MX2013001716A - Anticuerpos de peptido beta amiloide anti-n3pglu y usos de los mismos. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona anticuerpos Aß anti-N3pGlu o su fragmento de unión a antígeno. Además, la presente invención proporciona el uso de los anticuerpos anti-N3pGlu o su fragmento de unión a antígeno para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.

Description

ANTICUERPOS DE PEPTIDO BETA AMILOIDE ANTl-N3pGlu Y USOS DE LOS MISMOS La presente invención se refiere a anticuerpos que selectivamente unen péptido beta amiloide N3pGlu y su uso en el tratamiento de enfermedades relacionado a péptido Beta Amiloide (?ß, también referido como péptido Abeta).

El péptido ?ß en forma circulante está compuesto de 38-43 aminoácidos (principalmente 38, 40 ó 42 aminoácidos) resultando a partir del desdoblamiento de una proteína precursora, proteína precursora amiloide (APP). La conversión de ?ß a partir de formas soluble a insoluble que tiene un alto contenido lámina ß y la deposición de estas formas insolubles como placas neuríticas y cerebrovasculares en el cerebro se han asociado con un número condiciones y enfermedades, que incluyen enfermedad de Alzheimer (AD), síndrome de Down y angiopatía amiloide cerebral (CAA).

Los depósitos encontrados en plaquetas están comprendidos principalmente de mezclas heterogéneas de péptidos ?ß. ?ß N3pGlu, también referido como NepE o ?ß?3.42, es una forma truncada del péptido ?ß encontrado solamente en plaquetas. ?ß N3pGlu carece de los primeros dos residuos de aminoácido en el N-término de ?ß y tiene piroglutamato el cual se deriva de ácido glutámico en la tercera posición de aminoácido. A pesar que el péptido ?ß N3pGlu es un componente menor del ?ß depositado en el cerebro, estudios han demostrado que el péptido ?ß N3pGlu tiene propiedades de agregación agresivas y se acumula temprano en la cascada de deposición.

Mientras los anticuerpos policlonal y monoclonal del objetivo del péptido ?ß N3pGlu han sido previamente descritos en (US 7,122,374 y WO2010/009987), existe aún una necesidad para anticuerpos monoclonales ?ß anti-N3pGlu de alta afinidad para acoplarse in vivo (es decir, unirse a plaquetas) y subsecuentemente disminuir los niveles de plaquetas. Además, dado que los anticuerpos anti-?ß amino-termina y carboxilo terminal conducen a un incremento en angiopatía amiloide cerebral (CAA) relacionado a microhemorragia, existe una necesidad por anticuerpos ?ß anti-N3pGlu que no resulta en un incremento en microhemorragia aún sin embargo el tratamiento crónico resulta en una reducción significante de la placa depositada.

Los anticuerpos dentro del alcance de la presente invención son antagonistas del péptido ?ß N3pGlu terapéuticamente útiles que poseen un número de propiedades deseables. Los presentes anticuerpos unen el péptido ?ß N3pGlu humano con gran afinidad y exhiben disminución de placa in vivo dependiente de la dosis sin un incremento en angiopatía amiloide cerebral (CAA) relacionado a microhemorragia.

La presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano, o fragmento del mismo de unión al antígeno que tiene un Kd a 25°C de menos que 1 x 10"9 M para péptido ?ß N3pGlu humano. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano, o fragmento del mismo de unión al antígeno que tiene un Kd a 25°C de menos que 9 x 10"10 M para el péptido ?ß N3pGlu humano. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano, o un fragmento del mismo de unión al antígeno que tiene un Kd a 25°C de menos que 7 x 10"10 M para el péptido ?ß N3pGlu humano. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano, o un fragmento del mismo de unión al antígeno que tiene un Kd a 25°C entre 9 x 10"10 M y 1 x 10"10 M para el péptido ?ß N3pGlu humano. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu, o un fragmento del mismo de unió al antígeno que tiene un Kd a 25°C entre 9 x 10"10 M y 1 x 10"10 M para un péptido ?ß N3pGlu humano.

La presente invención además proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano, o un fragmento del mismo de unión al antígeno que tiene un Kd a 25°C de menor que 1 x 10"9 M, o menos que 9 x 10"10 M, o menos que 7 x 10'10 M, o entre 9 x 10"10 M y 1 x 10'10 M para el péptido ?ß N3pGlu humano y placa disminuida in vivo. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano, o un fragmento del mismo de unión al antígeno que tiene un Kd a 25°C de menos que 1 x 10"9 M, o menos que 9 x 10~10 M, o menos que 7 x 10"10 M, o entre 9 x 10"10 M y 1 x 10~10 M para el péptido ?ß N3pGlu humano o una placa disminuida in vivo sin incremento de microhemorragia relacionada a CAA.

La presente invención también proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LCVR y un HCVR en donde LCDR1 es KSX1X2SLLYSRX3KTYLN (SEC ID NO: 51), LCDR2 es AVSKLX4S (SEC ID NO: 52), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5) y HCDR1 es GYX5FTX6YYIN (SEC ID NO: 53), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGX7TVY (SEC ID NO: 54), en donde X, es S o T; X2 es Q o R, X3 es G o S, X4 es D o G, X5 es D o T, X6 es R o D, y X7 es I, T, E, o V.

La presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano, o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde esta LCVR comprende polipéptidos LCFR1, LCDR2, LCDR3 y la HCVR comprende polipéptidos HCDR1, HCDR2, HCDR3 los cuales se seleccionan del grupo que consiste de: a) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEC ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEC ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5), HCDR1 es GYDFTRYYIN (SEC ID NO: 6), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGITVY (SEC ID NO: 9); b) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEC ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEC ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTRYYIN (SEC ID NO: 7), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGTTVY (SEC ID NO: 10); c) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEC ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEC ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTDYYIN (SEC ID NO: 40), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGETVY (SEC ID NO: 41); d) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEC ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLGS (SEC ID NO: 35), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTRYYIN (SEC ID NO: 7), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGTTVY (SEC ID NO: 10); y e) LCDR1 es KSTRSLLYSRSKTYLN (SEC ID NO: 45), LCDR2 es AVSKLDS (SEQ ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTDYYIN (SEC ID NO: 40), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGVTVY (SEC ID NO: 46).

En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LCVR y una HCVR en donde LCDR1 es SEC ID NO: 3, LCDR2 es SEC ID NO: 4, LCDR3 es SEC ID NO: 5, HCDR1 es SEC ID NO: 6, HCDR2 es SEC ID NO: 8, y HCDR3 es SEC ID NO: 9. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß Anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LCVR y una HCVR en donde LCDR1 es SEC ID NO: 3, LCDR2 es SEC ID NO: 4, LCDR3 es SEC ID NO: 5, HCDR1 es SEC ID NO: 7, HCDR2 es SEC ID NO. 8, y HCDR3 es SEC ID NO: 10. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß Anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LCVR y una HCVR en donde LCDR 1 es SEC I D NO: 3, LCDR2 es SEC I D NO: 4, LCDR3 es SEC I D NO: 5, HCDR1 es SEC I D NO: 40, HCDR2 es SEC I D NO: 8, y HCDR3 es SEC ID NO: 41 . En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LCVR y una HCVR en donde LCDR 1 es SEC I D NO: 3, LCDR2 es SEC I D NO: 35, LCDR3 es SEC I D NO: 5, HCDR1 es SEC I D NO: 7, HCDR2 es SEC I D NO: 8, y HCDR3 es SEC I D NO: 1 0. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano o fragmento del m ismo de unión al antígeno que comprende una LCVR y una HCVR en donde LCDR 1 es SEC I D NO: 45, LCDR2 es SEC ID NO: 4, LCDR3 es SEC I D NO: 5, HCDR 1 es SEC I D NO: 40, HCDR2 es SEC I D NO: 8, y HCDR3 es SEC I D NO: 46.

En otra modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería humano, o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde esta LCVR y HCVR son polipéptidos seleccionados del grupo que consiste de: a. LCVR de la SEC ID NO: 1 1 y HCVR de la SEC I D NO: 12; b. LCVR de la SEC I D NO: 1 1 y HCVR de la SEC ID NO: 1 3; c. LCVR de la SEC ID NO: 11 y HCVR de la SEC ID NO: 42; d. LCVR de la SEC ID NO: 36 y HCVR de la SEC ID NO: 37; y e. LCVR de la SEC ID NO: 47 y HCVR de la SEC ID NO: 48. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LCVR de la SEC ID NO: 11 y una HCVR de la SEC ID NO: 12. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LCVR de la SEC ID NO: 11 y una HCVR de la SEC ID NO: 13. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LCVR de la SEC ID NO: 11 y una HCVR de la SEC ID NO: 42. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LCVR de la SEC ID NO: 36 y una HCVR de la SEC ID NO: 37. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LCVR de la SEC ID NO: 47 y una HCVR de la SEC ID NO: 48.

La presente invención también proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en. donde los polipéptidos LC y HC se seleccionan del grupo que consiste de: a) LC de la SEC I D NO: 14 y HC de la SEC I D NO: 1 5; b) LC de la SEC I D NO: 14 y HC de la SEC I D NO: 1 6; c) LC de la SEC I D NO: 14 y HC de la SEC I D NO: 44; d) LC de la SEC I D NO: 38 y HC de la SEC I D NO: 39; y e) LC de la SEC I D NO: 49 y HC de la SEC I D NO: 50.

En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LC de la SEC I D NO: 14 y una HC de la SEC ID NO: 15. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LC de la SEC I D NO: 14 y una HC de la SEC I D NO: 16. En una modalidad, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LC de la SEC I D NO: 14 y una HC de la SEC I D NO: 44. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LC de la SEC I D NO: 38 y una HC de la SEC ID NO: 39. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno que comprende una LC de la SEC I D NO: 49 y una HC de la SEC I D NO: 50.

En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas en donde cada LC es el polipéptido de la SEC I D NO: 14 y cada HC es el polipéptido de la SEC I D NO: 15. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas en donde cada LC es el polipéptido de la SEC I D NO: 14 y cada HC es el polipéptido de la SEC I D NO: 16. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas en donde cada LC es el polipéptido de la SEC ID NO: 14 y cada HC es el polipéptido de la SEC I D NO: 44. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas en donde cada LC es el polipéptido de la SEC I D NO: 38 y cada HC es el polipéptido de la SEC ID NO: 39. En una modalidad preferida, el anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu com prende dos cadenas l igeras y dos cadenas pesadas en donde cada LC es el polipéptido de la SEC I D NO: 49 y cada HC es el polipéptido de la SEC ID NO: 50.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu de la presente invención o fragmento del mismo de unión al antígeno. En una modalidad preferida, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu de la presente invención o fragmento del mismo de unión al antígeno y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad preferida, la composición farmacéutica adicionalmente comprende uno o más ingredientes terapéuticos.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de tratamiento para una condición asociada con actividad del péptido ?ß, que comprende administrar a un paciente humano en necesidad del mismo un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento de unión al antígeno de la presente invención.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de tratamiento para una condición seleccionada de un grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer clínica o pre-clínica, enfermedad de Alzheimer podrómica , Síndrome de Down , y CAA clínica o pre-clínica, que comprende administrar a un humano en necesidad del mismo un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu de la presente invención o fragmento del mismo de unión al antígeno. En una modalidad preferida , la presente invención proporciona un método de tratamiento para la enfermedad de Alzheimer.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno, para uso en terapia. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno, para uso en el tratamiento de una condición seleccionada de enfermedad de Alzheimer clínica o pre-cl ínica, enfermedad de Alzheimer podrómica, síndrome de Down, o CAA cl ínica o pre-clínica. En una modalidad más preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno, para uso en el tratamiento de enfermedad de Alzheimer. En otra modalidad preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno, para uso en la prevención de una condición seleccionada de enfermedad de Alzheimer clínica o pre-clínica, enfermedad de Alzheimer podrómica, CAA clínica o pre-clínica. En una modalidad más preferida, la presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno para uso en la prevención de enfermedad de Alzheimer.

En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un uso de un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de para una condición seleccionada de un grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer clínica o pre-clínica, enfermedad de Alzheimer podrómica, síndrome de Down, y CAA clínico o pre-clínico. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un uso de un anticuerpo monoclonal ?ß anti-N3pGlu o fragmento del mismo de unión al antígeno, en la manufactura de un medicamento para el tratamiento de enfermedad de Alzheimer.

Un anticuerpo de longitud completa es una molécula de inmunoglobulina que comprende 2 cadenas pesadas (H) y 2 cadenas ligeras (L) interconectadas por uniones de disulfuro. La porción terminal amino de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100-110 aminoácidos en primer lugar responsable para reconocimiento del antígeno por medio de las regiones que determinan la complementariedad (CDRs) contenidas en esta. La porción terminal carboxi de cada cadena define una región constante en primer lugar responsable para función ejecutora.

Las CDRs son intercaladas con regiones que son conservadas, llamadas regiones de marco de trabajo (FR). Cada región variable de cadena ligera (LCVR) y región variable de cadena pesada (HCVR) es compuesta de 3 CDRs y 4 FRs, ordenado partir de amino-términos a carboxi-términos en el siguiente orden: FR 1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las 3 CDRs de la cadena ligera son referidas como "LCDR 1 , LCDR2, y LCDR3" y las 3 CDRs de la cadena pesada son referidos como "HCDR 1 , HCDR2, y HCDR3." Las CDRs contienen la mayoría de los residuos los cuales forman interacciones específicas con el antígeno. La numeración y posicionamiento de residuos aminoácido CDR dentro de las regiones LCVR y HCVR es de acuerdo con la convención de numeración Kabat bien conocida Las cadenas ligeras son clasificadas como kappa o lambda, y se caracterizan por una región constante particular como se conoce en la técnica. Cadenas pesadas son clasificadas como gamma, mu, alfa, delta, o épsilon, y define el isotipo de un anticuerpo como IgG , IgM, IgA, IgD, o Ig E, respectivamente. Los anticuerpos IgG pueden además ser divididos en subclases, por ejemplo, I gG 1 , lgG2, lgG3, o lgG4. Cada tipo de cadena pesada es caracterizado por una región constante particular con una secuencia bien conocida en la técnica.

Como se usa en la presente, el término "anticuerpo monoclonal" (Mab) se refiere a un anticuerpo que es derivado o aislado de una copia o clon único que incluye, por ejemplo, cualquier clon eucariótico, procariótico o fago, y no el método por el cual es producido. Las Mabs de la presente invención preferiblemente existen en una población homogénea o sustancialmente homogénea. Las Mabs completas contienen 2 cadenas pesadas y 2 las cadenas ligeras. La frase "fragmento de unión al antígenos" incluye, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, y fragmentos Fv de cadena única. Anticuerpos monoclonales de la presente invención y fragmento de unión al antígenos del mismo pueden ser producidos, por ejemplo, por tecnologías recombinantes, tecnologías que exhiben el fago, tecnologías sintéticas, por ejemplo, injerto CDR, o combinaciones de estas tecnologías, o otras tecnologías conocidas en la técnica. Por ejemplo, ratones pueden ser inmunizados con ?ß Anti-N3pGlu humano o fragmentos del mismo, los anticuerpos resultantes pueden ser recuperados y purificados, y la determinación si poseen propiedades de unión o funcionales similares a o las mismas como los compuestos del anticuerpo descritos en la presente puede ser valorada por los métodos descritos esencialmente como se describe en los Ejemplos posteriores. Los fragmentos de unión al antígeno también se pueden preparar por métodos convencionales. Métodos para producir y purificar anticuerpos y fragmento de unión al antígenos son bien conocidos en la técnica y pueden ser encontrados, por ejemplo, en Harlow y Lañe (1988) Anticuerpos, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, capítulos 5-8 y 15, ISBN 0-87969-314-2.

La frase "anticuerpos humanos diseñados por ingeniería" se refiere a anticuerpos monoclonales que tienen propiedades de unión y funcionales de acuerdo con la invención, y que tienen tiene regiones de marco de trabajo que son sustancialmente humano o completamente humano circundantes a CDRs derivadas de un anticuerpo no humano.

"Fragmento de unión al antígenos" de estos anticuerpos humanos diseñados por ingeniería incluyen, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, y fragmentos Fv cadena única. "Región de marco de trabajo" o "secuencia de marco de trabajo" se refiere a cualquiera de las regiones de marco de trabajo 1 a 4. Anticuerpos humanos diseñados por ingeniería y fragmento de unión al antígenos del mismo abarcados por la presente invención incluyen moléculas en donde cualquiera de una o más de las regiones de marco de trabajo 1 a 4 es sustancialmente o completamente humano, es decir, en donde cualquier de las posibles combinaciones de regiones de marco de trabajo 1 a 4 ind ivid uales , sustancialmente o com pletamente humanas, están presentes. Por ejemplo, esto incluye moléculas en las cuales la región de marco de trabajo 1 y región de marco de trabajo 2, región de marco de trabajo 1 y región de marco de trabajo 3, región de marco de trabajo 1 , 2, y 3, etc. , son sustancialmente o completamente humanas. Marcos de trabajo sustancialmente humanos son aquellos que tienen al menos aproximadamente 80% identidad de secuencia para una secuencia de marco de trabajo de línea germinal humana conocida. Preferiblemente, los marcos de trabajo sustancialmente humanos tienen al menos aproximadamente 85%, aproximadamente 90%, aproximadamente 95%, o aproximadamente 99% identidad de secuencia para una secuencia de marco de trabajo de línea germinal humana conocida.

Marcos de trabajo completamente humanos son aquellos que son idénticos a una secuencia de marco de trabajo de línea germinal humana conocida. Las secuencias de línea germinal de marco de trabajo humanas pueden ser obtenidas de ImMunoGeneTics (IMGT) por medio de su sitio de red http://imgt.cines.fr, o de The Immunoglobulin FactsBook by Marie-Paule Lefranc y Gerard Lefranc, Academic Press, 2001, ISBN 012441351. Por ejemplo, marcos de trabajo de cadena ligera de línea germinal pueden ser seleccionados del grupo que consiste de: AI1, A17, A18, A19, A20, A27, A30, Ll, L1I, L12, L2, L5, L15, L6, L8, 012, 02, y 08, y regiones de marco de trabajo cadena pesada de línea germinal pueden ser seleccionadas del grupo que consiste de: VH2-5, VH2-26, VH2-70, VH3-20, VH3-72, VHI-46, VH3-9, VH3-66, VH3-74, VH4-31, VHI-18, VHI-69, VI-13-7, VH3-11, VH3-15, VH3-21, VH3-23, VH3-30, VH3-48, VH4-39, VH4-59, y VH5-5I.

Anticuerpos humanos diseñados por ingeniería además a aquellos descritos en la presente que exhiben propiedades funcionales similares de acuerdo con la presente invención pueden ser generados usando varios métodos diferentes. Los compuestos del anticuerpo específico descritos en la presente se pueden usar como plantillas o compuestos de anticuerpo precursores para preparar compuestos de anticuerpo adicionales. En un procedimiento, las CDRs del compuesto de anticuerpo precursor son injertadas en un marco de trabajo humano que tiene una identidad de secuencia ligera con el marco de trabajo del compuesto de anticuerpo precursor. La identidad de secuencia del nuevo marco de trabajo puede generalmente ser al menos aproximadamente 80%, al menos aproximadamente 85%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, o al menos aproximadamente 99% idéntica a la secuencia a la secuencia del marco de trabajo correspondiente en el compuesto de anticuerpo precursor. Este injerto puede resultar en una reducción en afinidad de unión comparada con la del anticuerpo precursor. Si este es el caso, el marco de trabajo puede ser retro-mutado al marco de trabajo precursor en ciertas posiciones en base a criterios específicos descritos por Queen et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:2869. Referencias adicionales que describen los métodos útiles en anticuerpos de ratón humanizantes incluyen Patentes Estadounidenses Nos. 4,816,397; 5,225,539, y 5,693,761; programas para computadora ABMOD y ENCAD como se describe en Levitt (1983) J. Mol. Biol. 168:595-620; y el método de Winter y colaboradores (Jones et al. (1986) Nature 321:522-525; Riechmann et al. (1988) Nature 332:323-327; y Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534-1536.

La identificación de residuos considerados para retro-mutación se puede llevar a cabo como sigue: Cuando un aminoácido cae bajo la siguiente categoría, el marco de trabajo de aminoácido de la secuencia de línea germinal humana que es usada (el "marco de trabajo aceptor") es reemplazado por un aminoácido del marco de trabajo a partir de un marco de trabajo del compuesto de anticuerpo precursor (el "marco de trabajo donador"): (a) el aminoácido en la región de marco de trabajo humano del marco de trabajo aceptor es inusual para los marcos de trabajo humanos en esta posición, mientras que el aminoácido correspondiente en la inmunoglobulina donadora es típica para marcos de trabajo humanos en la posición; (b) la posición del aminoácido es inmediatamente adyacente a una de las CDRs; o (c) cualquier átomo de cadena lateral de un aminoácido de marco de trabajo está dentro de aproximadamente 5-6 angstroms (centro a centro) de cualquier átomo de un aminoácido de CDR en un modelo de inmunoglobulina de tres dimensiones.

Cuando cada uno de los aminoácidos en la región de marco de trabajo humano del marco de trabajo aceptor y un aminoácido correspondiente en el marco de trabajo donador es generalmente inusual para los marcos de trabajo humanos en esta posición, este aminoácido puede ser reemplazado por un am inoácido típico para marcos de trabajo humanos en esta posición. Este criterio de retro-mutación permite a uno recuperar la actividad del compuesto de anticuerpo precursor.

Otra aproximación para generar anticuerpos diseñados por ingeniería humanos que exhiben propiedades funcionales similares a los compuestos del anticuerpo descritos en la presente involucra aminoácidos mutados al azar dentro de las CDRs injertadas sin cambiar el marco de trabajo, y seleccionando las moléculas resultantes para afinidad de enlace y otras propiedades funcionales que son tan buenas como o mejores que aquellas de los compuestos del anticuerpo precursores. Mutaciones únicas también se pueden introducir en cada posición de aminoácido dentro de cada CDR, seguido por la valoración de los efectos de estas mutaciones en afinidad de unión y otras propiedades funcionales. Mutaciones únicas que producen propiedades mejoradas pueden ser combinadas para valorar sus efectos en combinación con alguna otra.

Además, es posible una combinación de ambos procedimientos precedentes. Después del injerto CDR uno puede retro-mutar regiones de marco de trabajo especifico además a introducir cambios de aminoácido en las CDRs. Esta metodología se describe en Wu et al. (1999) J. Mol. Biol. 294:151-162.

Aplicando las enseñanzas de la presente invención, una persona experta en la técnica puede usar técnicas comunes, por ejemplo, mutagénesis dirigida al sitio, para sustituir aminoácidos dentro de la CDR y secuencias de marco de trabajo actualmente descritas y con ello además generar secuencias de aminoácido de región variable derivadas de las secuencias presentes. Todos los aminoácidos que se original de forma natural alternativos se pueden introducir en un sitio de sustitución específico. Los métodos descritos en la presente entonces se pueden usar para seleccionar estas secuencias de aminoácido de región variable adicionales para identificar secuencias que tienen las funciones in vivo indicadas. De esta forma, se pueden identificar secuencias adicionales adecuadas para preparar anticuerpos diseñados por ingeniería humanos y porciones de los mismos de unión al antígeno de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido dentro de los marcos de trabajo es restringida por uno, dos o tres posiciones dentro de cualquiera de uno o más de las 4 regiones de marco de trabajo de cadena ligera y/o cadena pesada descritas en la presente. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido dentro de las CDRs es restringida por uno, dos o tres posiciones dentro de cualquiera de uno o más de las 3 CDRs de cadena ligera y/o cadena pesada. También son posibles las combinaciones de los cambios variados dentro de estas regiones de marco de trabajo y las CDRs descritas anteriormente.

El término "tratar" (o "tratar" o "tratamiento") se refiere a procesos que involucran una disminución, interrupción, detener, controlar, bloquear, reducir o invertir el progreso o severidad de un síntoma, trastorno, condición o enfermedad existente, pero no necesariamente involucra una eliminación total de todos los síntomas, condiciones o trastornos relacionados con la enfermedad asociadas con el anticuerpo ?ß anti-N3pGlu.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser usados como medicamentos en medicina humana, administrados por una variedad de rutas. Más preferiblemente, estas composiciones son para administración parenteral. Estas composiciones farmacéuticas pueden ser preparadas por métodos bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19na ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) y comprende un anticuerpo como se describe en la presente o un fragmento del mismo de unión al antígeno, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

Los resultados de los siguientes ensayos demuestran que los anticuerpos monoclonales y fragmentos del mismo de unión al antígeno de la presente invención son útiles para el tratamiento de una condición asociada con actividad del péptido ?ß tal como enfermedad de Alzheimer, síndrome de Down, y CAA.

Ejemplo 1 : Producción de Anticuerpos Generación del Anticuerpo I nicial: ratones transgénicos FVB se inmunizaron con el péptido ß amiloide humano 3-42 truncado con N-terminal y modificado con piroglutamato (N3pGlu) pretratado a 37°C durante la noche para formar agregado. Se recolectaron los bazos de ratones y se redujeron las células B reactivas con ?ß 1 -40 por MACS. Las células restantes se ordenaron para unión al péptido ?ß N3pGlu agregado. Se aisló RNA a partir de las células B seleccionadas y se convirtieron en cDNA usando dT oligo Se obtuvieron regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo por PCR usando cebadores de secuencia de señal del anticuerpo y se clonaron en vector de fago por mutagénesis Kunkel para elaborar la biblioteca Fab. La biblioteca Fab se selecciona por unión al péptido N3Glu agregado por ELISA de Punto Único (SPE) y contra-seleccionado en contra de ?ß1 -40. Se caracterizaron clones positivos por secuenciamiento DNA, expresión fab y unión al péptido ?ß N3pGlu y carece de unió al péptido ?ß 1 -40 o ?ß1 -42 soluble.

Las bibliotecas mutantes de aminoácido único se construyen y seleccionan por SPE para unión al péptido ?ß N3pGlu agregados, pero no a ?ß1 -42. Las mutaciones benéficas se combinan en bibliotecas de combinación. Se seleccionan las variantes de combinación optimizadas por afinidad y convierten en IgGI de ratón para medición de afinidad por BIACORE® y unión de placa ?ß por inmunohistoqu ímica. A partir de un clon identificado, se elabora la proteína mAb en ambos isotipos IgGI de ratón (mE8) e lgG2a (mE8c) para estudios de eficacia ¡n vivo. mE8 no se une a la secuencia ?ß N3pGlu de ratón (mpE3-16) o ?ß1-42 humano.

Se usan VH1-69/JH6 y Vk-A18/JK2 de marcos de trabajo de línea germinal humana para la humanización inicial. Se injertan CDRs del anticuerpo mE8 (con cuatro mutaciones de afinidad) en los marcos de trabajo humanos resultando en anticuerpo hE8-C6. Se lleva a cabo la optimización de afinidad adicional en estructura hE8-C6, y se combinan las mutaciones benéficas para elaborar la variante R5, R17, R24 y 2420 humanizado, de gran afinidad.

Segunda ronda de optimización para mejorar la capacidad de desarrollo del fármaco: Dos variantes humanizadas, hE8-C6 y R17, se eligen como estructura para una segunda ronda de optimización para mejorar la vida media del suero de anticuerpo reduciendo la unión no específica a células y para incrementar la afinidad de anticuerpo al péptido ?ß N3pGlu soluble. Un péptido soluble biotinilado que consiste de los 14 aminoácidos N-terminal de ?ß N3pGlu (pE3-16B) es sintetizado y evaluado por ser equivalente al péptido ?ß N3pGlu para unión del anticuerpo mE8. Un ensayo de vida del filtro de alto rendimiento usando pE3-16B se desarrolló y aplicó a todas las selecciones de biblioteca subsecuentes. Todos los éxitos de la selección de levantamiento del filtro se confirmaron por unión a ?ß N3pGlu agregado.

Las bibliotecas de variantes hE8-C6 se seleccionaron nuevamente usando el ensayo de levantamiento de filtro y se identificaron una serie de mutaciones benéficas. Una subserie de estos se usaron para elaborar la biblioteca de combinación. Se seleccionaron cuatro variantes combi (Col l-E 10, Col l-G2, C0I I-G8 y Col l-E2) a partir de este procedimiento.

Se emplea el modelado por computadora para crear modelos estructurales de región V de hE8-C6, R1 7, R24 y otras variantes. El análisis de modelo estructural identifica cargas positivas introducidas por optimización de afinidad por agrupación en el sitio de unión, una causa potencial del anticuerpo no específico unido a las células. En base al modelado, se seleccionan varias posiciones para introducir cambios para balancear la superficie electrostática potencial. Se sintetizó una biblioteca de combinación , combinando algunas mutaciones benéficas a partir de selección de biblioteca y los cambios definidos por modelado estructural. Se seleccionan tres variantes (R17m-B4, R1 7m-A1 2 y R 17m-B 12) a partir de este esfuerzo para estudios adicionales.

El análisis de modelo estructural también describe un choque esférico entre el residuo Y36 de marco de trabajo de cadena ligera y residuos en la CDR3 de cadena pesada. La mutación Y36L es introducida a hE8-C6 de cadena ligera para producir la variante hE8L. Este cambio de marco de trabajo solo se encuentra por tener impacto significante en tanto incremento de afinidad del anticuerpo como en reducción de unión de célula no específica.

El otro esfuerzo fue para probar diferente marco de trabajo humano para la humanización. Las CDRs del anticuerpo mE8 son injertadas en marcos de trabajo VH5-51 /VK02 y VH3-23/VKA2. La Fab humanizada con VH5-51 /VK02 (hE8-5102) se determinó como equivalente, si no mejor, a hE8-C6 en unión de ?ß N3pGlu. La introducción de mutaciones benéficas adicionales en hE8-51 02 genera variantes CI-A1 , CI-B6, CI-C7 y CI-B8 combi.

Después de hacer pasar todos los ensayos in vitro, incluyendo ELISA y BIACORE® para especificidad a afinidad de antígeno, unión de célula no específica y teñido I HC, se seleccionan cinco variantes mAbs, B12L, CI-C7, hE8L, R1 7L y R 1 7.

Se pueden elaborar y purificar anticuerpos esencialmente como sigue. Una célula hospedera apropiada, tal como EBNA HEK 293 o CHO, es ya sea temporalmente o establemente transfectada con un sistema de expresión para anticuerpos de selección usando una relación de vector HC: LC predeterminada óptima o un sistema de vector único que codifica tanto HC, tal como SEC I D NO: 56 y SEC I D NO: 43, así como LC, tal como SEC I D NO: 55. Medio clarificado, en el cual el anticuerpo ha sido secretado, es purificado usando cualquiera de las muchas técnicas comúnmente usadas. Por ejemplo, el medio puede ser convenientemente aplicado a una columna de Sefarosa FF de Proteína A o G que ha sido equilibrada con un amortiguador compatible, tal como salina amortiguada de fosfato (pH 7.4). La columna es lavada para remover componentes de unión no específicos. El anticuerpo unido es eluido, por ejemplo, por gradiente de pH (tal como amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M, pH 6.8 a amortiguador de citrato de sodio 0.1 M , pH 2.5). Las fracciones del anticuerpo son detectadas, tal como por SDS-PAGE y entonces son combinadas. La purificación adicional es óptima, dependiendo del uso planeado. El anticuerpo puede ser concentrado y/o filtrado de forma estéril usando técnicas comunes. El agregado soluble y multímeros pueden ser efectivamente removidos por técnicas comunes, que incluyen exclusión por tamaño, interacción hidrofóbica, intercambio iónico o cromatografía de hidroxiapatito. La pureza del anticuerpo después de estas etapas de cromatografía es mayor que 99%. El producto puede ser inmediatamente congelado a 70°C o puede ser liofilizado. Las secuencias de aminoácido para estos anticuerpos de la presente invención se proporcionan abajo.

Tabla 1 - SEC ID Nos de los Anticuerpos Ejemplo 2: Afinidad de Unión a N3pGlu soluble La resonancia de plasmón de superficie medida con el instrumento BIACORE® 2000 se usó para medir la unión de ?ß N3pGlu a anticuerpos anti-N3pGlu. Excepto como se nota, todos los reactivos y materiales son de BIACORE® AB (Upsala, Suecia) . Todas las mediciones se realizan a 25°C. Las muestras se disuelven en amortiguador H BS-EP (cloruro de sodio 1 50 mM , EDTA 3 mM, 0.005% (p/v) tensoactivo P-20 y HEPES 10 mM, pH 7.4).

Una serie de péptidos Abeta con cambios de posición (mutantes de glicina) es sintetizada para valorar el impacto de un residuo proporcionado en unión de anticuerpo y con ello identificar las características y la secuencia requerida para reconocimiento de anticuerpo: Nombre del péptido Secuencia Abeta 3-16 pE3-16 Pyr-EFRHDSGYEVHHQK-biotina SEC I D NO: 25 E3-16 EFRHDSGYEVHHQK-biotina SEC I D NO: 26 pEG4 Pyr-EGRHDSGYEVH HQK-biotina SEC I D NO: 27 mpE3-16 Pyr-EFGH DSGFEVHHQK-biotina (roedor) SEC I D NO: 28 pEG6 Pyr-EFRGDSGYEVHHQK-biotina SEC I D NO: 29 pEG7 Pyr-EFRHGSGYE HHQK-biotina SEC I D NO: 30 pEG8 Pyr-EFRH DGGYEVHHQ -biotina SEC I D NO: 37 pEF1 0 Pyr-E FRHDSGFEVHHQK-biotina SEC I D NO: 39 La importancia de una forma truncada (des 1 ,2) y modificada de ácido glutám ico (3 pyr-E o 3 pyr-Glu) es valorada comparando unión de ?ß 1 -42 contra ?ß 3-16 contra pE3-16 (SEC I D NO: 1 contra SEC I D NO: 26 contra SEC I D NO: 25, respectivamente). Los péptidos se disolvieron en PBS a 5 mg/ml antes de la dilución para experimentos de unión.

Se evalúa la unión usando ciclos analíticos múltiples de captura de anticuerpo, inyección/asociación de péptido, flujo de amortiguador prolongado para disociación y regeneración de superficie. Para la etapa de captura del anticuerpo, dependiendo del tipo de anticuerpo a ser capturado, se inmoviliza con cualquiera de proteína A o Fe anti-ratón de cabra. Excepto para anticuerpos de ratón, cada ciclo consiste de: inyección de -5-7 µ? de 10 pg/ml de anticuerpo anti-N3pGlu a 5 µ?/min (captura aprox. 3,000 RU), inyección de 100 µ? del péptido a 50 µ?/min (1000 nM - 62.5 nM en diluciones seriales de dos veces para cada ciclo), seguido por 10 minutos para disociación. Para un anticuerpo de ratón, la velocidad de flujo es 50 µ?/min, y 20 µ? de anticuerpo de ratón a 50 pg/ml es inyectado. En ambos casos, la superficie del chip es regenerada usando 20 µ? de clorhidrato de glicina 10 mM, pH 1.5. La afinidad de unión (KD) es entonces obtenida a partir de las velocidades de asociación y disociación para cada ciclo usando un modelo de unión 1:1 en el software de análisis BIAevaluation. Los anticuerpos anti-N3pGlu, B12L y R17L, y el anticuerpo de ratón parenteral (mE8C) reconoce específicamente ?ß N3pGlu, con un KD menor que 1 nM. Anticuerpos anti-NepGlu, B12L y R17L y anticuerpo de ratón parenteral (mE8C) también une a pE3-16 con afinidad similar, indicando que el epítope se localiza dentro de esta región de los péptidos. Análisis de unión de anticuerpos para péptidos mutantes de glicina muestran que el residuo crítico para unió son de 3 a 7: pyroE en posición 3, F en posición 4, R en posición 5, H en posición 6, D en posición 7. Unión detectable para ?ß1 -40 no se detecta para los anticuerpos de la presente invención.

Ejemplo 3: Afinidad de Unión a N3pGlu agregado También se condujeron experimentos BIACORE® para monitorear la unión de anticuerpos anti-N3pGlu a ?ß N3pGlu agregado. En este experimento, se inmoviliza el péptido ?ß N3pGlu a diferentes densidades para flujo de células 2 (densidad baja, LD), 3 (densidad media, MD) y 4 densidad alta, HD) en un chip CM-5 a través de química de acoplamiento de amina. Los niveles diferentes del péptido ?ß N3pGlu son inmovilizados para examinar el impacto de densidad de superficie en la unión de anticuerpos anti-N3pGlu. En la inmovilización, la mayoría de los agregados ?ß N3pGlu en la superficie como se demuestra por la carencia de la unión de un Mab control el cual solamente reconoce el péptido monomérico. Esta forma agregada del péptido imita la propiedad del péptido abeta agregado en forma fibrilo o amiloide, en donde la región N-terminal de los péptidos es expuesta y puede ser dirigida con anticuerpos.

Se evalúa la unió usando múltiples ciclos anal íticos a 25°C.

Cada ciclo es realizado a una velocidad de flujo de 50 µ?/min y consiste de las siguientes etapas: inyección de 250 µ? de solución del anticuerpo N3pGlu (iniciando a 500 nM y usando diluciones seriales de dos veces para cada ciclo) seguido por 20 minutos para disociación, y la regeneración usando ~30 µ? de clorhidrato de glicina 1 0 mM, pH 1 .5. Las velocidades de asociación y disociación para cada ciclo son evaluadas usando un modelo de ligando heterogéneo en el software BIAevaluation. Ya que el modelo de unió 1 : 1 no ajusta los datos, el ajuste heterogéneo proporciona dos afinidades de unión (una afinidad bala y una alta). Los anticuerpos R17L y B1 2L y el anticuerpo mE8c de murina parental une a ?ß N3pGlu agregado con KD 1 de alta afinidad < 1 00 pM y un KD 2 de baja afinidad <10 nM. Se calculó la señal de unión máxima (Rmax) como la suma de Rmax a partir de unión de afinidad baja y alta. La Rmax se muestra por aumentar a medida que la densidad del péptido en la superficie se incrementa, como se espera cuando más sitios de unión están disponibles en la superficie de alta densidad. Estos estudios de unió demuestran que los anticuerpos de la presente invención se unen a ?ß N3pGlu agregado.

Ejemplo 4: Estudios de Acoplamiento de Objetivo ex vivo Se realiza el análisis inmunohistoqu ím ico con anticuerpos ?ß exógenamente agregados para determinar el acoplamiento de objetivo es vivo en secciones del cerebro de un cerebro de PDAPP fijado (24 meses de edad). El ratón transgénico PDAPP ha sido mostrado por desarrollar mucha de la patología asociada con la enfermedad de Alzheimer. Para anticuerpos murina, una etiqueta de biotina se usa como la marca ya que este experimento se conduce en tejido de murina, y así no es apropiada una comparación directa entre los anticuerpos anti-N3pGlu no de murina, no biotinilados. El anticuerpo ( 1 -5) N terminal 3D6 biotinilado fuertemente marca cantidades significantes de ?ß depositado en el hipocampo de PDAPP, mientras que mE8 biotiniladas marca solamente una subserie de depósitos. Diferente al cerebro AD humano, la gran mayoría del ?ß depositado en cerebro de PDAPP es de longitud completa. Se observa un etiquetado de placa similar para los anticuerpos anti-N3pGlu no biotinilados, tal como B 12L y R17L (comparado al mE8). Se observa etiquetado de placa no específica para ya sea IgG de ratón o humano. Debido a la composición y estructura similar del ?ß depositado es dramáticamente diferente en el cerebro de AD, los anticuerpos anti-N3pGlu (3 ug/ml) , no biotinilados son investigados para determinar si se unen a ?ß depositado en secciones del cerebro a partir de un cerebro AD recientemente congelado El anticuerpo de control positivo (3D6 biotinilado) intensamente etiqueta muchas placas ?ß en el cerebro AD, mientras que los anticuerpos de control negativo (IgG murina y humano) carecen de cualquier unión apreciable. Varios de los anticuerpos anti-N3pGlu no biotinilados tal como C1 2L y R 17L unen similarmente al ?ß depositado. Estos estudios histológicos demuestran que los anticuerpos anti-N3pGlu de la presente invención pueden acoplar el objetivo ?ß depositado ex vivo.

Ejemplo 5: Estudios de Acoplamiento de Objetivo In vivo Se mide la capacidad de los anticuerpos anti-N3pGlu para acoplar el objetivo depositado in vivo. Se realiza un estudio de 4 semanas sub-crónico con anticuerpos 36 y mE8c de murina biotinilados a 40 mg/kg administrados intraperitonealmente (I P) cada semana. Se recolectaron cerebros a la conclusión del experimento y se determina el nivel de acoplamiento del objetivo por examen histológico del cerebro. Los animales inyectados con el 3D6 biotinilado tienen placa etiquetada solamente a lo largo del tejido de hipocampo, mientras que los ratones inyectados con mE8c biotinilado exhiben un etiquetado de placa fuerte en el hipocampo y las regiones corticales. Se observan patrones de acoplamiento del objetivo muy similares en un ensayo de 3 días más agudo (teñido del tejido de hipocampo 3D6 y etiquetado con mE8 de las regiones tanto de hipocampo como cortical). Estos resultados sugieren fuertemente que el anticuerpo 3D6, el cual une ?ß tanto soluble como insoluble, se vuelve saturado con ?ß soluble y así no es capaz de acoplar el objetivo depositado deseado. En marcado contraste, el anticuerpo mE8 anti-N3pGlu de murina consistentemente acopla el objetivo planeado en ambas regiones del cerebro críticas. Se evaluaron dosis altas y bajas de los anticuerpos anti-N3pGlu R17L y B12L en un estudio in vivo de 3 días similar. Los anticuerpos son inyectados IP a ya sea 10 mg/kg (dosis baja) o 40 mg/kg (dosis alta). En la conclusión del estudio, se recolectaron plasma y cerebros y se determina el PK del plasma. Los cerebros se seccionan y se realiza la inmunohistoquímica en secciones hermanas con un anticuerpo anti-humano (para detectar la unión del anticuerpo anti-N3pGlu) y 3D6 (para detectar la cantidad total del objetivo depositado en las secciones). Para cuantificar mejor el nivel de acoplamiento del objetivo in vivo, el porcentaje del área unida por el anticuerpo anti-N3pGlu se normaliza contra el % de área total del objetivo posible (?ß depositado total visualizado por inmunohistoquímica 3D6 exógeno). Adicionalmente, el porcentaje total de acoplamiento del objetivo se normaliza contra los valores de farmacocinética (PK) del plasma^ para cada ratón individual ya que se detectan exposiciones significantes a la conclusión del estudio. Loa anticuerpos anti-N3pGlu tanto R1 7L como B 1 2L se encuentran por acoplar la placa depositada con una distribución similar al observado con el anticuerpo (mE8) anti-N3pGlu de murina. Estos resultados demuestran que los anticuerpos anti-N3pGlu R 1 7L y B12L cuando se administran periféricamente pueden cruzar la barrera hemato-encefálica y acopla el objetivo planeado del ?ß depositado, mientras que el anticuerpo que une ?ß tanto soluble como insoluble se vuelve saturado con el soluble y no puede acoplar el objetivo depositado planeado Ejemplo 6: Estudios de Disminución de Placa Terapéutica Se realiza un estudio de disminución de la placa terapéutica en ratones PDAPP de 23 meses de edad con los siguientes anticuerpos: anticuerpo de control negativo (lgG2a), 3D6, m E8 (lgG 1 ) y mE8c (lgG2a). Los ratones PDAPP viejos son inyectados subcutáneamente con 1 2.5 mg/kg de cada anticuerpo semanalmente por tres meses. Un grupo de ratones es sometido a necropsia el inicio del estudio (tiempo cero) para determinar la carga de placa inicial a 23 meses de edad. A la conclusión del estudio, se obtiene el plasma y los cerebros son procesados para resultados bioquímicos e histológicos (uno en cada hemisferio del cerebro). Las regiones de hipocampo y cortical son homogenizadas en guanidina 5M y el contenido de ?ß se mide por geles de urea acídica seguido por teñido Western. Un análisis de lisados de guanidina del hipocampo a partir de cohortes (26 meses de edad) control del anticuerpo negativo y tiempo de 23 meses de edad muestran un incremento no significante en ?ß, .42 depositado; con ello se confirma que los cerebros de los ratones PDAPP están en la placa plana. Similar a estudios previos en ratones PDAPP viejos, el tratamiento con el anticuerpo 3D6 de comparación no tiene efecto en la disminución de placa. El tratamiento con ya sea anticuerpo mE8 o m E8c anti-N3pGlu, resulta en disminución de placa significante comparado al anticuerpo de control negativo lgG2a (p<0.01 y p<0.001 , respectivamente)(Tabla 2). Los mE8 ymE8c disminuyen el ?ß1 -42 del hipocampo por ~38% y ~53%, respectivamente. El anticuerpo mE8c N3pGlu con función efectora máxima tiende a ser más eficaz que el anticuerpo mE8 de función efectora mínima (comparado al control), sin embargo esta diferencia no alcanza significancia estadística. También, el anticuerpo mE8c tiene una disminución de ~30% significante de ?ß! .42 en el hipocampo comparado a los ratones de tiempo cero (prueba t; p<0.0066), así indicando despeje de la placa previamente depositada. El análisis de los lisados de guanidina corticales proporciona resultados muy similares con la excepción que solo el mE8c con función efectora máxima significativamente disminuye la deposición de ?ß1 - 42. Estos resultados demuestran que el tratamiento crónico con anticuerpos N3pGlu de este ejemplo, significativamente disminuyen la deposición de placa en ratones PDAPP viejos en una manera dependiente de la función efectora. Adicionalmente, estos resultados soportan la hipótesis que el pobre acoplamiento del objetivo para anticuerpos ?ß que une ?ß tanto soluble como insoluble (en oposición a la senescencia) fue el factor causante para su falta de eficacia cuando se usan en parad ig mas terapéuticos Tabla 2 - Dism inución de placa en H ipocampo y Corteza (A -, .42 ng/peso húmedo mg) Ejemplo 7 : Análisis de Microhemorrag ia en Ratones PDAPP Viejos Se realiza un estudio histológico para investigar si el mecanismo de acción de los anticuerpos N3pGlu q ue conducen a disminución de placa es menor en ratones PDAPP puede resultar en una exacerbación de m icrohemorragia relacionada a CAA. Estudios previos han demostrado que el tratamiento de ratones transgénicos APP viejos con ciertos anticuerpos carboxi-terminal o amino-terminal anti-?ß puede conducir a un incremento en microhemorragia relacionada a CAA (Pfeifer et al., 2002; Wilcock et al. 2004; Racke et al. 2005). A pesar que el mecanismo subyacente de este evento adverso potencial no está claro, se han propuesto dos hipótesis no-mutuas: la redistribución de ?ß en los vasos cerebro-espinales (Wilcok et al. 2004) o la unión directa de anticuerpos a CAA existente (Racke et al. 2005). Los análisis bioquímicos e histológicos demuestran que ?ß?3.? es un constituyente de CAA tanto en pacientes Ad como en ratones PDAPP viejos. Se realiza un análisis histológico detallado para microhemorragia en ratones PDAPP viejos (23 a 26 meses de edad) que han sido terapéuticamente tratados con N3pGlu y anticuerpos de control por tres meses con inyecciones subcutáneas semanalmente de 12.5 mg/kg. El control positivo para el análisis de microhemorragia es el 3D6, animales tratados crónicamente los cuales han demostrado previamente que este anticuerpo amino-terminal anti-?ß significativamente exacerba la microhemorragia (Racke et al. 2005) En la conclusión de este estudio, un hemisferio del cerebro de cada animal se fijó con gota en formaldehído al 4% e incrustado en parafina. Las secciones coronales que abarcan 2 mm de tejido se seccionaron en 50 diapositivas (cuatro secciones de 10 µ?? por diapositiva). Once diapositivas incluso de intervalos a través de 2 mm del tejido se tiñen con Azul Perls para visualizar la hemosiderina (acumulación de hierro celular debido a microhemorragia). Dos secciones por diapositiva son manualmente cuantificadas en forma de ciego. El tratamiento crónico de ratones PDAPP viejos con 3D6 (control positivo) dramáticamente incrementa la microhemorragia (p<0.001 ). I mportantemente, se demuestra que el tratamiento con ya sea mE8 (IgG 1 ) o mE8c (lgG2a) no exacerba la microhemorragia, aún sin embargo estos anticuerpos N3pGlu significativamente disminuyen el ?ß depositado en estos animales. Estos resultados demuestran que los anticuerpos N3pGlu de este Ejemplo no exacerba la microhemorragia relacionada a CAA en ratones PDAPP viejos.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo monoclonal humano ?ß anto-N3pGlu diseñado por ingeniería o fragmento de unión al antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), caracterizado porque tal LCVR comprende polipéptidos LCDR1, LCDR2, y LCDR3 y la HCVR comprende polipéptidos HCDR1, HCDR2, y HCDR3 los cuales se seleccionan del grupo que consiste de: a) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEC ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEC ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5), HCDR1 es GYDFTRYYIN (SEC ID NO: 6), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGITVY (SEC ID NO: 9); b) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEC ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEC ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTRYYIN (SEC ID NO: 7), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGTTVY (SEC ID NO: 10); c) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEC ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLDS (SEC ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTDYYIN (SEC ID NO: 40), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGETVY (SEC ID NO: 41); d) LCDR1 es KSSQSLLYSRGKTYLN (SEC ID NO: 3), LCDR2 es AVSKLGS (SEC ID NO: 35), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTRYYIN (SEC ID NO: 7), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGTTVY (SEC ID NO: 10); and e) LCDR1 es KSTRSLLYSRSKTYLN (SEC ID NO: 45), LCDR2 es AVSKLDS (SEC ID NO: 4), LCDR3 es VQGTHYPFT (SEC ID NO: 5), HCDR1 es GYTFTDYYIN (SEC ID NO: 40), HCDR2 es WINPGSGNTKYNEKFKG (SEC ID NO: 8), y HCDR3 es EGVTVY (SEC ID NO: 46).

2. Un anticuerpo monoclonal humano ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería o fragmento de unión al antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) y una región variable de cadena pesada (HCVR), en donde tal LCVR y HCVR son polipéptidos seleccionados del grupo que consiste de: a) LCVR de la SEC ID NO: 11 y HCVR de la SEC ID NO: 12; b) LCVR de la SEC ID NO: 11 y HCVR de la SEC ID NO: 13; c) LCVR de la SEC ID NO: 11 y HCVR de la SEC ID NO: 42; d) LCVR de la SEC ID NO: 36 y HCVR de la SEC ID NO: 37; y e) LCVR de la SEC ID NO: 47 y HCVR de la SEC ID NO: 48.

3. Un anticuerpo monoclonal humano ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería o fragmento de unión al antígeno del mismo de conformidad con las reivindicaciones 1 -2 , caracterizado porque comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC) , en donde los polipéptidos LC y HC se seleccionan del grupo que consiste de: a) LC de la SEC I D NO: 14 y HC de la SEC I D NO: 15; b) LC de la SEC I D NO: 14 y HC de la SEC I D NO: 16; c) LC de la SEC I D NO: 14 y HC de la SEC I D NO: 44; d) LC de la SEC I D NO: 38 y HC de la SEC I D NO: 39; y e) LC de la SEC I D NO: 49 y HC de la SEC I D NO: 50.

4. Un anticuerpo monoclonal humano ?ß anti-N3pGlu diseñado por ingeniería o fragmento de unión al antígeno del mismo de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas en donde cada cadena ligera y cada cadena pesada son polipéptidos seleccionados del grupo que consiste de: a) LC de la SEC I D NO: 14 y HC de la SEC I D NO: 15; b) LC de la SEC I D NO: 14 y HC de la SEC I D NO: 16; c) LC de la SEC I D NO: 14 y HC de la SEC I D NO: 44; d) LC de la SEC I D NO: 38 y HC de la SEC I D NO: 39; y e) LC de la SEC I D NO: 49 y HC de la SEC I D NO: 50.

5. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el anticuerpo humano diseñado por ingeniería o fragmento de unión al antígeno del mismo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, y un portador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable.

6. Una composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque adicionalmente comprende uno o más ingredientes terapéuticos.

7. Un método para tratar una condición asociada con la actividad peptídica ?ß, caracterizado porque comprende administrar a un paciente humano en necesidad del mismo la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5 ó 6.

8. Un método para tratar una condición seleccionada de un grupo que consiste de enfermedad de Alzheimer clínica o pre-cl ínica, enfermedad de Alzheimer prodromal, síndrome de Down, y angiopatía amiloide (CAA) cl ínica o pre-cl ínica, caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5 ó 6.

9. Un método para tratar enfermedad de Alzheimer, caracterizado porque comprende administrar a un humano en necesidad del mismo la composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 5 ó 6.

1 0. Un anticuerpo humano diseñado por ingeniería o fragmento de unión al antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en terapia .

1 1 . Un anticuerpo humano diseñado por ingeniería o fragmento de unión al antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en el tratamiento de una condición asociada con la actividad peptídica ?ß.

12. Un anticuerpo humano diseñado por ingeniería o fragmento de unión al antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, para uso en el tratamiento de una condición seleccionada de enfermedad de Alzheimer clínica o pre-clínica, enfermedad de Alzheimer prodromal, síndrome de Down, o CAA clínica o preclínica. 1 3. Un anticuerpo diseñado por ingeniería humano o fragmento de unión al antígeno del mismo, de conformidad con la reivindicación 12, para uso en el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. RESU M E N La presente invención proporciona anticuerpos ?ß anti-N3pGlu o su fragmento de unión a antígeno. Además, la presente invención proporciona el uso de los anticuerpos ?ß anti-N3pGlu o su fragmento de unión a antígeno para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer.