MX2012007055A

MX2012007055A - Agentes epitopes de enlace wise.

Info

Publication number: MX2012007055A
Application number: MX2012007055A
Authority: MX
Inventors: Aaron George Winters; Xueming Qian; Michelle Hortter; Kevin Graham; Mei-Mei Tsai
Original assignee: Amgen Inc
Priority date: 2009-12-18
Filing date: 2010-12-17
Publication date: 2012-10-15
Also published as: AR079572A1; EP2512600A2; WO2011075636A3; UY33124A; US20120288507A1; JP2013514992A; CA2784093A1; TW201132353A; WO2011075636A2; AU2010330794A1

Abstract

La presente invención se refiere a agentes de enlace para WISE, e incluye métodos para su elaboración y uso.

Description

AGENTES Y EPÍTOPES DE ENLACE WiSE Solicitudes Relacionadas La presente solicitud reclama el beneficio de la Solicitud Provisional Norteamericana No. 61/288,171, presentada el 18 de diciembre de 2009, la cual está incorporada a la presente invención como referencia.

La presente solicitud se presenta junto con un listado de secuencias en formato electrónico. El Listado de Secuencias se proporciona como un archivo titulado A-1532-WO-PCT_SeqList.txt, creado el 1o de diciembre de 2010, el cual tiene un tamaño de 86.5 KB. La información en el formato electrónico del Listado de Secuencias, se incorpora en su propiedad a la presente invención como referencia.

Campo de la Invención La presente invención se refiere de manera general a epítopes de proteína WISE, que incluyen la proteína WISE humana, y agentes de enlace, tal como anticuerpos, con la capacidad de enlazar a WISE o epítopes en la misma.

Antecedentes de la Invención La fibrosis se define de manera general como el desarrollo de tejido extra conectivo como parte del proceso de curación, e incluye un diverso grupo de síntomas. La fibrosis excesiva es un problema doloroso que tiene algunas opciones terapéuticas.

Las proteínas que contienen un botón de cisteína, normalmente son reguladores importantes de las funciones clave y afectan diversos tipos de células. Wise (USAG-1, SOSTDC1) es una proteína que contiene un botón de cisteína secretada, y se expresa principalmente en el riñón, pulmones, piel y células epiteliales. Los ratones KO WISE son fértiles, y sus ríñones tienen función normal. Sin embargo cuando se desestimula el desarrollo de lesión en el riñón, ya sea mediante obstrucción ureteral unilateral (UUO) o inyección del agente quimiotóxico Cisplatin, los ratones KO WISE están protegidos (Yanagita y asociados, J. Clin Invest. 2006 Enero 4; 116(1): 70-79). En el modelo UUO, existe mucho menos fibrosis en el riñón afectado en ratones KO WISE, y se expresa mucho menos aSMA, un marcador de activación de miofibroblasto, y se conserva la expresión del marcador de célula epitelial E-cadherina. En un modelo de Cisplatin de lesión de riñón, la eliminación de WISE protegió al animal de lesión tubular y redujo la mortalidad (Tanaka y asociados, publicación en línea de avance Internacional de riñón, 17 de Octubre de 2007). Además, cuando los ratones KO WISE (ratones KO USAG-1) fueron cruzados con ratones KO Co14a3, los ratones de eliminación doble tuvieron significativamente menos proteinuria y desarrollaron menos enfermedad renal de etapa terminal en forma relativa a los ratones KO Co14a3 con el gen WT WISE. A las 4 semanas de edad, los ratones USAG-1+/+, 3 (IV)-/- ya muestran proteinuria severa con división extensa de la membrana de base glomerular (GBM), mientras que los ratones KO dobles mostraron estructura normal de GBM. A las 10 semanas de edad, los ratones USAG-1+/+, 3(IV)-/- desarrollaron enfermedad renal de etapa terminal, en tanto que los ratones KO dobles mostraron función renal significativamente conservada con menos cambios histológicos renales. (Tanaka y asociados J Clin Invest. 2010;120 (3):768-777 y extracto de la Reunión TH-FC059 2008 ASN).

Estos datos sugieren que WISE puede ser un regulador de la función renal en adultos. Sin embargo estos estudios estuvieron limitados a ratones de eliminación que carecen de WISE durante todo su ciclo de desarrollo, por consiguiente fue impredecible si la inhibición aguda de la actividad WISE utilizando un inhibidor tal como un anticuerpo, puede proporcionar beneficio terapéutico para conservar la función de riñón bajo condiciones patológicas asociadas con diversas enfermedades fibróticas.

Los inventores de la presente invención demuestran que es posible tratar trastornos de pulmón y riñón asociados con daño y reparación, incluyendo fibrosis y disfunción de órganos utilizando agentes de enlace que dirigen WISE.

Breve Descripción de la Invención En la presente invención se describen composiciones y métodos que pueden ser utilizados para prevenir o tratar enfermedades y trastornos. La presente invención se refiere además a regiones de WISE humana reconocidas a través de agentes de enlace aquí descritos, métodos de uso de estas regiones, y métodos para elaborar dichas regiones. La presente invención también se refiere a epítopes específicos para la región de WISE identificada como el dominio de botón de cisteína, y los agentes de enlace que enlazan específicamente a dicha región.

La presente invención se refiere a agentes de enlace, tal como anticuerpos, que enlazan específicamente a WISE. Los agentes de enlace pueden estar caracterizados por su capacidad de bloquear en forma cruzada el enlace de al menos un anticuerpo aquí descrito a WISE y/o quedar bloqueados en forma cruzada del enlace a WISE mediante al menos uno de dichos anticuerpos. Los anticuerpos y otros agentes de enlace de la presente invención también pueden estar caracterizados por su patrón de enlace a péptidos WISE humanos en un ensayo de enlace de competición de epítope de péptido WISE humano, tal como aquí se describe.

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a agentes de enlace tal como anticuerpos que inhiben la actividad WISE y que disminuyen la lesión en tejido y la fibrosis asociada en tejidos tales como ríñones, pulmón, piel, ojos, hígado y corazón. Además, la presente invención se refiere a agentes de enlace que inhiben la proteinuria o las lesiones inducidas por proteinuria, por ejemplo, fibrosis, que está asociada con diversas enfermedades renales transmitidas en forma inmunológica o no inmunológica, tal como en pacientes con nefropatía diabética, glomerulonefritis, nefropatía membranosa, lupus, trasplante y otras enfermedades renales que implican la manifestación de proteinuria incrementada. Además, la presente invención se refiere a agentes de enlace que mejoran la función de órganos o el retraso de la pérdida de función en los órganos mencionados anteriormente que se ven impactados debido ya sea a fibrosis y/o proteinuria, incluyendo pero sin limitarse a enfermedades tales como enfermedades de riñon crónicas, nefropatía de aloinjerto crónica, fibrosis pulmonar idiopática, cardiomiopatía, glaucoma (fibrosis de la célula del lente) y escleroderma (fibrosis en la piel). Además, en la forma de metástasis de tumor también utilizando mecanismos similares a los utilizados en la fibrosis de tejido, el agente de enlace WISE también puede tener utilidad en retardar la metástasis de tumor y/o el progreso de cáncer.

En otras modalidades, la presente invención se refiere a agentes de enlace, tal como anticuerpos, que pueden bloquear el efecto inhibidor de WISE en un ensayo a base de células. La presente invención también se refiere a agentes de enlace, tal como anticuerpos, que pueden alterar el efecto de WISE en un ensayo a base de células.

La presente invención se refiere además en parte a construcciones del polipéptido que comprenden dos, tres o cuatro fragmentos de polipéptido enlazados a través de al menos un enlace de disulfuro, que representa una región central del botón-cisteína de WISE, y anticuerpos con la capacidad de enlazar específicamente al mismo.

En una modalidad, la presente invención se refiere a métodos para obtener epítopes adecuados para utilizarse como inmunogenes para generar, en animales, agentes de enlace, tal como anticuerpos con la capacidad de enlazar específicamente a WISE; en ciertas modalidades, los agentes de enlace generados tienen la capacidad de neutralizar la actividad WISE in vitro y/o in vivo.

En otra modalidad, la presente invención se refiere a una composición para provocar un anticuerpo específico para WISE cuando la composición se administra a un animal, en donde la composición comprende un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada de, pero que no se limita a una de las secuencias en la siguiente tabla: Tabla 1 En otras modalidades, la presente invención también se refiere a una composición para provocar un anticuerpo específico para WISE, cuando la composición se administra a un animal, en donde la composición comprende al menos un polipéptido que consiste esencialmente en la secuencia de ácido de humano, ratón, rata o cinomolgo WISE.

Quedará entendido para los expertos en la técnica, que las proteínas WISE descritas en la tabla 1, son secuencias de proteína de longitud total para las especies respectivas y que ocurre un procesamiento adicional para permitir la secreción. En una modalidad particular, el péptido de señal son los primeros 23 aminoácidos (Sec Id Nos.: 2, 4, 6 y 8) y la eliminación del péptido de señal da como resultado un polipéptido maduro. En una modalidad específica, la presente invención también se refiere a un polipéptido que consiste esencialmente en los aminoácidos 82 a 109 de una WISE madura mostrada en la tabla 1 anterior, también ilustrada, por ejemplo, en la Sec Id No.: 9; este polipéptido conocido en la presente invención como polipéptido de lazo 2 WISE, puede ser obtenido mediante expresión recombinante de fragmentos de la proteína, digestión tríptica de WISE humana o síntesis química y la proteína puede ser aislada mediante fraccionado HPLC, entre otros métodos. El péptido, si se sintetiza, puede estar en una forma lineal o circular. Si el péptido se produce a través de expresión recombinante, puede ser fusionado a otras proteínas transportadoras tales como fragmento Fe o albúmina de suero humano u otras que incrementarán.

En una modalidad, la presente invención se refiere a un método para generar un anticuerpo con la capacidad de enlazar específicamente a WISE, en donde el método comprende: (a) inmunizar a un animal con una composición que comprende un polipéptido WISE; (b) recolectar suero del animal; y (c) aislar del suero un anticuerpo con la capacidad de enlazar específicamente a, e inhibir la actividad biológica de WISE, en donde el anticuerpo enlaza específicamente al lazo 2 de WISE.

Aún en otra modalidad, la presente invención contempla además un método para seleccionar un anticuerpo que enlaza al lazo 2 WISE utilizando despliegue de fago, y/o mejorar la afinidad de un anticuerpo conocido a WISE, utilizando despliegue de fago.

En modalidades adicionales, la presente invención también se refiere a un método para generar un anticuerpo con la capacidad de enlazar específicamente a WISE> en donde el método comprende: (a) inmunizar un animal con una composición que comprende un fragmento que contiene un botón de cisteína de WISE, por ejemplo, Sec Id No. 9, o un derivado del mismo; (b) recolectar el suero del animal; y (c) aislar del suero un anticuerpo con la capacidad de enlazar específicamente a, e inhibir la actividad biológica de WISE.

En modalidades adicionales, la presente invención se refiere además a un método para detectar un anticuerpo anti-WISE en una muestra biológica, en donde el método comprende los pasos de (a) contactar la muestra biológica con un polipéptido, que consiste esencialmente en un polipéptido que tiene los aminoácidos 24 a 206 de de la SEC ID NO: 2; un polipéptido que tiene los aminoácidos 24 a 206 de la SEC ID NO: 4; un polipéptido que tiene los aminoácidos 24 a 206 de la SEC ID NO: 6; un polipéptido que tiene los aminoácidos 24 a 206 de la SEC ID NO: 8, y un péptido, tal como SEC ID NO: 9, bajo condiciones que permiten que se forma un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido; y (b) detectar la presencia o ausencia del complejo, en donde la presencia de complejo indica que la muestra biológica contiene un anticuerpo anti-WISE.

En otras modalidades, la presente invención comprende un método para detectar un anticuerpo anti-WISE en una muestra biológica, en donde el método comprende los pasos de (a) contactar la muestra biológica con una composición que comprende un fragmento que contiene un botón de cisteína de WISE, bajo condiciones que permiten que se forme un complejo entre el anticuerpo y el polipéptido; y (b) detectar la presencia o ausencia del complejo, en donde la presencia de complejo indica que la muestra biológica contiene un anticuerpo anti-WISE.

En ciertas modalidades, la presente invención se refiere a un agente de enlace WISE, tal como un anticuerpo que bloquea en forma cruzada el enlace de al menos uno de los anticuerpos de la presente invención. Los anticuerpos de la presente invención incluyen los que enlazan al lazo 2 de los polipéptidos WISE. Los ejemplos de anticuerpo de enlace del lazo 2 se incluyen en la tabla 2, en donde se ilustran las regiones variables de anticuerpos que enlazan al lazo 2 de una proteína WISE. En otras modalidades, la presente invención se refiere a un agente de enlace WISE, tal como un anticuerpo que bloquea en forma cruzada el enlace de al menos uno de los anticuerpos en la Tabla 2 a una proteína WISE.

Tabla 2 SECUENCIA ID NO. : 85 EVQLQQSGAELVRSG ASV LSCTASGFNIKDYYMHWV QRPEQ Ab-AJ GLEWIGWIDPENGDTEYAP FQGKATMTADTSSNTAYLQLSSLT Cadena Pesada SEDTAVYYCNFYDVYSEGALDYWGQGTSVTVSS En ciertas modalidades de la presente invención, se contempla que los pares de dominios variables de los polipéptidos ilustrados en las Sec Id Nos.; 11 y 13, Sec Id Nos.: 15 y 17, Sec Id Nos.: 19 y 21, Sec Id Nos.: 23 y 25, Sec Id Nos. 27 y 29, Sec Id Nos. 31 y 33, Sec Id No. 71 y 73, Sec Id No. 75 y 77, Sec Id No. 79 y 81, y Sec Id No. 83 y 85, sean dominios de enlace con la capacidad de enlazar el lazo 2 de WISE humana (Sec Id No.: 9). Tal como se utiliza en la presente invención, los dominios variables ilustrados en los identif icadores de secuencia particulares como se indican a continuación, comprenden cadenas pesadas y ligeras con la capacidad de enlazar WISE (Sec Id No.: 9), a saber, Sec Id Nos.; 11 y 13 se refiere a Ab-AA, Sec Id Nos.; 15 y 17 se refiere a Ab-AB, Sec Id Nos.; 19 y 21 se refiere a Ab-AC, Sec Id Nos.; 23 y 25 se refiere a Ab-AD, Sec Id Nos.; 27 y 29 se refiere a Ab-AE, Sec Id Nos.; 31 y 33 se refiere a Ab-AF, Sec Id Nos.; 71 y 73 se refiere a Ab-AG, Sec Id Nos.; 75 y 77 se refiere a Ab-AH, Sec Id Nos.; 79 y 81 se refiere a Ab-AI y Sec Id Nos.; 83 y 85 se refiere a Ab-AJ. Se contempla en forma adicional que las regiones de determinación complementarias de estos dominios variables pueden ser clonadas en regiones de anticuerpos de estructura humana, por ejemplo, lgG2, de modo que se retenga la actividad de enlace para la Sec Id No. 9.

Las CDR's de los dominios variables de anticuerpo ilustrados en la tabla 2 se presentan a continuación en la Tabla Tabla 3: En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que comprende regiones de determinación complementarias mostradas en las Sec Id Nos.: 34, 35 y 36 y Sec Id Nos.: 37, 38 y 39. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que comprende regiones de determinación complementarias mostradas en las Sec Id Nos.: 40, 41 y 42 y Sec Id Nos.: 43, 44 y 45. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que comprende regiones de determinación complementarias mostradas en las Sec Id Nos.: 46, 47 y 48 y Sec Id Nos.: 49, 50 y 51. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que comprende regiones de determinación complementarlas mostradas en las Sec Id Nos.: 52, 53 y 54 y Sec Id Nos.: 55, 56 y 57. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que comprende regiones de determinación complementarias mostradas en las Sec Id Nos.: 58, 59 y 60 y Sec Id Nos.: 61, 62 y 63. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que comprende regiones de determinación complementarias mostradas en las Sec Id Nos.: 64, 65 y 66 y Sec Id Nos.: 67, 68 y 69. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que comprende regiones de determinación complementarias mostradas en las Sec Id Nos.: 86, 87 y 88 y Sec Id Nos.: 89, 90 y 69. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que comprende regiones de determinación complementarias mostradas en las Sec Id Nos.: 91, 92 y 93 y Sec Id Nos.: 94, 95 y 96. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que comprende regiones de determinación complementarias mostradas en las Sec Id Nos.: 97, 98 y 99 y Sec Id Nos.: 100, 101 y 102. En ciertas modalidades, un anticuerpo de la presente invención incluye un anticuerpo que comprende regiones de determinación complementarias mostradas en las Sec Id Nos.: 103, 104 y 105 y Sec Id Nos.: 106, 107 y 108.

Un agente de enlace WISE de la presente invención también puede ser bloqueado en forma cruzada del enlace a WISE, a través de al menos uno de los anticuerpos que comprenden los dominios variables ilustrados en la tabla 2. Un agente de enlace WISE de la presente invención, también puede ser bloqueado en forma cruzada del enlace a WISE, a través de al menos uno de los anticuerpos ilustrados en la tabla 2 y/o un anticuerpo que comprende las regiones de determinación complementarias ejemplificadas a través de las Sec Id Nos.: 34, 35, y 36, y Sec Id Nos.: 37, 38 y 39; Sec Id Nos.: 40, 41 y 42, y Sec Id Nos.: 43, 44 y 45; Sec Id Nos.: 46, 47 y 48 y Sec Id Nos.: 49, 50 y 51; Sec Id Nos.: 52, 53 y 54 y Sec Id Nos.: 55, 56 y 57; Sec Id Nos.: 58, 59 y 60 y Sec Id Nos.: 61, 62 y 63; Sec Id Nos.: 64, 65 y 66, y Sec Id Nos.: 67, 68 y 69; Sec Id Nos.: 86, 87, y 88, y Sec Id Nos.: 89, 90 y 69; Sec Id Nos.: 91, 92 y 93, y Sec Id Nos.: 94, 95 y 96; Sec Id Nos.: 97, 98 y 99, y Sec Id Nos.: 100, 101 y 102; y Sec Id Nos.: 103, 104 y 105, y Sec Id Nos.: 106, 107 y 108.

Los anticuerpos que comprenden las regiones de determinación complementarias (CDRs) de los anticuerpos aquí ejemplificados, incluyen anticuerpos humanizados, en donde los ácidos nucleicos que codifican CDRs mostrados en las Sec Id Nos.: 34, 35 y 36, y Sec Id Nos.: 37, 38 y 39; Sec Id Nos.: 40, 41 y 42, y Sec Id Nos.: 43, 44 y 45; Sec Id Nos.: 46, 47 y 48 y Sec Id Nos.: 49, 50 y 51; Sec Id Nos.: 52, 53 y 54 y Sec Id Nos.: 55, 56 y 57; Sec Id Nos.: 58, 59 y 60 y Sec Id Nos.: 61, 62 y 63; Sec Id Nos.: 64, 65 y 66. y Sec Id Nos.: 67, 68 y 69 Sec Id Nos.: 86, 87, y 88, y Sec Id Nos.: 89, 90 y 69; Sec Id Nos.: 91, 92 y 93, y Sec Id Nos.: 94, 95 y 96; Sec Id Nos.: 97, 98 y 99, y Sec Id Nos.: 100, 101 y 102; o Sec Id Nos.: 103, 104 y 105, y Sec Id Nos.: 106, 107 y 108, son clonados en una región de estructura humana, utilizando técnicas de biología molecular convencionales. Estas secuencias pueden ser clonadas con o sin modificaciones adicionales a las regiones de estructura y/o con los cambios adicionales a las CDRs. Estos anticuerpos humanizados se expresan utilizando métodos convencionales descritos en parte en la presente invención. Los ejemplos de anticuerpos humanizados de la presente invención, incluyen los ilustrados como pares de cadena pesada y ligera, mostrados en las Sec Id Nos.: 110 y 112, Sec Id Nos.: 114 y 116 (Sec Id Nos.: 118 y 116, Sec Id Nos.: 114 y 120, Sec Id Nos.: 118 y 120, Sec Id Nos.: 122 y 124, Sec Id Nos.: 126 y 124, Sec Id Nos.: 122 y 128, y Sec Id Nos.: 126 y 128 que se encuentran a continuación en la tabla 4, con las secuencias de ácido nucleico correspondientes.

Tabla 4: Aún en otras modalidades, la presente invención se refiere a un agente de enlace tal como un anticuerpo aislado que exhibe un patrón de enlace similar a los péptidos WISE humanos en un "ensayo de enlace de competición de epítope de péptido WISE humano" tal como se exhibe a través de al menos uno de los anticuerpos Ab-AA, Ab-AB, Ab-AC, Ab-AD, Ab-AE, Ab-AF, Ab-AG, Ab-AH, Ab-AI, Ab-AJ y D14 o derivados de los mismos; el anticuerpo aislado o el fragmento de enlace de antígeno del mismo puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano o un anticuerpo quimérico.

Los ejemplos de anticuerpos humanos específicos para WISE se muestran en la Tabla 5 que se encuentra a continuación: b l a 5 : Sec Id No. 129 CAGTACGAATTGACTCAGCCACCCTCAGTGGCCGTGTCCCC TGGAAAGACAGCCAGCATCACCTGCGCTGGAGATGAATTGG GTAATAAATATGCTGCGTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAG GCCCCTGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTC AGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAACTCTGGGAACA CGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGA GGCCGACTATTACTGTCAGGTGTGGGATAGAAGTAGTTATC ATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAGGT CAGCCCAAGGCCAACCCCACTGTCACTCTGTTCCCGCCCTCC TCTGAGGAGCTCCAAGCCAACAAGGCCACACTAGTGTGTCT GATCAGTGACTTCTACCCGGGAGCTGTGACAGTGGCCTGGA AGGCAGATGGCAGCCCCGTCAAGGCGGGAGTGGAGACCAC CAAACCCTCCAAACAGAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGC AGCTACCTGAGCCTGACGCCCGAGCAGTGGAAGTCCCACAG AAGCTACAGCTGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTG GAGAAGACAGTGGCCCCTACAGAATGTTCA Sec Id o. 130 QYELTQPPSVAVSPG TASITCAGDELGNKYAAWYQQKPGQA PVLWYDDSDRPSG1PERFSGSNSGNTATLTISRVEAGDEADYY CQVWDRSSYHVVFGGGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQA NKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSN NKYAASSYLSLTPEQW SHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS Sec Id No. 131 GAAGTTCAATTGTTAGAGTCTGGTGGCGGTCTTGTTCAGCCT GGTGGTTCTTTACGTCTTTCTTGCGCTGCTTCCGGATTCACTT TCTCTCTTTACACTATGCAGTGGGTTCGCCAAGCTCCTGGTA AAGGTTTGGAGTGGGTTTCTGGTATCGGTTCTTCTGGTGGCG GTACTTCTTATGCTGACTCCGTTAAAGGTCGCTTCACTATCT CTAGAGACAACTCTAAGAATACTCTCTACTTGCAGATGAAC AGCTTAAGGGCTGAGGACACTGCCGTGTATTACTGTGCGAG AGGGGTCAGCAGTTGGTTTTTCGAGTACTGGGGCCAGGGAA CCCTGGTCACCGTCTCTAGTGCCTCCACCAAGGGCCCATCG GTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAG CACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCG AACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGC Los anticuerpos humanos en la tabla 5 pueden ser mutados en forma adicional en sus CDR's para aumentar la función del anticuerpo, por ejemplo, incrementando la afinidad a WISE humana con mutaciones descritas en la tabla 6 que se encuentra a continuación. La numeración está basada en la posición de residuo de aminoácido en la cadena pesada o cadena ligera del anticuerpo (Sec Id No.132 o Sec Id No.130). Tabla 6 La presente invención se refiere en forma adicional a un método para tratar una enfermedad o trastorno fibrótico renal y/o de pulmón en un mamífero, en donde el método comprende proporcionar a un sujeto que necesita de dicho tratamiento una cantidad de un agente de enlace anti-WISE suficiente para disminuir síntomas asociados con el trastorno, en donde el agente de enlace anti-WISE comprende un anticuerpo o un fragmento de enlace WISE.

En la presente invención se proporcionan anticuerpos que enlazan específicamente a WISE humana. Los anticuerpos de la presente invención están caracterizados por su capacidad de bloquear en forma cruzada el enlace de al menos un anticuerpo descrito en la presente invención a WISE humana y/o ser bloqueados en forma cruzada de enlazar a WISE humana a través de al menos un anticuerpo aquí descrito. La presente invención también proporciona un anticuerpo aislado, o un fragmento de enlace de antígenp del mismo, que puede bloquear el efecto de WISE en un ensayo a base de células. La presente invención también proporciona un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, que puede activar el efecto de WISE en un ensayo a base de células.

Estos y otros aspectos de la presente invención podrán ser apreciados con referencia a la siguiente descripción detallada y a los dibujos adjuntos. Todas las referencias aquí descritas están incorporadas en sus totalidades a la presente invención como referencia, como si cada una estuviera incorporada en forma individual.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1: Identificación de anticuerpos que requieren Lazo-2 para enlazar a WISE.

Figura 2: Identificación de cuerpos de neutralización Lazo-2 e un ensayo a base de células. Las concentraciones de proteína son: 0.3 ug/ml hWISE y 3 ug/ml Ab.

Figura 3: anticuerpo de neutralización Lazo 2 Anti-Wise que Inhibe el enlace Wise-Lrp6.

Figura 4: Ensayo para medir el enlace competitivo de Ab-AA a hWISE. Ab-AA se enlaza a la placa. Ab-C, Ab-T, Ab-S y Ab-P son anticuerpos de control identificados previamente, y se incluyen aquí y en las siguientes figuras.

Figura 5: Ensayo para medir el enlace competitivo de Ab- AB a hWISE. Ab-AB se enlaza a la placa.

Figura 6: Ensayo para medir el enlace competitivo de Ab-AC a hWISE. Ab-AC se enlaza a la placa.

Figura 7: Ensayo para medir el enlace competitivo de Ab-AD a hWISE. Ab-AD se enlaza a la placa.

Figura 8: Ensayo para medir el enlace competitivo de Ab-AE a hWISE. Ab-AE se enlaza a la placa.

Figura 9: Ensayo para medir el enlace competitivo de Ab-AF a hWISE. Ab-AF se enlaza a la placa.

Figura 10: Ensayo para medir el enlace competitivo de Ab- S a hWISE. Ab-S se enlaza a la placa.

Figura 11: Ensayo para medir el enlace competitivo de Ab-a hWISE. Ab-S se enlaza a la placa.

Figura 12: Ensayo para medir el enlace competitivo de Ab-S a hWISE. Ab-S se enlaza a la placa.

Figura 13: Ensayo para medir el enlace competitivo de Ab-S a hWISE. Ab-S se enlaza a la placa.

Figura 14: Ensayo de enlace que muestra el enlace relativo de anticuerpos hWISE a hWISE mutante, en donde los residuos en el Lazo 2 han sido mutados individualmente a alanina. Los números menores a uno, indican enlace reducido. El Hu WISE-HuSost-lazo 2 es un polipéptido de control que es quimérico de hWISE y tiene el lazo 2 HuSost (ver Ejemplos). El término "residuo WT" indica el aminoácido que ha sido convertido a alanina. Estos residuos corresponden con los aminoácidos 4 a 25 en la Sec Id No: 9, respectivamente.

Figura 15: Función renal conservada mediante tratamiento de anticuerpo WISE en modelo T2DN.

Figura 16: Función renal conservada mediante tratamiento de anticuerpo WISE en modelo T2DN.

Figura 17: Lesión intersticial-tubular inhibida mediante tratamiento con anticuerpo WISE en modelo T2DN.

Figura 18: Lesión glomerular inhibida mediante tratamiento de anticuerpo WISE en modelo T2DN.

Figura 19: El tratamiento de anticuerpo WISE no tiene impacto en proteinuria establecida en modelo T2DN.

Figura 20: Perfil de enlace del Mab Lazo 2 WISE (Ab-AB) contra Mutantes WISE.

Figura 21: Perfil de enlace del Mab Lazo 2 WISE (Ab-AE) contra Mutantes WISE.

Figura 22: Perfil de enlace del Mab Lazo 2 WISE (Ab-AG) contra Mutantes WISE.

Figura 23: Perfil de enlace del Mab Lazo 2 WISE (Ab-AI) contra Mutantes WISE.

Figura 24: Perfil de enlace del Mab Lazo 2 WISE (Ab-AC) contra Mutantes WISE.

Figura 25: Perfil de enlace del Mab Lazo 2 WISE (Ab-AA) contra Mutantes WISE.

Figura 26: Perfil de enlace del Mab Lazo 2 WISE (Ab-AH) contra Mutantes WISE.

Figura 27: Perfil de enlace del Mab Lazo 2 WISE (Ab-AJ) contra Mutantes WISE.

Figura 28: Perfil de enlace del Mab Lazo 2 WISE (Ab-AF) contra Mutantes WISE.

Figura 29: Expresión MC3T3E1 -STF de mabs de lazo 2 WISE humanizado muestra actividad de anticuerpos.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se refiere en parte a regiones de la proteína WISE que contienen epítopes reconocidos mediante anticuerpos, en donde estos anticuerpos también tienen la capacidad de enlazar a epítopes dentro del contexto del polipéptido WISE de longitud total, y a métodos para elaborar y utilizar estos epítopes. La presente invención también proporciona agentes de enlace (tal como anticuerpos) que enlazan específicamente a WISE o partes de WISE, y a métodos para utilizar dichos agente de enlace. Los agentes de enlace son útiles para bloquear o dañar el enlace de WISE humana a uno o más ligando(s) y su actividad biológica.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término WISE humana pretende incluir la proteína ilustrada en la Sec Id No. 2, 4, 6 y 8 y las variantes alélicas de la misma. Los ortólogos de WISE, también se describen e incluyen Sec Id No. 2, 4, 6 y 8 de ratón, rata y cinomolgo. WISE puede ser purificada de células huésped que han sido transfectadas a través de un gen que codifica WISE, mediante la elución del sobrenadante filtrado del fluido de cultivo de célula huésped. La preparación y purificación adicional se describen en los ejemplos. Los ácidos nucleicos WISE humano se describen en la Patente Norteamericana No. 5,780,263.

Quedará entendido para un experto en la técnica, que existe un alto grado de identidad de secuencia entre los ortólogos de WISE. Por consiguiente, los agentes de enlace a WISE humana, se espera que enlacen al WISE de ratón, rata o cinomolgo, en casos en donde el sitio de reconocimiento del agente de enlace, por ejemplo, un sitio de enlace de anticuerpo tal como epítope, es altamente conservado y en particular casi o completamente idéntico a la secuencia humana. Por lo tanto, cuando se utiliza el término "enlace específico a", quedará entendido que incluye el enlace múltiples especies de WISE, en donde están conservadas las secuencias entre las especies.

Los ejemplos de agentes de enlace de acuerdo con la presente invención, incluyen los siguientes: Ab-AA, Ab-AB, Ab-AC, Ab-AD, Ab-AE, Ab-AF, Ab-AG, Ab-AH, Ab-AI, Ab-AJ y D14, y también un anticuerpo que comprende las Sec Id Nos.: 34, 35, y 36, y Sec Id Nos.: 37, 38 y 39; Sec Id Nos.: 40, 41 y 42, y Sec Id Nos.: 43, 44 y 45; Sec Id Nos.: 46, 47 y 48 y Sec Id Nos.: 49, 50 y 51; Sec Id Nos.: 52, 53 y 54 y Sec Id Nos.: 55, 56 y 57; Sec Id Nos.: 58, 59 y 60 y Sec Id Nos.: 61, 62 y 63; Sec Id Nos.: 64, 65 y 66, y Sec Id Nos.: 67, 68 y 69; Sec Id Nos.: 86, 87 y 88 y Sec Id Nos.: 89, 90 y 69; Sec Id Nos.: 91, 92 y 93 y Sec Id Nos.: 94, 95 y 96; Sec Id Nos.: 97, 98 y 99 y Sec Id Nos.: 100, 101 y 102; Sec Id Nos.: 103, 104 y 105 y Sec Id Nos.: 106, 107 y 108 y Sec Id Nos.: 133, 134 y 135 y Sec Id Nos.: 136, 137 y 138. Además, los ejemplos de polipéptidos CDR-L1 de la presente invención, incluyen los que se muestran en las Sec Id Nos.: 34, 40, 46, 52, 58, 64, 86, 91, 97, 103 y 133. Los ejemplos de CDR-L2 incluyen los que se muestran en Sec Id Nos.: 35, 41, 47, 53, 59, 65, 87, 92, 98, 104 y 134. Los ejemplos de CDR-L3 incluyen los que se muestran en las Sec Id Nos.: 36, 42, 48, 54, 60, 66, 88, 93, 99, 105 y 135. Los ejemplos de CDR-H1 incluyen los que se muestran en las Sec Id Nos.: 37, 43, 49, 55, 61, 67, 89, 94, 100, 106 y 136. Los ejemplos de CDR-H2 incluyen los que se muestran en las Sec Id Nos.: 38, 44, 50, 56, 62, 68, 90, 95, 101, 107 y 137. Los ejemplos de CDR-H3 incluyen los que se muestran en las Sec Id Nos.: 39, 45, 51, 57, 63, 69, 96, 102, 108 y 138.

Tal como se utiliza en la presente invención, Ab-AA está comprendido de polipéptidos expresados a través de los nucleótidos mostrados en la Sec Id No. 10 y 12; Ab-AB está comprendido de los polipéptidos expresados por los nucleótidos mostrados en la secuencia Sec Id No. 14 y 16; Ab-AC está comprendido de los polipéptidos expresados por los nucleótidos mostrados en la Sec Id No. 18 y 20; Ab-AD está comprendido de los polipéptidos expresados por los nucleótidos mostrados en la Sec Id No. 22 y 24; Ab-AE está comprendido de los polipéptidos expresados por los nucleótidos mostrados en la Sec Id No. 26 y 28; Ab-AF está comprendido de los polipéptidos expresados por los nucleótidos mostrados en la Sec Id No. 30 y 32; Ab-AG está comprendido de los polipéptidos expresados por los nucleótidos mostrados en la Sec Id No. 70 y 72; Ab-AH está comprendido de los polipéptidos expresados por los nucleótidos mostrados en la Sec Id No. 74 y 76; Ab-AI está comprendido de los polipéptidos expresados por los nucleótidos mostrados en la Sec Id No. 78 y 80; Ab-AJ está comprendido de los polipéptidos expresados por los nucleótidos mostrados en la Sec Id No. 82 y 84; y D14 está comprendido de los polipéptidos expresados por los nucleótidos mostrados en la Sec Id Nos.: 129 y 131. Quedará entendido que cada uno de Ab-AA, Ab-AB, Ab-AC, Ab-AD, Ab-AE, Ab-AF, Ab-AG, Ab-AH, Ab-AI, Ab-AJ y D14 aquí mostrados, carece de péptidos de señal, y un experto en la técnica puede expresar cada uno de estos polipéptidos utilizando técnicas convencionales, que incluyen el uso de péptidos de señal conocidos en la técnica. También quedará entendido que cada uno de Ab-AA, Ab-AB, Ab-AC, Ab-AD, Ab-AE, Ab-AF, Ab-AG, Ab-AH, Ab-AI y Ab-AJ aquí descrito, incluye únicamente las cadenas ligeras y pesadas variables y no incluyen regiones constantes.

Además, los anticuerpos no humanos aquí descritos pueden ser humanizados a través de un número de diferentes estrategias incluyendo el "cortar y pegar" simple de las CDR's, o también puede incluir mutaciones inversas para conservar las secuencias de múrido clave en la molécula humanizada. Los ejemplos específicos de humanización incluyen Ab-AB, Ab-AI y Ab-AE en los ejemplos que se encuentran a continuación (Sec Id Nos.: 114 y 116, Sec Id Nos.: 118 y 120, Sec Id Nos.: 122 y 124, Sec Id Nos.: 126 y 128, y Sec Id Nos. 110 y 112).

En la presente invención se presentan datos de anticuerpo adicionales con referencia a las moléculas previamente descritas (por ejemplo, Ab-C, Ab-T, Ab-S y Ab-P) en la Solicitud de Patente Norteamericana No. 12/275,850 (US 2009/0130114), la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Los agentes de enlace de la presente invención, normalmente son anticuerpos o fragmentos de los mismos, tal como aquí se define. El término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto, o un fragmento de enlace del mismo. Un anticuerpo puede comprender una molécula de anticuerpo completa (incluyendo versiones policlonales, monoclonales, quiméricas, humanizadas o humanas, que tienen cadenas pesadas y/o ligeras de longitud total), o comprende un fragmento de enlace de antígenos del mismo. Los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos F(ab')2, Fab, Fab', Fv, Fe y Fd, y pueden incorporarse en anticuerpos de dominio simple, anticuerpos de cadena simple, maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, v-NAR y bis-scFv (Ver la Publicación de, Hollinger y Hudson, 2005, Nature Biotechnology, 23, 9, 1126-1136). Los polipéptidos de anticuerpo también se describen en la Patente Norteamericana No. 6,703,199, incluyendo monocuerpos de polipéptido de fibronectina. Otros polipéptidos de anticuerpo se describen en la Publicación de Patente Norteamericana 2005/0238646, los cuales son polipéptidos de cadena simple. Tal como se utiliza en la presente invención, el anticuerpo aislado o un fragmento de enlace de antígeno de mismo, puede ser un anticuerpo policlonal, un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico o similares.

Los fragmentos de enlace de antígeno derivados de un anticuerpo pueden ser obtenidos, por ejemplo, mediante hidrólisis proteolítica del anticuerpo, por ejemplo, digestión de pepsina o papaína de anticuerpos completos de acuerdo con métodos convencionales. A manera de ejemplo, los fragmentos de anticuerpo pueden ser producidos mediante disociación enzimática de anticuerpos con pepsina, para proporcionar un fragmento 5S, denominado F(ab')2. Este fragmento puede ser disociado en forma adicional utilizando un agente de reducción de tiol para producir fragmentos monovalentes 3.5S Fab'. Opcionalmente, la reacción de disociación se puede llevar a cabo utilizando un grupo de bloqueo para los grupos sulfhidrilo, que resultan de la disociación de las ligaduras de disulfuro. Como alternativa, la disociación enzimática utilizando papaína produce dos fragmentos Fab monovalentes y un fragmento Fe directamente. Estos métodos se describen, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 4,331,647 de Goldenberg, en las Publicaciones Nisonoff y asociados, Arch. Biochem. Biophys. 89:230, 1960; Porter, Biochem. J. 73: 119, 1959; Edelman y asociados, en Methods in Enzymology 1:422 (Academic Press 1967); y en la Publicación de Andrews, S. M. y Titus, J. A. en Protocolos Corrientes en Inmunología (Coligan J. E., y asociados, eds), John Wiley & Sons, Nueva York (2003).

Páginas 2.8.1 a 2.8.10 y 2.10A.1 a 2.10A.5. También se pueden utilizar otros métodos para disociar anticuerpos, tal como separación de cadenas pesadas para formar fragmentos de cadena ligera-pesada (Fd) monovalentes, disociación adicional de fragmentos u otras técnicas enzimáticas químicas o genéticas, siempre que los fragmentos se enlacen al antígeno que es reconocido por el anticuerpo intacto.

Un fragmento de anticuerpo también puede ser cualquier proteína construida sintética o genéticamente. Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo incluyen fragmentos aislados que consisten en la región variable de cadena ligera, los fragmentos "Fv" que consisten en las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras, las moléculas de "Fv" de cadena simple recombinante en donde las regiones variables pesadas y ligeras se conectan mediante un enlazador de péptido (proteínas scFv).

Otra forma de un fragmento de anticuerpo es un polipéptido que comprende una o más regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de un anticuerpo. Las CDRs (también denominadas "unidades de reconocimiento mínimo" o "región hipervariable") pueden ser obtenidas construyendo polinucleótidos que codifican la CDR de interés. Dichos polinucleótidos son preparados, por ejemplo, utilizando la reacción de cadena de polimerasa para sintetizar la región variable utilizando el mARN de células que producen anticuerpos como una plantilla (ver, por ejemplo, la Publicación de Larrick y asociados, Métodos: A Companion to Methods in Enzymology 2: 106, 1991; Courtenay-Luck, "Manipulación Genética de Anticuerpos Monoclonales" en Anticuerpos Monoclonales. Producción, Construcción y Aplicación Química Ritter y asociados (eds.), página 166 (Cambridge University Press 1995); y en la Publicación de Ward y asociados, "Manipulación Genética y Expresión de Anticuerpos", en Anticuerpos Monoclonales: Principios y Aplicación, Birch y asociados, (eds.), página 137 (Wiley-Liss, Inc. 1995)).

Por lo tanto, en una modalidad, el agente de enlace comprende al menos una CDR tal como aquí se describe. El agente de enlace puede comprender al menos dos, tres, cuatro, cinco o seis CDR's tal como aquí se describe. El agente de enlace puede comprender en forma adicional al menos un dominio de región variable de un anticuerpo aquí descrito. El dominio de región variable puede ser de cualquier tamaño o composición de aminoácido, y generalmente comprenderá al menos una secuencia CDR responsable del enlace a WISE humana, por ejemplo CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3 y/o las CDRs de cadena ligera descritas específicamente en la presente invención, y la cual está adyacente a, o en estructura con una o más secuencias de estructura. En términos generales, el dominio de región variable (V) puede ser cualquier ajuste adecuado de dominios variables de cadena pesada (VH) y/o ligera (VL) de inmunoglobulina. Por lo tanto, por ejemplo, el dominio de región V puede ser monomérico y puede ser un dominio VH o VL, el cual tiene la capacidad de enlazar en forma independiente a WISE humana con una afinidad al menos igual a 1x10"7M o menos tal como se describe más adelante. Como alternativa, el dominio de región V puede ser dimérico y contener dímeros VH-VH, VH-VL, o VL-VL. El dímero de región V comprende al menos una cadena VH y al menos una cadena VL que puede estar asociada en forma no covalente (referido en la presente invención posteriormente como FV). Si se desea, las cadenas pueden ser acopladas covalentemente ya sea en forma directa, por ejemplo a través de un enlace de disulfuro entre los dos dominios variables, o a través de un enlazador, por ejemplo un enlazador de péptido, para formar una cadena simple Fv (scFV).

El dominio de región variable puede ser cualquier dominio variable que ocurra naturalmente, o una versión construida del mismo. Por versión construida se entiende un dominio de región variable que ha sido creado utilizando técnicas de construcción de ADN recombinante. Dichas versiones construidas incluyen las creadas, por ejemplo, de una región variable de anticuerpo específico mediante inserciones, eliminaciones o cambios en o a las secuencias de aminoácido del anticuerpo específico. Los ejemplos particulares incluyen dominios de región variable construidos que contienen al menos una CDR y opcionalmente uno o más aminoácidos de estructura de un primer anticuerpo, y el resto del dominio de región variable de un segundo anticuerpo.

El dominio de región variable puede ser unido en forma covalente a un aminoácido C-terminal al menos a otro dominio de anticuerpo o fragmento del mismo. Por lo tanto, por ejemplo, un dominio VH que está presente en el dominio de región variable puede enlazarse a un dominio CH1 de inmunoglobulina, o un fragmento del mismo. En forma similar, un dominio VL puede estar enlazado a un dominio CK o fragmento del mismo. En esta forma, por ejemplo, el anticuerpo puede ser un fragmento Fab, en donde el dominio de enlace de antígeno contiene dominios VH y VL asociados enlazados en forma covalente en su término-C a un dominio CHI y CK, respectivamente. El dominio CH1 puede ser extendido con aminoácidos adicionales, por ejemplo, para proporcionar una región de articulación o una porción de un dominio de región de articulación tal como se encuentra en un fragmento Fab', o para proporcionar dominios adicionales, tal como los dominios de anticuerpo CH2 y CH3.

Tal como se describe en la presente invención, los agentes de enlace comprenden al menos una de estas CDRs. Por ejemplo, se pueden incorporar una o más CDR en regiones de estructura de anticuerpo conocidas. (lgG1, lgG2, etc.), o conjugados a un vehículo adecuado para mejorar la vida media de la misma. Los vehículos adecuados, incluyen pero no se limitan a Fe, polietilenglicol (PEG), albúmina, transferrina , y similares. En la técnica se conocen éstos y otros vehículos adecuados. Dichos péptidos CDR conjugados pueden estar en forma monomérica, dimérica, tetramérica u otra forma. En una modalidad, se une un polímero soluble en agua en una o más posiciones específicas, por ejemplo en el término amino, de un agente de enlace.

En ciertas modalidades, un agente de enlace comprende una o más uniones de polímero soluble en agua, incluyendo, pero sin limitarse a, polietilenglicol, polioxietilenglicol, o polipropilenglicol. Ver por ejemplo las Patentes Norteamericanas Nos. 4,640,835, 4,496,689, 4,301,144, 4,670,417, 4,791,192 y 4,179,337. En ciertas modalidades, un agente de enlace derivado comprende uno o más de monometoxi-polietilenglicol, dextrano, celulosa, u otros polímeros a base de carbohidrato, poli-(N-vinilpirrolidona)-polietilenglicol, homopolímeros de propilenglicol, un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilenos (por ejemplo, glicerol) y alcohol . polivinílico, así como mezclas de dichos polímeros. En ciertas modalidades, uno o más polímeros solubles en agua se unen en forma aleatoria a una o más cadenas laterales. En ciertas modalidades, PEG puede actuar para mejorar la capacidad terapéutica de un agente de enlace, tal como un anticuerpo. Se describen ciertos de dichos métodos, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 6,133,426, la cual está incorporada a la presente invención como referencia para cualquier propósito.

Los expertos en la técnica podrán apreciar que un agente de enlace de la presente invención puede tener al menos una sustitución de un aminoácido, siempre que el agente de enlace retenga la especificidad de enlace. Por consiguiente, las modificaciones a las estructuras del agente de enlace están comprendidas dentro del alcance de la presente invención. Éstas pueden incluir sustituciones de aminoácido, que pueden ser conservadoras o no conservadoras, y que no destruyen la capacidad de enlace WISE de un agente de enlace. Las sustituciones de aminoácido conservadoras pueden comprender residuos de aminoácido que no ocurren naturalmente, las cuales normalmente se incorporan mediante síntesis de péptido química, en lugar de mediante síntesis en sistemas biológicos. Éstos incluyen péptido miméticos y otras formas revertidas o invertidas de porciones de aminoácido. Una sustitución de aminoácido conservadora también puede implicar una sustitución de un residuo de aminoácido nativo con un residuo normativo, de modo que exista poco o ningún efecto en la polaridad o carga del residuo de aminoácido en dicha posición.

Las sustituciones no conservadoras pueden implicar el intercambio de un miembro de una clase de aminoácidos o miméticos de aminoácido para un miembro, procedente de otra clase con diferentes propiedades físicas (por ejemplo, tamaño, polaridad, hidrofobicidad, carga). Dichos residuos sustituidos pueden introducirse en regiones del anticuerpo humano que son homologas con los anticuerpos no humanos, o en las regiones no homólogas de la molécula.

Además, un experto en la técnica puede generar variantes de prueba que contienen una sustitución simple de aminoácido en cada residuo de aminoácido deseado. Dichas pruebas se pueden llevar a cabo en el objetivo del agente de enlace, tal como se describe más adelante en los ejemplos, o en el agente de enlace terapéutico de la presente invención. Posteriormente las variantes pueden ser clasificadas utilizando ensayos de actividad conocidos para los expertos en la técnica. Dichas variantes pueden ser utilizadas para reunir información con respecto a variantes adecuadas. Por ejemplo, si se descubre que un cambio a un residuo de aminoácido particular dan como resultado una actividad destruida, indeseablemente reducida o no adecuada, se pueden evitar variantes con dicho cambio. En otras palabras, con base en la información reunida de dichos experimentos de rutina, un experto en la técnica puede determinar fácilmente los aminoácidos en donde se pueden evitar sustituciones adicionales, ya sea solas o en combinación con otras mutaciones.

Un experto en la técnica tendrá la capacidad de determinar variantes adecuadas del polipéptido tal como se establece en la presente invención, utilizando técnicas bien conocidas. En ciertas modalidades, un experto en la técnica puede identificar áreas adecuadas de la molécula que pueden ser cambiadas sin destruir la actividad, mediante la dirección a regiones que no se consideran importantes para la actividad. En ciertas modalidades, se pueden identificar residuos y porciones de las moléculas que están conservadas entre polipéptidos similares. En ciertas modalidades, incluso áreas que pueden ser importantes por la actividad biológica o por la estructura, pueden someterse a sustituciones de aminoácido conservadoras sin destruir la actividad biológica o sin afectar de manera adversa la estructura del polipéptido.

Además, un experto en la técnica puede revisar los estudios de función de estructura que identifican los residuos de polipéptidos similares que son importantes para la actividad o estructura. En virtud de dicha comparación, se puede anticipar la importancia de los residuos de aminoácido en una proteína que corresponde a los residuos de aminoácido que son importantes para actividad o estructura en proteínas similares. Un experto en la técnica puede optar por sustituciones de aminoácido químicamente similares para dichos residuos de aminoácido importantes anticipados.

Una cantidad de publicaciones científicas están dedicadas a la predicción de estructuras secundaria. Ver las Publicaciones de Moult J., Curr. Op. in Biotech., 7(4):422-427 (1996), Chou y asociados, Biochemistry, 13(2):222-245 (1974); Chou y asociados, Biochemistry, 113(2):211-222 (1974); Chou y asociados, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol, 47: 45-148 (1978); Chou y asociados, Ann. Rev. Biochem., 47:251-276 y Chou y asociados, Biophys. J., 26:367-384 (1979). Además, actualmente existen programas de computadora disponibles para ayudar a la predicción de la estructura secundaria. Un método para anticipar la estructura secundaria está basado en modelado de homología. Por ejemplo, dos polipéptidos o proteínas que tienen una identidad de secuencia mayor al 30%, o una similitud mayor al 40% con frecuencia tienen topologías estructurales similares. El reciente crecimiento de la base de datos estructural de proteínas (PDB), ha proporcionado una capacidad de anticipación mejorada de la estructura secundaria, incluyendo los números potenciales de dobleces dentro de una estructura de polipéptido o de proteína. Ver la Publicación de Holm y asociados, Nucí. Acid. Res., 27( 1 ):244-247 (1999). Se ha sugerido (Brenner y asociados, Curr. Op. Struct. Biol., 7(3):369-376 (1997)) que existe un número limitado de dobleces en un polipéptido o proteína determinado y que una vez que se ha resuelto un número importante de estructuras, la anticipación estructural será dramáticamente más precisa.

Los métodos adicionales para anticipar una estructura secundaria incluyen "enlace" (Jones, D., Curr. Opin. Struct. Biol, 7(3):377-87 (1997); Sippl y asociados, Structure, 4(1): 15-19 (1996)), "análisis de perfil" (Bowie y asociados, Science, 253: 164-170 (1991); Gribskov y asociados, Meth. Enzym., 183: 146-159 (1990); Gribskov y asociados, Proc. Nat. Acad. Sci., 84(13):4355-4358 (1987)), y "ligadura de evolución" (ver Holm, supra (1999), y Brenner, supra (1997)).

En ciertas modalidades, las variantes de los agentes de enlace incluyen variantes de glucosilación, en donde el número y/o tipo de sitio de glucosilación ha sido alterado en comparación con las secuencias de aminoácido de un polipéptido de origen. En ciertas modalidades, las variantes comprenden un número mayor o menor de sitios de glucosilación enlazados-N que la proteína nativa. Un sitio de glucosilación enlazado-N está caracterizado por la secuencia: Asn-X-Ser o Asn-X-Thr, en donde el residuo de aminoácido designado como X, puede ser cualquier residuo de aminoácido, excepto prolina, la sustitución de residuos de aminoácido para crear esta secuencia, proporciona un nuevo sitio potencial para la adición de una cadena de carbohidrato enlazada-N. Como alternativa, las sustituciones que eliminan estas secuencias eliminarán una cadena de carbohidrato enlazada-N existente. También se proporciona un reajuste de las cadenas de carbohidrato enlazadas-N, en donde uno o más sitios de glucosilación enlazados-N (normalmente los que ocurren naturalmente) son eliminados, y se crean uno o más nuevos sitios enlazados-N. Las variantes de anticuerpo preferidas adicionales, incluyen variantes de cisteína, en donde se eliminan uno o más residuos de cisteína o se sustituyen por otro aminoácido (por ejemplo serina) tal como se compara con la secuencia de aminoácido de origen. Las variantes de cisteína pueden ser útiles cuando los anticuerpos deben ser redoblados en una conformación biológicamente activa, tal como después del aislamiento de cuerpos de inclusión insolubles. Las variantes de cisteína generalmente tienen menos residuos de cisteína que la proteína nativa, y normalmente tienen un número par, para minimizar las interacciones que resultan de cisteínas disparejas.

Las sustituciones de aminoácido deseadas (ya sea conservadoras o no conservadoras) pueden ser determinadas por los expertos en la técnica al momento que se deseen dichas sustituciones. En ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácido pueden ser utilizadas para identificar residuos de anticuerpos importantes para WISE, o para incrementar o disminuir la afinidad de los anticuerpos a WISE, tal como aquí se describe.

De acuerdo con ciertas modalidades, las sustituciones de aminoácido preferidas son aquellas en donde: (1) se reduce susceptibilidad a proteólisis, (2) se reduce la susceptibilidad a oxidación, (3) se altera la afinidad de enlace para formar complejos de proteína, (4) se alteran las afinidades de enlace, y/o (4) se confiere o modifican otras propiedades fisioquímicas o funcionales en dichos polipéptidos. De acuerdo con ciertas modalidades, se pueden elaborar sustituciones de aminoácido simples o múltiples (en ciertas modalidades, sustituciones de aminoácido conservadoras) en la secuencia que ocurre naturalmente (en ciertas modalidades, en la parte del polipéptido fuera del dominio(s) que forma los contactos intermoleculares). En ciertas modalidades, una sustitución de aminoácido conservadora normalmente puede no cambiar sustancialmente las características estructurales de la secuencia de origen (por ejemplo, un aminoácido de reemplazo no debe tender a romper una hélice que surge en la secuencia de origen, o interrumpir otros tipos de estructura secundaria que caracteriza la secuencia de origen). Los ejemplos de estructuras secundarias y terciarias de polipéptido reconocidas en la técnica se describen en la Publicación de Proteínas, Estructuras y Principios Moleculares (Creighton, Ed., W.H. Freeman y Company, Nueva York (1984)); Introducción a Estructura de Proteína (C. Branden y J. Tooze, eds., Garland Publishing, Nueva York, N.Y. (1991)); y Thornton y asociados, Nature 354: 105 (1991), las cuales están incorporadas a la presente invención como referencia.

En ciertas modalidades, los agentes de enlace de la presente invención pueden estar unidos químicamente con polímeros, lípidos, u otras porciones.

Los agentes de enlace pueden comprender al menos una de las CDRs aquí descritas aquí incorporadas, en una estructura de estructura biocompatible. En un ejemplo, la estructura de armazón biocompatible. En un ejemplo, la estructura de armazón biocompatible comprende un polipéptido o porción del mismo que es suficiente para formar un soporte estructural conformacionalmente estable, o armazón, o andamio, que tiene la capacidad de desplegar una o más secuencias de aminoácidos que enlazan a un antígeno (por ejemplo, CDRs, una región variable, etc.) en una región de superficie localizada. Dichas estructuras pueden ser un polipéptido que ocurre naturalmente o un "doblez" de polipéptido (un motivo estructural) o pueden tener una o más modificaciones, tal como adiciones, eliminaciones, o sustituciones de aminoácidos, en forma relativa a un polipéptido o doblez que ocurren naturalmente. Estos andamios pueden ser derivados de un polipéptido de cualesquiera especies (o de una o más especies), tal como un humano, otro mamífero, otro vertebrado, invertebrado, plata, bacteria o virus. Por ejemplo, los que están basados en fibronectina, anquirina, lipocalina, neocarzinostaina, citocromo b, dedo de zinc CP1, PST1, bovina enroscada, LAC1-D1, dominio Z y dominios de tendramisat, pueden ser utilizados (Ver por ejemplo, Nygren y Uhlen, 1997, Opinión Actual en Biología Estructural, 7, 463-469).

En modalidades preferidas, se podrá apreciar que los agentes de enlace de la presente invención incluyen los anticuerpos humanizados aquí descritos. Los anticuerpos humanizados, tal como los aquí descritos, pueden ser producidos utilizando técnicas conocidas por los expertos en el arte (Zhang, W., y asociados, Molecular Immunology. 42(12): 1445-1451, 2005; Hwang W. y asociados, Methods. 36(l):35-42, 2005; DalFAcqua W F, y asociados, Methods 36(l):43-60, 2005; y Clark, M . , Immunology Today. 21 (8):397-402, 2000).

Además, un experto en la técnica podrá reconocer que los agentes de enlace adecuados incluyen porciones de estos anticuerpos, tal como una o más CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 tal como se describe de manera específica en la presente invención. Al menos una de las regiones de CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3, CDR-L1 , CDR-L2 y CDR-L3 pueden tener al menos una sustitución de aminoácido, siempre que el agente de enlace retenga la especificidad de enlace de la CDR no sustituida. Sin CDR del agente de enlace, puede ser una molécula sin proteína, en donde el agente de enlace bloquea en forma cruzada el enlace de un anticuerpo aquí descrito a WISE y/o WISE neutraliza. Las porciones sin CDR del agente de enlace pueden ser una molécula sin proteína en la cual el agente de enlace exhibe un patrón de enlace similar a los péptidos WISE humanos en un "ensayo de enlace de competición de epítope de péptido WISE humano", como el que se exhibe mediante al menos uno de los anticuerpos aquí descritos y/o neutraliza WISE. La porción sin CDR del agente de enlace puede estar compuesta de aminoácidos, en donde el agente de enlace es una proteína de enlace recombinante o péptido sintético, y las proteínas de enlace recombinante y bloquean en forma cruzada el enlace de un anticuerpo aquí descrito a WISE y/o neutralizan WISE. La porción sin CDR del agente de enlace puede estar compuesta de aminoácidos, en donde el agente de enlace es una proteína de enlace recombinante, y la proteína de enlace recombinante exhibe un patrón de enlace similar a péptidos WISE humanos en el ensayo de enlace de competición de epítope de péptido WISE humano (que se describe más adelante) como el que se exhibe mediante al menos uno de los anticuerpos aquí descritos Ab-AA, Ab-AB, Ab-AC, Ab-AD, Ab-AE, Ab-AF, Ab-AG, Ab-AH, Ab-AI, Ab-AJ D14 y anticuerpos humanizados con CDRs de Ab-AA, Ab-AB, Ab-AC, Ab-AD, Ab-AE, Ab-AF, Ab-AG, Ab-AH, Ab-AI, Ab-AJ y/o neutraliza WISE.

Cuando un anticuerpo comprende una o más de CDR-H1, CDR-H2 , CDR-H3, CDR-L1, CDR-L2 y CDR-L3 tal como aquí se describe, puede obtenerse mediante la expresión de una célula huésped que contiene ADN que codifica para estas secuencias. Un ADN que codifica para cada secuencia CDR puede ser determinado sobre las bases de la secuencia de aminoácido de la CDR y sintetizarse junto con una estructura de región variable de anticuerpo y secuencias de ADN de región constante deseadas, utilizando técnica de síntesis de oligonucleótido, mutagénesis dirigida al sitio y técnicas de reacción de cadena de polimerasa (PCR) según sea lo adecuado. El ADN que codifica las estructuras de región variable y las regiones constantes está ampliamente disponible para los expertos en la técnica de las bases de datos de secuencia genética, tal como GenBank®. Cada una de las CDRs antes mencionada, estará localizada normalmente en una estructura de región variable en las posiciones 31-35 (CDR-H1), 50-65 (CDR-H2) y 95-102 (CDR-H3) de la cadena pesada y las posiciones 24-34 (CDR-L1 ), 50-56 (CDR-L2) y 89-97 (CDR-L3) de la cadena ligera de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat (Kabat y asociados, 1987 en Secuencias de proteína de interés inmunológico, U.S. Department de Health y Human Services, NIH, USA).

El término "CDR" puede referirse a la región de determinación complementaria dentro de las secuencias variables de anticuerpo. Existen normalmente tres CDRs en cada una de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, que son designadas como CDR1, CDR2 y CDR3, para cada una de las regiones variables. Los límites de estas CDRs han sido definidos en forma diferente de acuerdo con sistemas diferentes. El sistema descrito por Kabat (Kabat y asociados, Secuencias de Proteínas de Interés Inmunológico (National Institutes de Health, Bethesda, Md. (1987) y (1991)) proporciona un sistema de numeración de residuos aplicable a cualquier región variable de un anticuerpo, y proporciona límites de residuo que definen las tres CDRs. Chothia y colaboradores (Chothia &Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) y Chothia y asociados, Nature 342:877-883 (1989)), descubrieron que ciertas subporciones dentro de la CDRs de Kabat adoptan conformaciones de esqueleto de péptido casi idénticas, a pesar de tener gran diversidad en el nivel de secuencia de aminoácido. Estas subporciones, fueron designadas como L1, L2 y L3 o H1, H2 y H3 en donde "L" y "H" designa las regiones de cadena ligera y de cadena pesadas, respectivamente. Estas regiones pueden tener límites que traslapan con las CDRs definidas utilizando Kabat. Otros límites que definen CDRs que se traslapan las CDRs con las Kabat, han sido descritos por Padlan (FASEB J. 9: 133-139 (1995)) y MacCallum (J Mol Biol 262(5): 732-45 (1996)). Aún otras definiciones de límites CDR pueden no seguir de manera estricta uno de los sistemas anteriores, aunque sin embargo tse raslaparán con la numeración de Kabat, aunque puedan ser acortadas o alargadas a la luz de la anticipación o descubrimientos experimentales de que los residuos o grupos de residuos de interés, o incluso CDRs completas, no impactan en forma significativa el enlace de antígeno. Los métodos aquí utilizados pueden utilizar CDRs definidas de acuerdo con cualesquiera de estos sistemas.

Tal como se utiliza en la presente invención, el término "estructura" o "secuencia de estructura" se refiere a las secuencias restantes de una región variable alrededor de, pero sin incluir las CDRs. Debido a que la definición exacta de una secuencia CDR puede ser determinada mediante diferentes sistemas, el significado de una secuencia de estructura está sujeto a diferentes interpretaciones correspondientes. Las CDRs (CDR-L1, -L2, y -L3 de cadena ligera y CDR-H1, -H2, y -H3 de cadena pesada) también dividen las regiones de estructura en la cadena ligera y la cadena pesada en cuatro subregiones (FR1, FR2, FR3 y FR4) en cada cadena, en donde CDR1 se coloca entre FR1 y FR2, CDR2 entre FR2 y FR3, y CDR3 entre FR3 y FR4. Sin especificar las subregiones particulares como FR1, FR2, FR3 o FR4, una región de estructura, tal como lo refieren otros, representa las FR's combinadas dentro de la región variable de una cadena de inmunoglobulina simple, que ocurre naturalmente. Tal como se utiliza en la presente invención, una FR representa una de las cuatro subregiones, y FRs representa dos o más de las cuatro subregiones que constituyen una región de estructura.

Una vez sintetizado, el ADN que codifica un anticuerpo de la presente invención, o un fragmento del mismo, puede ser propagado y expresado con cualesquiera de una variedad de procedimientos bien conocidos para excisión, ligadura, transformación y transfección de ácido nucleico utilizando cualquier número de vectores de expresión conocidos. Por lo tanto, en ciertas modalidades, puede ser preferida la expresión de un anticuerpo en un huésped procariótico , tal como Escherichia coli (ver por ejemplo, la Publicación de Pluckthun y asociados, 1989 Methods Enzymol. 178:497-515). En ciertas otras modalidades, la expresión del anticuerpo o un fragmento del mismo puede ser preferida en una célula huésped procariótica, incluyendo levadura (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, y Pichia pastoris), células de animales (incluyendo células de mamífero) o células de plantas. Los ejemplos de células animales adecuadas incluyen, pero no se limitan a, mieloma (tal como una línea NSO de ratón), COS, CHO, o células de hibridoma. Los ejemplos de células de plantas incluyen células de tabaco, maíz, frijol soya y arroz.

Uno o más vectores de expresión replicables que contienen ADN que codifica una región variable y/o constante de anticuerpo, pueden ser preparados y utilizados para transformar una línea celular adecuada, por ejemplo, una línea de célula de mieloma sin producción tal como la línea NSO de ratón o una bacteria tal como E. coli, en donde ocurrirá la producción del anticuerpo. Con el objeto de obtener una transcripción y traducción eficiente, la secuencia de ADN en cada vector debe incluir secuencias reguladoras adecuadas, particularmente una secuencia promotora o líder enlazada en forma operativa a la secuencia de dominio variable. Los métodos particulares producidos para producir anticuerpos en esta forma, son conocidos generalmente y utilizados en forma rutinaria. Por ejemplo, los procedimientos de biología molecular básica se describen en la Publicación de Maniatis y asociados (Clonación Molecular, Manual de Laboratorio, 2o edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, 1989; ver también la Publicación de Maniatis y asociados, 3o edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Nueva York, (2001)). La secuenciación de ADN se puede llevar a cabo tal como se describe en la Publicación de Sanger y asociados (PNAS 74:5463, (1977)) y el manual de secuenciación pie de Amersham International, y se puede llevar a cabo mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (Kramer y asociados, Nucleic Acids Res. 12:9441, (1984); Kunkel Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:488-92 (1985); Kunkel y asociados, Methods in Enzymol. 154:367-82 (1987); el Manual de Anglian Biotechnology Ltd). Adicionalmente, numerosas publicaciones describen técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos mediante manipulación de ADN, creación de vectores de expresión y transformación y cultivo de células adecuada (Mountain A y Adair, J R en Revisiones de Biolotecnología e Ingeniería Genética (ed. Tombs, M P, 10, Capítulo 1, 1992, Intercept, Andover, UK); "Protocolos Actuales en Biología Molecular", 1999, F. M. Ausubel (ed.), Wiley I nterscience, Nueva York).

Cuando se desea mejorar la afinidad de anticuerpos de acuerdo con la presente invención, que contienen una o más de las CDRs antes mencionadas, se pueden obtener a través de un número de protocolos de maduración por afinidad incluyendo el mantenimiento de las CDRs (Yang y asociados, J. Mol. Biol, 254, 392-403, 1995), arrastre de cadena (Marks y asociados, Bio/Technology, 10, 779-783, 1992), uso de cepas de mutación de E. coli. (Low y asociados, J. Mol. Biol, 250, 350-368, 1996), arrasre de ADN (Patten y asociados, Curr. Opin. BiotechnoL, 8, 724-733, 1997), despliegue de fago (Thompson y asociados, J. Mol. Biol, 256, 7-88, 1996) y PCR sexual (Crameri, y asociados, Nature, 391, 288-291, 1998). Todos de estos métodos de maduración por afinidad se describen en la Publicación de Vaughan y asociados (Nature Biotechnology , 16, 535-539, 1998).

Otros anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser obtenidos a través de procedimientos de fusión celular e inmunización convencionales tal como se describe en la presente invención y tal como se sabe en la técnica. Los anticuerpos monoclonales de la presente invención, pueden ser generados utilizando una variedad de técnicas conocidas. En general, los anticuerpos monoclonales que enlazan a antígenos específicos pueden ser obtenidos a través de métodos conocidos para los expertos en la técnica (ver, por ejemplo, la Publicación de Kohler y asociados, Nature 256:495, 1975; Coligan y asociados (eds.), Protocolos Actuales en Inmunología, 1:2.5.12.6.7 (John Wiley & Sons 1991); Patentes Norteamericanas Nos. RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439, y 4,411,993; Anticuerpos Monoclonales, Hibridomas: Una Nueva Dimensión en Análisis Biológicos, Plenum Press, Kennett, cKearn, y Bechtol (eds.) (1980); y Anticuerpos: Manual de Laboratorio, Harlow y Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press (1988); Picksley y asociados, "Producción de anticuerpos monoclonales contra proteínas expresadas en E. coli," en Clonación de ADN 2: Sistema de Expresión, segunda Edición Glover y asociados (eds.), página 93 (Oxford University Press 1995)). Los fragmentos de anticuerpo pueden ser derivados de los mismos utilizando cualquier técnica estándar adecuada, tal como digestión proteolítica u opcionalmente mediante digestión proteolítica (por ejemplo, utilizando papaína o pepsina) seguido de reducción leve de enlaces de disulfuro y alquilación. Como alternativa, dichos fragmentos también pueden ser generados mediante técnicas de ingeniería genética recombinante tal como aquí se describe.

Los anticuerpos monoclonales pueden ser obtenidos inyectando a un animal, por ejemplo, una rata, hámster, conejo o preferentemente un ratón, incluyendo por ejemplo un ratón transgénico o de eliminación, tal como se sabe en la técnica, con un inmunogen que comprende WISE, por ejemplo, que incluye los polipéptidos tanto de longitud total como los maduros ilustrados en la SEC ID NO: 2, 4, 6 ó 8, o un fragmento de los mismos, por ejemplo, Sec Id No. 9, de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y aquí descritos. La presencia de la producción de anticuerpo específico puede monitorearse después de la inyección inicial y/o después de una inyección de refuerzo obteniendo una muestra de suero y detectando la presencia de un anticuerpo que enlaza a WISE humana o un péptido utilizando cualesquiera de los diversos métodos de inmunodetección conocidos en la técnica y aquí descritos. De animales que producen los anticuerpos deseados, se eliminan células linfoides, más comúnmente células del bazo o nodo linfático, para obtener linfocitos-B. Los linfocitos B posteriormente se fusionan con una parte de fusión de célula de mieloma sensibilizada con fármacos, preferentemente una que es singeneica con el animal inmunizado y que opcionalmente tiene otras propiedades deseables (por ejemplo, incapacidad de expresar los productos de gen endógeno Ig, por ejemplo, P3X63-Ag 8.653 (ATCC No. CRL 1580); NSO, SP20) para producir hibridomas, que son líneas de célula eucariótica inmortales. Las células linfoides (por ejemplo, bazo) y las células de mieloma pueden ser combinadas durante algunos minutos con un agente de promoción de fusión de membrana, tal como un polietilenglicol o un detergente no iónico, y posteriormente revestirse en una baja densidad en un medio selectivo que soporta el crecimiento de células de hibridoma, pero no células de mieloma no fusionadas. Un medio de selección preferido es HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, normalmente aproximadamente una a dos semanas, se observan colonias de células. Las colonias simples son aisladas, y los anticuerpos producidos mediante las células pueden ser probadas para actividad de enlace a WISE humana, utilizando cualquiera de una variedad de inmunoensayos conocidos en la técnica y aquí descritos. Los hibridomas son clonados (por ejemplo, mediante clonación de dilución limitada o mediante aislamiento de placa de agar blanda) y se seleccionan y cultivan los clones positivos que producen un anticuerpo específico para WISE. Los anticuerpos monoclonales de los cultivos de hibridoma pueden ser aislados de los sobrenadantes de cultivos de hibridoma. Un método alternativo para producción de un anticuerpo monoclonal de múrido, es inyectar las células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón singeneico, por ejemplo, un ratón que ha sido tratado (por ejemplo imprimado con pristano) para promover la formación de fluido de ascitos que contienen el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos monoclonales pueden ser aislados y purificados a través de una variedad de técnicas bien establecidas. Dichas técnicas de aislamiento incluyen cromatografía por afinidad con Sefarosa de Proteína A, cromatografía de exclusión por tamaño y cromatografía de intercambio de iones (ver, por ejemplo, la Publicación de Coligan páginas 2.7.1 a 2.7.12 y páginas 2.9.1 a 2.9.3; Baines y asociados, "Purificación de Inmunoglobulina G (IgG)," en Métodos en Biología Molecular, volumen 10, páginas 79 a 104 (The Humana Press, Inc. 1992)). Los anticuerpos monoclonales pueden ser purificados mediante cromatografía por afinidad utilizando un ligando adecuado seleccionado con base en las propiedades particulares del anticuerpo (por ejemplo, isotipo de cadena pesada o ligera, especificidad de enlace, etc.). Los ejemplos de un ligando adecuado, inmovilizados en un soporte sólido, incluyen Proteína A, Proteína G, un anticuerpo de región anticonstante (cadena ligera o cadena pesada), un anticuerpo anti-idíotipo y una proteína de enlace TGF-beta, o fragmento o variante del mismo.

Un anticuerpo de la presente invención también puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser generados a través de cualquier número de técnicas con las cuales estarán familiarizados los expertos en la técnica. Dichos métodos incluyen pero no se limitan a transformación de Virus Epstein Barr (EBV) de células de sangre periférica humana (por ejemplo, que contienen linfocitos B), inmunización ¡n vitro de células B humanas, fusión de células de bazo de ratones transgénicos inmunizados que llevan genes de inmunoglobulina humana insertados, aislamiento de bibliotecas de fago de región de inmunoglobulina V u otros procedimientos conocidos en la técnica y basados en la presente descripción. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser obtenidos de ratones transgénicos que han sido construidos para producir anticuerpos humanos específicos en respuesta a un estímulo antigénico. Los métodos para obtener anticuerpos humanos de ratones transgénicos se describen por ejemplo en las Publicaciones de Green y asociados, Nature Genet. 7: 13, 1994; Lonberg y asociados, Nature 368:856, 1994; Taylor y asociados, Int. Immun. 6:579, 1994; Patente Norteamericana No. 5,877,397; Bruggemann y asociados, 1997 Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58; Jakobovits y asociados, 1995 Ann. N. Y Acad. Sci. 764:525-35. En esta técnica, se introducen elementos del locus de cadena pesada y ligera humana en cepas de ratones derivadas de líneas de célula madre embriónica que contienen interrupciones dirigidas de los lugares de cadena pesada y cadena ligera endógenos (ver también la Publicación de Bruggemann y asociados, Curr. Opin. Biotechnol. 8:455-58 (1997)). Por ejemplo, los transgenes de inmunoglobulina humana pueden ser construcciones de minigen, o translugares en cromosomas artificiales de levadura, que pasan por reajuste de ADN específico de célula B e hipermutación en el tejido linfoide de ratón. Los anticuerpos monoclonales humanos pueden ser obtenidos inmunizando los ratones transgénicos, que posteriormente pueden producir anticuerpos humanos específicos para WISE. Las células linfoides de los ratones transgénicos inmunizados pueden ser utilizadas para producir hibridomas de secreción de anticuerpos humanos de acuerdo con los métodos aquí descritos. También se pueden obtener sueros policlonales que contienen anticuerpos humanos de la sangre de los animales inmunizados.

Otro método para generar anticuerpos humanos de la presente invención incluye inmortalizar células de sangre periférica humana mediante transformación EBV. Ver por ejemplo la Patente Norteamericana No. 4,464,456. Dicha línea de célula B inmortalizada (o línea de célula de linfoblastoide) que produce un anticuerpo monoclonal que enlaza específicamente a WISE, puede ser identificada a través de métodos de inmunodetección tal como aquí se proporciona, por ejemplo, un ELISA, y posteriormente aislarse mediante técnicas de clonación estándar. La estabilidad de la línea de célula de linfoblastoide que produce un anticuerpo anti-WISE, puede ser mejorada fusionando la línea de célula transformada con un mieloma de múrido para producir una línea de célula híbrida de ratón-humano de acuerdo con métodos conocidos en la técnica (ver, por ejemplo, Glasky y asociados, Hybridoma 8:377-89 (1989)). Aún otro método para generar los anticuerpos monoclonales humanos es inmunización in vitro, que incluye imprimación de células B esplénicas humanas con WISE humano, seguido de fusión de células B imprimadas con una parte de fusión heterohíbrida. Ver por ejemplo, la Publicación de Boerner y asociados, 1991 J. Immunol. 147:86-95.

En ciertas modalidades, se selecciona una célula B que está produciendo un anticuerpo WISE anti-humano, y las regiones variables de cadena ligera y cadena pesada se clonan a partir de la célula B de acuerdo con técnicas de biología molecular conocidas en el arte (WO- 92/02551; Patente Norteamericana No. 5,627,052; Babcook y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 93:7843-48 (1996)) y aquí descritas. Las células B de un animal inmunizado pueden ser aisladas del bazo, nodo linfático o una muestra de sangre periférica, seleccionando una célula que está produciendo un anticuerpo que enlaza específicamente a WISE. Las células B también pueden ser aisladas de humanos, por ejemplo, de una muestra de sangre periférica. Los métodos para detectar células B simples que están produciendo un anticuerpo con especificidad deseada son bien conocidas en la técnica, por ejemplo, a través de formación de placa, clasificación de células activadas por fluorescencia, estimulación in vitro seguido de detección de un anticuerpo específico y similares. Los métodos para selección de células B que producen anticuerpos específicos incluyen, por ejemplo, preparar una suspensión de célula simple de células B en agar suave que contiene WISE humana. El enlace del anticuerpo específico producido a través de la célula B al antígeno da como resultado la formación de un complejo, el cual puede ser visible como un inmunoprecipitado. Después que las células B que producen el anticuerpo deseado son seleccionadas, se pueden clonar los genes de anticuerpo específicos aislando y amplificando el ADN o mARN de acuerdo con métodos conocidos en la técnica y aquí descritos.

Un método adicional para obtener anticuerpos de la presente invención es mediante despliegue de fagos. Ver, por ejemplo, las Publicaciones de Winter y asociados, 1994 Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Burton y asociados, 1994 Adv. Immunol. 57: 191-280. Se pueden crear bibliotecas de combinación de gen de región variable de inmunoglobulina de humano o múrido, en vectores de fago que pueden ser clasificados para seleccionar fragmentos Ig (Fab, Fv, sFv, o multímeros de los mismos) que enlazan específicamente a una proteína de enlace TGF-beta o variante o fragmento de la misma. Ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,223,409; Huse y asociados, 1989 Science 246: 1275-81; Sastry y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5728-32 (1989); Alting-Mees y asociados, Strategies in Molecular Biology 3: 1-9 (1990); Kang y asociados, 1991 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4363-66; Hoogenboom y asociados, 1992 J. Molec. Biol. 227:381-388; Schlebusch y asociados, 1997 Hybridoma 16:47-52, y referencias ahí mencionadas. Por ejemplo, una biblioteca que contiene una pluralidad de secuencias de polinucleótido que codifica fragmentos de región variable Ig, puede ser insertada en el genoma de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o un variante de la misma, en estructura con la secuencia que codifica una proteína de recubrimiento de fago. Una proteína de fusión puede ser una fusión de la proteína de recubrimiento con el dominio de región variable de cadena ligera y/o con el dominio de región variable de cadena pesada. De acuerdo con ciertas modalidades, los fragmentos Fab de inmunoglobulina también pueden ser desplegados en una partícula de fago (ver, por ejemplo, la Patente Norteamericana No. 5,698,426).

Las bibliotecas de expresión de cADN de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera también pueden ser preparadas en un fago lambda, por ejemplo, utilizando los vectores lambda ImmunoZap TM (H) y lambda ImmunoZap TM (L) (Stratagene, La Jolla, Calif). En síntesis, el mARN se aisla de una población de células B, y se utiliza para crear bibliotecas de expresión de cADN de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera en los vectores lambda ImmunoZap(H) y lambda ImmunoZap(L). Estos vectores pueden ser clasificados individualmente o coexpresarse para formar fragmentos o anticuerpos Fab (ver la Publicación de Huse y asociados, supra; ver también la Publicación de Sastry y asociados, supra). Las placas positivas pueden ser convertidas subsecuentemente a un plásmido no lítico que permite un alto nivel de expresión de fragmentos de anticuerpo monoclonal de E. coli.

En una modalidad, en un hibridoma las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal de interés son ejemplificadas utilizando cebadores de nucleótido. Estos cebadores pueden ser sintetizados por un experto en la técnica o pueden ser comprados en fuentes comercialmente disponibles. (Ver por ejemplo la Publicación de Stratagene (La Jolla, Calif), los cuales venden cebadores para regiones variables de ratón y humano, entre otros, cebadores para regiones VHa, VHb, VHc, VHd, CHI, VL y CL). Estos cebadores pueden ser utilizados para amplificar regiones variables de cadena pesada o ligera, que posteriormente pueden ser insertados en vectores tales como ImmunoZAP TM H o ImmunoZAP TM (Stratagene), respectivamente. Estos vectores posteriormente pueden ser introducidos en E. coli, levadura o sistemas para expresión a base de mamíferos. Se pueden producir grandes cantidades de una proteína de cadena simple que contiene una fusión de los dominios VH y VL utilizando estos métodos (ver la publicación de Bird y asociados, Science 242:423-426, 1988).

Una vez que las células que producen anticuerpos de acuerdo con la presente invención han sido obtenidas utilizando cualesquiera de las técnicas de inmunización antes descritas así como otras, se pueden clonar los genes de anticuerpo específicos aislando un ADN o mARN de amplificación de los mismos, de acuerdo con procedimientos estándar aquí descritos. Los anticuerpos producidos de los mismos pueden ser secuenciados y las CDRs identificadas y el ADN que codifica para CDRs puede ser manipulado tal como se describió previamente para generar otros anticuerpos de acuerdo con la presente invención.

Preferentemente, los agentes de enlace, enlazan específicamente a WISE. Como con todos los agentes de enlace y ensayos de enlace, un experto en la técnica reconoce que varias porciones en las cuales no debe enlazar en forma detectable un agente de enlace con el objeto de ser terapéuticamente efectivo y adecuado, puede ser exhaustivo e impráctico de considerar. Por consiguiente, para un agente de enlace aquí descrito, el término "enlaza en forma específica" se refiere a la capacidad de un agente de enlace para enlazar a WISE, preferentemente WISE humana, con mayor afinidad que la que enlaza a una proteína de control no relacionada. Preferentemente, la proteína de control es lisozoma de clara de huevo de gallina. Preferentemente, los agentes de enlace enlazan a WISE con una afinidad que es de al menos 50, 100, 250, 500, 1000, o 10,000 veces mayor a la afinidad para una proteína de control. Un agente de enlace puede tener una afinidad de enlace para WISE menor o igual a 1x10"7M, menor o igual a 1x10"8M, menor o igual a 1x10"9M, menor o igual a 1x10" 10 M, menor o igual a 1x10"11M, o menor o igual a 1x10"12M.

La afinidad puede ser determinada a través de un ensayo ELISA de afinidad. En ciertas modalidades, la afinidad puede ser determinada a través de un ensayo ELISA. En ciertas modalidades, la afinidad puede ser determinada a través de un ensayo BIAcore. En ciertas modalidades, la afinidad puede ser determinada a través de un método cinético. En ciertas modalidades, la afinidad puede ser determinada a través de un método de equilibrio/solución. Dichos métodos se describen con mayor detalle en la presente invención o son conocidos en la técnica.

Los agentes de enlace WISE de la presente invención modulan preferentemente la función WISE en el ensayo a base de células aquí descrito, y/o el ensayo in vivo aquí descrito y/o el enlace a uno o más de los epítopes aquí descritos, y/o el bloqueo cruzado del enlace de uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud, y/o el bloqueo cruzado del enlace WISE a través de uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud. Por consiguiente, dichos agentes de enlace puede ser identificados utilizando los ensayos aquí descritos.

En ciertas modalidades, los agentes de enlace se generan identificando primero anticuerpos que enlazan a uno o más de los epítopes aquí proporcionados, y/o neutralizan los ensayos a base de células y/o in vivo aquí descritos, y/o bloquean en forma cruzada los anticuerpos descritos en la presente solicitud, y/o son bloqueados en forma cruzada del enlace WISE a través de uno de los anticuerpos descritos en la presente solicitud. Las regiones CDR de estos anticuerpo se utilizan posteriormente para insertarse en estructuras biocompatibles adecuadas para generar agentes de enlace WISE. La porción sin CDR del agente de enlace, puede estar compuesta de aminoácidos, o puede ser una molécula sin proteína. Los ensayos aquí descritos permiten la caracterización de los agentes de enlace. Preferentemente, los agentes de enlace de la presente invención son anticuerpos tal como aquí se define.

Quedará entendido para un experto en la técnica que algunas proteínas, tal como anticuerpos, pueden pasar por una variedad de modificaciones posttraducción durante la expresión y secreción de células huésped. El tipo y grado de estas modificaciones con frecuencia depende de la línea de célula huésped utilizada para expresar la proteína, así como las condiciones de cultivo. Dichas modificaciones pueden incluir variaciones en glucosilación, oxidación de metionina o triptofan, formación de dicetopiperazina, isomerización de aspartato y desamidación de asparagina. Una modificación frecuente es la pérdida del residuo básico de terminal-carboxi (tal como lisina o arginina) debido a la acción de las carboxipeptidasas (tal como se describe en la Publicación de Harris, RJ., Revista de Cromatografía 705: 129-134, 1995). Una vez que las proteínas han sido expresadas y procesadas están en una forma "madura". Por lo tanto quedará entendido que la presente invención incluye anticuerpos maduros que resultan de la expresión de los ADNs de la presente invención.

Los anticuerpos aquí descritos se enlazan a regiones de WISE humana que son importantes para la actividad in vivo de la proteína, inhibiendo de esta forma la actividad de WISE. El enlace de un anticuerpo a WISE puede estar correlacionado con cambios en los biomarcadores asociados con la función renal, por ejemplo, niveles urinarios de albúmina o excreción de proteína urinaria total de 24 horas, creatinina en suero o rango de despeje de creatinina. Los métodos para construir y expresar anticuerpos y fragmentos de los mismos comprenden las CDR's de la presente invención que son conocidas para los expertos en la técnica.

Un oligopéptido o polipéptido está dentro del alcance de la presente invención, si tiene una secuencia de aminoácido que es al menos el 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idéntica al menos a una de las CDR's ilustradas en la tabla 1; y/o a una CDR de un agente de enlace WISE que bloquea en forma cruzada el enlace de al menos uno de los anticuerpos aquí descritos al lazo 2 de WISE, y/o es bloqueada en forma cruzada del enlace a WISE a través de al menos uno de los anticuerpos aquí descritos; y/o a una CDR de un agente de enlace WISE en donde el agente de enlace puede bloquear el efecto inhibidor de WISE en un ensayo a base de células o activar el efecto de WISE en un ensayo a base de células (por ejemplo, un agente de enlace de neutralización); y/o a una CDR de un agente de enlace WISE que enlaza a un epítope de dominio de botón de cisteína.

Los polipéptidos y anticuerpos del agente de enlace WISE están dentro del alcance de la presente invención, si tienen secuencias de aminoácido que son al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a una región variable de al menos uno de los anticuerpos que enlazan al lazo 2 de WISE (por ejemplo, Sec Id No. 9), y bloquean en forma cruzada el enlace de al menos uno de los anticuerpos que enlaza al lazo 2 de WISE, y/o son bloqueados en forma cruzada del enlace al lazo 2 de WISE mediante al menos uno de los anticuerpos aquí descritos; y/o pueden bloquear el efecto inhibidor de WISE en un ensayo a base de células (es decir, un agente de enlace de neutralización WISE); y/o enlazan a un epítope de dominio de botón de cisteina. La presente invención también contempla un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo WISE o fragmento del mismo, puede disminuir al menos uno de los siguientes parámetros: lesión de tejido y marcadores del mismo, manchado rojo Sirius o producción de colágeno, expresión de marcadores de miofibroblasto tal como aSMA o FSP-1, expresión de osteopontina, proteinuria y/o puede alterar la actividad de WISE en un ensayo a base de células. Tal como se utiliza en la presente invención, un experto en la técnica apreciará que la alteración de actividad incluye activación o inhibición.

Los polinucleótidos que codifican los agentes de enlace WISE están dentro del alcance de la presente invención, si tienen secuencias de polinucleótido que son al menos el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% idénticas a un polinucleótido que codifica una región variable de al menos uno de los anticuerpos Ab-AA, Ab-AB, y Ab-AC, y en donde los agentes de enlace WISE codificados bloquean en forma cruzada el enlace de al menos uno de los anticuerpos aquí descritos; y/o pueden bloquear el efecto inhibidor de WISE en un ensayo a base de células (es decir, un agente de enlace de neutralización WISE); y/o enlace a un epítope de dominio de botón de cisteina.

La afinidad de un agente de enlace, tal como un anticuerpo o parte de enlace, así como el grado al cual un agente de enlace (tal como un anticuerpo) inhibe el enlace, puede ser determinada por un experto en la técnica utilizando técnicas convencionales, por ejemplo las descritas por Scatchard y asociados (Ann. N.Y. Acad. Sci. 51: 660-672 (1949)) o mediante resonancia de plasmón de superficie (SPR; BIAcore, Biosensor, Piscataway, N. J.). Para resonancia de plasmón de superficie, las moléculas objetivo se inmovilizan en una fase sólida y se exponen a ligandos en una fase móvil que corre a lo largo de una célula de flujo. Si ocurre el enlace del ligando al objetivo inmovilizado, cambia el índice refractivo local, conduciendo a un cambio en el ángulo SPR, el cual puede ser monitoreado en tiempo real detectando cambios en la intensidad de la luz reflejada. Los rangos de cambio de la señal SPR, pueden ser analizados para producir constantes de rango aparentes para las fases de asociación y disociación de la reacción de enlace. La proporción de estos valores proporciona la constante de equilibrio aparente (afinidad) (ver, por ejemplo, la Publicación de Wolff y asociados, Cáncer Res. 53:2560-65 (1993)).

Un anticuerpo de acuerdo con la presente invención, puede pertenecer a cualquier clase de inmunoglobulina, por ejemplo IgG, IgE, IgM, IgD o IgA. Se puede obtener de, o derivarse de un animal, por ejemplo, ave de corral (por ejemplo, pollo) y mamíferos, que incluyen pero no se limitan a ratón, rata, hámster, conejo u otro roedor, vaca, caballo, oveja, cabra, camello, humano u otro primate. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de internalización. La producción de anticuerpos se describe de manera general en la Publicación de Patente Norteamericana No. 2004/0146888 A1.

Ensayos de Caracterización En los métodos aquí descritos para generar anticuerpos de acuerdo con la presente invención, incluyendo la manipulación de las CDRs de anticuerpo WISE de lazo 2 específicas en nuevas estructuras y/o regiones constantes, están disponibles ensayos adecuados para seleccionar los anticuerpos o agentes de enlace deseados (por ejemplo, ensayos para determinar la afinidad de enlace a WISE; ensayos de bloqueo cruzado; "ensayo de enlace de competición de epítope de péptido WISE humano" a base de Biacore; ensayo de base de célula MC3T3-E1 ;vensayos in vivo).

Ensayos de Enlace de Epítope La WISE humana no procesada, tiene 206 aminoácidos con el péptido de señal y la forma madura de WISE humana siendo una glucoproteína de 183 aminoácidos que contiene un motivo de botón de cistina. Debido a la conservación de los residuos de aminoácido clave, particularmente las cisternas, se considera que WISE tiene una estructura similar a las proteínas de botón de cistina descritas previamente. Esta estructura incluye, además del motivo de botón de cistina, tres lazos designados como Lazo 1, Lazo 2 y Lazo 3. Tal como se utiliza en la presente invención, las posiciones de los lazos son definidas aproximadamente como en los aminoácidos 75 a 104 de SEC ID NO: 2 para el Lazo 1; el Lazo 2 está aproximadamente en los aminoácidos 105 a 132; y el Lazo 3 está aproximadamente en los aminoácidos 134 a 170 de SEC ID NO:2. Quedará entendido que las posiciones aproximadas significa que las posiciones relativas pueden ser más o menos 3 aminoácidos de terminal carboxi o terminal amino de las posiciones manifestadas.

WISE humana puede ser sometida a digestión proteolítica para producir fragmentos. En síntesis, utilizando diferentes proteasas, incluyendo tripsina, Asp-N y Lys-C, fragmentos con diversos sitios y tamaños de disociación. Se determinan las secuencias y masa para diversos péptidos WISE humanos. Se evalúa la protección de anticuerpo para determinar el efecto en la accesibilidad para proteólisis, incluyendo el enmascaramiento del sitio recortado y el cambio de péptido. Finalmente, se lleva a cabo un "ensayo de competición de péptido WISE humano" a base de BIAcore.

Un grupo de anticuerpos exhibe un patrón específico de enlace a ciertos epítopes tal como se evidencia a través de un "ensayo de enlace de competición de epítope de péptido WISE humano" a base de Biacore. En síntesis, el anticuerpo se incuba previamente con el epítope que será probado, en concentraciones que saturarán los sitios de enlace de epítope en el anticuerpo. Posteriormente el anticuerpo se expone a WISE enlazado a una superficie de chip. Después de los procedimientos adecuados de incubación y lavado, se establece un patrón de enlace competitivo.

Ensayos de Bloqueo Cruzado Los términos "bloqueo cruzado", "bloqueado en forma cruzada" y "bloqueando en forma cruzada" se utilizan de manera intercambiable en la presente invención para significar la capacidad que tiene un anticuerpo u otro agente de enlace para interferir con el enlace de otros anticuerpos o agentes de enlace a WISE.

El grado en el cual un anticuerpo u otro agente de enlace tiene la capacidad de interferir con el enlace de otro a WISE, y por consiguiente, el hecho de que se pueda decir que bloquea en forma cruzada de acuerdo con la presente invención, puede ser determinado utilizando ensayos de enlace de competición. Un ensayo cuantitativo particularmente adecuado utiliza una máquina Biacore, la cual puede medir el grado de interacciones utilizando tecnología de resonancia de plasmón de superficie. Otro ensayo de bloqueo en forma cruzada cuantitativo adecuado, utiliza un método a base de ELISA para medir la competición entre anticuerpos u otros agentes de enlace en términos de su enlace a WISE.

También se contempla que un tipo de ensayo de bloqueo cruzado es adecuado para utilizarse en la identificación de péptidos que inhiben el enlace de WISE a sus receptores LRP-5 y LRP-6. Por ejemplo, un péptido de lazo 2 o un péptido de lazo 2 circulado por el uso de ligaduras de disulfuro de cisteína, han mostrado inhibir el enlace de WISE a su receptor.

Un experto en la técnica apreciará que los términos asociados con el bloqueo cruzado, no significa que sean tomados como un bloqueo absoluto, más bien es un término en la técnica comprendido para significar que existe un enlace reducido debido a interferencia estérica u otra interferencia de enlace previo en una región a la que también enlaza la molécula de prueba, reduciendo de esta forma la cantidad de enlace de la molécula de prueba. Por lo tanto se puede apreciar que puede haber un bloqueo cruzado cuando existe una reducción detectable en el enlace de un anticuerpo de prueba a un objetivo. Esta reducción detectable en enlace puede ser tan pequeña como del 15%, 10%, o menos, dependiendo de la sensibilidad del ensayo.

Ensayo de Bloque Cruzado Biacore A continuación se describe de manera general un ensayo Biacore adecuado para determinar si un anticuerpo u otro agente de enlace bloquea en forma cruzada, o tiene la capacidad de bloqueo en forma cruzada de acuerdo con la presente invención. Por conveniencia, se hace referencia a dos anticuerpos, aunque se podrá apreciar que el ensayo puede ser utilizado con cualesquiera de los agentes de enlace WISE aquí descritos. La máquina Biacore (por ejemplo Biacore 3000) opera en línea con las recomendaciones del fabricante.

Por lo tanto en un ensayo de bloqueo cruzado, WISE se acopla a un chip CM5 Biacore utilizando química de acoplamiento de amina estándar para generar una superficie recubierta con WISE. Normalmente, se pueden acoplar de 200 a 800 unidades de resonancia de WISE al chip (una cantidad que proporciona niveles de enlace fácilmente medibles, pero que es fácilmente saturable a través de las concentraciones del reactivo de prueba que está siendo utilizado).

Los dos anticuerpos (denominados A* y B*) que serán evaluados con respecto a su capacidad de bloqueo cruzado, cada uno se mezclan en una proporción molar de sitios de enlace de uno a uno en un amortiguador adecuado para crear la mezcla de prueba. Cuando se calculan las concentraciones en una base de sitio de enlace, se asume, que el peso molecular de un anticuerpo será el peso molecular total del anticuerpo dividido entre el número de sitios de enlace WISE en dicho anticuerpo.

La concentración de cada anticuerpo en la mezcla de prueba, debe ser lo suficientemente alta para saturar fácilmente los sitios de enlace de dicho anticuerpo en las moléculas WISE capturadas en el chip Biacore. Los anticuerpos en la mezcla están en la misma concentración molar (en una base de base de enlace) y dicha concentración normalmente puede ser de entre 1.00 y 1.5 micromolares (en una base de sitio de enlace).

También se preparan soluciones separadas que contienen el anticuerpo A* solo y el anticuerpo B* solo. El anticuerpo A* y el anticuerpo B* en estas soluciones deben estar en el mismo amortiguador y en la misma concentración que en la mezcla de prueba.

La mezcla de prueba pasa sobre el chip Biacore recubierto con WISE, y se registra la cantidad total de enlace. Posteriormente el chip se trata en forma tal que se eliminen los anticuerpos enlazados sin dañar el WISE enlazado por chip. Normalmente esto se hace tratando el chip con 30 mM de HCI durante 60 segundos.

La solución del anticuerpo A* solo, posteriormente se pasa sobre la superficie recubierta con WISE, y se registra la cantidad de enlace. El chip se trata nuevamente para eliminar todo el anticuerpo enlazado sin dañar el WISE enlazado por chip.

La solución del anticuerpo B* solo se pasa posteriormente sobre la superficie recubierta con WISE, y se registra la cantidad de enlace.

El enlace teórico máximo de la mezcla del anticuerpo A* y el anticuerpo B* se calcula posteriormente, y es la suma del enlace de cada anticuerpo, cuando se pasa sobre la superficie WISE sola. Si el enlace registro real de la mezcla es menor al de este máximo teórico, entonces se bloquean en forma cruzada entre sí los dos anticuerpos.

Por lo tanto, en general, un anticuerpo de bloqueo cruzado u otro agente de enlace de acuerdo con la presente invención, es uno que enlazará a WISE en el ensayo de bloqueo cruzado Biacore anterior, de modo que durante el ensayo y en la presencia de un segundo anticuerpo, u otro agente de enlace de la presente invención, el enlace registrado sea entre 80% y 0.1% (por ejemplo 80% a 4%) del enlace teórico máximo, específicamente entre 75% y 0.1% (por ejemplo 75% a 4%) del enlace teórico máximo, y más específicamente entre 70% y 0.1% (por ejemplo 70% a 4%) del enlace teórico máximo (tal como se definió anteriormente) de los dos anticuerpos o agentes de enlace en combinación.

El ensayo Biacore descrito anteriormente es un ensayo utilizado para determinar si los anticuerpos u otros agentes de enlace se bloquean en forma cruzada entre sí de acuerdo con la presente invención. En raras ocasiones anticuerpos u otros agentes de enlace particulares pueden no enlazar a WISE acoplado mediante química de amina a un chip Biacore CM5 (esto normalmente ocurre cuando el sitio de enlace relevante en WISE está enmascarado o es destruido por el acoplamiento al chip). En dichos casos, se puede determinar el bloqueo cruzando utilizando una versión etiquetada de WISE, por ejemplo WISE etiquetada-His N-terminal. En este formato particular, un anticuerpo anti-His puede acoplarse al chip Biacore y posteriormente el WISE etiquetado-H is puede pasar sobre la superficie de chip y capturarse a través del anticuerpo anti-His. El análisis de bloqueo cruzado puede llevarse a cabo esencialmente tal como se describió anteriormente, excepto que después de cada ciclo de regeneración de chip, se puede cargar un nuevo WISE etiquetado-His nuevamente en la superficie recubierta con anticuerpo anti-His. Además del ejemplo proporcionado utilizando WISE etiquetado-His N-terminal, se puede utilizar como alternativa WISE etiquetado-His C-terminal. Además, se sabe en la técnica que se pueden utilizar otras diversas etiquetas y combinaciones de proteína de enlace de etiqueta, para dicho análisis de bloqueo cruzado (por ejemplo etiqueta HA con anticuerpos anti-HA; etiqueta FLAG con anticuerpos anti-FLAG; etiqueta de biotina con estreptavidina). Ensayo de Bloqueo Cruzado a Base de Elisa A continuación se describe un ensayo ELISA para determinar si un anticuerpo anti-WISE u otro agente de enlace WISE bloquea en forma cruzada o tiene la capacidad de bloqueo en forma cruzada de acuerdo con la presente invención. Por conveniencia, se hace referencia a dos anticuerpos, aunque se podrá apreciar que el ensayo puede ser utilizado con cualesquiera de los agentes de enlace WISE aquí descritos.

El principio general del ensayo es tener un anticuerpo anti-WISE recubierto en los depósitos de una placa ELISA. Se agrega en una solución (una cantidad en exceso de un segundo anticuerpo anti-WISE, con bloqueo cruzado potencial (es decir, no enlazado a la placa ELISA). Posteriormente se agregan a los depósitos una cantidad limitada de WISE. El anticuerpo recubierto y el anticuerpo en la solución, compiten para el enlace del número limitado de moléculas WISE. La placa se lava para eliminar WISE que no ha sido enlazada por el anticuerpo recubierto, y también para eliminar el segundo anticuerpo de fase de solución, así como cualesquiera complejos formados entre el segundo anticuerpo de fase de solución y WISE. La cantidad de WISE enlazada posteriormente se mide utilizando un reactivo de detección de WISE adecuado. Un anticuerpo en solución que tiene la capacidad de bloquear en forma cruzada el anticuerpo recubierto, tendrá la capacidad de originar una disminución en el número de moléculas WISE que el anticuerpo recubierto puede enlazar en forma relativa al número de moléculas WISE, que el anticuerpo recubierto puede enlazar en la ausencia del segundo anticuerpo, de fase de solución.

Este ensayo se describe con mayor detalle más adelante para Ab-AA, Ab-AC y Ab-AE. En el caso en donde se elige Ab-AA como el anticuerpo inmovilizado, se recubren los depósitos de la placa ELISA, después de lo cual las placas son bloqueadas con una solución de bloqueo adecuada para minimizar el enlace no específico de reactivos que se agregan subsecuentemente. Posteriormente se agrega una cantidad en exceso de Ab-AC a la placa ELISA, de modo que las moléculas de los sitios de enlace WISE Ab-AC por depósito, sean al menos 10 veces más que los moles de los sitios de enlace WISE Ab-AA que fueron utilizado, por depósito, durante el recubrimiento de la placa ELISA.

Posteriormente se agrega WISE de modo que los moles de WISE agregados por depósito sean al menos 25 veces menores que los moles de sitios de enlace WISE Ab-AA que fueron utilizados para recubrir cada depósito. Después de un período de incubación adecuado, la placa ELISA se lava y se agrega un reactivo de detección WISE para medir la cantidad de WISE enlazada en forma específica a través del anticuerpo anti-WISE recubierto (en este caso Ab-AA). La señal de fondo para el ensayo se define como la señal obtenida en depósitos con el anticuerpo recubierto (en este caso Ab-AA), el segundo anticuerpo de fase de solución (en este caso Ab-AB), únicamente amortiguador WISE (es decir sin WISE) y reactivos de detección WISE. La señal de control positivo para el ensayo se define como la señal obtenida en depósitos con el anticuerpo recubierto (en este caso Ab-AA), únicamente el amortiguador del segundo anticuerpo de fase de solución (es decir, sin segundo anticuerpo de fase de solución), WISE y reactivos de detección WISE). El ensayo ELISA necesita ser corrido en forma tal que tenga la señal de control positiva al menos tres veces la señal de fondo.

Para evitar cualesquiera aspectos (por ejemplo, afinidades significativamente diferentes entre Ab-AA y Ab-AB para WISE) que resultan de la elección de que anticuerpo utilizar como el anticuerpo de recubrimiento, y cual utilizar como el segundo anticuerpo (competidor), el ensayo de bloqueo cruzado necesita ser corrido en dos formatos: 1) formato 1 es cuando el primer anticuerpo es el anticuerpo que es recubierto en la placa ELISA, y el segundo anticuerpo es el anticuerpo competidor que está en solución, y 2) el formato 2 es cuando el primero y segundo anticuerpo son invertidos en el recubrimiento y solución.

Ensayo de Neutralización de Base de Células Se utilizaron células reporteras MC3T3-E1 SuperTopFlash (STF) para determinar si la proteína WISE puede modular la señalización Wnt. La activación de señalización dependiente de TCF en células MC3T3-E1 STF, puede ser activada utilizando ya sea señalización Wnt endógena, inducida por cambio del medio de cultivo al medio de diferenciación, o agregando Wnt exógena, tal como Wnt3a. La proteína WISE recombinante derivada ya sea de E coli o célula de mamífero puede inhibir en forma dependiente a la dosis la señalización Wnt en células MC3T3-E1 STF.

Ensayo de luciferasa: se revistió un frasco de células C3T3-E 1 /STF en un frasco de cultivo en un medio de expansión. Cuando las células están confluentes, son tripsinizadas y las células en el medio de expansión revestidas en cada depósito en una placa de 96 depósitos. Al día siguiente todo el medio de expansión es eliminado y se reemplaza con 100 ul del medio de diferenciación preparado recientemente.

La mitad del medio de diferenciación (50 ul) fue reemplazada con un medio de diferenciación preparado en forma reciente cada día durante los siguientes cuatro días. Después de cinco días de diferenciación, se reemplaza todo el medio con muestras de prueba en el medio de diferenciación fresco en un volumen de 100 ul. Posteriormente las placas se dejan incubar durante 24 horas antes de que se mida la señal de luciferasa. La señal de luciferasa es medida al momento de la eliminación del medio de las placas de prueba, y de la adición de 20 ui de amortiguador de lisis 1x que ha sido equilibrado a temperatura ambiente. La placa se sella y se mueve durante 30 minutos a temperatura ambiente, y se agregan a cada depósito 100 ul de del reactivo de ensayo de luciferasa, y se captura la señal utilizando un Luminometer (LMAX, Molecular Device) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayo de Neutralización In Vivo Se pueden medir los incrementos en diversos parámetros asociados con, o que resultan de, protección renal o protección pulmonar como una salida de las pruebas in vivo de los agentes de enlace WISE, con el objeto de identificar los agentes de enlace que tengan la capacidad' de neutralizar WISE, y proporcionar un beneficio terapéutico. Dichos parámetros incluyen diversos marcadores renales/pulmonares y marcadores histomorfométricos de salud renal/pulmonar. Se define un agente de enlace de neutralización WISE, como uno con la capacidad de originar un incremento estadísticamente significativo, en comparación con animales tratados con vehículo, en cualquier parámetro asociado con, o que resulta de, la estimulación de protección renal/pulmonar. Dichas pruebas in vivo pueden llevarse a cabo en cualquier mamífero adecuado (por ejemplo, ratón, rata, mono).

Formulación y Suministro de Terapéuticos Se proporcionan composiciones farmacéuticas, que comprenden uno de los agentes de enlace descritos anteriormente, tal como al menos un anticuerpo de WISE humana aquí descrito, junto con un transportador, excipiente o diluyente farmacéutica o fisiológicamente aceptable.

El desarrollo de los regímenes de tratamiento y dosificación adecuados para utilizar las composiciones particulares aquí descritas en una variedad de regímenes de tratamiento, incluyendo, por ejemplo, administración y formulación subcutánea, oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular, es bien conocido en la técnica, algunos de los cuales se describen en forma resumida más adelante para propósitos de ilustración general.

En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas aquí descritas pueden ser suministradas mediante administración oral a un animal. Por lo tanto, estas composiciones pueden ser formuladas con un diluyente inerte o con un transportador comestible asimilable, o pueden guardarse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden comprimirse en tabletas, o pueden incorporarse directamente con el alimento de la dieta.

En ciertas circunstancias será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas aquí descritas en forma subcutánea, parenteral, intravenosa, intramuscular o incluso intraperitoneal. Dichos métodos son conocidos para los expertos en la técnica, algunos de los cuales se describen en forma adicional, por ejemplo, en la Patente Norteamericana No. 5,543,158; Patente Norteamericana No. 5,641,515 y Patente Norteamericana No. 5,399,363. En ciertas modalidades, las soluciones de compuestos activos como una base libre o sales farmacológicamente aceptables, pueden prepararse en agua mezclada en forma adecuada con un tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Las dispersiones también pueden prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones generalmente contendrán un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas ilustrativas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles (por ejemplo, ver la Patente Norteamericana No. 5,466,468). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida hasta el punto en que exista la facilidad de proporcionarse con jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe conservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tal como bacterias y hongos.

El transportador puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y/o aceites vegetales. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, a través del uso de un recubrimiento, tal como lecitina, a través del mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y/o a través del uso de tensoactivos. La prevención de la acción de microorganismos puede facilitarse a través de diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede llevarse a cabo a través del uso en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

En una modalidad, para administración parenteral en una solución acuosa, la solución debe ser amortiguada en forma adecuada si es necesario, y el diluyente líquido primero debe hacerse isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares, son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En relación a esto, un medio acuoso estéril que puede ser empleado será conocido para los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación puede ser disuelta en 1 mi de solución NaCI isotónica, y ya sea agregarse a 1000 mi de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en el sitio de infusión propuesto (ver por ejemplo la Publicación de Ciencias Farmacéuticas de Remington, edición quince, páginas 1035 a 1038 y 1570 a 1580). Ocurrirá en forma necesaria cierta variación en la dosificación, dependiendo de la condición del sujeto que esté siendo tratado. Además, para administración humana, las preparaciones por supuesto cumplirán preferentemente con esterilidad, pirogenicidad y estándares generales de seguridad y pureza, tal como lo requieren los estándares de la Oficina de Biología de la FDA (FDA Office of Biologies standards).

En otra modalidad de la presente invención, las composiciones aquí descritas pueden ser formuladas en una forma de sal o neutral. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas incluyen sales de adición de ácido (formadas con los grupos amino libres de la proteína), y las cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácidos hidroclóricos o fosfóricos, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden ser derivadas de bases inorgánicas tales como por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, metilamina, histidina, procaína y similares. Al momento de la formulación, las soluciones serán administradas en una forma compatible con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal, que sea terapéuticamente efectiva.

Los transportadores pueden comprender además cualesquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, amortiguadores, soluciones transportadoras, suspensiones, coloidales, y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticas activas es bien conocido en la técnica. Excepto que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, está contemplado su uso en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos suplementarios en las composiciones. La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción alérgica o no pretendida similar cuando se administran a un humano.

En ciertas modalidades, se utilizan liposomas, nanocápsulas, micropartículas, partículas de lípidos, vesículas y similares para la introducción de las composiciones de la presente invención en organismos/células huésped adecuadas. En particular, las composiciones de la presente invención se pueden formular para suministrarse ya sea en forma encapsulada en una partícula de lípidos, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera o una nanopartícula o similares. Como alternativa, las composiciones de la presente invención pueden ser enlazadas, ya sea en forma covalente o no covalente, a la superficie de dichos vehículos transportadores.

La formación y uso de liposomas y preparaciones tipo liposoma, como transportadores de fármaco potenciales, es generalmente conocida para los expertos en la técnica (ver por ejemplo, las Publicaciones de Lasic, Trends Biotechnol. 16(7):307-21 , 1998; Takakura, Nippon Rinsho 56(3):691 -95, 1998; Chandran y asociados, Indian J. Exp. Biol. 35(8):801-09, 1997; Margalit, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 12(2-3):233-61, 1995; Patente Norteamericana No. 5,567,434; Patente Norteamericana No. 5,552,157; Patente Norteamericana No. 5,565,213; Patente Norteamericana No. 5,738,868 y Patente Norteamericana No. 5,795,587, cada una de las cuales está incorporada en su totalidad específicamente a la presente invención como referencia). El uso de liposomas no parece estar asociado con respuestas autoinmunes o toxicidad inaceptable después del suministro sistémico. En ciertas modalidades, se forman liposomas de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y que forman de manera espontánea vesículas de bicapa concéntrica multilamelar (también llamadas vesículas multilamelares (MLVs)).

Como alternativa, en otras modalidades, la presente invención proporciona formulaciones de nanocápsula farmacéuticamente aceptable de las composiciones de la presente invención. Las nanocápsulas pueden atrapar de manera general compuestos en forma estable y reproducible (ver, por ejemplo, la Publicación de Quintanar-Guerrero y asociados, Drug Dev. Ind. Pharm. 24(12): 1113-28, 1998). Para evitar los efectos secundarios debido a la sobrecarga polimérica intracelular, dichas partículas ultrafinas (con un tamaño de aproximadamente 0.1 um) pueden ser diseñadas utilizando polímeros con la capacidad de ser degradados in vivo. Dichas partículas pueden elaborarse tal como se describe, por ejemplo, en las Publicaciones de Couvreur y asociados, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 5(1): 1-20, 1988; zur Muhlen y asociados, Eur. J. Pharm. Biopharm. 45(2): 149-55, 1998; Zambaux y asociados, J Controlled Reléase 50(1-3): 31 -40, 1998; y en la Patente Norteamericana No. 5,145,684.

Además, las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden colocarse dentro de contenedores, junto con materiales de empaque que proporcionan instrucciones con respecto al uso de dichas composiciones farmacéuticas. De manera general, dichas composiciones incluirán una expresión tangible que describe la concentración de reactivo, así como dentro de ciertas modalidades, cantidades relativas de ingredientes o diluyentes de excipiente (por ejemplo, agua), solución salina o PBS) que pueden ser necesarios para reconstituir la composición farmacéutica.

La dosis administrada fluctuará de 0.01 mg/kg a 200 mg/kg de peso corporal. Las dosificaciones típicas son entre 30 mg/kg y 75 mg/kg. Sin embargo, tal como podrá ser evidente para un experto en la técnica, la cantidad y frecuencia de administración dependerá, por supuesto, de factores tales como la naturaleza y severidad de la indicación que esté siendo tratada, la respuesta deseada, la condición del paciente, etc. Normalmente, las composiciones pueden administrarse a través de una variedad de técnicas, tal como se observó anteriormente.

Método de Tratamiento Utilizando Agentes de Enlace WISE El término "tratamiento" es una intervención llevada a cabo con la intención de prevenir el desarrollo, o alterar la patología de un trastorno. Por consiguiente, el término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los que necesitan de tratamiento, incluyen los que ya tienen el trastorno, así como en los cuales se evitará el trastorno.

El término "mamífero" para propósitos de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo humanos, animales domésticos y de granja, animales de zoológico, de deportes o mascotas, tales como perros, gatos, caballos, vacas, etc. Preferentemente el mamífero es humano.

Tal como se utiliza dentro del contexto de tratar trastornos o enfermedades renales, la frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se entiende que se refiere a una cantidad de anticuerpo WISE terapéutica o profiláctica, que proporciona una reducción en el daño o deterioro renal, o que proporciona una reducción en la severidad o progreso de síntomas asociados con la enfermedad renal, tal como fibrosis y/o proteinuria (es decir, que proporciona "eficacia terapéutica") o conserva o mejora la función renal tal como se mide utilizando el rango de creatinina en suero o de despeje de creatinina. Tal como se utiliza dentro del contexto de tratamiento de fibrosos, la frase "cantidad terapéuticamente efectiva" se entiende que se refiere a una cantidad de anticuerpo WISE terapéutica a profiláctica que proporciona una reducción en los elementos fibroides o sus precursores, y/o que proporciona una reducción en la severidad o progreso de síntomas asociados con enfermedad fibrótica (es decir, que proporciona "eficacia terapéutica"), por ejemplo, enfermedad glomerular proteinúrica.

En una modalidad, las composiciones de la presente invención se contemplan como útiles para tratar, reducir y/o prevenir la disfunción renal incluyendo las seleccionadas del grupo que consiste en enfermedad glomerular proteinúrica, enfermedad renal de etapa terminal, enfermedad renal crónica tal como nefropatía diabética, disfunción de injerto relacionado con trasplante, nefropatía IgA, síndrome de Bartter, síndrome de Gitelman, nefrolitiasis, amiloidosis renal, hipertensión, aldosteronismo primario, enfermedad de Addison; falla renal; glomerulonefritis y glomerulonefritis crónica: nefritis tubulointersticial; trastornos quísticos del riñón y malformaciones displásicas tales como enfermedad poliquística, displasias renales, y quistes corticales o medulares; enfermedades renales poliquísticas hereditarias (PRD), tal como PRD dominante y recesivo y autosomal; enfermedad quística medular; riñon de esponja medular y displasia tubular; síndrome de Alport; cánceres no renales que afectan la fisiología renal, tal como tumores broncogénicos de los pulmones o tumores de la región basal del cerebro; mieloma múltiple; adenocarcinoma de riñón; carcinoma renal metastásico; además, trastornos nefrotóxicos que incluyen cualquier cambio funcional o morfológico en el riñón producidos por cualquier agente farmacéutico químico o biológico que sea ingerido, inyectado, inhalado o absorbido; algunas categorías amplias de agentes nefrotóxicos comunes incluyen pero no se limitan a supresores inmune, tal como inhibidores de calcineurina, metales pesados, todas las clases de antibióticos, analgésicos, solventes, agentes de inducción de oxalosis, fármacos anti-cáncer, herbicidas y pesticidas, botánicos y biológicos, y antiepilépticos.

La frase "actividad de reducción fibrótica" significa que se refiere a la capacidad de inhibir completa o parcialmente, la formación fibroide, o eliminar o reducir la fibrosis existente. Por lo tanto, en una modalidad las composiciones de la presente invención se contemplan como útiles para tratar enfermedades fibróticas, incluyendo fibrosis patológica o cicatrización (incluyendo esclerosis endocardial), fibrosis intersticial idiopática, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis perimuscular, fibrosis de Symmers, fibrosis pericentral, hepatitis, dermatofibroma, cirrosis biliar, cirrosis alcohólica, fibrosis pulmonar aguda, fibrosis pulmonar idiopática, síndrome de dificultad respiratoria aguda, fibrosis de riñón/glomerulonefritis, fibrosis de riñón/nefropatía diabética, escleroderma/sistémica, escleroderma/local, cicatrices queloides, hipertróficas, artritis/adhesiones en las articulaciones severas, mielofibrosis, cicatrización de la córnea, fibrosis quística, distrofia muscular (de Duchenne), fibrosis cardiaca, separación retinal/fibrosis muscular, enfermedad de constricción esofageal. Los trastornos fibróticos adicionales pueden ser inducidos o iniciados mediante cirugía, incluyendo revisión de cicatriz/cirugías plásticas, glaucoma, fibrosis de cataratas, cicatrización de córnea, adhesiones en las articulaciones, enfermedad de injerto versus receptor (por ejemplo en pacientes de trasplante), cirugía de tendón, atrapamiento de nervios, contractura de Dupuytren, OB/adhesiones GYN/fibrosis, adhesiones pélvicas, fibrosis peridurales, restenosis. También se contempla que las condiciones fibróticas cuando la deposición de proteínas de matriz extracelular múltiples, incluyendo pero sin limitarse a colágeno, y/o fibronectina, son un factor causante, pueden ser tratadas de acuerdo con la presente invención. La fibrosis pulmonar idiopática, pulmón de bleomicina, fibrosis quística, y nefropatía glomerular, incluyendo enfermedad caracterizada por, por ejemplo, depósitos de colágeno/fibronectina en los ríñones, que finalmente conducen a falla renal, son ejemplos de condiciones que también pueden ser tratados de acuerdo con la presente invención.

La presente invención también contempla un anticuerpo que tiene una afinidad menor a 1 x 10"7 M para WISE e inhibe la actividad WISE para utilizarse en un método para tratar una condición médica asociada en fibrosis, en donde la fibrosis puede estar asociada con una enfermedad descrita anteriormente, incluyendo enfermedad de pulmón y enfermedad de riñón. Además, también se contempla un anticuerpo que tiene una afinidad menor a 1 x 10"7 M para WISE e inhibe la actividad WISE adecuada para utilizarse en un método para tratar una condición médica asociada con proteinuria.

La presente invención también proporciona terapias de combinación, en donde las composiciones de la presente invención se administran a un paciente que necesita de las mismas, con agentes terapéuticos adicionales que ya sea tratan la enfermedad subyacente, o reducen los síntomas asociados con la enfermedad que está siendo tratada. Estas terapias adicionales pueden ser administradas en forma simultánea, antes o después de la administración de la composición de la presente invención. Las terapias adicionales para utilizarse en combinación con las composiciones de la presente invención, incluyen inhibidores ACE, bloqueo de receptor de angiotensina (ARB), eritropoyetina (por ejemplo, Aranesp® (darbepoyetina), Epogen® (eritropoyetina alfa), inhibidores de calcineurina, esteroides, bloqueadores beta y similares.

La presente invención también proporciona un equipo de diagnóstico que comprende al menos un agente de enlace anti-WISE de acuerdo con la presente invención. El agente de enlace puede ser un anticuerpo. Además, dicho equipo puede comprender opcionalmente uno o más de los siguientes: (1) instrucciones para utilizar el uno o más agentes de enlace, para clasificación, diagnóstico, pronóstico, monitoreo terapéutico o cualquier combinación de estas aplicaciones; (2) una parte de enlace etiquetada a los agentes de enlace anti-WISE; (3) una fase sólida tal como (tal como una tira de reactivo) en la cual se inmoviliza el agente(s) de enlace anti-WISE; y (4) una etiqueta o inserto que indica la aprobación reguladora para clasificación, diagnóstico, pronóstico o uso terapéutico o cualquier combinación de los mismos. Si no se proporciona una parte de enlace etiquetada al agente(s) de enlace, el propio agente(s) puede ser etiquetado con uno o más de un marcador (detectable), por ejemplo, una porción quimioluminiscente enzimática fluorescente o radioactiva.

Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración, y no pretenden ser limitantes.

EJEMPLOS Preparación de Construcción de Wise y Mutante de Lazo-2 Wise Se amplificó hWise a través de cebadores PCR, procedentes de un clon de ADN que contiene el cADN para hWise (NM 015464). Se digirió el vector de expresión, así como el producto PCR de aproximadamente 641 pares base PCR con enzimas de restricción Xbal y Notl. Los fragmentos adecuados fueron ligados para producir el vector de expresión hWise.

A continuación se describe el reemplazo del lazo 2 de WISE humana con lazo 2hSost. Clonación de la proteína quimérica de lazo 2 h Wise-hSost: se generó una mutación por sustitución a través de una combinación de extensión de cebador y PCR de traslape. El mutante quimérico de lazo 2 tiene 75 pb de lazo 2 de hWise sustituido con 63pb de lazo 2 de hSost. Específicamente, utilizando hWise como una plantilla, se amplificó el N-término de hWise con cebadores y se extendió. El C-término de hWise, fue amplificado con cebadores y extensores. Se utilizaron los fragmentos N-terminal y C-terminal como plantillas en una reacción PCR de traslape. El producto PCR se digirió con enzimas de restricción Xbal y Notl y se subclonó en un vector de expresión de mamífero.

Expresión y Purificación de WISE de Ratón y Humano en Células de Mamífero Se inoculó un frasco de cultivo de reserva en 10 mi de medio de cultivo en un Frasco de Agitación (125 mi, Plástico), el cultivo se continuó durante 2 a 3 días; posteriormente el cultivo se expandió de un frasco de agitación 10 mL a 100 mL, y nuevamente de un cultivo con volumen de 100 mi a 500 mi. Para transfección, las células se sembraron en un medio de cultivo de 1 litro y se crecieron hasta la densidad celular adecuada.

Se preparó la mezcla de transfección, las células fueron transfectadas utilizando técnicas estándar y post-transfección de 24 horas, y se agregó alimento a las células. El cultivo se continuó posteriormente durante otras 48 horas y el medio acondicionado se recolectó, girando a 4000 rpm durante 30 minutos y posteriormente filtrando a través de un filtro 0.2 uM. Se tomó posteriormente una pequeña muestra (1 mi) para análisis de manchado western, y el resto se congeló para purificación. Se centrifugó el fluido de cultivo de célula huésped (CCF) para eliminar los residuos celulares. Posteriormente se filtró el sobrenadante CCF.

Se cargó una columna de heparina con proteína, posteriormente se lavó con PBS hasta una absorbancia en 280 nm del flujo que se regresó a la línea de base. Posteriormente se eluyó la proteína WISE de la columna, utilizando un gradiente lineal de 150 mM a 2 M de cloruro de sodio en PBS, y se recolectaron las fracciones. Posteriormente las fracciones se ensayaron mediante SDS-PAGE manchado Coomassie para identificar fracciones que contienen un polipéptido que emigra en el tamaño anticipado de WISE. Se combinaron las fracciones adecuadas de las columnas para elaborar el pozo de Heparina.

La proteína WISE eluida de la columna de Heparina, fue purificada en forma adicional mediante cromatografía de fase inversa. El pozo de heparina fue elaborado del 22% de etanol y se ajustó a un pH 5.0 con ácido acético. El pozo fue filtrado. Posteriormente el pozo de heparina filtrado fue cargado en una columna de equilibrio. Después de la carga, la columna se lavó hasta una absorbancia en 280 nm del flujo que regresó a la línea de base. Posteriormente se eluyó la proteína WISE de la columna.

Después de la purificación, se formuló la WISE en PBS mediante diálisis. Después de la formulación, se filtró WISE a través de un filtrado de 0.2 pm estéril y se almacenó a una temperatura de 4°C o se congeló.

Modificación de Antígeno e Inmunizaciones Se emulsificó la proteína WISE humana de fuentes de mamífero en una proporción de 1:1 utilizando ya sea Adyuvante de Freund Completo de (Pierce) o RIBI (Sigma), posteriormente se inmunizó en forma subcutánea e intraperitoneal en ratones de eliminación WISE. La inmunización ocurrió al menos cada 2 semanas y se tomó el antisuero de los ratones después de las 3o inmunizaciones para el análisis de titulador anti-WISE.

Fusiones Durante cuatro días antes de la fusión, cada ratón fue reforzado en forma intraperitoneal con proteínas Hu WISE en PBS. El día de la fusión, se eliminaron los bazos en forma aséptica y los órganos se procesaron en una suspensión de célula simple. Se Usaron los glóbulos rojos y se lavaron los esplenocitos con RPMI (Gibco). Se mezclaron células de mieloma de crecimiento de fase-log viables, con esplenocitos de múrido en una proporción de 1:2.5 de mieloma.esplenocitos. Posteriormente las células se lavaron 2 veces en Medio del Citofusión C (Cytopulse Sciences Inc). Después del lavado, las células fueron suspendidas en un Medio de Citofusión C al 33% y 67% de amortiguador de fusión hipo-osmolar derivado en forma local en una densidad final de 1e7 células/ml. Esta mezcla se cargó en cámaras de fusión BTX de 2 mi (Harvard Apparatus), posteriormente se sometió a condiciones de electro fusión a partir de un BTX ECM 2001 (Harvard Apparatus).

Las suspensiones celulares fueron eliminadas de las cámaras y suspendidas en un medio de crecimiento celular. Se revistieron 20 µ? por depósito de esta suspensión celular en placas de cultivo celular de 384 depósitos y (Greiner) se incubó durante la noche a una temperatura de 7°C, en un incubador C02 al 10% humidificado. Al día siguiente, se agregaron a cada uno de los depósitos de las placas 20 µ? del medio de crecimiento mencionado anteriormente que contiene 2X HAT (Sigma). Los cultivos se incubaron durante 7 días, posteriormente se aspiró el medio de crecimiento de los depósitos y se intercambio por medio de crecimiento fresco. La clasificación de los sobrenadantes de hibridoma comenzó 2 a 3 días después del cambio del medio.

Clasificación Se recubrieron 384 placas de depósito de poliestireno claro de enlace de alto nivel (Corning) con 25 µ?/depósito de una solución 1 ug/ml que consiste en IgG anti-mu de cabra, pAb específico Fe (Pierce) en PBS. Las placas se incubaron durante la noche con una solución de recubrimiento durante una temperatura de 4°C, posteriormente se lavaron una vez en un lavador de placa automático utilizando PBS +.05% Tween 20 (Sigma). Se agregaron 50 µ? de la solución de bloqueo a cada depósito y se incubó durante la noche a una temperatura de 4°C.

Se transfirieron cinco µ? de sobrenadante de hibridoma a cada depósito de la placa ELISA, y se dejaron incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las placas se lavaron posteriormente 2 veces utilizando el método descrito anteriormente. Posteriormente se agregaron a cada depósito de la placa 20 µ?/depósito de una solución de 10 ng/ml de proteína WISE humana diluida en solución de bloqueo. Después de la adición del antígeno WISE, las placas ELISA se dejaron incubar durante 60 minutos a temperatura ambiente, posteriormente se lavaron. Posteriormente, se agregaron a cada depósito, 20 ul por depósito de una solución de Pab de conejo-anti-WISE-HRP (Amgen) diluido en una solución de bloqueo, y se incubó durante 60 minutos y se lavaron las placas 4x.

Finalmente, se agregaron 20 µ?/depósito de TMB (Pierce) a cada depósito, y las placas se leyeron en un lector de placa Spectramax Píate (Molecular Devices) en 650 nM. Las células de los depósitos de hibridoma positivos ELISA, se expandieron en forma subcutánea en un cultivo celular para estudios de caracterización adicional.

Purificación de IgGs de Alto Rendimiento Se transfirieron a placas de 96 depósitos, clones de hibridoma positivos ELISA identificados durante la clasificación primaria, utilizando una plataforma de transferencia de líquidos automática (Bravo) y se dejaron crecer durante 3 a 5 días en un incubador de C02 al 5% humidificado a una temperatura de 37°C. Una vez que se alcanzó la masa celular adecuada, cada placa se duplicó en 8 placas (96 depósitos) transfiriendo 20 ul del sobrenadante de la placa original. El volumen final de cada placa fue de 200 ul. Las placas se incubaron durante 7 días en un incubador de C02 al 5% humidificado a una temperatura de 37°C. Posteriormente se recolectaron los sobrenadantes de hibridoma en un bloque de ensayo de polipropileno (2 mi, Costar 3961) y se centrifugaron en 3500G durante 30 minutos. El sobrenadante despejado desprovisto de residuos celulares, fue transferido a nuevos bloques de ensayo, y se incubó con 70 ul por depósito de Proteína G Más Agarosa (Calbiochem, Cat # IP08) durante la noche a temperatura ambiente en el agitador. Posteriormente se utilizó un robot de manejo de líquidos automático, que utiliza un software acostumbrado y un sistema de múltiple de vacío, para aislar y aclarar la resina de Proteína G que contiene el IgG enlazado. El IgG enlazado posteriormente fue eluido utilizando condiciones de neutralización y elución de pH bajo estándares. Se cuantificó el IgG purificado resultante mediante absorbancia A280.

Análisis de Enlace para Identificar Enlazadores de Lazo-2 Se recolectaron sobrenadantes de hibridoma anti-WISE y se agregaron en las placas ELISA de alto nivel, cubiertas previamente con 1 ug/ml de IgG Fe anti-ratón de cabra (Pierce). Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente las placas fueron lavadas 4X con Amortiguador de Lavado. En forma subsecuente, se agregó proteína quimérica huWISE o WISE-hSost-lazo 2 humana en una concentración final de 2 ng/ml y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavado 4X, el Pab-biotina anti-WISE de conejo (50 ng/ml) + NeutrAvidin-HRP (Pierce) se agregaron en las placas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron nuevamente 4X con Amortiguador de Lavado. Se analizó el enlace utilizando un substrato 1-Step Ultra TMB-ELISA (Pierce) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Identificación de Neutralización en Ensayo a Base de Células MC3T3-E1/STF-LUC Se utilizaron células reporteras MC3T3-E1 SuperTopFlash (STF) para determinar si la proteína WISE puede modular la señalización Wnt. La activación de señalización de activación dependiente de TCF en células MC3T3-E1 /STF-luc, puede activarse utilizando ya sea señalización Wnt endógena inducida cambiando el medio de cultivo al medio de diferenciación, o agregando Wnt exógena, tal como proteína Wnt3a. La proteína WISE recombinante puede inhibir en forma dependiente de la dosis de señalización Wnt en células MC3T3-E 1 /STF-luc.

Se revistió un frasco de células MC3T3-E1 /STF-luc en un frasco de cultivo en medio de expresión. Cuando las células alcanzan una confluencia del 90 a 95%, se tripsinizan, y las células en el medio de expansión de revisten 10K por depósito en una placa de prueba de 96 depósitos. Al siguiente día, se elimina todo el medio de expansión y reemplaza con 100 ul del medio de diferenciación preparado recientemente. Se reemplazó el 50% del medio de diferenciación con un medio de diferenciación preparado recientemente cada día durante los siguientes cada 4 días. Después de 5 días de diferenciación, todo el medio se reemplazó con muestras de prueba en el medio de diferenciación fresco en un volumen de 100 ul. Se pre-incubó la proteína WISE y el mAb WISE durante 1 hora a una temperatura de 37°C antes de agregarse al depósito de prueba. Posteriormente las placas se dejaron incubar durante 24 horas antes de que se midiera la señal de luciferasa. La señal de luciferasa se mide utilizando el Sistema de Ensayo de Luciferasa de Promega. Se elimina cuidadosamente el medio de las placas de prueba, se enjuagan las células con PBS y se realiza la adición de 20 ul de amortiguador de lisis 1X que ha sido equilibrado a temperatura ambiente. La placa se sella y se mueve durante 30 minutos a temperatura ambiente y se agregan a cada depósito 100 ul del substrato de ensayo de luciferasa, y la señal se captura utilizando un Luminometer (LMAX) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Expresión y Purificación de Hibridoma de Lazo 2 CM Se aislaron células simples de los depósitos de hibridoma positivos ELISA, utilizando clasificación FACS y se colocaron en placas de 96 depósitos con 80 ul de medio BDR [50ml de Factor de Clonación de Hibridoma (BioVeris), 1X OPI de suplemento de medio (Sigma), 55 uM 2-ME (Gibco), 10% de IgG bajo nivel FBS (Gibco), 1X PSG (Gibco), Medio de Rendimiento de Quantum BD (BD Bioscience)] por depósito. Estas células se dejaron crecer hasta que se alcanzó la masa celular adecuada. Posteriormente las células se expanden en forma adicional en placas de 24 depósitos con 1 mi de un medio BDR por depósito. Una vez que las placas de 24 depósitos fueron confluentes, las células se transfirieron en placas de 6 depósitos con 5 mi de un medio BDR por depósito. Después de 5 días de incubación, la mitad de las células se congeló en una mezcla de FBS (IgG Ultra bajo) + 10% DMSO para soporte. La otra mitad se transfirió en un frasco de T-175 con 40 mi de medio BDR y se dejo expandir. Una vez que los frascos T-175 fueron confluentes, se recolectaron los sobrenadantes, se filtraron (.45 um filtro CA) y se purificaron.

Purificación de mAbs WISE de Cultivo de Célula de Hibridoma para Estudios In Vitro Se purificaron anticuerpos monoclonales WISE (mAbs) a partir de cultivo de célula de hibridoma como se indica a continuación. Se llevaron a cabo todos los procesos de purificación a temperatura ambiente o 4°C. Se utilizó un esquema de purificación para purificar los diversos mAbs, y se utilizó cromatografía por afinidad.

Cromatografía de Proteína G Se centrifugó el fluido de cultivo de célula huésped (CCF) en un centrifugador Beckman Coulter Allegra X-12R en 1500 rpm durante 5 minutos a una temperatura de 10°C, para eliminar los residuos celulares. Posteriormente el sobrenadante de CCF fue filtrado a través de un filtro 0.45 pm estéril. En este punto, el CCF filtrado estéril fue almacenado congelado hasta la purificación. Si estaba congelado, el CCF fue descongelado a una temperatura de 40°C. Después de descongelar el CCF, se filtró a través de un filtro de 0.45 pm estéril, y posteriormente se cargó en un medio de cromatografía de Proteína G en la forma de una columna, de Alto Desempeño de Proteína G (GE Healtcare, antes Amersham Biosciences), equilibrada en PBS a temperatura ambiente.

Después de cargar la columna de Proteína G, se lavó con PBS hasta que la absorbancia en 280 nm del flujo regresó a la línea de base. Posteriormente se eluyó el mAb WISE de la columna utilizando 0.1 M de Acetato, de pH 3 e inmediatamente se neutralizó agregando 65 µ?_ de una solución de reserva de 1 de Tris Base por ml_ de volumen de elución. La absorbancia en 280 nm del eluato se monitoreó y las fracciones que contienen la proteína se recolectaron para elaborar el pozo de Proteína G.

Formulación y Concentración Se llevaron a cabo los pasos de formulación y concentración a una temperatura de 4°C. Después de la purificación, se formularon mAbs WISE en A5Su (acetato de sodio 10 mM, 9% de sacarosa, pH 5) mediante diálisis utilizando membranas 10,000 MWCO (Pierce Slide-A-Lyzer). Si fue necesaria la concentración de mAbs WISE, se utilizó un dispositivo de centrifugación (Vivascience Vivaspin) con una membrana 10,000 MWCO. Como alternativa, el pozo de Proteína G fue intercambiado por amortiguador en A5Su y se concentró utilizando el dispositivo de centrifugación sólo. Después de la formulación, los mAbs WISE se filtraron a través de un filtro 0.2 pm estéril y se almacenaron a una temperatura de 40°C o se congelaron.

WISE Enlaza a LRP6 y el Enlace puede ser Bloqueado Neutralizando el Anticuerpo de Lazo 2 Anti-Wise El enlace de WISE a LRP6 de receptor putativo, fue caracterizado utilizando tecnología AlphaScreen. A continuación se describen los procedimientos detallados del ensayo: Se preparó un amortiguador 1x diariamente en forma fresca siguiendo las instrucciones proporcionadas con el equipo de Detección (PerkinElmer) de Histidina AlphaScreen (Nickel Chelate).

Se diluyó la solución de trabajo de la huWise biotinilada, huWise-huSost-lazo 2 biotinilado, rml_RP6-His6 (R&D Systems), y anticuerpos lazo 2 anti-Wise con amortiguador 1 x a 3 veces de la concentración final deseada para cada proteína y reacción de anticuerpo.

Se suministraron cinco microlitros de cada uno de Wise o Wise-huSost-lazo 2 y solución de trabajo LRP6 en depósitos adecuados en una microplaca OptiPlate-384 opaca (PerkinElmer). Después de que Wise y LRP6 se hacen reaccionar a temperatura ambiente durante 1 hora con agitación suave, se agregan a los depósitos adecuados, 5 ul de cada una de las series de solución de trabajo de anticuerpo diluido, se deja continuar la reacción. Se prepararon la dilución en serie de His6-b¡otinilado (control positivo, proporcionado con el Equipo) y la solución de trabajo de gránulos donadores de estreptavidina y aceptores de quelato de níquel (proporcionados con el Equipo) de acuerdo con la misma instrucción. Después de la competición del anticuerpo con LRP6 para enlace Wise durante 60 minutos, se suministraron 15 ul de cada solución His6 biotinilada diluida en serie en los depósitos vacíos en la placa. Finalmente se suministraron 5 ul de cada una de las soluciones de trabajo de los gránulos aceptores donadores en todos los depósitos de muestra y control, se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante 1 hora más y se analizaron en un analizador de microplaca.

Construcción Mutantes Ala de Lazo 2 hWise La mutagénesis de escaneo de alanina ha sido exitosa en el mapeo en forma sistemática de los epítopes de enlace funcional. La forma de longitud total de WISE es de 206 aminoácidos, y la forma madura de hWISE es una glucoproteína de 183 aminoácidos que contiene un motivo de botón de cistina y tres lazos designados como Lazo 1, Lazo 2 y Lazo-3. El lazo 1 está en aproximadamente los aminoácidos y el lazo 3 está en el Lazo 2 en aproximadamente los aminoácidos de 105 a 132 de la WISE humana de longitud total, y los aminoácidos 82 a 109 de la forma madura de WISE humana. Se cambiaron a alaninas un total de 23 residuos de aminoácidos identificados de la posición 107 a 129 en el lazo 2 hWISE.

Se generaron genes de lazo 2 hWISE de escaneo de alanina mediante mutagénesis dirigida al sitio utilizando cebadores de oligodesoxinucleótido de 24 a 30 nucleótidos de longitud, y ADN de plásmido de hWISE tipo natural como plantilla. Las reacciones se llevaron a cabo como se describe en el Equipo de Mutagénesis Dirigido al Sitio QuikChange (QuikChange Site-Directed Mutagénesis Kit) (Stragagene). Cada mutante fue creado directamente en un vector de expresión de mamífero. Las construcciones mutantes de alanina se confirmaron mediante secuencia y se transfectaron en células huésped de mamífero para la producción temporal de proteínas mutantes. La mutación de aminoácido simple no tiene efecto en la expresión de proteína.

Las sustituciones de alanina representativa se describen a continuación con el cambio de aminoácido: Leucina a alanina en el aminoácido 107 de Sec Id No.: 2.

Prolina a alanina en el aminoácido 108 de Sec Id No.: 2.

Valina a alanina en el aminoácido 109 de Sec Id No.: 2.

Leucina a alanina en el aminoácido 110 de Sec Id No.: 2.

Prolina a alanina en el aminoácido 111 de Sec Id No.: 2.

Asparagina a alanina en el aminoácido 112 de Sec Id No.: 2.

Triptofan a alanina en el aminoácido 113 de Sec Id No.: 2. Isoleucina a alanina en el aminoácido 114 de Sec Id No.: 2.

Glicina a alanina en el aminoácido 115 de Sec Id No.: 2.

Glicina a alanina en el aminoácido 116 de Sec Id No.: 2. Glicina a alanina en el aminoácido 117 de Sec Id No.: 2. Tirosina a alanina en el aminoácido 118 de Sec Id No.: 2. Glicina a alanina en el aminoácido 119 de Sec Id No.: 2. Treonina a alanina en el aminoácido 120 de Sec Id No.: 2. Lisina a alanina en el aminoácido 121 de Sec Id No.: 2. Tirosina a alanina en el aminoácido 122 de Sec Id No.: 2. Triptofan a alanina en el aminoácido 123 de Sec Id No.: 2. Serina a alanina en el aminoácido 124 de Sec Id No.: 2. Arginina a alanina en el aminoácido 125 de Sec Id No.: 2. Arginina a alanina en el aminoácido 126 de Sec Id No.: 2. Serina a alanina en el aminoácido 127 de Sec Id No.: 2. Serina a alanina en el aminoácido 128 de Sec Id No.: 2. Glutamina a alanina en el aminoácido 128 de Sec Id No.: 2.

Mapeo de Epítope de Enlazadores Lazo 2 Y Residuos Críticos para el Enlace Se llevó a cabo mutagénesis de escaneo de alanina en la región de lazo 2 hWISE y se generaron un total de 23 mutantes y se ensayaron in vitro para enlace de anticuerpo para características funcionales y de enlace a anticuerpo.

Se comparó la captura relativa de las proteínas mutantes WISE individuales o proteínas tipo natural, ya sea mediante anticuerpos de neutralización o anticuerpos de no neutralización, para evaluar si cualesquiera estos cambios de aminoácido simple afecta el enlace de un anticuerpo a la proteína WISE. Las proteínas WISE enlazadas se detectaron posteriormente utilizando anticuerpo policlonal purificado mediante afinidad conjugada mediante HRP contra WISE.

Se agregaron anticuerpos anti-WISE purificados (0.5 ug/ml) en placas ELISA de enlace de alto nivel cubiertas previamente con 1 ug/ml de IgG Fe anti-ratón de cabra (Pierce). Las placas fueron incubadas durante 1 hora a temperatura ambiente. Posteriormente las placas se lavaron 4X con Amortiguador de Lavado. En forma subsecuente, se agregaron los sobrenadantes de muíante de lazo 2 WISE escaneados con alanina procedentes de cultivo de transfección temporal (diluidos 100X), y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavado 4X, se agregó Pab-biotina anti-WISE de conejo (50 ng/ml) + NeutrAvidin-H RP (Pierce, Cat # 31001) en las placas y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron nuevamente 4X con Amortiguador de Lavado. El enlace se analizó utilizando un substrato Ultra TMB-ELISA de 1 Paso (Pierce; Cat # 34028) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se aplicó un panel de anticuerpos de enlace de lazo 2 a los mutantes de alanina, y se identificaron ciertos aminoácidos como importantes para enlace a través de estos anticuerpos. Estos aminoácidos incluyen uno o más aminoácidos seleccionados de un grupo que consiste en una asparagina en el residuo de aminoácido 112 de la SEC ID NO: 2, una isoleucina en el residuo de aminoácido 114 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el residuo de aminoácido 115 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el residuo de aminoácido 117 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el residuo de aminoácido 119 de la SEC ID NO: 2, una lisina en el residuo de aminoácido 121 de la SEC ID NO: 2, un triptofan en el residuo de aminoácido 123 de la SEC ID NO: 2, una arginina en el residuo de aminoácido 126 de la SEC ID NO: 2, o una glutamina en el residuo de aminoácido 129 de la SEC ID NO: 2.

Estos datos proporcionan ejemplos de mutación únicamente con uno de los residuos mencionados anteriormente, que reducen en forma significativa el enlace de los anticuerpos WISE a la proteína WISE. Es concebible que puede ser importante una combinación del residuo antes mencionado para un enlace óptimo de cierto anticuerpo de enlace de lazo 2. Sin embargo un residuo simple puede ser suficiente para conferir el enlace de un anticuerpo a un lazo 2 de WISE.

Clonación de las Cadenas Pesadas y Ligeras del Anticuerpo Anti-huWISE de Múrido Las secuencias de las regiones variables de cadena pesada y cadena ligera WISE anti-humano de múrido, fueron obtenidas mediante una técnica de amplificación de reacción de cadena de polimerasa (PCR) conocida como 5' RACE (amplificación rápida de extremos cADN). Se aisló un ARN total de seis hibridomas de múrido que expresan anticuerpos monoclonales de enlace WISE humanos, Ab-AA, Ab-AB, Ab-AC, Ab-AD, Ab-AE, y Ab-AF, utilizando el reactivo TRIzol (Invitrogen) seguido de purificación adicional utilizando el ini Equipo RNeasy (Qiagen). Se prepararon cADNs listos para RACE, de primera hebra imprimados con Oligo-dT utilizando el Equipo GeneRacer (Invitrogen). Se llevaron a cabo amplificaciones PCR de los cADNs con polimerasa de ADN Phusion HF (Finnzymes). Se clonaron los productos PCR RACE en pCR4-TOPO (Invitrogen) y sus secuencias se determinaron utilizando instrumentos de secuenciación de ADN ABI (Perkin Elmer). Se determinaron las secuencias de consenso utilizando el software Vector NTI Advance 10 (Invitrogen).

Humanización de Anticuerpos Anti-WISE Humanos de Múrido Se humanizó Ab-AB utilizando v1 de cadena ligera con injerto CDR recto en una estructura aceptora VK1|018. Se humanizó Ab Ab-AB utilizando el v1 la cadena pesada con injerto CDR, con residuos de múrido en A24T, R71A y A93T en la estructura aceptora VH1|1-46. También se humanizó Ab-AB utilizando el v2 de cadena ligera con mutaciones inversas F71Y y Y87F. Se humanizó Ab-AB utilizando el v2 de cadena pesada con v1 con V2I, VTM 67, 68, 69 a AKL y V78A adicional (Sec Id Nos.: 114 y 116 y Sec Id Nos.: 118 y 120 respectivamente).

Se humanizó Ab-AI utilizando el v1 de cadena ligera con el injerto CDR recto en la estructura VK4|B3 aceptora. Se humanizó Ab-AI utilizando el v1 de cadena pesada con mutación inversa S30T. También se introdujeron las mutaciones inversas como Ab-AI, también se humanizaron utilizando el v2 de cadena ligera con la mutación inversa Y49S (Kabat). Se humanizó Ab-AI utilizando el v2 de cadena pesada con el injerto CDR recto en la estructura aceptora VH2|2-70 (Sec Id Nos.: 122 y 124 y Sec Id Nos.: 126 y 128).

Se humanizó Ab-AJ utilizando la cadena ligera con el injerto CDR recto en la estructura aceptora VK4|B3. Se humanizó Ab-AJ utilizando el injerto CDR de cadena pesada en la estructura aceptora VH1|1-46 con residuos de múrido mantenidos en su lugar en las posiciones de Kabat 27, 28, 29, 30, 71, 93, 94 (Y27F, T28N, F29I, T30K, R71A, A93N, R94F) (Sec Id Nos.: 110 y 112).

Las cadenas ligeras y pesadas humanizadas de los anticuerpos anteriores también fueron intercambiables y se ilustran como pares de cadena pesada y ligera mostradas en las Sec Id Nos.: 110 y 112 (hz Ab-AJ), Sec Id Nos.: 114 y 116 (hz Ab-AB v1; LC1 y HC1, respectivamente), Sec Id Nos.: 118 y 116 (hz Ab-AB v2; LC2 y HC1, respectivamente), Sec Id Nos.: 114 y 120 (hz Ab-AB v3; LC1 y HC2, respectivamente), Sec Id Nos.: 118 y 120 (hz Ab-AB v4; LC2 y HC2, respectivamente), Sec Id Nos.: 122 y 124 (hz Ab-AI v1; LC1 y HC1, respectivamente), Sec Id Nos.: 126 y 124 (hz Ab-AI v2; LC2 y HC1, respectivamente), Sec Id Nos.: 122 y 128 (hz Ab-AI v3; LC1 y HC2, respectivamente), y Sec Id Nos.: 126 y 128 (hz Ab-AI v4; LC2 y HC2, respectivamente) que se encuentran más adelante en la tabla 4 con secuencias de ácido nucleico correspondientes.

El ensayo de reportero MC3T3 utilizando anticuerpos humanizados para WISE se muestra en la figura 29. Se incorpora Ab-R como referencia de la Solicitud de Patente Internacional WO2009/070243. Expresión MC3T3E1 -STF de mabs lazo 2 de WISE humanizado: Todos los datos se presentan como el % total de la señal de luciferasa normalizada contra el control. Se incubaron los Mabs de 300 ng/ml huWISE. Se analizaron las expresiones de gen reportero 24 horas posteriores a la incubación utilizando sustrato luminiscente (Luciferase Assay System, Promega E4530) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Aislamiento de D14 a partir de la biblioteca de fago Fab-310 Se lavó con batea la biblioteca de fago Fab-310 (Dyax Corp) contra WISE humana recombinante biotinilada en 5 ug/ml, 0.5 ug/ml y 0.025 ug/ml envueltas subsecuentes. Se aisló D14 del pozo de lavado de la Vuelta 3 durante la noche. Se aislaron 53 fagos Fab únicos incluyendo D14 enlazado a huWISE, y se convirtieron a lgG2. Estas moléculas lgG2 se probaron en un ensayo funcional MC3T3-E1. D14 mostró la mejor actividad inhibidora contra huWISE.

Maduración por afinidad de D14 lgG2 Se llevó a cabo la maduración por afinidad en D14 lgG2 con el objeto de mejorar la actividad inhibidora. Cada residuo en todas las CDRs de la cadena pesada (31 posiciones) y cadena ligera (29 posiciones) fue mutado mediante mutagénesis aleatorizada. Se identificaron siete mutaciones de cadena pesada en 5 posiciones, y diez mutaciones en cadena ligera en 6 posiciones que mejoran el enlace a WISE humana, mediante medidas de afinidad en Octet QK (ForteBio) utilizando muestras de un medio de condición crudo y biosensores de estreptavidina recubiertos con WISE humana biotinilada. L34, L36, H66 y H127 fueron cuatro mutantes de residuo simple superiores. Se emparejaron la mutación de cadena pesada y mutación de cadena ligera benéficas en la matriz mediante transfección temporal en 293 células 6E para producir mutantes dobles mejorados en forma adicional (DM, una mutación en la cadena pesada y una en la cadena ligera). Se seleccionaron diez mutantes DM. Se combinaron las dos mejores mutaciones de cadena pesada (H66 y H127) mediante PCR de traslape. La cadena pesada resultante con mutaciones dobles, fue emparejada con L34 o L36 para producir dos mutantes triples (TM1 y TM2).

Tratamiento de anticuerpo WISE en el Progreso de Disfunción Renal Asociada con Nefropatía Diabética Se desarrolló el modelo de rata T2DN combinando los genomas de ratas GK que desarrollan diabetes tipo 2, pero no enfermedad renal progresiva, y ratas FHH que desarrollan enfermedad renal progresiva pero no diabetes tipo 2. Después de la diabetes de generación temprana, se desarrolla una proteinuria aparente en ratas T2DN a los ~6 meses de edad, y el grado de proteinuria se vuelve progresivamente más severos conforme envejecen las ratas. Esto está acompañado por hipertrofia del glomérulo, engrosamiento de las membranas de base glomerulares y tubulares, la expansión de la matriz mesangial, y el desarrollo de focal seguido de glomeruloesclerosis global difusa y la formación de nodulos glomerulares a los 18 meses de edad.

El efecto del anticuerpo WISE en el progreso de disfunción renal en este modelo fue probado en ratas de 12 meses de edad cuando se habían establecido lesiones glomerulares significativas, incluyendo hipertrofia glomerular glomeruloesclerosis segmental focal, con adhesión regional de la sutura glomerular a la cápsula de Bowman asociada con expresión de la matriz mesangial y llenado de los capilares. A los 12 meses de edad, los glomérulos en ratas T2DN también exhibieron expansión de la matriz mesangial y la aparición de material positivo-Schiff con ácido periódico (referencia Diabetes 53: 735-742). Para acelerar el progreso de la enfermedad, las ratas pasaron por uninefrectomía (riñon izquierdo, que sirvió como línea de base para histología).

Se midió el nivel de proteinuria en cada rata individual dos semanas posteriores a la cirugía, y justo antes de que iniciara el tratamiento, y se utilizaron para aleatorizar los animales en cuatro grupos: 1) grupo naive, sin tratamiento, n = 10 2) Lisinopril (diariamente 20 mg/kg en el agua para beber, n = 12 y sirvió como control positivo para disminuir proteinuria; 3) control cotejado por isotipo lgG1 (20 mg/kg, inyección IP, tres veces a la semana en amortiguador de dilución de anticuerpo, n=12); 4) anticuerpo WISE (20 mg/kg, inyección IP, tres veces a la semana en amortiguación de dilución de anticuerpo, n = 12). Se recolectaron las muestras de orina en la línea de base cada dos semanas en jaulas metabólicas y se alicuotaron antes de las pruebas o congelación. Se recolectaron las muestras de suero en la línea de base, 8 semanas posteriores al tratamiento, 14 semanas posteriores al tratamiento y la necropsia terminal a las 16 semanas posteriores al tratamiento. En la necropsia, el riñon derecho se procesó para histología (mitad, H&E, Masson Trichrome) y proteína / ARN (la otra mitad). Se evaluó el impacto en la proteinuria, fibrosis glomerular é intersticial, así como la función renal.

El tratamiento con el anticuerpo WISE relativo al tratamiento con el control IgG, inhibió en forma significativa el progreso de lesiones tanto glomerulares como intersticiales; y las ratas recibieron anticuerpo WISE conservado e incrementó la función renal (4%) en forma relativa al nivel observado en la línea de base, en tanto que las ratas del grupo naive o del grupo tratado con IgG de control tuvieron 27 y 23% de disminución en la función renal (rango de despeje de creatinina estimado) en forma relativa al nivel de línea de base, respectivamente. Por lo tanto se espera que el anticuerpo WISE tenga aplicaciones terapéuticas para reducir lesiones renales y conservar o mejorar la función renal en enfermedades tipo nefropatía diabética, en donde la disfunción renal es originada por diabetes, hipertensión o una combinación de ambos; y enfermedades en las cuales las lesiones renales son originadas por proteinuria pesada; así como enfermedades en las cuales la fibrosis novo o fibrosis en curso conduce a disfunción de injerto o renal progresiva, incluyendo pero sin limitarse a enfermedades de riñon hipertenso, y fibrosis de haloinjerto relacionada con trasplante.

Perfiles de Enlace de Anticuerpos de Lazo 2 WISE Las figuras 20 a 28 ilustran los perfiles de enlace de los anticuerpos anti WISE que enlazan a la región del lazo 2. La figura 20 ilustra Ab-AB contra mutantes WISE. La figura 21 ilustra Ab-AE contra mutantes WISE. La figura 22 ilustra Ab-AG contra mutantes WISE. La figura 23 ilustra Ab-AI. La figura 24 ilustra Ab-AC contra mutantes WISE. La figura 25 ilustra Ab-AA contra mutantes WISE. La figura 26 ilustra Ab-AH contra mutantes WISE. La figura 27 ilustra Ab-AJ contra mutantes WISE. La figura 28 ilustra Ab-AF contra mutantes WISE.

Los mutantes en las figuras 20 a 28 están representados como aminoácido que ocurren naturalmente, seguido de un número para la posición de aminoácido en la proteína WISE, y seguido de la mutación (por ejemplo, A = alanina). Por lo tanto, queda entendido que L110A representa una mutación de leucina en la posición 110 de la SEC ID NO: 2 mutada a alanina. N112A es asparagina en la posición 112 de la SEC ID NO: 2 es mutada a alanina. 1114A es isoleucina en la posición 114 de la SEC ID NO: 2 es mutada alanina. Gl 15A es glicina en la posición 115 de la SEC ID NO: 2 es mutada a alanina. G116A es glicina en la posición 116 de la SEC ID NO: 2 es mutada a alanina. G117A es glicina en la posición 117 de la SEC ID NO: 2 es mutada a alanina. K121A es lisina en la posición 121 de la SEC ID NO: 2 es mutada a alanina. S128A es serina en la posición 128 de SEC ID NO: 2 es mutada para alanina. WISE-Sc1 L2 ilustra la proteína WISE humana en donde la región de lazo 2 ha sido reemplazada con el lazo 2 SOST. La absorbancia superior representa el enlace, en tanto que la absorbancia inferior representa el enlace disminuido.

La mutación de ciertos residuos conduce al enlace disminuido a la proteína WISE mutante, lo que indica que el anticuerpo requiere el residuo que ocurre naturalmente para el enlace. Ab-AB tiene enlace disminuido a G117A (figura 20). Ab-AE tiene enlace disminuido a 1114A (figura 21). Ab-AG tiene enlace disminuido a 1114A y K121A (figura 22). Ab-AI tiene enlace disminuido a G115A y G117A (figura 23). Ab-AC tiene enlace disminuido a G115A y G117A (figura 24). Ab-AA tiene enlace disminuido a N112A, 1114A, G115A y K121A (figura 25). Ab-AH tiene enlace disminuido a N112A y 1114A (figura 26). Ab-AJ tiene enlace disminuido a L11A, N112A y G117A (figura 27). Ab-AF tiene enlace disminuido a L11A, N112A, y G117A (figura 28).

Por lo tanto, un anticuerpo aislado de la presente invención incluye uno en donde el enlace a WISE es a través de una o más de una leucina en el aminoácido 110 de la SEC ID NO: 2, una asparagina en el aminoácido 112 de la SEC ID NO: 2, una isoleucina en el aminoácido 114 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el aminoácido 115 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el aminoácido 116 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el aminoácido 117 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el aminoácido 119 de la SEC ID NO: 2, una lisina en el aminoácido 121 de la SEC ID NO: 2, un triptofan en el aminoácido 123 de la SEC ID NO: 2, una arginina en el aminoácido 126 de la SEC ID NO: 2, una serina en el aminoácido 128 de la SEC ID NO: 2, o una glutamina en el aminoácido 129 de la SEC ID NO: 2. Un experto en la técnica comprenderá, con base en los métodos aquí descritos, que se pueden identificar anticuerpos que enlazan a través de un residuo, elaborando una mutación en la posición designada, que posteriormente da como resultado el enlace reducido. El enlace reducido está representado, por ejemplo, mediante Ab-AJ que enlaza a WISE nativa en una absorbancia de aproximadamente 2. La mutación de los residuos L110A o N112A o G117A da como resultado una reducción de la absorbancia en aproximadamente 1.5 o menos (figura 27).

Aunque las composiciones y métodos de la presente invención han sido descritos en términos de algunas modalidades, los expertos en la técnica podrán apreciar que se pueden aplicar variaciones a las composiciones y/o métodos y en los pasos o en la secuencia de los pasos de los métodos aquí descritos, sin apartarse del concepto, espíritu y alcance de la presente invención. Más específicamente se podrá apreciar que ciertos agentes que están tanto química como fisiológicamente relacionados, pueden ser sustituidos por los agentes aquí descritos, logrando al mismo tiempo resultados iguales o similares. Todos los sustitutos y modificaciones similares que pueden apreciar los expertos en la técnica, se consideran dentro del espíritu alcance y concepto de la presente invención, tal como se define a través de las reivindicaciones adjuntas.

Las referencias aquí mencionadas, hasta el grado en que proporcionen procedimientos de ejemplo y otros detalles suplementarios a los aquí establecidos, están incorporadas todas de manera específica a la presente invención como referencia. Se hace referencia particular a los anticuerpos para WISE de la Solicitud Internacional WO2009/070243, la cual está incorporada en su totalidad a la presente invención como referencia.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo, que bloquea en forma cruzada el enlace de al menos uno de los anticuerpos Ab-AA, Ab-AB, Ab-AC, Ab-AD, Ab-AE, Ab-AF, Ab-AG, Ab-AH, Ab-AI, Ab-AJ y D14 a WISE humana, y enlaza específicamente al dominio de lazo 2 de WISE humana y/o es bloqueado en forma cruzada del enlace a WISE humana mediante al menos uno de los anticuerpos Ab-AA, Ab-AB, Ab-AC, Ab-AD, Ab-AE, Ab-AF, Ab-AG, Ab-AH, Ab-AI, Ab-AJ y D14 y enlaza específicamente al dominio de lazo 2 de WISE humana.

2. El anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque el anticuerpo WISE o fragmento del mismo, puede disminuir al menos uno de los siguientes parámetros: lesión de tejido y marcadores del mismo, manchado rojo Sirius o producción de colágeno, expresión de marcadores de miofibroblasto tal como aSMA o FSP-1, expresión de osteopontina, proteinuria, y/o puede inhibir la actividad de WISE en un ensayo a base de células.

3. El anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 1, caracterizado porque puede incrementar o conservar la función renal medida mediante rango de despeje de creatinina y/o, disminuir la elevación de creatinina en suero o plasma en un paciente que necesita del mismo, en comparación con un paciente no tratado.

4. Un anticuerpo aislado o fragmento del mismo que enlaza a un epítope de Lazo 2 de WISE.

5. El anticuerpo aislado tal como se describe en la reivindicación 4, caracterizado porque el anticuerpo que enlaza a WISE está en una o más de una leucina en el aminoácido 110 de la SEC ID NO: 2, una asparagina en el aminoácido 112 de la SEC ID NO: 2, una isoleucina en el aminoácido 114 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el aminoácido 115 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el aminoácido 116 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el aminoácido 117 de la SEC ID NO: 2, una glicina en el aminoácido 119 de la SEC ID NO: 2, una lisina en el aminoácido 121 de la SEC ID NO: 2, un triptofan en el aminoácido 123 de la SEC ID NO: 2, una arginina en el aminoácido 126 de la SEC ID NO: 2, una serina en el aminoácido 128 de la SEC ID NO: 2, o una glutamina en el aminoácido 129 de la SEC ID NO: 2.

6. El anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 3 y la 5, caracterizado porque comprende al menos una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad con una seleccionada de las SEC ID NOs: 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105 106, 107, 108, 133, 134, 135, 136, 137, y 138 y enlaza a WISE humana.

7. El anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describe en cualesquiera de las reivindicaciones 4 y 6, caracterizado porque comprende seis de las secuencias.

8. El anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describe en la reivindicación 7, caracterizado porque el porcentaje de identidad es 95%.

9. El anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describe en la reivindicación 8, caracterizado porque comprende: a. secuencias de las SEC ID NOs: 34, 35, y 36 b. secuencias de las SEC ID NOs: 37, 38, y 39 c. secuencias de las SEC ID NOs: 40, 41, y 42 d. secuencias de las SEC ID NOs: 43, 44, y 45 e. secuencias de las SEC ID NOs: 46, 47, y 48 f. secuencias de las SEC ID NOs: 49, 50, y 51; g. secuencias de las SEC ID NOs: 52, 53, y 54; h. secuencias de las SEC ID NOs: 55, 56, y 57; i. secuencias de las SEC ID NOs: 58, 59, y 60; j. secuencias de las SEC ID NOs: 61, 62, y 63; k. secuencias de las SEC ID NOs: 64, 65, y 66; 1. secuencias de las SEC ID NOs: 67, 68, y 69; m. secuencias de las SEC ID NOs: 86, 87, y 88; n. secuencias de las SEC ID NOs: 89, 90, y 69; o. secuencias de las SEC ID NOs: 91, 92, y 93; p. secuencias de las SEC ID NOs: 94, 95, y 96; q. secuencias de las SEC ID NOs: 97, 98, y 99; r. secuencias de las SEC ID NOs: 100, 101, y 102; s. secuencias de las SEC ID NOs: 103, 104, y 105; t. secuencias de las SEC ID NOs: 106, 107, y 108; u. secuencias de las SEC ID NOs: 133, 134, y 135; y v. secuencias de las SEC ID NOs: 136, 137, y 138.

10. El anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describe en la reivindicación 9, caracterizado porque comprende: a. secuencias de las SEC ID NOs: 34, 35, y 36 y secuencias de las SEC ID NOs: 37, 38, y 39; b. secuencias de las SEC ID NOs: 40, 41, y 42 y secuencias de las SEC ID NOs: 43, 44, y 45; c. secuencias de las SEC ID NOs: 46, 47, y 48 y secuencias de las SEC ID NOs: 49, 50, y 51; d. secuencias de las SEC ID NOs: 52, 53, y 54 y secuencias de las SEC ID NOs: 55, 56, y 57; e. secuencias de las SEC ID NOs: 58, 59, y 60 y secuencias de las SEC ID NOs: 61, 62, y 63; f. secuencias de las SEC ID NOs: 64, 65, y 66 y secuencias de las SEC ID NOs: 67, 68, y 69; g. secuencias de las SEC ID NOs: 86, 87, y 88 y secuencias de las SEC ID NOs: 89, 90, y 69; h. secuencias de las SEC ID NOs: 91, 92, y 93 y secuencias de las SEC ID NOs: 94, 95, y 96; i. secuencias de las SEC ID NOs: 97, 98, y 99 y secuencias de las SEC ID NOs: 100, 101, y 102; j. secuencias de las SEC ID NOs: 103, 104, y 105 y secuencias de las SEC ID NOs: 106, 107, y 108; y k. secuencias de las SEC ID NOs: 133, 134, y 135 y secuencias de las SEC ID NOs: 136, 137, y 138.

11. El anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque comprende al menos una secuencia que tiene al menos el 90% de identidad con una de las secuencias a-k.

12. El anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 10, caracterizado porque comprende una cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 110 y una cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 112, una cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 114 y una cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 116, una cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 118 y una cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 116, una cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 114 y una cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 120, una cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 118 y una cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 120, una cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 122 y una cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 124, una cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 1126 y una cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 124, una cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 122 y una cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 128, o una cadena ligera de acuerdo con la SEC ID NO: 126 y una cadena pesada de acuerdo con la SEC ID NO: 128.

13. Un anticuerpo que tiene una afinidad menor a 1 x 10" 7 M para WISE que enlaza específicamente al lazo 2 del polipéptido maduro de la Sec Id No: 2, e inhibe la actividad WISE para utilizarse en un método para tratar una condición médica asociada con enfermedad o trastorno del riñón.

14. El anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque el trastorno de riñón es nefropatía diabética o enfermedad renal hipertensa o disfunción de injerto relacionada con trasplante.

15. El anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 13, caracterizado porque la enfermedad de riñón está asociada con proteinuria y/o fibrosis.

16. Una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento tal como se describe en la reivindicación 13 ó 16.

17. El anticuerpo o fragmento del mismo, tal como se describe en la reivindicación 16, en combinación con uno o más de un excipiente, diluyente o transportador farmacéuticamente aceptable.

18. El anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describe en la reivindicación 17, conjugado para al menos uno de Fe, PEG, albúmina, y transferrina.

19. Un polipéptido inmunogénico de WISE adecuado para utilizarse en la producción de anticuerpos inhibidores, en donde los anticuerpos enlazan a WISE humana de longitud total con una afinidad menor a 1 x 10"7 M, y pueden disminuir al menos uno de los siguientes parámetros: lesión de tejido, manchado de rojo sirius o producción de colágeno, expresión de marcadores de miofibroblasto tal como aSMA o FSP-1, expresión de osteopontina, y proteinuria, disminución en la función renal y/o puede bloquear el efecto inhibidor de WISE en un ensayo a base de células.

20. Un método para tratar nefropatía diabética con un anticuerpo tal como se describe en la reivindicación 1.