MX2012005684A

MX2012005684A - Metodo para producir butanol usando fermentacion extractiva con adiccion de electrolitos.

Info

Publication number: MX2012005684A
Application number: MX2012005684A
Authority: MX
Inventors: Michael Charles Grady; Ranjan Patnaik
Original assignee: Butamax Tm Advanced Biofuels
Priority date: 2009-11-23
Filing date: 2010-11-23
Publication date: 2012-06-19
Also published as: JP2013511283A; US20110159558A1; BR112012012219A2; IN2012DN03440A; WO2011063391A1; ZA201203653B; CN102656272A; US20140080189A1; EP2504446A1; US8969055B2; US8617861B2; NZ599414A; AU2010321564A1; CA2779884A1; KR20120115500A

Abstract

Un método para producir butanol a través de fermentación microbiana, en donde el producto de butanol se elimina durante la fermentación por extracción en un agente extractante orgánico inmiscible en agua en presencia de al menos un electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal. El electrolito podría comprender una sal que se disocia en el medio de fermentación, o en la fase acuosa de un medio de fermentación bifásico, para formar iones libres. Se proporciona, además, un método y una composición para recuperar butanol a partir de un medio de fermentación.

Description

METODO PARA PRODUCIR BUTANOL USANDO FERMENTACION EXTRACTIVA CON ADICION DE ELECTROLITOS Campo de la Invención La presente invención se relaciona con el campo de los biocombustibles . Más específicamente, la invención se relaciona con un método para producir butanol mediante fermentación microbiana, en el cual al menos un electrolito se encuentra presente en el medio de fermentación microbiana a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal, y el producto de butanol se elimina por extracción en un agente extractante orgánico inmiscible en agua.

Antecedentes de la Invención El butanol es una sustancia química industrial importante con una variedad de aplicaciones, tal como el uso como un aditivo de combustible, como un componente de mezcla para combustible diesel, como sustancia química de materia prima en la industria de los plásticos y como un agente extractante grado alimenticio en la industria de los alimentos y los saborizantes . Cada año, se producen 4.54 a 5.44 mil millones de kilogramos (10 a 12 mil millones de libras) de butanol por medios petroquímicos . A medida que aumenta la demanda de butanol, se expande el interés por producir esta sustancia Ref.: 230183 química a partir de fuentes renovables, tales como maíz, caña de azúcar o suministros celulósicos.

En un proceso fermentativo para producir butanol, la eliminación de producto en el lugar reduce ventajosamente la inhibición de butanol del microorganismo y mejora los índices de fermentación al controlar las concentraciones de butanol en el caldo de fermentación. Las tecnologías para la eliminación de producto en el lugar incluyen arrastre, adsorción, pervaporación, extracción por solvente de membrana, y extracción líquido-líquido . En la extracción líquido- líquido, un agente extractante se pone en contacto con el caldo de fermentación para dividir el butanol entre el caldo de fermentación y la fase extractante. El butanol y el agente extractante se recuperan por un proceso de separación, por ejemplo, por destilación.

J.J. Malinowski y A.J. Daugulis, AIChE Journal (1994), 40(9), 1459-1465, describen estudios experimentales para evaluar el efecto de la adición de sal en la extracción de 1-butanol, etanol y acetona de soluciones acuosas diluidas mediante el uso de ciclopentanol, n-valeraldehído, alcohol amílico terciario, y Adol 85NF (compuesto en gran parte de alcohol oleílico) como agentes extractantes. Los autores destacan en sus conclusiones que a pesar de las ventajas que ofrece la adición de sal a la extracción de etanol, 1-butanol y acetona de soluciones acuosas diluidas encontradas, típicamente, en procesos de fermentación, la implantación práctica de una configuración de proceso así se encuentra limitada en la actualidad. Como una estrategia de recuperación en el lugar (fermentación extractiva) , las concentraciones de sal relativamente altas que podrían requerirse podrían tener efectos muy nocivos en las células debido al choque osmótico.

La solicitud de patente de los Estados Unidos publicada núm. 2009/0171129 Al describe métodos para la recuperación de alcoholes de C3-C6 a partir de soluciones acuosas diluidas, tal como caldos de fermentación. El método incluye aumentar la actividad del alcohol de C3-C6 en una porción de la solución acuosa a al menos la de la saturación del alcohol de C3-C6 en la porción. De conformidad con una modalidad de la invención, aumentar la actividad del alcohol de C3-C6 podría comprender adicionar soluto hidrofílico a la solución acuosa. Se adiciona suficiente soluto hidrofílico para permitir la formación de una segunda fase líquida, tanto solo por adición del soluto hidrofílico o en conjunto con otras etapas de proceso. El soluto hidrofílico adicionado podría ser una sal, un aminoácido, un solvente hidrosoluble , un azúcar o combinaciones de estos.

La solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/478,389 presentada el 4 de junio de 2009 describe métodos para producir y recuperar butanol de un caldo de fermentación; los métodos comprenden la etapa de contactar el caldo de fermentación con un agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de Ci2 a C22, ásteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de Ci2 a C22, y mezclas de estos, para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol.

Las solicitudes de patente de los Estados Unidos núm. 61/168,640; 61/168,642; y 61/168,645, presentadas en conjunto el 13 de abril de 2009; y 61/231,697; 61/231,698; y 61/231,699; presentadas en conjunto el 6 de agosto de 2009; describen métodos para producir y recuperar butanol de un medio de fermentación; los métodos comprenden la etapa de contactar el medio de fermentación con un agente extractante orgánico inmiscible en agua que comprende un primer solvente y un segundo solvente; el primer solvente se selecciona del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de CX2 a C22/ ésteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22, y mezclas de estos, y el segundo solvente se selecciona del grupo que consiste en alcoholes de C7 a Cu, ácidos carboxílieos de C7 a Cu, ésteres de ácidos carboxílieos de C7 a Cu, aldehidos de C7 a Cu, y mezclas de estos, para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol.

Se buscan continuamente métodos para producir y recuperar butanol de un medio de fermentación. Se desea encontrar un proceso para la eliminación de producto de butanol en el lugar, en el cual la adición electrolítica a un medio de fermentación proporcione eficacia de extracción de butanol mejorada y biocompatibilidad aceptable con el microorganismo.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un método para recuperar butanol de un medio de fermentación que comprende butanol, agua, al menos un electrolito y un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir de al menos una fuente de carbono fermentable. El electrolito se encuentra presente en el medio de fermentación a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal . La presente invención proporciona, además, métodos para producir butanol mediante el uso de un microorganismo así y un electrolito adicionado. Los métodos incluyen contactar el medio de fermentación con i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua y, opcionalmente, ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua, separar la fase orgánica que contiene butanol de la fase orgánica, y recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol. En una modalidad de la invención, se proporciona un método para recuperar butanol de un medio de fermentación; caracterizado porque comprende: a) proporcionar un medio de fermentación que comprende butanol, agua, al menos un electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal, y un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir de al menos una fuente de carbono fermentable; contactar el medio de fermentación con i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de Ci2 a C22/ ácidos grasos de Ci2 a C22, ésteres de ácidos grasos de C12 a C22 aldehidos grasos de Ci2 a C22, amidas grasas de C12 a C22y mezclas de estos y, opcionalmente , ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C7 a C22, ácidos grasos de C7 a C22, ésteres de ácidos grasos de C7 a C22, aldehidos grasos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22 y mezclas de estos para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol ; opcionalmente, separar la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa; y recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol para producir butanol recuperado.

En algunas modalidades, una porción del butanol se extrae en forma conjunta del medio de fermentación mediante un proceso que comprende las etapas de: a) arrastrar el butanol del medio de fermentación con un gas para formar una fase gaseosa que contiene butanol; y b) recuperar el butanol de la fase gaseosa que contiene butanol .

De conformidad con los métodos de la invención, el electrolito podría adicionarse al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional o a combinaciones de estos. En algunas modalidades, el electrolito comprende una sal con un catión seleccionado del grupo que consiste en litio, sodio, potasio, rubidio, cesio, magnesio, calcio, estroncio, bario, amonio, fosfonio, y combinaciones de estos. En algunas modalidades, el electrolito comprende una sal con un anión seleccionado del grupo que consiste en sulfato, carbonato, acetato, citrato, lactato, fosfato, fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, y combinaciones de estos. En algunas modalidades, el electrolito se selecciona del grupo que consiste en sulfato de sodio, cloruro de sodio y combinaciones de estos.

De conformidad con los métodos de la invención, en algunas modalidades, el microorganismo modificado genéticamente se selecciona del grupo que consiste en bacterias, · cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras. En algunas modalidades, las bacterias se seleccionan del grupo que consiste en Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium y Brevibacteriu-n. En algunas modalidades, la levadura se selecciona del grupo que consiste en Pichia, Candida, ansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia y Saccharomyces .

De conformidad con los métodos de la invención, el primer agente extractante podría seleccionarse del grupo que consiste en alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol estearílico, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, aldehido láurico, 1-dodecanol, y una combinación de estos. En algunas modalidades, el primer agente extractante comprende alcohol oleílico. En algunas modalidades, el segundo agente extractante podría seleccionarse del grupo que consiste en 1-nonanol, 1-decanol, 1-undecanol, 2-undecanol, 1-nonanal, y una combinación de estos.

En algunas modalidades, el butanol es 1-butanol. En algunas modalidades, el butanol es 2 -butanol. En algunas modalidades, el butanol es isobutanol. En algunas modalidades, el medio de fermentación comprende, además, etanol, y la fase orgánica que contiene butanol contiene etanol .

En una modalidad de la invención se proporciona un método para la producción de butanol; caracterizado porque comprende : a) proporcionar un microorganismo genéticamente modificado que produce butanol a partir de por lo menos una fuente de carbono fermentable ; b) cultivar el microorganismo en un medio de fermentación bifásico que comprende una fase acuosa y i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22 , ácidos grasos de Ci2 a C22, ésteres de ácidos grasos de Ci2 a C22, aldehidos grasos de Ci2 a C22, amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente , ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22, ácidos carboxílicos de C7 a C22 ésteres de ácidos carboxílicos de C a C22 , aldehidos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22, y mezclas de estos, en donde el medio de fermentación bifásico comprende, además, un electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal, durante un tiempo suficiente para permitir la extracción del butanol en el agente extractante orgánico para formar una fase orgánica que contiene butanol. c) opcionalmente , separar la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa; y d) recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol para producir butanol recuperado.

En una modalidad de la invención se proporciona un método para la producción de butanol; caracterizado porque comprende : a) proporcionar un microorganismo genéticamente modificado que produce butanol a partir de por lo menos una fuente de carbono fermentable; b) cultivar el microorganismo en un medio de fermentación, en donde el microorganismo produce el butanol en el medio de fermentación para producir un medio de fermentación que contiene butanol; c) adicionar al menos un electrolito al medio de fermentación para proporcionar el electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el I coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal; d) contactar al menos una porción del medio de fermentación que contiene butanol con i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22/ ácidos grasos de C12 a C22, ásteres de ácidos grasos de Ci2 a C22/ aldehidos grasos de C12 a C22/ amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente , un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22, ácidos carboxílicos de C7 a C22/ esteres de ácidos carboxílicos de C7 a C22/ aldehidos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22y mezclas de estos, para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol; e) opcionalmente, separar la fase orgánica que contiene butanol a partir de la fase acuosa; f) recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol; y g) opcionalmente, regresar al menos una porción de la fase acuosa al medio de fermentación.

En algunas modalidades, el microorganismo modificado genéticamente comprende una modificación que desactiva una ruta competidora para el flujo de carbono. En algunas modalidades, el microorganismo modificado genéticamente no produce acetona.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual el primer agente extractante se combina con el segundo agente extractante en un recipiente, antes de entrar en contacto con el medio de fermentación en un recipiente de fermentación.

La Figura 2 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual el primer agente extractante y el segundo agente extractante se adicionan por separado a un recipiente de fermentación, en el cual el medio de fermentación se pone en contacto con los agentes extractantes.

La Figura 3 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual el primer agente extractante y el segundo agente extractante se adicionan por separado a distintos recipientes de fermentación.

La Figura 4 ilustra esquemáticamente Una modalidad de los métodos de la invención, en la cual la extracción del producto sucede dirección 3' del termentador, y el primer agente extractante y el segundo agente extractante se combinan en un recipiente antes de que el medio de fermentación entre en contacto con los agentes extractantes en un recipiente distinto.

La Figura 5 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención en la que la extracción del producto se produce dirección 3' del fermentador y el primer agente extractante inmiscible en agua y el segundo agente extractante opcional inmiscible en agua se agregan por separado a un recipiente en el que el medio de fermentación entra en contacto con los agentes extractantes .

La Figura 6 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual la extracción del producto sucede dirección 3' del fermentador, y el primer agente extractante y el segundo agente extractante se adicionan por separado a distintos recipientes para que entren en contacto con el medio de fermentación.

La Figura 7 ilustra esquemáticamente una modalidad de los métodos de la invención, en la cual la extracción del producto sucede en al menos un fermentador por lotes a través de un flujo de corrientes paralelas de un agente extractante orgánico inmiscible en agua en o cerca del fondo de una masa de fermentación para llenar el fermentador con agente extractante que fluye fuera del fermentador en un punto en la parte superior, o cerca de éste, del fermentador.

Breve Descripción de Listado de Secuencias Las siguientes secuencias cumplen con el Título 37 del C.F.R., 1.821 1.825 ("Requisitos para solicitudes de patentes que contienen descripciones de secuencias de nucleótidos y/o secuencias de aminoácidos - reglas de las secuencias") según la norma ST.25 (1998) de la Organización Mundial de Propiedad Intelectual (WIPO, por sus siglas en inglés) y los requisitos para listados de secuencias de la EPO y el PCT (Reglas 5.2 y 49.5 (a bis), y Sección 208 y Anexo C de las Instrucciones Administrativas) .

Tabla la. Sec . con números de ident . de secuencias codificantes y proteínas Tabla Ib. Sec. con números de ident . de las secuencias usadas en la construcción, iniciadores y vectores 5 Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona métodos para recuperar butanol a partir de un medio de fermentación microbiano que comprende al menos un electrolito, mediante la extracción en un agente extractante orgánico inmiscible en agua para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. El electrolito se encuentra presente en el medio de fermentación a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal . La fase orgánica que contiene butanol se separa de la fase acuosa y el butanol podría recuperarse. Se proporcionan, además, métodos para producir butanol.

Definiciones En esta descripción se usan las siguientes definiciones. El término "electrolito" se refiere a un soluto que se ioniza o disocia en una solución acuosa, y que podría funcionar como un conductor iónico.

El término "butanol" se refiere a 1-butanol, 2 -butanol y/o isobutanol, individualmente o como mezclas de estos.

El término "inmiscible en agua" se refiere a un componente químico, tal como un agente extractante o un solvente, el cual es incapaz de mezclarse con una solución acuosa, tal como un caldo de fermentación, de manera tal que forme una fase líquida.

El término "agente extractante", como se usa en la presente invención, se refiere a uno o más solventes orgánicos que se usan para extraer butanol de un caldo de fermentación.

El término "medio de fermentación bifásico" se refiere a un medio de crecimiento bifásico que comprende un medio de fermentación (es decir, una fase acuosa) y una cantidad adecuada de un agente extractante orgánico inmiscible en agua.

El término "fase orgánica", como se usa en la presente invención, se refiere a la fase no acuosa de una mezcla bifásica obtenida al poner en contacto un caldo de fermentación con un agente extractante inmiscible en agua.

El término "fase acuosa", como se usa en la presente invención, se refiere a la fase de una mezcla bifásica, obtenida al poner en contacto un medio de fermentación acuoso con un agente extractante orgánico, el cual comprende agua.

El término "eliminación de producto en el lugar", como se usa en la presente invención, significa la eliminación selectiva de un producto de fermentación específico a partir de un proceso biológico tal como fermentación, para controlar la concentración de producto en el proceso biológico.

El término "caldo de fermentación", como se usa en la presente invención, significa la mezcla de agua, azúcares, sólidos disueltos, sólidos suspendidos, microorganismos que producen butanol, butanol producto y todos los otros constituyentes del material mantenido en el recipiente de fermentación en el cual se está elaborando el butanol producto mediante la reacción de azúcares a butanol, agua y dióxido de carbono (C02) por los microorganismos presentes. El caldo de fermentación podría comprender uno o más fuentes de carbono fermentable, tal como los azúcares descritos en la presente invención. El caldo de fermentación es la fase acuosa en la extracción fermentativa bifásica. De vez en cuando, como se usa en la presente invención, el término "medio de fermentación" podría usarse como sinónimo de "caldo de fermentación".

El término "recipiente de fermentación", como se usa en la presente invención, significa el recipiente en el cual se realiza la reacción de fermentación por la cual se hace el butanol producto a partir de azúcares . El término "fermentador", como se usa en presente invención, podría usarse como sinónimo de "recipiente de fermentación".

El término "fuente de carbono fermentable" se refiere a una fuente de carbono capaz de metabolizarse por los microorganismos que se describen en la presente invención. Las fuentes de carbono fermentable adecuadas incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos , tales como glucosa o fructosa; disacáridos, tales como lactosa o sacarosa; oligosacáridos ; polisacáridos, tales como almidón o celulosa; sustratos de un carbono; y una combinación de estos, que pueden encontrarse en el medio de fermentación. Las fuentes de carbono fermentable incluyen carbono renovable, el cual es carbono que no es a base de petróleo, que incluye carbono de materias primas agrícolas, algas, celulosa, hemicelulosa, lignocelulosa o cualquier combinación de estos .

El término "ácido graso", como se usa en la presente invención, se refiere a un ácido carboxílico con una cadena alifática larga de átomos de carbono de C7 a C22, el cual es saturado o insaturado.

El término "alcohol graso", como se usa en la presente invención, se refiere a un alcohol con una cadena alifática larga de átomos de carbono de C7 a C22/ el cual es saturado o insaturado.

El término "aldehido graso", como se usa en la presente invención, se refiere a un aldehido con una cadena alifática larga de átomos de carbono de C7 a C22 , el cual es saturado o insaturado .

El término "amida grasa", como se usa en la presente invención, se refiere a una amida con una cadena alifática larga de átomos de carbono de Ci2 a C22/ la cual es saturada o insaturada.

El término "coeficiente de partición", abreviado en la presente invención como Kp, significa la relación de la concentración de un compuesto en las dos fases de una mezcla de dos solventes inmiscibles en equilibrio. Un coeficiente de partición es una medida de la solubilidad diferencial de un compuesto entre dos solventes inmiscibles. Como se usa en la presente invención, el término "coeficiente de partición para butanol" se refiere a la relación de concentraciones de butanol entre la fase orgánica que comprende el agente extractante y la fase acuosa que comprende el medio de fermentación. Coeficiente de partición, como se usa en la presente invención, es sinónimo del término coeficiente de distribución.

El término "separación", como se usa en la presente invención, es sinónimo de "recuperación" y se refiere a remover un compuesto químico de una mezcla inicial para obtener el compuesto con una mayor pureza o a una concentración más alta que la pureza o la concentración del compuesto en la mezcla inicial.

El término "ruta biosintética del butanol", como se usa en la presente invención, se refiere a una ruta enzimática para producir 1-butanol, 2-butanol o isobutanol.

El término "ruta biosintética del 1-butanol", como se usa en la presente invención, se refiere a una ruta enzimática para producir 1-butanol a partir de acetil coenzima A (acetil CoA) .

El término "ruta biosintética del 2-butanol", como se usa en la presente invención, se refiere a una ruta enzimática para producir 2-butanol a partir de piruvato.

El término "ruta biosintética del isobutanol", como se usa en la presente invención, se refiere a una ruta enzimática para producir isobutanol a partir de piruvato.

El término "título eficaz", como se usa en la presente invención, se refiere a la cantidad total de butanol producida por fermentación por título de medio de fermentación. La cantidad total de butanol incluye: (i) la cantidad de butanol en el medio de fermentación; (ii) la cantidad de butanol recuperada del agente extractante orgánico; y (iii) la cantidad de butanol recuperada de la fase gaseosa, si se usa arrastre por gas.

El término "índice eficaz", como se usa en la presente invención, se refiere a la cantidad total de butanol producida por fermentación por título de medio de fermentación por hora de fermentación.

El término "rendimiento eficaz", como se usa en la presente invención, se refiere a la cantidad de butanol producida por unidad de sustrato de carbono fermentable consumida por el catalizador biológico.

El término "condiciones aerobias", como se usa en la presente invención, significa condiciones de crecimiento en presencia de oxígeno.

El término "condiciones microaerobias", como se usa en la presente invención, significa condiciones de crecimiento con niveles bajos de oxígeno (es decir, por debajo de los niveles normales de oxígeno atmosférico) .

El término "condiciones anaerobias", como se usa en la presente invención, significa condiciones de crecimiento en ausencia de oxígeno.

El término "medios mínimos", como se usa en la presente invención, se refiere a los medios de crecimiento que contienen los nutrientes mínimos posibles para el crecimiento, generalmente, sin la presencia de aminoácidos. Un medio mínimo contiene, típicamente, una fuente de carbono fermentable y varias sales, que podrían variar entre los microorganismos y las condiciones de crecimiento; estas sales proporcionan, generalmente, elementos esenciales, tales como magnesio, nitrógeno, fósforo y azufre para permitir que el microorganismo sintetice proteínas y ácidos nucleicos.

El término "medios definidos", como se usa en la presente invención, se refiere a los medios de crecimiento que tienen cantidades conocidas de todos los ingredientes presentes, por ejemplo, una fuente de carbono y una fuente de nitrógeno definidas, y elementos traza y vitaminas requeridos por el microorganismo.

El término "biocompatibilidad", como se usa en la presente invención, se refiere a la medida de la capacidad de un microorganismo para usar glucosa en presencia de un agente extractante. Un agente extractante biocompatible permite que el microorganismo use glucosa. Un agente extractante no biocompatible (es decir, biotóxico) no permite que el microorganismo use glucosa, por ejemplo, a un índice mayor que aproximadamente 25 % del índice cuando el agente extractante no está presente.

El término "°c" significa grados Celsius.

El término "OD" significa densidad óptica.

El término "OD6oo" se refiere a la densidad óptica a una longitud de onda de 600 nm.

El término ATCC se refiere a la Colección Estadounidense de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection) , Manassas, VA.

El término "s" significa segundo (s).

El término "min" significa minuto (s) .

El término "h" significa hora(s) .

El término "mL" significa mililitro (s) .

El término "L" significa litro.

El término "g" significa gramo (s).

El término "mmol" significa milimol(es) .

El término "M" significa molar.

El término "µ?" significa microlitro (s) .

El término "yg" significa microgramo (s) .

El término " g/mL" significa microgramo por mililitro.

El término "mL/min" significa mililitros por minuto.

El término "g/L" significa gramos por litro.

El término "g/L/h" significa gramos por litro por hora El término "mmol/min/mg" significa milimol por minuto por miligramo.

El término "temp." significa temperatura.

El término "rpm" significa revoluciones por minuto.

El término "HPLC" significa cromatografía de gas de alta presión, por sus siglas en inglés.

El término "CG" significa cromatografía de gas.

Todas las publicaciones, las patentes, las solicitudes de patentes, y otras referencias mencionadas en la presente invención se incorporan expresamente como referencia, en su totalidad, para todo propósito. Además, cuando una cantidad, una concentración, u otro valor o parámetro se da como un intervalo, un intervalo preferido o una lista de valores preferibles superiores y valores preferibles inferiores, deberá entenderse que revelan específicamente todos los intervalos formados a partir de cualquier par de cualquier límite de intervalo o valor preferido superior y cualquier límite de intervalo o valor preferido inferior, sin importar si los intervalos se describen por separado. En donde un intervalo de valores numéricos se menciona en la presente invención, a menos que se indique de cualquier otra forma, el intervalo pretende incluir los puntos finales de estos, y todos los enteros y las fracciones dentro del intervalo. El ámbito de la invención no pretende limitarse a los valores específicos mencionados cuando se define un intervalo.

Microorganismos genéticamente modificados Los huéspedes microbianos para la producción de butanol podrían seleccionarse de bacterias, cianobacterias, hongos filamentosos y levaduras. El huésped microbiano usado deberá ser tolerante al producto de butanol producido, de manera que el rendimiento no se limite por la toxicidad del producto al huésped. La selección de un huésped microbiano para la producción de butanol se describe con más detalle abajo.

Los microbios que son metabólicamente activos a niveles de títulos altos de butanol no son muy conocidos en la técnica. Aunque los mutantes tolerantes al butanol se han aislado de Clostridia solventogénica, hay poca información disponible respecto de la tolerancia al butanol de otras cepas de bacterias potencialmente útiles . La mayoría de los estudios sobre la comparación de la tolerancia al alcohol en bacterias sugiere que el butanol es más tóxico que el etanol (de Cavalho et al., Microsc. Res. Tech. 64:215-22 (2004) y Kabelitz et al., FEMS Microbiol. Lett. 220:223-227 (2003)). Tomas et al. (J. Bacteriol. 186:2006-2018 (2004)) informan que el rendimiento de 1-butanol durante la fermentación en Clostridiu acetobutylicu podría limitarse por la toxicidad del butanol. El efecto principal de 1-butanol sobre Clostridium acetobutylicum es la interrupción de las funciones de membrana (Hermann et al., Appl. Environ. Microbiol. 50:1238-1243 (1985)).

Los huéspedes microbianos seleccionados para la producción de butanol deberán ser tolerantes al butanol y deberán ser capaces de convertir carbohidratos en butanol mediante el uso de una ruta biosintética introducida, tal como la ruta descrita abajo. Los criterios para la selección de huéspedes microbianos adecuados incluyen los siguientes: tolerancia intrínseca al butanol, alto índice de uso de carbohidratos, disponibilidad de herramientas genéticas para la manipulación genética y capacidad para generar alteraciones cromosómicas estables.

Las cepas huésped adecuadas con una tolerancia al butanol podrían identificarse mediante un análisis basado en la tolerancia intrínseca de la cepa. La tolerancia intrínseca de los microbios al butanol podría medirse al determinar la concentración de butanol que es responsable del 50 % de la inhibición del índice de crecimiento (IC50) cuando se cultivan en un medio mínimo. Los valores de IC50 podrían determinarse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los microbios de interés podrían cultivarse en presencia de distintas cantidades de butanol y el índice de crecimiento podría monitorearse al medir la densidad óptica a 600 nanómetros . El tiempo de duplicación podría calcularse a partir de la parte logarítmica de la curva de crecimiento y usarse como una medida del índice de crecimiento. La concentración de butanol que produce 50 % de inhibición de crecimiento podría determinarse a partir de un gráfico del porcentaje de inhibición de crecimiento contra la concentración de butanol. Preferentemente, la cepa huésped deberá tener una IC50 para butanol mayor que aproximadamente 0.5 %. Es más adecuada una cepa huésped con una IC50 para butanol mayor que aproximadamente 1.5 %. Es particularmente adecuada una cepa huésped con una IC50 para butanol mayor que aproximadamente 2.5 %.

El huésped microbiano para la producción de butanol deberá usar, además, glucosa y/u otros carbohidratos a un Indice alto. La mayoría de los microbios son capaces de usar carbohidratos. Sin embargo, ciertos microbios ambientales no pueden usar carbohidratos eficazmente y, por lo tanto, no serían huéspedes adecuados .

La capacidad de modificar genéticamente el huésped es esencial para la producción de cualquier microorganismo recombinante . Los modos de tecnología de transferencia de genes que podrían usarse incluyen por electroporación, conjugación, transducción o transformación natural. Se encuentra disponible un amplio intervalo de plásmidos conjugativos huésped y de marcadores con resistencia a los fármacos. Los vectores de clonación usados con un organismo se adaptan al organismo huésped sobre la base de la naturaleza de los marcadores de resistencia a los antibióticos que pueden funcionar en ese huésped.

El huésped microbiano podría manipularse, además, a fin de desactivar las rutas competidoras para el flujo de carbono al desactivar distintos genes. Esto requiere la disponibilidad de trasposones o vectores de integración cromosómica para dirigir la desactivación. Adicionalraente, los huéspedes de producción susceptibles a la mutagénesis química podrían tener mejoras en la tolerancia intrínseca al butano! a través de la mutagénesis química y el análisis de mutantes .

Como un ejemplo de desactivación de rutas competidoras para el flujo de carbono, podría reducirse o eliminarse la piruvato decarboxilasa (véase, por ejemplo, la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 20090305363) . En modalidades, el butanol es el producto principal del organismo. En modalidades, el microorganismo no produce acetona.

Sobre la base de los criterios descritos anteriormente, los huéspedes microbianos adecuados para la producción de butanol incluyen, pero no se limitan a, miembros de los géneros Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pseudomonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Pichia, Candida, Hansenula, Kluyverowyces, Issatchenkia, y Saccharomyces. Los huéspedes preferidos incluyen: Escherichia coli, Alcaligenes eutrophus, Bacillus licheniformis, Paenibacillus macerans, Rhodococcus erythropolis, Pseudomonas putida, Lactobacillus plantarum, Enterococcus faecium, Enterococcus gallinarium, Enterococcus faecalis, Pediococcus pentosaceus, Pediococcus acidilactici, Bacillus subtilis y Saccharomyces cerevisiae.

Los microorganismos mencionados anteriormente podrían modificarse genéticamente para convertir fuentes de carbono fermentables en butanol, específicamente, 1-butanol, 2-butanol o isobutanol, mediante el uso de métodos conocidos en la técnica. Los microorganismos adecuados incluyen Escherichia, Lactobacillus y Saccharomyces. Los microorganismos adecuados incluyen E. coli, L. plantarum y S. cerevisiae . Adicionalmente, el microorganismo podría ser una cepa tolerante al butanol de uno de los microorganismos enumerados anteriormente que se aislan mediante el uso del método descrito por Bramucci et al. (Solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 11/761497; y WO 2007/146377) . Un ejemplo de una cepa así es la cepa de Lactobacillus plantarum PN0512 (ATCC: PTA-7727, depósito biológico hecho el 12 de julio de 2006 para la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 11/761497) .

Las rutas biosintéticas adecuadas para la producción de butanol son conocidas en la técnica, y ciertas rutas adecuadas se describen en la presente invención. En algunas modalidades, la ruta biosintética de butanol comprende al menos un gen que es heterólogo a la célula huésped. En algunas modalidades, la ruta biosintética de butanol comprende más de un gen que es heterólogo a la célula huésped. En algunas modalidades, la ruta biosintética de butanol comprende genes heterologos que codifican polipéptidos que corresponden a cada etapa de una ruta biosintética .

De forma similar, ciertas proteínas adecuadas con la capacidad de catalizar las conversiones de sustrato en producto indicadas se describen en la presente invención y otras proteínas adecuadas se proporcionan en la técnica. Por ejemplo, las publicaciones de las solicitudes de patente de los Estados Unidos núm. US20080261230 , US20090163376 y US20100197519 describen acetohidroxi ácido isomeroreductasas como lo hace la solicitud de los Estados Unidos núm. de serie: 12/893,077, presentada el 29 de septiembre de 2010; la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20100081154 describe dihidroxiácido deshidratasas ; las alcohol deshidrogenasas se describen en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. US20090269823 y la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/290636.

Los microorganismos pueden modificarse genéticamente para que contengan una ruta biosintética de 1-butanol para producir 1-butanol. Las modificaciones adecuadas incluyen las descritas por Donaldson et al. en la patente O 2007/041269. Por ejemplo, el microorganismo podría modificarse genéticamente para que exprese una ruta biosintética de 1-butanol que comprenda las siguientes conversiones de sustrato en producto catalizadas por enzimas: a) acetil CoA en acetoacetil-CoA; b) acetoacetil-CoA en 3-hidroxibutiril-CoA; c) 3-hidroxibutiril-CoA en crotonil-CoA; d) crotonil-CoA en butiril-CoA; e) butiril-CoA en buliraldehído; y f) buliraldehído en a-butanol.

Los microorganismos podrían modificarse genéticamente, además, para que expresen una ruta biosintética de 2-butanol para producir 2-butanol. Las modificaciones adecuadas incluyen las descritas por Donaldson et al . en las publicaciones de las solicitudes de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0259410 y 2007/0292927, y las publicaciones de las solicitudes del PCT núm. WO 2007/130518 y WO 2007/130521. Por ejemplo, en una modalidad, el microorganismo podría modificarse genéticamente para que exprese una ruta biosintética de 2-butanol que comprenda las siguientes conversiones de sustrato en producto catalizadas por enzimas: a) piruvato en alfa acetolactato; b) alfa acetolactato en acetoína c) acetoína en 2 , 3-butanodiol; d) 2 , 3 -butanodiol en 2-butanona; y e) 2-butanona en 2-butanol.

Los microorganismos podrían modificarse genéticamente, además, para que expresen una ruta biosintética de isobutanol para producir isobutanol. Las modificaciones adecuadas incluyen las descritas por Donaldson et al . en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 2007/0092957 y WO 2007/050671. Por ejemplo, el microorganismo podría modificarse genéticamente para que contenga una ruta biosintética de isobutanol que comprenda las siguientes conversiones de sustrato en producto catalizadas por enzimas: a) piruvato en acetolactato; b) acetolactato en 2, 3-dihidroxiisovalerato; c) 2 , 3 -dihidroxiisovalerato en -cetoisovalerato ; d) a-cetoisovalerato en isobutiraldehído; y e) isobutiraldehído en isobutanol.

La cepa de Escherichia coli podría comprender: (a) una ruta biosintética de isobutanol codificada por los siguientes genes: budB (sec. con núm. de ident.:l) de Klebsiella pneumoniae que codifica acetolactato sintasa (dada como sec. con núm. de ident.:2), ilvC (dado como sec. con núm. de ident.:3) de E. coli que codifica acetohidroxi ácido reductoisomerasa (dada como sec. con núm. de ident.:4), ilvD (dado como sec. con núm. de ident.:5) de E. coli que codifica acetohidroxi ácido deshidratasa (dada como sec. con núm. de ident.:6), kivD (dado como sec. con núm. de ident.:7) de Lactococcus lactis que codifica la ceto ácido decarboxilasa de cadena ramificada (dada como sec. con núm. de ident.:8) y sadB (dado como sec. con núm. de ident.:9) de Achromobacter xylosoxidans que codifica una butanol deshidrogenasa (dada como sec . con núm. de ident.:10). Las enzimas codificadas por los genes de la ruta biosintética de isobutanol catalizan las conversiones de sustrato en producto para convertir piruvato en isobutanol, como se describió anteriormente. Específicamente, la acetolactato sintasa cataliza la conversión de piruvato en acetolactato, la acetohidroxiácido reductoisomerasa cataliza la conversión de acetolactato en 2 , 3-dihidroxiisovalerato, la acetohidroxi ácido deshidratasa cataliza la conversión de 2 , 3-dihidroxiisovalerato en a-cetoisovalerato, la ceto ácido decarboxilasa de cadena ramificada cataliza la conversión de -cetoisovalerato en isobutiraldehído y la butanol deshidrogenasa cataliza la conversión de isobutiraldehído en isobutanol. Esta cepa de Escherichia coli recombinante puede construirse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica (véanse las solicitudes de patente de los Estados Unidos copendientes núm. 12/478,389 y 12/477,946) y/o que se describen abajo, en la presente invención. Se contempla que podrían construirse cepas adecuadas que comprendan una secuencia con al menos aproximadamente 70-75 % de identidad, al menos aproximadamente 75-80 %, al menos aproximadamente 85-90 % de identidad con las secuencias de proteínas descritas en la presente invención.

La cepa de Escherichia coli podría comprender deleciones de los siguientes genes para eliminar las rutas competidoras que limitan la producción de isobutanol: pflB, dado como sec. con núm. de ident. : 71, (que codifica para piruvato formato liasa) IdhA, dado como sec. con núm. de ident núm.: 73, (que codifica para lactato deshidrogenasa) , adhE, dado como sec . con núm. de ident.: 77, (que codifica para alcohol deshidrogenasa), y al menos un gen que comprende el operón frdABCD (que codifica para fumarato reductasa) , específicamente, frdA, dado como sec. con núm. de ident.: 90, fróB, dado como sec. con núm. de ident.: 75, frdC, dado como sec. con núm. de ident.: 92, y frdD, dado como sec. con núm. de ident.: 94.

La cepa de Saccharo yces cerevisiae podría comprender: una ruta biosintética de isobutanol codificada por los siguientes genes: región codificante de alsS de Bacillus subtilis (sec. con núm. de ident. :11) que codifica acetolactato sintasa (sec. con núm. de ident. :12), ILV5 de S. cerevisiae (sec. con núm. de ident. :13) que codifica acetohidroxi ácido reductoisomerasa (KARI; sec. con núm. de ident.: 14) y/o una KARI mutante tal como la codificada por Pf5. IlvC-Z4B8 (sec. con núm. de ident.: 15; proteína con sec. con núm. de ident.: 16), ilvD de Streptococcus mutans (sec. con núm. de ident.: 17) que codifica acetohidroxi ácido deshidratasa (sec. con núm. de ident.: 18), kivD de Bacillus subtilis (secuencia codificada por codones dada como sec. con núm. de ident.: 19) que codifica la ceto ácido decarboxilasa de cadena ramificada (sec. con núm. de ident. :20) y sadB de Achromobacter xylosoxidans (sec. con núm. de ident.: 9) que codifica una butanol deshidrogenasa (sec. con núm. de ident.:10) . Las enzimas codificadas por los genes de la ruta biosintética de isobutanol catalizan las conversiones de sustrato en producto para convertir piruvato en isobutanol, como se describe en la presente invención. Se contempla que podrían construirse cepas adecuadas que comprendan una secuencia con al menos aproximadamente 70-75 % de identidad, al menos aproximadamente 75-80 %, al menos aproximadamente 80-85 % de identidad o al menos aproximadamente 85-95 % de identidad con las secuencias de proteínas descritas en la presente invención.

En la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/477,942 se describe una cepa de levadura que expresa una ruta de isobutanol con actividad de acetolactato sintasa (ALS) en el citosol y las deleciones de los genes de piruvato decarboxilasa (PDC) endógenos. Se ha descubierto que esta combinación de ALS citosólica y expresión reducida de PDC aumenta mucho el flujo de piruvato en acetolactato, el cual fluye, después, a la ruta para la producción de isobutanol. Una cepa de Saccharomyces cerevisiae recombinante así pude construirse mediante el uso de métodos conocidos en la técnica y/o descritos en la presente invención. Otras cepas de levadura adecuadas se conocen en la técnica. Se proporcionan ejemplos adicionales en las solicitudes provisionales de los Estados Unidos núm. 61/379546, 61/380563 y la solicitud de los Estados Unidos núm. de serie: 12/893089.

Las modificaciones adicionales para microorganismos en conjunto con los procesos proporcionados en la presente invención incluyen modificaciones para reducir la actividad de la glicerol-3-fosfato deshidrogenasa, como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20090305363, modificaciones a una célula huésped que proporciona aumento en el flujo de carbono a través de una ruta de Entner-Doudoroff o el equilibrio de equivalentes reductores, como se describe en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20100120105. Las cepas de levadura con actividad aumentada de proteínas heterólogas que requieren la unión de un agrupamiento Fe-S para su actividad se describen en la publicación de la solicitud de patente los Estados Unidos núm. 20100081179. Otras modificaciones incluyen modificaciones en un polinucleótido endógeno que codifica un polipéptido con actividad de hexocinasa de doble rol, descritas en la solicitud de provisional de los Estados Unidos núm. 61/290,639, integración de al menos un polinucleótido que codifica un polipéptido que cataliza una etapa en una ruta biosintética que usa piruvato descrita en la solicitud provisional de los Estados Unidos núm. 61/380563.

Adicionalmente, las células huésped que comprenden al menos una deleción, una mutación y/o una sustitución en un gen endógeno que codifica un polipéptido que afecta la biosíntesis del agrupamiento de Fe-S se describen en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 61/305333, y las células huéspedes que comprenden un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de fosfocetolasa y células huésped que comprenden un polinucleótido heterólogo que codifica un polipéptido con actividad de fosfotransacetilasa se describen en la solicitud de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/356379.

Construcción de una cepa de levadura adecuada La NGI-049 es un ejemplo de una cepa adecuada de Saecharomyees cerevisiae . La NGI-049 es una cepa con inserción-desactivación de los genes PDC1 , PDC5 y PDC6 endógenos, y que contiene los vectores de expresión pLH475-Z4B8 y pLH468. Los genes PDC1, PDC5 y PDC6 codifican las tres mayores isozimas de piruvato decarboxilasa . La cepa expresa genes que codifican enzimas para una ruta biosintética de isobutanol, que se integran sobre plásmidos . En la presente invención se proporciona la construcción de la cepa NGI-049.

La actividad de piruvato decarboxilasa endógena en levadura convierte piruvato en acetaldehído, el cual, después, se convierte en etanol o en acetil-CoA a través de acetato. Por lo tanto, la actividad de piruvato decarboxilasa endógena es un objetivo para la reducción o eliminación de la formación de subproductos.

Se han informado ejemplos de otras cepas de levadura con actividad de piruvato decarboxilasa reducida debido a la interrupción de la piruvato decarboxilasa que codifica genes, tal como para Saccharomyces en Flikweert et al. (Yeast (1996) 12:247-257), para Kluyverowyces en Bianchi et al. (Mol. Microbiol . (1996) 19(l):27-36) e interrupción del gen regulador en Hohmann, (Mol Gen Genet. 241:657-666 (1993) ) . Las cepas de Saccharomyces que no tienen actividad de piruvato decarboxilasa se encuentran disponibles del ATCC (núm. de acceso 200027 y 200028) .

Construcción del cásete de integración pdc6 : : GPMpl-sadB y supresión de PDC6 : Un cásete de integración pdc6: : GPMl - sadB-ADH1 t- URA3r se elaboró al unir el segmento GPM- sadB-ADHt (sec. con nüm. de ident.:21) de pRS425: :GPM-sadB (sec. con núm. de ident.: 63) al gen URA3x de pUC19-URA3r. El pUCl9-URA3r (sec. con núm. de ident. :22) contiene el marcador URA3 de pRS426 (ATCC núm. 77107) flanqueado por secuencias de repetición homologas de 75 pb para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador URA3. Los dos segmentos de ADN se unieron por SOE PCR (como lo describió Horton et al. (1989) Gene 77:61-68) mediante el uso como plantilla de los ADN de pRS425: : GPM-sadB y del plásmido pUC19-URA3r, con Phusion ADN polimerasa (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; núm. de catálogo F-540S) y los iniciadores 114117-11A a 114117-11D (sec. con núms . de ident.:23, 24, 25 y 26), y 114117-13A y 114117-13B (sec. con núms. de ident.:27 y 28).

Los iniciadores externos para la SOE PCR (114117-13A y 114117 -13B) contenían regiones 5' y 3' de -50 pb homologas a regiones corriente arriba y dirección 3' del promotor y el terminador PDC6, respectivamente. El fragmento de PCR del cásete completo se transformó en BY4700 (ATCC núm. 200866) y los transformantes se mantuvieron en medio completo sintético sin uracilo y complementado con 2 % de glucosa a 30 °C mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pág. 201-202) . Los transformantes se analizaron por PCR mediante el uso de los iniciadores 112590-34G y 112590-34H (sec. con núms. de ident.:30 y 31) , y 112590-34F y 112590-49E (sec. con núms. de ident. : 29 y 32) para verificar la integración en el locus de PDC6 con deleción de la región codificante de PDC6. El marcador URA3r se recicló al sembrarlo en placas sobre medio completo sintético complementado con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C siguiendo protocolos estándar. La eliminación del marcador se confirmó al parchar colonias de las placas de 5-FOA sobre medio SD-URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante tiene el genotipo: BY4700 pdc6 : : PGPMI- sadB-ADHlt .

Construcción del cásete de integración pdcl : : PDCl-ilvD y supresión de PDC1: Un cásete de integración pdcl : : PDClp- ilvD-FBAlt-URA3r se elaboró al unir el segmento ilvD-FBAlt (sec. con núm. de ident.:33) de pLH468 al gen URA3r de pUC19-URA3r por SOE PCR (como lo describió Horton et al. (1989) Gene 77:61-68) mediante el uso como plantilla de los ADN de pLH468 y el plásmido pUC19-URA3r con Phusion ADN-polimerasa . (New England Biolabs Inc., Beverly, MA; núm. de catálogo F-540S) y los iniciadores 114117-27A a 114117-27D (sec. con núms. de ident.:34, 35, 36 y 37).

Los iniciadores externos para la SOE PCR (114117-27A y 114117-27D) contenían regiones 5' y 3' de -50 pb homologas a las regiones dirección 3' del promotor PDC1 y dirección 3' de la secuencia codificante PDC1. El fragmento de PCR del cásete completo se transformó en BY4700 pdc6: :PGPMI~ sadB-ADHlt y los transformantes se mantuvieron en medio completo sintético sin uracilo y complementado con 2 % de glucosa a 30 °C mediante el uso de técnicas genéticas estándar [Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pág. 201-202) . Los transformantes se analizaron por PCR i mediante el uso de los iniciadores 114117-36D y 135 (sec. con núms. de ident . 38 y 39), y los iniciadores 112590-49E y 112590-30F (sec. con núms. de ident . 32 y 40) para verificar la integración en el locus PDC1 con deleción de la secuencia codificante PDC1. El marcador URA3r se recicló al sembrar en placas sobre medio completo sintético complementado con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C por medio de seguir protocolos estándar. Se confirmó la eliminación del marcador al parchar colonias de las placas de 5-FOA sobre medio SD -URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante "NYLA67" tiene el genotipo: BY4700 pdc6::GPMlp-sadB-ADH11 pdcl ; : PDClp-HvD-FBA11.

Supresión de HIS3 A fin de eliminar la región codificante HIS3 endógena, se amplificó por PCR un cásete his3::URA3r2 del ADN de la plantilla URA3r2 (sec. con núm. de ident.; 41). El URA3r2 contiene el marcador URA3 de pRS426 (ATCC # 77107) flanqueado por secuencias de repetición de 500 pb homologas para permitir la recombinación homologa in vivo y la eliminación del marcador C7RA3. La PCR se realizó mediante el uso de Phusion ADN polimerasa y los iniciadores 114117-45A y 114117-45B (sec. con núms. de ident.: 42 y 43), los cuales generaron un producto de PCR de -2.3 kb. La porción HIS3 de cada iniciador se derivó de la región dirección 5' del promotor HIS3 y la región dirección 3' de la región codificante de manera que la integración del marcador URA3r2 resulte en el reemplazo de la región codificante HIS3. El producto de PCR se transformó en NYLA67 mediante el uso de técnicas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pág. 201-202) y los transformantes se seleccionaron en medio completo sintético sin uracilo y complementado con 2 % de glucosa a 30 °C. Los transformantes se analizaron para verificar la integración correcta mediante el sembrado réplica de transformantes en medio completo sin histidina y complementado con 2 % de glucosa a 30 °C. El marcador URA3r se recicló al sembrar en placas en medio completo sintético complementado con 2 % de glucosa y 5-FOA a 30 °C siguiendo protocolos estándar. La eliminación del marcador se confirmó al parchar colonias de las placas de 5-FOA sobre medio SD -URA para verificar la ausencia de crecimiento. La cepa identificada resultante "NYLA73" tiene el genotipo: BY4700 pdc6: : GPMlp-sadB-ADHlt pdcl : : PDClp-ilvD-FBAlt Ahis3. Construcción del cásete de integración pdc5::kan X y supresión de PDC5 : Se amplificó por PCR un cásete pdc5::kanMX4 a partir de ADN cromosómico de la cepa YLR134 (ATCC núm. 4034091) mediante el uso de Phusion ADN polimerasa y los iniciadores PDC5::Kan XF y PDC5 : : KanMXR (sec. con núm. de ident.:44 y 45) que generó un producto de PCR de -2.2 kb. La porción PDC5 de cada iniciador se derivó de la región dirección 5 ' del promotor PDC5 y la región dirección 3' de la región codificante, de manera que la integración del marcador kanMX resulta en el reemplazo de la región codificante PDC5. El producto de PCR se transformó en NYLA73 mediante el uso de técnicas genéticas estándar (Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Y, pág. 201-202) y se seleccionaron transformantes en medio YP complementado con 1 % de etanol y geneticina (200 g/mL) a 30 °C. Los transformantes se analizaron por PCR para verificar la integración correcta en el locus PDC con reemplazo de la región codificante PDC5 mediante el uso de los iniciadores PDC5kofor y N175 (sec. con núm. de ident. : 46 y 47) . Los transformantes correctos identificados tienen el genotipo: BY4700 pdc6: :GPMlp-sadB-ADHlt pdcl: :PDClp-ilvD-FBAl t Ahis3 pdc5 : :kanMX4.

Construcción de pLH475-Z4B8 El plásmido pLH475-Z4B8 (sec. con núm. de ident. :48) se construyó para la expresión de ALS y KARI en levadura. El PLH475-Z4B8 es un vector pHR81 (ATCC núm. 87541) que contiene los siguientes genes quiméricos: 1) El promotor CUP1 (sec. con núm. de ident.: 49), región codificante de acetolactato sintasa de Bacillus subtilis (AlsS; sec. con núm. de ident.: 11; proteína sec. con núm. de ident.: 12) y terminador CYC1 (CYC1-2; sec. con núm. de ident.: 50); 2) un promotor ILV5 (sec. con núm. de ident. :51), región codificante Pf5. IlvC-Z4B8 (sec. con núm. de ident.: 15; proteína sec. con núm. de ident.: 16) y terminador ILV5 (sec. con núm. de ident.:52); y 3) el promotor FBA1 (sec. con núm. de ident.:53), región codificante de KARI de S. cerevisiae {ILV5; sec. con núm. de ident . : 13; proteína sec. con núm. de ident.: 14) y terminador CYC1 (sec. con núm. de ident. : 54) .

La región codificante Pf5. IlvC-Z4B8 es una secuencia que codifica KARI derivada de Pseudomonas fluorescens, pero que contiene mutaciones, que se describió en la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US20090163376. La KARI codificada por Pf5. IlvC-Z4B8 (sec. con núm. de ident.: 16) tiene los siguientes cambios de aminoácidos comparada con la KARI natural de Pseudomonas fluorescens: C33L: la cisteína en la posición 33 cambió a leucina, R47Y: la arginina en la posición 47 cambió a tirosina, S50A: la serina en la posición 50 cambió a alanina, T52D: la treonina en la posición 52 cambió a asparagina, V53A: la valina en la posición 53 cambió a alanina, L61F: la leucina en la posición 61 cambió a fenilalanina, T80I: la treonina en la posición 80 cambió a isoleucina, A156V: la alanina en la posición 156 cambió a treonina, y G170A: la glicina en la posición 170 cambió a alanina.

La región codificante Pf5. IlvC-Z4B8 se sintetizó mediante DNA 2.0 (Palo Alto, CA; sec. con núm. de ident. :15) sobre la base de codones que se optimizaron para la expresión en Saccharomyces cerevisiae .

Vector de expresión pLH 68 El plásmido pLH468 (sec. con núm. de ident . : 55) se construyó para la expresión de DHAD, KivD y HADH en levadura.

Las regiones codificantes para cetoisovalerato decarboxilasa (KivD) de B. subtilis y alcohol deshidrogenasa de hígado de caballo (HADH) se sintetizaron por DNA2.0 sobre la base de codones que se optimizaron para la expresión en Sacc aromyces cerevisiae (sec. con núm. de ident. :19 y 56, respectivamente) y se proporcionaron en los plásmidos pKivDy-DNA2.0 y pHadhy-DNA2.0. Las proteínas codificadas son las sec. con núm. de ident.: 20 y 57, respectivamente. Se construyeron los vectores de expresión individuales para KivD y HADH. Para ensamblar pLH467 (pRS426 : : PQPD -kivDy-GPDlt. ) , se digirió el vector pNY8 (sec. con núm. de ident.: 58; denominado, además, pRS426. GPD-ald-GPDt , descrito en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US20080182308 , Ejemplo 17) con las enzimas AscI y Sfil, y se eliminó, así, el promotor GPD1 (sec. con núm. de ident. : 59) y la región codificante ald. Un fragmento del promotor GPD1 (GPD1-2; sec. con núm. de ident. : 60) de p Y8 se amplificó por PCR para adicionar un sitio AscI en el extremo 5' y un sitio Spel en el extremo 3', mediante el uso del iniciador 5' OT1068 y el iniciador 3' OT1067 (sec. con núm. de ident.: 61 y 62). El fragmento del vector pNY8 digerido de Ascl/Sfil se ligó con el producto de PCR del promotor GPD1 digerido con AscI y Spel, y el fragmento Spel-Sfil que contiene la región codificante kivD optimizada por codones aislada del vector pKivD-DNA2.0. La ligadura triple generó el vector pLH467 (pRS426 : : VGPD1-kivDy-GPDlt) . El pLH467 se verificó por mapeo de restricción y secuenciación. pLH435 (pRS425 : : PGPm-Hadhy-ADfílt) se derivó del vector pRS425 : :GPM-sadB (sec. con núm. de ident.:63), el cual se describió en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/477942, Ejemplo 3. El pRS425 : : GPM-sadB es el vector pRS425 (ATCC núm. 77106) con un gen quimérico que contiene el promotor GPM1 (sec. con núm. de ident.:64), la región codificante de una butanol deshidrogenasa de Achromobacter xylosoxidans (sadB; sec. con núm. de ident . : 9; proteína sec. con núm. de ident.: 10: descrita en la publicación de solicitud de patente de los Estados Unidos núm. US20090269823 ) , y el terminador ADH1 (sec. con núm. de ident.: 65). El pRS425 : : GPMp-sadB contiene sitios Bbvl y PacJ en los extremos 5' y 3' de la región codificante sadB, respectivamente. Un sitio Nhel se adicionó en el extremo 5' de la región codificante sadB por mutagénesis dirigida al sitio mediante el uso de los iniciadores OT1074 y OT1075 (sec. con núm. de ident. :66 y 67) para generar el vector pRS425-GPMp-sadB-NheI , el cual se amplificó por secuenciación. El pRS425 :: PGPMI-sadB-Nhel se digirió con Nhel y Pací para desprender la región codificante sadB y se ligó con el fragmento Nhel-PacI que contiene la región codificante HADH optimizada por codones del vector pHadhy-DNA2. O para crear pLH435.

Para combinar los casetes de expresión KivD y HADH en un único vector, el vector de levadura pRS411 (ATCC núm. 87474) se digirió con SacI y Notl, y se ligó con el fragmento Sacl-Salí de pLH467 que contiene el cásete PGPD1-kivDy-GPDlt junto con el fragmento Sall-Notl de pLH435 que contiene el cásete ?s???-Hadhy-ADHlt en una reacción de ligadura triple. Esto proporcionó el vector pRS411 : : PGPIJ1-&iv y-PGi>MI-Had.hy (pLH441) , lo cual se verificó por mapeo de restricción.

A fin de generar un vector de coexpresión para los tres genes en la ruta de isobutanol inferior: ilvD, kivDy Hadhy, se usó pRS423 FBA ilvD(Strep) (sec. con núm. de ident.:68), que se describe en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/569636 como la fuente del gen IlvD. Este vector transportador contiene un origen de replicación Fl (nt 1423 a 1879) para el mantenimiento en E. coli y un origen de 2 micrones (nt 8082 a 9426) para la replicación en levadura. El vector tiene un promotor FBA (nt 2111 a 3108; sec. con núm. de ident . : 53) y el terminador FBA (nt 4861 a 5860; sec. con núm. de ident.: 69) . Adicionalmente, porta el marcador His (nt 504 a 1163) para la selección en levadura y el marcador con resistencia a la ampicilina (nt 7092 a 7949) para la selección en E. coli. La región codificante ilvD (nt 3116 a 4828; sec. con núm. de ident.: 17; proteína sec. con núm. de ident.: 18) de Streptococcus mutans UA159 (ATCC núm. 700610) está entre el promotor FBA y el terminador FBA que forma un gen quimérico para la expresión. Adicionalmente, existe una etiqueta lumio fusionada con la región codificante ilvD (nt 4829-4849) .

La primera etapa fue linealizar pRS423 FBA ilvD(Strep) (denominado, además, pRS423 -FBA (Spel) -IlvD (Streptococcus mutans) -Lumio) con SacI y SacII (con el sitio SacII con extremo romo mediante el uso de T4 ADN polimerasa) , para dar un vector con la longitud total de 9,482 pb. La segunda etapa fue aislar el cásete kivDy-hADHy de pLH441 con SacI y Kpnl (con . el sitio Kpnl con extremo romo mediante el uso de T4 ADN polimerasa) , lo que da un fragmento de 6,063 pb. Este fragmento se ligó con el fragmento del vector de 9,482 pb de pRS423- FBA (Spel) -IlvD (Streptococcus mutans) -Lumio . Esto generó el vector pLH468 (pRS423 : : PFBAI~ ilvD (Strep) Lumio-FBAlt-PGPD!-kivDy-GPDlt-VGPM!-hadhy-ADHlt) , lo cual se confirmó por mapeo de restricción y secuenciación.

Los vectores plasmídicos pLH468 y pLH475-24B8 se transformaron simultáneamente en la cepa BY4700 pdc6 : :GPMlp-sadB-ADHlt pdcl : : PDClTp- ilvD-FBAlt Ahis3 pdc5: :kanMX4 mediante el uso de técnicas genéticas estándar {Methods in Yeast Genetics, 2005, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY) y la cepa resultante se mantuvo en medio completo sintético, sin histidina ni uracilo, y complementado con 1 % de etanol a 30 °C. La cepa resultante se denominó NGI-049.

Agentes extractantes orgánicos El agente extractante es una mezcla de solventes o un solvente orgánico inmiscible en agua que tiene características que lo hacen útil para la extracción de butanol a partir de un caldo de fermentación. Un agente extractante adecuado debería cumplir con los criterios para un solvente ideal para una fermentación extractiva de dos fases para la producción o la recuperación de butanol. Específicamente, el agente extractante debería (i) ser biocompatible con los microorganismos, por ejemplo Escherichia coli, Lactobacillus plantaru y Saccharo yces cerevisiae, (ii) ser sustancialmente inmiscible con el medio de fermentación, (iii) tener un coeficiente de partición (KP) alto para la extracción de butanol, (iv) tener un coeficiente de partición inferior para la extracción de nutrientes, (v) tener una tendencia baja a formar emulsiones con el medio de fermentación, y (vi) ser económico y no riesgoso. Adicionalmente, para una mejor operabilidad del proceso y una mejor economía, el agente extractante debería (vii) tener una viscosidad baja (µ) , (viii) tener una densidad baja (r) en comparación con el medio de fermentación acuoso, y (ix) tener un punto de ebullición adecuado para la separación dirección 3' del agente extractante y el butanol.

En una modalidad, el agente extractante podría ser biocompatible con el microorganismo, es decir, no tóxico para el microorganismo o tóxico solamente a un grado tal que el microorganismo se deteriore a un grado aceptable, de manera que el microorganismo siga produciendo el producto de butanol en el medio de fermentación. El grado de biocompatibilidad de un agente extractante puede determinarse mediante el índice del uso de glucosa del microorganismo en presencia del agente extractante y el producto de butanol, según se mide bajo condiciones de fermentación definidas. Véase, por ejemplo, los ejemplos en las solicitudes de patente provisional de los Estados Unidos núm. 61/168,640; 61/168,642; y 61/168,645. Si bien un agente extractante biocompatible permite que el microorganismo use glucosa, un agente extractante no biocompatible no permite que el microorganismo use glucosa a un Indice mayor que, por ejemplo, 25 % del índice cuando el agente extractante no está presente. Dado que la presencia del butanol producto de la fermentación puede afectar la sensibilidad del microorganismo al agente extractante, el producto de la fermentación debería estar presente durante la prueba de biocompatibilidad del agente extractante. La presencia de productos de fermentación adicionales, por ejemplo, etanol, podría afectar de manera similar la biocompatibilidad del agente extractante. Se desea el uso de un agente extractante biocompatible para los procesos en los cuales se desea la producción continua de butanol después de contactar el caldo de fermentación que comprende el microorganismo con un agente extractante orgánico.

En una modalidad, el agente extractante podría seleccionarse del grupo que consiste en alcoholes grasos de C7 a C22, ácidos grasos de C7 a C22/ esteres de ácidos grasos de C7 a C22, aldehidos grasos de C7 a C22; amidas grasas de C7 a C22/ y mezclas de estos. Los ejemplos de los agentes extractantes adecuados incluyen un agente extractante que comprende al menos un solvente seleccionado del grupo que consiste en alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol estearílico, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, aldehido láurico, 1-nonanol, 1-decanol, 1-undecanol, 2-undecanol, 1-nonanal, 2-butiloctanol , ácido 2-butil-octanoico y mezclas de estos. En modalidades, el agente extractante comprende un alcohol saturado de cadena ramificada, por ejemplo, 2-butiloctanol, disponible comercialmente como ISOFAL® 12 (Sasol, Houston, TX) o Jarcol 1-12 (Jarchem Industries, Inc., Newark, NJ) . En modalidades, el agente extractante comprende un ácido carboxílico de cadena ramificada, por ejemplo, ácido 2-butil-octanoico, ácido 2-hexil-decanoico o ácido 2 -decil-tetradecanoico, disponible comercialmente como ISOCARB® 12, ISOCARB® 16 e ISOCARB® 24, respectivamente (Sasol, Houston, TX) .

En una modalidad, un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua podría seleccionarse del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de Ci2 a C22, ésteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de Ci2 a C22, amidas grasas de Ci2 a C22/ y mezclas de estos. Los primeros agentes extractantes adecuados podrían seleccionarse, además, del grupo que consiste en alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico denominado, además, 1-dodecanol, alcohol miristílico, alcohol estearílico, ácido oleico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, aldehido láurico, y mezclas de estos. En una modalidad, el agente extractante podría comprender alcohol oleílico.

En una modalidad, un segundo agente extractante orgánico opcional inmiscible en agua podría seleccionarse del grupo que consiste en alcoholes grasos de C7 a C22, ácidos carboxílieos grasos de C7 a · C22/ ésteres de ácidos carboxílieos grasos de C7 a C22, aldehidos grasos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22, y mezclas de estos. Los segundos agentes extractantes adecuados podrían seleccionarse, además, del grupo que consiste en 1-nonanol, 1-decanol, 1-undecanol, 2-undecanol, 1-nonanal, y mezclas de estos. En una modalidad, el segundo agente extractante comprende 1-decanol.

En una modalidad, el primer agente extractante comprende alcohol oleílico y el segundo agente extractante comprende 1-decanol.

Cuando se usan un primer y un segundo agentes extractantes, las cantidades relativas de cada uno pueden variar dentro de un intervalo adecuado. Por ejemplo, el primer agente extractante podría usarse en una cantidad, la cual es aproximadamente 30 por ciento a aproximadamente 90 por ciento, o aproximadamente 40 por ciento a aproximadamente 80 por ciento, o aproximadamente 45 por ciento a aproximadamente 75 por ciento, o aproximadamente 50 por ciento a aproximadamente 70 por ciento del volumen combinado del primer y el segundo agentes extractantes. El intervalo óptimo refleja maximización de las características del agente extractante, por ejemplo, equilibrar un coeficiente de partición relativamente alto para butanol con un nivel aceptable de biocompatibilidad. Para una fermentación extractiva de dos fases para la producción o la recuperación de butanol, la temperatura, el tiempo de contacto, la concentración de butanol en el medio de fermentación, las cantidades relativas de agente extractante y medio de fermentación, el agente extractante y el medio de fermentación específicos usados, las cantidades relativas del primer y segundo agentes extractantes, la presencia de otros solutos orgánicos, la presencia y la concentración de electrolitos, y la cantidad y el tipo de microorganismo están relacionados. Por lo tanto, estas variables podrían ajustarse como sea necesario dentro de los límites adecuados para optimizar el proceso de extracción como se describe en la presente invención.

Los agentes extractantes adecuados podrían estar disponibles comercialmente de varias fuentes, tales como Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) , en varios grados, muchos de los cuales podrían ser adecuados para usarse en la fermentación extractiva para producir o recuperar butanol. Los grados técnicos de un solvente pueden contener una mezcla de compuestos, que incluyen el componente deseado y componentes de pesos moleculares inferiores y superiores. Por ejemplo, un alcohol oleílico de grado técnico adecuado disponible comercialmente contiene aproximadamente 65 % de alcohol oleílico y una mezcla de alcoholes grasos inferiores y superiores.

Electrolito De conformidad con el presente método, el medio de fermentación contiene al menos un electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol en comparación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal . El electrolito podría comprender una o más de las sales contenidas en el medio de fermentación basal, en cuyo caso el electrolito se encuentra presente a una concentración superior a aquel de la concentración de las sales totales contenidas en el medio de fermentación basal. El electrolito podría comprender una o más sales que no están presentes en el medio de fermentación basal. El medio de fermentación basal podría contener, por ejemplo, sales de fosfato, magnesio y/o amonio y, generalmente, se adapta a un microorganismo específico. Las composiciones sugeridas de medios de fermentación basal podrían encontrarse en el manual Difco™ & BBL™ (Becton Dickinson and Company, Sparks, D 21152, Estados Unidos) . Generalmente, las sales proporcionadas por elementos traza podrían ignorarse en el cálculo de la concentración total de sal del medio de fermentación basal debido a sus concentraciones extremadamente bajas.

El electrolito podría comprender una sal que se disocia en el medio de fermentación, o en la fase acuosa de un medio de fermentación bifásico, para formar iones libres. Por ejemplo, el electrolito podría comprender una sal con un catión seleccionado del grupo que consiste en litio> sodio, potasio, rubidio, cesio, magnesio, calcio, estroncio, bario, amonio, fosfonio, y combinaciones de estos. Por ejemplo, el electrolito podría comprender una sal con un anión seleccionado del grupo que consiste en sulfato, carbonato, acetato, citrato, lactato, fosfato, fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, y combinaciones de estos. El electrolito podría seleccionarse del grupo que consiste en sulfato de sodio, cloruro de sodio, y combinaciones de estos.

El electrolito podría estar disponible comercialmente de varias fuentes, tales como Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) , en varios grados, muchos de los cuales podrían ser adecuados i para usarse en fermentación extractiva para producir o recuperar butanol mediante los métodos descritos en la presente invención. El electrolito podría recuperarse mediante métodos conocidos en la técnica a partir de un medio de fermentación o a partir de una fase acuosa formada al poner en contacto el medio de fermentación con un agente extractante, u otros métodos físicos o químicos, tales como precipitación, cristalización y/o evaporación. El electrolito recuperado podría usarse en una fermentación subsiguiente.

La cantidad de electrolito necesario para lograr una concentración en el medio de fermentación al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol comparado con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal puede determinarse como se describe, por ejemplo, mediante los procedimientos de los ejemplos que figuran más abajo. El intervalo de concentraciones de electrolito que tiene un efecto positivo sobre el coeficiente de partición se determina, por ejemplo, por experimentación. También se determina el intervalo de concentraciones de electrolito, el cual demuestra biocompatibilidad aceptable con el microorganismo de interés. El intervalo de concentraciones de electrolito adecuadas se selecciona, después, de la superposición de estos dos intervalos, de manera que la cantidad de electrolito requerida para tener un efecto positivo sobre el coeficiente de partición del butanol se equilibra con el intervalo de concentración que proporciona un nivel aceptable de biocompatibilidad con el microorganismo.

Las consideraciones económicas también podrían ser un factor en la selección de la cantidad de osmolito a usarse.

En una modalidad, el electrolito podría estar presente en el medio de fermentación a una concentración que es biocompatible con el microorganismo, es decir, no tóxica para el microorganismo o tóxica solamente a un grado tal que el microorganismo siga produciendo el producto de butanol en el medio de fermentación en presencia del electrolito. El grado de biocompatibilidad de un electrolito puede determinarse mediante el índice de crecimiento del microorganismo en presencia de distintas concentraciones del electrolito, como se describe en el Ejemplo 2 más abajo. Si bien una concentración de electrolito biocompatible permite que el microorganismo use glucosa (u otra fuente de carbono) o crezca a una velocidad mayor que, por ejemplo, aproximadamente 25 % del índice de crecimiento cuando la cantidad excesiva de electrolito no está presente. La presencia de productos de fermentación, por ejemplo, butanol, podría afectar, además, los intervalos de concentración del electrolito que tienen biocompatibilidad con el microorganismo. Se desea usar un electrolito dentro de intervalos de concentración que tienen biocompatibilidad para procesos en los cuales la producción continua de butanol es necesaria después de contactar el medio de fermentación que comprende el microorganismo con el electrolito. En procesos en los cuales no se requiere la producción continua de butanol después de contactar el medio de fermentación que comprende el microorganismo con el electrolito, podría usarse un electrolito en intervalos de concentración que tienen poca biocompatibilidad, o ninguna, con el microorganismo.

Para lograr en el medio de fermentación una concentración de electrolito que sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición del butanol comparado con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal, el electrolito podría adicionarse al medio de fermentación o a la fase acuosa de un medio de fermentación bifásico durante la fase de crecimiento del microorganismo, durante la fase de producción del butanol, cuando la concentración de butanol es inhibidora, o a combinaciones de estos. El electrolito podría adicionarse al primer agente extractante, al segundo agente extractante, o a combinaciones de estos. El electrolito podría adicionarse como un sólido, como una suspensión, o como una solución acuosa. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse al medio de fermentación y al/los agente/s extractante/s . El electrolito podría adicionarse de una forma continua, semicontinua o por lotes. El electrolito podría adicionarse a la totalidad de la corriente a la cual se introduce, por ejemplo, a la totalidad del medio de fermentación en un termentador, o a una corriente parcial tomada de uno o más recipientes, por ejemplo, a una corriente parcial tomada de un fermentador.

En modalidades, la concentración total de electrolito en el medio de fermentación es mayor que aproximadamente 0.05 M, 0.1 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.7 M, 0.8 M o 1 M. En algunas modalidades, la concentración de electrolito en la fermentación es menor que aproximadamente 1M y, en algunas modalidades, la concentración de electrolito en la fermentación es menor que 2 M.

Fermentación El microorganismo podría cultivarse en un medio de fermentación adecuado en un termentador adecuado para producir butanol . Podría usarse cualquier termentador adecuado, que incluye un termentador de tanque agitado, un termentador con dispositivo de elevación de aire, un termentador de burbujas, o cualquier combinación de estos. Los materiales y los métodos para el mantenimiento y el crecimiento de cultivos microbianos son muy conocidos para aquellas personas con experiencia en la técnica de la microbiología o de la ciencia de la fermentación (véase, por ejemplo, Bailey et al., Bioche ical Engineering Fundamentáis, segunda edición, McGraw Hill, Nueva York, 1986) . Debe considerarse el medio de fermentación adecuado, el pH, la temperatura y los requerimientos para condiciones aerobias, microaerobias o anaerobias, dependiendo de los requerimientos específicos del microorganismo, la fermentación y el proceso. El medio de fermentación usado no es crítico, pero debe soportar el crecimiento del microorganismo usado y promover la ruta biosintética necesaria para producir el producto de butanol deseado. Podría usarse un medio de fermentación convencional, que incluye, pero no se limita a, medios complejos que contienen fuentes de nitrógeno orgánico, tales como extracto de levadura o peptona, y al menos una fuente de carbono fermentable; medios mínimos; y medios definidos. Las fuentes de carbono fermentable adecuadas incluyen, pero no se limitan a, monosacáridos , tales como glucosa o fructosa; disacáridos, tales como lactosa o sacarosa; oligosacáridos; polisacáridos , tales como almidón y celulosa; un sustrato de carbono; y mezclas de estos. Adicionalmente a la fuente de carbono adecuada, el medio de fermentación podría contener una fuente de nitrógeno adecuada, tal como una sal de amonio, extracto de levadura o peptona, minerales, sales, cofactores, amortiguadores y otros componentes, conocidos para aquellas persona con experiencia en la técnica (Bailey et al., arriba) . Las condiciones adecuadas para la fermentación extractiva dependen del microorganismo particular usado y una persona con experiencia en la técnica podría determinarlas fácilmente mediante el uso de experimentación de rutina.

Métodos para recuperar butanol mediante el uso de fermentación extractiva con electrolito adicionado El butanol podría recuperarse a partir de un medio de fermentación que contiene butanol, agua, al menos un electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en comparación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal, opcionalmente , al menos una fuente de carbono, y un microorganismo que se ha modificado genéticamente (es decir, por ingeniería genética) para producir butanol a través de una ruta biosintética de al menos una fuente de carbono. Tales microorganismos modificados genéticamente pueden seleccionarse de bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras, e incluyen Escherichia coli, Lactobacillus plantarum y Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo. Una etapa en el proceso es poner en contacto el medio de fermentación con un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua y, opcionalmente, un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. "Poner en contacto" significa que el medio de fermentación y el agente extractante orgánico o sus componentes solventes se ponen en contacto físico en cualquier momento durante el proceso de fermentación. El electrolito podría adicionarse al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional, o a combinaciones de estos. En una modalidad, el medio de fermentación comprende, además, etanol, y la fase orgánica que contiene butanol puede contener etanol.

Cuando se usan un primer y un segundo agentes extractantes, el contacto puede llevarse a cabo con el primer y el segundo agentes extractantes combinados previamente . Por ejemplo, el primer y el segundo agentes extractantes podrían combinarse en un recipiente tal como un tanque de agitación, y los agentes extractantes combinados, después, podrían adicionarse a un recipiente que contiene el medio de fermentación. Alternativamente, el contacto podría llevarse a cabo con el primer y el segundo agentes extractantes combinándose durante el contacto. Por ejemplo, el primer y el segundo agentes extractantes podrían adicionarse por separado a un recipiente, el cual contiene el medio de fermentación. En una modalidad, el contacto del medio de fermentación con el agente extractante orgánico comprende, además, poner en contacto el medio de fermentación con el primer agente extractante antes de poner en contacto el medio de fermentación y el primer agente extractante con el segundo agente extractante. En una modalidad, el contacto con el segundo agente extractante podría llevarse a cabo en el mismo recipiente que el contacto con el primer agente extractante. En una modalidad, el contacto con el segundo agente extractante podría llevarse a cabo en un recipiente diferente del contacto con el primer agente extractante. Por ejemplo, el primer agente extractante podría ponerse en contacto con el medio de fermentación en un recipiente, y los contenidos podrían transferirse a otro recipiente en el cual sucede el contacto con el segundo agente extractante. En estas modalidades, el electrolito podría adicionarse al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo extractante opcional, o a combinaciones de estos.

El agente extractante orgánico podría ponerse en contacto con el medio de fermentación al principio de la fermentación y formar un medio de fermentación bifásico. Alternativamente, el agente extractante orgánico podría ponerse en contacto con el medio de fermentación después de que el microorganismo alcanzó una cantidad de crecimiento deseada, la cual puede determinarse al medir la densidad óptica del cultivo. En una modalidad, el primer agente extractante podría ponerse en contacto con el medio de fermentación en un recipiente, y el segundo agente extractante podría ponerse en contacto con el medio de fermentación y el primer agente extractante en el mismo recipiente. En otra modalidad, el segundo agente extractante podría ponerse en contacto con el medio de fermentación y el primer agente extractante en un recipiente diferente de aquel en el cual el primer agente extractante se pone en contacto con el medio de fermentación. En estas modalidades, el electrolito podría adicionarse al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional, o a combinaciones de estos.

Además, el agente extractante orgánico podría ponerse en contacto con el medio de fermentación en un momento en el que el nivel de butanol en el medio de fermentación alcanza un nivel preseleccionado, por ejemplo, antes de que la concentración de butanol alcance un nivel tóxico o inhibidor. La concentración de butanol podría monitorearse durante la fermentación mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tal como por cromatografía de gas o cromatografía líquida de alto rendimiento. El electrolito podría adicionarse al medio de fermentación antes o después de que la concentración de butanol alcance un nivel tóxico o inhibidor. En modalidades, el agente extractante orgánico comprende ácidos grasos. En modalidades, los procesos descritos en la presente invención pueden usarse en conjunto con los procesos descritos en las solicitudes de patentes provisionales de los Estados Unidos núm. 61/368429 y 61/379546, en donde el butanol se esterifica con un ácido orgánico tal como ácido graso mediante el uso de un catalizador, tal como una lipasa, para formar ésteres de butanol .

La fermentación podría llevarse a cabo bajo condiciones aerobias durante un tiempo suficiente para que el cultivo logre un nivel preseleccionado de crecimiento, según se determinó por la medición de densidad óptica. El electrolito podría adicionarse al cultivo de fermentación antes o después de lograr el nivel de crecimiento preseleccionado. Después, podría adicionarse un inductor para inducir la expresión de la ruta biosintética de butanol en el microorganismo modificado, y las condiciones de fermentación se cambian a condiciones microaerobias o aerobias para estimular la producción de butanol, como se describe en detalle en el Ejemplo 6 de la solicitud de patente de los Estados Unidos nüm. 12/478,389. El agente extractante podría adicionarse después de cambiar a condiciones microaerobias o anaerobias. En una modalidad, el primer agente extractante podría ponerse en contacto con el medio de fermentación antes de que el medio de fermentación y el primer agente extractante entren en contacto con el segundo agente extractante. Por ejemplo, en una proceso de fermentación por lotes, podría permitirse que pase un periodo de tiempo adecuado entre el contacto del medio de fermentación con el primer y el segundo agentes extractantes. En una proceso de fermentación continuo, el contacto del medio de fermentación con el primer agente extractante podría suceder en un recipiente y el contacto de los contenidos de ese recipiente con el segundo agente extractante podría suceder en un segundo recipiente. En estas modalidades, el electrolito podría adicionarse al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional, o a combinaciones de estos.

Después de poner en contacto el medio de fermentación con el agente extractante orgánico en presencia del electrolito, el producto de butanol se divide en el agente extractante orgánico, lo que disminuye la concentración en la fase acuosa que contiene el microorganismo y, de esa manera, limita la exposición del microorganismo de producción al producto de butanol inhibidor. El volumen del agente extractante orgánico a usarse depende de un número de factores que incluyen el volumen del medio de fermentación, el tamaño del fermentador, el coeficiente de partición del agente extractante para el producto de butanol, la concentración de electrolito, y el modo de fermentación elegido, como se describe abajo. El volumen del agente extractante podría ser aproximadamente 3 % a aproximadamente 60 % del volumen operante del fermentador. La relación del agente extractante al medio de fermentación es de aproximadamente 1:20 a aproximadamente 20:1 sobre una base volumen : volumen, por ejemplo, de aproximadamente 1: 15 a aproximadamente 15:1, o de aproximadamente 1:12 a aproximadamente 12 : 1, o de aproximadamente 1 : 10 a aproximadamente 10:1, o de aproximadamente 1:9 a aproximadamente 9:1, o de aproximadamente 1:8 a aproximadamente 8:1.

La cantidad del electrolito a adicionarse depende de un número de factores, que incluyen el efecto del electrolito adicionado sobre las propiedades de crecimiento del microorganismo que produce butanol y el efecto del electrolito adicionado sobre el Kp de butanol en una fermentación de dos fases. La cantidad óptima de electrolito a adicionarse podría depender, además, de la composición del medio de fermentación basal inicial. Una concentración demasiado alta de un electrolito, aunque, posiblemente, aumente el Kp del butanol y disminuya los efectos tóxicos del butanol en el microorganismo, puede ser inhibidora para el microorganismo. Por otro lado, una concentración demasiado baja de electrolito podría no aumentar el Kp de butanol lo suficiente como para disminuir el efecto inhibidor del butanol sobre el microorganismo. Por lo tanto, es necesario encontrar un equilibrio a través de la experimentación para asegurar que el efecto neto de adicionar un exceso de electrolito al medio de fermentación resulte en un aumento general en la velocidad y el título de la producción de butanol. Adicionalmente, se podría modular la biocompatibilidad de las sales al microorganismo mediante la adición de osmoprotectores u osmolitos tanto exógenamente al medio como al modificar genéticamente el microorganismo para producir endógenamente el/los osmolito/s. En modalidades, el Kp se aumenta por aproximadamente 10 %, aproximadamente 20 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 40 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, ^ aproximadamente 100 %, aproximadamente 150 %, o aproximadamente 200 % comparado con el Kp sin electrolito adicionado. En modalidades, el Kp se aumenta por al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 3 veces, al menos aproximadamente 4 veces, al menos aproximadamente 5 veces o al menos aproximadamente 6 veces. En modalidades, la concentración total de electrolito se selecciona para que aumente el Kp por una cantidad a la vez que mantenga el índice de crecimiento del microorganismo a un nivel que sea al menos aproximadamente 25 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 80 % o al menos aproximadamente 90 % del índice de crecimiento en ausencia del electrolito adicionado. En modalidades, la concentración total de electrolito en el medio de fermentación es suficiente para aumentar la velocidad eficaz de producción de butanol por al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 %, al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, o al menos aproximadamente 100 % comparada con el rendimiento eficaz sin electrolito adicionado. En modalidades, la concentración total de electrolito en el medio de fermentación es suficiente para aumentar el título eficaz de butanol por al menos aproximadamente 10 %, al menos aproximadamente 20 %, al menos aproximadamente 30 %, al menos aproximadamente 40 , al menos aproximadamente 50 %, al menos aproximadamente 60 %, al menos aproximadamente 70 %, al menos aproximadamente 80 %, al menos aproximadamente 90 %, o al menos aproximadamente 100 % comparado con el título eficaz sin electrolito adicionado.

En modalidades, la cantidad de electrolito adicionado es suficiente para que resulte en un título eficaz de al menos aproximadamente 7 g/L, al menos aproximadamente 10 g/L, al menos aproximadamente 15 g/L, al menos aproximadamente 20 g/L, al menos aproximadamente 25 g/L, al menos aproximadamente 30 g/L, o al menos aproximadamente 40 g/L. En modalidades, la cantidad de electrolito adicionado es suficiente para que resulte en un título eficaz de al menos aproximadamente 0.12, al menos aproximadamente 0.15, al menos aproximadamente 0.2, al menos aproximadamente 0.25, o al menos aproximadamente 0.3. En modalidades, la cantidad de electrolito adicionado es suficiente para que resulte en una velocidad eficaz de al menos aproximadamente 0.1 g/L/h, al menos aproximadamente 0.15 g/L/h, al menos aproximadamente 0.2 g/L/h, al menos aproximadamente 0.3 g/L/h, al menos aproximadamente 0.4 g/L/h, al menos aproximadamente 0.6 g/L/h, al menos aproximadamente 0.8 g/L/h, al menos aproximadamente 1 g/L/h o al- menos aproximadamente 1.2 g/L/h. En algunas modalidades, la velocidad eficaz es aproximadamente 1.3 g/L/h.

La siguiente etapa es separar, opcionalmente , la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa mediante el uso de métodos conocidos en ¡la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, sifoneo, decantación, centrifugación, uso de un sedimentador que decanta por acción de la gravedad y división de fases asistida por membrana.

La recuperación del butanol de la fase orgánica que contiene butanol podría llevarse a cabo mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, destilación, adsorción por resinas, separación por tamices moleculares y pervaporacion. La fase extractante podría reciclarse para el proceso de producción y/o recuperación de butanol .

El electrolito podría recuperarse del medio de fermentación o de la fase acuosa de una mezcla de dos fases mediante métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la fase acuosa o el medio de fermentación podría concentrarse por destilación, arrastre, pervaporacion u otros métodos para obtener una mezcla acuosa concentrada que comprende el electrolito. Opcionalmente , el electrolito podría regresarse a un medio de fermentación y, así, reciclarse dentro del proceso de fermentación. Opcionalmente, el electrolito obtenido de un medio de fermentación podría adicionarse a un medio de fermentación para proporcionar una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en comparación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal.

Podría usarse arrastre por gas en forma conjunta con el agente extractante orgánico, y la adición de electrolito para eliminar el producto de butanol del medio de fermentación. El arrastre por gas podría llevarse a cabo al pasar un gas tal como aire, nitrógeno o dióxido de carbono a través del medio de fermentación, y así, se forma una fase gaseosa que contiene butanol . El producto de butanol podría recuperarse de la fase gaseosa que contiene butanol mediante métodos conocidos en la técnica, tal como mediante el uso de un condensador de agua fría para condensar el butanol, o al depurar la fase gaseosa con un solvente .

Cualquier butanol que se mantiene en el medio de fermentación después de que se completó el proceso fermentación podría recuperarse por extracción continuada mediante el uso de agente extractante nuevo o fresco. Alternativamente, el butanol puede recuperarse del medio de fermentación mediante el uso de métodos conocidos en la técnica, tal como destilación, destilación azeotrópica, extracción líquido-líquido, adsorción, arrastre por gas, evaporación de membrana, pervaporación, y similares. En el caso donde el medio de fermentación no se recicla al proceso, podría adicionarse electrolito adicional para aumentar más aun el coeficiente de partición de butanol y mejorar la eficacia de la recuperación de butanol.

El método de fermentación extractiva de dos fases podría llevarse a cabo en un modo continuo en un termentador de tanque agitado. En este modo, la mezcla del medio de fermentación y el agente extractante orgánico que contiene butanol se remueve del fermentador. Las dos fases se separan mediante medios conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, sifoneo, decantación, centrifugación, el uso de un sedimentador que decanta por acción de la gravedad, división de fases asistida por membrana, y similares, como se describió anteriormente. Después de la separación, el medio de fermentación y el electrolito en él podrían reciclarse al fermentador o podrían reemplazarse con medio fresco, al cual se adiciona electrolito adicional. Después, el agente extractante se trata para recuperar el producto de butanol para una extracción adicional del producto. Alternativamente, podría adicionarse, continuamente, agente extractante fresco al fermentador para reemplazar el agente extractante removido. Este modo continuo de operación ofrece varias ventajas. Dado que el producto se remueve continuamente del reactor, se requiere un volumen más pequeño de agente extractante, lo que permite que se use un volumen más grande del medio de fermentación. Esto resulta en rendimientos de producción más altos. El volumen del agente extractante orgánico podría ser de aproximadamente 3 % a aproximadamente 50 % del volumen operante del fermentador; 3 % a aproximadamente 20 % del volumen operante del fermentador; o 3 % a aproximadamente 10 % del volumen operante del fermentador. Resulta beneficioso usar la cantidad más pequeña posible de agente extractante en el fermentador para maximizar el volumen de la fase acuosa y, por lo tanto, la cantidad de células en el termentador . El proceso podría operarse en un modo totalmente continuo, en el cual el agente extractante se recicla continuamente entre el termentador y un aparato de fermentación, y el medio de fermentación se remueve continuamente del termentador que se vuelve a cargar con medio fresco. En este modo totalmente continuo, el producto de butanol no se deja alcanzar la concentración tóxica crítica y se proporcionan continuamente nutrientes frescos, de manera que la fermentación podría llevarse a cabo durante largos períodos de tiempo. Los aparatos que podrían usarse para llevar a cabo estos modos de fermentaciones extractivas de dos fases son muy conocidos en la técnica. Los ejemplos se describen, por ejemplo, en la patente de los Estados Unidos núm. 4,865,973 de Kollerup et al.

Podría usarse, además, el modo de fermentación por lotes. La fermentación por lotes, la cual es muy conocida en la técnica, es un sistema cerrado en el cual la composición del medio de fermentación se fija al comienzo de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante el proceso. En este modo, la cantidad deseada de electrolito complementario y un volumen de agente extractante orgánico se adicionan al termentador, y el extractante no se remueve durante el proceso. El agente extractante orgánico podría formarse en el termentador por adición individual del primer agente extractante y el segundo agente extractante opcional, o el primer agente extractante y el segundo agente extractante podrían combinarse para formar el agente extractante antes de la adición de cualquier agente extractante al termentador. El electrolito podría adicionarse al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional, o a combinaciones de estos. Aunque este modo de fermentación es más simple que los modos continuo o totalmente continuo descritos anteriormente, requiere un volumen más grande de agente extractante orgánico para minimizar la concentración del producto de butanol inhibidor en el medio de fermentación. En consecuencia, el volumen del medio de fermentación es menor y la cantidad de producto producida es menor que la obtenida mediante el uso del modo continuo. El volumen de agente extractante orgánico en el modo por lotes podría ser de 20 % a 60 % del volumen operante del termentador,· o 30 % a aproximadamente 60 % del volumen operante del termentador . Resulta beneficioso usar el menor volumen posible de agente extractante en el termentador, por la razón descrita anteriormente.

Podría usarse, además, el modo de fermentación alimentada por lotes. La fermentación alimentada por lotes es una variación del sistema por lotes estándar, en el cual los nutrientes, por ejemplo, glucosa, se adicionan en incrementos durante la fermentación. La cantidad y la velocidad de adición del nutriente podrían determinarse mediante experimentación de rutina. Por ejemplo, la concentración de nutrientes críticos en el medio de fermentación podría monitorearse durante la fermentación. Alternativamente, podrían monitorearse factores más fáciles de medir, tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases residuales, tales como dióxido de carbono. A partir de estos parámetros medidos, podría determinarse el índice de nutrientes . La cantidad de agente extractante orgánico usado y sus métodos de adición en este modo son iguales que los usados en el modo por lotes descrito anteriormente. La cantidad de electrolito adicionado podría ser la misma que en otros modos de fermentación.

La extracción del producto podría hacerse dirección 3' del termentador, mejor que en el lugar. En este modo externo, la extracción del producto de butanol en el agente extractante orgánico se lleva a cabo en el medio de fermentación removido del termentador. El electrolito podría adicionarse al medio de termentador removido del termentador. La cantidad de agente extractante usado es aproximadamente 20 % a aproximadamente 60 % del volumen operante del termentador; o 30 % a aproximadamente 60 % del volumen operante del termentador. El medio de fermentación podría removerse del termentador continua o periódicamente, y la extracción del producto de butanol por el agente extractante orgánico podría llevarse a cabo con o sin la eliminación de las células del medio de fermentación. Las células podrían removerse del medio de fermentación por medios conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, filtración o centrifugación. El electrolito podría adicionarse al medio de fermentación antes o después de la eliminación de las células. Después de la separación del medio de fermentación del agente extractante mediante los medios descritos anteriormente, el medio de fermentación podría reciclarse en el termentador, desecharse o tratarse para la eliminación de cualquiera producto de butanol restante. Similarmente , las células aisladas podrían reciclarse en el termentador. Después del tratamiento para recuperar el producto de butanol, el agente extractante podría reciclarse para usarse en el proceso de extracción. Alternativamente, podría usarse agente extractante fresco. En este modo, el agente extractante no se encuentra presente en el termentador, por lo que la toxicidad del agente extractante no es un problema. Si las células se separan del medio de fermentación antes de entrar en contacto con el agente extractante, el problema de la toxicidad del agente extractante podría reducirse más aún.

Además, mediante el uso de este modo externo, existe menos posibilidades de que se forme una emulsión y se minimiza la evaporación del agente extractante, lo que reduce los problemas ambientales.

Métodos para producir butanol mediante el uso de fermentación extractiva con electrolito adicionado Se proporciona un método mejorado para la producción de butanol, en donde un microorganismo que se ha modificado genéticamente para que produzca butanol mediante una ruta biosintética a partir de al menos una fuente de carbono fermentable se cultiva en un medio de fermentación bifásico, que comprende una fase acuosa y i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua y, opcionalmente, ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua, y el medio de fermentación bifásico comprende, además, al menos un electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol comparado con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal . Tales microorganismos modificados genéticamente pueden seleccionarse de bacterias, cianobacterias, hongos filamentosos y levaduras, e incluyen Escherichia coli, Lactobacill s plantarum y Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo. El primer agente extractante orgánico inmiscible en agua podría seleccionarse del grupo que consiste en alcoholes grasos de CX2 a C22, ácidos grasos de Ci2 a C22, ásteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de Ci2 a C22, amidas grasas de CQL2 a C22, Y mezclas de estos, y el segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua opcional podría seleccionarse del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22/ ácidos carboxílieos de C7 a C22, ásteres de ácidos carboxílieos de C7 a C22, aldehidos de C7 a C22 amidas grasas de C7 a C22 y mezclas de estos, en donde el medio de fermentación bifásico comprende de aproximadamente 10 % a aproximadamente 90 % por volumen del agente extractante orgánico. Alternativamente, el medio de fermentación bifásico podría comprender de aproximadamente 3 % a aproximadamente 60 % por volumen del agente extractante orgánico o de aproximadamente 15 % a aproximadamente 50 %. El microorganismo se cultiva en el medio de fermentación bifásico durante un tiempo suficiente para extraer butanol en el agente extractante para formar una fase orgánica que contiene butanol. La al menos suficiente concentración del electrolito en el medio de fermentación podría alcanzarse al adicionar electrolito a la fase acuosa durante la fase de crecimiento del microorganismo, a la fase acuosa durante la fase de producción de butanol, a la fase acuosa cuando la concentración de butanol en la fase acuosa es inhibidora, al primer agente extractante, al segundo agente extractante, o a combinaciones de estos.

En una modalidad, el medio de fermentación comprende, además, etanol, y la fase orgánica que contiene butanol puede contener etanol . La fase orgánica que contiene butanol se separa, después, de la fase acuosa, como se describió anteriormente. Subsiguientemente, el butanol se recupera de la fase orgánica que contiene butanol, como se describió anteriormente .

Se proporciona, además, un método mejorado para la producción de butanol, en donde un microorganismo que se ha modificado genéticamente para producir butanol a través de una ruta biosintética a partir de al menos una fuente de carbono se cultiva en un medio de fermentación, en donde el microorganismo produce el butanol en el medio de fermentación para producir un medio de fermentación que produce butanol. Tales microorganismos modificados genéticamente pueden seleccionarse de bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras, e incluyen Escherichia coli, Lactobacillus plantarían, y Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo. Al menos un electrolito se adiciona al medio de fermentación para proporcionar el electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol comparado con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal. En una modalidad, el electrolito podría adicionarse al medio de fermentación cuando la fase de producción de butanol está completa. Al menos una porción del medio de fermentación que contiene butanol se pone en contacto con un agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22/ ácidos grasos de C12 a C22, ésteres de ácidos grasos de Ci2 a C22i aldehidos grasos de C12 a C22, amidas grasas de CC12 a C22fy mezclas de estos y, opcionalmente, ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22 ácidos carboxílicos de C7 a C22/ ésteres de ácidos carboxílicos de C7 a C22/ aldehidos de C7 a C22í amidas grasas de CC7 a C22 y mezclas de estos, para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. La fase orgánica que contiene butanol se separa, después, de la^ fase acuosa, como se describió anteriormente. Subsiguientemente, el butanol se recupera de la fase orgánica que contiene butanol, como se describió anteriormente. Al menos una porción de la fase acuosa se regresa al medio de fermentación. En una modalidad, el medio de fermentación comprende, además, etanol, y la fase orgánica que contiene butanol puede contener etanol .

Podría producirse isobutanol por fermentación extractiva con el uso de una cepa modificada de Escherichia coli en conjunto con un alcohol oleílico como el agente extractante orgánico, como se describió en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/478,389. El método produce un título eficaz más alto para isobutanol (es decir, 37 g/L) comparado con el uso de técnicas de fermentación convencionales (véase el Ejemplo 6 de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/478,389). Por ejemplo, Atsumi et al. (Nature 451 (3) : 86-90 , 2008) informan títulos de isobutanol de hasta 22 g/L mediante el uso de fermentación con una Escherichia coli que se modificó genéticamente para que contenga una ruta biosintética de isobutanol. El título de butanol más alto obtenido con el método de fermentación extractiva descrito en la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 12/478,389 resulta, al menos en parte, de la eliminación del producto de butanol tóxico del medio de fermentación, por lo cual mantiene el nivel por debajo de aquel que es tóxico para el microorganismo. Resulta razonable asumir que el presente método de fermentación extractiva que emplea el uso de al menos un electrolito a una concentración en el medio de fermentación al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol comparado con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal, como se definió en la presente descripción, se usaría de una forma similar y proporcionaría resultados similares.

El butanol producido por los métodos descritos en la presente invención podría tener un título eficaz mayor que 22 g por litro del medio de fermentación. Alternativamente, el butanol producido por métodos descritos podría tener un título eficaz de al menos 25 g por litro del medio de fermentación. Alternativamente, el butanol producido por métodos descritos en la presente invención, podría tener un título eficaz de al menos 30 g por litro del medio de fermentación. Alternativamente, el butanol producido por métodos descritos en la presente invención podría tener un título eficaz de al menos 37 g por litro del medio de fermentación.

Los presentes métodos se describen generalmente abajo con referencia a la Figura 1 a la Figura 7.

Ahora con referencia a la Figura 1, se muestra una representación esquemática de una modalidad de los procesos para producir y recuperar butanol mediante el uso de fermentación extractiva en el lugar. Una corriente acuosa 10 de al menos una fuente de carbono fermentable, que contiene, opcionalmente, electrolito, se introduce en un fermentador 20, el cual contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no mostrado) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse como una corriente separada (no mostrada) al fermentador. Una corriente del primer agente extractante 12 y una corriente del segundo agente extractante opcional 14 se introducen en un recipiente 16, en el cual el primer y el segundo agentes extractantes se combinan para formar el agente extractante combinado 18. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse (no mostrado) a la corriente 18, al recipiente 16, a la corriente del primer agente extractante 12, a la corriente del segundo agente extractante 14, o a una combinación de estos. Una corriente del agente extractante 18 se introduce en el fermentador 20, en el cual sucede el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol . Una corriente 26 que comprende las fases acuosa y orgánica se introduce en un recipiente 38, en el cual se lleva a cabo la separación de las fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 40 y una fase acuosa 42. Opcionalmente, al menos una porción de la fase acuosa 42 que contiene electrolito se regresa (no mostrado) al fermentador 20 o a otro fermentador (no mostrado) . El/los punto/s de adición del electrolito al proceso se selecciona/n de manera que la concentración de electrolito en la fase acuosa 42 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol comparado con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal.

Ahora con referencia a la Figura 2, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol mediante el uso de fermentación extractiva en el lugar. Una corriente acuosa 10 de al menos una fuente de carbono fermentable, que contiene, opcionalmente, electrolito, se introduce en un fermentador 20, el cual contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no mostrado) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse como una corriente individual (no mostrada) al fermentador. Una corriente del primer agente extractante 12 y una corriente del segundo agente extractante opcional 14 se introducen por separado al fermentador 20, en el cual sucede el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse (no mostrado) a la corriente 12, a la corriente 14 o a una combinación de estas. Una corriente 26 que comprende las fases acuosa y orgánica se introduce en un recipiente 38, en el cual se lleva a cabo la separación de las fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 40 y una fase acuosa 42.Opcionalmente, al menos una porción de la fase acuosa 42 que contiene electrolito se regresa (no mostrado) al fermentador 20 o a otro fermentador (no mostrado) . El/los punto/s de adición del electrolito al proceso se selecciona/n de manera que la concentración de electrolito en la fase acuosa 42 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol comparado con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal .

Ahora con referencia a la Figura 3, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol mediante el uso de fermentación extractiva en el lugar. Una corriente acuosa 10 de al menos una fuente de carbono fermentable, que contiene, opcionalmente, electrolito, se introduce en un primer termentador 20, el cual contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no mostrado) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse como una corriente individual (no mostrada) al termentador. Una corriente del primer agente extractante 12 se introduce en el fermentador 20, y una corriente 22 que comprende una mezcla del primer agente extractante y los contenidos del fermentador 20 se introduce en un segundo fermentador 24. Una corriente del segundo agente extractante opcional 14 se introduce en el segundo fermentador 24, en el cual sucede el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse (no mostrado) a la corriente 12, a la corriente 22, a la corriente 14, al recipiente 24, o a una combinación de estos. Una corriente 26 que comprende las fases acuosa y orgánica se introduce en un recipiente 38, en el cual se lleva a cabo la separación de las fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 40 y una fase acuosa 42.

Opcionalmente, al menos una porción de la fase acuosa 42 que contiene electrolito se regresa (no mostrado) al fermentador 20 o a otro fermentador (no mostrado) . El/los punto/s de adición del electrolito al proceso se selecciona/n de manera que la concentración de electrolito en la fase acuosa 42 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol comparado con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal.

Ahora con referencia a la Figura 4, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol, en los cuales la extracción del producto se lleva a cabo dirección 3' del fermentador, en vez de en el lugar. Una corriente acuosa 110 de al menos una fuente de carbono fermentable, que contiene, opcionalmente, electrolito, se introduce en un fermentador 120, el cual contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no mostrado) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse como una corriente individual (no mostrada) al fermentador. Una corriente del primer agente extractante 112 y una corriente del segundo agente extractante opcional 114 se introducen en un recipiente 116, en el cual se combinan el primer y el segundo agentes extractantes para formar un agente extractante combinado 118. Al menos una porción, mostrada como corriente 122, del medio de fermentación en el termentador 120 se introduce en el recipiente 124. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse (no mostrado) a la corriente 112, a la corriente 114, al recipiente 116, a la corriente 118, al recipiente 124, o a una combinación de estos. Una corriente del agente extractante 118 se introduce, además, en el recipiente 124, en el cual sucede el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. Una corriente 126 que comprende las fases acuosa y orgánica se introduce en un recipiente 138, en el cual se lleva a cabo la separación de las fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 140 y una fase acuosa 142. Al menos una porción de la fase acuosa 142 que contiene electrolito se regresa al termentador 120 u, opcionalmente, a otro termentador (no mostrado) . El/los punto/s de adición del electrolito al proceso se selecciona/n de manera que la concentración de electrolito en la fase acuosa 142 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal .

Ahora con referencia a la Figura 5, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol, en los cuales la extracción del producto se lleva a cabo dirección 3' del termentador, en vez de en el lugar. Una corriente acuosa 110 de al menos una fuente de carbono fermentable, que contiene, opcionalmente, electrolito, se introduce en un fermentador 120, el cual contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no mostrado) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse como una corriente individual (no mostrada) al fermentador. Una corriente del primer agente extractante 112 y una corriente del segundo agente extractante 114 se introducen por separado a un recipiente 124, en el cual el primer y el segundo agentes extractantes se combinan para formar el agente extractante combinado. Opcionalmente, podría adicionarse electrolito (no mostrado) a la corriente 112, a la corriente 114, a la corriente 122, al recipiente 124, o a combinaciones de estos. Al menos una porción, mostrada como corriente 122, del medio de fermentación en el fermentador 120 se introduce, además, en el recipiente 124, en el cual sucede el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. Una corriente 126 que comprende la las fases acuosa y orgánica se introduce en un recipiente 138, en el cual se lleva a cabo la separación de las fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 140 y una fase acuosa 142. Al menos una porción de la fase acuosa 142 que contiene electrolito se regresa al fermentador 120 u, opcionalmente, a otro fermentador (no mostrado) . El/los punto/s de adición del electrolito al proceso se selecciona/n de manera que la concentración de electrolito en la fase acuosa 142 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal .

Ahora con referencia a la Figura 6, se muestra una representación esquemática de una modalidad de procesos para producir y recuperar butanol, en los cuales la extracción del producto se lleva a cabo dirección 3' del fermentador, en vez de en el lugar. Una corriente acuosa 110 de al menos una fuente de carbono fermentable, que contiene, opcionalmente, electrolito, se introduce en un fermentador 120, el cual contiene al menos un microorganismo modificado genéticamente (no mostrado) que produce butanol a partir de un medio de fermentación que comprende al menos una fuente de carbono fermentable. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse como una corriente individual (no mostrada) al fermentador. Una corriente del primer agente extractante 112 se introduce en un recipiente 128, y al menos una porción, mostrada como corriente 122, del medio de fermentación en el fermentador 120 se introduce, además, en el recipiente 128. Opcionalmente, el electrolito podría adicionarse (no mostrado) a la corriente 122, a la corriente 112, al recipiente 128, o a una combinación de estos. Una corriente 130 que comprende una mezcla del primer agente extractante y los contenidos del termentador 120 se introduce en un segundo recipiente 132. Opcionalmente , podría adicionarse electrolito (no mostrado) a la corriente 130, a la corriente 114, al recipiente 132, o a una combinación de estos. Una corriente del segundo agente extractante opcional 114 se introduce en el segundo recipiente 132, en el cual sucede el contacto del medio de fermentación con el agente extractante para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol. Una corriente 134 que comprende las fases acuosa y orgánica se introduce en un recipiente 138, en el cual se lleva a cabo la separación de las fases acuosa y orgánica para producir una fase orgánica que contiene butanol 140 y una fase acuosa 142. Al menos una porción de la fase acuosa 142 que contiene electrolito se regresa al fermentador 120 u, opcionalmente, a otro fermentador (no mostrado) . El/los punto/s de adición del electrolito al proceso se selecciona/n de manera que la concentración de electrolito en la fase acuosa 142 sea al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal.

Los procesos extractivos descritos en la presente invención pueden llevarse a cabo como procesos por lote o pueden llevarse a cabo en un modo continuo en donde se adiciona agente extractante fresco y el agente extractante usado se bombea hacia el exterior, de manera que la cantidad de agente extractante en el termentador permanezca constante durante todo el proceso de fermentación. Tal extracción continua de productos y subproductos de la fermentación puede aumentar la velocidad, el título y el rendimiento eficaces.

En otra modalidad, resulta posible, además, operar la extracción líquido-líquido en forma de cocorriente flexible, alternativamente, contracorriente que da cuenta de la diferencia en perfiles de operación por lotes cuando se usa una serie de termentadores por lotes. En este escenario, los fermentadores se llenan con masa fermentable, la cual proporciona al menos una fuente de carbono fermentable y un microorganismo de una forma continua, una después de la otra, durante el tiempo en que opere la planta. Con referencia a la Figura 7, una vez que el Fermentador F100 se llena con la masa y el microorganismo, el suministro de masa y microorganismo avanza al Fermentador F101 y, después, al Fermentador F102 y, después, otra vez al Fermentador F100 en un circuito continuo. Podría adicionarse electrolito (no mostrado) a uno o más termentadores, a la corriente que ingresa al fermentador, a la corriente que sale del fermentador, o a una combinación de estos. La fermentación en cualquiera de los termentadores comienza una vez que la masa y el microorganismo se encuentran presentes juntos, y continúa hasta que la fermentación se completa. El tiempo de llenado de masa y microorganismo equivale al número de termentadores dividido por el tiempo de ciclo total (llenar, fermentar, vaciar y limpiar) . Si el tiempo de ciclo total es 60 horas y hay 3 termentadores, entonces el tiempo de llenado es 20 horas. Si el tiempo de ciclo total es 60 horas y hay 4 termentadores, entonces el tiempo de llenado es 15 horas.

La extracción cocorriente adaptativa sigue el perfil de fermentación bajo la asunción de que el fermentador que opera al título de fase de caldo de cultivo superior puede usar la corriente de solvente de extracción más rica en concentración de butanol y el fermentador que opera al título de fase de caldo de cultivo inferior se beneficiará de la corriente de solvente de extracción más pobre en concentración de butanol. Por ejemplo, nuevamente con referencia a la Figura 7, se considera el caso en donde el Fermentador F100 está al comienzo de una fermentación y opera a un título de fase de caldo de cultivo de butanol (B) relativamente bajo, el Fermentador F101 se encuentra en la mitad de una fermentación que opera a un título de fase de caldo de cultivo de butanol relativamente moderado y el Fermentador F102 se encuentra cerca del final de una fermentación que opera a un título de fase de caldo de cultivo de butanol relativamente alto. En este caso, el solvente de extracción pobre (S) , con ninguna o una mínima cantidad de butanol extraída, puede suministrarse al Fermentador F100, la corriente "de solvente saliente" (S1) del Fermentador F100 que tiene un componente de butanol extraído puede suministrarse, después, al Fermentador F101 como su corriente de "solvente entrante" y la corriente de solvente saliente de F101 puede enviarse, después, para procesarse a fin de recuperar el butanol presente en la corriente. La corriente de solvente saliente de F102 puede enviarse, después, para procesarse a fin de recuperar el butanol presente en la corriente. La corriente de solvente procesada de la cual se remueve la mayoría del butanol puede regresarse al sistema como solvente de extracción pobre y sería el suministro de solvente entrante del Fermentador F100 mencionado anteriormente.

A medida que las fermentaciones prosiguen de una manera ordenada, las válvulas en el distribuidor de solvente de extracción pueden colocarse para que suministren el solvente de extracción más pobre al fermentador que opera al título de fase de caldo de cultivo de butanol más bajo. Por ejemplo, se asume que (a) el Fermentador F102 completa su fermentación, se ha vuelto a cargar y comienza de nuevo, (b) el Fermentador F100 se encuentra en la mitad de la fermentación que opera a título de caldo de cultivo de butanol moderado y (c) el Fermentador F101 se encuentra cerca del final de su fermentación que opera a un título de caldo de cultivo de butanol relativamente alto. En este escenario, el solvente de extracción más pobre alimentaría F102, el solvente de extracción que sale de F102 alimentaría el Fermentador F100 y el solvente de extracción que sale del Fermentador F100 alimentaría el Fermentador F101.

La ventaja de operar de esta forma puede ser mantener el título de butanol de la fase de caldo de cultivo tan bajo como sea posible durante el mayor tiempo posible para lograr mejoras en la productividad. Adicionalmente, puede ser posible bajar la temperatura en los otros fermentadores que han progresado más en la fermentación y que están operando a títulos de fase de caldo de cultivo de butanol más altos. El descenso de la temperatura puede permitir que se obtenga una mayor tolerancia a los títulos de fase de caldo de cultivo de butanol.

Ventajas de los presentes métodos Los métodos de fermentación extractiva de la presente proporcionan butanol que se conoce tiene un contenido energético similar al de la gasolina, y el cual puede mezclarse con cualquier combustible fósil . El butanol se ve favorecido como combustible o aditivo de combustible dado que proporciona solamente C02 y poco o nada de SOx o NOx cuando se quema en el motor de combustión interna estándar. Adicionalmente, el butanol es menos corrosivo que el etanol, el aditivo de combustible más preferido hasta la fecha.

Adicionalmente a su utilidad como un biocombustible o un aditivo de combustible, el butanol producido de conformidad con los presentes métodos tiene el potencial de impactar sobre los problemas de distribución de oxígeno en la industria de las células de combustible emergente. Las células de combustible de la actualidad están plagadas de problemas de seguridad asociados con el transporte y la distribución de hidrógeno. El butanol puede reformarse fácilmente para su contenido de hidrógeno y puede distribuirse por estaciones de servicio existentes en la pureza requerida para células de combustible y vehículos. Además, los presentes métodos producen butanol de fuentes de carbono derivadas de plantas, y evitan el impacto ambiental negativo asociado con los procesos petroquímicos estándar para la producción de butanol .

Las ventajas de los presentes métodos incluyen viabilidad de producir butanol a rendimientos, título y velocidad eficaces netos que son significativamente más altos y más económicos que los niveles umbral de butanol obtenido por un proceso de fermentación extractiva de dos fases sin la adición de al menos un electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol comparado con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal. El presente método puede reducir, además, la cantidad neta de agente extractante fresco o reciclado necesario para lograr un nivel deseado de producción de butanol a partir de una fermentación por lotes.

I EJEMPLOS La presente invención se define más aun en los siguientes ejemplos. Deberá entenderse que estos ejemplos, si bien indican las modalidades preferidas de la invención, se dan solamente a modo de ilustración. De lo mencionado anteriormente y de estos ejemplos, una persona con experiencia en la técnica puede determinar las características esenciales de esta invención y, sin alejarse del espíritu y del alcance de ella, puede hacer diferentes cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a diferentes usos y condiciones.

Materiales En los ejemplos se usaron los siguientes materiales.

Todos los reactivos comerciales se usaron como se recibieron.

Todos los solventes se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) y se usaron sin más purificación. El alcohol oleílico usado fue de grado técnico, y contenía una mezcla de alcohol oleílico (65 %) y alcoholes grasos superiores e inferiores. El isobutanol (pureza 99.5 %) se obtuvo de Sigma-Aldrich y se usó sin más purificación. El sulfato de sodio (Na2S04f CAS 7757-82-6, mayor que 99 % de pureza) se obtuvo de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . El cloruro de sodio (NaCl, CAS 7647-14-5, grado técnico) se compró de EMD Chemicals, Inc. (Gibbstown, NJ) .

Métodos generales La lectura de la densidad óptica . para medir la concentración de células del microorganismo se llevó a cabo mediante el uso de un espectrofotómetro Thermo Electron Corporation Helios Alpha. Las mediciones se hicieron, típicamente, a una longitud de onda de 600 nanómetros .

La concentración de glucosa en el caldo de cultivo se midió rápidamente mediante el uso de un analizador 2700 Select Biochemistry (YSI Life Sciences, Yellow Springs, OH) . Las muestras de caldo de cultivo se centrif garon a temperatura ambiente durante 2 minutos a 13.200 rpm en tubos Eppendorf de 1.8 mL, y el sobrenadante acuoso se analizó en busca de la concentración de glucosa. El analizador llevó a cabo una autocalibración con un estándar de glucosa conocido, antes de ensayar cada conjunto de muestras de termentador,¦ se ensayó periódicamente, además, un estándar externo para asegurar la integridad de los ensayos de caldo de cultivo. Las especificaciones del analizador para el análisis fueron como figura a continuación: Tamaño de la muestra: 15 L Química de sonda negra: dextrosa Química de sonda blanca: dextrosa Las concentraciones de isobutanol y glucosa en la fase acuosa se midieron por HPLC (Modelo Waters Alliance, Serie Milford, MA o Agilent 1200, Santa Clara, CA) mediante el uso de una columna BioRad Aminex HPX-87H, 7.8 mm x 300 mm, (laboratorios Bio-Rad, Hercules, CA) con columnas de , guarda adecuadas, mediante el uso de ácido sulfúrico acuoso 0.01 N, isocrático, como el eluyente. La muestra se pasó por un filtro centrífugo de 0.2 µp? (nailon modificado Nanosep MF) en un frasco de HPLC. Las condiciones de ejecución de HPLC fueron como las que figuran a continuación: Volumen de inyección: 10 L Velocidad de flujo: 0.60 mL/minuto Tiempo de ejecución: 40 minutos Temperatura de columna: 40 °C Detector: índice de refracción Temperatura del detector: 35 °C Detección UV: ancho de banda 210 nm, 8 nm Después de la ejecución, las concentraciones en la muestra se determinaron a partir de curvas estándar para cada uno de los compuestos. Los tiempos de retención fueron 32.6 y 9.1 minutos para isobutanol y glucosa, respectivamente.

El isobutanol y el etanol en la fase extractante orgánica se midió mediante el uso de cromatografía de gas (GC, por sus siglas en inglés) , como se describe abajo.

El siguiente método de GC se usó para determinar la cantidad de isobutanol y etanol en la fase orgánica. El método de GC usó una columna J&W Scientific DB-WAXETR (50 m x 0.32 mm ID, película de 1 pm) de Agilent Technologies (Santa Clara, CA) . El gas vehículo fue helio a un régimen de flujo de 4 mL/min con presión principal constante; la división del inyector fue 1:5 a 250 °C; la temperatura del horno fue 40 °C durante 5 minutos, 40 °C a '230 °C a 10 °C/minuto, y 230 °C durante 5 minutos. La detección de ionización de llama se usó a 250 °C con 40 mL/min de gas auxiliar de helio. Las muestras de caldo de cultivo se centrifugaron antes de la inyección. El volumen de inyección fue 1.0 pL. Se generaron curvas estándar calibradas para etanol e isobutanol. Bajo estas condiciones, el tiempo de retención de isobutanol fue 9.9 minutos, y el tiempo de retención para etanol fue 8.7 minutos.

Construcción de una cepa de E. coli que tiene deleciones de los genes pflB, frdB, ldhA y adhE En la presente invención se proporciona un método adecuado para eliminar los genes pflB, frdB, ldhA, y adhE de E. coli. La colección Keio de cepas de E. coli (Baba et al., Mol. Syst. Biol., 2:1-11, 2006) se usó para la producción de ocho de los knockout. La colección Keio (disponible de NBRP en el National Institute of Genetics, Japón) es una genoteca de knockout de un solo gen creados en la cepa de E. coli BW25113 mediante el método de Datsenko y anner (Datsenko, K. A. & Wanner, B. L. , Proc Nati Acad Sci., Estados Unidos, 97: 6640-6645, 2000) . En la colección, cada gen eliminado se reemplazó con un marcador de canamicina flanqueado por FRT que era removible por Flp recombinasa. La cepa de E. coli que porta múltiples knockout se construyó al mover el marcador de canamicina del knockout de la cepa donante Keio por transducción con bacteriófago Pl a una cepa receptora. Después de que cada transducción Pl produjera un knockout, el marcador de canamicina se retiró mediante Flp recombinasa. Esta cepa sin marcador actuó como la nueva cepa receptora para la próxima transducción Pl . Uno de los knockout descritos se construyó directamente en la cepa mediante el uso del método de Datsenko y Wanner (arriba) en vez de la transducción Pl .

La cepa 4KO de E. coli se construyó en la cepa Keio J 0886 por transducciones Plvir con Usados de fagos Pl preparados a partir de tres cepas Keio. Las cepas Keio usadas se enumeran a continuación: - JW0886: el marcador para canamicina se inserta en el gen pflB JW4114: el marcador para canamicina se inserta en el gen frdB JW1375: el marcador para canamicina se inserta en el gen IdhA JW1228: el marcador para canamicina se inserta en el adhE [Las secuencias que corresponden a los genes desactivados son: pflB (sec. con núm. de ident. : 71) , frdB (sec. con núm. de ident. : 73) , IdhA (sec. con núm. de ident. : 77) , adhE (sec. con núm. de ident. : 75) .] La eliminación del marcador para canamicina flanqueado por FRT del cromosoma se llevó a cabo al transformar la cepa resistente a la canamicina con pCP20, un plásmido resistente a la ampicilina (Cherepanov y Wackernagel , arriba)) . Los transformantes se esparcieron sobre placas de LB que contenían 100 g/mL de ampicilina. El plásmido pCP20 porta la FLP recombinasa de levadura bajo el control del promotor XPR, y la expresión de este promotor se controla mediante el represor sensible a la temperatura cI857 que reside en el plásmido. El origen de replicación de pCP20 también es sensible a la temperatura.

La eliminación del marcador para canamicina flanqueado por loxP del cromosoma se llevó a cabo al transformar la cepa resistente a la canamicina con pJW168, un plásmido resistente a la ampicilina (Wild et al., Gene. 223:55-66, 1998) que alberga el bacteriófago Pl Cre recombinasa. La Cre recombinasa (Hoess, R.H. & Abremski, K. , arriba) media la escisión del gen de resistencia a la canamicina a través de la recombinación en los sitios loxP. El origen de replicación de pJW168 es el pSClOl sensible a la temperatura. Se esparcieron transformantes sobre placas de LB que contenían 100 g/mL de ampicilina.

La cepa J 0886 (ApflB::kan) se transformó con el plásmido pCP20 y se esparció sobre las placas de LB que contenían 100 pg/mL de ampicilina a 30 °C. Los transformantes resistentes a la ampicilina, después, se seleccionaron, se estriaron en las placas de LB y se cultivaron a 42 °C. Las colonias aisladas se parcharon sobre las placas de LB y las placas de medio selectivo de ampicilina y canamicina. Se analizaron las colonias sensibles a la canamicina y sensibles a la ampicilina por PCR de colonias con los iniciadores pflB CkUp (sec. con núm. de ident . : 78) y pflB CkDn (sec. con núm. de ident.: 79) . Se analizó una alícuota de 10 L de la mezcla de reacción de PCR mediante electroforesis de gel. Se observó el producto de PCR aproximado esperado de 0.4 kb, lo que confirma la eliminación del marcador y crea la cepa "J 0886" sin marcador. La cepa tiene una deleción del gen pflB.

La cepa "JW0886 sin marcador" se tradujo con un lisado de Plvir de JW 114 (frdB: :kan) y se estrió sobre placas de LB que contenían 25 g/mL de canamicina. Los transductores resistentes a la canamicina se analizaron por PCR de colonias con los iniciadores frdB CkUp (sec. con núm. de ident. : 80) y frdB CkDn (sec. con núm. de ident. : 81) . Las colonias que produjeron el producto de PCR aproximado esperado de 1.6 kb se hicieron electrocompetentes y se transformaron con pCP20 para la eliminación del marcador, como se describió anteriormente. Los transformantes, primero, se esparcieron sobre placas de LB que contenían 100 g/mL de ampicillina a 30 °C y, después, se seleccionaron transformantes resistentes a la ampicilina, se estriaron sobre placas de LB y se cultivaron a 42 °C. Las colonias aisladas se parcharon sobre las placas de medio selectivo de canamicina y ampicilina, y las placas de LB. Las colonias sensibles a la canamicina y sensibles a la ampicilina se analizaron por PCR con los iniciadores frdB CkUp (sec. con núm. de ident.: 80) y frdB CkDn (sec. con núm. de ident.: 81). Se observó el producto de PCR esperado aproximado de 0.4 kb, lo que confirmó la eliminación del marcador y creó la cepa knockout doble "ApflB frdB".

La cepa knockout doble se tradujo con un lisado PlVir de JW1375 (AldhA: : kan) y se esparció sobre placas de LB que contenían 25 pg/mL de canamicina. Los traductores resistentes a la canamicina se analizaron por PCR de colonias con los iniciadores ldhA CkUp (sec. con núm. de ident . : 82) y ldhA CkDn (sec. con núm. de ident.: 83). Los clones que producen el producto de PCR esperado de 1.5 kb se hicieron electrocompetentes y se transformaron con pCP20 para la eliminación del marcador, como se describió anteriormente. Los transformantes se esparcieron sobre placas de LB que contenían 100 pg/mL de ampicilina a 30 °C, y los transformantes resistentes a la ampicilina se estriaron sobre placas de LB y se cultivaron a 42 °C. Las colonias aisladas se parcharon sobre placas de medio selectivo de ampicilina y canamicina, y placas de LB. Las colonias sensibles a la ampicilina y sensibles a la canamicina se analizaron por PCR con los iniciadores ldhA CkUp (sec. con núm. de ident.: 82) y ldhA CkDn (sec. con núm. de ident.: 83) para un producto de 0.3 kb. Los clones que produjeron el producto de PCR aproximado esperado de 0.3 kb confirmaron la eliminación del marcador y crearon la cepa knockout triple designada "3KO" (???IB frdB ldhA) .

La cepa "3KO" se tradujo con un lisado Plvir de JW1228 (AadhE: :kan) y se esparció sobre placas de LB que contenían 25 rag/mL de canamicina. Los traductores resistentes a la canamicina se analizaron por PCR de colonias con los iniciadores adhE CkUp (sec. con núm. de ident. : 84) y adhE CkDn (sec. con núm. de ident.: 85). Los clones que produjeron el producto de PCR esperado de 1.6 kb se denominaron 3KO adhE:: kan. La cepa 3KO adhE: : kan se hizo electrocompetente y se transformó con pCP20 para la eliminación del marcador. Los transformantes se esparcieron sobre placas de LB que contenían 100 g/mL de ampicilina a 30 °C. Los transformantes resistentes a la ampicilina se estriaron sobre placas de LB y se cultivaron a 42 °C. Las colonias aisladas se parcharon sobre placas selectivas de ampicilina y canamicina, y placas de LB. Las colonias sensibles a la canamicina y sensibles a la ampicilina se analizaron por PCR con los iniciadores adhE CkUp (sec. con núm. de ident.: 84) y adhE CkDn (sec. con núm. de ident.: 85). Los clones que produjeron el producto de PCR aproximado de 0.4 kb se denominaron "4KO" (ApflB frdB ldhA adhE) .

Construcción de un huésped de producción de E. coli (Cepa NGCI-031) que contiene una ruta biosintética de isobutanol y deleciones de los genes pflB, frdB, ldhA y adhE Un fragmento que codifica sadB, una butanol deshidrogenasa, (ADN sec. con núm. de ident.: 9; proteína sec. con núm. de ident.: 10) de Achromobacter xylosoxidans se amplificó de ADN genómico de A. xylosoxidans mediante el uso de condiciones estándar. El ADN se preparó mediante el uso de un estuche Gentra Puregene (Gentra Systems, Inc., Minneapolis, M ; número de catálogo: D-5500A) de conformidad con el protocolo recomendado para organismos gram negativos. La modificación de PCR se llevó a cabo mediante el uso de los iniciadores directo e inverso N473 y N469 (sec. con núm. de ident.: 86 y 87), respectivamente, con ADN polimerasa Phusion de alta fidelidad (New England Biolabs, Beverly, MA) . El producto de PCR se clonó con TOPO-Blunt en pCR4 BLUNT (Invitrogen) para producir pCR4Blunt : : sadB, el cual se transformó en células Mach-1 de E. coli. Subsiguientemente, se aisló el plásmido de cuatro clones y se verificó la secuencia.

La región codificante sadB, después, se clonó en el vector pTrc99a (Amann et al., Gene 69: 301- 315, 1988). El pCR4Blunt : : sadB se digirió con EcoRI y liberó el fragmento sadB, el cual estaba ligado con pTrc99a digerido por EcoRI para generar pTrc99a : : sadB . Este plásmido se transformó en células Mach 1 de E. coli y el transformante resultante se denominó Machl/pTrc99a : : sadB . Se determinó que la actividad de la enzima expresada a partir del gen sadB en estas células era de 3.5 mmol/min/mg de proteína en extractos libres de células, cuando se analizó mediante el uso de isobutiraldehldo como el estándar.

El gen sadB, después, se subclonó en pTrc99A: :budB-ilvC-ilvD-kivD como se describe más abajo. El pTrc99A: : budB-ilvC-ilvD-kivD es el vector de expresión pTrc-99a que porta un operón para la expresión de isobutanol (descrito en los Ejemplos 9-14 de la publicación de la solicitud de patente de los Estados Unidos núm. 20070092957) . El primer gen en el operón de isobutanol pTrc99A: : budB-ilvC-ilvD-kivD es budB que codifica acetolactato sintasa de Klebsiella pneumoniae núm. de la ATCC: 25955, seguido por el gen ilvC que codifica acetohidroxi ácido reductoisomerasa de E.. coli. Lo sigue el ilvD que codifica acetohidroxi ácido deshidratasa de E. coli y, finalmente, el gen kivD que codifica la ceto ácido decarboxilasa de cadena ramificada de L . lactis.

La región codificante sadB se amplificó a partir de pTrc99a: : sadB mediante el uso de los iniciadores N695A (sec. con núm. de ident. : 88) y N696A (sec. con núm. de ident.: 89) con ADN polimerasa Phusion de alta fidelidad (New England Biolabs, Beverly, MA) . La amplificación se llevó a cabo con una desnaturalización inicial a 98 °C, durante 1 minuto, seguida por 30 ciclos de desnaturalización a 98 °C durante 10 segundos, hibridación a 62 °C durante 30 segundos, elongación a 72 °C durante 20 segundos y un ciclo de elongación final a 72 °C durante 5 minutos, seguido por un mantenimiento a 4 °C. El iniciador N695A contenía un sitio de restricción Avrll para clonación y un RBS corriente arriba del codón de inicio ATC de la región codificante sadB. El iniciador N696A incluía un i sitio Xbal para la clonación. El producto de PCR de 1.1 kb se digirió con Avrll y Xbal (New England Biolabs, Beverly, MA) y se purificó con gel mediante el uso del estuche de extracción con gel Qiaquick (Qiagen Inc., Valencia, CA) ) . El fragmento purificado se ligó con pTrc99A: : budB-ilvC-ilvD-kivD, que se había cortado con las mismas enzimas de restricción, mediante el uso de T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Beverly, MA) . La mezcla de ligadura se incubó a 16 °C durante la noche y, después, se transformó en células competentes Mach 1™ de E. coli (Invitrogen) de conformidad con el protocolo del fabricante. Los transformantes se obtuvieron después del cultivo sobre LB agar con 100 pg/mL de ampicilina. Se preparó ADN plasmídico de los transformantes con el estuche QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA) de conformidad con los protocolos del fabricante . El plásmido resultante se denominó pTrc99A: : budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB .

Las células electrocompetentes de las cepas 4KO se prepararon como se describió y transformó con pTrc99A: :budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB ("pBCDDB") . Los transformantes se estriaron sobre placas de agar que contenían 100 pg/mL de ampicilina. La cepa resultante portadora del plásmido pTrc99A: :budB-ilvC-ilvD-kivD-sadB con 4K0 (designada cepa NGCI-031) se usó para los estudios de fermentación en los ejemplos indicados.

Ejemplo 1 Efecto de la concentración electrolítica en el coeficiente de partición (Kp) El propósito de este ejemplo fue evaluar el efecto de las concentraciones electrolíticas en el medio de fermentación sobre el coeficiente de partición (Kp) de isobutanol cuando se usó alcohol oleílico como el agente extractante. El medio de fermentación basal (BFM, por sus siglas en inglés) usado, típicamente, en fermentaciones de E.coli se usó como el medio de fermentación en este Ejemplo. La composición de BFM se muestra en la Tabla 2.

Tabla 2. Composición de BFM La solución de elementos traza usados en el medio mencionado anteriormente se preparó de la siguiente manera. Los ingredientes enumerados abajo se adicionaron en el orden enumerado y la solución se calienta a 50-60 °C hasta que todos los componentes se disuelven completamente. El citrato férrico se adicionó lentamente después de que otros ingredientes se encontraban en la solución. La solución se esterilizó por filtrado mediante el uso de filtros de 0.2 micrones.

Se calcula que el nivel inicial de sales totales (suma fosfato monobásico de potasio, fosfato dibásico de amonio, monohidrato de ácido cítrico y heptahidrato de sulfato de magnesio) en BFM, como se muestra en la Tabla 2, era de aproximadamente 144.2 mM. Dado que se usó un biocatalizador de E.coli en los ejemplos que se muestran más abajo, se adicionó clorhidrato de betaína (Sigma-Aldrich) a 0.31 g/L (2 mmoles/L) al medio de fermentación basal ya que se informa en la literatura (Cosquer A, et al; 1999; Appl Environ Microbiol 65:3304-3311) que mejora la tolerancia a la sal de E.coli.

El siguiente procedimiento experimental se usó para generar la información en las Tablas 3 y 4. En estos experimentos de medición de Kp se adicionó una cantidad de electrolito como sulfato de sodio (Na2S04) o cloruro de sodio (NaCl) al medio de fermentación basal. A 30 mL de BFM complementado con electrolito, se adicionó 10 mL de agente extractante de alcohol oleílico (OA, por sus siglas en inglés) rico en isobutanol que contenía 168 g/L de isobutanol, y se mezcló vigorosamente durante aproximadamente 4-8 horas a 30 °C con agitación a 250 rpm en un agitador de mesa (innova 4230, New Brunswick scientific, Edison, NJ) para alcanzar un equilibrio entre las dos fases. Las fases acuosas y orgánicas en cada matraz se separaron por decantación. La fase acuosa se centrifugó (2 minutos a 13,000 rpm con una centrífuga Eppendorf modelo 5415R) para remover la fase extractante residual, y el sobrenadante se analizó en busca de glucosa e isobutanol por HPLC. El análisis de los niveles de isobutanol en la fase acuosa después de 4 horas de agitación fue similar al obtenido después de 8 horas de mezclado, lo que sugiere que el equilibrio entre las dos fases se logró dentro de las 4 horas . Se intentó mostrar que más mezclado después de las 4 horas no cambiaba el Kp.

Los coeficientes de partición (Kp) para la distribución de isobutanol entre las fases orgánica y acuosa se calcularon a partir de la cantidad conocida de isobutanol adicionada al matraz y de la información de la concentración de isobutanol medida para la fase acuosa. La concentración de isobutanol en la fase extractante se determinó por equilibrio de masa. El coeficiente de partición se determinó como la relación de las concentraciones de isobutanol en las fases orgánica y acuosa, es decir, Kp = [Isobutanol] Fase orgánica / [isobutanol] Fase acuosa- Cada punto de información que corresponde a un nivel especificado de electrolito como se muestra en la Tabla 3 y la Tabla 4 se repitió dos veces y se informaron los valores para Kp como el promedio de los dos matraces .

I Tabla 3. Efecto de la concentración de sulfato de sodio ( a2S0 ) sobre el Kp de isobutanol Tabla 4. Efecto de la concentración de cloruro de sodio (NaCl) sobre Kp de isobutanol Los resultados de las Tablas 3 y 4 demuestran que la complementación del medio de fermentación acuoso con los electrolitos Na2S04 y NaCl resultó en Kp más alto para isobutanol en un sistema de dos fases con alcohol oleílico como la fase extractante.

Ejemplo 2 Efecto de la complementacion electrolítica en el índice de crecimiento de E. coli Para evaluar el efecto de los electrolitos tales como Na2S04 sobre las propiedades de crecimiento del biocatalizador, se cultivó la cepa 4K0 de E. coli en matraces oscilantes en medio BFM complementado con 0.31 g/L de clorhidrato de betaína y diferentes niveles de Na2S04 (0-284 g/L) a 30 °C, 250 RPM en agitadores de mesa Innova. A partir de un frasco congelado, se cultivaron 25 mL de cultivos de semillas en caldo de cultivo de LB Difco, medio Miller, comprado de BD Laboratories (Becton & Dickinson and Company, Sparks , MD, 21152, Estados Unidos) a 30 °C, 200 RPM. Se adicionó 1 mL de este cultivo de semillas a matraces oscilantes que contenían 30 mL de medio BFM complementado con 0.31 g/L de clorhidrato de betaína y distintos niveles de Na2S04. Se retiraron muestras en periodos de tiempo definidos para monitorear el crecimiento de la biomasa según lo medido por OD6oo · Los índices de crecimiento se calcularon a partir de los perfiles de tiempo de biomasa al adaptar ecuaciones exponenciales de velocidad de crecimiento.

Tabla 5. Efecto de Na2S04 en el índice de crecimiento de la cepa K0 de E. coli La velocidad de crecimiento mostrada en la Tabla 5 sugiere que el biocatalizador puede tolerar niveles de sal tan altos como aproximadamente 0.67 M de Na2S0 (nivel total de sal de 0.81 M) con un 30 % de pérdida de velocidad de crecimiento comparada con el testigo sin electrolito. Sin embargo, existe una caída significativa (mayor que aproximadamente 80 %) en el índice de crecimiento a una concentración de sal de 1 M. La información en la Tabla 3 muestra que a una concentración de Na2S04 de 0.67 M, el Kp para butanol aumenta dos veces comparada con el testigo sin adición de sal, cuando se encuentra presente alcohol oleílico como la fase extractante. Así, el efecto neto general de la adición de electrolitos a una fermentación extractiva de 2 fases mediante el uso de un microorganismo que produce butanol recombinante puede ser impredecible dado que los electrolitos, por un lado, pueden inhibir el crecimiento celular (Tabla 3), pero, por otro lado, puede aumentar el coeficiente de partición del producto de butanol tóxico, el cual podría aliviar sus efectos tóxicos sobre el microorganismo.

Ejemplo 3 Efecto de la adición electrolítica sobre la velocidad, el título y el rendimiento de la producción de butanol en un proceso de fermentación extractiva de dos fases El propósito de este ejemplo fue demostrar las ventajas de la adición de al menos una cantidad suficiente de electrolito a la fase acuosa de una fermentación extractiva de dos fases en la cual un microorganismo recombinante produce butanol, una cepa de Escherichia coli (NGCI-031) que contiene una ruta biosintética de isobutanol. La fermentación extractiva usa alcohol oleílico como el agente extractante orgánico inmiscible en agua.

La cepa de Escherichia coli NGCI-031 se construyó como se describió en la sección Métodos generales que figura más arriba. Todos los cultivos de semillas para la preparación de inóculos se cultivaron en medio Luria-Bertani (LB) con ampicilina (100 mg/L) como el antibiótico de selección. El medio de fermentación usado fue un medio semisintético complementado con 2 mmoles/L de clorhidrato de betaína, la composición del cual se da en la Tabla 6.

Tabla 6 Composición del medio de fermentación a Obtenido a través de BD Diagnostic Systems, Sparks, k Obtenido a través de Sigma-Aldrich Tabla 7 Metales traza modificados de Balch Los ingredientes 1-11 de la Tabla 6 se adicionaron a agua a la concentración designada para hacer un volumen final de 0.4 1 en el fermentador. Los contenidos del fermentador se esterilizaron mediante autoclave. Los componentes 12-14 se mezclaron, se esterilizaron por filtrado y se adicionaron al termentador después de que se enfrió el medio esterilizado por autoclave. El volumen final total del medio de fermentación (la fase acuosa) fue de aproximadamente 0.5 1 después de la adición de 50 mL de inoculo de semillas.

Se adicionó electrolito en la forma de Na2S04 a concentraciones de 0 g/L, 40 g/L o 60 g/L al medio antes de la esterilización. Se adicionaron soluciones esterilizadas por filtrado de ampicilina, clorhidrato de tiamina y glucosa al medio del termentador, después de la esterilización, a una concentración final de 100 mg/L, 5 mg/L y 20 mg/L, respectivamente. Las fermentaciones se llevaron a cabo mediante el uso de un bioreactor de autoclave de 1 1, Bio Consolé ADI 1025 (Applikon, Inc, Holland) con un volumen operante de 900 mL. La temperatura se mantuvo a 30 °C durante la totalidad de la fermentación y el pH se mantuvo a 6.8 mediante el uso de hidróxido de amonio. Después de la inoculación del medio de fermentación estéril con cultivo de semillas (2-10 % vol) , el termentador se operó aeróbicamente a un punto fijo de 30 % de oxígeno disuelto (DO, por sus siglas en inglés) con 0.3 vvm de flujo de aire por control automático de la velocidad de agitación (rpm) . Una vez que se alcanzó la densidad óptica (OD60o) (es decir, OD6oo=10) , se indujo el cultivo con la adición de 0.4-0.5 mM de isopropil beta-D-1 tiogalactopiranosida para sobreexpresar la ruta biosintética de isobutanol. Cuatro horas después de la inducción, las condiciones de fermentación se cambiaron a condiciones microaeróbicas al disminuir el flujo de aire a 0.13 slpm y al fijar el punto fijo de DO a 3-5 %. El cambio a condiciones microaeróbicas inició la producción de isobutanol mientras que minimizó la cantidad de carbono que iba a la producción de biomasa, lo cual desacopló la formación de biomasa de la producción de isobutanol. Se adicionó alcohol oleílico (aproximadamente 250 mL) durante la fase de producción de isobutanol para aliviar el problema de la inhibición debido a la acumulación de isobutanol en la fase acuosa. Se adicionó glucosa como un bolo (50 % en peso de solución de materia prima) al termentador según fue necesario para mantener los niveles de glucosa entre 20 g/L y 2 g/L.

Dado que la producción eficaz de isobutanol requiere condiciones microaeróbicas para permitir el equilibrio redox en la ruta biosintética, se suministró aire continuamente al termentador a 0.3 wm. La aireación continua llevó a un arrastre significativo de isobutanol desde la fase acuosa del fermentador. A fin de cuantificar la pérdida de isobutanol debido al arrastre, el gas saliente del fermentador se envió directamente a un espectrómetro de masa (espectrómetro de masa Prima dB, Thermo Electron Corp., Madison, I) para cuantificar la cantidad de isobutanol en la corriente de gas. Los picos de isobutanol a relaciones de masa a carga de 74 o 42 se monitorearon continuamente para cuantificar la cantidad de isobutanol en la corriente de gas.

Para la producción de isobutano, el título eficaz, la velocidad eficaz y el rendimiento eficaz, todos corregidos para la pérdida de isobutanol debido al arrastre, se muestran abajo en forma tubular (Tabla 8) . El isobutanol en la fase acuosa se midió mediante el uso del método de HPLC descrito anteriormente en la presente invención. El isobutanol en la fase extractante de alcohol oleílico se midió mediante el uso del método de GC descrito anteriormente en la presente invención. Los niveles de glucosa se monitorearon mediante el uso de HPLC e YSI como se describió anteriormente en la presente invención.

Como puede verse de los resultados de la Tabla 8, el uso de electrolitos en una fermentación extractiva para la producción de isobutanol resulta en una velocidad eficaz, un rendimiento eficaz y un título eficaz significativamente altos comparados con el caso donde no se adiciona sal . El producto de isobutanol, el cual es tóxico para el huésped bacteriano, se extrae continuamente en la fase de alcohol oleílico por lo que disminuye su concentración en la fase acuosa, lo que reduce su toxicidad al microorganismo. Adicionalmente, se observa una mejora inesperada en la velocidad eficaz, el título eficaz y el rendimiento eficaz cuando se adiciona sal al medio. La adición de sales, en principio, podría tener no solamente un efecto perjudicial en el metabolismo del biocatalizador que produce butanol, si no que también alivia el efecto inhibidor de butanol al aumentar el Kp de butanol comparado con el testigo sin adición de sal. El efecto neto de la adición de sales en nuestro sistema extractivo de 2 fases favorece la producción y la recuperación mejoradas de butanol.

Tabla 8. Efecto de sales en la velocidad el título y el rendimiento de la roducción en el E em lo 3.

La cantidad inicial de sales en medio de fermentación (Tabla 6) fue de aproximadamente 0.05 moles/1.

Ejemplo 4 Efecto de la adición de electrolito en la velocidad, el título y el rendimiento de la producción de butanol acoplada con arrastre de gas de butanol durante la fermentación A fin de evaluar el efecto de la adición electrolítica sobre la producción de butanol durante la fermentación de fase acuosa sin la adición de agente extractante de alcohol olellico, se repitió el Ejemplo 3 excepto que no se adicionó alcohol oleílico a ninguno de los termentadores . En este ejemplo, prevaleció el arrastre por gas de butanol de la fase acuosa debido a la inyección de aire de los fermentadores . La cantidad de butanol arrastrado al gas saliente se cuantificó como en el Ejemplo 3 mediante el uso de espectrometría de masa. La velocidad, el título y el rendimiento eficaces, todos corregidos para la pérdida de butanol debido al arrastre, se muestran en la Tabla 9.

Tabla 9. Efecto de las sales en la velocidad, el título y el rendimiento de la producción de butanol acoplada con arrastre por gas de butanol durante la fermentación para el Ejemplo 4 [La cantidad inicial de sales en el medio de fermentación (Tabla 9) fue de aproximadamente 0.05 moles/1] Los resultados de la Tabla 9 muestran que la adición de electrolitos a la fase acuosa aumenta la velocidad, el título y el rendimiento de la producción de butanol en ausencia de alcohol oleílico al aumentar la velocidad de arrastre de isobutanol. Los gramos de butanol arrastrado son casi dos veces más altos en presencia de sal, comparado con el caso sin adición de electrolito.

Si bien se han descrito modalidades particulares de la presente invención en la descripción anterior, las personas con experiencia en la técnica entenderán que la invención puede someterse a distintas modificaciones, sustituciones y arreglos sin alejarse del espíritu, del alcance o de los atributos esenciales de la invención. Deberá hacerse referencia a las reivindicaciones adjuntas, antes que a la descripción anterior, que indican el alcance de la invención.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para recuperar butanol de un medio de fermentación; caracterizado porque comprende: a) proporcionar un medio de fermentación que comprende butanol, agua, al menos un electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal, y un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol a partir de al menos una fuente de carbono fermentable ; b) contactar el medio de fermentación con i) un primer agente extractante inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de Ci2 a C22, ácidos grasos de C12 a C22, ésteres de ácidos grasos de Ci2 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22, amidas grasas de Ci2 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente, ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C7 a C22/ ácidos grasos de C7 a C22/ ésteres de ácidos grasos de C a C22, aldehidos i grasos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22 y mezclas de estos, para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol; y c) recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol para producir butanol recuperado.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque una porción del butanol se elimina en forma conjunta del medio de fermentación por un proceso que comprende las etapas de: a) arrastrar butanol del medio de fermentación con un gas para formar una fase gaseosa que contiene butanol; y b) recuperar butanol de la fase gaseosa que contiene butanol.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el electrolito se adiciona al medio de fermentación, al primer agente extractante, al segundo agente extractante opcional, o a combinaciones de estos.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el electrolito comprende una sal que tiene un catión seleccionado del grupo que consiste en litio, sodio, potasio, rubidio, cesio, magnesio, calcio, estroncio, bario, amonio, fosfonio, y combinaciones de estos.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el electrolito comprende una sal que tiene un anión seleccionado del grupo que consiste en sulfato, carbonato, acetato, citrato, lactato, fosfato, fluoruro, cloruro, bromuro, yoduro, y combinaciones de estos.

6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el electrolito se selecciona del grupo que consiste en sulfato de sodio, cloruro de sodio, y combinaciones de estos.

7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo modificado genéticamente se selecciona del grupo que consiste en bacterias, cianobacterias , hongos filamentosos y levaduras.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque las bacterias se seleccionan del grupo que consiste en Zymomonas, Escherichia, Salmonella, Rhodococcus, Pse domonas, Bacillus, Lactobacillus, Enterococcus, Pediococcus, Alcaligenes, Klebsiella, Paenibacillus, Arthrobacter, Corynebacterium, y BrevijacteriuiTi.

9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la levadura se selecciona del grupo que consiste en Pichia, Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Issatchenkia, y Saccharowyces.

10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer agente extractante se selecciona del grupo que consiste en alcohol oleílico, alcohol behenílico, alcohol cetílico, alcohol laurílico, alcohol miristílico, alcohol estearílico, ácido oleico, ácido láurico, ácido mistírico, ácido esteárico, miristato de metilo, oleato de metilo, aldehido láurico, 1-dodecanol, y una combinación de estos .

11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer agente extractante comprende alcohol oleílico.

12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo agente extractante se selecciona de 1-nonanol, 1-decanol, 1-undecanol, 2-undecanol, 1-nonanal, y una combinación de estos.

13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el butanol es 1 -butanol.

14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el butanol es 2-butanol.

15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el butanol es isobutanol.

16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el medio de fermentación comprende, además, etanol, y la fase orgánica que contiene butanol contiene etanol.

17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo modificado genéticamente comprende una modificación, la cual desactiva una ruta competidora para flujo de carbono.

18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el microorganismo modificado genéticamente no produce acetona.

19. Un método para la producción de butanol, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un microorganismo genéticamente modificado que produce butanol a partir de por lo menos una fuente de carbono fermentable ; b) cultivar el microorganismo en un medio de fermentación bifásico que comprende una fase acuosa y i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de Ci2 a C22, ésteres de ácidos grasos de Ci2 a C22, aldehidos grasos de C12 a C22, amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente, ii) un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22, ácidos carboxílieos de C7 a C22 , ésteres de ácidos carboxílieos de C7 a C22, aldehidos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22, y mezclas de estos, en donde el medio de fermentación bifásico comprende, además, un electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de ^ sal del medio de fermentación basal, durante un tiempo suficiente para permitir la extracción del butanol en el agente extractante orgánico para formar una fase orgánica que contiene butanol ,-c) separar la fase orgánica que contiene butanol de la fase acuosa; y d) recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol para producir butanol recuperado.

20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el electrolito se adiciona a la fase acuosa durante la fase de crecimiento del microorganismo, a la fase acuosa durante la fase de producción de butanol, a la fase acuosa cuando la concentración de butanol en la fase acuosa es inhibidora, al primer agente extractante, al segundo agente extractr.nte opcional, o a combinaciones de estos.

21. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el electrolito se obtiene de un medio de fermentación.

22. Un método para la producción de butanol, caracterizado porque comprende: a) proporcionar un microorganismo genéticamente modificado que produce butanol a partir de por lo menos una fuente de carbono fermentable ; b) cultivar el microorganismo en un medio de fermentación, en donde el microorganismo produce el butanol en el medio de fermentación para producir un medio de fermentación que contiene butanol; adicionar al menos un electrolito al medio de fermentación para proporcionar el electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el coeficiente de partición de butanol en relación con aquel en presencia de la concentración de sal del medio de fermentación basal; contactar al menos una porción del medio de fermentación que contiene butanol con i) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 C22, ácidos grasos de C12 a C22í esteres de ácidos grasos de C12 a C22, aldehidos grasos de Cí2 a C22, amidas grasas de C12 a C22 y mezclas de estos y, opcionalmente, un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes de C7 a C22, ácidos carboxílieos de C7 a C22/ esteres de ácidos carboxílieos de C7 a C22, aldehidos de C7 a C22, amidas grasas de C7 a C22y mezclas de estos, para formar una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol; opcionalmente, recuperar el butanol de la fase orgánica que contiene butanol; y opcionalmente, regresar al menos una porción de la fase acuosa al medio de fermentación.

23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el electrolito se adiciona al medio de fermentación de la etapa (c) , cuando la fase de crecimiento del microorganismo se hace más lenta.

24. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el electrolito se adiciona al medio de fermentación de la etapa (c) , cuando la fase de producción de butanol está completa.

25. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1, 19 o 22, caracterizado porque al menos una fuente de carbono fermentable se encuentra presente en el medio de fermentación y comprende carbono renovable de materias primas agrícolas, algas, celulosa, hemicelulosa, lignocelulosa, o cualquier combinación de estas.

26. Una composición, caracterizada porque comprende: (a) un medio de fermentación que comprende butanol, agua, al menos un electrolito a una concentración al menos suficiente para aumentar el medio iónico del coeficiente de partición de butanol y un microorganismo modificado genéticamente que produce butanol de al menos una fuente de carbono fermentable; b) un primer agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C12 a C22, ácidos grasos de Ci2 a C22, ésteres de ácidos grasos de C12 a C22 , aldehidos grasos de Ci2 a C22, amidas grasas de Ci2 a C22 y mezclas de estos; y opcionalmente , un segundo agente extractante orgánico inmiscible en agua seleccionado del grupo que consiste en alcoholes grasos de C7 a C22, ácidos grasos de C7 a C22, ásteres de ácidos grasos de C7 a C22, aldehidos grasos de C7 a C22/ amidas grasas de C7 a C22, y mezclas de estos; en donde la composición forma una mezcla de dos fases que comprende una fase acuosa y una fase orgánica que contiene butanol, a través de la cual podría separarse butanol del medio de fermentación de (a) .