MX2011010273A - Tratamiento de trastornos resistentes a insulina. - Google Patents

Abstract

La invención se refiere al tratamiento de tratamientos resistentes a insulina. En particular, la invención se refiere al tratamiento de trastornos resistentes a insulina por administración de IL-17, tales como antagonistas de IL-17A y/o IL-17F, tales como anticuerpos anti-IL-17A y/o IL-17F y/o IL-17Rc, o fragmentos de anticuerpos.

Description

TRATAMIENTO DE TRASTORNOS RESISTENTES A INSULINA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se ocupa del tratamiento de trastornos resistentes a insulina. En particular, la invención se ocupa del tratamiento de trastornos resistentes a insulina por la administración de IL-17, tales como antagonistas de IL-17A y/o IL-17F, tales como anticuerpos anti-IL-17A y/o IL-17F y/o IL-17RC, o fragmentos de anticuerpo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La familia IL-17 La interleucina-17A (IL-17A) es una molécula proinflamatoria derivada de células T que estimula las células epitelial, endotelial y fibroblásticas para producir otras citoquinas inflamatorias y quimiocinas que incluyen IL-6, IL-8, G-CSF, y MCP-1 (ver, Yao, Z. et al., J. Immunol . , 122 (12) : 5483-5486 (1995); Yao, Z. et al, Immunity, 3(6) :811-821 (1995); Fossiez, F., et al., J. Ex . Med. , 183(6): 2593-2603 (1996); Kennedy, J. , et al., J. Interferon Cytokine Res., 16(8):611-7 (1996); Cai , X. Y., et al., Immunol. Lett, 62(l):51-8 (1998); Jovanovic, D.V., et al., J. Immunol., 160 (7) : 3513-21 (1998); Laan, M . , et al., J. Immunol., 162 (4) : 2347-52 (1999); Linden, A., et al., Eur Respir J, 15(5): 973-7 (2000); y Aggarwal, S. y Gurney, A. L., J Leukoc Biol. 71(1) :l-8 (2002)). IL-17 también actúa sinérgicamente REF: 222971 con otras citoquinas incluso TNF-a y IL-?ß para inducir aún más la expresión de la quimiocina (Chabaud, M . , et al., J. Immunol. 161 (1) : 409-14 (1998)). IL-17A exhibe actividades biológicas pleiotrópicas sobre diversos tipos de células. IL-17A también tiene la capacidad para inducir la expresión de superficie de ICAM-1, la proliferación de células T, y el crecimiento y la diferenciación de progenitores CD34+ humanos a neutrófilos. IL-17A también ha sido relacionada con el metabolismo óseo, y se ha sugerido que juega un papel importante en las condiciones patológicas caracterizadas por la presencia de células T activadas y la producción de TNF-oc tales como artritis reumatoide y aflojamiento de implantes óseos (Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res., 14: 1513-1521 (1999]) . Se halló que las células T activadas del tejido sinovial derivadas de pacientes con artritis reumatoide secretan mayores cantidades de IL-17A que las derivadas de individuos normales o pacientes con osteoartritis (Chabaud et al., Arthritis Rheum. , 42: 963-970 (1999)). Se sugirió que esta citoquina proinflamatoria contribuye activamente a la inflamación sinovial en artritis reumatoide. Además de su papel proinflamatorio, IL-17A parece contribuir a la patología de artritis reumatoide por algún otro mecanismo. Por ejemplo, se ha demostrado que IL-17A induce la expresión del mAR del factor de diferenciación de osteoclastos (ODF) en osteoblastos (Kotake et al., J. Clin. Invest . , 103: 1345- 1352 (1999) ) . ODF estimula la diferenciación de células progenitoras en osteoclastos , las células que intervienen en la resorción ósea. Dado que el nivel de IL-17A está significativamente incrementado en el liquido sinovial fluid de pacientes con artritis reumatoide, en apariencia la formación de osteoclastos inducida por IL-17A juega un papel esencial en la resorción ósea en artritis reumatoide. También se cree que IL-17A juega un papel clave en ciertos otros trastornos autoinmunes tales como esclerosis múltiple (Matusevicius et al., Mult . Scler., 5: 101-104 (1999); Kurasawa, K. , et al., Arthritis Rheu 43 (11) : 2455-63 (2000)) y psoriasis (Teunissen, M. B., et al., J Invest . Dermatol 111(4) :645-9 (1998); Albanesi, C, et al., J Invest Dermatol 115(1): 81-7 (2000); y Homey, B., et al., J. Immunol . 164(12:6621-32 (2000)).

También se ha demostrado que IL-17A, a través de señales intracelulares , estimula el influjo de Ca2+ y una reducción de [cAMP] i en macrófagos humanos (Jovanovic et al, J. Immunol., 160:3513 (1998)). Los fibroblastos tratados con IL-17A inducen la activación de NFKB, (Yao et al., Immunity, 3:811 (1995), Jovanovic et al., supra) , mientras que los macrófagos tratados con ella activan NF-?? y las proteína cinasas activadas por mitógeno (Shalom-Barek et al, J. Biol . Chem., 273:27467 (1998)). Además, IL-17A también comparte similitud de secuencia con factor símil citosina 7 de mamífero que interviene en el crecimiento de hueso y cartílago. Otras proteínas con las cuales los polipéptidos de IL-17A comparten similitud de secuencia son el factor relacionado con interleucina derivado de embrión humano (EDIRF) e interleucina-20.

En concordancia con el amplio intervalo de efectos de IL-17A, se halló que el receptor de superficie celular de IL-17A está ampliamente expresado en muchos tejidos y tipos celulares (Yao et al., Cytokine, 2:794 (1997)). Si bien la secuencia de aminoácidos del receptor de IL-17A humano (IL-R) (866 aminoácidos) predice una proteína con un único dominio transmembrana y un largo dominio intracelular de 525 aminoácidos, la secuencia del receptor es singular y no es similar a la de ninguno de los receptores de la familia de receptores de citoquinas/factores de crecimiento. Esto, acoplado con la falta de similitud de la propia IL-17A a otras proteínas conocidas indica que IL-17A y su receptor podrían ser parte de una nueva familia de proteínas y receptores de señales. Se ha demostrado que la actividad de IL-17A es mediada a través de la unión a su exclusivo receptor de superficie celular (designado en la presente como IL-17R human) , en donde estudios previos han demostrado que el contacto de las células T con una forma soluble del polipéptido de receptor IL-17A inhibe la proliferación de las células T y la producción de IL-2 inducida por PHA, concanavalina A y anticuerpo monoclonal anti-TCR (Yao et al., J. Immunol., 155:5483-5486 (1995)). Como tal, hay significativo interés por identificar y caracterizar nuevos polipéptidos que tienen homología con los receptores de citoquina conocidos, específicamente los receptores de IL-17A.

En la actualidad se reconoce que la interleucina 17A es el elemento prototipo de una familia emergente de citoquinas. La determinación a gran escala de la secuencia del genoma humano y otros vertebrados ha revelado la presencia de genes adicionales que codifican proteínas claramente relacionadas con IL-17A, por lo que se define una nueva familia de citoquinas. Hay al menos 6 miembros de la familia IL-17 en humanos y ratones incluso IL-17A, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E y IL-17F así como nuevos receptores IL-17RH1, IL-17RH2, IL-17RH3 y IL-17RH4 (ver el documento WOOl/46420 publicado el 28 de junio de 2001) . Se ha demostrado que uno de los miembros de IL-17 (designado IL-17F) se fija al receptor de IL-17 humano (IL-17R) (Yao et al., Cytokine, 9 (11) : 794-800 (1997)) . La caracterización inicial sugiere que, al igual que IL-17A, varias de estas moléculas recientemente identificadas tienen capacidad para modular la función inmunológica . Las potentes acciones inflamatorias que se han identificado para varios de estos factores y las asociaciones emergentes con importantes enfermedades humanas sugieren que estas proteínas pueden tener significativos papeles en los procesos inflamatorios y pueden ofrecer oportunidades para la intervención terapéutica.

El gen que codifica IL-17F humano está ubicado adyacente a IL-17A (Hymowitz, S. G. , et al., Embo J, 20 (19) : 5332-41 (2001) ) . IL-17A y IL-17F comparten aproximadamente 44% de identidad de aminoácidos, mientras que los demás miembros de la familia IL-17 comparten un más limitado 15-27% de identidad de aminoácidos, lo cual sugiere que IL-17A y IL-17F forman un subgrupo diferenciado dentro de la familia IL-17 (Starnes, T., et al., J Immunol . 167 (8) :4137-40 (2001); Aggarwal, S. y Gurney, A. L., J. Leukoc Biol, 71(1) :l-8 (2002) ) . IL-17F parece tener acciones biológicas similares a IL-17A, y es capaz de promover la producción de IL-6, IL-8, y G-CSF a partir de una amplia variedad de células. De modo similar a IL-17A, es capaz de inducir la liberación de matriz de cartílago y de inhibir la síntesis de nueva matriz de cartílago (ver el documento U. S. 2002-0177188-A1 publicado el 28 de noviembre de 2002) . En consecuencia, al igual que IL-17A, IL-17F posiblemente contribuya a la patología de los trastornos inflamatorios. Se ha informado que tanto IL-17A como IL-17F son inducidos en las células T por la acción de interleucina 23 (IL-23) (Aggarwal, S., et al., J. Biol. Chem., 278 (3) : 1910-4 (2003)). Más específicamente, tanto IL-17A como IL-17F han sido implicadas como agentes contribuyentes de la progresión y la patología de diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunes en humanos y modelos murinos de enfermedades humanas. De hecho, IL-17A, y en menor grado IL-17F, han sido implicadas como citoquinas efectoras que desencadenan las respuestas inflamatorias y así contribuyen a numerosas enfermedades autoinflamatorias (autoinmunes) , incluso esclerosis múltiple ( S) , artritis reumatoide (RA) , y enfermedades inflamatorias intestinales (IBD) . Este linaje ha sido denominado Thi7 y la cantidad de estas células se correlaciona claramente con la progresión de la enfermedad y la severidad en modelos murinos de enfermedades autoinmunes humanas. Si bien el compromiso de IL-17A y IL-17F en las enfermedades inflamatorias parece ser claro, las células objetivo para estas citoquinas no se han identificado, debido en parte al hecho de que no se ha detectado el receptor de IL-17F. Recientemente se informó que IL-17RC es un receptor de IL-17A y IL-17F (Presnell, et al., J. Immunol. 179 ( 8 ): 5462-73 (2007)).

Inflamación y obesidad Un importante desarrollo reciente de nuestro conocimiento de la obesidad es la emergencia del concepto de que la inflamación y la diabetes se caracterizan por un estado de inflamación crónica de grado bajo. La base de esta visión es que los niveles elevados circulantes de varios marcadores de inflamación, tanto de citoquinas proinflamatorias como de proteínas de fase aguda, están elevados en los obesos; estos marcadores incluyen IL-6, el sistema TNF , la proteína C reactiva (CRP) y haptoglobina . Sin embargo, las implicaciones en términos del propio sitio de la inflamación, ya sea sistémica o local, no están definidas .

La resistencia a insulina, definida como una respuesta biológica inferior a la esperada ante una dosis determinada de insulina, es un correlato ubicuo de la obesidad. De hecho, se cree que muchas de las consecuencias patológicas de la obesidad incluyen la resistencia a insulina. Estas incluyen hipertensión, hiperlipidemia y, más notablemente, diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM) . La mayoría de los pacientes de NIDDM son obesos, y un componente muy central y temprano del desarrollo de NIDDM es la resistencia a insulina (Moller et al., New Eng. J. Med. , 325: 938 (1991)). Se ha demostrado que se desarrolla una anomalía posreceptor durante el curso de la resistencia a insulina, además de la regulación hacia abajo del receptor de insulina durante las fases iniciales de esta enfermedad (Olefsky et al., en Diabetes Mellitus, Rifkin y Porte, Jr . , Eds . (Elsevier Science Publishing Co . , Inc., Nueva York, ed. 4, 1990), pp . 121-153) .

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que los miembros de la familia IL-17, y en particular IL-17A y IL-17F, juegan un papel importante en la obesidad, la resistencia a insulina y otros trastornos asociados con la obesidad, tales como hiperlipidemia y el síndrome metabólico, y que los antagonistas de IL-17, especialmente los antagonistas de IL-17A y IL-17F, se pueden usar para tratar estas condiciones patológicas.

En un aspecto, la invención se ocupa de un método para tratar un trastorno de resistencia a insulina en un mamífero que comprende administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad efectiva de un antagonista de IL-17A y/o IL-17F.

En otro aspecto, la invención se ocupa de una composición farmacéutica que comprende un antagonista de IL-17A y/o IL-17F en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de un trastorno resistente a insulina .

En otro aspecto, la invención se ocupa del uso de un antagonista de IL-17A y/o IL-17F en el tratamiento de un trastorno de resistencia a insulina.

En aún otro aspecto, la invención se ocupa de un kit para tratar un trastorno de resistencia a insulina, en donde el kit comprende: (a) un contenedor que comprende un antagonista de IL-17A y/o IL-17F; y (b) un rótulo o instrucciones para administrar el anticuerpo para tratar el trastorno.

En todos los aspectos, en una modalidad, el trastorno es seleccionado del grupo que consiste de diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM) , obesidad, hiperandrogenismo ovárico, e hipertensión. En otra modalidad, el trastorno es NIDDM u obesidad.

En aún otra modalidad, el mamífero es humano y la administración es sistémica.

En aún otra modalidad, el antagonista IL-17A y/o IL-17F es un anticuerpo o uno de sus fragmentos, tales como un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos anti-IL-17A, anti-IL-17F, anti-IL-17A/F, anti-IL-17Rc y anti-IL-17RA o uno de sus fragmentos.

Con preferencia, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, incluso anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos, anticuerpos biespecíficos, multiespecífieos o con reacciones cruzadas.

En aún otra modalidad, el método incluye la administración de una cantidad efectiva de un agente para tratar la resistencia a insulina, tal como insulina, IGF-1, o una sulfonilurea .

En otra modalidad, el método incluye la administración de una cantidad efectiva de otro agente capaz de tratar el trastorno de resistencia a insulina, tales como Dickkopf-5 (Dkk-5) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La FIG. 1 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) de una secuencia nativa de cADN de IL-17A humana.

La FIG. 2 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de una secuencia nativa de IL-17A humana derivada de la secuencia codificadora de SEQ ID NO : 1 mostrada en la FIG. 1.

La FIG. 3 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 3) de una secuencia nativa de cADN de IL-17F humana.

La FIG. 4 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de una secuencia nativa de IL-17F humana derivada de la secuencia codificadora de SEQ ID NO : 3 mostrada en la FIG.3.

La FIG. 5 muestra una secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 5) que codifica la secuencia nativa del polipéptido receptor de IL-17 humana C (IL-17Rc) , es cual también se conoce como un clon designado "ADN164625-2890" .

La FIG. 6 muestra la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) del la secuencia nativa del polipéptido IL-17Rc humano (también denominado receptor IL-17RH2) .

FIG. 7 Diseño experimental de un estudio de modelo de dieta rica en grasas (HFD) que utiliza ratones IL-17RC KO .

FIGS . 8A - 8B Resultados a la semana 8 de un estudio de modelo de dieta rica en grasa (HFD) usando ratones IL-17RC KO .

FIGS. 9A - 9C Niveles de glucosa en ratones de tipo silvestre y IL-17Rc KO en el grupo control y el grupo de dieta rica en grasas. Los ratones IL-17RC KO son resistentes a la resistencia a insulina inducida por la dieta rica en grasas (HFD) .

FIG. 10 Área bajo la curva a la semana 10.

FIGS. 11A - 11B Resultados de peso corporal.

FIG. 12 Efecto de mAb anti-IL-17 y anti-IL-17F sobre el modelo de dieta HF resistente a insulina.

FIG. 13 Prueba de tolerancia a glucosa (GTT) en el período de dosis posterior a la semana 9.

FIGS. 14A - 14B Expresión ectópica de IL-17 A debida a la inyección de ADN de plásmido seguida de la prueba de tolerancia a glucosa (GTT) . Efecto de la sobreexpresión de IL-17 sobre el estado de resistencia a insulina evaluado mediante GTT.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A. Definiciones El término "IL-17" se usa para referirse en general a miembros de la familia IL-17, incluso IL-17A, IL-17, IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E, IL-17F, y IL-17A/F. Los IL-17 preferidos en la presente son IL-17A, IL-17F, y IL-17A/F.

Un "polipéptido de secuencia nativa de IL-17" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el correspondiente polipéptido IL-17 derivado de la naturaleza. El polipéptido de secuencia nativa de IL-17 se puede aislar de la naturaleza o puede ser producido por medios recombinantes o de síntesis. El término "polipéptido de secuencia nativa de IL-17" abarca específicamente las formas truncadas o secretadas que se encuentran en la naturaleza del polipéptido IL-17 específico (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes que se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y variantes alélicas del polipéptido que se encuentran en la naturaleza. En diversas modalidades de la invención, los polipéptidos de secuencia nativa de IL-17 descritos en la presente son polipéptidos maduros o de longitud total de secuencia nativa humana IL-17A, IL-17F, y IL-17A/F que comprenden la longitud total de las secuencias de aminoácidos mostrada en las Figuras 2 y 4 (SEQ ID ÑOs : 2 y 4) . Los codones de inicio y de detención se muestran en fuente negrita, y subrayados en las figuras.

El término "polipéptido de secuencia nativa IL-17RC" o "secuencia nativa IL-17Rc" se refiere a un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el correspondiente polipéptido IL-17Rc derivado de la naturaleza. Los polipéptidos de secuencias nativas IL-17Rc pueden ser aislados de la naturaleza o pueden ser producidos por medios recombinantes o de síntesis. El término "polipéptido de secuencia nativa IL-17Rc" abarca específicamente las formas truncadas o secretadas del polipéptido específico IL-17Rc que se encuentran en la naturaleza, las formas variantes que se encuentran en la naturaleza (por ejemplo, formas empalmadas alternativamente) y las variantes alélicas del polipéptido que se encuentran en la naturaleza. En diversas modalidades de la invención, el polipéptido de secuencia nativa IL-17Rc descrito en la presente es de longitud total de la secuencia nativa humana IL-17RC que comprende la longitud total de aminoácidos mostrada en las Figuras 6 (SEQ ID NO : 6) .

"Aislado" , cuando se usa para describir los diversos polipéptidos descritos en la presente, significa un polipéptido que ha sido identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales que generalmente interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos para el polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En formas preferidas de modalidad, el polipéptido será purificado (1) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria, o (2) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones no reductoras o reductoras mediante el uso de tinción de azul Coomassie o, con preferencia, de plata. El polipéptido aislado incluye polipéptido en situ dentro de células recombinantes , dado que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido IL-17 no estará presente. En condiciones ordinarias, sin embargo, se preparará el polipéptido aislado mediante al menos una etapa de purificación.

Tal como se usa en la presente, "obesidad" se refiere a una condición por la cual un mamífero tiene un índice de masa corporal (IMC) , el cual se calcula por el peso (kg) por la altura2 (metros), de al menos 25,9. Convencionalmente, las personas con peso normal tienen un IMC de 19,9 a menos de 25,9. La obesidad asociada con resistencia a insulina se incluye específicamente dentro de esta definición.

"Resistencia a insulina" o un "trastorno de resistencia a insulina" o una "actividad resistente a insulina" es una enfermedad, condición patológica o trastorno que resulta de una falla de la respuesta metabólica normal de los tejidos periféricos (insensibilidad) a la acción de insulina exogena, es decir, es una condición en la cual la presencia de insulina produce una respuesta biológica subnormal. En términos clínicos, hay resistencia a insulina cuando los niveles de glucosa en sangre normales o elevados persisten frente a niveles normales o elevados de insulina. Representa, en esencia, una inhibición de la síntesis de glucógeno, por lo cual la síntesis de glucógeno basal o estimulada por la insulina, o ambas, se reducen por debajo de los niveles normales. La resistencia a insulina juega u papel importante en la diabetes tipo 2, tal como se demuestra por el hecho de que la hiperglucemia presente en la diabetes tipo 2 en ocasiones se puede revertir con la dieta o la pérdida de peso suficiente, en apariencia, pare restablecer la sensibilidad de los tejidos periféricos a la insulina. El término incluye la tolerancia anormal a la glucosa, así como los muchos trastornos en los cuales la resistencia a insulina juega un papel clave, tales como obesidad, diabetes mellitus, hiperandrogenismo ovárico e hipertensión.

"Diabetes mellitus" se refiere a un estado de hiperglucemia crónica, es decir, exceso de azúcar en la sangre, como consecuencia de una falta relativa o absoluta de acción de la insulina. Hay tres tipos básicos de diabetes mellitus, tipo I o diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) , tipo II o diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM) , y tipo A de resistencia a insulina, si bien el tipo A es relativamente infrecuente. Los pacientes con diabetes de tipo I o de tipo II pueden hacerse insensibles a los efectos de la insulina exógena a través de diversos mecanismos. La resistencia a insulina de tipo A es el resultado de mutaciones en el gen receptor de insulina o de defectos en los sitios posteriores al receptor de acción crítica para el metabolismo de la glucosa. Los sujetos diabéticos pueden ser fácilmente reconocidos por el médico, y se caracterizan por la hiperglucemia, el deterioro de la tolerancia a la glucosa, la hemoglobina glucosilada y, en algunas instancias, cetoacidosis asociada con traumatismo o enfermedad.

"Diabetes mellitus no insulinodependiente" o "NÍDDM" se refiere a diabetes tipo II. Los pacientes con NIDDM tienen una concentración anormalmente elevada de glucosa sanguínea en ayunas y retraso de la captación celular de glucosa después de las comidas o después de una prueba de diagnóstico denominada prueba de tolerancia a glucosa. La NIDDM se diagnostica sobre la base de criterios reconocidos (American Diabetes Association, Physician's Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988; American Diabetes Association, Physician's Guide to no Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988) .

Los síntomas y las complicaciones de la diabetes que se desea tratar como trastorno definido en la presente incluyen hiperglucemia, control insatisfactorio de la glucemia, cetoacidosis, resistencia a insulina, niveles elevados de hormona de crecimiento, niveles elevados de hemoglobina glucosilada y productos finales de avanzada glucosilación (AGE) , fenómeno del amanecer, perfil lipídico insatisfactorio, enfermedad vascular (por ejemplo, aterosclerosis) , enfermedad microvascular , trastornos de la retina (por ejemplo, retinopatía diabética proliferativa) , trastornos renales, neuropatía, complicaciones del embarazo (por ejemplo, terminación prematura y defectos de nacimiento) y similares. Se incluyen en la definición de tratamiento los puntos finales tales como, por ejemplo, incremento de sensibilidad a la insulina, reducción de la dosis de insulina con mantenimiento del control de la glucemia, disminución de HbAlc, mejoramiento del control de la glucemia, reducción de las complicaciones vasculares, renales, neurales, retiñíanos, y otros de la diabetes, prevención o reducción del "fenómeno del amanecer", mejoramiento del perfil lipídico, reducción de las complicaciones del embarazo, y reducción de la cetoacidosis .

Una "composición terapéutica" o "composición" , tal como se usa en la presente, se define en que comprende Dkk-5 y un portador farmacéuticamente aceptable, tal como agua, minerales, proteínas, y otros excipientes conocidos por los expertos en la técnica.

El término "mamífero" a los fines del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluso sin limitaciones, humanos, roedores, animales deportivos, de zoológico, mascotas y domésticos o de granja tales como perros, gatos, vacas, ovejas, cerdos, caballos, y primates no humanos, tales como monos. Con preferencia los roedores son ratones o ratas. Con preferencia, el mamífero es un humano, también denominado en la presente paciente.

Tal como se usa en la presente, "tratar" describe el manejo y la atención de un mamífero con el fin de combatir cualquiera de las enfermedades o condiciones patológicas dirigidas de acuerdo con la presente invención, incluso, sin limitación, resistencia a insulina, diabetes mellitus, hiperinsulinemia, hipoinsulinemia, u obesidad e incluye la administración para prevenir el inicio de los síntomas o complicaciones, aliviar los síntomas o complicaciones, o eliminar la's enfermedades o condiciones patológicas a las cuales está dirigida.

A los fines de la presente invención, el "tratamiento" clínico beneficioso o deseado da por resultado la reducción de resistencia a insulina que incluye, sin limitaciones, alivio de síntomas asociados con resistencia a insulina, disminución del grado de los síntomas de resistencia a insulina, estabilización (es decir, no agravamiento) de los síntomas de resistencia a insulina (por ejemplo, reducción de requisito de insulina) , incremento de la sensibilidad a insulina y/o la secreción de insulina para impedir la falla de las células de los islotes, y el retraso o freno de la progresión de la resistencia a insulina, por ejemplo, la progresión de la diabetes.

Respecto de la obesidad, el "tratamiento" generalmente se refiere a reducir el IMC del mamífero a menos de aproximadamente 25,9, y mantener el peso durante al menos 6 meses. El tratamiento de preferencia da por resultado una reducción de la ingesta de alimentos o calórica por parte del mamífero. Además, el tratamiento en este contexto se refiere a impedir que ocurra la obesidad si el tratamiento se administra antes del inicio de la condición obesa. El tratamiento incluye la inhibición y/o la completa supresión de la lipogénesis en mamíferos obesos, es decir, la excesiva acumulación de lípidos en las células grasas, la cual es una de las principales características de la obesidad human y animal, así como la pérdida del peso corporal total.

Aquellos "en necesidad de tratamiento" incluyen mamíferos que ya padecen el trastorno, así como los que tienen tendencia a tener el trastorno, incluso aquellos en los cuales se desea prevenir el trastorno.

Un "agente para tratar la resistencia a insulina" es un agente distinto del antagonista de IL-17 que se usa para tratar la resistencia a insulina, tales como, por ejemplo, Dickkopf-5 (Dkk-5) (ver, por ejemplo, la Publicación de la solicitud de los Estados Unidos N.° 2005/0170440), y agentes hipoglucemiantes . Los ejemplos de los agentes de tratamiento incluyen insulina (una o más insulinas diferentes) ; insulinomiméticos tales como una insulina de molécula pequeña, por ejemplo, L-783,281; análogos de insulina (por ejemplo, insulina HUMALOG8 (Eli Lilly Co . ) , insulina LysB28/ insulina ProB29/ o insulina AspB2i o las descritas, por ejemplo, en las patentes de los Estados Unidos N.° 5. 149.777 y 5.514.646), o sus fragmentos fisiológicamente activos; péptidos relacionados con insulina (péptido C, GLP-1, factor de crecimiento símil insulina -I (IGE-1) , o complejo IGF-l/IGFBP-3) o sus análogos o fragmentos; ergoset; pramlintida; leptina; BAY-27-9955; T-1095; antagonistas de inhibidor tirosina cinasa de receptor de insulina; antagonistas de la función de TNF-OC; un agente liberador de hormona de crecimiento; amilina o anticuerpos contra amilina; un sensibilizador de insulina, tal como compuestos de la familia de glitazonas, incluso los descritos en la patente de los Estados Unidos N.° 5.753.681, tales como troglitazona, pioglitazona, englitazona, y compuestos relacionados; Linalol solo o con Vitamina E (patente de los Estados Unidos N.° 6.187.333); mejoradores de la secreción de insulina tales como nateglinida (AY-4166) , ( 2S) -2-bencil-3- (cis-hexahidro-2-isoindolinilcarbonil ) propionato de calcio dihidrato (mitiglinida, KAD-1229) , y repaglinida; fármacos de sulfonilurea, por ejemplo, acetohexamida, clorpropamida, tolazamida, tolbutamida, glucopiramida y su sal de amonio, glibenclamida, glibomurida, gliclazida, l-butil-3-metanililurea, carbutamida, glipizida, gliquidona, glisoxepida, glibutiazol, glibuzol, glihexamida, gliymidina, glipinamida, fenbutamida, tolciclamida, glimepirida, etc.; biguanidas (tales como denformina, metformina, buformina, etc.); inhibidores de a-glucosidasa (tales como acarbosa, voglibosa, miglitol, emiglitato, etc.), y tratamientos no típicos tales como trasplante de páncreas o reactivos autoinmunes .

Un "agente de pérdida de peso" se refiere a una molécula de utilidad para el tratamiento o la prevención de la obesidad. Las moléculas incluyen, por ejemplo, hormonas (catecolaminas , glucagón, ACTH, y hormona de crecimiento combinada con IGF-1) ; la proteína Ob; clofibrato; halogenato; cincocaína; clorpromazina ,- fármacos supresores del apetito que actúan sobre neurotransmisores noradrenérgicos tales como mazindol y derivados de fenetilamina, por ejemplo, fenilpropanolamina, dietilpropiona, fentermina, fendimetrazina, benzfetamina, anfetamina, metanfetamina y fenmetrazina; fármacos que actúan sobre neurotransmisores de serotonina tales como fenfluramina, triptófano, 5-hidroxitriptófano, fluoxetina, y sertralina; fármacos de acción central tales como naloxona, neuropéptido-Y, galanina, hormona liberadora de corticotropina y colecistocinina ; un agonista colinérgico tal como poridos igmina; un esfingolípido tal como un lisoesfingolípido o sus derivados; fármacos termogénicos tales como hormona tiroidea; efedrina; agonistas beta-adrenérgicos ; fármacos que afectan el tracto gastrointestinal tales como inhibidores de enzimas, por ejemplo tetrahidrolipostatina , alimentos indigeribles tales como poliéster de sacarosa, e inhibidores de vaciamiento gástrico tales como ácido treoclorocítrico o sus derivados; agonistas beta-adrenérgicos tales como isoproterenol y yohimbina; aminofhilina para incrementar los efectos símil beta adrenérgicos de yohimbina, un fármaco bloqueador oc2-adrenérgico tal como clonidina sola o en combinación Con un a péptido liberador de hormona de crecimiento; fármacos que interfieren con la absorción intestinal tales como biguanidas tales como metformina y fenformina; rellenos de masa tales como metilcelulosa; fármacos bloqueadores metabólicos tales como hidroxicitrato; progesterona; agonistas de colecistocinina ; moléculas pequeñas que simulan cetoácidos; agonistas de hormona liberadora de corticotropina ; un compuesto inhibidor de prolactina relacionado con ergot para reducir los depósitos de grasa del organismo (patente de los Estados Unidos N.° 4.783.469 emitida el 8 de noviembre de 1988); beta-3-agonistas ; bromocriptina ; antagonistas péptidos opioides; antagonistas de neuropéptido Y; antagonistas de receptor de glucocorticoides ; agonistas de hormona del crecimiento; sus combinaciones; etc.

Tal como se usa en la presente, "insulina" se refiere a cualquiera y todas las sustancias que tienen acción de insulina, y se ejemplifican, por ejemplo, animal insulina extraída de páncreas bovino o porcino, insulina humana semisintética que es sintetizada enzimáticamente a partir de insulina extraída de páncreas porcino e insulina humana sintetizada por técnicas de ingeniería genética que generalmente usan E. coli o levaduras, etc. Además, la insulina puede incluir un complejo de insulina-zinc que contiene aproximadamente 0,45 a 0,9 (p/p)% de zinc, protamina-insulina-zinc producida a partir de cloruro de zinc, sulfato de protamina e insulina, etc. La insulina puede estar en la forma de sus fragmentos o derivados, por ejemplo, INS-1. La insulina también puede incluir sustancias símil insulina tales como L83281 y agonistas de insulina. Si bien la insulina está disponible en diversos tipos tales como de acción superinmediata, de acción inmediata, de acción bimodal, de acción intermedia, de acción prolongada, etc., estos tipos se pueden seleccionar en forma adecuada de acuerdo con la condición del paciente.

Una "composición terapéutica" , tal como se usa en la presente, se define por comprender un antagonista de IL-17 (incluso antagonistas IL-17A y IL-17F) y un portador farmacéuticamente aceptable, tal como agua, minerales, proteínas, y otros excipientes conocidos por los expertos en la técnica.

Las expresiones, "antagonista", "antagonistas de IL-17 (A y/o F) " , "antagonistas de IL-17 (A y/o F) " y similares dentro del alcance de la presente invención se entienden con inclusión de cualquier molécula que interfiere con la función de IL-17, tal como IL-17A y/o IL-17F, o que bloquea o neutraliza una actividad relevante de IL-17 (tal como IL-17A y/o F) , por cualquier medio, según la indicación tratada.

Puede prevenir la interacción entre IL-17 (incluso IL-17 y IL-17F) y uno o más de sus receptores. Los agentes logran este efecto de diversas maneras. Por ejemplo, la clase de antagonistas que "neutralizan" una actividad de IL-17 se fijan a IL-17, o a un receptor de IL-17, con suficiente afinidad y especificidad para interferir con IL-17 tal como se define más adelante. Un anticuerpo "que fija" IL-17, o un receptor de IL-17 (por ejemplo IL-17Rc) , es una capaz de fijar el antígeno suficiente afinidad para que el anticuerpo sea útil como agente terapéutico dirigido contra una célula que expresa el receptor IL-17 o IL-17. El término "antagonista de IL-17" se usa en referencia a cualquiera y todos los antagonistas de IL-17A, IL-17F y IL-17A/F.

Se incluyen en este grupo de antagonistas, por ejemplo, los anticuerpos dirigidos contra IL-17 o sus porciones, reactivos con IL-17, o un receptor de IL-17 o sus porciones, con inclusión específicamente de los anticuerpos contra IL-17A y/o IL-17F y IL-17RC. El término también incluye cualquier agente que pueda interferir con la sobreproducción de IL-17A y/o IL-17F o antagonizar al menos un receptor de IL-17 (por ejemplo IL-17A y/o IL-17F) , tal como IL-17RC Los antagonistas pueden estar en la may forma de híbridos quiméricos, de utilidad para combinar la función del agente con una proteína portadora a fin de incrementar la vida media sérica del agente terapéutico o conferir tolerancia cruzada de especies. En consecuencia, los ejemplos de los antagonistas incluyen moléculas bioorgánicas (por ejemplo, peptidomiméticos) , anticuerpos, proteínas, péptidos, glucoproteínas , glucopéptidos , glucolípidos , polisacáridos , oligosacáridos , ácidos nucleicos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control de transcripción y traducción, y similares. En una modalidad preferida, el antagonista es un anticuerpo que tiene las propiedades deseadas de fijación de IL-17A y/o IL-17F, y de prevención de su interacción con un receptor, con preferencia IL-17Rc.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente, por ejemplo, anticuerpos monoclonales aislados anti-IL-17A/F o anti-IL17A o anti-IL-17F (incluso anticuerpos agonistas, antagonistas y neutralizantes) , las correspondientes composiciones de anticuerpo con especificidad poliepitópica, anticuerpos policlonales , anticuerpos de cadena única, y fragmentos de anticuerpo (ver más adelante) siempre que exhiban la actividad biológica o inmunológica deseada.

La unidad básica de anticuerpo de cuatro cadenas es una glucoproteína heterotetramérica compuesta por dos cadenas idénticas livianas (L) y dos cadenas idénticas pesadas (H) (un anticuerpo IgM consiste de 5 de las unidades básicas heterotetraméricas junto con un polipéptido adicional denominado cadena J, y en consecuencia contiene 10 sitios de fijación del antígeno, mientras que los anticuerpos IgA secretados se pueden polimerizar para formar ensamblados polivalentes que comprenden 2-5 de las unidades básicas de cuatro cadenas junto con la cadena J) . En el caso de IgG, la unidad de cuatro cadenas es de general aproximadamente 150.000 dalton. Cada cadena L está ligada a una cadena H mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que las dos cadenas H están ligadas entre sí por uno o más enlaces disulfuro según el isotipo de cadena H. Cada cadena H y L también presenta puentes disulfuro intracatenarios a espacios regulares. Cada cadena H tiene en el N-teriminal un dominio variable (VH) seguido de tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas a y ? y cuatro dominios CH para los isotipos µ y e. Cada cadena L tiene en el N-teriminal, un dominio variable (VL) seguido de un dominio constante (CL) en el otro extremo. El VL se alinea con el VH y el CL se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada (CHi) . Se cree que residuos particulares de aminoácidos forman una interfaz entre los dominios variables de las cadenas livianas y las cadenas pesadas . El apareamiento de VH y VL forma en conjunto un sitio único de fijación del antígeno. Para la estructura y las propiedades de las diferentes clases de anticuerpos, ver, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8o edición, Daniel P. Stites, Abba I. Terr y Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Norwalk, Conn., 1994, página 71 y Capítulo 6.

La cadena L proveniente de cualquier especie de vertebrado se asigna a uno de dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa y lambda, sobre la base de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes. Según la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) , las inmunog1obulinas se pueden asignar a diferentes clases o isotipos. Hay cinco clases de inmunog1obulinas : IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las clases ? y a están subdivididas en subclases sobre la base de diferencias relativamente menores de la secuencia y la función de CH, por ejemplo, los humanos expresan las siguientes subclases: IgGl, IgG2 , IgG3, IgG4 , IgAl e IgA2.

El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios variables difieren extensamente en secuencia entre los anticuerpos. El dominio V media la fijación al antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular por su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida en forma uniforme a través del espectro de 110 aminoácidos de los dominios variables. En cambio, las regiones V consisten de porciones relativamente invariables denominadas regiones marco (FR) de 15-30 aminoácidos, separadas por regiones más cortas de extrema variabilidad denominadas "regiones hipervariables" que miden cada una 9-12 aminoácidos de longitud. Los dominios variables de las cadenas pesadas y livianas nativas comprenden cada uno cuatro FR, que por lo general adoptan una configuración de lámina beta, conectadas por tres regiones hipervariables, las cuales forman giros que conectan, y en algunos casos forman parte de la estructura de lámina beta. Las regiones hipervariables de cada cadena se mantienen unidas en estrecha proximidad mediante las FR y, con las regiones hipervariables provenientes de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de fijación del antígeno de los anticuerpos (ver Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5o Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Los dominios constantes no intervienen directamente en la fijación de un anticuerpo a un antígeno, pero exhiben diversas funciones efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) .

El término "región hipervariable" cuando se usa en la presente se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión con el antígeno. La región hipervariable generalmente comprende residuos de aminoácidos provenientes de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo alrededor de aproximadamente los residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en VL, y alrededor de aproximadamente 1-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en VH; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5o Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) y/o los residuos de un "giro hipervariable" (por ejemplo los residuos 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en VL, y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en VH; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196 : 901-917 (1987) ) .

La expresión "anticuerpo monoclonal" tal como se usa en la presente se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto respecto de posibles mutaciones que ocurren naturalmente, que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, y están dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales , que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal está dirigido contra un único determinante en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos en cuanto a que se pueden sintetizar sin contaminaciones de otros anticuerpos. El anticuerpo monoclonal generalmente incluye un anticuerpo que comprende una región variable que se fija a un blanco, en donde el anticuerpo se obtiene por un proceso que incluye la selección del anticuerpo de una pluralidad de anticuerpos. Por ejemplo, el proceso de selección puede ser la selección de un clon singular dentro de una pluralidad de clones, tales como un pool de clones de hibridoma, clones de fago o clones de ADN recombinante . Se debe entender que el anticuerpo seleccionado también se puede alterar, por ejemplo, para mejorar la afinidad por el objetivo, para humanizar el anticuerpo, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenicidad in vivo, para crear un anticuerpo multiespecífico, etc., y que un anticuerpo que comprende la secuencia alterada de la región variable es también un anticuerpo monoclonal de la presente invención. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpo monoclonal son ventajosas en cuanto a que generalmente no están contaminadas con otras inmunoglobulinas . El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo por ser obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, y no se debe interpretar como que requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales usados de acuerdo con la presente invención se pueden fabricar por diversas técnicas, incluso el método del hibridoma (por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2 ° ed. 1988); Hammerling et al., en: Monoclonal antiobodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N. Y., 1981), métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567), tecnologías de disposición de fagos (ver, por ejemplo, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Mol. Biol. 338 (2 ) : 299-310 (2004); Lee et al., J. Mol. Biol. 340 (5) : 1073-1093 (2004); Fellouse, Proc . Nat. Acad. Sci . USA 101 ( 34 ): 12467-12472 (2004); y Lee et al. J. Immunol . Methods 284 ( 1-2 ): 119-132 (2004) y tecnologías para la producción de anticuerpos humanos o símil human de animales que tienen partes o la totalidad de los loci de las inmunoglobulinas humanas o genes que codifican secuencias de inmunoglobulinas humanas (ver, por ejemplo, los documentos WO 98/24893, O/9634096, WO/9633735, y WO/9110741, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); las patentes de los Estados Unidos N.° 5.545.806. 5.569.825. 5.591.669 (todas de GenPharm) ; 5.545.807; el documento WO 97/17852, las patentes de los Estados Unidos N. ° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; y 5.661.016, y Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996); y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93 (1995).

Los anticuerpos monoclonales en la presente incluyen anticuerpos "quiméricos" en los cuales una porción de la cadena pesada y/o la cadena liviana es idéntica u homologa a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a un anticuerpo de una clase o subclase particular, mientras que el resto de la(s) cadena (s) es idéntica u homologa a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a un anticuerpo de otra clase o subclase particular, así como fragmentos de los anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (ver la patente de los Estados Unidos . ° 4.816.567; y Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Los anticuerpos quiméricos de interés en la presente incluyen anticuerpos "primatizados" que comprenden secuencias de dominio variable fijadoras de antígeno derivadas de un primate no humano (por ejemplo mono del viejo mundo, simio etc.), y las secuencias de la región constante humana.

Un anticuerpo "intacto" es aquel que comprende un sitio fijador del antígeno así como una CL y al menos dominios constantes de la cadena pesada, CH1, CH2 y CH3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de la secuencia nativa (por ejemplo dominios constantes de la secuencia nativa humana) o la secuencia variante de aminoácidos correspondiente. Con preferencia, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectoras ; Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, con preferencia la región fijadora de antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen Fab, Fab ' , F(ab')2, y los fragmentos Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales (ver la patente de los Estados Unidos N.° 5.641.870, Ejemplo 2; Zapata et al., Protein Eng. 8(10): 1057-1062

[1995]); moléculas de anticuerpo monocatenarias ; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. En una modalidad, el fragmento es "funcional", es decir, retiene cualitativamente la capacidad del correspondiente anticuerpo intacto para fijar los polipéptidos IL-17A y IL-17F objetivos y, si el anticuerpo intacto también inhibe la actividad biológica o función de IL-17A/F, también retiene cualitativamente la propiedad inhibitoria. La retención cualitativa significa que se mantiene el tipo de la actividad, pero el grado de afinidad de unión y/o actividad puede diferir.

La digestión con papaína de los anticuerpos produce dos fragmentos fijadores de antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab", y un fragmento residual "Fe", una designación que refleja la capacidad para cristalizad fácilmente. El fragmento Fab consiste de toda una cadena L además del dominio de la región variable de la cadena H (VH) , y el primer dominio constante de una cadena pesada (CHi) . Cada fragmento Fab es monovalente con respecto a la fijación del antígeno, es decir, posee un único sitio fijador del antígeno. El tratamiento con pepsina de un anticuerpo produce un único fragmento grande F(ab')2 que a groso modo se corresponde con dos fragmentos Fab unidos por enlaces disulfuro que tienen actividad fijadora de antígeno divalente y aún es capaz de formar enlaces cruzados con el antígeno. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por tener pocos residuos adicionales en el carboxilo-terminal del dominio CHi incluso una i más cisteínas provenientes de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación en la presente para Fab1, en donde el(os) residuo(s) de cisteína de los dominios constantes portan un grupo tiol libre. Los fragmentos F(ab')2 de anticuerpo originalmente se producían como pares de fragmentos Fab1 que tenían cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos de fragmentos de anticuerpo.

El fragmento Fe comprende las porciones carboxiterminales de ambas cadenas H que se mantienen unidas mediante disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan mediante las secuencias de la región Fe, en donde la región también es la parte reconocida por los receptores Fe (FcR) que se encuentra en ciertos tipos de células.

"Fv" es el mínimo fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de reconocimiento y de fijación del antígeno completo. Este fragmento consiste de un dímero de un dominio de región variable de cadena pesada y un dominio de región variable de cadena liviana en estrecha asociación no covalente . Del plegamiento de estos dos dominios emanan seis giros hipervariables (3 giros de cada una de las cadenas H y L) que contribuyen con los residuos de aminoácidos en la fijación del antígeno y confieren especificidad de fijación del antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable aislado (o la mitad de un Fv que comprende sólo tres CDR específicos para un antígeno) tiene capacidad para reconocer y fijar el antígeno, aunque con menor afinidad que la totalidad del sitio de unión.

"Fv monocatenario" también abreviado "sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpo que comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo conectados en una única cadena de polipéptidos . Con preferencia, el polipéptido sFv también comprende un ligador de polipéptido entre los dominios VH y VL, lo cual permite al sFv formar la estructura deseada para la fijación del antígeno. Para una revisión de sFv, ver Pluckthun en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer-Verlag, Nueva York, p . 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, infra.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños · fragmentos de anticuerpo preparadas al construir fragmentos sFv (ver el párrafo precedente) con ligadores cortos (aproximadamente 5-10 residuos) entre los dominios VH y VL de manera tal que se logra el apareamiento intercatenario pero no intracátenario de los dominios V, lo cual da por resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tiene dos sitios fijadores de antígeno. Los diacuerpos biespecífieos son heterodímeros de dos fragmentos sFv "de cruzamiento" en los cuales los dominios VH y VL de los dos anticuerpos se encuentren en diferentes cadenas de polipéptidos . Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).

Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, roedores) son anticuerpos quiméricos que contienen mínimas secuencias derivadas del anticuerpo no humano. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en el cual los residuos provenientes de una región hipervariable del receptor están reemplazados por residuos provenientes de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, la afinidad y la capacidad adecuada del anticuerpo. En algunas instancias, los residuos de la región de marco (FR) de la inmunoglobulina humana son reemplazados por los correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo del receptor o en el anticuerpo del donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el desempeño del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprende sustancialmente la totalidad de al menos uno, y generalmente dos dominios variables, en los cuales la totalidad o sustancialmente la totalidad de los giros hipervariables se corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y la totalidad o sustancialmente la totalidad de los FR son los de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprende al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , generalmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332 : 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op . Struct . Biol . 2:593-596 (1992) .

La expresión "anticuerpo multiespecífico" se usa en el sentido más amplio y cubre específicamente un anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena liviana (VL) , en donde la unidad VHVL tiene especificidad poliepitópica (es decir, es capaz de fijarse a dos epítopos diferentes en una molécula biológica o cada epítopo en una molécula biológica diferente) . Los anticuerpos multiespecífieos incluyen, sin limitaciones, anticuerpos de longitud total, anticuerpos que tienen dos o más dominios VL y VH, fragmentos de anticuerpo tales como Fab, Fv, dsFv, scFv, diacuerpos, diacuerpos y triacuerpos biespecíficos , fragmentos de anticuerpo que se han ligado en forma covalente o no covalente.

"Especificidad poliepitópico" se refiere a la capacidad para ligarse específicamente a dos o más epítopos diferentes en el mismo o diferente(s) objetivo(s).

"Monoespecífico" se refiere a la capacidad para fijarse sólo a más de un epítopo. De acuerdo con una modalidad, el anticuerpo multiespecífico en una forma de IgGl se fija a cada epítopo con una afinidad de 5 µ? a 0,001 pM, 3 µ? a 0,001 pM, 1 µ? a 0,001 pM, 0,5 µ? a 0,001 pM o 0,1 µ? a 0,001 pM.

Un "anticuerpo con reacciones cruzadas" es un anticuerpo que reconoce epítopos idénticos o similares en más de un antígeno. En consecuencia, los anticuerpos con reacciones cruzadas de la presente invención reconocen epítopos idénticos o similares presentes en IL-17A y IL-17F. En una forma particular de modalidad, el anticuerpo con reacciones cruzadas usa el mismo o esencialmente el mismo paratopo para fijarse a IL-17A y IL-17F. Con preferencia, el anticuerpo con reacciones cruzadas en la presente también bloquea la función de IL-17A y IL-17F (actividad) .

El término "paratopo" se usa en la presente para referirse a la parte de un anticuerpo que se fija a un antígeno objetivo.

Un "anticuerpo dependiente de especie" por ejemplo, un anticuerpo de mamífero anti-I.L-17A/F, es un anticuerpo que tiene una afinidad de unión más fuerte por un antígeno proveniente de una especie de mamífero que la por un homólogo homologue del antígeno proveniente de una segunda especie de mamífero. Normalmente, el anticuerpo dependiente de especie "se fija específicamente" a un antígeno humano (es decir, tiene un valor de afinidad de unión (Kd) no superior a aproximadamente 1 x 10~7 M, con preferencia no superior a aproximadamente 1 x 10~8 M y con mayor preferencia no superior a aproximadamente 1 x 10~9 M) pero tiene afinidad de unión por un homólogo del antígeno de una segunda especie de mamífero no humano que es al menos aproximadamente 50 veces, o al menos aproximadamente 500 veces, o al menos aproximadamente 1000 veces más débil que su afinidad de unión por el antígeno humano. El anticuerpo dependiente de especie puede ser de cualquiera de los diversos tipos de anticuerpo definidos con anterioridad, pero con preferencia es un anticuerpo humanizado o humano.

Un anticuerpo "que se fija" a un antígeno de interés, es uno que se fija al antígeno con suficiente afinidad para que el anticuerpo sea útil como agente de diagnóstico y/o terapéutico al dirigirse a la células o el tejido que expresa el antígeno, y no forma significativamente reacciones cruzadas con otras proteínas. En las modalidades, el grado de fijación del anticuerpo a una proteína "sin objetivo" ser inferior a aproximadamente el 10% de la fijación del anticuerpo a su proteína objetivo particular, según se determina por análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) o por radioinmunoprecipitación (RIA) . Con respecto de la fijación de un anticuerpo a una molécula objetivo, el término "unión específica" o "fijación específica a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo con un objetivo de polipéptido particular significa la unión que es mediblemente diferente de una interacción no específica. La unión específica se puede medir, por ejemplo, al determinar la unión de una molécula comparada con la unión de una molécula control, la cual generalmente es una molécula de estructura similar que no tiene actividad de fijación. Por ejemplo, se puede determinar la unión específica por competencia con una molécula control que es similar al objetivo, por ejemplo, un exceso de un objetivo no rotulado. En este caso, se indica la unión específica si la fijación del objetivo rotulado a una sonda está inhibida competitivamente por un exceso del objetivo rotulado. El término "unión específica" o "fijación específica a" o es "específico para" un polipéptido particular o un epítopo en un objetivo de polipéptido particular tal como se usa en la presente puede ser exhibido, por ejemplo, por una molécula que tiene una Kd para el objetivo de al menos aproximadamente 10-4 M, alternativamente al menos aproximadamente 10"5 M, alternativamente al menos aproximadamente 10" -6 M, alternativamente al menos aproximadamente 10' -7 M, alternativamente al menos aproximadamente 10 -8 M, alternativamente al menos aproximadamente 10 -9 M, alternativamente al menos aproximadamente 10" -10 M, alternativamente al menos aproximadamente 10' -11 M, a11ernativamente al menos aproximadamente lO"12 M, o mayor. En una modalidad, el término "unión específica" se refiere a una unión en la cual una molécula se fija a un polipéptido particular o epítopo en un polipéptido particular sin fijarse sustancialmente a cualquier otro polipéptido o epítopo de polipéptido. En formas preferidas de modalidad, la afinidad específica de unión es al menos de aproximadamente 10"10 M.

Las "funciones efectoras" de un anticuerpo se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de secuencia nativa o una secuencia de aminoácidos de una región variante de Fe) de un anticuerpo, y varían con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de efectos y funciones del anticuerpo incluyen: fijación de Clq y citotoxicidad dependiente del complemento; fijación del receptor de Fe; citotoxicidad dependiente de anticuerpo mediada por células (ADCC) ; fagocitosis; regulación hacia debajo de los receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de células B) ; y activación de células B.

"Citotoxicidad dependiente de anticuerpo mediada por células" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig secretada ligada a los receptores de Fe (FcR) presenten en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, las células asesinas naturales (NK) , neutrófilos, y macrófagos) permiten a estas células efectoras citotóxicas fijarse específicamente a una célula objetivo portadora de antígeno y luego eliminar la células objetivo mediante citotoxinas. El "brazo" de anticuerpo de las células citotóxicas es un requerimiento absoluto para la eliminación. Las células primarias para mediar ADCC, las células NK, sólo expresan FCYRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI , FcyRII y FCYRIII. La expresión de FcR en las células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-92 (1991). Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, tal como el descrito en las patentes de los Estados Unidos Nros . 5.500.362 ó 5.821.337.

Las células efectoras útiles para analizar incluyen células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y células asesinas naturales (NK) . Alternativamente, o además, la actividad de ADCC de la molécula de interés puede ser evaluada in vivo, por ejemplo, en un moleo animal tal como el descrito en Clynes et al. Proc . Nati. Acad. Sci. U.S. A. 95:652-656 (1998) .

El "receptor de Fe" o "FcR" describe un receptor que se fija a la región Fe de un anticuerpo. El FcR preferido es un FcR humano de secuencia nativa. Además, un FcR preferido es uno que se fija a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI , FcyRII y FcyRIII, incluso las variantes alélicas y alternativamente las formas empalmadas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcTRIIA (un "receptor activador") y Fcy RIIB (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmáticos . El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación basado en un inmunorreceptor de tirosina (ITAM) en su dominio citoplasmático . El receptor inhibidor FcyRUB contiene un motivo de inhibición basado en un inmunorreceptor de tirosina (ITIM) en su dominio citoplasmático. (ver la revisión M. en Daeron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). Los FcR son revistos en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Otros FcR, incluso los identificados en el futuro, están abarcados por el término "FcR" en la presente. El término también incluye el receptor neonatal, FcRn, el cual es responsable de la transferencia de IgG maternos al feto (Guyer et al., J. Immunol . 117:587 (1976) y Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)).

Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. Con preferencia, las células expresan al menos FcyRIII y realizan funciones efectoras de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median ADCC incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) , las células asesinas naturales (NK) , los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos; con preferencia por las PBMC y las células NK. Las células efectoras se pueden aislar de una fuente nativa, por ejemplo, de la sangre.

La "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula objetivo en presencia de complemento. La activación de la vía clásica del complemento se inicia por la fijación del primer componente del sistema del complemento (Clq) a los anticuerpos (de la subclase adecuada) los cuales están unidos a su antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, se puede realizar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano- Santoro et al., Immunol . Methods 202:163 (1996).

Los términos "neutralizar" y "neutralizar la actividad de" se usan en la presente con el significado, por ejemplo, de bloquear, impedir, reducir, contrarrestar la actividad, o transformar en ineficaz la IL-17 (por ejemplo IL-17A y/o IL-17F) por cualquier mecanismo. En consecuencia, el antagonista puede impedir un proceso de fijación necesario para la activación de IL-17.

Por "anticuerpo neutralizante" se entiende una molécula de anticuerpo definida como en la presente que es capaz de bloquear o reducir significativamente una función efectora de IL-17 (incluso IL-17A y/o IL-17F) . Por ejemplo, un anticuerpo neutralizante puede inhibir o reducir la capacidad de IL-17 (por ejemplo IL-17A y/o IL-17F) para interactuar con un receptor de IL-17, tal como IL-17RC. Alternativamente, el anticuerpo neutralizante puede inhibir o reducir la capacidad de IL-17 para bloquear la vía de señales del receptor IL-17. El anticuerpo neutralizante también puede fijarse inmunoespecíficamente a IL-17 en un inmunoensayo para la actividad de IL-17. Es característico del "anticuerpo neutralizante" de la invención que retiene su actividad funcional situaciones in vitro e in vivo.

B. Descripción a detalle 1. Usos terapéuticos La resistencia a insulina es una condición patológica en la cual la presencia de insulina produce una respuesta biológica subnormal. En términos clínicos, la resistencia a insulina está presente cuando los niveles normales o elevados de glucosa sanguínea persisten frente a niveles normales o elevados de insulina. En esencia representa una inhibición de la síntesis de glucógeno, por lo cual la síntesis de glucógeno basal o estimulada por insulina, o ambos, están reducidos por debajo de los niveles normales. La resistencia a insulina juega un papel importante en la diabetes tipo 2, tal como se demuestra por el hecho de que la hiperglucemia presente en la diabetes tipo 2 en ocasiones se puede revertir mediante dieta o pérdida de peso en forma suficiente, aparentemente, para restablecer la sensibilidad de los tejidos periféricos a la insulina.

La presente invención se ocupa del tratamiento de la resistencia a insulina o diabetes tipo 2 por administración de un antagonista de IL-17A y/o IL-17F. Tal como se analizó con anterioridad, el antagonista de IL-17A y/o IL-17F puede ser cualquier molécula que interfiere con la función de IL-17A y/o IL-17F, o bloquea o neutraliza una actividad importante de IL-17A y/o F, por cualquier medio, según la indicación del tratamiento. Puede impedir la interacción entre IL-17A y/o IL-17F y uno o más de sus receptores, especialmente IL-17Rc. Los agentes logran este efecto de diversas formas. Por ejemplo, la clase de antagonistas que neutralizan una actividad de IL-17A y/o IL-17F se fijarán a IL-17A y/o IL-17F, o a un receptor de IL-17A y/o IL-17F, especialmente IL-17RC, con suficiente afinidad y especificidad para interferir con IL-17A y/o IL-17F. 2. Administración y formulaciones El antagonista de IL-17 se puede administrar por cualquier vía adecuada, incluso una vía de administración parenteral tal como, sin limitaciones, intravenosa (IV) , intramuscular (IM) , subcutánea (SC) , e intraperitoneal (IP) , así como las vías transdérmica, bucal, sublingual, intrarrectal , intranasal e inhalatoria. La administración IV, IM, SC, e IP pueden ser por bolo o infusión, y en el caso de SC, también puede ser mediante un dispositivo implantable de liberación lenta, incluso, sin limitaciones bombas, formulaciones de liberación lenta, y dispositivos mecánicos. Con preferencia, la administración es sistémica.

Un método específicamente preferido para la administración de antagonista de IL-17 es por infusión subcutánea, particularmente mediante el uso de un dispositivo de infusión medida, tal como una bomba. La bomba puede ser reutilizable o desechable, e implantable o de montaje externo. Las bombas de infusión de medicación que se emplean con utilidad con este fin incluyen, por ejemplo, las bombas descritas en las patentes de los Estados Unidos Nros . 5.637.095, 5.569.186 y 5.527.307. Las composiciones se pueden administrar en forma continua desde los dispositivos, o en forma intermitente.

Las formulaciones terapéuticas de antagonistas de IL-17 adecuados para el almacenamiento incluyen mezclas del antagonista que tienen el grado deseado de pureza con portadores, excipientes, o estabilizantes farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16° edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes, o estabilizantes aceptables son no tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas, e incluyen buffer tales como fosfato, citrato, y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencilamonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquilparabenos tales como metil o propilparabeno ; catecol; resorcinol; ciclohexanol ; 3-pentanol; y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (inferior a aproximadamente 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tales como polivinilpirrolidona ; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos , disacáridos, y otros hidratos de carbono que incluyen glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos de metal (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) ; y/o agentes tensioactivos no iónicos tales como TWEENT™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG) . Las formulaciones liofilizadas preferidas de anticuerpo anti-IL-17 se describen en el documento O 97/04801. Estas composiciones comprenden antagonistas de IL-17 que contienen desde aproximadamente 0,1 a 90% en peso del antagonista activo, con preferencia en una forma soluble, y más generalmente desde aproximadamente 10 a 30%.

Los ingredientes activos también pueden ser atrapados en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacrilato) , respectivamente en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microes eras de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Las técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, supra .

Los antagonistas de IL-17A y/o IL-17F, tales como los anticuerpos anti-IL-17 descritos en la presente también se pueden formular como inmunoliposomas . Los liposomas que con tienen el anticuerpo se preparan por métodos conocidos en la técnica, tales como los descritos en Epstein et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); las patentes de los Estados Unidos N.° 4.485.045 y 4.544.545; y el documento WO 97/38731 publicado el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con mayor tiempo de circulación se describen en la patente de los Estados Unidos N.° 5.013.556.

Los liposomas particularmente útiles se pueden generar mediante el método de evaporación de fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido a fin de obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab 1 del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas descritos en Martin et al.', J. Biol . Chem. , 257: 286-288 (1982) mediante una reacción de intercambio de disulfuros.

Se pueden preparar preparaciones de liberación prolongada. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación prolongada incluyen matrices semipermeables de polímeros sólidos hidrofóbicos que contienen el anticuerpo, en donde las matrices tienen la forma de artículos conformados, por ejemplo, películas, o microcápsulas . Los ejemplos de matrices de liberación prolongada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2- hidroxietilmetacrilato) , o poli (alcohol vinílico) ) , poliláctidos (patente de los Estados Unidos N.° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y L-glutamato de etilo, copolímeros no degradables de etileno-acetato de vinilo, degradables de ácido láctico-ácido glicólico tales como LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico .

Cualquiera de los antagonistas específicos se puede unir a una proteína portadora con el fin de incrementar la vida media sérica del antagonista terapéutico. Por ejemplo, se puede obtener una quimera de inmunoglobulina soluble, tal como se describe en la presente, para cada antagonista específico de IL-17 o su porción antagonista, según se describe en la patente de los Estados Unidos N.° 5.116.964. Las quimeras de inmunoglobulina se purifican fácilmente por cromatografía de la proteína A fijadora de IgG en sefarosa. Las quimeras tienen la capacidad de formar un dímero símil inmunoglobulina con la concomitante mayor avidez y vida media sérica.

Las formulaciones usadas para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles.

La formulación en la presente también puede contener más de un compuesto activo necesario para la indicación particular tratada, con preferencia aquellos con actividades complementarias que no tengan efectos adversos entre ellos. Además, el compuesto activo se puede administrar por separado al mamífero tratado.

Por ejemplo, puede ser deseable proveer también un agente para el tratamiento de la resistencia a insulina para las indicaciones. Además, los pacientes con diabetes de tipo 2 que no responden a la dieta y la pérdida de peso pueden responder a la terapia con sulfanilureas junto con el antagonista de IL-17. La clase de fármacos de sulfónilurea incluye acetohexamida, clorpropamida, tolázamida, tolbutamida, glibenclamida, glibomurida, gliclazida, glipizida, gliquidona y glimidina. Otros agentes para este fin incluyen un reactivo autoinmune, un sensibilizador de insulina, tal como los compuestos de la familia de glitazonas, incluso los descritos en la patente de los Estados Unidos N.° 5.753.681, tales como troglitazona, pioglitazona, englitazona, y compuestos relacionados, inhibidor de antagonistas de insulina de receptor tirosina quiinasa (patentes de los Estados Unidos N.° 5.939.269 y 5.939.269), el complejo IGF-l/lGFBP-3 (patente de los Estados Unidos N.° 6.040.292), antagonistas de la función de TNF-alfa (patente de los Estados Unidos N.° 6.015.558), agente liberador de hormona de crecimiento (patente de los Estados Unidos N.° 5.939.387), y anticuerpos contra amilina (patente de los Estados Unidos N.° 5.942.227). Otros compuestos que se pueden usar incluyen insulina (una o más insulinas diferentes) , insulinomiméticos tales como una insulina de molécula pequeña, análogos de insulina tal como se destacó con anterioridad o sus fragmentos fisiológicamente activos, péptidos relacionados con insulina tal como se destacó con anterioridad, o sus análogos o fragmentos. Los agentes también se especifican en la definición anterior.

Para tratar la hipoinsulinemia, por ejemplo, se puede administrar insulina junta o separada del antagonista de IL-17.

Las moléculas adicionales están presentes en forma adecuada o se administran en combinación en cantidades que son efectivas para el fin pretendido, generalmente inferiores a las usadas si se administran solas sin el antagonista de IL-17. Si se formulan juntas, se pueden formular en las cantidades determinadas de acuerdo con, por ejemplo, el tipo de indicación, el sujeto, la edad y el peso corporal del sujeto, el estado clínico actual, el tiempo de administración, la forma de dosificación, el método de administración, etc. Por ejemplo, con preferencia se usa un fármaco concomitante en una proporción de aproximadamente 0,0001 a 10.000 partes en peso respecto de una parte en peso del antagonista de IL-17 de la presente.

El uso del antagonista de IL-17 en combinación con insulina permite la reducción de la dosis de insulina comparado con la dosis en el momento de la administración de insulina sola. En consecuencia, el riesgo de complicación de los vasos sanguíneos y de inducción de la hipoglucemia , ambos problemas que pueden aparecer con la administración de grandes cantidades de insulina, es bajo. Para la administración de insulina a un paciente diabético adulto (peso corporal aproximadamente 50 kg) , por ejemplo, la dosis por día es usualmente de aproximadamente 10 a 100 U (Unidades) , con preferencia 10 a 80 U, pero esto puede ser inferior, según determinen los médicos. Para la administración de mej oradores de la secreción de insulina al mismo tipo de paciente, por ejemplo, la dosis por día es con preferencia de aproximadamente 0,1 a 1000 mg, con mayor preferencia de aproximadamente 1 a 100 mg. Para la administración de biguanidas al mismo tipo de paciente, por ejemplo, la dosis por día es con preferencia de aproximadamente 10 a 2500 mg, con mayor preferencia de aproximadamente 100 a 1000 mg. Para la administración de inhibidores de a-glucosidasas al mismo tipo de paciente, por ejemplo, la dosis por día es con preferencia de aproximadamente 0,1 a 400 mg, con mayor preferencia de aproximadamente 0,6 a 300 mg . La administración de ergoset, pramlintida, leptina, BAY-27-9955, o T-1095 a los pacientes se puede realizar en una dosis con preferencia de aproximadamente 0,1 a 2500 mg, con mayor preferencia de aproximadamente 0,5 a 1000 mg. Todas las dosis anteriores se pueden administrar de una a varias veces por día.

El antagonista de IL-17 también se puede administrar junto con un tratamiento no farmacológico adecuado para la resistencia a insulina tal como un trasplante de páncreas.

Las dosis de antagonista administradas a un mamífero resistente a insulina o hipoinsulinémico pueden ser determinadas por el médico a la luz de las circunstancias relevantes, incluso la condición del mamífero, el tipo de antagonista, el tipo de indicación, y la vía de administración elegida. La dosis con preferencia tiene un nivel suficientemente bajo para no causar aumento de peso en cualquier grado significativo, y el médico puede determinar el nivel. Las glitazonas aprobadas para el tratamiento de diabetes tipo 2 humana (rosiglitazona/Avandia y pioglitazona/Actos) causan cierto aumento de peso, sin embargo se utilizan a pesar de los efectos secundarios debido a que han demostrado ser beneficiosas por su índice terapéutico. Los- intervalos de dosis presentados en la presente de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención. Una cantidad "terapéuticamente efectiva" a los fines de la presente para hipoinsulinemia y resistencia a insulina se determina mediante los factores anteriores, pero por lo general es de aproximadamente 0,01 a 100 mg/kg peso corporal/día. La dosis preferida es de aproximadamente 0,1-50 mg/kg/día, con mayor preferencia de aproximadamente 0,1 a 25 mg/kg/día. Con aún mayor preferencia, cuando el antagonista de IL-17 se administra diariamente, la dosis intravenosa o intramuscular para un humano es de aproximadamente 0,3 a 10 mg/kg de peso corporal por día, con mayor preferencia, de aproximadamente 0,5 a 5 mg/kg. Para la administración subcutánea, la dosis es con preferencia superior a la dosis terapéuticamente equivalente administrada por vía intravenosa o intramuscular. Con preferencia, la dosis subcutánea diaria para un humano es de aproximadamente 0,3 a 20 mg/kg, con mayor preferencia de aproximadamente 0,5 a 5 mg/kg para ambas indicaciones .

La invención contempla diversos esquemas de dosificación. La invención abarca esquemas de dosificación continua, en los cuales el antagonista de IL-17 se administra en forma regular (diaria, semanal, o mensual, según la dosis y la forma de dosificación) sin interrupciones sustanciales. Los esquemas de dosificación continua preferidos incluyen la infusión continua diaria, en la cual el antagonista de IL-17 es infundido cada día, y los esquemas de administración continua de bolos, en donde el antagonista de IL-17 se administra al menos una vez por día por inyección de bolo o por vías inhalatoria o intranasal . La invención también abarca esquemas de dosis discontinua. Los parámetros exactos de los esquemas de administración discontinua varían de acuerdo con la formulación, el método de suministro, y las necesidades clínicas del mamífero tratado. Por ejemplo, si el antagonista de IL-17 se administra por infusión, los esquemas de administración pueden comprender un primer período de administración seguido de un segundo período en el cual el antagonista de IL-17 no es administrado que es mayor, igual, o menor que el primer período.

Cuando la administración es por inyección de bolo, especialmente la inyección de bolo de una formulación de liberación lenta, los esquemas de dosificación también pueden ser continuos en cuando a que el antagonista de IL-17 se administra cada día, o pueden ser discontinuos, con primeros y segundos períodos tal como se describió con anterioridad.

Los esquemas de administración continua y discontinua por cualquier método también incluyen esquemas de dosificación en los cuales la dosis se modula durante el primer período, de manera tal que, por ejemplo, al comienzo del primer período, la dosis es baja y se incrementa hasta el fin del primer período, la dosis es inicialmente alta y se disminuye durante el primer período, la dosis es inicialmente baja, se incrementa hasta un nivel pico, luego se reduce hacia el final del primer período, y cualquiera de sus combinaciones .

Los efectos de la administración de antagonista de IL-17 sobre la resistencia a insulina se pueden medir mediante diversos ensayos conocidos en la técnica. Más comúnmente, el alivio de los efectos de la diabetes darán por resultado un mejoramiento del control de la glucemia (medido por pruebas seriadas de la glucosa sanguínea) , la reducción del requerimiento de insulina para mantener un buen control de la glucemia, reducción de la hemoglobina glucosilada, reducción de los niveles sanguíneos de los productos finales de la glucosilación avanzada (AGE) , reducción del "fenómeno del amanecer", reducción de la cetoacidosis , y mejoramiento del perfil lipídico. Alternativamente, la administración de antagonista de IL-17 puede dar por resultado una estabilización de los síntomas de diabetes, tal como se indica por la reducción de los niveles de glucosa sanguínea, reducción del requerimiento de insulina, reducción de la hemoglobina glucosilada y de AGE de la sangre, reducción de las complicaciones vasculares, renales, neurales y retiñíanos, reducción de las complicaciones del embarazo, y mejoramiento del perfil lipídico.

El efecto de reducción del azúcar sanguíneo del antagonista de IL-17 se puede evaluar mediante la determinación de la concentración de glucosa o Hb (hemoglobina) Aic en plasma de sangre venosa en el sujeto antes y después de la administración, y luego comparar la concentración obtenida antes de la administración y después de la administración. HbAlc significa hemoglobina glucosilada, y es producida gradualmente en respuesta a la concentración de glucosa sanguínea. En consecuencia, se cree que HbAic es importante como índice del control del azúcar en la sangre que no recibe influencias fácilmente por los cambios rápidos del azúcar en la sangre en los pacientes diabéticos.

La evidencia del tratamiento de la hipoinsulinemia se demuestra, por ejemplo, mediante un incremento de los niveles circulantes de insulina en el paciente.

La dosis para la reparación y la regeneración muscular generalmente es de aproximadamente 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal, con mayor preferencia de 1 a 10 mg/kg según la condición del paciente, el tipo específico de reparación muscular deseado, etc. El esquema de dosificación es de acuerdo con el esquema estándar usado por un médico clínico en esta área. La evidencia de reparación o regeneración muscular se demuestra mediante diversas pruebas de medición bien conocidos en la técnica, incluso ensayos para la proliferación y diferenciación de células musculares y una prueba de reacción en cadena de polimerasa (ver, por ejemplo, Best et al., J. Orthop. Res., 19: 565-572 (2001), que provee un análisis de los cambios de los niveles de mAR de los productos génicos derivados de mioblastos y fibroblastos en el músculo esquelético de conejo en curación mediante el uso de reacción en cadena de polimerasa cuantitativo de transcripción inversa) . 3. Artículos de fabricación y kits La invención también provee kits para el tratamiento de la resistencia a insulina y la hipoinsulinemi , y para la reparación y regeneración muscular. Los kits de la invención comprenden uno o más contenedores de antagonista de IL-17, con preferencia un anticuerpo, en combinación con un conjunto de instrucciones, generalmente instrucciones por escrito, referidas al uso y ala dosis de antagonista de IL-17 para el tratamiento de la resistencia a insulina o la hopoinsulinemia , o para cualquier otra enfermedad objetivo asociada con la resistencia a insulina. Las instrucciones incluidas en el kit generalmente incluyen información sobre la dosis, el esquema de dosificación, y la vía de administración para el tratamiento de la enfermedad objetivo, tal como trastorno resistente a insulina o hipoinsulinémico . Los contenedores de antagonista de IL-17 pueden ser dosis unitarias o paquetes masivos (por ejemplo, paquetes de dosis múltiples) o dosis subunitarias .

El artículo de fabricación comprende un contenedor y un rótulo o prospecto de envase sobre o asociado con el contenedor. Los contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales, jeringas, etc. Los contenedores pueden estar formados por diversos materiales tales como vidrio o plástico. Los contenedor contienen una composición que es efectiva para tratar la condición y pueden tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo el contenedor puede ser una bolsa de solución intravenosa o un vial que tiene un tapón que puede ser perforado por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo de la composición es un antagonista de IL-17 de la invención. El rótulo o prospecto indica que la composición se usar para tratar la condición particular. El rótulo o prospecto también comprende instrucciones para administrar la composición de anticuerpo al paciente. También están contemplados los artículos de fabricación y kits que comprenden terapias de combinación descritos en la presente.

Los prospectos se refieren a instrucciones habitualmente incluidas en paquetes comerciales de productos terapéuticos que contienen información sobre las indicaciones, el uso, la dosis, la administración, las contraindicaciones y/o las advertencias referidas al uso de los productos terapéuticos.

Además, el artículo de fabricación también puede comprender un segundo contenedor que comprende un buffer farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución fisiológica con buffer fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa . También puede incluir otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluso otros buffer, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. 4. Preparación de anticuerpos Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos monoclonales se pueden fabricar mediante el uso del método del hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), o se pueden fabricar por métodos de ADN recombinante (patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567). En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedero apropiado, tal como un hámster o un mono macaco, es inmunizado como se describió con anterioridad para generar linfocitos que producen o son capaces de producir anticuerpos que se fijan específicamente a la proteína usada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos luego se fusionan con células de mieloma mediante el uso de un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986) ) .

Las células de hibridoma así preparadas se siembran y se dejan crecer en un medio de cultivo adecuado que con preferencia contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de originales no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mioloma originales carecen de la enzima hopoxantinaguanina fosforibosiltransferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluye hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias impiden el crecimiento de las células deficientes en HGPRT.

Las células de mieloma preferidas son las que se fusionan eficientemente, sostienen una producción estable de alto nivel de anticuerpo por parte de las células productoras de anticuerpo seleccionadas, y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas líneas celulares de mieloma preferidas se encuentran las líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif., EE . UU. , y las células SP-2 o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Md. , EE. UU. Las líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma ratón-humano también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol . , 133:3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)).

El medio de cultivo en el cual crecen las células de hibridoma es analizado respecto de la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno. Con preferencia, se determina la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por células de hibridoma mediante inmuno recipitación o por un ensayo de fijación in vitro, tales como radioinmunoensayos (RIA) o ensayos de inmunosorción ligada a enzima (ELISA) .

Después de que se han identificado las células de hibridoma que producen anticuerpos con la especificidad, afinidad, y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar mediante procedimientos de dilución limitante y se cultivan por métodos estándar (Goding, MonoclonalAntibodies : Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, el medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma se pueden cultivar in vivo como tumores ascíticos en un animal .

Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan de manera adecuada del medio de cultivo, líquido ascítico o suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, cromatografía de proteína A-Sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad.

El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y se secuencia mediante el uso de procedimientos convencionales (por ejemplo, mediante el uso de sondas de oligonucleóticos capaces de fijarse específicamente a los genes codificadores de las cadenas pesadas y livianas de los anticuerpos monoclonales) . Las células de hibridoma sirven como fuente preferida de tal ADN. Una vez aislado, el ADN se puede ubicar en vectores de expresión, los cuales luego son transíectados a células hospederas tales como células de E. coli , células COS simianas, células de ovario de hámster chino (CHO) , o células de mieloma que de otro modo no producen proteína de inmunoglobulina, a fin de obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células hospederas recombinantes . La producción recombinante de anticuerpos se describe con mayor detalle a continuación.

En otra modalidad, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de bibliotecas de fagos de anticuerpo generadas mediante el uso de las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990).

Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, mediante el uso de bibliotecas de fagos. Posteriores publicaciones describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo de nM) por variación de cadena (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992) ) , así como por infección combinatoria y recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nuc . Acids. Res., 21:2265- 2266 (1993)). En consecuencia, estas técnicas son alternativas viables para las tradicionales técnicas de hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales .

El ADN también se puede modificar, por ejemplo, al sustituir la secuencia codificadora de los dominios constantes de las cadenas pesadas y livianas humanas, en lugar de las secuencias homologas murinas (patente de los Estados Unidos N.° 4.816.567; Morrison, et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 81:6851 (1984)), o por unión covalente a la secuencia codificadora de la inmunoglobulina de la totalidad o parte de la secuencia codificadora de un polipéptido distinto de la inmunoglobulina.

Generalmente, los polipéptidos distintos de inmunoglobulina se sustituyen en los dominios constantes de un anticuerpo, o son sustituidos en los dominios variables de un sitio de combinación del antígeno de un anticuerpo a fin de crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprende un sitio de combinación del antígeno que tiene especificidad por un antígeno y otros sitio de combinación del antígeno que tiene especificidad por un antígeno diferente.

Anticuerpos humanos y humanizados Un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos introducidos que provienen de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos a menudo se refieren como residuos "importados", los cuales generalmente se toman de un dominio variable "importado" . La humanización se realiza esencialmente según el método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986) ; Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir las CDR o las secuencias de CDR de roedores por las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. En consecuencia, los anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de los Estados Unidos N. ° 4.816.567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido sustituido por la correspondiente secuencia proveniente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados generalmente son anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos provenientes de sitios análogos en anticuerpos de roedores.

La elección de dominios variables humanos, tanto livianos como pesados, utilizados para fabricar los anticuerpos humanizados, es muy importante para reducir la antigenícidad. De acuerdo con el método denominado "mejor ajuste", la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor se analiza respecto de la totalidad de la biblioteca de secuencias de dominio variable humanas conocidas. La secuencia humana más cercana a la del roedor se acepta como el marco humano (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims et al., J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol . , 196:901 (1987)). Otro método utiliza un marco particular derivado de la secuencia de consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas livianas o pesadas. El mismo marco se puede usar para diferentes anticuerpos humanizados (Cárter et al., Proc. Nati. Acad Sci . USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J. Immnol., 151:2623 (1993)).

También es importante humanizar los anticuerpos con retención de la elevada afinidad por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método preferido, se preparan los anticuerpos humanizados mediante un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y diversos productos humanizados conceptuales que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias progenitoras y humanizadas. Los modelos tridimensionales de las inmunoglobulinas comúnmente están disponibles y son conocidas por los expertos en la técnica. Están disponibles programas de computación que ilustran y presentan probables estructuras tridimensionales de conformación de secuencias seleccionadas candidatas de inmunoglobulinas. La inspección de estas presentaciones permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia candidata de inmunoglobulina, es decir, el análisis de los residuos que influyen sobre la capacidad del candidato de inmunoglobulina para unirse a su antígeno. De este modo, se pueden seleccionar los residuos FR y combinare con las secuencias del receptor e importadas de manera tal que se obtengan las características deseadas del anticuerpo, tales como incremento de la afinidad por el (os) antígeno (s) objetivo (s) . En general, los residuos de CDR intervienen en forma directa y más sustancialmente en la influencia sobre la fijación del antígeno.

Alternativamente, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) capaces, luego de la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas . Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J.sub.H) en ratones quiméricos y imitantes de línea germinal da por resultado la completa inhibición de la producción endógena de anticuerpo. La transferencia de la disposición de genes de línea germinal de inmunoglobulina humana en los ratones imitantes de línea germinal da por resultado la producción de anticuerpos humanos luego de la exposición al antígeno. Ver, por ejemplo, Jakobovits et al, Proc . Nati. Acad. Sci . USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal et al. Nature 355:258 (1992). Los anticuerpos humanos también se pueden derivar de bibliotecas de presentación de fagos (Hoogenboom et al, J. Mol. Biol . , 227:381 (1991); Marks et al, J. MoL Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan et al. Nature Biotech 14:309 (1996)). La generación de anticuerpos humanos a partir de las bibliotecas de presentación de fagos de anticuerpo se describe a continuación.

Fragmentos de anticuerpo Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. Tradicionalmente , estos fragmentos eran derivados por digestión proteolítica de anticuerpos intactos (ver, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora pueden ser producidos directamente por células hospederas recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpo se pueden aislar de las bibliotecas de fagos de anticuerpo descritos con anterioridad. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden ser recuperados directamente de E. coli y acoplar químicamente para formar los fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). En otra modalidad, tal como se describe en el ejemplo siguiente, se forma F(ab' )2 mediante el uso del cierre de leucina GCN4 para promover el ensamblado de la molécula F(ab')2. De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab' )2 pueden ser aislados directamente del cultivo de células hospederas recombinantes . Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo serán aparentes para los expertos en la técnica. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv monocatenario (scFv) . Ver el documento WO 93/16185.

Anticuerpos multiespecífieos Los anticuerpos multiespecífieos tienen especificidades de unión para al menos dos epítopos diferentes, en dónde los epítopos usualmente provienen de distintos antígenos. Si bien las moléculas normalmente sólo se fijan a dos epítopos diferentes (es decir anticuerpos biespecífieos , BsAbs) , los anticuerpos con especificidades adicionales tales como anticuerpos triespecífieos están abarcados por esta expresión cuando se usan en la presente. Los métodos para fabricar estos anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecífieos de longitud total se basa en la coexpresión de dos pares de cadenas pesadas-cadenas livianas de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas pesadas y livianas de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpo, de las cuales sólo una tiene la correcta estructura biespecífica . La purificación de la molécula correcta, lo cual usualmente se realiza por etapas de cromatografía por afinidad, es bastante laboriosa, y los rendimientos de producto son bajos. Procedimientos similares se describen en el documento WO 93/08829, y en Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991) . De acuerdo con un enfoque diferente, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades deseadas (anticuerpo-sitios de combinación del antígeno) se fusionan en las secuencias de dominio constante de la inmunoglobulina . La fusión con preferencia se realiza con un dominio constante de la cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, las regiones CH2 , y CH3. Se prefiere tener la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la fijación de la cadena liviana, presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena liviana de la inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados, y se cotransfectan en un organismo hospedero adecuado. Esto provee gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptido en las modalidades cuando las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos usadas en la construcción proveen los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificadoras de dos o de las tres cadenas de polipéptido en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en proporciones iguales producen altos rendimientos o cuando las proporciones no tienen particular significancia.

En una modalidad de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos se componen de una cadena pesada híbrida de inmunoglobulina con una primera especificidad de unión en un brazo, y un par de cadena pesada-cadena liviana híbrido de inmunoglobulina (que provee una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se halló que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones no deseadas de las cadenas de la inmunoglobulina, dado que la presencia de una cadena liviana de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica provee una forma de separación sencilla. Este enfoque se describe en el documento O 94/04690. Para más detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos ver, por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121 :210 (1986) .

De acuerdo con otro enfoque descrito en el documento WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpo se puede someter a ingeniería a fin de maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados del cultivo de células recombinantes . La interfaz preferida comprende al menos una parta del dominio CH3 de un dominio constante del anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos provenientes de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo es reemplazada por cadenas laterales más grandes (por ejemplo tirosina o triptófano) . Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a la(s) grande (s) cadena (s) lateral (es) en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar con cadenas laterales grandes de aminoácidos las más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto provee un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados tales como homodímeros .

Los anticuerpos biespecífieos incluyen anticuerpos con enlaces cruzados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se puede acoplar con avidina, el otro con biotina. Se ha propuestos que los anticuerpos, por ejemplo, tienen por objetivo las células del sistema inmunológico respecto de las células no deseadas (patente de los Estados Unidos N. ° 4.676.980), y para el tratamiento de la infección por HIV (documentos WO 91/00360, WO 92/200373) . Los anticuerpos heteroconjugados se pueden fabricar mediante el uso de cualquier método conveniente para formar enlaces cruzados. Los agentes adecuados para formar enlaces cruzados son bien conocidos en la técnica, y se describen en la patente de los Estados Unidos N.° 4.676.980, junto con una cantidad de técnicas para formar enlaces cruzados.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecífieos a partir de fragmentos de anticuerpo también han sido descritas en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar mediante el uso de enlaces químicos. Brennan et al., Science 229: 81 (1985) describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2-Estos fragmentos se reducen en presencia del agente complej izante de ditiol arsenita de sodio a fin de estabilizar ditioles vecinales y prevenir la formación intermolecular de disulf ros. Los fragmentos Fab1 generados luego son convertidos en derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab 1 -TNB luego es reconvertido en Fab 1 -tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab 1 -TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de las enzimas.

Los fragmentos Fab'-SH también se pueden recuperar directamente de E. coli, y se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecífieos . Shalaby et al., J_ Exp. Med., 175: 217-225 (1992) describe la producción de una molécula totalmente humanizada de anticuerpo biespecífico F(ab')2- Cada fragmento Fab' fue secretado en forma separada de E. coli y sometido a acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico .

También se han descrito diversas técnicas para preparar y aislar fragmentos de anticuerpo biespecífico directamente de cultivos de células recombinantes . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos mediante el uso de cierres de leucina. Kostelny et al., J. Immunol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos del cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun se ligaron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes, por fusión génica. Los homodímeros de anticuerpo se redujeron a la región bisagra para formar monómeros y luego se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología de "diacuerpo" descrita por Hollinger et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) provee un mecanismo alternativo para fabricar fragmentos de anticuerpo. Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado con un dominio variable de cadena liviana (VL) mediante un ligador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento están forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, por lo que se forman dos sitios fijadores de antígeno. También se ha informado otra estrategia para preparar fragmentos de anticuerpo biespecífico mediante el uso de dímeros monocatenarios Fv (sFv) . Ver Gruber et al, J. Immunol . 152:5368 (1994).

Los anticuerpos con más de dos valencias están contemplados. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos . Tuft et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Ingeniería de la función efectora Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora, a fin de mejorar la efectividad del anticuerpo. Por ejemplo, se pueden introducir residuos de cisteína en la región Fe, lo cual permite la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico así generado puede tener mejor capacidad, de internalización y/o incremento de la eliminación ~" de células mediada por complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) . Ver Carón et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con incremento de la actividad antitumoral también se pueden preparar usando ligadores cruzados heterobifuncionales tal como se describe en olff et al. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede obtener un anticuerpo por ingeniería que tiene regiones Fe duales y así tiene incremento de la capacidad de lisis por complemento y ADCC. Ver Stevenson et al Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989).

Fusiones de epítopo de salvataje fijador del receptor de anticuerpo .

En ciertas modalidades de la invención, puede ser deseable usar un fragmento de anticuerpo, en lugar de un anticuerpo intacto. En este caso, puede ser deseable modificar el fragmento de anticuerpo a fin de incrementar su vida media sérica. Esto se puede lograr, por ejemplo, mediante la incorporación de un epítopo de salvataje de fijación del receptor en el fragmento de anticuerpo (por ejemplo por mutación de la región apropiada en el fragmento de anticuerpo o mediante la incorporación del epítopo en un rótulo peptídico que luego se fusiona al fragmento de anticuerpo en cualquiera de los extremos o en la parte media, por ejemplo, pos ADN o síntesis del péptido) .

El epítopo de salvataje de fijación del receptor con preferencia constituye una región en donde uno cualquiera o más residuos de aminoácidos provenientes de uno o dos giros de un dominio Fe es transferido a una posición análoga del fragmento de anticuerpo. Con aún mayor preferencia, se transfieren tres o más residuos de uno o dos giros del dominio Fe. Con aún mayor preferencia, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fe (por ejemplo, de una IgG) y es transferido a la región CH1, CH3 , o V.sub.H, o en más de una de las regiones del anticuerpo. Alternativamente, el epítopo se toma del dominio CH2 de la región Fe y se transfiere a la región CL o la región VL, o ambas, del fragmento de anticuerpo .

Otras modificaciones covalentes de los anticuerpos Las modificaciones covalentes de los anticuerpos se incluyen en el alcance de la presente invención. Pueden ser preparados por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si corresponde. Otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo se introducen en la molécula al hacer reaccionar los residuos de aminoácidos objetivo del anticuerpo con un agente derivador orgánico capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos N- o C-terminales . Los ejemplos de modificaciones covalentes se describen en la patente de los Estados Unidos N. ° 5.534.615, incorporada específicamente en la presente por referencia. Un tipo preferido de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno de diversos polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol , polipropilenglicol, o polioxialquileños, de la manera establecida en las patentes de los Estados Unidos N.° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.

Generación de anticuerpos a partir de bibliotecas de fagos para la síntesis de anticuerpos En una modalidad, la invención provee un método para generar y seleccionar nuevos anticuerpos mediante el uso de un enfoque singular de presentación por fago. El enfoque incluye la generación de bibliotecas de fagos para la síntesis de anticuerpos sobre la base de una plantilla de marco único, el diseño de diversidades suficientes dentro de dominios variables, la presentación de polipéptidos que tienen dominios variables diversificados, la selección de candidatos de anticuerpos con elevada afinidad dirigida al antígeno, y el aislamiento de los anticuerpos seleccionados.

Los detalles de los métodos de presentación de fagos se pueden hallar, por ejemplo, en el documento WO 03/102157 publicado el 11 de diciembre de 2003, cuya descripción completa se incorpora expresamente en la presente por referencia .

En un aspecto, las bibliotecas de anticuerpo usadas en la invención se pueden generar por mutación de las posiciones accesibles al solvente y/o altamente diversas en al menos una CDR de un dominio variable del anticuerpo. Algunas o todas las CDR se pueden mutar mediante el uso de los métodos provistos en la presente. En algunas en modalidades, puede ser preferible generar diversas bibliotecas de anticuerpo por mutación de las posiciones en CDRH1, CDRH2 y CDRH3 a fin de formar una única biblioteca o por mutación de las posiciones en CDRL3 y CDRH3 para formar una única biblioteca o por mutación de las posiciones en CDRL3 y CDRH1, CDRH2 y CDRH3 para formar una única biblioteca.

Se puede generar una biblioteca de dominios variables de anticuerpo, por ejemplo, que tenga mutaciones en posiciones accesibles al solvente y/o altamente diversas de CDRH1, CDRH2 y CDRH3. Se puede generar otra biblioteca que tenga mutaciones en CDRL1, CDRL2 y CDRL3. Estas bibliotecas también se pueden usar en conjunción entre sí para generar ligadores con afinidades deseadas. Por ejemplo, después de una o más ruedas de selección de bibliotecas de cadenas pesadas para unión con un antígeno objetivo, se puede reemplazar una biblioteca de cadenas livianas dentro de la población de ligadores de cadenas pesadas para otras rondas de selección, a fin de incrementar la afinidad de los ligadores .

Con preferencia, se crea una biblioteca por sustitución de los aminoácidos originales por aminoácidos variantes en la secuencia de la región CDRH3 de la región variable de la cadena pesada. La biblioteca obtenida puede contener una pluralidad de secuencias de anticuerpo, en donde la diversidad de secuencia está principalmente en la secuencia de la región CDRH3 de la región de la cadena pesada.

En un aspecto, se crea la biblioteca en el contexto de la secuencia del anticuerpo humanizado 4D5, o la secuencia de los aminoácidos del marco de la secuencia del anticuerpo humanizado 4D5. Con preferencia, se crea la biblioteca por sustitución de al menos los residuos 95-100a de la cadena pesada por los aminoácidos codificados por el conjunto del codón DVK, en donde el conjunto del codón DVK se usa para codificar un conjunto de aminoácidos variantes para cada una de estas posiciones. Un ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos de utilidad para crear estas sustituciones comprende la secuencia (DVK) 7. En algunas modalidades, se crea una biblioteca por sustitución de los residuos 95-100a por los aminoácidos codificados por los conjuntos de codones DVK y NNK. Un ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos de utilidad para crear estas sustituciones comprende la secuencia (DVK) 6 (NNK) . En otra modalidad, se crea una biblioteca por sustitución de al menos los residuos 95-100a por los aminoácidos codificados por los conjuntos de codones DVK y NNK. Un ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos de utilidad para crear estas sustituciones comprende la secuencia (DVK) 5 (NNK) . Otro ejemplo de un conjunto de oligonucleótidos de utilidad para crear estas sustituciones comprende la secuencia (NNK)6- Otros ejemplos de secuencias de oligonucleótidos adecuados pueden ser determinados por un experto en la técnica de acuerdo con los criterios descritos en la presente .

En otra modalidad, se utilizan diferentes diseños de CDRH3 para aislar los ligadores de gran afinidad y para aislar los ligadores para diversos epítopos . El intervalo de longitudes de CDRH3 generadas en esta biblioteca es de 11 a 13 aminoácidos, si bien también se pueden generar longitudes diferentes de esta. La diversidad de H3 se puede expandir mediante el uso de los conjuntos de codones NNK, DVK y NVK, así como una diversidad más limitada en el N y/o C-terminal .

También se puede generar diversidad en CDRH1 y CDRH2. Los diseños de las diversidades CDR-H1 y H2 siguen la estrategia de dirección hacia la semejanza con el repertorio de anticuerpos naturales tal como se describe con las modificaciones que centran la atención en la diversidad que coincide más estrechamente con la diversidad natural que el diseño previo.

Para la diversidad en CDRH3 , se pueden construir múltiples bibliotecas por separado con diferentes longitudes de H3 y luego se combinan para seleccionar ligadores para los antígenos objetivos. Las múltiples bibliotecas se pueden juntar y clasificar mediante la selección de soportes sólidos y los métodos de clasificación de soluciones tal como se describió previamente y en la presente a continuación. En emplear múltiples estrategias de clasificación. Por ejemplo, una variación incluye la clasificación en un objetivo ligado a un sólido, seguido de clasificación según un rótulo que puede estar presente en el polipéptido de fusión (por ejemplo, rótulo anti-gD) y seguido de otra clasificación sobre un rótulo ligado a un sólido. Alternativamente, las bibliotecas se pueden clasificar primero sobre un objetivo ligado a una superficie sólida, luego se clasifican los ligadores eluidos mediante fijación de la fase en solución con concentraciones decrecientes del antígeno objetivo. El uso de combinaciones de los diferentes métodos de clasificación provee la minimización de la selección de sólo las secuencias con expresión elevada y provee la selección de numerosos clones diferentes con afinidad elevada.

Los ligadores con alta afinidad por el antígeno objetivo se pueden aislar de las bibliotecas. La limitación de la diversidad en la región H1/H2 disminuye la degeneración en aproximadamente 104 a 105 veces y al permitir mayor diversidad de H3 provee ligadores con mayor afinidad. El uso de bibliotecas con diferentes tipos de diversidad en CDRH3 (por ejemplo, al utilizar DVK o NVT) provee el aislamiento de ligadores que se pueden unir a diferentes epítopos de un antígeno objetivo.

De los ligadores aislados de las bibliotecas reunidas tal como se describió con anterioridad, se descubrió que la afinidad se puede mejorar aún más al proveer limitada diversidad en la cadena liviana. La diversidad de la cadena liviana se genera en esta modalidad tal como sigue en CDRL1 : la posición del aminoácido 28 es codificada por RDT; la posición del aminoácido 29 es codificada por RKT; la posición del aminoácido 30 es codificada por RV ; la posición del aminoácido 31 es codificada por ANW; la posición del aminoácido 32 es codificada por THT; opcionalmente , la posición del aminoácido 33 es codificada por CTG ; en CDRL2 : la posición del aminoácido 50 es codificada por KBG; la posición del aminoácido 53 es codificada por AVC; y opcionalmente, la posición del aminoácido 55 es codificada por GMA ; en CDRL3 : la posición del aminoácido 91 es codificada por TMT o SRT o ambos; la posición del aminoácido 92 es codificada por DMC; la posición del aminoácido 93 es codificada por RVT; la posición del aminoácido 94 es codificada por NHT; y la posición del aminoácido 96 es codificada por TWT o YKG o ambos.

En otra modalidad, se genera una biblioteca o bibliotecas con diversidad en las regiones CDRH1 , CDRH2 y CDRH3. En esta modalidad, se genera diversidad en CDRH3 mediante el uso de diversas longitudes de las regiones H3 y mediante el uso principalmente de los conjuntos de codones XYZ y NNK o NNS. Las bibliotecas se pueden formar mediante el uso de oligonucleótidos individuales y los conjuntos o los oligonucleótidos se pueden reunir para formar un subconjunto de bibliotecas. Las bibliotecas de esta modalidad se pueden clasificar respecto de un objetivo ligado a un sólido. Los clones aislados de múltiples clasificaciones se pueden analizar respecto de la especificidad y la afinidad mediante el uso de ensayos por ELISA. Para la especificidad se pueden analizar los clones respecto de los antígenos objetivo deseados así como otros antígenos no objetivo. Estos ligadores del antígeno objetivo luego se pueden analizar respecto de la afinidad en un ensayo por ELISA de competencia de fijación en solución o ensayo de competencia en mancha. Los ligadores con alta afinidad se pueden aislar de la biblioteca utilizando conjuntos de codones XYZ preparados tal como se describió con anterioridad. Estos ligadores se pueden producir fácilmente como anticuerpos o fragmentos de fijación del antígeno con alto rendimiento en cultivos celulares.

En algunas modalidades, puede ser deseable generar bibliotecas con mayor diversidad de longitudes de la región CDRH3. Por ejemplo, puede ser deseable generar bibliotecas con regiones CDRH3 que varían desde aproximadamente 7 hasta 19 aminoácidos.

Los ligadores con alta afinidad aislados de las bibliotecas de estas modalidades se producen fácilmente en cultivos bacterianos y de células eucariontes, con altos rendimientos. Los vectores se pueden diseñar para extraer fácilmente las secuencias tales como los rótulos gD, la secuencia del componente de la proteína de cubierta viral, y/o agregar secuencias en la región constante para proveer la producción de anticuerpos de longitud total o fragmentos de fijación del antígeno con alto rendimiento.

Una biblioteca con mutaciones en CDRH3 se puede combinar con una biblioteca que contiene versiones variantes de otros CDR, por ejemplo CDRL1, CDRL2 , CDRL3 , CDRH1 y/o CDRH2. En consecuencia, por ejemplo, en una modalidad, una biblioteca CDRH3 se combina con una biblioteca CDRL3 creada en el contexto de la secuencia de anticuerpo 4D5 humanizado con aminoácidos variantes en las posiciones 28, 29, 30, 31 y/o 32 mediante el uso de conjuntos de codones predeterminados. En otra modalidad, una biblioteca con mutaciones de CDRH3 se puede combinar con una biblioteca que comprende variantes de los dominios variables de las cadenas pesadas CDRH1 y/o CDRH2. En una modalidad, la biblioteca de CDRH1 es creada con la secuencia del anticuerpo 4D5 humanizado con variantes de aminoácidos en las posiciones 28, 30, 31, 32 y 33. Se puede crear una biblioteca de CDRH2 con la secuencia de anticuerpo humanizado 4D5 con variantes de aminoácidos en las posiciones 50, 52, 53, 54, 56 y 58 mediante el uso de conjuntos de codones predeterminados.

La descripción escrita anterior se considera suficiente para permitir a un experto en la técnica poner en práctica la invención. Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con fines ilustrativos, y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la presente invención. De hecho, diversas modificaciones de la invención además de las mostradas y descritas en la presente serán obvias para los expertos en la técnica a partir de la descripción precedente y caen dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Los reactivos disponibles en el comercio a que se hace referencia en los Ejemplos se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a menos que se indique otra cosa. La fuente de las células identificadas en los siguientes Ejemplos, y en toda la memoria descriptiva, por los números de acceso ATCC es la American Type Culture Collection, Manassas, VA. A menos que se destaque de otro modo, la presente invención utiliza procedimientos estándar de tecnología de ADN recombinante , tales como los descritos con anterioridad en la presente y en los siguientes textos: Sambrook et al., supra; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates y Wiley Interscience, N.Y., 1989) ; Innis et al., PC Protocols: A Guide to Methods and Applications (Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleot ide Synthesis (IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991.

Otros detalles de la invención se proveen en los siguientes ejemplos no limitantes.

Todas las referencias citadas en toda la descripción se incorporan así expresamente en la presente por referencia en su totalidad.

Ejemplo 1 Papel de los miembros de la familia IL-17 en diabetes y resistencia a insulina.

Estudio en ratones IL-17Rc KO y modelo de dieta rico en grasas Ratones machos de 8 semanas de edad IL-17Rc (UNQ6118. KO . lex) Knockout y carnadas de ratones semejantes de tipo silvestre (WT) como control fueron alimentados con dieta de alimento común o 60% de dieta rica en grasas (HFD) .

GRUPO 1: ratones IL-17Rc Knockout (KO) con dieta rica en grasas (5 animales) GRUPO 2: ratones IL-17Rc, WT de carnada similar como control con dieta rica en grasas (5 animales) GRUPO 3: ratones IL-17Rc KO con dieta común (3 animales) GRUPO 4 : ratones IL-17RC WT de carnada similar como control con dieta común (3 animales) .

El diseño experimental se muestra en la Figura 7.

Los ratones se sometieron a Prueba de tolerancia a glucosa (GTT) para acceder a su estado de Resistencia a insulina .

Se efectuó GTT usando el siguiente método.

Mediciones de glucosa sanguínea e insulina: Se obtuvieron muestras de sangre por sangrado de las venas safenas, y se analizó respecto de la concentración de glucosa inmediatamente mediante el uso de un glucómetro (OneTouch Glucometer fabricado por Lifescan, EE. UU.). La insulina sérica se midió mediante el método de ELISA.

Prueba de tolerancia a glucosa (GTT) : después de ayuno durante la noche (14 h) , los animales fueron estudiados por la mañana, a las 9:00 h. Se midió la glucosa sanguínea en muestras obtenidas de sangrado de la vena safena antes de la inyección intraperitoneal de glucosa a 1,5 mg/gramo de peso corporal de cada animal, así como a los 30, 60, 120 y 150 minutos después de la administración de glucosa. Los valores se calcularon como mg/dL de glucosa.

Se realizó GTT para la línea de base (antes de ser sometidos a dieta rica en grasas) así como en la semana 8, la semana 10, la semana 12 y la semana 14 después del grupo con dieta rica en grasas. Los ratones alimentados con dieta de alimento común se usaron como grupos control. El resto de las condiciones eran similares en los ratones Knockout y los ratones de control de carnada similar de tipo silvestre (WT) .

Además de GTT, cada semana se monitorearon el peso corporal total del animal, así como los niveles séricos en ayunas de insulina y glucosa.

Los resultados se muestran en las Figuras 8-11.

Si bien los ratones control de carnada similar IL-17Rc WT mostraron significativo aumento de peso y desarrollaron un fenotipo de resistencia a insulina, los ratones IL-17Rc Knockout eran significativamente más magros y depuraban la glucosa mucho mejor que los controles de carnada similar WT.

Incluso después de alimentarse con dieta rica en grasas durante más de 12 semanas, los ratones knockout no aumentaron de peso. Ambos grupos mostraron un nivel similar de concentraciones circulantes de insulina en ayunas. No se observó diferencia significativa entre los ratones KO y WT en el control de grupos alimentados con dieta.

Además del experimento descrito con anterioridad mediante el uso de ratones IL-17 Re KO, se utilizaron dos líneas de estudio separadas para estudiar el papel de las citoquinas proinflamatorias IL-17A y IL-17F en diabetes y resistencia a insulina.

Ejemplo 2 Efecto de mAb anti-IL-17 y Anti-IL-17F sobre ratones modelo resistentes a insulina con dieta rica en grasas El objeto de este estudio consistió en investigar la eficacia de los mAb Anti-Il-17 y Anti-IL-17F en el modelo de resistencia a insulina preventiva y establecida y comparar con el efecto terapéutico de muTNFRII-Fc.

Diseño experimental y grupos: Grupo.1: Ragweed 6 mg/kg en 100 ul de solución fisiológica ip 3 veces/semana durante 10 semanas (n=10) .

Grupo.2: MuTNFRI I-IgG2a 4 mg/kg en 100 µ? de solución fisiológica ip 3 veces/semana durante 10 semanas (n=10) .

Grupo.3: MuAnti-IL-17 6 mg/kg en 100 ul de solución fisiológica ip 3 veces/semana durante 10 semanas (n=10) .

Grupo.4: MuAnti-IL-17+MuAntÍ-IL-17F mAb 6mg/kg en 100 µ? de solución fisiológica ip 3 veces/semana durante 10 semanas (n=10) .

Grupo.5: MuTNFRII-Fc 4. mg/kg=MuAnti-IL-17 6 mg/kg+MuAnti-IL17FmAb 6 mg/kg en 18 semanas y 24 semanas (10 animales) .

Todos los grupos fueron sometidos a alimentación con dieta rica en grasas. A fin de evaluar el estado de resistencia a insulina de los ratones se efectuó prueba de tolerancia a glucosa (GTT) cada 2 semanas después de HFD y dosificación del anticuerpo.

El protocolo se ilustra en la Figura 12. El efecto de los MAb anti-IL-17A y anti-IL-17F sobre la tolerancia a glucosa después de 9 semanas de dosis se muestra en la Figura 13.

Ejemplo 3 Efecto de la sobreexpresión de IL-17 sobre el estado de resistencia a insulina evaluada mediante GTT El estudio se basó en la inyección hidrodinámica por la vena de la cola (HTV) del ADN de plásmido para la expresión de las proteínas nativas murinas IL-17A y IL-17F en ratones alimentados con dieta normal y rica en grasas para expresar el nivel elevado de las citoquinas proinflamatorias murinas IL-17A y IL-17F en ratones a fin de estudiar su papel en la resistencia a insulina.

Grupo 1: sin plásmido Grupo 2 : vector pRK solo Grupo 3 : pRK-IL-17A Grupo 4 : pRK-IL-17F Dentro de cada grupo, 5 subgrupos de ratones fueron inyectados para extraer sangre en diversos puntos temporales (O h, 2 h, 6 h, 24 h, y 72 h después de la ingestión de ADN) a fin de medir los niveles de citoquina circulante en suero. Una vez establecido esto, se sobreexpresaron IL-17A y IL-17F en los ratones alimentados con dieta rica en grasas (HFD) a fin de acceder al cambio del estado de resistencia a insulina .

Experimentos de inyección de la vena de la cola: 1) La construcción de ADN (vector pRK o pRK-lL-17A y pRK-IL-17F) se diluyó en solución fisiológica (con preferencia de Ringer) a una concentración que dio una dosis final de 50 pg/ratón /inyección. 2) Cada ratón fue inyectado por vía intravenosa en la vena de la cola con aproximadamente 1,6 mi de la solución que con tiene ADN en solución fisiológica o solución de Ringer. 3) Las dosis se administraron como una inyección de bolo intravenosa (vena de la cola) durante un período de 4-5 segundos (8 segundos como máximo) para el máximo de captación de ADN.

Los resultados se muestran en la Figura 14. A) Los ratones C57BL/6 de ocho semanas de edad fueron inyectados con 50 ug de ADN de plásmido (pRK-IL-17A) o vector pRK solo. 48 h más tarde se recolectó suero de ambos grupos y se midió el nivel de IL-17 en el suero por ELISA. B) Tres grupos de ratones se dejaron en ayunas durante la noche y se sometieron a ip GTT y los resultados se graficaron en función del tiempo después de la inyección de glucosa. (*p>0,05).

Si bien la presente invención ha sido descrita con referencia a lo que se considera son las formas específicas de modalidad, se debe entender que la invención no se limita a las modalidades. Por el contrario, la invención pretende cubrir diversas modificaciones y equivalentes incluidos en el espíritu y el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (21)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Un método para tratar un trastorno de resistencia a insulina en un mamífero caracterizado porque comprende administrar a un mamífero que lo necesite una cantidad efectiva de un antagonista de IL-17A y/o IL-17F.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el trastorno es seleccionado del grupo que consiste de diabetes mellitus no insulinodependiente (NIDDM) , obesidad, hiperandrogenismo ovárico e hipertensión.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el trastorno es NIDDM u obesidad.

4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el mamífero es humano y la administración es sistémica.

5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el antagonista IL-17A y/o IL-17F es un anticuerpo o uno de sus fragmentos.

6. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de anticuerpos anti-IL-17A, anti-IL-17F, anti-IL-17A/F y anti-IL-17Rc y anti-IL-17RA.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, multespecífico o de reacción cruzada.

10. El método de conformidad con la reivindicación 9, caracterizado porque además comprende administrar una cantidad efectiva de un agente para tratar la resistencia a insulina .

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el agente para tratar la resistencia a insulina es insulina, IGF-1 o una sulfonilurea .

12. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque además comprende una cantidad efectiva de otro agente capaz de tratar el trastorno de resistencia a insulina .

13. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque el otro agente es Dickkopf-5 (Dkk-5) .

14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un antagonista de IL-17A y/o IL-17F en mezcla con un excipiente farmacéuticamente aceptable, para el tratamiento de un trastorno de resistencia a insulina.

15. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el antagonista IL-17A y/o IL-17F es un anticuerpo o uno de sus fragmentos.

16. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo seleccionado del grupo que consiste de los anticuerpos anti-IL-17A, anti-IL-17F, anti-IL-17A/F, anti-IL-17Rc y anti-IL-17RA.

17. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal .

18. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque el anticuerpo es un un anticuerpo quimérico, humanizado o humano.

19. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico, multiespecífico o de reacción cruzada.

20. El uso de un antagonista de IL-17A y/o IL-17F en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno de resistencia a insulina.

21. Un kit para tratar un trastorno de resistencia a insulina, caracterizado porque comprende: (a) un contenedor que comprende un antagonista de IL-17A y/o IL-17F; y (b) un rótulo o instrucciones para administrar el anticuerpo para tratar el trastorno.