatible . En ciertas modalidades, el enlace se puede hacer mediante la formación de una unión covalente, una unión iónica y/o combinaciones de estas. Por ejemplo, el enlace puede hacerse mediante la formación de una combinación de uno o más enlaces covalentes y/o uno o más enlaces iónicos. En ciertas modalidades, el enlace covalente puede incluir, más no se limita a, la formación de un enlace amida, un enlace oxima, un enlace hidrazona, un enlace triazol, un enlace sulfuro, un enlace éter, un enlace amina, como puede ser un enlace amina secundaria o terciaria, un enlace enol éter, un enlace éster, un enlace disulfuro o mezclas de estos. En ciertas modalidades, el enlace amida puede formarse, por ejemplo, entre un grupo ácido carboxilico y una porción ácido carboxilico activada de una biomolécula que contenga sacárido y un grupo amina de una biomolécula que contenga aminoácido, como puede ser una proteina, por ejemplo, una proteina que contenga un residuo de lisina. Por ejemplo, en ciertas modalidades, el enlace amida puede ser entre, por ejemplo, una biomolécula que contenga una porción sacárido modificada, como puede ser una porción polisacárido modificada con un grupo separador, y una biomolécula que contenga una porción aminoácido, como puede ser una proteina. En ciertas modalidades', el enlace amida puede ser entre, por ejemplo, una biomolécula que contenga una porción sacárido y una biomolécula que contenga una porción aminoácido modificada, como puede ser proteina modificada con un grupo separador.
El término "modificado" puede referirse a una modificación de una molécula y/o una porción de una molécula, como puede ser una biomolécula o un biopolimero, por procesos naturales, modificaciones químicas sintéticas, bio-manipulación o similares, y/o combinaciones o variaciones de estos. En ciertas modalidades, la molécula y/o porción de la molécula puede ser modificada mediante la transformación de una porción ya existente en la molécula, como puede ser por procesos de transformación química sintética y/o por procesos naturales, la unión de una porción adicional y/o combinaciones o variaciones de estos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la unión de una porción sobre la molécula puede ser mediante la formación de un enlace covalente. En ciertas modalidades, por ejemplo, la molécula modificada que contenga una porción transformada, puede ser capaz o más capaz de reaccionar con un grupo reactivo complementario para formar un enlace, un enlace cruzado y/o combinaciones o derivados de estos. En ciertas modalidades, por ejemplo, la molécula modificada que contenga una porción unida, puede ser capaz o más capaz de reaccionar con un grupo reactivo complementario para formar un enlace, enlace cruzado y/o combinaciones o derivados de estos. En ciertas modalidades, la molécula modificada que contenga la porción transformada y/o unida, puede incluir, por ejemplo, un grupo reactivo, un grupo enlazable, un grupo separador, un grupo reactivo complementario, y/o combinaciones o derivados de estos. En ciertas modalidades, la molécula modificada que contenga la porción transformada y/o unida, puede tener una porción, como puede ser un grupo reactivo, que puede formarse y/o desprotegerse por modificaciones químicas sintéticas o por procesos naturales disponibles para reaccionar para formar un enlace o enlace cruzado, por ejemplo, reaccionando con un grupo reactivo complementario. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la molécula modificada puede obtenerse activando un grupo químico, como puede ser un grupo carboxilo, uniendo un grupo separador, desprotegiendo una porción reactiva y/o combinaciones o variaciones de estas.
El término "mol" o "concentración molar (M) " de los polisacáridos , cuando se utilizan en la presente, se refieren a las moles de la unidad monomérica repetida contenida en el polímero.
El término "polisacárido" puede incluir, por ejemplo, una molécula que contenga sacárido que contenga al menos tres residuos sacáridos, por ejemplo, al menos tres unidades repetidas de los monómeros sacáridos, como pueden ser al menos tres unidades repetidas monosacáridas , al menos tres unidades repetidas disacáridos, al menos tres unidades repetidas trisacárido, al menos tres unidades repetidas oligosacárido y/o combinaciones o derivados de estos. En ciertas modalidades, un polisacárido puede contener residuos sacáridos iguales y/o diferentes, por ejemplo, uno o más de los residuos sacáridos iguales y/o diferentes, dos o más de los residuos sacáridos iguales y/o diferentes, tres o más de los residuos sacáridos iguales y/o diferentes y/o combinaciones o derivados de estos .
El término "molécula gue contiene sacárido" puede incluir, por ejemplo, una molécula que contenga un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un oligosacárido, y/o un polisacárido. En ciertas modalidades, por ejemplo, la molécula que contiene sacárido puede contener una unidad repetida monomérica que puede consistir en un monosacárido, un disacárido, un trisacárido, un oligosacárido o a polisacárido. En ciertas modalidades, la molécula que contiene sacárido puede tener una o más de las mismas o diferentes unidades repetidas monómeros sacáridos, por ejemplo, la molécula que contenga sacárido puede tener una o más de las mismas o diferentes unidades repetidas monómeros disacárido, trisacárido, oligosacárido y/o polisacárido .
En ciertas modalidades, el residuo que contiene sacárido puede obtenerse a partir de un oligosacárido, oligosacárido modificado, polisacárido, polisacárido modificado y/o derivados de estos, o puede obtenerse a partir de una molécula reticuladora que contenga sacárido, por ejemplo, un reticulador oligosacárido, reticulador oligosacárido modificado, reticulador polisacárido, reticulador polisacárido modificado y/o derivados de estos.
El término "proteína" o "unidad proteína" o "monómero de proteína" puede incluir, por ejemplo, una proteína de longitud completa, una proteína de longitud prácticamente completa, un fragmento de proteína, una proteína bioactiva, un fragmento de proteína bioactiva, una prot-eína en forma proactiva, una proteína inactiva, una proteína que contenga un sitio activo, una proteína que contenga un sitio de unión, una proteína que contenga un sitio de desdoblamiento proteolítico, una proteína parcialmente digerida, una proteína parcialmente hidrolizada, una proteína que contenga una o más mutaciones de un solo punto, una proteina que contenga aproximadamente 50 hasta aproximadamente 99.99% de proteina de longitud completa, una proteina que contenga la conservación de aproximadamente 50% hasta aproximadamente 99.99% de los aminoácidos de la proteina de longitud completa. En ciertas modalidades, la proteina puede incluir, por ejemplo, un péptido que contenga al menos una secuencia peptidica bioactiva, un péptido que contenga al menos un sitio de unión al receptor, un péptido que contenga al menos un sitio de desdoblamiento proteolitico, un oligopéptido, un polipéptido y/o combinaciones o derivados de estos.
En ciertas modalidades, la proteina puede incluir, por ejemplo, una proteina que contenga al menos un residuo de lisina, al menos un residuo de arginina, al menos un residuo de cisteina, al menos un residuo de serina, al menos un residuo de treonina, al menos un residuo de tirosina, al menos un residuo de glutamato, al menos un residuo de aspartato, al menos un residuo de prolina y/o combinaciones o derivados de estos. En ciertas modalidades, la proteina puede incluir, por ejemplo, una proteina que contenga al menos un residuo dimérico, como puede ser al menos un residuo de cisteina.
En ciertas modalidades, la proteina puede incluir, por ejemplo, una proteína que contenga al menos un grupo amino, una proteína que contenga al menos una cadena lateral portadora de amina, una proteína que contenga al menos un residuo de aminoácido portador de amina, como puede ser una proteína que contenga al menos un residuo de lisina, una proteína que contenga al menos un residuo de arginina y/o combinaciones o derivados de estos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la proteína puede consistir en una proteína que contenga una región rica en amina, como puede ser una región rica en lisina o una región rica en arginina y/o combinaciones o derivados de estos. En ciertas modalidades, la proteína puede incluir, por ejemplo, una poli ( residuos de amina) proteína, como puede ser polilisina, poliarginina y/o combinaciones o derivados de estos.
En ciertas modalidades, una proteína puede incluir homopolímeros o copolímeros, por ejemplo, homopolímeros o copolímeros de residuos de aminoácidos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la proteína puede consistir en un homopolímero o copolímero de residuos de lisina, residuos de arginina y/o residuos de histidina, como puede ser una proteína que contenga una región rica en lisina. En ciertas modalidades, por ejemplo, la proteína que contenga una región rica en lisina puede tener al menos dos unidades de lisina, como puede ser que contenga una región de polilisina, por ejemplo, que contenga al menos 5 unidades de lisina. En ciertas modalidades, por ejemplo, la proteína que contenga una región rica en arginina puede tener al menos dos unidades arginina, como puede ser que contenga una región de poliarginina, por ejemplo, que contenga al menos 5 unidades de arginina. En ciertas modalidades, la [lacuna] puede tener al menos dos diferentes regiones ricas en residuos, por ejemplo, una proteína que contenga al menos una región rica en lisina y al menos una región rica en arginina y/o combinaciones o derivados de estas. En ciertas modalidades, la proteína puede ser, más no se limitan a, tropoelastina, elastina, albúmina, colágena, monómeros de colágena, inmunoglobulinas , insulina y/o derivados o combinaciones de estos.
En ciertas modalidades, una proteína puede incluir una proteína modificada o derivado de proteína. En ciertas modalidades, por ejemplo, una proteína modificada o derivado de proteína puede ser una proteína preparada a partir de y/o derivada de o por procesos naturales, modificación química sintética y/o combinaciones de estos. En ciertas modalidades, por ejemplo, una proteína modificada o derivado de proteina puede ser una proteina preparada a partir de y/o derivada de o preparada por procesos naturales, como pueden ser los que ocurren en células eucariotas, células procariotas y/o combinaciones de estos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, los procesos naturales pueden ser síntesis de proteínas, degradación de proteínas, hidrólisis, procesamiento y/o conjugación enzimática, oxidación, reducción, glicosilación, aminación, carboxilación, incorporación de un residuo de aminoácido o un grupo separador (algunas veces denominado un grupo ligador) , la modificación y/o derivación de un residuo de aminoácido o grupo separador, y/o combinaciones o variaciones de estos. En ciertas modalidades, por ejemplo, una proteína modificada o derivado de proteína puede ser una proteína que se prepare a partir de y/o derivada de o que se prepare por modificación química sintética. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la modificación química sintética puede ser, oxidación, reducción, conjugación, hidrólisis, aminación, esterificación, amidación, aminación reductiva, activación del grupo carboxilo, modificación del grupo carboxilo, incorporación de un residuo de aminoácido o grupo separador (en ocasiones denominado un grupo ligador) , modificación y/o derivación de un residuo de aminoácido o grupo separador, y/o combinaciones de estos.
En ciertas modalidades, la proteina modificada o derivado de proteina puede ser preparada por síntesis en fase sólida, síntesis en fase en solución y/o combinaciones de estas. En ciertas modalidades, una proteina modificada o derivado de proteína puede ser preparada a partir de una proteína que contenga una región rica en residuos de aminoácidos portadores del grupo amina, como puede ser una región rica en lisina.
En ciertas modalidades, el residuo de proteína puede obtenerse a partir de una proteína y/o derivado de ésta, como ya se describió.
El término "grupo separador" puede incluir, por ejemplo, una porción que enlace uno o más componentes individuales, como puede ser la unión de una proteína y un polisacárido .
El término "molécula sintética" puede referirse a una molécula pequeña o un polímero que no se obtenga en forma natural. Por ejemplo, una molécula sintética puede ser preparada por modificación química a través de la síntesis en fase sólida, síntesis en fase en solución, o combinaciones de estas.
Algunas modalidades proporcionan los métodos para modificar o derivar una molécula que contenga sacárido, como puede ser un polisacárido, con un grupo químico que pueda formar un enlace covalente cuando se combina con una proteina. El polisacárido puede ser modificado en una forma que le permita permanecer soluble, o suficientemente soluble en agua y/o solución salina. La mayor parte de los reactantes que quedan después de la modificación del polisacárido se eliminan mediante, p. e . , precipitación o filtración. La molécula que contiene sacárido, modificada, como puede ser un polisacárido, entonces puede utilizarse como el agente reticulador. Una solución del polisacárido modificado puede entonces ser mezclada con la proteína o proteínas necesarias y se puede dejar reaccionar. Los grupos químicos modificados en el polisacárido modificado reaccionan con la proteína para formar los biomateriales . Los biomateriales que se producen de este modo tienen algunas propiedades específicas cuando se comparan con biomateriales producidos utilizando los métodos tradicionales. Por ejemplo, las formulaciones que se producen a partir de proteínas reticuladas empleando sustancias químicas que ocasionan los enlaces cruzados intra-moleculares por lo regular son opacas y muchas veces de color blanco con tinte de amarillo o café. Las formulaciones que se obtienen con ciertos métodos descritos son formulaciones incoloras, transparentes. Más aún, las proteínas reticuladas con sustancias químicas, p. ej . , glutaraldehído, pueden tener sustancias químicas residuales que quedan en la formulación las cuales pueden causar inflamación in vivo y/o reducir la biocompatibilidad del producto. Las formulaciones que se obtienen con ciertos métodos descritos están prácticamente desprovistas de cualquiera de tales sustancias químicas residuales.
Las formulaciones que se producen utilizando reticuladores químicos o moléculas reticuladoras cortas muchas veces dan lugar a biomateriales que necesitan ser micronizados u homogeneizados para permitir su entrega utilizando jeringas o agujas; o, requieren que el nivel de reticulación se mantenga en un nivel mínimo para permitir la extrusión de la aguja. Las proteínas reticuladas con sustancias químicas, p. ej . , glutaraldehído, que son demasiado densamente reticuladas no pueden ser extruídas a través de agujas de calibre fino .
Las formulaciones preparadas utilizando ciertos métodos descritos pueden ser extruídas a través de agujas de calibre fino sin otro procesamiento, o prácticamente sin otro procesamiento. Algunas formulaciones descritas conservan suficiente cohesividad aún después de la extrusión de la aguja de modo que hebras suficientemente largas de material pueden ser extruidas de la aguja sin romper el material (p. ej . , >10 cm, >12 cm, >15 cm, >18 cm, >20 cm, etc.) . Más aún, utilizando algunas modalidades descritas en la presente, las formulaciones a base de proteínas de longitud completa y que utilizan un polisacárido modificado como agente reticulador producen una estructura de matriz flexible que puede producir biomateriales muy firmes que todavía conservan suficiente flexibilidad para permitir la eyección a través de las agujas de calibre fino.
Matriz de proteína reticulada La matriz de proteína reticulada puede variar en las modalidades descritas.
Por ejemplo, la matriz de proteína reticulada puede obtenerse a partir de la reticulación de una o más moléculas de proteína, como puede ser una o más proteínas de longitud completa, con una o más moléculas que contengan sacáridos, como puede ser una o más moléculas que contengan sacárido modificadas.
Por ejemplo, la matriz de proteina reticulada puede tener uno o más residuos de proteina que estén reticulados con uno o más residuos que contenqan sacárido, como puede ser una proteina con sacárido unidos por enlaces cruzados, una proteina con disacárido unidos por enlaces cruzados, una proteina con trisacárido unidos por enlaces cruzados, una proteina con oligosacárido unidos por enlaces cruzados o una proteina con polisacárido unidos por enlaces cruzados.
La matriz de proteina unida por enlaces cruzados o reticulada puede incluir, por ejemplo, uno o más enlaces entre uno o más residuos de proteina a través de uno o más enlaces a uno o más residuos de polisacárido, por ejemplo, uno o más residuos de proteina pueden estar conectados o ligadcs entre si a través de uno o más enlaces a uno o más residuos que contengan sacárido. La matriz de proteina reticulada puede incluir, por ejemplo, al menos un residuo de proteina ligado a al menos un residuo que contenga sacárido, como puede ser un residuo oligosacárido o un residuo polisacárido, mediante uno o más enlaces covalentes y/o uno o más enlaces iónicos, o combinaciones de estos.
La matriz de proteina reticulada puede incluir, por ejemplo, enlaces, es decir, uno o más enlaces cruzados, por ejemplo, uno o más enlaces cruzados intermoleculares y/o uno o más enlaces cruzados intramolecular o mezclas o combinaciones de estos. La matriz de proteina reticulada puede estar unida por enlaces cruzados intermoleculares, por enlaces cruzados considerablemente intermoleculares, por enlaces cruzados intramoleculares, por enlaces cruzados considerablemente intramoleculares y/o por enlaces cruzados intermoleculares e intramoleculares. La matriz de proteina reticulada o que se une por enlaces cruzados puede obtener a partir de uno o más agentes reticuladores o formadores de enlaces cruzados, como pueden ser un reticular que contenga sacárido, por ejemplo, un polisacárido o polisacárido modificado, como puede ser ácido hialurónico o ácido hialurónico modificado. Por ejemplo, la matriz de proteina reticulada puede obtenerse a partir de uno o más agentes reticuladores, y el uno o más agentes reticuladores puede unirse y/o reticularse a una o más moléculas de proteina y/o formar uno o más enlaces a la misma molécula de proteina. Por ejemplo, la matriz de proteina reticulada puede consistir en una estructura de matriz, por ejemplo, una matriz de residuos de proteina unidos y/o reticulados a uno o más residuos reticuladores o formadores de enlaces cruzados que contengan sacárido. La estructura de una matriz de proteina reticulada puede proporcionar flexibilidad, en donde el grado de reticulación dentro de la matriz de proteína reticulada puede alterar la flexibilidad proporcionada.
En ciertas modalidades, el uso de una matriz de proteína reticulada obtenida a partir de una proteína de longitud completa prácticamente desprovista de enlaces cruzados intramoleculares, como se describe en la presente, puede dar lugar a una formulación que sea más compatible con el tejido, que mejore el crecimiento interno del tejido, que mejore el nuevo crecimiento de tejido o combinaciones de estos. Tal formulación también puede ser remodelada en estructuras más comunes y deseables y/o puede ser incorporada en el nuevo tejido.
En algunas modalidades, el uso de una matriz de proteína reticulada obtenida a partir de una proteína de longitud prácticamente completa considerablemente desprovista de enlaces cruzados intramoleculares descrita en la presente puede dar lugar a una formulación que sea más compatible con el tejido, que mejore el crecimiento interno del tejido, que mejore el nuevo crecimiento de tejido o combinaciones de estos. Tal formulación también puede ser remodelada en estructuras más comunes y deseables y/o incorporada en el nuevo tejido.
Otras modalidades descritas en la presente pueden tener un cierto grado de reticulación o enlaces cruzados intramoleculares en el residuo de proteína de la matriz de proteína reticulada y todavía proporcionar suficientes propiedades para que sea aceptable para su uso.
En algunas modalidades, el uso de una matriz de proteína reticulada obtenida a partir de una proteína prácticamente de longi.tud completa en donde la estructura del residuo de proteína no esté considerablemente enmascarado por el proceso de reticulación puede dar lugar a una formulación que sea más compatible con el tejido, que mejore el crecimiento interno del tejido, que mejore el nuevo crecimiento de tejido o combinaciones de estos. Tal formulación también puede ser remodelada en estructuras más comunes y deseables y/o incorporada en el nuevo tejido.
Grado de reticulación En ciertas modalidades, la solubilidad del agente reticulador que contiene sacárido, como puede ser un agente reticulador polisacárido, puede mantenerse utilizando una proporción específica de reactivos químicos utilizados durante la modificación, derivación y/o el manejo del polisacárido. En ciertas modalidades, para garantizar que el polisacárido derivado no se retícula consigo mismo, puede ser necesario tener algunas precauciones durante el proceso posterior a la derivación. Por ejemplo, puede ser necesario que el HA derivado sea procesado razonablemente rápido después de que precipite para lavar los reactantes remanentes. En algunas modalidades, la precipitación del HA derivado, el lavado de los reactantes y la re-suspensión en una solución acuosa puede llevarse a cabo en aproximadamente 30 minutos. Es posible emplear otros periodos temporales dependiendo de la situación específica. Por ejemplo, la precipitación del HA derivado, el lavado de los reactantes y la re-suspensión en una solución acuosa se puede llevar a cabo en al menos 20, 30 40, 50 minutos, 1 hora o 2 horas.
En algunas modalidades, también puede ser útil además dividir el HA derivado, precipitado en piezas más pequeñas antes de la disolución con el fin de aumentar la velocidad de disolución la cual puede tardar varias horas, por ejemplo, al menos 1, 2, o 3 horas. Una vez disuelto, puede ser deseable, en algunas aplicaciones, utilizar el polisacárido derivado en un cierto periodo de tiempo, por ejemplo, en el lapso de al menos 1, 2, 3, 4 o 24 horas. Sin embargo, lo anterior puede no ser necesario y dependerá de la formulación y/o aplicación particular .
En ciertas modalidades, la molécula de proteina utilizada para formar la matriz de proteina reticulada en la formulación puede ser limitada por el requisito de los grupos reactivos adecuados para permitirle que sea reticulada por el agente reticulador polisacárido .
En ciertas modalidades, al menos o aproximadamente 50% del monómero de proteina puede ser reticulado con una biomolécula y/o biopolimero, como puede ser una molécula que contenga sacárido, por ejemplo, un oligosacárido, polisacárido, o derivados de estos. En otras modalidades, al menos o aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 90%, 95%, 98% o 99% del monómero de proteina puede estar reticulado con una biomolécula y/o biopolimero o derivados de estas. En ciertas modalidades, el monómero de proteina puede estar práctica o completamente reticulado con una biomolécula y/o biopolimero.
En ciertas modalidades, el número de enlaces cruzados por sitios para reticulación posibles por polisacárido puede ser al menos 0.5%, 1%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35% o 50%.
En ciertas modalidades, el número de unidades de proteina o monómeros de proteína que no se incorpore en la matriz o complejo de proteina reticulada y que se quedan sin unirse pueden ser al menos 1, 3, 5, 7, 9, 10%, 15% o 20%. Es deseable en ciertas aplicaciones llevar al mínimo el porcentaje de unidades de proteína que quedan sin unirse después de la formación de la matriz o complejo de proteína reticulada. Por ejemplo, en ciertas aplicaciones pude ser deseable tener en la formulación menos de 20%, 15%, 10%, 7%, 5%, 3%, o 1% de las unidades de proteína no unidas después de la reticulación. La ausencia de unidades de proteína o monómeros de proteína no unidos es uno de los beneficios de ciertas aplicaciones de la presente divulgación.
Los porcentajes pueden depender de diversos aspectos, como pueden ser, más no se limitan a, la proteína elegida y el tipo de sustancias químicas elegidas para la aplicación específica. Por ejemplo, para enlaces de tropoelastina y lisina, el número potencial de sitios en algunas aplicaciones por lo regular es alrededor de 30 hasta alrededor de 35, de modo que la proporción podría ser desde 1-35 (o aproximadamente 3% hasta 100%) . Con respecto a esta combinación, los porcentajes preferidos para la matriz de proteína reticulada puede ser al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 99% del número posible de sitios sobre la una o más moléculas de proteina sean reticulados con una o más biomoléculas y/o biopolímeros, como puede ser moléculas que contengan sacárido, o derivados de estas.
Otro aspecto es la longitud de la molécula que contiene sacárido, como puede ser un polisacárido, y las sustancias químicas que se utilicen para la activación, derivación o modificación. Por ejemplo, en ciertas aplicaciones 1 a 30%, 1 a 40%, 3 a 30%, o 5 a 30% del uno o más grupos ácido carboxílico sobre un grupo carboxilo [sic] en el oligosacárido o polisacárido puede ser activado con un agente activador, como puede ser NHS para formar 1 a 30%, 1 a 40%, 3 a 30%, o 5 a 30% sitios ésteres activados que estén disponibles para la reticulación con la proteína. Por ejemplo, en ciertas aplicaciones 1 a 30%, 1 a 50%, 3 a 30%, o 5 a 30% del uno o más grupos hidroxilo sobre el oligosacárido o polisacárido puede ser activado con un agente activador, como puede ser alilglicidil éter, y además modificado con un haluro, como puede ser bromo, para formar 1 a 30%, 1 a 40%, 3 a 30%, 5 a 30% o l a 50% sitios epoxi o halohidrina activados que estén disponibles para reticulación con la proteina. También es posible utilizar otras sustancias químicas que sean más o menos eficientes. Otro aspecto es mantener bajo el porcentaje de unidades de proteína que puedan quedarse como monómero (es decir, no unidas), por ejemplo, 5% o menos.
En ciertas modalidades, el monómero de proteína puede ser reticulado con una biomolécula y/o biopolímero para que entre aproximadamente 40% hasta aproximadamente 99% del monómero de proteína se pueda incorporar en la formulación. En otras modalidades, el monómero de proteína puede ser reticulado para que entre aproximadamente 30% hasta aproximadamente 99%, aproximadamente 40% hasta aproximadamente 99%, aproximadamente 50% hasta aproximadamente 100%, aproximadamente 60% hasta aproximadamente 100%, aproximadamente 70% hasta aproximadamente 99%, 80% hasta aproximadamente 100%, o aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100% del monómero de proteína pueda ser incorporado en la formulación.
En ciertas modalidades, la matriz de proteína reticulada puede tener resistencia aceptable a la biodegradación, degradación, termólisis, hidrólisis y/o combinaciones de estos durante un tiempo. En ciertas modalidades, una formulación que contenga una matriz de proteína reticulada puede tener resistencia aceptable a la biodegradación, degradación, termólisis, hidrólisis, y/o combinaciones de estas durante un tiempo. Dependiendo de la matriz de proteína reticulada, el periodo de tiempo puede ser al menos 1, 2, 3, 6, 9 o 12 meses. Dependiendo de la formulación que contiene una matriz de proteína reticulada este periodo de tiempo puede ser al menos 1, 2, 3, 6, 9 o 12 meses.
En ciertas modalidades, una formulación que contenga una matriz de proteína reticulada puede permanecer aceptablemente intacta y/o persistir durante desde 1 semana hasta 1 año, in vivo. Dependiendo de la formulación específica, el tiempo puede variar. Por ejemplo, la formulación que contenga una matriz de proteína reticulada puede persistir durante al menos' 1 a 4 semanas, 2-8 semanas, 1-3 meses, 1-6 meses, 3-9 meses o 6-12 meses, 1 semana hasta 24 meses, o 12 meses hasta 24 meses. En ciertas modalidades, la formulación que contiene una matriz de proteína reticulada puede persistir in vivo durante al menos 1 semana, 2 semanas, 4 semanas, 2 meses, 3 meses, 6 meses, 9 meses, 12 meses, 15 meses o 24 meses.
Por ejemplo, en ciertas modalidades, una formulación que contenga una proteina reticulada, como puede ser 0.05 mL, 0.1 mL, 0.2 mL o 0.5 mL, 1 mL, 2 mL o 3 mL de implante, puede persistir durante aproximadamente 1 semana hasta aproximadamente 2 años, in vivo.
En ciertas modalidades, el componente matriz de proteina reticulada dentro de una formulación puede ser estable a la termólisis, resistente a la termólisis, estable a la hidrólisis, resistente a la hidrólisis, o combinaciones de estas durante el almacenamiento de la formulación. Por ejemplo, la formulación puede ser estable durante al menos 6, 12 o 24 meses en almacenamiento a una temperatura de alrededor de 2-8 °C. El componente matriz de proteina reticulada dentro de una formulación puede ser estable a la termólisis, resistente a la termólisis, estable a la hidrólisis, resistente a la hidrólisis, o combinaciones de estos durante el almacenamiento de la formulación, si se liofiliza y almacena a temperatura apropiada, por ejemplo, a menos de o alrededor de -10°C, entonces puede ser estable durante varios años. El componente matriz de proteina reticulada en una formulación puede ser estable a y/o resistente a la termólisis y/o hidrólisis durante el almacenamiento de la formulación a temperatura ambiente durante al menos 1, 2, 3, 4 semanas, 1, 2, 6, o 12 meses. En ciertas modalidades, el componente matriz de proteina reticulada en una formulación puede ser estable a y/o resistente a la termólisis y/o hidrólisis durante el almacenamiento a temperatura ambiente durante entre al menos 1 semana hasta 12 meses, 2 semanas hasta 8 meses, 1 semana hasta 5 semanas, o 1 mes hasta 6 meses.
Matrices de proteina reticulada homologa y heterologa La matriz de proteina reticulada puede variar en su estructura y composición. La matriz de proteina reticulada puede incluir, por ejemplo, una matriz de proteina reticulada que contenga uno o más residuos de proteina homogéneos u homólogos reticulados con una o más biomoléculas homogéneas u homologas, como puede ser los biopolimeros homólogos. Por ejemplo, las moléculas que contienen sacárido homologas. Una matriz de proteina reticulada puede tener uno o más residuo de proteínas homólogos reticulados con uno o más residuos de biomolécula heterogéneos o heterólogos, por ejemplo, dos o más residuos de biomolécula diferentes, como pueden ser residuos de biopolímero heterólogos. Por ejemplo, los residuos que contienen sacárido heterólogos. Una proteína reticulada con uno o más moléculas diferentes o, dos o más moléculas diferentes, por ejemplo, diferentes biomoléculas o biopolímeros y/o derivados o combinaciones de estos. La matriz de proteina reticulada puede tener uno o más residuos de proteina reticulados con uno o más residuos que contienen sacárido diferentes, como pueden ser uno o más residuos de oligosacárido o polisacárido diferentes, y/o combinaciones de estos. La matriz de proteina reticulada puede tener uno o más residuo de proteínas reticulados con una mezcla de uno o más residuos de polisacárido diferentes, como puede ser una combinación o mezcla de residuos de ácido hialurónico y residuos de carboximetil celulosa. La matriz de proteína reticulada puede ser preparada a partir de la reticulación de una o más moléculas de proteína con una mezcla de uno o más polisacáridos activados diferentes, como puede ser una combinación o mezcla de ácido hialurónico activado y carboximetil celulosa activada.
La matriz de proteína reticulada puede incluir, por ejemplo, una matriz de proteína reticulada que contenga un residuo de proteína heterologo, por ejemplo, dos o más residuos de proteína diferentes, reticulados con residuos de biomolécula homólogos, como pueden ser residuos de biopolímero homólogos, por ejemplo, residuos de la molécula que contiene sacárido homólogos. La matriz de proteína reticulada puede tener, por ejemplo, una matriz de proteina reticulada que contenga un residuo de residuo de proteina heterólogo, por ejemplo, dos o más residuos de proteina diferentes, reticulados con residuo de biomolécula heterólogo, por ejemplo, dos o más residuos de biomolécula diferentes, como pueden ser residuos de biopolimero heterólogos, por ejemplo, residuos que contengan sacárido heterólogos. La matriz de proteina reticulada puede tener uno o más residuos de proteina diferentes, por ejemplo, dos o más residuos de proteina diferentes, reticulados con un residuo de molécula, por ejemplo, un residuo de biomolécula, un residuo de biopolimero y/o derivados o combinaciones de estos. La proteina reticulada puede tener uno o más residuos de proteina diferentes, por ejemplo, dos o más residuos de proteina diferentes, reticulados con un residuo que contenga sacárido, como puede ser un residuos de oligosacárido o uno de polisacárido .
La matriz de proteina reticulada puede tener uno o más residuos de proteina diferentes, por ejemplo, dos o más residuos de proteina diferentes, reticulados con uno o más residuos de molécula diferentes, por ejemplo, uno o más residuos de biomolécula diferentes, uno o más residuos de biopolimero diferentes y/o derivados o combinaciones de estos. Por ejemplo, la matriz de proteína reticulada puede tener uno o más residuos de proteína diferentes, por ejemplo, dos o más residuos de proteína diferentes, reticulados uno o más residuos que contienen sacáridos diferentes, por ejemplo, uno o más residuos de oligosacárido diferentes y/o uno o más residuos de polisacárido diferentes, como pueden ser dos o más residuos de oligosacárido diferentes y/o dos o más residuos de polisacárido diferentes, o mezclas o combinaciones de estos.
La matriz de proteína reticulada puede tener un residuo de proteína reticulado con uno o más residuos de moléculas diferentes, por ejemplo, uno o más residuos de biomoléculas diferentes, uno o más residuos de biopolímero diferentes y/o derivados o combinaciones de estos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la matriz de proteína reticulada puede tener un residuo de proteína reticulado con uno o más residuos que contienen sacárido diferentes, por ejemplo, dos o más residuos que contienen sacárido diferentes, por ejemplo, uno o más residuos de oligosacárido diferentes y/o uno o más residuos de polisacárido diferentes, como puede ser do o más residuos de oligosacárido diferentes y/o dos o más residuos de polisacárido diferentes, o mezclas o combinaciones de estos .
La matriz de proteína reticulada puede incluir, por ejemplo, uno o más residuos de proteína por residuo de polisacárido, como puede ser dos o más residuos de proteína por residuo de polisacárido. La matriz de proteína reticulada puede tener, por ejemplo, uno o más residuos de polisacárido por residuo de proteína, como puede ser dos o más residuos de polisacárido por residuo de proteína. En ciertas modalidades, la matriz de proteína reticulada puede tener, por ejemplo, una proporción de aproximadamente 0.1% -1.5% del residuo de polisacárido hasta aproximadamente 2.5% - 10% del residuo de proteína. Otros ejemplos de proporciones son: 0.75% -1.5% del residuo de polisacárido a 3% - 6% del residuo de proteína; 0.1%-1.5% del residuo de polisacárido a 0.1% -6% del residuo de proteína; 0.25% - 0.85% del residuo de polisacárido a 1% - 4% del residuo de proteína; 0.1% - 3% del residuo de polisacárido a 0.5% - 15% del residuo de proteína; menos que o igual a 3% del residuo de polisacárido a al menos 0.5% del residuo de proteína; al menos 0.25% del residuo de polisacárido a menos de o igual a 15% del residuo de proteína; al menos 0.01% del residuo de polisacárido a menos que o igual a 12% del residuo de proteína; o al menos 1% del residuo de polisacárido a menos que o igual a 8% del residuo de proteína. Es posible utilizar otras proporciones y dependerá de las propiedades deseadas y la estructura de la molécula de proteina que se utilice para obtener la matriz de proteina reticulada. Por ejemplo, en formulaciones más suaves es posible reducir la cantidad de la molécula de polisacárido que se utilice. Por ejemplo, en ciertas formulaciones el uso de sacáridos de cadena más larga puede permitir el uso de una menor cantidad de molécula de polisacárido y todavía producir formulaciones aceptables.
En ciertas modalidades, la matriz de proteína reticulada puede tener un material biocompatible y/o biodisponible. Por ejemplo, la matriz de proteína reticulada puede ser y/o ser derivada de un material biocompatible y/o biodisponible; o la matriz de proteína reticulada puede ser biocompatible y/o biodisponible.
En ciertas modalidades, la matriz de proteína reticulada puede tener y/o ser derivada de un agente reticulador soluble en agua, por ejemplo, un agente reticulador que contenga sacárido, soluble en agua o un agente reticulador que contenga sacárido, modificado, soluble en agua, como puede ser un agente reticulador oligosacárido soluble en agua o un agente reticulador oligosacárido, modificado, soluble en agua. La matriz de proteína reticulada puede también tener y/o ser obtenida a partir de un agente reticulador que contenga polisacárido, soluble en agua o un agente reticulador que contenga polisacárido, modificado, soluble en agua.
En ciertas modalidades, la matriz de proteína reticulada puede tener, por ejemplo, un conjugado biomolécula-proteína o un conjugado biopolímero-proteína o combinaciones de estos. Por ejemplo, la matriz de proteína reticulada puede incluir un conjugado molécula que contenga polisacárido-proteína , como puede ser un conjugado sacárido-proteína, un conjugado disacárido-proteína, un conjugado trisacárido-proteína , un conjugado oligosacárido-proteína, un conjugado polisacárido-proteína y/o combinaciones de estos.
Molécula que contiene sacárido En ciertas modalidades, la molécula que contiene sacárido, como puede ser un oligosacárido, puede tener uno o más disacáridos, uno o más trisacáridos, dos o más disacáridos, dos o más trisacáridos, tres o más disacáridos, tres o más trisacáridos, y/o combinaciones o derivados de estos. Por ejemplo, un oligosacárido puede tener al menos o aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8 u 11 residuos o unidades de sacárido. Un oligosacárido utilizado para obtener la imatriz de proteina reticulada, en ciertas formulaciones, también puede tener entre aproximadamente 3 hasta aproximadamente 15, 3 hasta aproximadamente 14, aproximadamente 3 hasta aproximadamente 12, aproximadamente 3 hasta aproximadamente 11, aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10, aproximadamente 4 hasta aproximadamente 15, aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15, o aproximadamente 5 hasta aproximadamente 10 residuos o unidades de sacárido.
En ciertas modalidades, el polisacárido, puede tener uno o más unidades o residuos disacárido, uno o más unidades o residuos trisacárido, uno o más oligosacáridos; dos o más unidades o residuos disacáridos, dos o más unidades o residuos trisacáridos , dos o más oligosacáridos; tres o más unidades o residuos disacáridos, tres o más unidades o residuos trisacáridos, tres o más oligosacáridos, o combinaciones de estos. Por ejemplo, un polisacárido puede tener al menos o alrededor de 25, 50, 100, 200, 500, 800, 1,000, 1,200, 1,500, 2,000, 5,000, 10,000 o 20,000, unidades o residuos sacáridos. Un polisacárido que se utilice para obtener la matriz de proteina reticulada, en ciertas formulaciones, también puede contener entre aproximadamente 25 hasta aproximadamente 5000, 500 hasta aproximadamente 2000, aproximadamente 3000 hasta aproximadamente 5000, aproximadamente 150 hasta aproximadamente 250, aproximadamente 175 hasta aproximadamente 225, aproximadamente 100 hasta aproximadamente 175, aproximadamente 150 hasta aproximadamente 200, o aproximadamente 100 hasta aproximadamente 200 residuos o unidades sacáridos.
En ciertas modalidades, el ácido hialurónico (HA) puede ser utilizado en el intervalo de aproximadamente 100 a 300 unidades o residuos sacáridos, por ejemplo alrededor de 200 unidades o residuos sacáridos. En otras modalidades, el HA puede ser utilizado en el intervalo de 200 a 20,000 unidades o residuos sacáridos. En otras modalidades, el HA puede ser utilizado en el intervalo de aproximadamente 500 a 2000 unidades o residuos sacáridos. En otras modalidades, El HA puede ser utilizado en el intervalo de 3000 a 5000 unidades o residuos sacáridos. En otras formulaciones, el HA utilizado puede contener al menos o alrededor de 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175 200, 500, 800, 1,000, 1,200, 1,500, 2,000, 5,000, 10,000, o 20,00C, unidades o residuos sacáridos. El HA utilizado para obtener la matriz de proteina reticulada, en ciertas formulaciones, también puede contener entre aproximadamente 25 hasta aproximadamente 5000, 500 hasta aproximadamente 2000, aproximadamente 3000 hasta aproximadamente 5000, aproximadamente 150 hasta aproximadamente 250, aproximadamente 175 hasta aproximadamente 225, aproximadamente 100 hasta aproximadamente 175, aproximadamente 150 hasta aproximadamente 200, o aproximadamente 100 hasta aproximadamente 200 residuos o unidades sacáridos.
La. molécula que contiene sacárido, como puede ser un polisacárido, puede ser de peso molecular bajo, medio o alto. Por ejemplo, la composición o formulación puede ser obtenida a partir de un polisacárido o agente reticulador polisacárido de peso molecular bajo, medio o alto.
La molécula que contiene sacárido de peso molecular bajo puede tener un peso molecular de entre aproximadamente 25,000 hasta aproximadamente 300,000 Daltons, por ejemplo, entre aproximadamente 50,000 hasta aproximadamente 275,000 Daltons, aproximadamente 100,000 hasta aproximadamente 250,000 Daltons, o aproximadamente 50,000 hasta aproximadamente 300,000 de Daltons. La molécula que contiene sacárido de peso molecular medio puede tener un peso molecular de entre aproximadamente 300,000 hasta aproximadamente 900,000 Daltons, aproximadamente 600,000 hasta aproximadamente 800,000, aproximadamente 500,000 hasta aproximadamente 900,000, o aproximadamente 500,000 hasta aproximadamente 750,000 Daltons. La molécula que contiene sacárido de peso molecular alto puede tener un peso molecular de entre aproximadamente 900,000 hasta aproximadamente 4,000,000 Daltons, aproximadamente 1,000,000 hasta aproximadamente 3,500,000, aproximadamente 900,000 hasta aproximadamente 3,500,000, aproximadamente 1,500,000 hasta aproximadamente 3,700,000, o aproximadamente 1,250,000 hasta aproximadamente 3,000,000 Daltons. También se piensa que es posible utilizar polisacáridos que tengan intervalos de peso molecular que combinen los intervalos que se dan en la presente. Por ejemplo, es posible utilizar un polisacárido que tenga un intervalo de peso molecular de aproximadamente 25,000 hasta aproximadamente 750,000, aproximadamente 50,000 hasta aproximadamente 900,000, aproximadamente 100,000 hasta aproximadamente 750,000, o aproximadamente 250,000 hasta aproximadamente 500,000 Daltons. También es posible seleccionar otros intervalos .
En ciertas modalidades, la posibilidad de utilizar polisacáridos de peso molecular bajo a peso molecular medio facilita estos abordajes desde la perspectiva de la fabricación/procesamiento. Por ejemplo, el uso de HA de peso molecular menor permite que el HA sea modificado, precipitado y lavado y el HA permanece en una solución razonablemente poco viscosa que puede utilizarse fácilmente como el agente reticulador. El uso de polisacáridos de peso molecular superior puede proporcionar problemas de manejo adicionales (p. ej . , solución viscosa, problemas con el mezclado, aireación etc.) pero, en algunas modalidades, un intervalo amplio de pesos moleculares se puede utilizar para obtener los resultados deseados. Un abordaje para manejar polisacáridos de peso molecular superior puede ser utilizar una solución más diluida. (Por ejemplo, utilizar HA de 1,500,000 Daltons, pero utilizar una solución al 0.1% para mantener baja la viscosidad).
La matriz de proteína reticulada puede tener el residuo que contiene sacárido, como puede ser un residuo polisacárido, en una concentración de entre aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 15%. En ciertas modalidades, la matriz de proteína reticulada puede tener el residuo que contiene sacárido en una concentración de entre aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 10%, aproximadamente 0.2% hasta aproximadamente 5%, aproximadamente 0.25% hasta aproximadamente aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 3.5%, aproximadamente 0 .20% hasta aproximadamente o , aproximadamente 0. 25% hasta aproximadamente "39o- , aproximadamente 0 .5% hasta aproximadamente 4 1 %o , aproximadamente 0 .5% hasta aproximadamente "52- aproximadamente 0. 75% hasta aproximadamente 3.5 ~o , aproximadamente 1% hasta aproximadamente o f aproximadamente 1 .5% hasta aproximadamente 3.5%, o aproximadamente 0.2% hasta aproximadamente 4%.
La molécula que contiene sacárido, como puede ser un polisacárido, puede tener un peso molecular de al menos o aproximadamente 500 Daltons, por ejemplo, un peso molecular de al menos o aproximadamente 5, 000, 10, 000, 25, 000, 50, 000, 100, 000, 150, 000, 200, 000, 250, 000, 300, 000, 500, 000, 750, 000 o 1, 500, 000 Daltons.
En ciertas modalidades, una molécula, como puede ser una biomolécula o un biopolimero, puede tener, al menos una porción enlazable, como puede ser al menos una porción reticulable, por ejemplo, un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, una amina, un tiol, un alcohol, un alqueno, un alquino, un grupo ciano o una azida, y/o modificaciones, derivados o combinaciones de estos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, una biomolécula o un biopolimero, como pude ser una proteina o una molécula que contenga sacárido, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido , puede tener al menos una porción reticulable, como puede ser un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, una amina, un tiol, un alcohol, un alqueno, un alquino, un grupo ciano o una azida, y/o modificaciones, derivados o combinaciones de estos.
En ciertas modalidades, la porción enlazable, como puede ser una porción reticulable, puede ser una porción que sea capaz de activación, por ejemplo, una porción grupo carboxilo, una porción grupo hidroxilo, de modo que la activación de la porción enlazable permita y/o facilite una reacción con un grupo reactivo complementario en la misma y/o una segunda molécula para formar un enlace, como pude ser un enlace covalente, con la misma y/o segunda molécula, por ejemplo, formar un enlace cruzado con una segunda molécula, como puede ser una segunda biomolécula o biopolimero.
En ciertas modalidades, una molécula, como puede ser una biomolécula o un biopolimero, por ejemplo, una molécula que contiene sacárido o una proteina, puede contener un grupo separador, de modo que el grupo separador sea capaz de unirse a la misma y/o una segunda molécula, por ejemplo, una segunda biomolécula o biopolímero. Por ejemplo, en ciertas modalidades, un grupo separador puede tener al menos una o más porciones enlazables permitiendo con ello al grupo separador unirse a la misma y/o una segunda molécula. En ciertas modalidades, por ejemplo, una molécula, como puede ser una molécula que contenga sacárido o una proteina, pueden tener un grupo separador que contenga al menos una o más porciones enlazables, permitiendo con ello a la molécula formar un enlace, como puede ser un enlace cruzado, con una segunda molécula, como puede ser una segunda biomolécula o biopolímero, por ejemplo, una proteína o una molécula que contenga sacárido, mediante un enlace que forme la porción enlazable en el grupo separador. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la molécula que contiene sacárido, como puede ser un oligosacárido, polisacárido o polisacárido modificado, puede tener un grupo separador que contenga al menos una o más porciones enlazables, como puede ser un grupo carboxilo o un grupo carboxilo activado o modificado, permitiendo con ello al polisacárido formar un enlace, como puede ser un enlace cruzado, a una segunda molécula, como puede ser una proteína, por ejemplo, una proteína que contenga una amine, mediante un enlace amida que forme la porción enlazable sobre el grupo separador en el oligosacárido, polisacárido o polisacárido modificado.
En ciertas modalidades, la molécula que contiene sacárido, como puede ser un oligosacárido o un polisacárido, puede tener grupos funcionales con carga negativa o grupos funcionales con carga o positiva, por ejemplo, un oligosacárido que contenga grupos funcionales con carga negativa o grupos funcionales con carga positiva; o un polisacárido que contenga grupos funcionales con carga negativa o grupos funcionales con carga positiva; y/o derivados o combinaciones de estos. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la molécula que contiene sacárido, como puede ser un oligosacárido o un polisacárido, puede tener un ácido idurónico, ácido glucurónico o un residuo N-acetilglucosamina . En ciertas modalidades, por ejemplo, la molécula que contiene sacárido puede incluir, por ejemplo, un oligosacárido que tenga un grupo carboxilo o un polisacárido que contenga un grupo carboxilo, como puede ser un polisacárido que contenga poli-ácido carboxilico, por ejemplo, ácido hialurónico o carboximetil celulosa; un oligosacárido que contenga un grupo amina o un polisacárido que contenga un grupo amina; y/o derivados de estos.
Características estructurales - Lineal o ramificado En ciertas modalidades, la molécula que contiene sacárido puede incluir, oligosacáridos lineales, oligosacáridos ramificados, polisacáridos lineales y/o polisacáridos ramificados. La molécula que contiene sacárido puede incluir, más no se limita a, oligosacáridos y/o polisacáridos, como puede ser ácido hialurónico ("HA"); un derivado de celulosa, por ejemplo, carboxi celulosa, carboximetil celulosa, hidroximetil celulosa, hidroxipropil celulosa ("UPC"), hidroxipropil metilcelulosa ("HPMC"), hidroxi-propilcelulosacarboximetil amilosa ("C A"); goma de xantana; goma guar; a-glucano; ß-glucano; ß-1 , -glucano; ß-l, 3-glucano; alginatos; carboximetil dextrano; un derivado glicosaminoglicano; 6-sulfato de condroitina; sulfato de dermatina; heparina; sulfato de heparina; poliácido láctico ( " PLA" ) ; o biomateriales como poliácido glicólico ("PGA") ; poli (ácido láctico-co-glicólico) ( " PLGA" ) ; fosfato tricálcico ("TCP"); 1-hidroxiapatita ("PAH"); y/o sus sales o derivados aceptados para uso farmacéutico o combinaciones de estos. La molécula que contiene sacárido puede incluir una pectina y/o un derivado de ésta, incluidos los oligosacáridos y/o polisacáridos lineales y ramificados.
La molécula que contiene sacárido puede ser una molécula que contiene sacárido preparada a partir de y/o derivada de procesos naturales, modificación química sintética y/o combinaciones de estos.
Por ejemplo, la molécula que contiene sacárido puede incluir moléculas que contienen sacárido preparadas y/o derivadas de células eucariotas o células procariotas, por ejemplo, procesos naturales que toman lugar a través de células eucariotas o células procariotas, o combinaciones de estos.
Por ejemplo, la molécula que contiene sacárido puede incluir moléculas que contiene sacárido preparadas y/o derivadas por modificación química sintética, como puede ser por síntesis en fase sólida. La molécula que contiene sacárido incorpora un ligador durante la síntesis del polisacárido en fase sólida.
La molécula que contiene sacárido puede contener una molécula que contenga sacárido considerablemente soluble, por ejemplo, completamente soluble, parcialmente soluble, como puede ser un oligosacárido o polisacárido que sea considerablemente soluble en una solución acuosa y/o solución fisiológica.
La molécula que contiene sacárido puede comprender, por ejemplo, un sacárido polianiónico, un sacárido policatiónico, una molécula sacárido biocompatible, un sacárido biodisponible, un sacárido biodegradable, un sacárido bioabsorbible, un sacárido bioresorbible, o combinaciones de estos.
Proteina y Polisacárido En ciertas modalidades, la matriz de proteina reticulada puede incluir, por ejemplo, un componente residuo que contenga sacárido que tenga un carácter con carga electrónica que complemente el carácter con carga electrónica del componente residuo de proteina en la matriz de proteina reticulada. El carácter de complementación de la carga de cada componente puede ayudar y/o facilitar la reunión de los componentes. El carácter complementador de la carga de cada componente puede adicionarse a las propiedades generales de la composición. La matriz de proteina reticulada puede además incluir contraiones aceptados para uso farmacéutico y/o fisiológico que pueden complementar un componente residuo que contenga sacárido que tenga un carácter con carga electrónica, o contraiones aceptados para uso farmacéutico y/o fisiológico que puedan complementar un carácter con carga electrónica del componente residuo de proteína, o ambos. Por ejemplo, la matriz de proteína reticulada puede comprender un componente residuo que contenga sacárido polianiónico, como puede ser un residuo de polisacárido polianiónico reticulado a un residuo de proteína con carga positiva. Por ejemplo, la matriz de proteína reticulada puede comprender un componente residuo que contenga sacárido policatiónico, como puede ser un residuo polisacárido policatiónico reticulado a un residuo de proteína con carga negativa.
Elección de la Proteína y el Polisacárido En ciertas modalidades, la elección del componente proteína incluido en la matriz de proteína reticulada, como puede ser tropoelastina, puede basarse en los requisitos funcionales finales del producto biomaterial resultante. Por ejemplo, el componente residuo de proteína incluido en la matriz de proteína reticulada puede consistir en residuos de proteínas, como pueden ser residuos de albúmina o colágena. En ciertas modalidades, la elección del componente residuo de proteína incluido en la matriz de proteína reticulada puede basarse en el requisito final de la bioactividad del producto biomaterial resultante. En ciertas modalidades, la elección del componente residuo de proteína incluido en la matriz de proteina reticulada se puede basar en el deseo de incluir una combinación del residuo de proteina en el producto biomaterial resultante.
En ciertas modalidades, el componente residuo de proteina incluido en la formulación de la matriz de proteina reticulada puede variar en la formulación. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la formulación pude tener desde 25-50 mg/mL del residuo de proteina y 1-30 mg/mL del residuo del agente reticulador polisacárido. En ciertas formulaciones, el componente residuo de proteina contenido en la formulación de la matriz de proteina reticulada puede ser desde 1-200 mg/mL; 5-30 mg/mL, 20-100 mg/mL, 50-200 mg/mL, 20-100 mg/mL, 25- 80 mg/mL, 30-60 mg/mL. 40-70 mg/mL, o 25-65 mg/mL. En ciertas modalidades, el intervalo apropiado de las cantidades del componente residuo de proteina y el intervalo apropiado de las cantidades del componente residuo de polisacárido contenido en la formulación de la matriz de proteina reticulada puede ser diferente, con base en los requisitos de la aplicación especifica.
Acoplamiento / Conjugación / Reticulación En ciertas modalidades, la matriz de proteina reticulada se puede preparar enlazando, como puede ser acoplando y/o reticulando, una proteina, como puede ser una proteína que contenga amina, a una molécula que contiene sacárido, que contenga un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un grupo carboxilo activado, un grupo hidroxilo activado, un grupo carboxilo modificado o un grupo hidroxilo modificado, como puede ser un oligosacárido, polisacárido y/o derivados de estos, que contengan un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un grupo carboxilo activado, un grupo hidroxilo activado, un grupo carboxilo modificado o un grupo hidroxilo modificado, para formar un enlace amida o amina. Por ejemplo, la matriz de proteina reticulada puede prepararse por acoplamiento y/o reticulación de una proteína, como puede ser una proteína portadora de un residuo amina, a un oligosacárido y/o oligosacárido modificado que contenga un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un grupo carboxilo activado, un grupo hidroxilo activado, un grupo carboxilo modificado o un grupo hidroxilo modificado, para formar un enlace amida o amina entre la proteína y el oligosacárido. Por ejemplo, la matriz de proteína reticulada puede ser preparada mediante el acoplamiento y/o reticulación de una proteína, como puede ser una proteína portadora de un residuo amina, a un polisacárido y/o polisacárido modificado que contenga un grupo carboxilo, un grupo hidroxilo, un grupo carboxilo activado, un grupo hidroxilo activado, un grupo carboxilo modificado o un grupo hidroxilo modificado, para formar un enlace amida o amina entre la proteina y el he polisacárido .
En ciertas modalidades, la formación de una matriz de proteina reticulada puede ser facilitada empleando un agente activador y/o agente de acoplamiento o mediante el empleo de un agente activador y/o agente de acoplamiento y un agente modificador y/o agente de acoplamiento auxiliar para formar un enlace y/o enlace cruzado entre el componente proteina de la proteina reticulada y la segunda molécula de la proteina reticulada, como puede ser una biomolécula, biopolimero, o un grupo separador, o combinaciones o derivados de estos. La matriz de proteina reticulada puede ser preparada empleando un agente activador y/o agente de acoplamiento para formar un enlace y/o enlace cruzado. Por ejemplo, la matriz de proteina reticulada puede ser preparada activando uno o más grupos ácido carboxilico sobre un oligosacárido o polisacárido que contenga grupo carboxilo, como puede ser el ácido hialurónico, con un agente activador y/o acoplador para formar un oligosacárido activado o polisacárido activado, y el acoplamiento y/o reticulación del oligosacárido activado o polisacárido activado a una proteína, como puede ser una proteína portadora de residuos amina, para formar un enlace amida entre el oligosacárido o polisacárido y la proteína. Por ejemplo, la matriz de proteína reticulada puede ser preparada activando uno o más grupos hidroxilo contenidos en el oligosacárido o polisacárido que contenga grupos hidroxilo, como puede ser el ácido hialurónico, con un agente activador y/o acoplador para formar un oligosacárido activado o polisacárido activado, y acoplar y/o reticular el oligosacárido activado o polisacárido activado a una proteína, como puede ser una proteína portadora de residuos amina, para formar un enlace amina entre el oligosacárido o polisacárido y la proteína.
Agente activador / Agente acoplador / Agente modificador En ciertas modalidades, un agente activador, algunas veces denominado agente acoplador puede incluir, más no se limita a, una di-imida, como puede ser una carbodiimida o una carbodiimida soluble en agua, por ejemplo, 1-etil-3- ( 3-cimetilaminopropil ) -carbodiimida ("EDC"), metyoduro de l-etil-3- ( 3-dimetilaminopropil ) -carbodiimida ("ETC"), l-ciclohexil-3- (2-morfolinoetil ) -carbodiimida ( "CMC" ) , y/o las sales correspondientes o las mezclas de estos. El agente activador también puede incluir, por ejemplo, hexafluorofosfato de benzotriazol-l-iloxitris- (dimetilamino) -fosfonio ("reactivo Bop"), hexafluorofosfato de O-benzotriazol-l-il-N, N, N ' , N ' -tetrametiluronio, hexafluorofosfato de bromo-tris- ( dimetilamino) -fosfonio y/o las sales haluro correspondientes o mezclas de estos. En ciertas modalidades, un agente activador, algunas veces denominado un agente acoplador, puede incluir, más no se limita a, un epóxido como alilglicidil éter o un haloalqueno como cloruro de alilo y/o las sales correspondientes o mezclas de estos.
La matriz de proteina reticulada puede ser preparada empleando un agente activador y/o agente acoplador y un agente modificador y/o agente acoplador auxiliar para formar un enlace y/o enlace cruzado. Por ejemplo, la matriz de proteina reticulada puede ser preparada activando uno o más grupos ácido carboxilico en un oligosacárido o polisacárido que contenga grupos carboxilo, como puede ser el ácido hialurónico, con un agente activador y/o acoplador para formar un oligosacárido activado o polisacárido activado, modificando el uno o más grupos carboxilo activados en el oligosacárido activado o polisacárido activado con un agente modificador y/o agente acoplador auxiliar para formar un oligosacárido modificado o polisacárido modificado, y acoplando y/o reticulando el oligosacárido modificado o polisacárido modificado a una proteina, como puede ser una proteina portadora de residuos amina, para formar un enlace amida entre el oligosacárido o polisacárido y la proteina.
En ciertas modalidades, un agente modificador, algunas veces denominado un agente acoplador auxiliar, puede incluir, más no se limita a, un reactivo que, en presencia de una porción carboxilo y/o hidroxilo activada, como puede ser una porción carboxilo y/o hidroxilo activada sobre un polisacárido, reaccione con la porción carboxilo y/o hidroxilo activada para formar especies modificadas que puedan ser más estables o más capaces de reaccionar con un nucleófilo. Por ejemplo, el agente modificador, o el agente acoplador auxiliar pueden incluir, más no se limitan a, N-hidroxi-succinimida ("NHS"), N-hidroxisulfosuccinimida ("sulf-NHS") , 1-hidroxi-benzotriazol hidratado ( "HOBt" ) , 1-hidroxibenzotriazol monohidratado, 3, 4-dihidro-3-hidroxi-4-oxo-l, 2, 3-benzotriazol (HOBt), l-hidroxi-7-azabenzotriazol (HAT), 4-nitrofenol , 2-nitrofenol, 4-nitrotiofenol, 2-nitrotiofenol, pentaclorofenol, pentafluorofenol, imidazol, tetrazol, 4-dimetilaminopiridina, un haluro y/o otros compuestos relacionados.
En ciertas modalidades, la matriz de proteina reticulada puede ser preparada activando y/o modificando una molécula que contenga sacárido que comprenda uno o más grupos carboxilo y/o hidroxilo, como puede ser un oligosacárido o un polisacárido, por ejemplo, ácido hialurónico, con un agente activador y/o un agente modificador, y combinando con una proteina para formar uno o más enlaces y/o enlaces cruzados, como puede ser uno o más enlaces amida o amina entre la molécula que contiene sacárido y la proteina.
El método de preparación de una matriz de proteina reticulada puede comprender mezclar y/o combinar un agente activador y/o agente modificador con una molécula que contenga sacárido que contenga uno o más grupos carboxilo y/o hidroxilo, por ejemplo, ácido hialurónico, para formar una molécula que contenga sacárido activada y/o modificada, y mezclar y/o combinar la molécula que contenga sacárido activada y/o modificada con una proteina para formar uno o más enlaces y/o enlaces cruzados, como pueden ser uno o más enlaces amida o amina entre la molécula que contiene el sacárido y la proteina. Por ejemplo, una molécula que contiene sacárido, que contiene uno o más grupos carboxilo y/o hidroxilo, como puede ser el ácido hialurónico, puede ser activada y/o modificada con un agente activador, como puede ser EDC o alilglicidil éter, y/o agente modificador, como puede ser NHS, HOBt o Bromo. Por ejemplo, la molécula que contiene sacárido activada y/o modificada puede contener uno o más grupos carboxilo y/o hidroxilo activados y/o modificados como los ésteres activados y/o modificados, como pueden ser los ésteres triazol activados y/o modificados o como ésteres de N-hidroxisuccinimida activados y/o modificados, epóxidos activados y/o modificados, o halohidrinas activadas y/o modificadas. Una molécula que contiene sacárido, que contiene uno o más grupos carboxilo y/o hidroxilo, como puede ser el ácido hialurónico, puede ser activada y/o modificadada con un agente activador, como puede ser EDC o alilglicidil, y/o agente modificador, como puede ser NHS, HOBt o Bromo, y puede ser combinada, mezclada y/o reaccionar con un compuesto que lleve una o más porciones amina, como puede ser una proteina que contenga una o más cadenas laterales portadoras de amina, para formar uno o más enlaces y/o enlaces cruzados, como pueden ser los enlaces amida o amina entre la molécula que contiene sacárido y el compuesto portador de una o más porciones amina.
En ciertas modalidades, una molécula que contiene una o más porciones amina, como puede ser una proteina, péptido, o grupo separador, que contienen una o más porciones amina, pueden ser acopladas a uno o más grupos carboxilo y/o hidroxilo en una molécula que contenga sacárido, por ejemplo, pueden ser acoplados en un medio acuoso a un oligosacárido o polisacárido que contenga uno o más grupos carboxilo y/o hidroxilo, como puede ser un oligosacárido o polisacárido que contenga uno o más grupos carboxilo y/o hidroxilo que hayan sido activados y/o modificados con un agente activador y/o agente modificador.
En ciertas modalidades, el método que se utilice para modificar un polisacárido puede depender de la proteina que se retícula y/o del polisacárido que se utilice como reticulador. Por ejemplo, el método que se utilice para modificar un polisacárido puede consistir en el uso de oxidación con peryodato. El método utilizado para modificar un polisacárido puede comprender el uso de un agente activador, como puede ser una carbodiimida, por ejemplo EDC. El método utilizado para modificar un polisacárido puede comprender el uso de un agente activador, como puede ser un epóxido, por ejemplo alilglicidil éter. El método utilizado para modificar un polisacárido además puede comprender el uso de un agente modificador, como puede ser N-hidroxisuccinimida (NHS) o un haluro como bromo. Por ejemplo, el ácido hialurónico y/o carboximetil celulosa pueden ser activados por un agente activador, como puede ser carbodiimida, y pueden además ser modificados mediante un agente modificador, como puede ser N-hidroxisuccinimida . Por ejemplo, el ácido hialurónico y/o carboximetil celulosa pueden ser activados por un agente activador, como puede ser un epóxido, y además pueden ser modificados por un agente modificador, como bromo.
Reactivo molecular bifuncional En ciertas modalidades, la matriz de proteína reticulada puede ser preparada haciendo reaccionar una proteína con un reactivo mult ifuncional , como puede ser una molécula que contenga sacárido, que contenga dos o más porciones reactivas o un grupo separador que contenga dos o más porciones reactivas, para formar dos o más enlaces o enlaces cruzados. Por ejemplo, el reactivo multifuncional puede contener dos o más de las mismas porciones reactivas o diferentes, como puede ser una mezcla de grupos carboxilo y/o hidroxilo, grupos carboxilo y/o hidroxilo activados, grupos carboxilo y/o hidroxilo modificados, y/o combinaciones o derivados de estos. Por ejemplo, cada una de las porciones reactivas en el reactivo multifuncional puede ser reactiva con grupos reactivos complementarios de la misma molécula u otra. Por ejemplo, una o más de las porciones reactivas en el reactivo multifuncional puede requerir desprotección, como puede ser la eliminación de un grupo protector, para que sea capaz de reaccionar con los grupos reactivos complementarios de la misma molécula u otra .
Grupo separador El grupo separador puede incluir una porción que se una a uno o más componentes individuales. El grupo separador puede ser unido a una o más moléculas, por ejemplo, ligado a una proteina por enlace covalente, ligado a un polisacárido por enlace covalente, ligado a una proteina y un polisacárido por enlaces covalentes, y/o combinaciones de estos. El grupo separador puede incluir, por ejemplo, más no se' limita a, una porción glicol, una porción óxido de etileno, un polímero formado de porciones repetidas - (-CH2-CH2-0-) -, como puede ser polietilen glicol (PEG), o polióxido de etileno (PEO), una poliamina o un poliol. El grupo separador puede ser estable a la termólisis o hidrólisis, o a ambas. El separador puede ser biocompatible , biodisponible, soluble y/o considerablemente soluble en medio acuoso y/o fisiológico o combinaciones de estos. La biomolécula o biopolimero puede tener uno o más residuos del grupo separador, por ejemplo, como puede ser polietilen glicol (PEG) o un grupo polióxido de etileno (PEO) . La matriz de proteina reticulada puede tener uno o más residuos de grupo separador, por ejemplo, como puede ser un polietilen glicol (PEG) o un grupo polióxido de etileno (PEO) . La molécula que contiene sacárido puede tener uno o más residuos del grupo separador, por ejemplo, como puede ser un grupo polietilen glicol (PEG) o un grupo polióxido de etileno (PEO) . La molécula que contiene sacárido puede tener una o más porciones que incluyan un grupo reactivo, por ejemplo, un grupo reactivo que pueda formar un enlace covalente cuando reacciona con un grupo reactivo complementario que puede ser parte de una proteina o proteina modificada. La proteina o proteina modificada puede tener una o más porciones que incluyan un grupo reactivo, por ejemplo, un grupo reactivo que pueda formar un enlace covalente cuando reacciona con un grupo reactivo complementario que puede ser parte de una molécula que contiene sacárido.
Grado de modificación del polisacárido En ciertas modalidades, el agente reticulador que contiene sacárido, que contiene uno o más grupos carboxilo y/o hídroxilo, por ejemplo, ácido hialurónico, puede ser activado y/o modificado para contener un intervalo de carboxilo y/o hidroxilo activados y/o modificados y un intervalo de grupos carboxilo y/o hidroxilo que no estén activados ni/o modificados. Por ejemplo, el agente reticulador que contiene sacárido activado y/o modificado puede ser activado y/o modificado para que tenga al menos o alrededor de 2% de los grupos carboxilo y/o hidroxilo activados y/o modificados, como puede ser al menos o alrededor de 0.5%, 1%, 3%, 5%, 10%, 20%, 25%, 30%, o 35% de los grupos carboxilo y/o hidroxilo activados y/o modificados. En ciertas aplicaciones, el agente reticulador que contiene sacárido puede tener grupos carboxilo y/o hidroxilo considerable o completamente activados y/o modificados. En ciertas modalidades, el agente reticulador que contiene sacárido activado y/o modificado puede ser activado y/o modificado para tener entre aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 40%, aproximadamente 1% hasta aproximadamente 30%, aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 25%, aproximadamente 3%> hasta aproximadamente 30%, o aproximadamente 5% hasta aproximadamente 25%, grupos carboxilo y/o hidroxilo activados y/o modificados.
En ciertas modalidades, la variación en el nivel de grupos activados y/o modificados en el agente reticulador que contiene sacárido puede aumentar o disminuir la capacidad del agente reticulador que contiene sacárido para formar enlaces cruzados con una biomolécula. Por ejemplo, el nivel de grupos activados y/o modificados en el agente reticulador que contiene sacárido puede dar lugar a la formación de una o más conexiones entre el agente reticulador que contiene sacárido y la biomolécula o biopolímero. La variación en el nivel del agente reticulador que contiene sacárido que contiene grupos activados y/o modificados empleados para preparar la proteina reticulada puede regular o considerablemente regular el número de grupos activados y/o modificados que pueden reaccionar con una biomolécula o biopolímero, como puede ser el enlace y/o enlace cruzado con una proteína puede estabilizar o prácticamente estabilizar la proteína .
Extrusión En ciertas modalidades, la matriz de proteína reticulada puede ser extruida a través de una aguja. Por ejemplo, extruía a través de una aguja de calibre fino. La matriz de proteína reticulada puede conservar suficiente cohesividad, por ejemplo, conservar suficiente cohesividad aún después de la extrusión a través de la aguja de modo que una hebra larga de material puede ser extruida desde la aguja sin el rompimiento del material. Por ejemplo, como puede ser una hebra de material de al menos o aproximadamente 15 cm puede ser extruida desde la aguja sin el rompimiento del material. La matriz de proteina reticulada puede tener una estructura de matriz flexible. Por ejemplo, la estructura de matriz flexible de la matriz de proteina reticulada puede facilitar la producción de biomaterials firmes que conserven suficiente flexibilidad para que sean expulsados a través de una aguja fina. En ciertas modalidades, una formulación que contenga una matriz de proteina reticulada puede ser extruida a través de una aguja, por ejemplo, extruida a través de una aguja de calibre fino sin la necesidad de otro procesamiento. En ciertas modalidades, una formulación que contenga una matriz de proteina reticulada puede conservar suficiente cohesividad aún después de la extrusión a través de la aguja, de modo que una hebra larga de material puede ser extruida de la aguja sin rompimiento del material, como puede ser una hebra de material de al menos aproximadamente 15 cm. En ciertas modalidades, la formulación puede contener una matriz de proteina reticulada que consiste en una estructura de matriz flexible. Por ejemplo, en ciertas modalidades, la estructura de matriz flexible de la matriz de proteina reticulada en la formulación puede facilitar la producción de biomateriales firmes, como pueden ser biomateriales firmes que conserven la flexibilidad, por ejemplo, flexibilidad considerable y/o suficiente y puedan permitir a la formulación y/o biomaterial ser expulsados a través de una aguja, por ejemplo, una aguja de calibre fino.
Métodos de preparación En ciertas modalidades, la concentración de un polisacárido en la reacción puede ser entre aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 5%, por ejemplo, entre aproximadamente 0.25% hasta aproximadamente 3%, aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 3%, o aproximadamente 0.25% hasta 3.5%.
En ciertas modalidades, la estequiometria del reactivo puede variar con la química y el polisacárido elegido. Por ejemplo, para HA : EDC : NHS , la proporción puede ser 1:1:1, 1:1:2, 1:1:3, 1:0.5:2, 1:0.5:3. Con NHS se ha encontrado que la proporción 1:1:1 da buenos resultados en términos de la incorporación de NHS en un agente reticulador polisacárido soluble.
En ciertas modalidades, la proporción molar de polisacárido a agente activador puede ser al menos 1:1 hasta al menos alrededor de 1:4. En ciertas modalidades, la proporción molar del agente activador a las unidades ácido carboxilico del polisacárido puede ser entre aproximadamente 2% hasta aproximadamente 200%, por ejemplo, entre aproximadamente 5% hasta aproximadamente 100%. En ciertas modalidades, la proporción molar del agente modificador al agente activador puede ser entre aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente 3:1, por ejemplo, entre aproximadamente 1.5:1 hasta aproximadamente 2.5:1, como puede ser aproximadamente 2: 1.
En ciertas modalidades, el pH para llevar a cabo la preparación de la reacción del reticulador polisacárido puede ser al menos 4, 5, 6, 7, 8.0 u 8.5. En ciertas modalidades, el pH para llevar a cabo la preparación de la reacción del reticulador polisacárido puede ser entre aproximadamente 5 hasta aproximadamente 15, aproximadamente 6.5 hasta aproximadamente 9, aproximadamente 7 hasta aproximadamente 8.6. También es posible utilizar otros valores de pH.
En ciertas modalidades, el intervalo de temperaturas de la reacción de activación, acoplamiento y/o reticulación es entre aproximadamente 15°C hasta aproximadamente 30°C, 20°C hasta aproximadamente 25°C, o a temperatura ambiente.
En ciertas modalidades, el método de purificación y/o aislamiento del polisacárido derivado puede ser robusto, sencillo, de rendimiento alto o combinaciones de estos. Por ejemplo, el método puede producir al menos 40% del polisacárido derivado, aislado, con respecto al polisacárido de inicio. En otras modalidades, el rendimiento puede ser al menos 40%, 50%, 60% ,65%, 70%, 75%, 80%, 85%o, 90% o 95% del polisacárido derivado, aislado, con respecto al polisacárido inicial o el polisacárido modificado.
Usos terapéuticos Las composiciones, materiales, formulaciones, métodos de uso, sistemas y/o kits de la matriz de proteina reticulada descrita en la presente pueden emplearse en diversos entornos terapéuticos, como pueden ser, más no se limitan a, los empleados en medicina humana o veterinaria, como puede ser en cirugía. Por ejemplo, estos pueden emplearse con fines terapéuticos en cirugía restaurativa, cirugía estética, estética, abultamiento de tejido, como puede ser productos para incontinencia o en reemplazo dérmico, dermatología, como puede ser cirugía dermatológica, cirugía de ojos, reumatología, farmacología o en el campo de los cosméticos. Otros usos terapéuticos pueden consistir en la detención de hemorragia en cirugía general, para reconstruir nervios y vasos en cirugía reconstructiva, neuro- y plástica y para anclar piel, trasplantes vasculares o de cartílago o injertos en cirugía ortopédica, como puede ser para tratar osteoartritis de rodilla (rodilla inflamada) , vascular y plástica. Ciertas modalidades pueden ser útiles como vehículos para el suministro de células o moléculas bioactivas como factores de crecimiento para estimular la reparación focal; el suministro local de factores de crecimiento en combinación con las composiciones, materiales y/o formulaciones de matriz de proteína reticulada pueden facilitar la curación de heridas y regeneración de tejido en muchos casos, como puede ser para favorecer la formación de hueso, para estimular la reparación de cartílago en procedimientos ortopédicos, para tratar estados de heridas patológicas, como pueden ser úlceras crónicas y/o para que sirva como un andamio para generar tejidos artificiales mediante la proliferación de células autólogas en cultivo. En ciertas modalidades, la propiedad inyectable de las composiciones, materiales y/o formulaciones de matriz de proteína reticulada pueden hacerlas apropiadas para aumento de tejido en cirugía plástica, por ejemplo, como un material de relleno biocompatible, inerte, como puede ser para llenar grietas dérmicas o para reconstrucción de labios. En ciertas modalidades, las composiciones, materiales y/o formulaciones de matriz de proteina reticulada pueden ser útiles para la suplementación de una cavidad o deficiencia corporal. En ciertas modalidades, las composiciones, materiales y/o formulaciones de matriz de proteina reticulada pueden ser útiles en medicina estética, tratamientos ortopédicos, para restablecer el volumen perdido durante cirugía, como puede ser durante la cirugía de ojos y/o para aplicación tópica en tejido sano o lesionado, como puede ser piel, por ejemplo, para aplicación tópica en cosmetología y/o dermatología. En ciertas modalidades, las composiciones, materiales y/o formulaciones de la matriz de proteína reticulada pueden ser útiles para llenar arrugas faciales, líneas finas, tratamiento de piel "envejecida", tejido cicatrizado y/o depresiones de la piel, como puede ser lipodístrofia.
Ciertas modalidades pueden ser utilizadas para estabilizar una proteína, por ejemplo, una proteína bioactiva, pueden ser utilizadas para suministrar una o más proteínas estabilizadas, por ejemplo, una o más proteínas bioactivas.
Ciertas modalidades pueden incluir una sustancia farmacéutica activa perfectamente dispersada y pueden ser útiles como sistema de suministro de un fármaco. Ciertas modalidades pueden incluir, por ejemplo, proteínas, factores de crecimiento, enzimas, fármacos, biopolímeros , polímeros sintéticos compatibles con sistemas biológicos y/o combinaciones, derivados o variaciones de estos.
Características; estabilidad En ciertas modalidades, la matriz de proteína reticulada puede tener al menos una de las siguientes propiedades, como pueden ser, más no se limitan a, inyectable, biocompatible, considerablemente biocompatible, estable, considerablemente estable, mantiene la bioactividad, prácticamente mantiene la bioactividad, mantiene la conformación bioactiva, proporciona elasticidad o elasticidad considerable, un módulo elástico, un módulo viscoso, proporciona rigidez estructural y rigidez considerable, resistencia o resistencia considerable al calor, resistencia o resistencia considerable a la termólisis, resistencia o resistencia considerable a la biodegradación, puede ser biodegradable, puede no desencadenar una respuesta a cuerpo extraño o una respuesta intensa frente a un cuerpo extraño (es decir, auto-reconocimiento) , tiene un nivel de pureza de al menos aproximadamente 25%, puede ser extruida, puede ser extruida a través de una aguja, puede ser extruida a través de una aguja de calibre fino.
En ciertas modalidades, la composición, material y/o formulación de la matriz de proteina reticulada puede tener una molécula que contenga sacárido que tenga al menos una de las siguientes propiedades, que incluye, más no se limita a, solubilidad considerable, solubilidad en medio acuoso, prácticamente soluble en una solución acuosa y/o una solución amortiguadora acuosa, solubilidad en medio fisiológico, solubilidad considerable en el medio fisiológico, inyectable, biocompatible, prácticamente biocompatible, estable, prácticamente estable, mantiene la bioactividad, mantiene prácticamente la bioactividad, mantiene la conformación bioactiva, resistancia o resistencia considerable a la biodegradación, puede ser biodegradable, puede no desencadenar una respuesta frente a un cuerpo extraño o una respuesta intensa frente a cuerpo extraño (es decir, auto-reconocimiento) , o tiene un nivel de pureza de al menos aproximadamente 25%.
En ciertas modalidades, la composición, material, y/o formulación de la matriz de proteina reticulada puede tener y/o comprender al menos una de las siguientes propiedades, que incluye, más no se limita a, inyectable, biocompatible, prácticamente biocompatible, estable, prácticamente estable, mantiene la bioactividad, prácticamente mantiene la bioactividad, mantiene la conformación bioactiva, proporciona elasticidad o elasticidad considerable, un módulo elástico, un módulo viscoso, proporciona rigidez estructural o rigidez considerable, resistencia o resistencia considerable al calor, resistencia o resistencia considerable a la termólisis, resistencia o resistencia considerable a la biodegradación, puede ser biodegradable , pero no desencadenar una respuesta frente a un cuerpo extraño o una respuesta intensa frente a cuerpo extraño (es decir, auto-reconocimiento) , tiene un nivel de pureza de al menos aproximadamente 25%, es extruible, puede ser extruido a través de una aguja o se puede extruir a través de una aguja de calibre fino.
Ciertas modalidades pueden tener un módulo elástico de entre aproximadamente 500 Pa hasta aproximadamente 50 Pa, aproximadamente 450 Pa hasta aproximadamente 100 Pa, aproximadamente 400 Pa hasta aproximadamente 125 Pa; aproximadamente 400 Pa hasta aproximadamente 150 Pa, o aproximadamente 385 Pa hasta aproximadamente 150 Pa . El módulo elástico variará dependiendo de la concentración y los componentes que se utilicen. Por ejemplo, para un producto matriz de 1% HA reticulado a 4% tropoelastina el módulo elástico/de almacenamiento es estable a lo largo de un intervalo de frecuencias a alrededor de 80-100 Pa y domina el material con el módulo de pérdida comenzando alrededor de 5-10 Pa y poco a poco aumenta con frecuencias angulares crecientes.
Ciertas modalidades pueden tener una longitud que puede ser extruida, que esté considerablemente coherente y se mantenga considerablemente junta sin soporte, de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm cuando se extruye a través de una aguja calibre 25. Ciertas modalidades pueden tener una longitud extruible, que sea coherente y se mantenga junta sin soporte, de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm cuando se extruye a través de una aguja calibre 25.
Ciertas modalidades pueden tener una longitud que puede ser extruida, que esté considerablemente coherente y se mantenga considerablemente junta sin soporte, de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm cuando se extruye a través de una aguja calibre 27. Ciertas modalidades pueden tener una longitud extruible, que sea coherente y se mantenga junta sin soporte, de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm cuando se extruye a través de una aguja calibre 27.
Ciertas modalidades pueden tener una longitud que puede ser extruida, que esté considerablemente coherente y se mantenga considerablemente junta sin soporte, de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm cuando se extruye a través de una aguja calibre 30. Ciertas modalidades pueden tener una longitud extruible, que sea coherente y se mantenga junta sin soporte, de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm cuando se extruye a través de una aguja calibre 30.
Ciertas modalidades pueden tener una longitud que puede ser extruida, que esté considerablemente coherente y se mantenga considerablemente junta sin soporte, de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm cuando se extruye a través de una aguja calibre 31. Ciertas modalidades pueden tener una longitud extruible, que sea coherente y se mantenga junta sin soporte, de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm cuando se extruye a través de una aguja calibre 31.
Ciertas modalidades pueden ter una longitud que puede ser extruida de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm a través de una aguja calibre fino. Ciertas modalidades pueden tener una longitud extruible entre aproximadamente 5 cm hasta aproximadamente 30 cm, aproximadamente 10 cm hasta aproximadamente 20 cm; aproximadamente 10 cm hasta aproximadamente 15 cm, o aproximadamente 15 cm hasta aproximadamente 30 cm. Ciertas modalidades pueden tener una longitud extruible que esté considerablemente coherente y prácticamente se mantenga junta sin soporte, de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm a través de una aguja calibre fino. Ciertas modalidades pueden tener una longitud extruible que sea coherente y se mantenga junta sin soporte, de al menos aproximadamente 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm a través de una aguja calibre fino. Ciertas modaldiades pueden tener una longitud que puede ser extruida entre aproximadamente 5 cm hasta aproximadamente 30 cm, aproximadamente 10 cm hasta aproximadamente 20 cm; aproximadamente 10 cm hasta aproximadamente 15 cm, o aproximadamente 15 cm hasta aproximadamente 30 cm que esté considerablemente coherente y se mantenga prácticamente junta sin soporte cuando se extruye.
En ciertas modalidades, la composición, material, y/o formulación de la matriz de proteina reticulada puede ser estabilizada mediante el componente proteina del producto. La estabilidad de la composición, material y/o formulación de la matriz de proteina reticulada puede resultar de una combinación de un componente residuo de proteína de longitud completa y un componente residuo reticulador, como puede ser un componente residuo de polisacárido . En ciertas modalidades, las propiedades de un material final pueden no depender de la viscosidad del componente residuo de polisacárido, como puede ser el componente molecular polisacárido de inicio. La composición, material y/o formulación de la matriz de proteína reticulada puede ser estabilizado mediante el componente residuo reticulador del producto, como puede ser un residuo reticulador que contenga sacárido, por ejemplo, un residuo reticulador polisacárido.
En ciertas modalidades, la composición, material y/o formulación de la matriz de proteína reticulada contiene un residuo de proteína reticulado, biocompatible .
En ciertas modalidades, la composición, material, y/o formulación de la matriz de proteina reticulada puede ser apropiado para la incorporación en una j eringa .
En ciertas modalidades, es posible utilizar agujas de calibre fino. Por ejemplo, es posible utilizar agujas 25G, 27G, 29G, 30G o 31G. No obstante, ciertas modalidades pueden ser utilizadas con agujas de calibre más grande, por ejemplo, 20G a 25G, 15G a 25G, 15G a 20G, 10G a 20G, 10G a 15G, etc. En ciertas modalidades, el tamaño de la aguja puede depender del material inyectado, por ejemplo, el tipo y/o consistencia del material que se inyecte, en el deseo de suministrar una cantidad especifica de volumen de material y/o combinaciones o variaciones de estos. Ciertas modalidades permiten el uso de agujas calibre fino donde la formulación descrita conserva suficiente cohesividad después de la extrusión de la aguja de modo que hebras de material de >15 cm de largo pueden ser extruidas desde la aguja sin la ruptura del material. Por ejemplo, con ciertas modalidades, hebras de material de >15 cm de largo pueden ser extruidas de la aguja 25G, 27G, 29G o 30G sin la ruptura del material.
Para ciertas aplicaciones, por ejemplo, las aplicaciones de abultamiento, como puede ser el cuello de la vejiga es posible utilizar una aguja de calibre 18, 19, 20, 21, 22 o 23. Es posible utilizar agujas más anchas en ciertas aplicaciones ya que la longitud de la aguja es más larga (por lo regular de varias pulgadas) y de ese modo el flujo a través de la aguja es objeto de más resistencia. En ciertas aplicaciones, el volumen a ser inyectado también puede ser aumentado por varios mililitros, por ejemplo, al menos 1.5 mL, 2 mL, 2.5 mL, 3 mL o 4 mL. En ciertas aplicaciones, donde pueden utilizarse volúmenes menores (por ejemplo, el 'tejido' o (llenado de las arrugas finas o aumento de la piel delgada) el volumen que se utiliza puede ser menos, por ejemplo, menos de 2 mL, 1.5 mL, 1.0 mL, 0.75 mL, 0.5 mL o 0.1 mL. Por lo regular, estas aplicaciones utilizan una aguja de calibre angosto más corta, por ejemplo, 29G, 30G o 31G que son de ½ pulgada de largo.
El calibre de la aguja y la longitud de la aguja que se utilicen puede variar dependiendo de la aplicación y/o la formulación particular. Por ejemplo, formulaciones con mayores niveles de derivación (p. ej . , 20-30% de sitios modificados posibles, 1.5% de contenido de polisacárido y 5% de contenido de proteina) las cuales pueden utilizarse para proporcionar soporte persistente, estructural del tejido por lo regular se aplicarían utilizando una aguja más ancha y corta (como puede ser 27 o 25G x ½" o 1") . Otro ejemplo, sería una formulación con poca derivación (alrededor de 5%), bajo contenido de HA (<1%) y/o de proteína (<3%) que por lo regular sería suministrada a través de una aguja más fina, como puede ser una aguja 31G.
En ciertas modalidades, el material extruído puede ser extruido sin soporte - por lo regular extruido desde una superficie inicial verticalmente o en un ángulo de 45° de la vertical. La posibilidad de formar hebras coherentes del material puede hacerlo particularmente atractivo para aplicaciones donde se lleva a cabo el tejido del implante en la piel en una matriz o retícula para proporcionar soporte estructural.
También es posible utilizar otros métodos de suministro, por ejemplo, cánulas, catéteres, catéteres de polímeros flexibles y/o jeringas sin aguja.
En ciertas modalidades, al menos uno de los beneficios de los métodos y/o las composiciones, materiales y/o formulaciones de la matriz de proteína reticulada descritos en la presente es que la cantidad de proteina que puede ser incluida en la formulación del material resultante no es un factor limitativo. Por ejemplo, el contenido del residuo de proteina incluido en la matriz de proteina reticulada puede contener aproximadamente 35 o 40 mg/mL por encima de la cantidad de la cual se vuelve resistente a la extrusión con la aguja cuando se utilizan otros métodos de reticulación de a proteínas, como pueden ser los reticuladores químicos como glutaraldehído (ya que el material reticulado puede ser muy denso) . El residuo de proteína puede ser reticulado intra-molecularmente, inter-molecularmente y/o combinaciones de estos. El residuo de proteína puede ser considerable o solo reticulado inter-molecularmente. La formulación de la matriz de proteína reticulada puede ser más flexible y/o puede ser manejable para inyección a altas concentraciones de la proteína.
Las composiciones, materiales y/o formulaciones de la matriz de proteína reticulada que se describen en la presente pueden ser utilizados en un kit o paquete. En ciertas modalidades, el kit o paquete contiene una jeringa que haya sido precargada con la composición de la matriz de proteína reticulada y una selección de agujas de tamaño adecuado o sistemas de suministro con aguja, como puede ser un sistema tipo bola de rodillo de aguja, un sistema tipo recipiente para inyección automática o un sistema tipo pistola para inyección con mesoterapia. El paquete o kit también puede contener las instrucciones para inyectar la composición que se ofrece. En otras modalidades, el kit o paquete puede tener al menos una jeringa, al menos un envase diferente, como puede ser un vial o frasco ámpula que contenga la composición que se va a utilizar, múltiples agujas e instrucciones para utilizar el kit.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos y protocolos se proporcionan como modalidades particulares de la divulgación y para demostrar las ventajas de esta. Se entiende que los ejemplos y protocolos se dan como demostración y no se pretende limitar la especificación ni las reivindicaciones siguientes.
Procedimiento para la derivación de ácido hialurónico (HA) utilizando EDC y NHS : 1. Disolver HA en agua a una concentración final de 1% (posiblemente hasta o 2%). 2. Adicionar 1 g de N-hidroxisuccinimida (NHS) por g de HA que va a ser derivado. 3. Adicionar 1 g de l-ehil-3- ( 3-dimet ilaminopropil ) - carbodiimida (EDC) por gramo de HA. 4. Cerciorarse que los reactantes estén completamente disueltos mediante agitación (aproximadamente 10-20 min) . 5. Dejar reaccionar durante 60 min a 20-25°C. 6. Adicionar NaCl hasta una concentración final de 1%. 7. Precipitar el HA derivado mediante la adición de 2 volúmenes de isopropanol (IPA) . 8. Recuperar el HA derivado, precipitado por filtración, centrifugación suave u otro medio apropiado y descartar el sobrenadante. 9. Comprimir suavemente el HA derivado, recuperado para eliminar el liquido en exceso 10. Lavar el HA derivado, precipitado en IPA al 60%. 11. Retirar y descartar el liquido de lavado. 12. Comprimir suavemente el HA derivado, recuperado para ¦eliminar el líquido en exceso. 13. Pesar la cantidad de HA derivado, recuperado. 14. Disolver el HA derivado, recuperado en agua estéril a una concentración final de 2.5% con base en la cantidad de HA disuelto en el paso 1. 15. Analizar las cantidades de la derivación de NHS (con base en la modificación química y el análisis UV) . 16. Analizar la concentración de HA derivado, disuelto (con base en la modificación química y el análisis UV o el peso seco) . 17. Ajusfar la concentración del HA derivado a 2% (20 mg/mL) . 18. Filtrar por filtración estéril el HA derivado.
Nota: Los pasos 7-14 deben hacerse tan rápido como sea posible, por ejemplo, menos de 30 min deben permitirse para estos pasos en total (aunque la disolución real del HA precipitado puede tardar más) .
Procedimiento para la preparación de la matriz de proteína reticulada 1. Disolver la proteína en PBS (solución salina amortiguada con fosfato) estéril para una concentración final de 100 mg/mL y filtrar por filtración estéril. 2. Analizar la concentración de proteína (p. ej . , con base en el análisis UV) . 3. Mezclar volúmenes iguales de una solución de 20 mg/mL de HA derivado con una solución de 100 mg/mL de la proteína mediante agitación sin introducción de burbujas de aire. 4. Dejar que gelifique durante 30-60 minutos (20-25°C) . 5. Cargar las jeringas.
Los siguientes son procedimientos comunes que se utilizan en los Ejemplos siguientes.
EJEMPLO 1 Diagrama esquemático para la producción de un agente reticulador ácido hialurónico soluble utilizando carbodiimida y N-hidroxisuccinimida (NHS) : El ácido hialurónico (HA) es un polisacárido que consiste en las unidades del disacárido ácido ß-D-glucurónico - [ 1 , 3 ] -ß-D-N-acetil-glucosamina . La estructura ideal de HA se muestra en la Figura 1.
Como se puede observar, el HA contiene un grupo carboxilo por unidad disacárida, y éste es el grupo funcional que puede ser utilizado en el al menos uno de los métodos de reticulación que se describen en la presente. En este abordaje se forma un enlace químico covalente entre el grupo carboxilo del HA y los grupos amino libres de la proteína. Lo anterior se puede llevar a cabo haciendo reaccionar el HA con una carbodiimida como puede ser 2-etil-3- ( 3-dimetilaminopropil ) -carbodiimida (EDC) , formando un éster o-acilisourea activo. Aunque este compuesto es reactivo con nucleófilos como pueden ser los grupos amino primarios, también es inestable y se hidrolizará rápidamente en agua en ausencia de alguno de los grupos reactivos apropiados. Por tanto, muchas veces se prefiere formar un producto intermedio éster activo más estable a partir del éster o-acilisourea activo, lo cual se puede efectuar mediante una reacción de condensación empleando compuestos como N-hidroxisuccinimida (NHS) o sulfo-N-hidroxisuccinimida (Sulfo-NHS) . Lo anterior da lugar a la formación de HA activado con NHS, el cual luego puede reaccionar con grupos amino primarios procedentes de la proteína para formar enlaces amida muy estables. En la Figura 2 se muestran los esquemas de estas reacciones.
Uno de los principales beneficios de este abordaje es que el HA puede ser derivado antes de ser mezclado con la proteína, lo cual limitará o evitará la presencia de reactivos residuales de la derivación en la formulación final. El principal abordaje para eliminar los reactivos en exceso son la precipitación con disolventes orgánicos miscibles en agua como alcohol isopropílico (IPA) o etanol seguido por el lavado con una mezcla de agua/disolvente o la diafiltración empleando una membrana semipermeable con un límite de peso molecular apropiado.
Una vez que el HA derivado ha sido purificado, este puede entonces ser disuelto en agua o en una solución amortiguadora apropiada como solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y luego puede ser mezclado con la proteína para formar una formulación reticulada mediante la reacción entre los ácidos carboxilicos activados con NHS del HA y los grupos amino de la proteina. En este método el HA efectivamente se convierte en el reticulador para la proteína. Se espera que las propiedades de la formulación obtenida sean diferentes a una formulación donde la proteína se retícula con un reticulador corto; o, donde el HA se retícula mediante un reticulador corto en ausencia de una proteína.
EJEMPLO 2 Diagrama esquemático para una producción de un reticulador ácido hialurónico soluble empleando el reactivo heterobifuncional alilglicidil éter (AGE) Este enfoque se basa en la derivación de ácido hialurónico (HA) con un reactivo heterobifuncional que permite hacer un método en dos pasos para la reticulación de las proteínas con HA. El método elegido para este Ejemplo fue el uso de alilglicidil éter (AGE) , donde la incorporación inicial del AGE sucede cuando el grupo oxirano reacciona con los grupos hidroxilo del HA en condiciones fuertemente alcalinas, formando un enlace éter estable. Los grupos alilo de ese modo incorporado entonces se pueden convertir en halohidrinas mediante la reacción con un haluro, como puede ser bromo. Estas halohidrinas entonces pueden reaccionar con la proteina a través de los grupos amino primarios formando enlaces amina secundaria estables. La reacción entre las halohidrinas y los grupos amino primarios sucede con mayor eficiencia con valores de pH altos, pero alguna reacción comenzará a ocurrir por arriba del pH 8.5-9. 1. HA-OH + AGE ÍHA-R-CH=CH> 2. HA-R-CH-CH : -r Br2 + H20 - HA- -CHi OH K'l kBr + HBr XaOK 3. HA-R-CI NOl U-Ci Wir + Pr-NH: ^HA-R-CH(OH )-CH -NH-Pr ) HBr El esquema de reacciones mostrado en lo anterior para la reticulación de las proteínas con HA. HA = ácido hialurónico, R = 0-CH2-CH (OH) -CH2-0-CH2, AGE alilglicidil éter, Pr = Proteína.
EJEMPLO 3 Preparación de un agente reticulador polisacárido A: En este Ejemplo, 5 mL de una solución al 1% de ácido hialurónico de peso molecular bajo, 1 mL de H20, 100 mg de NHS (Sigma) y 100 mg de EDC (Sigma) se mezclaron entre sí y se dejaron reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después el ácido hialurónico derivado fue precipitado con dos volúmenes de IPA, se comprimió brevemente para disminuir el contenido de agua y el disolvente del precipitado, se lavó con una solución de etanol al 66%, luego se re-disolvió en 4 mL de solución salina amortiguada con fosfato (Sigma) a temperatura ambiente. El HA derivado se disolvió completamente en el lapso de 1 hora. La concentración del HA derivado se midió utilizando un analizador de humedad y luego se diluyó a una solución al 2% antes de utilizarlo para la reticulación de la proteína. Todas las preparaciones eran estériles y los experimentos, hasta donde fue posible, se hicieron en una campana de flujo laminar.
EJEMPLO 4 Preparación del reticulador polisacárido B: En este Ejemplo, 5 mL de una solución al 1% de carboximetil celulosa, 1 mL de H20, 100 mg de NHS (Sigma) y 100 mg de EDC (Sigma) se mezclaron entre sí y se dejaron reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. La carboximetil celulosa derivada fue luego precipitada con dos volúmenes de IPA, se comprimió brevemente para reducir el contenido de agua y disolvente del precipitado, se lavó con una solución de etanol al 66%, luego se re-disolvió en 4 mL de solución salina amortiguada con fosfato (Sigma) a temperatura ambiente. Todas las preparaciones fueron estériles y los experimentos se hicieron, hasta donde fue posible, en una campana de flujo laminar.
EJEMPLO 5 Preparación del reticulador polisacárido C: En este Ejemplo, 4 mL de HA al 2% se mezclaron con 0.5 mL de NaOH 10M y 0.5 mL de AGE y se dejaron reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. Después la solución fue neutralizada con lmL de ácido acético 9M, se adicionaron 40 mg de NaCl seguido por precipitación con dos volúmenes de IPA. El precipitado fue lavado con IPA al 60%, se secó sobre papel filtro formando una torta y luego se redisolvió en 3 mL de agua. Los grupos alilo incorporados después fueron convertidos con agua de bromo (se adicionaron 250 pL, pero la cantidad necesaria para la conversión completa fue entre 200 y 250 yL) . Para eliminar el bromo en exceso, la solución fue nuevamente precipitada adicionando 30 mg de NaCl seguido por 2 volúmenes de IPA. El precipitado fue lavado con IPA al 60% IPA, se secó sobre papel filtro para formar una torta y luego se re-disolvió en 2 mL de agua. Se utilizaron 0.5 mL de la solución para probar la concentración final del HA derivado en un analizador de humedad, y se encontró que el contenido de la materia seca era de 2.59%. El HA derivado fue diluido a una suspensión al 2% antes de utilizarla para reticular la proteína.
EJEMPLO 6 Preparación de una formulación a base de proteína utilizando rh tropoelastina 1: En este Ejemplo, 250 de una solución de 200 mg/mL de rh tropoelastina en salina amortiguada con fosfato (Elastagen) se mezclaron con 250 µ?, de salina amortiguada con fosfato, seguido por la adición de 500 µ]_, de reticulador ácido hialurónico del Ejemplo 3. La combinación fue mezclada perfectamente seguido por centrifugación breve para eliminar las burbujas de aire. El material fue dejado durante 30 min a temperatura ambiente para formularlo. La formulación entonces fue cargada en una jeringa estéril de 1 mL en una campana de flujo laminar. Las formulaciones preparadas de este modo todas presentaron las propiedades de materiales firmes que fueron extruibles a través de agujas de calibre fino 31G como hebras coherentes de 10-20 cm de longitud.
EJEMPLO 7 Preparación de una formulación a base de proteina empleando albúmina sérica bovina (BSA) : En este Ejemplo, 250 pL de una solución de 200 mg/mL de BSA en salina amortiguada con fosfato (Sigma) se mezclaron con 250 µ? de salina amortiguada con fosfato, seguido por la adición de 500 µ?_ del reticulador ácido hialurónico del Ejemplo 3. La combinación fue mezclada perfectamente, seguida por centrifugación breve para eliminar las burbujas de aire. Se dejó el material durante 30 min a temperatura ambiente para formular. La formulación preparada de este modo presentó las propiedades de una material firme que pudo ser extruido a través de agujas de calibre fino 31G como hebras coherentes de 10-20 cm de longitud.
EJEMPLO 8 Preparación de una formulación a base de proteina utilizando rhHSA: En este Ejemplo, una solución de 20 mg/mL solución de HSA recombinante (Sigma) en salina amortiguada con fosfato (Sigma) se mezcló con un volumen igual de reticulador ácido hialurónico del Ejemplo 3. La combinación fue mezclada perfectamente, seguida por centrifugación breve para eliminar las burbujas de aire.
Se de] ó el material durante 30 min a temperatura ambiente para formular. Lo anterior produjo una formulación de HSA incolora, transparente, reticulada, suave que pudo ser extruida a través de agujas calibre fino 31G.
EJEMPLO 9 Preparación de una formulación a base de proteina utilizando rh tropoelastina 2: En este Ejemplo, 500 de una solución de 100 mg/mL de rh tropoelastina en salina amortiguada con fosfato (Elastagen) se mezclaron con 500 L de una solución al 2% del reticulador ácido hialuronico del Ejemplo 5 a pH 8.5. La combinación fue mezclada perfectamente, seguida por breve centrifugación para eliminar las burbujas de aire. Se dejó el material durante 12 horas a temperatura ambiente para formular. La formulación producida fue una formulación de matriz incolora, transparente, firme de tropoelastina reticulada con HA.
E JEMPLO 10 Evaluación del contenido de monómero en las formulaciones En este Ejemplo, una alícuota de la formulación producida en el Ejemplo 6 fue macerada en PBS y el sobrenadante resultante fue analizado por SDS-PAGE (dodecilsulfato de sodio-electroforesis en gel de poliacrilamida ) (el gel resultante se muestra en la Figura 3) .
Carga: Formulación producida en el Ejemplo 6, macerada en PBS Franja M: marcador.
Franjas A y B: sobrenadante.
Franja TE: TE puro.
Como se puede observar en el gel, no se extrajo monómero de la preparación HA-TE.
EJEMPLO 11 Evaluación de la reologia de la formulación En este Ejemplo, el comportamiento reológico en los flujos por cizallamiento de la formulación producida en el Ejemplo 6 se estudió utilizando un reómetro Haake RS 150 utilizando una geometría de cono y placa. En el estudio se utilizó un cono de titanio de 35 mm/l° manteniendo la temperatura a 25°C.
La respuesta de la formulación frente al flujo con cizallamiento oscilatorio de amplitud pequeña, con frecuencia angular variable, es dominado por el módulo de almacenamiento (C) en el intervalo de la frecuencia angular de 0.1 y 100 rad/s. En este intervalo el módulo de almacenamiento fue relativamente insensible a los cambios de la frecuencia angular. En flujo por cizallamiento estable, el esfuerzo aumenta linealmente con tensión de hasta aproximadamente 200 Pa.
Más allá de este valor, un cambio pequeño en la tensión aplicada dio origen a un aumento significativo en el esfuerzo. Cuando la viscosidad por cizallamiento fue graficada contra la velocidad de cizallamiento el fluido demostró una viscosidad constante de alrededor de 260 Pas a velocidades de cizallamiento bajas. Sin embargo, la viscosidad disminuyó rápidamente con la velocidad de cizallamiento creciente más allá de una velocidad de cizallamiento de aproximadamente 0.4/s.
Las propiedades reológicas de la formulación a base de proteina producida en el Ejemplo 6 son significativamente diferentes de los polisacáridos no reticulados de los productos polisacárido reticulados con reticuladores cortos, como puede ser BDDE los cuales luego son micronizados para permitir la extrusión a través de agujas finas. Estos productos polisacáridos se comportan más como fluidos viscosos y tienen una contribución mayor a sus propiedades reológicas respecto al módulo de pérdida (G") en las mismas frecuencias examinadas. El valor relativamente constante del módulo complejo de la formulación producida en el Ejemplo 6 proporciona un punto de diferencia particular para los productos a base de polisacárido .
En lo siguiente, se proporcionan otras modalidades y ej emplos : Modalidad 1. Una composición, que contiene al menos una matriz de proteína reticulada, en donde la al menos una matriz de proteína reticulada contiene: i) al menos un residuo de proteína; y ii) al menos un residuo que contiene sacárido. 2. La composición de la modalidad 1, en donde la composición es una composición inyectable. 3. La composición de las modalidades 1 o 2, en donde la composición se suministra por cánula, catéter, catéter de polímero flexible, jeringa con aguja o jeringa sin aguja. 4. La composición de una o más de las modalidades 1-3, en donde la composición puede ser extruida a una longitud de al menos 10 cm. 5. La composición de una o más de las modalidades 1-4, en donde la composición puede ser extruida a través de agujas de 18G hasta 31G a una longitud de entre aproximadamente 5 cm hasta aproximadamente 30 cm y la composición extruida se mantiene considerablemente junta sin soporte de superficie. 6. La composición de una o más modalidades 1-5, en donde la composición puede ser extruida a través de una aguja 25G a una longitud de al menos 5 cm, 10 cm, 12 cm, 15 cm, 18 cm, 20 cm, o 25 cm. 7. La composición de una o más modalidades 1-6, en donde la composición puede ser extruida a una longitud de al menos 10 cm, 15 cm, 20 cm, o 25 cm cuando se extruye a través de una aguja de calibre fino. 8. La composición de una o más modalidades 1-7, en donde la composición puede ser extruida a una longitud de entre 5 cm a 30 cm, 10 cm a 20 cm; o 15 cm a 30 cm sin otro soporte de superficie cuando se extruye a través de una aguja de calibre fino, y en donde la composición extruida es considerablemente coherente y prácticamente se mantiene junta. 9. La composición de una o más modalidades 1-8, en donde la composición puede ser extruida a una longitud de al menos 10 cm, 15 cm, 20 cm, o 25 cm sin soporte físico adicional cuando se extruye a través de un calibre medio y la composición extruida es considerablemente coherente y se mantiene prácticamente junta. 10. La composición de una o más modalidades 1-9, en donde la composición puede ser extruida a una longitud de al menos 10 cm, 15 cm, 20 cm, o 25 cm sin soporte de superficie adicional cuando se extruye a través de una aguja de calibre grande y la composición extruida es considerablemente coherente y se mantiene prácticamente junta. 11. La composición de una o más de las modalidades 1-10, en donde la composición puede ser extruida a una longitud de al menos 10 cm, 20 cm, o 30 cm sin soporte de superficie adicional en un ángulo de al menos 45° desde la vertical y forma hebras coherentes del material. 12. La composición de una o más de las modalidades 1-11, en donde la composición extruida forma hebras coherentes del material. 13. La composición de una o más de las modalidades 1-12, en donde la composición puede ser extruida sin procesamiento adicional considerable. 14. La composición de una o más de las modalidades 1-13, en donde la composición puede ser extruida sin procesamiento adicional considerable a través de una aguja de calibre fino y cuando se extruye es considerablemente coherente y prácticamente se mantiene junta sin soporte físico adicional. 15. La composición de una o más de las modalidades 1-14, en donde la composición conserva cohesividad suficiente después de la extrusión de la aguja de modo que las hebras de la composición extruida no se rompen durante la extrusión . 16. La composición de una o más de las modalidades 1-15, en donde la composición mantiene cohesividad suficiente después de la extrusión de la aguja de modo que las hebras de la composición mayores de 10 cm, mayores de 12 cm, mayores de 15 cm, mayores de 18 cm o mayores de 20 cm pueden ser extruidas desde la aguja sin que las hebras de la composición se rompan. 17. La composición de una o más de las modalidades 1-16, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene un residuo de proteina de longitud completa. 18. La composición de una o más de las modalidades 1-17, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene un residuo de proteina de longitud considerablemente completa. 19. La composición de una o más de las modalidades 1-18, en donde la composición es considerablemente flexible, de modo que puede ser expulsada a través de una aguja. 20. La composición de una o más de las modalidades 1-19, en donde la composición tiene suficiente flexibilidad para permitir la expulsión a través de agujas de calibre fino. 21. La composición de una o más de las modalidades 1 -20, en donde la composición permite a al menos un residuo de proteina retener su longitud completa o longitud considerablemente completa, y el al menos un residuo de proteina es protegido de la reabsorción rápida o degradación . 22. La composición de una o más de las modalidades 1-21, en donde la composición permite a al menos un residuo de proteina conservar su longitud completa, o longitud considerablemente completa, y en donde la composición es inyectable con aguja, conserva una estructura coherente y se retícula suficientemente para hacer lenta la resorción de la composición in vivo. 23. La composición de una o más de las modalidades 1-22, en donde el al menos un residuo de proteína es de longitud considerablemente completa y está considerablemente desprovisto de enlaces cruzados intramoleculares . 24. La composición de una o más de las modalidades 1-23, en donde la composición es compatible con tejido, mejora el crecimiento interno del tejido, mejora el nuevo crecimiento de tejido, o combinaciones de estos. 25. La composición de una o más de las modalidades 1-24, en donde la composición puede ser remodelada en las estructuras comunes y deseables e incorporada en nuevo tejido. 26. La composición de una o más de las modalidades 1-25, en donde el al menos un residuo que contiene sacárido permanece soluble, o suficientemente soluble, en agua o solución salina. 27. La composición de una o más de las modalidades 1-26, en donde el al menos un residuo que contiene sacárido es considerablemente soluble en medio acuoso o fisiológico. 28. La composición de una o más de las modalidades 1-27, en donde el al menos un residuo de proteina reticulada es considerablemente reticulada con enlaces intermoleculares . 29. La composición de una o más de las modalidades 1-28, en donde el al menos un residuo que contiene sacárido tiene uno o más de las siguientes propiedades: considerablemente biodisponible, considerablemente biodegradable, considerablemente bioabsorbible, o considerablemente bioresorbible . 30. La composición de una o más de las modalidades 1 -29, en donde el al menos un residuo que contiene sacárido contiene al menos un residuo de polisacárido, al menos un residuo de oligosacárido, o combinaciones de estos. 31. La composición de una o más de las modalidades 1-30, en donde el al menos un residuo de polisacárido contiene un residuo de polisacárido de peso molecular bajo, medio alto, o combinaciones de estos. 32. La composición de una o más de las modalidades 1-31, en donde el al menos un residuo de polisacárido comprende un peso molecular de entre aproximadamente 50,000 hasta aproximadamente 275,000 Daltons. 33. La composición de una o más de las modalidades 1-32, en donde el al menos un residuo de polisacárido se obtiene de o contiene el residuo de ácido hialurónico, un derivado de celulosa, carboxi celulosa, carboximetil celulosa, hidroximetil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, hidroxipropil celulosacarboximetil amilosa, goma de xantana, goma de guar, -glucano, ß-glucano, ß-1 , 4-glucano, ß-1 , 3-glucano, alginatos, carboximetil dextrano, derivado de glicosaminoglicano, 6-sulfato de condroitina, sulfato de dermatina, heparina, sulfato de heparina, poliácido láctico, poliácido glicólico, poli (ácido láctico-co-glicólico) , fosfato tricálcico, 1-hidroxiapatita, las sales aceptadas para uso farmacéutico, derivados de, o combinaciones de estos. 34. La composición de una o más de las modalidades 1-33, en donde el al menos un residuo de polisacárido se obtiene de o contiene el residuo de ácido hialurónico. 35. La composición de una o más de las modalidades 1-34, en donde el al menos un residuo de polisacárido se obtiene de o contiene residuo de carboximetil celulosa. 36. La composición de una o más de las modalidades 1-35, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene el al menos un residuo que contiene sacárido en una concentración de entre aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 30%. 37. La composición de una o más de las modalidades 1-36, en donde el al menos un residuo de proteína contiene un residuo de cadena lateral portador de amina, que contiene al menos un residuo de lisina, al menos un residuo de arginina, o combinaciones de estos. 38. La composición de una o más de las modalidades 1-37, en donde el al menos un residuo de proteína se obtiene de o contiene el residuo de tropoelastina, elastina, albúmina, colágena, monómeros de colágena, inmunoglobulinas, insulina, derivados de, o combinaciones de estos. 39. La composición de una o más de las modalidades 1-38, en donde la cantidad del al menos un residuo de proteína es entre aproximadamente 1 mg/mL hasta aproximadamente 200 mg/mL. 40. La composición de una o más de las modalidades 1-39, en donde la al menos una matriz de proteína reticulada contiene un residuo de proteína bioactivo. 41. La composición de una o más de las modalidades 1-40, en donde la al menos una matriz de proteína reticulada se obtiene de o contiene el residuo de una proteína sintética considerablemente idéntica a una proteína humana natural. 42. La composición de una o más de las modalidades 1-41, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada se obtiene de o contiene el residuo de una proteina estabilizada . 43. La composición de una o más de las modalidades 1-42, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada se obtiene de o contiene el residuo de una proteina extra celular . 44. La composición de una o más de las modalidades 1-43, en donde la proteina extra celular es tropoelastina, elastina, colágena o un derivado de éstas. 45. La composición de una o más de las modalidades 1-44, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene el al menos un residuo que contiene sacárido en una concentración de entre aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 5%. 46. La composición de una o más de las modalidades 1-45, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene una proporción de aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 1.5% del al menos un residuo que contiene sacárido a aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 6% del al menos un residuo de proteina. 47. La composición de una o más de las modalidades 1-46, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene una proporción de aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1.5% del al menos un residuo que contiene sacár do, que consiste en un residuo de polisacárido, para aproximadamente 0.1% hasta aproximadamente 6% del al menos un residuo de proteina. 48. La composición de una o más de las modalidades 1-47, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada se prepara a partir de al menos una molécula reticuladora que contiene sacárido que contiene al menos 5%, 10%, 20%, o 25% de grupos carboxilo y/o hidroxilo activados, grupos carboxilo y/o hidroxilo modificados, o combinaciones de estos. 49. La composición de una o más de las modalidades 1-48, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada se prepara a partir de al menos una molécula reticuladora que contiene sacárido, que contiene al menos 5% de grupos carboxilo y/o hidroxilo activados, grupos carboxilo y/o hidroxilo modificados, o combinaciones de estos. 50. La composición de una o más de las modalidades 1-49, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene menos de 5% de un residuo de proteina monomérico. 51. La composición de una o más de las modalidades 1-50, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene menos de 1% del residuo de proteina monomérico. 52. La composición de una o más de las modalidades 1-51, en donde la composición se emplea para fines terapéuticos en al menos uno de lo siguiente: cirugía, estética, abultamiento de tejido, para tratar incontinencia, en productos de reemplazo dérmico, dermatología, cirugía dermatológica, cosméticos o combinaciones de estos. 53. La composición de una o más de las modalidades 1-52, en donde la composición se emplea para fines terapéuticos en dermatología. 54. La composición de una o más de las modalidades 1-53, en donde la composición se emplea para fines terapéuticos en cirugía dermatológica. 55. La composición de una o más de las modalidades 1-54, en donde la composición se emplea para fines terapéuticos como aplicación tópica en cosmetología, dermatología o combinaciones de estos. 56. La composición de una o más de las modalidades 1-55, en donde la composición se emplea para fines terapéuticos como una aplicación tópica en dermatología. 57. La composición de una o más de las modalidades 1-56, en donde la composición se utiliza para el tratamiento de arrugas faciales, para rellenar arrugas faciales, para el tratamiento de líneas finas, el tratamiento de piel envejecida, el tratamiento de tejido cicatrizado, tratamiento de depresiones de la piel o combinaciones de estos. 58. La composición de una o más de las modalidades 1-57, en donde la composición se emplea en el implante de un depósito localizado del residuo de- proteina considerablemente bioactivo. 59. La composición de una o más de las modalidades 1-58, en donde la composición se emplea en la implantación de un depósito localizado de un residuo de proteina considerablemente bioactivo. 60. La composición de una o más de las modalidades 1-59, en donde la composición se emplea en el implante del depósito de liberación lenta de un residuo de proteina considerablemente bioactivo. 61. La composición de una o más de las modalidades 1-60, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene al menos 90%, 95%, 98% o 99% del al menos un residuo de proteina reticulado con una biomolécula y/o biopolimero, en donde la biomolécula y/o biopolimero comprende el al menos un residuo que contiene sacárido. 62. La composición de una o más de las modalidades 1-61, en donde la al menos una matriz de proteína reticulada contiene el al menos un residuo de proteína que está considerablemente reticulado con una biomolécula, biopolimero reticulador o combinaciones de estos. 63. La composición de una o más de las modalidades 1-62, en donde el número de enlaces cruzados en el al menos un residuo de polisacárido puede ser al menos 5%, 10%, 15%, 20% o 25% del número de sitios reticulados posibles en el al menos un residuo de polisacárido . 64. La composición de una o más de las modalidades 1-63, en donde el número de unidades de proteína no incorporadas en la al menos una matriz de proteína reticulada y que quedaron no unidas puede ser al menos 1"6 , 3"6 , 5"6 O 7 "6. 65. La composición de una o más de las modalidades 1-64, en donde menos de 20%, 15%, 10%, o 7% de las unidades de proteina no se incorporan en la al menos una matriz de proteína reticulada y quedan no unidas. 66. La composición de una o más de las modalidades 1-65, en donde el monómero de proteína puede ser reticulado de modo que entre aproximadamente 90% hasta aproximadamente 100% del monómero de proteína puede ser incorporado en la composición . 67. La composición de una o más de las modalidades 1-66, en donde el al menos un residuo de proteína se obtiene a partir de una proteína de longitud completa o una proteína de longitud considerablemente completa, y en donde la estructura del residuo de proteína no es considerablemente enmascarado por el al menos un residuo que contiene sacárido. 68. La composición de una o más de las modalidades 1-67, en donde la composición, que contiene al menos un residuo de proteina que tiene una estructura que no es considerablemente enmascarada por el al menos un residuo que contiene sacárido, puede ser más compatible con tejido, mejorar el crecimiento interno del tejido, el re-crecimiento o combinaciones de estos. 69. La composición de una o más de las modalidades 1-68, en donde la composición, que contiene al menos un residuo de proteina que tiene una estructura que no es considerablemente enmascarada por el al menos un residuo que contiene sacárido, puede ser remodelada en estructuras más típicas y deseables y/o incorporada en un nuevo tejido. 70. Un método para preparar la composición de una o más de las modalidades 1-69, que consiste en reticular al menos una proteína con al menos una molécula que contiene sacárido, soluble. 71. Un método de preparación de una composición que contiene al menos una matriz de proteína reticulada, en donde la al menos una matriz de proteína reticulada contiene: i) al menos un residuo de proteína; y ii) al menos un residuo que contiene sacárido; en donde la reticulación consiste en: i) modificar la al menos una molécula que contiene sacárido para que contenga al menos un grupo químico reactivo; ii) combinar la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada con la al menos una proteina, en donde la al menos una proteina contiene un grupo químico reactivo complementario para el grupo reactivo en la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada; y iii) formar al menos un enlace entre la al menos una proteina y la al menos una molécula modificada que contiene sacárido, modificada . 72. El método de las modalidades 70 o 71, en donde el al menos un grupo químico reactivo es un grupo químico que puede formar un enlace covalente cuando se combina con la al menos una proteína. 73. El método de una o más de las modalidades 70-72, en donde el al menos un enlace es un enlace covalente. 74. El método de una o más de las modalidades 70-73, en donde la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada es soluble o considerablemente soluble en agua y/o solución salina. 75. El método de una o más de las modalidades 70-74, en donde la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada permanece soluble o considerablemente soluble en agua o solución amortiguadora fisiológica. 76. El método de una o más de las modalidades 70-75, en donde la al menso una molécula que contiene sacárido contiene un grupo carboxilo y/o hidroxilo. 77. El método de una o más de las modalidades 70-76, en donde la al menos una molécula que contiene sacárido es modificada activando un grupo carboxilo y/o hidroxilo. 78. El método de una o más de las modalidades 70-77, en donde el método además puede consistir en purificar la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada, por precipitación y/o filtración de la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada, para eliminar o prácticamente eliminar los reactantes de la modificación sin reaccionar. 79. El método de una o más de las modalidades 70-78, en donde la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada, se utiliza como agente reticulador cuando se combina con la al menos una proteina. 80. El método de una o más de las modalidades 70-79, en donde la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada, se mezcla con la al menos una proteina para formar la al menos una matriz de proteina reticulada. 81. Un método de uso que consiste en inyectar la composición de una o más de las modalidades 1-69. 82. El método de la modalidad 81, en donde la inyección se utiliza para abultar, aumentar tejidos o combinaciones de estos, en al menos uno de lo siguiente: medicina humana o veterinaria; cirugía; cirugía restaurativa; cirugía estética; estética; abultamiento de tejido; cirugía dermatológica; cirugía de ojos; reumatología; farmacología; en el campo de la cosmética; para detener hemorragia en cirugía general; para reconstruir nervios y vasos en cirugía reconstructiva, neurocirugía ; cirugía plástica; para anclar la piel, trasplantes o injertos vasculares o cartílago en cirugía ortopédica, para tratar osteoartritis de rodilla; cirugía vascular; como vehículos para el suministro de células o moléculas bioactivas, como factores de crecimiento para estimular la reparación focal; el suministro local de factores de crecimiento en combinación con las composiciones de matriz de proteína reticulada para facilitar la curación de heridas y regeneración de tejido o favorecer la formación de hueso; para estimular la reparación de cartílago en procedimientos ortopédicos; para tratar estados de heridas patológicas, como pueden ser úlceras crónicas; sirve como andamio para generar tejidos artificiales mediante la proliferación de células autólogas en cultivo; para aumento de tejido en cirugía plástica, como puede ser para llenar grietas dérmicas o para reconstrucción de labios; para suplementacion de una cavidad o deficiencia corporal; para medicina estética; tratamiento ortopédico; o para restaurar el volumen perdido durante cirugía, como puede ser durante la cirugía de ojos. 83. Un método de uso que consiste en: aplicar por vía tópica una composición de una o más de las modalidades 1-69. 84. El método de la modalidad 83, en donde la aplicación tópica se utiliza en tejido sano o lesionado en al menos uno de lo siguiente: cosmetología; dermatología; el llenado de arrugas faciales; líneas finas; tratamiento de piel envejecida; tejido cicatrizado; o depresiones de la piel. 85. Un kit para administrar las composiciones de una o más de las modalidades 1-69.
Si bien la presente divulgación ha sido descrita en relación con ciertas modalidades, debe entenderse que la presente divulgación no está limitada a las modalidades descritas, sino por el contrario se pretende cubrir las diversas modificaciones y arreglos equivalentes. Asimismo, las diversas modalidades descritas en la presente pueden ponerse en práctica junto con otras modalidades, p. ej . , aspectos de una modalidad pueden ser combinados con aspectos de otra modalidad para constituir todavía otras modalidades. Además, cada característica o componente independiente de una modalidad puede constituir una modalidad adicional.

Claims (18)

  1. REIVINDICACIONES Una composición que contiene al menos una matriz de proteina reticulada, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene: i) al menos un residuo de proteina; y ii) al menos un residuo que contiene sacárido. La composición de la reivindicación 1, en donde la composición es una composición inyectable. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-2, en donde la composición puede ser extruida a través de agujas de 18G a 31G a una longitud de entre aproximadamente 5 cm hasta aproximadamente 30 cm y la composición extruida permanece considerablemente junta sin soporte superficial. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-3, en donde la composición puede ser extruida a una longitud de entre 5 cm a 30 cm, 10 cm a 20 cm; o 15 cm a 30 cm sin soporte de superficie adicional cuando se extruye a través de una aguja de calibre fino y en donde la composición extruida es considerablemente coherente y se mantiene prácticamente junta. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-4, en donde la composición conserva suficiente cohesividad después de la extrusión en aguja de modo que las hebras de la composición extruida no se rompen durante la extrusión. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-5, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene un residuo de proteina de longitud considerablemente completa. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-6, en donde la composición permite a al menos un residuo de proteina conservar su longitud completa, o longitud considerablemente completa, y en donde la composición es inyectable con aguja, conserva una estructura coherente y se retícula suficientemente para hacer lenta la resorción de la composición in vivo . La composición de una o más de las reivindicaciones 1-7, en donde el al menos un residuo de proteína es de longitud considerablemente completa y está prácticamente desprovisto de enlaces cruzados intramoleculares . La composición de una o más de las reivindicaciones 1-8, en donde la composición es compatible con tejido, mejora el crecimiento interno del tejido, mejora el re-crecimiento del tejido o combinaciones de estos. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-9, en donde el al menos un residuo que contiene sacárido tiene una o más de las siguientes propiedades: considerablemente biodisponible, considerablemente biodegradable , considerablemente bioabsorbible , o considerablemente bioresorbible . La composición de una o más de las reivindicaciones 1-10, en donde el al menos un residuo de polisacárido se obtiene de o contiene el residuo de ácido hialurónico, un derivado de celulosa, carboxi celulosa, carboximetil celulosa, hidroximetil celulosa, hidroxipropil celulosa, hidroxipropil metilcelulosa, hidroxipropil celulosacarboximetil amilosa, goma de xantana, goma de guar, a-glucano, ß-glucano, ß-?, 4-glucano, ß-1 , 3-glucano, alginatos, carboximetil dextran, un derivado de glicosaminoglicano, 6-sulfato de condroitina, sulfato de dermatina, heparina, sulfato de heparina, poliácido láctico, poliácido glicólico, poli (ácido láctico-co-glicólico) , fosfato tricálcico, 1-hidroxiapatita, las sales de, derivados de o combinaciones de estos aceptados para uso farmacéutico . La composición de una o más de las reivindicaciones 1-11, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene el al menos un residuo que contiene sacárido en una concentración de entre aproximadamente 0.01% hasta aproximadamente 30%. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-11, en donde la al menos un residuo de proteina se obtiene de o contiene el residuo de tropoelastina, elastina, albúmina, colágena, monómeros de colágena, inmunoglobulinas, insulina, derivados de, o combinaciones de estos. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-13, en donde la cantidad del al menos un residuo de proteina es entre aproximadamente 1 mg/mL hasta aproximadamente 200 mg/mL. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-14, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada se obtiene de, o contiene el residuo de una proteina sintética considerablemente idéntica a una proteina humana natural. 16. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-15, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada se prepara a partir de al menos una molécula reticuladora que contiene sacárido que contiene al menos 5% de grupos carboxilo y/o hidroxilo activados, grupos carboxilo y/o hidroxilo modificados, o combinaciones de estos. La composición de una o más de las reivindicaciones 1-16, en donde el número de unidades de proteina no incorporadas en la al menos una matriz de proteina reticulada y que quedaron no unidas puede ser al menos 1%, 3%, 5% o 7%. 18. Un método para preparar una composición que contiene al menos una matriz de proteina reticulada, en donde la al menos una matriz de proteina reticulada contiene : i) al menos un residuo de proteina; y ii) al menos un residuo que contiene sacárido; en donde la reticulación consiste en: i) modificar la al menos una molécula que contiene sacárido para que contenga al menos un grupo químico reactivo; ii) combinar la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada, con la al menos una proteína, en donde la al menos una proteína contiene un grupo químico reactivo complementario al grupo reactivo en la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada; y iii) formar al menos un enlace entre la al menos una proteína y la al menos una molécula modificada que contiene sacárido, modificada. El método de la reivindicación 18, en donde la al menos una molécula que contiene sacárido, modificada, permanece soluble o considerablemente soluble en agua o solución amortiguadora fisiológica . El método de la reivindicación 19, en donde la inyección se utiliza para abultar, aumentar tejidos o combinaciones de estos, en al menos uno de lo siguiente: medicina humana o veterinaria; cirugía; cirugía restaurativa; cirugía estética; estética; abultamiento de tejido; cirugía dermatológica; cirugía de ojos; reumatología ; farmacología; en el campo de la cosmética; para detener hemorragia en cirugía general; para reconstruir nervios y vasos en cirugía reconstructiva, neurocirugía; cirugía plástica; para anclar la piel, para trasplantes o injertos vasculares o cartílago en cirugía ortopédica, para tratar osteoartritis de rodilla; cirugía vascular; como vehículos para el suministro de células o moléculas bioactivas, como factores de crecimiento para estimular la reparación focal; el suministro local de factores de crecimiento en combinación con las composiciones de matriz de proteína reticulada para facilitar la curación de heridas y la regeneración de tejido o favorecer la formación de hueso; para estimular la reparación de cartílago en procedimientos ortopédicos; para tratar estados de heridas patológicas, como úlceras crónicas; sirve como andamio para generar tejidos artificiales mediante la proliferación de células autólogas en cultivo; para el aumento de tejido en cirugía plástica, como puede ser para llenar grietas dérmicas o para reconstrucción de labios; para suplementación de una cavidad o deficiencia corporal; para medicina estética; tratamiento ortopédico; o para restaurar el volumen perdido durante cirugía, como puede ser durante la cirugía de ojos.
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