MX2010013632A

MX2010013632A - Actividad trombopoyetica de polipeptidos de tirosil-arnt sintetasa.

Info

Publication number: MX2010013632A
Application number: MX2010013632A
Authority: MX
Inventors: Rajesh Belani; Jeffrey Dean Watkins; Wei Zhang; Alain Philippe Vasserot
Original assignee: Atyr Pharma Inc
Priority date: 2008-06-11
Filing date: 2009-06-10
Publication date: 2011-06-16
Also published as: WO2009152247A3; ES2622444T3; US20140255375A1; AU2009257538A1; WO2009152247A2; CN102105164A; US9499810B2; JP5771142B2; US20100092434A1; JP2011525178A; US20170209554A1; EP2307046A2; CA2727622A1; EP2307046B1

Abstract

Se proporcionan composiciones trombopoyéticas que comprenden polipéptidos de tirosil tARN sintetasa que incluyen truncamientos y/o variaciones de los mismos; también se proporcionan métodos para utilizar dichas composiciones en el tratamiento de condiciones que se benefician de la trombopoyesis incrementada, tal como trombocitopenia.

Description

ACTIVIDAD TROMBOPOYÉTICA DE POLIPÉPTIDOS DE TIROSIL-ARNT SINTETASA REFERENCIA RECÍPROCA A LA SOLICITUD RELACIONADA Esta solicitud reclama el beneficio bajo 35 U.S.C. § 119(e) de la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 61/060,747, presentada en Junio 11 de 2008, cuya solicitud provisional se incorpora en su totalidad en la presente como referencia.

DECLARACIÓN RESPECTO AL LISTADO DE SECUENCIAS El listado de secuencias asociado con esta solicitud se provee en formato de texto en lugar de una copia de papel, y se incorpora de esta manera como referencia en la especificación. El nombre del archivo de texto que contiene al listado de secuencias es 120161_409PC_SEQUENCE_LISTING.txt. El archivo de texto es de 37 KB, fue creado en Junio 10 de 2009, y está siendo referido electrónicamente por medio de EFS-Web.

CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere generalmente a composiciones trombopoyéticas que comprenden polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa, incluyendo truncamientos y/o variantes de los mismos, y métodos de uso de dichas composiciones en el tratamiento de enfermedades de condiciones que se benefician de la trombopoyesis incrementada, tales como enfermedades o condiciones asociadas con trombocitopenia.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La trombocitopenia se refiere generalmente a una condición en la cual el número de plaquetas por volumen unitario de sangre periférica en el sujeto, es menor de lo normal. Por ejemplo, el conteo normal de plaquetas varía generalmente de aproximadamente 150,000 mm3 a aproximadamente 450,000 mm3, y la trombocitopenia se caracteriza típicamente por una disminución en el conteo de plaquetas hasta aproximadamente 100,000/mm3 o menos.

Las plaquetas, o trombocitos, son células sanguíneas incoloras que desempeñan una función importante en la coagulación sanguínea, amontonándose juntas y formando tapones en los agujeros de los vasos sanguíneos. La trombopoyesis se refiere al proceso por el cual las plaquetas se forman de células hematopoyéticas precursoras, tales como megacariocitos. La trombopoyesis es regulada principalmente por la trombopoyetina, la cual a su vez es regulada por una variedad de mecanismos, tales como la captación y destrucción mediada por el receptor en respuesta a niveles incrementados de plaquetas, entre otros factores.

La trombocitopenia está asociada con muchas causas subyacentes, tales como destrucción incrementada de plaquetas, producción disminuida de plaquetas, consumo de plaquetas y entrampado de plaquetas, además de trombocitopenia inducida por medicaciones. Dada la función central de las plaquetas en la coagulación sanguínea, los síntomas iniciales de la trombocitopenia implican normalmente varias formas de hemorragia y púrpura. Puesto que los sujetos están en riesgo incrementado de hemorragia, el diagnóstico y tratamiento tempranos son importantes, especialmente para la prevención del progreso hacia síntomas más serios, tales como la hemorragia cerebral.

El tratamiento para condiciones de conteo reducido de plaquetas, es guiado con frecuencia por la etiología y la severidad de la enfermedad. Los tratamientos actualmente disponibles para la trombocitopenia y condiciones relacionadas incluyen, por ejemplo, corticosteroides, IVIG, esplenectomía y transfusión de plaquetas, cuyos métodos son paliativos y no específicos, o drásticos y costosos. Además, los esfuerzos previos por utilizar la trombopoyetina, el mediador biológico primario de la trombopoyesis, han fracasado en la clínica debido a los efectos serios observados en los pacientes que desarrollaron una respuesta inmune al fármaco y, en consecuencia, a su propiedad trombopoyetina endógena. Miméticos de trombopoyetina y activadores de pequeña molécula del receptor de trombopoyetina están en desarrollo, pero no han sido aprobados por la Food and Drug Administration (FDA).

Las aminoacil-ARNt sintetasas, que catalizan la aminoacilación de moléculas de ARNt, son esenciales para la decodificación de la información genética durante el proceso de traducción. En eucariontes superiores, las aminoacil-ARNt sintetasas se asocian con otros polipéptidos para formar complejos de multienzimas supramoleculares. Cada una de las ARNt sintetasas eucarióticas consiste de una enzima central, la cual está estrechamente relacionada con la contraparte procariótica de la ARNt sintetasa, y un dominio adicional que está anexo al extremo amino-terminal o carboxilo-terminal de la enzima central. La tirosil-ARNt sintetasa (YRS) humana, por ejemplo, tiene un dominio carboxilo-terminal que no forma parte de las moléculas de YRS procarióticas y eucarióticas inferiores.

Las aminoacil ARNt sintetasas, tales como la tirosil-ARNt sintetasa, están asociadas comúnmente con funciones expandidas en células de mamífero, incluyendo actividades en las vías de transducción de señales, entre otras.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se deriva del hallazgo inesperado de que composiciones que comprenden polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa (YRS), incluyendo polipéptidos truncados y/o variantes de los mismos, estimulan la trombopoyesis in vivo (es decir, la formación incrementada de plaquetas). Por consiguiente, las modalidades de la presente invención pueden usarse generalmente para tratar y/o reducir el riesgo de que se desarrollen enfermedades o condiciones asociadas con trombocitopenia, o niveles reducidos de plaquetas.

Ciertas modalidades incluyen métodos para aumentar el conteo de plaquetas en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, incrementando de esta manera el conteo de plaquetas en el sujeto. Ciertas modalidades incluyen métodos para tratar, o reducir el riesgo de que se desarrolle, trombocitopenia en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, tratando o reduciendo de esta manera el riesgo de que se desarrolle trombocitopenia en el sujeto. Ciertas modalidades contemplan métodos para estimular la trombopoyesis en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, estimulando de esta manera la trombopoyesis en el sujeto. Ciertas modalidades incluyen métodos para mantener el conteo de plaquetas en un sujeto (por ejemplo, un sujeto que sufre una terapia asociada con el conteo reducido de plaquetas), que comprenden administrar al sujeto una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, manteniendo de esta manera el conteo de plaquetas en el sujeto.

Ciertas modalidades abarcan métodos para estimular la migración, proliferación y/o diferenciación de los megacariocitos en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, estimulando de esta manera la proliferación y/o diferenciación de los megacariocitos en el sujeto. Ciertas modalidades incluyen métodos para estimular la migración o proliferación de neutrófilos en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, estimulando de esta manera la proliferación de neutrófilos en el sujeto.

En ciertos aspectos, el sujeto tiene, o está en riesgo de que tenga, una enfermedad o condición asociada con un conteo disminuido o reducido de plaquetas. En ciertos aspectos, el sujeto tiene un conteo de plaquetas de aproximadamente 100,000/mm3 o menor, aproximadamente 110,000/mm3 o menor, aproximadamente 20,000/mm3 o menor, aproximadamente 130,000/mm3 o menor, aproximadamente 140,000/mm3 o menor o aproximadamente 150,000/mm3 o menor. En ciertas modalidades, la enfermedad o condición asociada con un conteo disminuido o reducido de plaquetas incluye, pero no está limitada a, hemorragia, contusión, epistaxis (hemorragias de la nariz), hiperesplenismo, hipotermia, infección por el virus de Epstein-Barr, mononucleosis infecciosa, síndrome de Wiskott-Aldrich, ingestión materna de tiazidas, trombocitopenia amegacariocítica congénita, síndrome de radio ausente en trombocitopenia, anemia de Fanconi, síndrome de Bernard-Soulier, anomalía de May-Hegglin, síndrome plaquetario de Grey, síndrome de Alport, rubéola neonatal, anemia aplásica, síndrome mielodisplásico, leucemia, linfoma, tumor, cáncer de médula ósea, deficiencia nutricional, exposición a radiaciones, insuficiencia hepática, sepsis bacteriana, sarampión, fiebre del dengue, infección por VIH o SIDA, premadurez, eritroblastosis fetal, púrpura trombocitopénica ¡diopática (ITP), ITP materna, síndrome hemolítico-urémico, coagulación intravascular diseminada, púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura post-transfusión, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, trombocitopenia aloinmune neonatal, hemoglobinuria nocturna paroxismal, infección por virus de la hepatitis C (HCV), trombocitopenia inducida por medicación y trombocitosis inducida por quimioterapia (CIT), entre otras conocidas en la técnica. En ciertos aspectos, el sujeto es un donador de plaquetas.

En ciertas modalidades, la condición asociada con un conteo disminuido o reducido de plaquetas, es inducida por una medicación o fármaco (por ejemplo, trombocitopenia inducida por medicación, trombocitosis inducida por quimioterapia). Ejemplos de medicaciones o fármacos que reducen el conteo de plaquetas pueden seleccionarse de agentes quimioterapéuticos, agentes antiinflamatorios no esteroidales, sulfonamidas, vancomicina, clopidogrel, inhibidores de glucoproteína llb/llla, interferones, ácido valproico, abciximab, linezolid, famotidina, mebeverina, bloqueadores de histamina, agentes alquilantes, heparina, alcohol y antibióticos. En ciertas modalidades, los agentes quimioterapéuticos pueden seleccionarse de cisplatino (CDDP), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán, clorambucilo, busulfán, nitrosourea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, etopósido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de unión al receptor de estrógeno, taxol, gemcitabina, navelbina, inhibidores de farnesil-proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato, temozolomida (una forma acuosa de DTIC), o cualquier análogo o derivado variante de los anteriores.

En ciertas modalidades de los métodos reclamados, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende una tirosil-ARNt sintetasa de mamífero, incluyendo una tirosil-ARNt sintetasa de mamífero truncada en su extremo C-terminal. En algunos de los métodos provistos en la presente, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde aproximadamente 1 a 50 residuos de aminoácido son truncados de su extremo C-terminal. En algunos de los métodos provistos en la presente, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde aproximadamente 50 a 100 residuos de aminoácido son truncados de su extremo C-terminal. En ciertas modalidades, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde aproximadamente 100 a 150 residuos de aminoácido son truncados de su extremo C-terminal. En otras modalidades, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde aproximadamente 150 a 200 residuos son truncados de su extremo C-terminal. En otras modalidades, los métodos provistos en la presente abarcan en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde aproximadamente 200 a 250 residuos de aminoácido son truncados de su extremo C-terminal. Ejemplos particulares de polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa C-terminalmente truncados, incluyen polipéptidos que comprenden o que consisten de los aminoácidos 1-343, aminoácidos 1-344, aminoácidos 1-350, aminoácidos 1-353 o aminoácidos 1-364 de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NOS: 1 , 2 ó 3. Ejemplos adicionales de polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa C-terminalmente truncados, incluyen los polipéptidos de SEQ ID NOS: 3 y 8.

En ciertas modalidades de los métodos reclamados, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende una tirosil-ARNt sintetasa de mamífero truncada en su extremo N-terminal. En algunos de los métodos provistos en la presente, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde aproximadamente 1 a 50 residuos de aminoácido son truncados de su extremo N-terminal. En algunos de los métodos provistos en la presente, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde aproximadamente 50 a 100 residuos de aminoácido son truncados de su extremo N-terminal. En ciertas modalidades, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde aproximadamente 100 a 150 residuos de aminoácido son truncados de su extremo N-terminal. En otras modalidades, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde aproximadamente 150 a 200 residuos son truncados de su extremo N-terminal. En otras modalidades, los métodos provistos en la presente abarcan en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde aproximadamente 200 a 250 residuos de aminoácido son truncados de su extremo N-terminal. Ejemplos particulares de polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa N-terminalmente truncados, incluyen los polipéptidos de SEQ ID NOS: 6, 10, 12 y 14.

En algunos de los métodos descritos en la presente, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa se selecciona de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; y (e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.

En ciertas modalidades de los métodos provistos en la presente, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa se selecciona de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; y (e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14.

Además de los métodos descritos en la presente, ciertas modalidades de la presente invención abarcan composiciones adaptadas para administración, que comprenden un excipiente y/o vehículo fisiológicamente aceptable y una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa como se describe en la presente, en donde la composición es capaz de estimular la trombopoyesis (es decir, de aumentar o mantener el conteo de plaquetas en un sujeto), estimular la proliferación y/o diferenciación de megacariocitos y/o estimular la proliferación de neutrófilos en un sujeto. En ciertas composiciones, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende una tirosil-ARNt sintetasa de mamífero truncada en su extremo C-terminal, como se describió anteriormente y en otra parte en la presente. En ciertas composiciones, el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende una tirosil-ARNt sintetasa de mamífero truncada en su extremo N-terminal, como se describió anteriormente y en otra parte en la presente.

En ciertas modalidades, las composiciones trombopoyéticas descritas en la presente comprenden un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa seleccionado de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; y (e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.

En ciertas modalidades, las composiciones trombopoyéticas descritas en la presente comprenden un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa seleccionado de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; y (e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14.

En ciertas modalidades, las composiciones de la presente invención comprenden además un segundo polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, incluyendo en donde los dos polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa forman un dímero. En ciertos aspectos, el dímero es un homodímero. En otros aspectos, el dímero es un heterodímero, tal como un heterodímero entre un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa de longitud completa y un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa truncado. En ciertas modalidades, las composiciones de la presente invención comprenden además un polipéptido heterólogo, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa y el polipéptido heterólogo forman un heterodímero, tal como un heterodímero bifuncional.

En ciertas modalidades, las composiciones trombopoyéticas provistas en la presente comprenden un excipiente y/o vehículo fisiológicamente aceptable y una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa quimérico, en donde el polipéptido quimérico comprende dos o más fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en donde los dos o más fragmentos comprenden por lo menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de YRS, en donde los dos o más fragmentos son enlazados para formar un polipéptido quimérico, y en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa quimérico es capaz de estimular la trombopoyesis y/o de incrementar el conteo de plaquetas en un sujeto.

En ciertas modalidades, las composiciones trombopoyéticas provistas en la presente comprenden un excipiente y/o vehículo fisiológicamente aceptable y una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa quimérico, en donde el polipéptido quimérico comprende (a) uno o más fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en donde los uno o más fragmentos comprenden por lo menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de YRS; y (b) uno o más polipéptidos heterólogos, en donde los uno o más fragmentos de (a) y los uno o más polipéptidos heterólogos de (b) son enlazados para formar un polipéptido quimérico, y en donde el polipéptido quimérico es capaz de estimular la trombopoyesis (es decir, de aumentar o mantener el conteo de plaquetas en un sujeto), estimular la proliferación y/o diferenciación de megacariocitos, y/o estimular la proliferación de neutrófilos en un sujeto.

Ciertas modalidades se refieren a métodos para estimular la proliferación y/o diferenciación de células progenitoras de megacariocitos tempranas, que comprenden incubar un cultivo de células madre hematopoyéticas con un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa por un tiempo suficiente para permitir la proliferación de las células progenitoras de megacariocitos tempranas, estimulando de esta manera la proliferación y/o diferenciación de células progenitoras de megacariocitos tempranas. En ciertas modalidades, el método se lleva a cabo ex vivo o in vitro. En ciertas modalidades, el cultivo se obtiene de médula ósea. En ciertas modalidades, el cultivo se obtiene de sangre del cordón umbilical. En ciertas modalidades, dichos métodos comprenden además administrar las células a un sujeto que necesita de las mismas.

Ciertas modalidades se refieren a métodos para estimular la migración de una célula que expresa CXCR-2, que comprenden poner en contacto la célula con un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, estimulando de esta manera la migración de la célula que expresa CXCR-2. En ciertas modalidades, el paso de puesta en contacto la célula ocurre in vitro o ex vivo. En ciertas modalidades, el paso de puesta en contacto comprende administrar a un sujeto que necesita del mismo, una composición que comprende una concentración efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa.

Ciertas modalidades se refieren a métodos para reducir la inflamación pulmonar y/o sus síntomas en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una concentración efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, reduciendo de esta manera la inflamación pulmonar y/o sus síntomas en el sujeto. En ciertas modalidades, el sujeto tiene una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En ciertas modalidades, la administración del polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa es efectiva para lograr la desensibilización de los neutrófilos circulantes a un alérgeno.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la tirosil-ARNt sintetasa humana (SEQ ID NO: 1).

La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de una variante Y341A de la tirosil-ARNt sintetasa humana de longitud completa (SEQ ID NO: 2).

La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos de una tirosil-ARNt sintetasa humana C-terminalmente truncada (aminoácidos 1-364) que tiene actividad trombopoyética (SEQ ID NO: 3).

La figura 4 muestra una secuencia de polinucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de longitud completa de la tirosil-ARNt sintetasa humana (SEQ ID NO: 4).

Las figuras 5A y 5B muestran los efectos in vivo sobre el número de plaquetas, después de la administración de una tirosil-ARNt sintetasa humana truncada. Para la figura 5A, se inyectó subcutáneamente a ratones dos veces al día por siete días con 1 , 3 y 10 pg/kg de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa C-terminalmente truncado (SEQ ID NO: 3) que tiene un marcador C-termí'nal de ocho aminoácidos L-E-H-H-H-H-H-H (SEQ ID NO: 5), y se determinó el conteo de plaquetas al final del estudio. Para la figura 5B, se inyectó subcutáneamente a ratones dos veces al día por 7 días con 3 g/kg del mismo polipéptido C-terminalmente truncado como en la figura 5A, y se determinó el conteo de plaquetas al final del estudio.

La figura 6 muestra los efectos in vivo sobre el número de megacariocitos después de la administración de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa humano C-terminalmente truncado (SEQ ID NO: 3) que tiene un marcador C-terminal de ocho aminoácidos, L-E-H-H-H-H-H-H (SEQ ID NO: 5).

Se inyectó subcutáneamente a los animales dos veces al día con 3 y 300 g/kg de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa de SEQ ID NO: 3 que tiene un marcador C-terminal de ocho aminoácidos (SEQ ID NO: 5) por 6 días, y se examinó la histología de la médula ósea y el bazo al final del estudio.

La figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante de empalme de la tirosil-ARNt sintetasa humana SP1 (SEQ ID NO: 6), que representa una variante N-terminalmente truncada de la secuencia de polipéptidos de YRS de tipo silvestre de longitud completa. La variante de empalme SP1 tiene 8 ó 9 aminoácidos N-terminales que no muestran similitud de secuencia con la secuencia de tipo silvestre. "X" representa cualquier aminoácido.

La figura 8 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 7) que codifica para el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa humana SP1 de SEQ ID NO: 6.

La figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante de empalme de tirosil-ARNt sintetasa humana SP2 (SEQ ID NO: 8), que representa una variante C-terminalmente truncada de la secuencia del polipéptido de YRS de tipo silvestre de longitud completa. La variante SP2 tiene aproximadamente 35 aminoácidos C-terminales que no muestran similitud de secuencia con la secuencia de tipo silvestre. "X" representa cualquier aminoácido.

La figura 10 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 9) que codifica para el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa humana SP2 de SEQ ID NO: 8.

La figura 11 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante de empalme de tirosil-ARNt sintetasa humana SP3 (SEQ ID NO: 10), que representa una variante N-terminalmente truncada de la secuencia del polipéptido de YRS de tipo silvestre de longitud completa.

La figura 12 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 11) que codifica para el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa humana SP3 de SEQ ID NO: 10.

La figura 13 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante de empalme de tirosil-ARNt sintetasa humana SP4 (SEQ ID NO: 12), que representa una variante N-terminalmente truncada de la secuencia del polipéptido de YRS de tipo silvestre de longitud completa.

La figura 14 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 13) que codifica para el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa humana SP4 de SEQ ID NO: 12.

La figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos de la variante de empalme de tirosil-ARNt sintetasa humana SP5 (SEQ ID NO: 14), que representa una variante N-terminalmente truncada de la secuencia del polipéptido de YRS de tipo silvestre de longitud completa. La variante SP5 tiene aproximadamente 8 aminoácidos N-terminales que no muestran similitud con la secuencia de tipo silvestre. "X" representa cualquier aminoácido.

La figura 16 muestra la secuencia de ácido nucleico (SEQ ID NO: 15) que codifica para el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa humana SP5 de SEQ ID NO: 14.

La figura 17 ilustra el empalme alterno de genes de la tirosil-ARNt sintetasa humana de tipo silvestre (WT), representada por la secuencia de ADNc de las variantes de empalme alternas SP1 a SP5.

La figura 18 describe la alineación de la secuencia de proteínas de los marcos de lectura abiertos predichos y reportados para los polipéptidos de YRS SP1 a SP5, en comparación con el polipéptido de YRS humano de longitud completa.

La figura 19 muestra la actividad trombopoyética de polipéptidos de YRS en ratas (véase el ejemplo 4).

La figura 20 muestra la migración de megacarioblastos MO7e en respuesta a la estimulación por los polipéptidos de YRS (véase el ejemplo 5).

La figura 21 muestra que los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa promueven la adhesión celular de células THP-1 a monocapas endoteliales de células HUVEC-2 (véase el ejemplo 6).

La figura 22 muestra que los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa incrementan la expresión de la molécula de adhesión VCAM-1 en monocapas endoteliales de células HUVEC-2 (véase el ejemplo 6).

La figura 23 muestra que los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa estimulan la migración de líneas de células 293 y CHO transfectadas con el receptor CXCR-2 (véase el ejemplo 7). La gráfica de la izquierda en la figura 23 muestra los resultados para las células 293/CXCR-2, y la gráfica de la derecha en la figura 23 muestra los resultados para las células CHO/CXCR-2.

La figura 24 muestra los efectos estimuladores de los polipéptidos de YRS sobre la migración de células polimorfonucleares (PMN) (véase el ejemplo 8).

La figura 25A-Figura 25C muestran los efectos de los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa sobre células progenitoras de megacariocitos en cultivos de células de médula ósea, medidos por el número de colonias (véase el ejemplo 10). La figura 25A muestra los efectos estimuladores de los polipéptidos de YRS sobre la formación de colonias de progenitores primitivos restringidos en linaje, o progenitores tempranos, y las figuras 25B y 25C muestran los efectos inhibidores de los polipéptidos de YRS sobre progenitores intermedios relativamente maduros (figura 25B) y progenitores tardíos (figura 25C), respectivamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al descubrimiento inesperado de que los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa (YRS), incluyendo truncamientos y variantes de los mismos, son capaces de imitar y estimular el proceso de trombopoyesis normal y, de esta manera, poseen actividad trombopoyética terapéuticamente benéfica. Ciertas modalidades de la presente invención se refieren, por lo tanto, al uso de polipéptidos de YRS para estimular el proceso de trombopoyesis natural, e incrementar de esta manera la producción de plaquetas en sujetos que necesitan de los mismos, tales como sujetos que sufren de una condición asociada con trombocitopenia (es decir, conteo reducido de plaquetas). Las ventajas del uso de los polipéptidos de YRS sobre otros tratamientos incluyen, por ejemplo, un mecanismo de acción diferente de los tratamientos tradicionales, sinergia con la señalización de trombopoyetina, mayor potencia, y los beneficios asociados con el uso de una molécula desinmunizada (por ejemplo, sin impacto de la respuesta inmune adversa potencial contra la trombopoyetina). Otras ventajas serán evidentes para los expertos en la técnica.

La práctica de la presente invención usará, a menos que se indique específicamente lo contrario, métodos convencionales de biología molecular y técnicas de ADN recombinante dentro de la aptitud de la técnica, muchos de los cuales se describen más adelante para el propósito de ilustración. Dichas técnicas se explican enteramente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a. edición, 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I y II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames y S. Higgins, eds., 1985); Transcríption and Translation (B. Hames y S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed., 1986); A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal, ed., 1984).

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente, se incorporan de esta manera en su totalidad en la presente como referencia.

Definiciones A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente tienen el mismo significado como lo entienden comúnmente los expertos en la técnica a la cual la invención pertenece. Aunque cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente puede usarse en la práctica o prueba de la presente invención, se describen métodos y materiales preferidos. Para los propósitos de la presente invención, los siguientes términos se definen a continuación.

Los artículos "un" y "una" se usan en la presente para referirse a uno o más de uno (es decir, a por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa un elemento o más de un elemento.

Por el término "aproximadamente" se entiende una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud que varía por tanto como 30, 25, 20, 25, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ó 1% respecto a una cantidad, nivel, valor, número, frecuencia, porcentaje, dimensión, tamaño, cantidad, peso o longitud de referencia.

El término "fragmento biológicamente activo", como se aplica a fragmentos de una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos de referencia, se refiere a un fragmento que tiene por lo menos aproximadamente 0.1 , 0.5, 1 , 2, 5, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 110, 120, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000% o más de la actividad de una secuencia de referencia. Incluidos dentro del alcance de la presente invención, son fragmentos biológicamente activos de por lo menos aproximadamente 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, o más residuos de aminoácido o nucleótidos contiguos de longitud, incluyendo todos los enteros intermedios, que comprenden o codifican para una actividad trombopoyética de un polipéptido o polinucleótido de referencia, tal como las secuencias de polipéptidos de referencia de SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 y 14, o las secuencias de nucleótidos de referencia de SEQ ID NOS: 4, 7, 9, 11 , 13 y 15. Ejemplos particulares de fragmentos biológicamente activos incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa C-terminalmente truncados que comprenden o consisten de los aminoácidos 1-343, aminoácidos 1-344, aminoácidos 1-350, aminoácidos 1-353 o aminoácidos 1-364, de la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , además de los polipéptidos de SEQ ID NOS: 3 y 6. Ejemplos adicionales de fragmentos biológicamente activos incluyen, pero no están limitados a, polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa N-terminalmente truncados, que comprenden o consisten de las secuencias de aminoácidos expuestas en SEQ ID NOS: 6, 10, 12 y 14. Los fragmentos biológicamente activos representativos participan generalmente en una interacción, por ejemplo, una interacción intramolecular o una interacción intermolecular. Una interacción intermolecular puede ser una interacción de unión específica o una interacción enzimática. Una interacción intermolecular puede ser entre un polipéptido de YRS y una molécula objetivo, tal como una molécula objetivo implicada en la regulación del proceso de trombopoyesis. Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de YRS incluyen fragmentos de polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos con similitud o identidad suficiente con, o las cuales se derivan de, las secuencias de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, incluyendo porciones trombopoyéticamente efectivas de los mismos, o son codificados por una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOS: 4, 7, 9, 11 , 13 y 15.

Por el término "secuencia codificante", se entiende cualquier secuencia de ácido nucleico que contribuye al código para el polipéptido producto de un gen. En contraste, el término "secuencia no codificante" se refiere a cualquier secuencia de ácido nucleico que no contribuye al código para el polipéptido producto de un gen.

A lo largo de esta especificación, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, se entenderá que los términos "comprende" y "que comprende" implican la inclusión de un paso o elemento o grupo de pasos o elementos establecidos, pero no la exclusión de cualquier otro paso o elemento o grupo de pasos o elementos.

Por el término "que consiste de" se entiende que incluye, y está limitado a, lo que sigue a la frase "que consiste de". De esta manera, la frase "que consiste de" indica que los elementos enlistados se requieren o son obligatorios, y que ningún otro elemento puede estar presente. Por el término "que consiste esencialmente de" se entiende que incluye cualquier elemento enlistado después de la frase, y está limitado a otros elementos que no interfieren con, o contribuyen a, la actividad o acción especificada en la descripción para los elementos enlistados. De esta manera, la frase "que consiste esencialmente de" indica que los elementos enlistados se requieren o son obligatorios, pero que otros elementos son opcionales, y pueden o no estar presentes, dependiendo de si o no afectan la actividad o acción de los elementos enlistados.

Los términos "complementario" y "complementariedad", se refieren a polinucleótidos (es decir, una secuencia de nucleótidos) relacionados por las reglas del apareamiento de bases. Por ejemplo, la secuencia "A-G-T" es complementaria a la secuencia "T-C-A". La complementariedad puede ser "parcial", en la cual sólo algunas de las bases de los ácidos nucleicos se aparean de acuerdo con las reglas del apareamiento de bases. O, puede haber una complementariedad "completa" o "total" entre los ácidos nucleicos. El grado de complementariedad entre las cadenas de ácidos nucleicos tiene efectos significativos sobre la eficiencia y fuerza de hibridación entre las cadenas de ácido nucleico.

Por el término "corresponde a" o "que corresponde a", se entiende (a) un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que es sustancialmente idéntica o complementaria a la totalidad o una porción de una secuencia de polinucleótidos de referencia o que codifica para una secuencia de aminoácidos idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína; o (b) un péptido o polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a una secuencia de aminoácidos en un péptido o proteína de referencia.

Por el término "derivado", se entiende un polipéptido que se ha derivado de la secuencia básica por modificación, por ejemplo, por conjugación o combinación con otras porciones químicas (por ejemplo, pegilación) o por técnicas de modificación post-traducción como se entendería en la técnica. El término "derivado" incluye también dentro de su alcance alteraciones que se hayan hecho a una secuencia precursora, incluyendo adiciones o deleciones que provean moléculas funcionalmente equivalentes.

Como se usa en la presente, los términos "función" y "funcional" y similares se refieren a una función biológica, enzimática o terapéutica.

Por el término "gen", se entiende una unidad de herencia que ocupa un locus específico en un cromosoma, y consiste de secuencias reguladoras de la transcripción y/o traducción y/o una región codificante y/o secuencias no traducidas (es decir, intrones, secuencias no traducidas 5' y 3').

El término "homología" se refiere al porcentaje del número de aminoácidos que son sustituciones conservativas idénticas o constitutivas.

Puede determinarse la homología usando programas de comparación de secuencia, tales como GAP (Deveraux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12, 387-395), el cual se incorpora en la presente como referencia. De esta manera, secuencias de una longitud similar o sustancialmente diferente de aquellas citadas en la presente, podrían compararse por la inserción de espacios intermedios en la alineación, dichos espacios intermedios siendo determinados, por ejemplo, por el algoritmo de comparación usado por GAP.

El término "célula hospedera" incluye una célula individual o cultivo de células que puede ser o ha sido un receptor de algún vector recombinante o polinucleótido aislado de la invención. Las células hospederas incluyen la progenie de una célula hospedera individual, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN total) a la célula precursora original, debido a mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado. Una célula hospedera incluye células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con un vector recombinante o un polinucleótido de la invención. Una célula hospedera que comprende un vector recombinante de la invención, es una célula hospedera recombinante.

Por el término "aislado", se entiende material que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que lo acompañan normalmente en su estado nativo. Por ejemplo, un "polinucleótido aislado", como se usa en la presente, se refiere a un polinucleótido que ha sido purificado de las secuencias que lo flanquean en un estado de ocurrencia natural, por ejemplo, un fragmento de ADN que ha sido removido de las secuencias que son normalmente adyacentes al fragmento. En forma alternativa, un "péptido aislado" o un "polipéptido aislado", y similares, como se usa en la presente, se refiere al aislamiento y/o purificación in vitro de una molécula de péptido o polipéptido de su ambiente celular natural, y de la asociación con otros componentes de la célula, es decir, no está asociado con sustancias in vivo.

Por el término "obtenida de", se entiende que una muestra tal como, por ejemplo, un extracto de polinucleótido o extracto de polipéptido es aislado de, o derivado de, una fuente particular del sujeto. Por ejemplo, el extracto puede obtenerse de un tejido o un fluido biológico aislado directamente del sujeto.

El término "oligonucleótido", como se usa en la presente, se refiere a un polímero compuesto de una multiplicidad de residuos de nucleótido (desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos, o variantes estructurales relacionadas o análogos sintéticos de los mismos) enlazados por medio de enlaces fosfodiéster (o variantes estructurales relacionadas o análogos sintéticos de los mismos). De esta manera, mientras que el término "oligonucleótido" se refiere típicamente a un polímero de nucleótidos en el cual los residuos de nucleótido y los enlaces entre ellos son de ocurrencia natural, se entenderá que el término incluye también dentro de su alcance varios análogos que incluyen, pero no están restringidos a, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs), fosforamidatos, fosforotioatos, metil fosfonatos, ácidos 2-O-metil ribonucleicos, y similares. El tamaño exacto de la molécula puede variar, dependiendo de la aplicación particular. Un oligonucleótido es típicamente más bien corto en longitud, generalmente de aproximadamente 10 a 30 residuos de nucleótido, pero el término puede referirse a moléculas de cualquier longitud, aunque el término "polinucleótido" o "ácido nucleico" se usa típicamente para largos oligonucleótidos.

El término "enlazado operablemente", como se usa en la presente, significa poner un gen estructural bajo el control regulador de un promotor, el cual controla entonces la transcripción y opcionalmente la traducción del gen. En la construcción de combinaciones de genes estructurales/promotor heterólogo, se prefiere generalmente posicionar la secuencia genética o promotor a una distancia del sitio de inicio de la transcripción del gen, que es aproximadamente la misma distancia entre esa secuencia genética o promotor y el gen que la controla en su ambiente natural; es decir, el gen del cual la secuencia genética o promotor se deriva. Como es sabido en la técnica, cierta variación en esta distancia puede ser acomodada sin pérdida de función. Asimismo, el posicionamiento preferido de un elemento de secuencia regulador con respecto a un gen heterólogo que se va a poner bajo su control, es definido por el posicionamiento del elemento en su ambiente natural; es decir, los genes de los cuales se deriva.

El término "polinucleótido" o "ácido nucleico", como se usa en la presente, designa ARNm, ARN, ARNc, ADNc o ADN. El término se refiere típicamente a la forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos, o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término incluye formas de ADN de cadena sencilla y de doble cadena.

Los términos "variante de polinucleótido" y "variante", y similares, se refieren a polinucleótidos que exhiben identidad de secuencia sustancial con una secuencia de polinucleótidos de referencia, o polinucleótidos que hibridan con una secuencia de referencia bajo condiciones severas que se definen más adelante. Estos términos abarcan también polinucleótidos que se distinguen de un polinucleótido de referencia por la adición, deleción o sustitución de por lo menos un nucleótido. Por consiguiente, los términos "variante de polinucleótido" y "variante" incluyen polinucleótidos en los cuales uno o más nucleótidos han sido añadidos o deletados, o reemplazados con diferentes nucleótidos. A este respecto, está bien entendido en la técnica que ciertas alteraciones que incluyen mutaciones, adiciones, deleciones y sustituciones pueden hacerse a un polinucleótido de referencia, por las cuales el polinucleótido alterado retiene la función o actividad biológica del polinucleótido de referencia. Las variantes de polinucleótido incluyen, por ejemplo, polinucleótidos que tienen por lo menos 50% (y por lo menos 51% a por lo menos 99% y todos los porcentajes en enteros intermedios) de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 4, o porciones de los mismos que codifican para un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa trombopoyético. Los términos "variante de polinucleótido" y "variante", incluyen también variantes alélicas de ocurrencia natural.

Los términos "polipéptido", "fragmento de polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan recíprocamente en la presente, para referirse a un polímero de residuos de aminoácido y a variantes y análogos sintéticos de los mismos. De esta manera, estos términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácido son aminoácidos sintéticos de ocurrencia no natural, tales como un análogo químico de un aminoácido de ocurrencia natural correspondiente, así como polímeros de aminoácidos de ocurrencia natural.

Los términos "tirosina ARN sintetasa" y "tirosil ARNt sintetasa" se usan recíprocamente en la presente, y se refieren a un polipéptido de "YRS" de la invención.

Los términos "polipéptidos de YRS", "fragmentos de polipéptidos de YRS", "polipéptidos de YRS truncados" o "variantes de los mismos" abarcan, sin limitación, polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos que comparte por lo menos 50% (y por lo menos 51% a por lo menos 99% y todos los porcentajes en enteros intermedios) de identidad de secuencia con una secuencia de referencia expuesta en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, incluyendo fragmentos biológicamente activos de los mismos, tales como fragmentos que tienen por lo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 200 o más aminoácidos contiguos de las secuencias de referencia, incluyendo todos los enteros intermedios. Estos términos abarcan además la variación alélica natural de los polipéptidos de YRS que pueden existir y ocurren de un género o especie a otro.

Los polipéptidos de YRS, incluyendo truncamientos y/o variantes de los mismos, abarcan polipéptidos que exhiben por lo menos aproximadamente 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 1 10%, 120%, 130%, 140%, 150%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%), 900%, 1000%) o más de la actividad biológica específica de un polipéptido de YRS de referencia (es decir, de modo que tienen una actividad trombopoyética en un sujeto o in vitro). Para los propósitos de la presente solicitud, la actividad biológica relacionada con YRS puede cuantificarse, por ejemplo, midiendo la capacidad de un polipéptido de YRS para incrementar el conteo de plaquetas en un sujeto, o incrementar el número de megacariocitos en un sujeto (véase, por ejemplo, el ejemplo 1 ). Además, modelos animales adecuados para medir la producción de plaquetas humanas se describen en Suzuki et al., European Journal of Haemotology 78: 123-130, 2007, cita incorporada en la presente como referencia. Modelos in vitro adecuados para medir la actividad trombopoyética se describen en el ejemplo 2, e incluyen además la prueba de la formación de colonias de megacariocitos, como se ejemplifica en Dessypris et al., Exp Hematol. 18: 754-7, 1990. Los polipéptidos de YRS, incluyendo truncamientos y/o variantes de los mismos que tienen actividad biológica sustancialmente reducida respecto a un polipéptido de YRS de referencia de tipo silvestre, son aquellos que exhiben menos de aproximadamente 25%, 10%, 5% ó 1 % de la actividad específica de los polipéptidos de YRS de tipo silvestre.

El término "variante" de polipéptido, se refiere a polipéptidos que se distinguen de un polipéptido de referencia por la adición, deleción o sustitución de por lo menos un residuo de aminoácido. En ciertas modalidades, una variante de polipéptido se distingue de un polipéptido de referencia por una o más sustituciones, las cuales pueden ser conservativas o no conservativas. En ciertas modalidades, la variante de polipéptido comprende sustituciones conservativas y, a este respecto, está bien entendido en la técnica que algunos aminoácidos pueden ser cambiados por otros con propiedades ampliamente similares, sin que cambie la naturaleza de la actividad del polipéptido. Las variantes de polipéptido abarcan también polipéptidos en los cuales uno o más aminoácidos han sido añadidos o deletados, o reemplazados con diferentes residuos de aminoácido.

La presente invención contempla el uso en los métodos descritos en la presente, de variantes de polipéptidos de YRS de longitud completa (por ejemplo, un polipéptido de longitud completa que tenga una sustitución Y341A), fragmentos truncados de polipéptidos de YRS de longitud completa, vahantes de fragmentos truncados, así como sus fragmentos biológicamente activos relacionados. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de YRS pueden participar en una interacción, por ejemplo, una interacción intramolecular o una interacción intermolecular. Una interacción intermolecular puede ser una interacción de unión específica o una interacción enzimática (por ejemplo, la interacción puede ser transitoria y un enlace covalente es formado o roto). Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de YRS incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente similares a, o derivadas de, las secuencias de aminoácidos de una secuencia de polipéptido de YRS de longitud completa (putativo), tal como SEQ ID NO: 1 , o porciones de los mismos, tales como los polipéptidos de SEQ ID NOS: 3, 6, 8, 10, 12 y 14. Típicamente, los fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con por lo menos una actividad de un polipéptido de YRS, y pueden incluir uno o más (y en algunos casos la totalidad) de los varios dominios activos, e incluyen fragmentos que tienen una actividad trombopoyética. En algunos casos, los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de YRS tienen una actividad biológica (por ejemplo, actividad trombopoyética) que es única del fragmento truncado particular, de modo que el polipéptido de YRS de longitud completa puede no tener esa actividad. En algunos casos, la actividad biológica puede revelarse separando el fragmento del polipéptido de YRS biológicamente activo de las otras secuencias del polipéptido de YRS de longitud completa, o alterando ciertos residuos (por ejemplo, Y341A) de la secuencia del polipéptido de YRS de longitud completa de tipo silvestre, para desenmascarar los dominios trombopoyéticamente activos. Un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de YRS truncado puede ser un fragmento de polipéptido que sea, por ejemplo, de 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400 o más aminoácidos contiguos, incluyendo todos los enteros intermedios, de las secuencias de aminoácidos expuestas en cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14. En ciertas modalidades, un fragmento biológicamente activo comprende una secuencia, dominio o motivo que estimula la trombopoyesis. En forma conveniente, el fragmento biológicamente activo tiene no menos de aproximadamente 1%, 10%, 25% o 50% de una actividad del polipéptido de tipo silvestre del cual se deriva.

Los términos "identidad de secuencia" o, por ejemplo, que comprende una "secuencia 50% idéntica a", como se usan en la presente, se refieren al grado que las secuencias son idénticas sobre una base de nucleótido por nucleótido o una base de aminoácido por aminoácido sobre una ventana de comparación. De esta manera, un "porcentaje de identidad de secuencia" puede calcularse comparando dos secuencias óptimamente alineadas sobre la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico idéntica (por ejemplo, A, T, C, G, I) o el residuo de aminoácido idéntico (por ejemplo, Ala, Pro, Ser, Thr, Gly, Val, Leu, lie, Phe, Tyr, Trp, Lys, Arg, His, Asp, Glu, Asn, Gln, Cys y Met) ocurre en ambas secuencias para dar el número de posiciones apareadas, dividiendo el número de posiciones apareadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana), y multiplicando el resultado por 100, para dar el porcentaje de identidad de secuencia.

Los términos usados para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos, incluyen "secuencia de referencia", "ventana de comparación", "identidad de secuencia", "porcentaje de identidad de secuencia" e "identidad sustancial". Una "secuencia de referencia" es de por lo menos 12, pero con frecuencia 15 a 18 y con frecuencia por lo menos 25 unidades monoméricas, incluyendo residuos de aminoácido y nucleótidos, de longitud. Debido a que dos polinucleótidos pueden comprender cada uno (1) una secuencia (es decir, sólo una porción de la secuencia de polinucleótidos completa) que es similar entre dos polinucleótidos, y (2) una secuencia que es divergente entre los dos polinucleótidos, comparaciones de secuencia entre dos (o más) polinucleótidos se realizan típicamente, comparando las secuencias de los dos polinucleótidos sobre una "ventana de comparación" para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento conceptual de por lo menos 6 posiciones contiguas, usualmente aproximadamente 50 a aproximadamente 100, más usualmente aproximadamente 100 a aproximadamente 150, en la cual una secuencia se compara con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas después de que las dos secuencias son óptimamente alineadas. La ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios intermedios) de aproximadamente 20% o menos, en comparación con la secuencia de referencia (la cual no comprende adiciones o deleciones) para la alineación óptima de las dos secuencias. La alineación óptima de secuencias para alinear una ventana de comparación puede llevarse a cabo por implementaciones computadas de algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el paquete de software Wisconsin Genetics versión 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Drive Madison, Wl, USA), o por inspección y la mejor alineación (es decir, resultando en el más alto porcentaje de homología sobre la ventana de comparación) generada por cualquiera de los varios métodos seleccionados. Puede hacerse referencia también a la familia de programas BLAST como es descrito, por ejemplo, por Altschul et al., 1997, Nucí. Acids Res. 25: 3389. Una discusión detallada del análisis de secuencias puede encontrarse en la unidad 19.3 de Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons Inc., 1994-1998, capítulo 15.

Un "sujeto", como se usa en la presente, incluye cualquier animal que exhibe un síntoma, o que está en riesgo de que exhiba un síntoma, que puede tratarse con un polipéptido de YRS trombopoyético de la invención. Sujetos (pacientes) adecuados incluyen animales de laboratorio (tales como ratón, rata, conejo o conejillo de Indias), animales de granja y animales domésticos o mascotas (tales como un gato o perro). Se incluyen primates no humanos y, de preferencia, pacientes humanos. Sujetos típicos incluyen animales que exhiben, o que están en riesgo de que exhiban, cantidades aberrantes de una o más actividades fisiológicas que pueden ser moduladas por un polipéptido trombopoyético, tal como el conteo disminuido o reducido de plaquetas (es decir, trombocitopenia). Típicamente, el término un sujeto que tiene trombocitopenia, o un conteo "reducido" de plaquetas, como se usa en la presente, se refiere a un sujeto que tiene una disminución en el conteo de plaquetas hasta aproximadamente 100,000/mm3 o menor, aproximadamente 110,0007mm3 o menor, aproximadamente 120,000/mm3 o menor, aproximadamente 130,000/mm3 o menor, aproximadamente 140,000/mm3 o menor o aproximadamente 150,000/mm3 o menor, en comparación con un conteo normal de plaquetas. Como se usa en la presente, un conteo "normal" de plaquetas varía generalmente de aproximadamente 150,000/mm3 a aproximadamente 450,000/mm3 en un sujeto. Como un ejemplo, un "sujeto" puede estar también cerca de que sufra, o que esté sufriendo o haya sufrido, un procedimiento de trasplante, tal como un trasplante de células madre o de médula ósea. Un sujeto puede tener también una enfermedad o trastorno pulmonar, tal como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD), y/o puede estar sufriendo una inflamación pulmonar.

El término "trombopoyesis", como se usa en la presente, se refiere a la formación de plaquetas sanguíneas, o trombocitos.

Una "concentración trombopoyéticamente efectiva" de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, como se describe en la presente, se refiere a una cantidad que es capaz de "tratar" un sujeto, tal como siendo "efectiva" para estimular o aumentar la trombopoyesis, según se mide típicamente por los niveles incrementados de plaquetas, niveles mantenidos de plaquetas, números incrementados de megacariocitos yo producción incrementada de neutrófilos.

Un "megacariocito" se refiere generalmente a una célula de la médula ósea que es responsable de la producción de trombocitos sanguíneos (es decir, plaquetas), los cuales son necesarios para la coagulación sanguínea normal: Los megacariocitos dan razón típicamente de 1 de 10,000 células de la médula ósea. Los megacariocitos se derivan de células precursoras de células madre hematopoyéticas pluripotentes en la médula ósea. La trombopoyetina (TPO) es la señal primaria para la producción de megacariocitos, es decir, la TPO es suficiente pero no absolutamente necesaria para inducir la diferenciación de las células progenitoras en la médula ósea hacia un fenotipo de megacariocito final. Otras señales moleculares para la diferenciación de los megacariocitos incluyen GM-CSF, IL-3, IL-6, IL-11 , quimiocinas (SDF-1 ; FGF-4) y eritropoyetina.

Se cree que los megacariocitos se desarrollan a través del siguiente linaje: CFU-Me (célula madre hematopoyética pluripotencial o hemocitoblasto) - > megacarioblasto -> promegacariocito -> megacariocito. En la etapa de megacarioblasto, la célula pierde su capacidad para dividirse, pero es aún capaz de replicar su ADN y de continuar su desarrollo, volviéndose poliploide. Tras la maduración, los megacariocitos comienzan el proceso de producción de plaquetas. La trombopoyetina desempeña una función en la inducción del megacariocito para formar pequeños procesos de proto-plaquetas, o membranas internas citoplásmicas para almacenar plaquetas antes de la liberación. Tras la liberación, cada uno de estos procesos de proto-plaquetas puede dar lugar a 2000 a 5000 nuevas plaquetas. En general, aproximadamente 2/3 partes de las plaquetas recién liberadas se mantendrán en la circulación, y aproximadamente 1/3 será secuestrado por el bazo. Después de la liberación de las plaquetas, el núcleo de la célula restante cruza típicamente la barrera de la médula ósea hacia la sangre, y es consumido en el pulmón por lo macrófagos alveolares.

Un "neutrófilo", o neutrófilo granulocito, se refiere generalmente a un tipo abundante de glóbulos blancos en humanos el cual, junto con los basófilos y eosinófilos, forman parte de la familia de células polimorfonucleares (PMNs). Los neutrófilos pueden identificarse fácilmente de acuerdo con sus características de tinción únicas en preparaciones citológicas o histológicas de hematoxilina y eosina (H&E). Los neutrófilos se encuentran normalmente en el torrente sanguíneo, pero son uno de los primeros grupos de células inflamatorias que migra hacia los sitios de inflamación durante la fase de inicio (es decir, la fase aguda) de la inflamación, principalmente como resultado de infección o cáncer. Típicamente, los neutrófilos migran primero a través de los vasos sanguíneos, y entonces a través de los tejidos intersticiales, siguiendo señales químicas (por ejemplo, interleucina-8 (IL-8), interferón-gamma (IFN-gamma) y C5a) que se originan en el sitio de inflamación. La "neutropenia" se refiere a la presencia de bajos conteos de neutrófilos, lo cual puede resultar de un trastorno congénito (genético), o puede desarrollarse debido a otras condiciones, como en el caso de anemia aplásica o algunos tipos de leucemia. Ciertas medicaciones, tales como los quimioterapéuticos, pueden causar también neutropenia. La neutropenia predispone notablemente para la infección. La neutropenia puede resultar también de la colonización de parásitos neutrofílicos intracelulares.

El término "aumenta" o "que aumenta", o "incrementa" o "que incrementa", o "estimula" o "que estimula", se refiere generalmente a la capacidad de uno o varios agentes o composiciones para producir o causar una mayor respuesta fisiológica (es decir, efectos corriente abajo) en una célula, en comparación con la respuesta causada por ningún polipéptido de YRS o una composición/molécula control. Una respuesta fisiológica mensurable puede incluir mayor crecimiento, expansión o migración de células, entre otras aparentes del entendimiento en la técnica y la descripción en la presente. Entre otros métodos conocidos en la técnica, las pruebas de formación de colonias in vitro representan una forma de medir las respuestas celulares a los agentes provistos en la presente. Una cantidad "incrementada" o "aumentada" es típicamente una cantidad "estadísticamente significativa", y puede incluir un incremento que sea de 1.1 , 1.2, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30 o más veces (por ejemplo, 500, 1000 veces) (incluyendo todos los enteros y puntos decimales intermedios y arriba de 1 ), por ejemplo, 1.5, 1.6, 1.7. 1.8, etc., la cantidad producida por ningún polipéptido de YRS (la ausencia de un agente) o una composición control.

El término "reduce" puede referirse generalmente a la capacidad de uno o más polipéptidos de YRS de la invención para "disminuir" una respuesta celular o fisiológica relevante, tal como un síntoma de una enfermedad o condición (por ejemplo, inflamación pulmonar, etc.), según se mide de acuerdo con técnicas de rutina en la materia de diagnóstico. Un ejemplo específico de una respuesta relevante incluye la migración de células inmunes (por ejemplo, neutrófilos) hacia ciertos tejidos, tales como el pulmón. Otras respuestas celulares o fisiológicas relevantes (in vivo o in vitro), serán evidentes para los expertos en la técnica. Una "disminución" en una respuesta puede ser estadísticamente significativa en comparación con la respuesta producida por ningún polipéptido de YRS o una composición control.

El término "migración" se refiere a migración celular, un proceso que puede medirse de acuerdo con pruebas in vitro de rutina, como se describe en la presente y es sabido en la técnica (véase, por ejemplo, el ejemplo 8). El termino migración se refiere también a la migración in vivo, tal como la migración de células de un tejido a otro tejido (por ejemplo, de médula ósea a sangre periférica, o de sangre periférica a tejido del pulmón), o de un sitio dentro de un tejido a otro sitio dentro del mismo tejido. La migración in vivo (por ejemplo, quimiotaxis) ocurre con frecuencia en una respuesta a la infección o a tejido irritado/dañado.

El término "diferenciación" se refiere al proceso por el cual una célula menos especializada (por ejemplo, pluripotente, totipotente, multipotente, etc.) se vuelve un tipo de célula más especializado.

El término "desensibilización" se refiere generalmente a la reducción o eliminación de una reacción inmune negativa (patológica) del organismo a una sustancia o estímulo, tal como un alérgeno o irritante, incluyendo antígenos extraños, así como "auto-antígenos". Por ejemplo, ciertas enfermedades o condiciones pulmonares están asociadas con una reacción negativa a irritantes extraños tales como el humo, de modo que la desensibilización de los neutrófilos a estos irritantes puede prevenir (es decir, reducir el riesgo de que se desarrollen) o reducir dichas enfermedades o condiciones, y/o sus síntomas.

El término "tratamiento" o "tratar", como se usa en la presente, incluye cualquier efecto deseable sobre los síntomas o la patología de una enfermedad o condición asociada con la trombocitopenia (es decir, niveles reducidos de plaquetas), o en riesgo de que se desarrolle trombocitopenia, y puede incluir incluso cambios mínimos o mejoras en uno o más marcadores mensurables de la enfermedad o condición que está siendo tratada. El término "tratamiento" o "tratar", no indica necesariamente la erradicación o cura completa de la enfermedad o condición, o los síntomas asociados de la misma. El sujeto que recibe este tratamiento, es cualquier animal que esté en necesidad, incluyendo primates, en particular humanos, y otros mamíferos tales como equinos, ganado, cerdos y ovejas; y aves de corral y mascotas en general. Ejemplos de marcadores de mejora clínica incluyen conteos incrementados de plaquetas, mantenimiento del conteo normal de plaquetas y/o número incrementado de megacariocitos, después de la administración de un polipéptido de YRS trombopoyético, como se describe en la presente.

Por el término "vector", se entiende una molécula de polinucleótido, de preferencia una molécula de ADN derivada, por ejemplo, de un plásmido, bacteriófago, levadura o virus, en el cual un polinucleótido puede ser insertado o clonado. Un vector contiene de preferencia uno o más sitios de restricción únicos, y puede ser capaz de exhibir replicación autónoma en una célula hospedera definida, incluyendo una célula o tejido objetivo o una célula o tejido progenitor de la misma, o puede ser integrable con el genoma del hospedero definido, de modo que la secuencia clonada sea reproducible. Por consiguiente, el vector puede ser un vector de replicación autónoma, es decir, un vector que existe como una entidad extracromosómica, cuya replicación es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo, un plásmido circular lineal o cerrado, un elemento extracromosómico, un minicromosoma o un cromosoma artificial. El vector puede contener cualquier medio que asegure la auto-replicación. En forma alternativa, el vector puede ser uno el cual, cuando es introducido en la célula hospedera, es integrado en el genoma y replicado junto con los cromosomas en los cuales ha sido integrado. Un sistema de vector puede comprender un vector o plásmido individual, o dos o más vectores o plásmidos, los cuales contienen en conjunto el ADN total que será introducido en el genoma de la célula hospedera, o un transposón. La elección del vector dependerá típicamente de la compatibilidad del vector con la célula hospedera en la cual el vector será introducido. En el presente caso, el vector es de preferencia uno que sea operablemente funcional en una célula bacteriana. El vector puede incluir también un marcador de selección, tal como un gen de resistencia a antibióticos que puede usarse para la selección de transformantes adecuados.

Los términos "de tipo silvestre" y "de ocurrencia natural", se usan recíprocamente para referirse a un gen o producto de gen que tiene las características de ese gen o producto de gen cuando es aislado de una fuente de ocurrencia natural. Un gen o producto de gen (por ejemplo, un polipéptido) de tipo silvestre, es aquel que se observa con más frecuencia en una población, y es de esta manera designado arbitrariamente como la forma "normal" o "de tipo silvestre" del gen.

Polipéptidos de tirosil-ARNt trombopovéticos, y variantes de los mismos La presente invención se refiere en parte a la observación inesperada de que ciertos polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa, incluyendo truncamientos y/o variantes de los mismos, imitan y estimulan el proceso trombopoyético natural in vivo. Por consiguiente, los polipéptidos trombopoyéticos de la presente invención incluyen un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa de longitud completa, además de cualquier fragmento biológicamente activo, o variante o modificación del mismo, de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en donde el polipéptido es capaz de estimular la trombopoyesis (es decir, la formación de plaquetas), la proliferación y/o diferenciación de megacariocitos, y/o la proliferación de neutrófilos en un sujeto o in vitro.

Las aminoacil-ARNt sintetasas, tales como la tirosil-ARNt sintetasa, catalizan típicamente la aminoacilación del ARNt por su aminoácido cognado. Debido a su función central en el enlace de los aminoácidos con los tripletes de nucleótidos contenidos en las moléculas de ARNt, se piensa que las aminoacil-ARNt sintetasas están entre las primeras proteínas que aparecieron en evolución. Las tirosil-ARNt sintetasas pertenecen en particular a la familia de la ARNt sintetasa clase I, la cual tiene dos motivos de secuencia altamente conservados en el sitio activo, HIGH y KMSKS. Las ARNt sintetasas clase I aminoacilan en el 2'-OH de un nucleótido de adenosina, y son usualmente monoméricas o diméricas (de una o dos subunidades, típicamente).

La tirosil-ARNt sintetasa humana está compuesta de tres dominios: 1) un dominio del pliegue de Rossmann amino-terminal que es responsable de la formación del intermediario E yr-AMP activado, y está conservado entre bacterias, miembros de los Archeae y eucariontes; 2) un dominio de reconocimiento del anticodón de ARNt que no ha sido conservado entre bacterias y eucariontes; y 3) un dominio carboxilo-terminal que es único de la tirosil-ARNt sintetasa humana, y cuya estructura primaria es 49% idéntica a la proteína II activadora de monocitos endoteliales de citocina humana putativa, 50% idéntica al dominio carboxilo-terminal de metionil-ARNt sintetasa de Caenorhabditis elegans, y 43% idéntica al dominio carboxilo-terminal de Arclp de Saccharomyces cerevisiae.

Los primeros dos dominios de la tirosil-ARNt sintetasa humana, son 52, 36 y 16% idénticos a las tirosil-ARNt sintetasas de S. cerevisiae, Methanococcus jannaschii y Bacillus stearothermophilus, respectivamente.

Nueve de los quince aminoácidos que se sabe están implicados en la formación del complejo de tirosil-adenilato en ß. stearothermophilus, están conservados a través de todos los organismos, mientras que los aminoácidos implicados en el reconocimiento de ARNtTyr no están conservados. Los análisis de la cinética de las tirosil-ARNt sintetasas de B. stearothermophilus y de humano recombinantes expresadas en Escherichia coli, indican que la tirosil-ARNt sintetasa humana aminoacila el ARNtTyr de humano pero no de B. stearothermophilus, y viceversa. Se cree que el dominio carboxilo-terminal de la tirosil-ARNt sintetasa humana evolucionó de la duplicación de genes del dominio carboxilo-terminal de la metionil-ARNt sintetasa, y puede dirigir el ARNt hacia el sitio activo de la enzima.

Los fragmentos biológicos de las tirosil-ARNt sintetasas eucarióticas enlazan la síntesis de proteínas a las vías de señalización celular, tales como la trombopoyesis. Estos fragmentos pueden ser producidos naturalmente por empalme alterno o proteólisis. Por ejemplo, como se provee en la presente invención, el fragmento N-terminal pro-trombopoyético mini-YRS es capaz de estimular la trombopoyesis in vivo. Además, ciertas mutaciones en la secuencia del polipéptido de YRS de longitud completa confieren actividad trombopoyética incrementada sobre la secuencia de referencia de tipo silvestre (por ejemplo, Y341A). Ejemplos de variantes de empalme truncadas de la secuencia del polipéptido de YRS de longitud completa, incluyen los polipéptidos SP1 a SP5 descritos en las figuras 17 a 18 y cuadro 1.

CUADRO 1 Anotación del NCBI de las secuencias de ADNc para las variantes de empalme de tirosil-ARNt sintetasa humanas SP1 a SP5.

La estructura del mini-YRS humano (es decir, SEQ ID NO: 3; o mini-Tyr), la cual contiene el dominio de reconocimiento de anticodones y el dominio catalítico, ha sido reportada a una resolución de 1.18 Á. Mientras que los dominios catalíticos de las enzimas humanas y bacterianas se sobreponen, la disposición espacial del dominio de reconocimiento anticodones respecto al dominio catalítico es única en el mini-YRS respecto a los ortólogos bacterianos. Sin que se desee que sea limitado por alguna teoría, la orientación única del dominio de reconocimiento anticodones puede explicar por qué el fragmento mini-YRS es más activo en varias vías de señalización celular.

Por consiguiente, las modalidades de la presente invención contemplan el uso de composiciones que comprenden polipéptidos de YRS trombopoyéticos, incluyendo polipéptidos truncados, variantes y/o modificados de los mismos, para estimular la trombopoyesis en un sujeto. Varias proteínas abarcadas por la presente solicitud son biológicamente activas, es decir, continúan poseyendo la actividad trombopoyética de una secuencia del polipéptido de YRS de referencia (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 y 14). Dichas variantes pueden resultar de, por ejemplo, polimorfismo genético o de manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de un fragmento de polipéptido de YRS de referencia tendrán por lo menos 40%, 50%, 60% o 70%, generalmente por lo menos 75%, 80% u 85%, usualmente aproximadamente 90% a 95% o más, y típicamente aproximadamente 98% o más similitud o identidad de secuencia, con la secuencia de aminoácidos para una proteína de referencia, según se determina por los programas de alineación de secuencia descritos en otra parte en la presente usando parámetros predeterminados. Una vanante biológicamente activa de un polipéptido de YRS de referencia, puede diferir de esa proteína generalmente por tanto como 200, 100, 50 ó 20 residuos de aminoácido, o en forma conveniente por tan pocos como 1 a 15 residuos de aminoácido, tan pocos como 1 a 10, tal como 6 a 10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2 ó incluso 1 residuo de aminoácido. En algunas modalidades, un polipéptido de YRS difiere de las secuencias de referencia en SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 y 14 por cuando menos uno, pero por menos de 15, 10 ó 5 residuos de aminoácido. En otras modalidades, difiere de las secuencias de referencia en SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 y 14 por cuando menos un residuo, pero menos de 20%, 15%, 10% o 5% de los residuos.

Un polipéptido de YRS puede ser alterado en varias formas, incluyendo sustituciones, deleciones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Métodos para dichas manipulaciones se conocen generalmente en la técnica. Por ejemplo, pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos de un polipéptido de YRS truncado y/o variante, por mutaciones en el ADN. Métodos para mutagénesis y alteraciones de la secuencia de nucleótidos son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Kunkel (1985, Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 82: 488-492), Kunkel et al., (1987, Methods in Enzymol, 154: 367-382), patente de E.U.A. No. 4,873,192, Watson, J. D. et al., ("Molecular Biology of the Gene", cuarta edición, Benjamin/Cummings, Menlo Park, Calif, 1987), y las referencias citadas en las mismas. Una guía para sustituciones adecuadas de aminoácidos que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés, puede encontrarse en el modelo de Dayhoff et al., (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found., Washington, D. C). Se conocen en la técnica métodos para identificar productos de genes de colecciones combinatorias hechas por mutaciones de punto o truncamiento, y para identificar colecciones de ADNc para productos de genes que tienen una propiedad seleccionada. Dichos métodos son adaptables para la identificación rápida de las colecciones de genes generadas por mutagénesis combinatoria de polipéptidos de YRS. La mutagénesis por ensamble recursiva (REM), una técnica que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las colecciones, puede usarse en combinación con las pruebas de identificación para identificar variantes de polipéptidos de YRS (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 7811-7815; Delgrave et al., (1993) Protein Engineering, 6: 327-331). Sustituciones conservativas, tales como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares pueden ser deseables, como se discute en más detalle más adelante.

Los polipéptidos de YRS truncados y/o variantes trombopoyéticamente activos pueden contener sustituciones conservativas de aminoácidos en varios sitios a lo largo de su secuencia, en comparación con una secuencia de aminoácidos de YRS de referencia (por ejemplo, SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14). Una "sustitución conservativa de aminoácidos", es una en la cual el residuo de aminoácido es reemplazado con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica, las cuales pueden subclasificarse generalmente como sigue: Ácidos: El residuo tiene una carga negativa debido a la pérdida de un ión H a pH fisiológico, y el residuo es atraído por una solución acuosa, de modo que busca las posiciones de superficie en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral ácida incluyen ácido glutámico y ácido aspártico.

Básicos: El residuo tiene una carga positiva debido a la asociación con ión H a pH fisiológico o dentro de una o dos unidades de pH del mismo (por ejemplo, histidina), y el residuo es atraído una por solución acuosa, de modo que busca las posiciones de superficie en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso a pH fisiológico. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral básica incluyen arginina, lisina e histidina.

Cargados: Los residuos están cargados a pH fisiológico y, por lo tanto, incluyen aminoácidos que tienen cadenas laterales ácidas o básicas (es decir, ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina e histidina).

Hidrofóbicos: Los residuos no están cargados a pH fisiológico, y el residuo es repelido por una solución acuosa, de modo que busca las posiciones interiores en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral hidrofóbica, incluyen tirosina, valina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina y triptófano.

Neutros/polares: Los residuos no están cargados a pH fisiológico, pero el residuo no es suficientemente repelido por las soluciones acuosas, de modo que buscaría posiciones interiores en la conformación de un péptido en el cual está contenido cuando el péptido está en un medio acuoso. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral neutra/polar, incluyen asparagina, glutamina, cisteína, histidina, serina y treonina.

Esta descripción caracteriza también a ciertos aminoácidos como "pequeños", puesto que sus cadenas laterales no son suficientemente largas, incluso si están ausentes grupos polares, para conferir carácter hidrofóbico. Salvo la prolina, los aminoácidos "pequeños" son aquellos con cuatro carbonos o menos cuando por lo menos un grupo polar está en la cadena lateral, y con tres carbonos o menos cuando no lo está. Los aminoácidos que tienen una cadena lateral pequeña incluyen glicina, serina, alanina y treonina. El aminoácido secundario codificado por genes prolina es un caso especial, debido a sus efectos conocidos sobre la conformación secundaria de las cadenas peptídicas. La estructura de la prolina difiere de todos los demás aminoácidos de ocurrencia natural, porque su cadena lateral está unida al nitrógeno del grupo a-amino, así como el carbono a. Sin embargo, varias matrices de similitud de aminoácidos (por ejemplo, la matriz PAM120 y la matriz PAM250 como es descrito, por ejemplo, por Dayhoff et al., (1978), A model of evolutionary change in proteins. Matrices for determining distance relationships, en M. O. Dayhoff (ed.), Atlas of protein sequence and structure, Vol. 5, pp. 345-358, National Biomedical Research Foundation, Washington DC; y por Gonnet et al., (Science, 256: 14430-1445, 1992), incluyen a la prolina en el mismo grupo que la glicina, serina, alanina y treonina. Por consiguiente, para los propósitos de la presente invención, la prolina se clasifica como un aminoácido "pequeño".

El grado de atracción o repulsión requerido para la clasificación como aminoácidos polares o no polares es arbitrario y, por lo tanto, los aminoácidos contemplados específicamente por la invención han sido clasificados como uno o el otro. La mayoría de los aminoácidos no nombrados específicamente, pueden clasificarse con base en su comportamiento conocido.

Los residuos de aminoácido pueden subclasificarse adicionalmente como cíclicos o no cíclicos, y aromáticos o no aromáticos, clasificaciones auto-explicativas con respecto a los grupos sustituyentes de la cadena lateral de los residuos, y como pequeños o grandes. El residuo es considerado pequeño, si contiene un total de cuatro átomos de carbono o menos, incluyendo el átomo del carboxilo, siempre que un sustituyente polar adicional esté presente; tres o menos si no. Los residuos pequeños son, de hecho, siempre no aromáticos. Dependiendo de sus propiedades estructurales, los residuos de aminoácido pueden clasificarse en dos o más clases. Para los aminoácidos de proteínas de ocurrencia natural, clasificación de acuerdo con este esquema se muestra en el cuadro A.

CUADRO A Sub-clasificación de aminoácidos Las sustituciones conservativas de aminoácidos incluyen también agrupaciones basadas en las cadenas laterales. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas incluye glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifáticas incluye serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida incluye asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas incluye fenilalanina, tirosina y triptófano; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas incluye lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre incluye cisteína y metionina. Por ejemplo, es razonable esperar que el reemplazo de una leucina con una isoleucina o valina, un aspartato con un glutamato, una treonina con una serina, o un reemplazo similar de un aminoácido con un aminoácido estructu raímente relacionado, no tenga un efecto importante sobre las propiedades del polipéptido variante resultante. Si un cambio de aminoácido resulta en un polipéptido de YRS truncado y/o variante funcional, puede determinarse fácilmente poniendo a prueba su actividad, como se describe en la presente (véase, por ejemplo, los ejemplos 1 y 2). Sustituciones conservativas se muestran en el cuadro B bajo el encabezado de ejemplos de sustituciones. Las sustituciones de aminoácido que están dentro del alcance de la invención se logran, en general, seleccionando sustituciones que no difieran significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura de la estructura de base del péptido en el área de la sustitución, (b) la carga o carácter hidrofóbico de la molécula en el sitio objetivo, o (c) el volumen de la cadena lateral. Después de que se introducen las sustituciones, las variantes se identifican para actividad biológica.

CUADRO B Ejemplos de sustituciones de aminoácido En forma alternativa, los aminoácidos similares que se usan para hacer sustituciones conservativas pueden agruparse en tres categorías, con base en la identidad de las cadenas laterales. El primer grupo incluye ácido glutámico, ácido aspártico, arginina, lisina e histidina, todos los cuales tienen cadenas laterales cargadas; el segundo grupo incluye glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, glutamina y asparagina; y el tercer grupo incluye leucina, isoleucina, valina, alanina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina, como se describe en Zubay, G., Biochemistry, tercera edición, Wm.C. Brown Publishers (1993).

De esta manera, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido de YRS truncado y/o variante, es reemplazado típicamente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de la cadena lateral. En forma alternativa, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de la totalidad o parte de una secuencia codificante de YRS, tal como por mutagénesis por saturación, y los mutantes resultantes pueden identificarse por una actividad del polipéptido precursor para identificar mutantes que retienen esa actividad. Después de la mutagénesis de las secuencias codificantes, el péptido codificado puede ser expresado recombinantemente, y puede determinarse la actividad del péptido. Un residuo de aminoácido "no esencial", es un residuo que puede ser alterado de la secuencia de tipo silvestre de una modalidad del polipéptido sin que se supriman o sustancialmente se alteren una o más de sus actividades. En forma conveniente, la alteración no suprime sustancialmente una de estas actividades, por ejemplo, la actividad es por lo menos 20%, 40%, 60%, 70% u 80%, 100%, 500% o 1000% o más, de tipo silvestre. Un residuo de aminoácido "esencial" es un residuo que, cuando es alterado de la secuencia de tipo silvestre de un polipéptido de YRS truncado de referencia, resulta en la supresión de una actividad de la molécula precursora, de modo que menos de 20% de la actividad de tipo silvestre está presente. Por ejemplo, dichos residuos de aminoácido esenciales incluyen aquellos que están conservados en los polipéptidos de YRS a través de diferentes especies, incluyendo aquellas secuencias que están conservadas en los motivos o sitios de unión que estimulan la trombopoyesis, de los polipéptidos de YRS de varias fuentes.

Por consiguiente, la presente invención contempla también variantes de las secuencias de polipéptidos de YRS de ocurrencia natural o sus fragmentos biológicamente activos, en donde las variantes se distinguen de la secuencia de ocurrencia natural por la adición, deleción o sustitución de uno o más residuos de aminoácido. En general, las variantes exhibirán por lo° menos aproximadamente 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 o 99% de similitud o identidad de secuencia con una secuencia de polipéptido de YRS de referencia, por ejemplo, como se expone en SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 y 14. Además, se contemplan secuencias que difieren de las secuencias nativas o precursoras por la adición, deleción o sustitución de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 o más aminoácidos, pero que retienen las propiedades de una secuencia de polipéptido de YRS precursora o de referencia. En ciertas modalidades, la región C-terminal o N-terminal de cualquiera de SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14 puede estar truncada por 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más aminoácidos, incluyendo todos los enteros intermedios (por ejemplo, 101 , 102, 103, 104, 105), en tanto el polipéptido de YRS truncado sea capaz de estimular la trombopoyesis (es decir, la formación de plaquetas), la proliferación y/o diferenciación de megacariocitos y/o la proliferación de neutrófilos en un sujeto o in vitro.

En algunas modalidades, los polipéptidos variantes difieren de una secuencia de YRS de referencia por cuando menos uno, pero por menos de 50, 40, 30, 20, 15, 10, 8, 6, 5, 4, 3 ó 2 residuos de aminoácido. En otras modalidades, los polipéptidos variantes difieren de las secuencias correspondientes de SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14 por cuando menos 1 %, pero menos de 20%, 15%, 10% o 5% de los residuos. (Si esta comparación requiere alineación, las secuencias deben ser alineadas para similitud máxima. Las secuencias "descompuestas" de deleciones o inserciones, o no apareamientos, se consideran como diferencias). Las diferencias son, en forma conveniente, diferencias o cambios en un residuo no esencial o una sustitución conservativa.

En ciertas modalidades, un polipéptido variante incluye una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o más identidad o similitud de secuencia, con una secuencia correspondiente de un polipéptido de YRS como se expone, por ejemplo, en SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, y tiene la capacidad de estimular la trombopoyesis en un sujeto, estimular la proliferación y/o diferenciación de megacariocitos en un sujeto, y estimular la proliferación de neutrófilos en un sujeto. Ejemplos de variantes de polipéptidos de YRS incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido de YRS de longitud completa, o una variante de empalme o truncamiento del mismo, que tiene una o más sustituciones de aminoácido seleccionadas de una sustitución R93Q, una sustitución I14L, una sustitución N17G, una sustitución L271 , una sustitución A85S y una sustitución V156L, además de combinaciones de las mismas. Ejemplos particulares de variantes de polipéptido de YRS incluyen, pero no están limitados a, un polipéptido de YRS que tiene los aminoácidos 1-364 de SEQ ID NO: 1 con una sustitución R93Q, un polipéptido de YRS que tiene los aminoácidos 1-353 de SEQ ID NO: 1 con una sustitución I14L, un polipéptido de YRS que tiene los aminoácidos 1-353 de SEQ ID NO: 1 con una sustitución N17G, un polipéptido de YRS que tiene los aminoácidos 1-353 de SEQ ID NO: 1 con una sustitución L27I, un polipéptido de YRS que tiene los aminoácidos 1-353 de SEQ ID NO: 1 con una sustitución A85S, y un polipéptido de YRS que tiene los aminoácidos 1-353 de SEQ ID NO: 1 con una sustitución V156L.

Los cálculos de la similitud de secuencia o identidad de secuencia entre las secuencias (los términos se usan recíprocamente en la presente), se realizan como sigue. Para determinar el por ciento de identidad de dos secuencias de aminoácidos, o de dos secuencias de ácido nucleico, las secuencias son alineadas para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse espacios intermedios en una de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico, o ambas, para alineación óptima, y pueden pasarse por alto secuencias no homologas para propósitos de comparación). En ciertas modalidades, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es de por lo menos 30%, de preferencia por lo menos 40%, más preferiblemente por lo menos 50%, 60%, e incluso más preferiblemente por lo menos 70%, 80%, 90% o 100%, la longitud de la secuencia de referencia. Se comparan entonces los residuos de aminoácido o los nucleótidos, en las posiciones de nucleótido o posiciones de aminoácido correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia es ocupada por el mismo residuo de aminoácido o nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición.

El por ciento de identidad entre las dos secuencias, es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios intermedios, y la longitud de cada espacio intermedio, el cual necesita ser introducido para la alineación óptima de las dos secuencias.

La comparación de las secuencias y la determinación de por ciento de identidad entre las dos secuencias, pueden lograrse usando un algoritmo matemático. En una modalidad preferida, el por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se determina usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970, J. Mol. Biol. 48: 444-453), el cual ha sido incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso para espacio intermedio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso para longitud de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6. En otra modalidad preferida, el por ciento de identidad entre dos secuencias de nucleótidos se determina usando el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz NWSgapdna.CMP y un peso para espacio intermedio de 40, 50, 60, 70 u 80 y un peso para longitud de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6. Una serie de parámetros particularmente preferida (y la única que debe usarse a menos que se especifique de otra manera), es una matriz de puntuación Blossum 62 con una penalización para espacio intermedio de 12, una penalización extendida para espacio intermedio de 4, y una penalización para espacio intermedio de estructura de 5.

El por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos o nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (1989, Cabios, 4: 1 1-17), el cual ha sido incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización para longitud de espacio intermedio de 12 y una penalización para espacio intermedio de 4.

Las secuencias de proteína y ácido nucleico descritas en la presente, pueden usarse como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas pueden llevarse a cabo usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al. (1990, J. Mol. Biol, 215: 403-10). Pueden realizarse búsquedas de nucleótidos BLAST con el programa NBLAST, puntuación = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a las moléculas de ácido nucleico de la invención. Pueden llevarse a cabo búsquedas de proteínas BLAST con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de~palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de proteína de la invención. Para obtener alineaciones con intersticios para propósitos de comparación puede usarse Gapped BLAST, como se describe en Altschul et al. (1997, Nucleic Acids Res, 25: 3389-3402). Cuando se usan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros predeterminados de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y N BLAST).

Pueden identificarse variantes de un polipéptido de YRS identificando colecciones combinatorias de mutantes de un polipéptido de YRS. Pueden usarse colecciones o fragmentos, por ejemplo, fragmentos N-terminales, C-terminales o internos, de una secuencia codificante de proteína de YRS, para generar una población variegada de fragmentos para identificación y selección subsiguiente de las variantes de un polipéptido de YRS.

Métodos para identificar productos de genes de colecciones combinatorias obtenidas por mutación de punto o truncamiento, y para identificar colecciones de ADNc para productos de genes que tienen una propiedad seleccionada, se conocen en la técnica. Dichos métodos son adaptables para la identificación rápida de las colecciones de genes generadas por mutagénesis combinatoria de polipéptidos de YRS.

La presente invención contempla también el uso de proteínas de fusión o quiméricas de YRS para estimular la trombopoyesis. Como se usa en la presente, una "proteína quimérica" o "proteína de fusión" de YRS, incluye un polipéptido o fragmento de polipéptido de YRS enlazado a otro polipéptido de YRS (por ejemplo, para crear fragmentos múltiples), a un polipéptido no de YRS, o a ambos. Un "polipéptido no de YRS", se refiere a un "polipéptido heterólogo" que tiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a una proteína que es diferente de la proteína de YRS, y el cual se deriva del mismo organismo o un organismo diferente. El polipéptido de YRS de la proteína de fusión puede corresponder a la totalidad o una porción de una secuencia de aminoácidos de YRS biológicamente activa. En ciertas modalidades, una proteína de fusión de YRS incluye por lo menos una porción o dos porciones biológicamente activas de una proteína de YRS. Los polipéptidos que forman la proteína de fusión están típicamente enlazados del extremo C-terminal al extremo N-terminal, aunque pueden estar también enlazados del extremo C-terminal al extremo C-terminal, del extremo N-terminal al extremo N-terminal o del extremo N-terminal al extremo C-terminal. Los polipéptidos de la proteína de fusión pueden estar en cualquier orden.

El miembro de fusión puede ser diseñado e incluido para esencialmente cualquier propósito deseado, siempre que no afecte adversamente la actividad trombopoyética del polipéptido. Por ejemplo, en una modalidad, un miembro de fusión puede comprender una secuencia que ayude en la expresión de la proteína (un intensificador de expresión) a mayores rendimientos que la proteína recombinante nativa. Pueden seleccionarse otros miembros de fusión, de modo que incrementen la solubilidad de la proteína, o permitan que la proteína sea dirigida hacia compartimientos intracelulares deseados.

La proteína de fusión puede incluir una porción que tenga una alta afinidad por un ligando. Por ejemplo, la proteína de fusión puede ser una proteína de fusión de GST-YRS, en la cual las secuencias de YRS están fusionadas al extremo C-terminal de las secuencias GST. Como otro ejemplo, un polipéptido de YRS puede estar fusionado a un marcador de ocho aminoácidos en el extremo C-terminal, tal como un marcador L-E-H-H-H-H-H-H (SEQ ID NO: 5). En ciertas modalidades, los aminoácidos 1-364 de un polipéptido YRS son fusionados a un marcador 365-L-E-H-H-H-H-H-H-372 (SEQ ID NO: 5) en el extremo C-terminal. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación y/o identificación de un polipéptido de YRS. En forma alternativa, la proteína de fusión puede ser una proteína de YRS que contenga una secuencia de señal heteróloga en su extremo N-terminal. En ciertas células hospederas, la expresión y/o secreción de las proteínas de YRS puede ser incrementada a través del uso de una secuencia de señal heteróloga.

Más generalmente, puede usarse la fusión con secuencias heterólogas, tal como un fragmento Fe, para remover características no deseadas, o para mejorar las características deseadas (por ejemplo, propiedades farmacocinéticas) de un polipéptido de YRS trombopoyético. Por ejemplo, la fusión con una secuencia heteróloga puede incrementar la estabilidad química, disminuir la inmunogenicidad, mejorar la determinación del blanco in vivo y/o incrementar la vida media en la circulación, de un polipéptido de YRS trombopoyético.

Puede usarse también la fusión con secuencias heterólogas para crear proteínas de fusión bifuncionales, tales como proteínas bifuncionales que no sólo sean capaces de estimular la trombopoyesis, la proliferación y/o diferenciación de megacariocitos, y/o la proliferación de neutrófilos a través del polipéptido de YRS, sino también sean también capaces de modificar (es decir, estimular o inhibir) otras vías a través del polipéptido heterólogo. Ejemplos de dichas vías incluyen, pero no están limitados a, varias vías relacionadas con el sistema inmune, tales como vías de activación inmunes innatas o adaptativas, o vías reguladoras del crecimiento de las células, tales como hematopoyesis y angiogénesis. En ciertos aspectos, el polipéptido heterólogo puede actuar sinérgicamente con el polipéptido de YRS para estimular vías relacionadas con la hematopoyesis y/o relacionadas con la trombopoyesis en un sujeto. Ejemplos de polipéptidos heterólogos que pueden usarse para crear una proteína de fusión bifuncional incluyen, pero no están limitados a, trombopoyetina, citocinas (por ejemplo, IL-11), quimiocinas y varios factores de crecimiento hematopoyéticos, además de fragmentos biológicamente activos y/o variantes de los mismos.

Pueden prepararse generalmente proteínas de fusión usando técnicas estándar. Por ejemplo, secuencias de ADN que codifican para los polipéptidos componentes de una fusión deseada pueden ser ensambladas por separado, y ligadas en un vector de expresión adecuado. El extremo 3' de la secuencia de ADN que codifica para un polipéptido componente es ligado, con o sin un enlazador de péptidos, al extremo 5' de una secuencia de ADN que codifica para el segundo polipéptido componente, de modo que los marcos de lectura de las secuencias estén en fase. Esto permite la traducción en una proteína de fusión individual que retiene la actividad biológica de ambos polipéptidos componentes.

Una secuencia del enlazador de péptidos puede usarse para separar el primer y segundo polipéptidos componentes por una distancia suficiente para garantizar que cada polipéptido se pliegue en sus estructuras secundaria y terciaria, si se desea. Dicha secuencia del enlazador de péptidos es incorporada en la proteína de fusión usando técnicas estándar bien conocidas en la materia. Ciertas secuencias del enlazador de péptidos pueden seleccionarse con base en los siguientes factores: (1) su capacidad para adoptar una conformación extendida flexible; (2) su incapacidad para adoptar una estructura secundaria que podría interactuar con epítopes funcionales en el primer y segundo polipéptidos; y (3) la falta de residuos hidrofóbicos o cargados que podrían reaccionar con los epítopes funcionales del polipéptido. Las secuencias preferidas del enlazador de péptidos contienen residuos de Gly, Asn y Ser. Otros aminoácidos casi neutros, tales como Thr y Ala, pueden usarse también en la secuencia del enlazador. Secuencias de aminoácidos que pueden emplearse útilmente como enlazadores, incluyen aquellas descritas en Maratea et al., Gene 40: 3946 (1985); Murphy et al., Proc. Nati. Acad Sci. USA 83: 8258-8262 (1986); patente de E.U.A. No. 4,935,233 y patente de E.UA No. 4,751 ,180. Las secuencias del enlazador puede ser generalmente de 1 a aproximadamente 50 aminoácidos de longitud. No se requieren secuencias del enlazador cuando el primer y segundo polipéptidos tienen regiones de aminoácido N-terminales no esenciales que pueden usarse para separar los dominios funcionales y prevenir la interferencia estérica.

Las secuencias de ADN ligadas pueden ser enlazadas operablemente a elementos reguladores adecuados de la transcripción o traducción. Los elementos reguladores responsables de la expresión del ADN se localizan 5' hacia la secuencia de ADN que codifica para los primeros polipéptidos. Asimismo, los codones de detención requeridos para terminar la traducción y las señales de terminación de la transcripción, están presentes 3' hacia la secuencia de ADN que codifica para el segundo polipéptido.

En general, los polipéptidos y polipéptidos de fusión (así como sus polinucleótidos codificantes) están aislados. Un polipéptido o polinucleótido "aislado", es uno que es removido de su ambiente original. Por ejemplo, una proteína de ocurrencia natural está aislada, si está separada de la totalidad de los materiales coexistentes o algunos de ellos en el sistema natural. De preferencia, dichos polipéptidos son por lo menos aproximadamente 90% puros, más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95% puros, y muy preferiblemente por lo menos aproximadamente 99% puros. Se considera que un polinucleótido está aislado si, por ejemplo, es clonado en un vector que no forma parte del ambiente natural.

Ciertas modalidades abarcan también dímeros de polipéptidos de YRS. Los dímeros pueden incluir, por ejemplo, homodímeros entre dos polipéptidos de YRS idénticos, heterodimeros entre dos diferentes polipéptidos de YRS (por ejemplo, un polipéptido de YRS de longitud completa y un polipéptido de YRS truncado), y/o heterodimeros entre un polipéptido de YRS y un polipéptido heterólogo. Ciertos heterodimeros, tales como aquellos entre un polipéptido de YRS y un polipéptido heterólogo pueden ser bifuncionales, como se describe en la presente.

Ciertas modalidades de la presente invención contemplan también el uso de polipéptidos de YRS modificados, incluyendo modificaciones que mejoran las características deseadas de un polipéptido de YRS, como se describe en la presente. Las modificaciones de los polipéptidos de YRS de la invención incluyen derivatizaciones químicas y/o enzimáticas en uno o más aminoácidos constituyentes, incluyendo modificaciones de la cadena lateral, modificaciones de la estructura de base y modificaciones N- y C-terminales que incluyen acetilación, hidroxilación, metilación, amidación y la unión de porciones de carbohidrato o lípido, cofactores, y similares. Ejemplos de modificaciones incluyen también la pegilación de un polipéptido de YRS (véase, por ejemplo, Veronese y Harris, Advanced Drug Delivery Reviews 54: 453-456, 2002, cita incorporada en la presente como referencia).

En ciertos aspectos, puede usarse la tecnología de ligación quimioselectiva para modificar los polipéptidos de YRS truncados de la invención, tal como uniendo los polímeros en una manera controlada y específica de sitio. Dicha tecnología depende típicamente de la incorporación de anclas quimioselectivas en la estructura de base de la proteína por medios químicos o recombinantes, y la modificación subsiguiente con un polímero que posea un enlazador complementario. Como resultado, el procedimiento de ensamble y la estructura covalente del conjugado de polímero-proteína resultante pueden ser controlados, permitiendo la optimización racional de las propiedades del fármaco, tales como las propiedades farmacocinéticas y de eficacia (véase, por ejemplo, Kochendoerfer, Current Opinión in Chemical Biology 9: 555-560, 2005).

Los polipéptidos de YRS truncados y/o variantes de la invención pueden prepararse por cualquier procedimiento adecuado conocido por los expertos en la técnica, tal como por técnicas recombinantes. Por ejemplo, pueden prepararse polipéptidos de YRS por un procedimiento que incluye los pasos de: (a) preparar una construcción que comprenda una secuencia de polinucleótidos que codifique para un polipéptido de YRS truncado y que esté enlazada operablemente a un elemento regulador; (b) introducir la construcción en una célula hospedera; (c) cultivar la célula hospedera para que exprese el polipéptido de YRS truncado; y (d) aislar el polipéptido de YRS truncado y/o variante de la célula hospedera. En ejemplos ilustrativos, la secuencia de nucleótidos codifica para por lo menos una porción biológicamente activa de una secuencia de polipéptidos expuesta en, o derivada de, SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, o una variante o fragmento biológicamente activo de la misma. Los polipéptidos de YRS recombinantes pueden prepararse convenientemente usando protocolos estándar como se describe, por ejemplo, en Sambrook, et al. (1989, citado anteriormente), en particular las secciones 16 y 17; Ausubel et al. (1994, citado anteriormente), en particular los capítulos 10 y 16; y Coligan et al., Current Protocols in Protein Science (John Wiley & Sons, Inc. 1995-1997), en particular los capítulos 1 , 5 y 6.

Además de los métodos de producción recombinantes, los polipéptidos de la invención, y fragmentos de los mismos, pueden producirse por síntesis directa de péptidos usando técnicas de fase sólida (Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154 (1963)). Puede realizarse la síntesis de proteínas usando técnicas manuales o por automatización. Puede lograrse la síntesis automatizada, por ejemplo, usando el sintetizador de péptidos 431A de Applied Biosystems (Perkin Elmer). En forma alternativa, pueden sintetizarse químicamente por separado varios fragmentos, y pueden combinarse usando métodos químicos para producir la molécula deseada.

Composiciones de polinucleótidos La presente invención provee también polinucleótidos aislados que codifican para los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa de la invención, incluyendo truncamientos y/o variantes de los mismos, así como composiciones que comprenden dichos polinucleótidos.

Como se usa en la presente, los términos "ADN" y "polinucleótido" y "ácido nucleico" se refieren a una molécula de ADN que ha sido aislada libre de ADN genómico total de una especie particular. Por lo tanto, un segmento de ADN que codifica para un polipéptido se refiere a un segmento de ADN que contiene una o más secuencias codificantes, y sin embargo está sustancialmente aislado de, o purificado libre de, ADN genómico total de la especie de la cual el segmento de ADN se obtiene. Incluidos dentro de los términos "segmento de ADN" y "polinucleótido", son segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos, y también vectores recombinantes que incluyen, por ejemplo, plásmidos, cósmidos, fagémidos, fagos, virus, y similares.

Como lo entenderán los expertos en la técnica, las secuencias de polinucleótidos de esta invención pueden incluir secuencias genómicas, secuencias codificadas por plásmidos y extragenómicas y segmentos de genes diseñados más pequeños que expresan, o pueden ser adaptados para que expresen, proteínas, polipéptidos, péptidos, y similares. Dichos segmentos pueden ser aislados en forma natural, o pueden ser modificados sintéticamente por la mano del hombre.

Como los expertos en la técnica reconocerán, los polinucleótidos pueden ser de cadena sencilla (codificantes o antisentido) o de doble cadena, y pueden ser moléculas de ADN (genómico, ADNc o sintético) o ARN. Secuencias codificantes o no codificantes adicionales pueden, pero no necesitan, estar presentes dentro de un polinucleótido de la presente invención, y un polinucleótido puede, pero no necesita, ser enlazado a otras moléculas y/o materiales de soporte.

Los polinucleótidos pueden comprender una secuencia nativa (es decir, una secuencia endógena que codifica para una tirosil-ARNt sintetasa, o una porción de la misma), o pueden comprender una variante, o un equivalente biológico funcional, de dicha secuencia. Las variantes de polinucleótidos pueden contener una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, como se describe adicionalmente más adelante, de preferencia de modo que la actividad trombopoyética del polipéptido codificado no sea sustancialmente disminuida respecto al polipéptido no modificado. El efecto sobre la actividad trombopoyética del polipéptido codificado puede evaluarse generalmente como se describe en la presente.

En modalidades adicionales, la presente invención provee polinucleótidos aislados que comprenden varias longitudes de tramos contiguos de secuencia idénticos a o complementarios a, una tirosil-ARNt sintetasa, en donde los polinucleótidos aislados codifican para una tirosil-ARNt sintetasa truncada como se describe en la presente.

Ejemplos de secuencias de nucleótidos que codifican para los polipéptidos de YRS de la solicitud abarcan genes de YRS de longitud completa, tales como las secuencias de polinucleótidos de SEQ ID NOS: 4, 7, 9, 1 , 13 y 15, así como porciones de las secuencias de nucleótidos de longitud completa o de sustancialmente longitud completa de los genes de YRS o sus transcritos o copias de ADN de estos transcritos. Las porciones de una secuencia de nucleótidos de YRS pueden codificar para porciones o segmentos de polipéptidos que retienen la actividad biológica del polipéptido de referencia. Una porción de una secuencia de nucleótidos de YRS que codifica para un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de YRS puede codificar para por lo menos aproximadamente 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 120, 150, 300 ó 400 residuos de aminoácido contiguos, o casi hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido de YRS de longitud completa. Se entenderá fácilmente que el término "longitudes intermedias" en este contexto y en los demás contextos usados en la presente, significa cualquier longitud entre los valores citados, tales como 101, 102, 103, etc.; 151 , 152, 153, etc.; 201 , 202, 203, etc.

Los polinucleótidos de la presente invención, sin tener en cuenta la longitud de la secuencia codificante misma, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiples, otros segmentos codificantes, y similares, de modo que su longitud general puede variar considerablemente. Se contempla por lo tanto que puede usarse un fragmento de polinucleótido de casi cualquier longitud, siendo limitada de preferencia la longitud total por la facilidad de preparación y el uso en el protocolo de ADN recombinante deseado.

La invención contempla también variantes de las secuencias de nucleótidos de YRS. Las variantes de ácido nucleico pueden ser de ocurrencia natural, tales como variantes alélicas (mismo locus), homologas (diferente locus) y ortólogas (diferente organismo), o pueden ser de ocurrencia no natural. Variantes de ocurrencia natural tales como estas, pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular bien conocidas tales como, por ejemplo, con técnicas de hibridación y de reacción en cadena de polimerasa (PCR), como es sabido en la técnica. Pueden obtenerse variantes de ocurrencia no natural por técnicas de mutagénesis, incluyendo aquellas aplicadas a polinucleótidos, células u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de nucleótidos. Puede ocurrir variación en las regiones codificantes y no codificantes, o en ambas. Las variaciones pueden producir sustituciones de aminoácido conservativas y no conservativas (según se compara en el producto codificado). Para las secuencias de nucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican para la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de YRS de referencia, tales como las secuencias expuestas en SEQ ID NOS: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 y 14. Las secuencias de nucleótidos variantes incluyen también secuencias de nucleótidos derivadas sintéticamente, tales como aquellas generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida a sitio, pero que codifican aún para un polipéptido de YRS. En general, las variantes de una secuencia de nucleótidos de YRS en particular tendrán por lo menos aproximadamente 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65% o 70%, en general por lo menos aproximadamente 75%, 80% u 85%, deseablemente aproximadamente 90% a 95% o más, y más convenientemente aproximadamente 98% o más identidad de secuencia, con aquella secuencia de nucleótidos particular, según se determina por programas de alineación de secuencia descritos en otro parte en la presente usando parámetros predeterminados.

Pueden usarse secuencias de nucleótidos de YRS para aislar secuencias y alelos correspondientes de otros organismos, en particular otros organismos o microorganismos. Están fácilmente disponibles en la técnica métodos para la hibridación de secuencias de ácido nucleico. Pueden aislarse secuencias codificantes de otros organismos de acuerdo con técnicas bien conocidas basadas en su identidad de secuencia con las secuencias codificantes expuestas en la presente. En estas técnicas, la totalidad o parte de la secuencia codificante conocida se usa como una sonda que híbrida selectivamente con otras secuencias codificantes de YRS presentes en una población de fragmentos de ADN genómico o fragmentos de ADNc clonados (es decir, colecciones de ADNc o colecciones genómicas) de un organismo seleccionado.

Por consiguiente, la presente invención contempla también polinucleótidos que hibridan con secuencias de nucleótidos de YRS de referencia, o con sus complementos, bajo las condiciones de severidad descritas más adelante. Como se usa en la presente, el término "híbrida bajo condiciones de baja severidad, severidad media, alta severidad o muy alta severidad", describe condiciones para hibridación y lavado. Una guía para realizar reacciones de hibridación, puede encontrarse en Ausubel et al. (1998, citado anteriormente), secciones 6.3.1-6.3.6. Métodos acuosos y no acuosos se describen en esa referencia, y pueden usarse. La referencia en la presente para condiciones de baja severidad, incluye y abarca formamida de por lo menos aproximadamente 1 % en v/v a por lo menos aproximadamente 15% en v/v, y sal de por lo menos aproximadamente 1 M a por lo menos aproximadamente 2 M para hibridación a 42°C, y sal de por lo menos aproximadamente 1 M a por lo menos aproximadamente 2 M para lavado a 42°C. Las condiciones de baja severidad pueden incluir también albúmina de suero de bovino (BSA) a 1%, EDTA 1 mM, NaHPO40.5 M (pH 7.2), SDS a 7% para hibridación a 65°C, y (i) 2 x SSC, SDS a 0.1 %; o (ii) BSA a 0.5%, EDTA 1 mM, NaHP04 40 mM (pH 7.2), SDS a 5% para lavado a temperatura ambiente. Una modalidad de condiciones de baja severidad incluye hibridación en 6 x cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC) a aproximadamente 45°C, seguida de dos lavados en 0.2 x SSC, SDS a 0.1% por lo menos a 50°C (la temperatura de los lavados puede incrementarse hasta 55°C para condiciones de baja severidad). Las condiciones de severidad media incluyen y abarcan formamida de por lo menos aproximadamente 16% en v/v a por lo menos aproximadamente 30% en v/v, y sal de por lo menos aproximadamente 0.5 M a por lo menos aproximadamente 0.9 M para hibridación a 42°C, y sal de por lo menos aproximadamente 0.1 M a por lo menos aproximadamente 0.2 M para lavado a 55°C. Las condiciones de severidad media pueden incluir también albúmina de suero de bovino (BSA) a 1%, EDTA 1 mM, NaHP04 0.5 M (pH 7.2), SDS a 7% para hibridación a 65°C, y (i) 2 x SSC, SDS a 0.1 %; o (ii) BSA a 0.5%, EDTA 1 mM, NaHP04 40 mM (pH 7.2), SDS a 5% para lavado a 60 a 65°C. Una modalidad de condiciones de severidad media incluye hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45°C, seguida de uno o más lavados en 0.2 x SSC, SDS a 0.1 % a 60°C. Las condiciones de alta severidad incluyen y abarcan formamida de por lo menos aproximadamente 31 % en v/v a por lo menos aproximadamente 50% en v/v, y sal de aproximadamente 0.01 M a aproximadamente 0.15 M para hibridación a 42°C, y sal de aproximadamente 0.01 M a aproximadamente 0.02 M para lavado a 55°C. Las condiciones de alta severidad pueden incluir también BSA a 1%, EDTA 1 mM, NaHP04 0.5 M (pH 7.2), SDS a 7% para hibridación a 65°C, y (i) 0.2 x SSC, SDS a 0.1%; o (ii) BSA a 0.5%, EDTA 1 mM, NaHPO440 mM (pH 7.2), SDS a 1 % para lavado a una temperatura mayor de 65°C. Una modalidad de condiciones de alta severidad incluye hibridación en 6 x SSC a aproximadamente 45°C, seguida de uno o más lavados en 0.2 x SSC, SDS a 0.1 % a 65°C.

En ciertas modalidades, un polipéptido de YRS es codificado por un polinucleótido que híbrida con una secuencia de nucleótidos descrita, bajo condiciones de muy alta severidad. Una modalidad de condiciones de muy alta severidad, incluye hibridación en fosfato de sodio 0.5 M, SDS a 7% y 65°C, seguida de uno o más lavados en 0.2 x SSC, SDS a 1 % a 65°C.

Otras condiciones de severidad son bien conocidas en la técnica, y el experto en la materia reconocerá que varios factores pueden manipularse para optimizar la especificidad de la hibridación. La optimización de la severidad de los lavados finales puede servir para garantizar un alto grado de hibridación. Para ejemplos detallados, véase Ausubel et al., citado anteriormente, en las páginas 2.10.1 a 2.10.16, y Sambrook et al. (1989, citado anteriormente) en las secciones 1.101 a 1.104.

Mientras que los lavados severos se llevan a cabo típicamente a temperaturas de aproximadamente 42°C a 68°C, el experto en la técnica apreciará que otras temperaturas pueden ser adecuadas para las condiciones de severidad. La velocidad de hibridación máxima ocurre típicamente a aproximadamente 20°C a 25°C abajo de la Tm para la formación de un híbrido de ADN-ADN. Es bien sabido en la técnica que la Tm es la temperatura de fusión, o la temperatura a la cual dos secuencias de polinucleótidos complementarias se disocian. Métodos para estimar la Tm, son bien conocidos en la técnica (véase Ausubel et al., citado anteriormente, en la página 2.10.8).

En general, la Tm de un dúplex de ADN perfectamente acoplado puede predecirse como una aproximación por la fórmula: Tm = 81.5 + 16.6 (logio M) + 0.41 (% de G+C) - 0.63 (% de formamida) - (600/longitud), en donde: M es la concentración de Na+, de preferencia en la escala de 0.01 molar a 0.4 molar; % de G+C es la suma de bases de guanosina y citosina como un porcentaje del número total de bases, dentro de la escala entre 30% y 75% de G+C; % de formamida es el porcentaje de la concentración de formamida en volumen; y la longitud es el número de pares de bases en el dúplex de ADN. La Tm de un dúplex de ADN disminuye en aproximadamente 1 °C con cada incremento de 1% en el número de pares de bases aleatoriamente no apareadas. El lavado se lleva a cabo generalmente a Tm -15°C para alta severidad, o Tm - 30°C para severidad moderada.

En un ejemplo de un procedimiento de hibridación, una membrana (por ejemplo, una membrana de nitrocelulosa o una membrana de nylon) que contiene ADN inmovilizado, es hibridada durante la noche a 42°C en un regulador de pH de hibridación (formamida desionizada a 50%, 5 x SSC, 5 x solución de Denhardt (ficoll a 0.1%, polivinilpirrolidona a 0.1 % y albúmina de suero de bovino a 0.1%), SDS a 0.1% y 200 mg/mL de ADN de esperma de salmón desnaturalizado) conteniendo una sonda marcada. La membrana es sometida entonces a dos lavados de severidad media secuenciales (es decir, 2 x SSC, SDS a 0.1% por 15 minutos a 45°C, seguido de 2 x SSC, SDS a 0.1% por 15 minutos a 50°C), seguidos de dos lavados de mayor severidad secuenciales (es decir, 0.2 x SSC, SDS a 0.1 % por 12 minutos a 55°C, seguido de 0.2 x SSC y solución de SDS a 0.1% por 12 minutos a 65 a 68°C).

Los polinucleótidos y fusiones de los mismos pueden ser preparados, manipulados y/o expresados usando cualquiera de una variedad de técnicas bien establecidas conocidas y disponibles en la materia. Por ejemplo, pueden usarse secuencias de polinucleótidos que codifiquen para los polipéptidos de la invención, o proteínas de fusión o equivalentes funcionales de las mismas, en moléculas de ADN recombinantes, para dirigir la expresión de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa truncado y/o variante en células hospederas adecuadas. Debido a la degeneración inherente del código genético, pueden producirse otras secuencias de ADN que codifiquen para sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia de aminoácidos funcionalmente equivalente, y estas secuencias pueden usarse para clonar y expresar un polipéptido dado.

Como lo entenderán los expertos en la técnica, puede ser ventajoso en algunos casos producir secuencias de nucleótidos que codifiquen para polipéptidos que posean codones de ocurrencia no natural. Por ejemplo, pueden seleccionarse codones preferidos por un hospedero procariótico o eucariótico particular, para incrementar la velocidad de expresión de las proteínas o para producir un transcrito de ARN recombinante que tenga propiedades deseables, tales como una vida media que sea más larga que la de un transcrito generado de la secuencia de ocurrencia natural.

Además, las secuencias de polinucleótidos de la presente invención pueden diseñarse usando métodos generalmente conocidos en la técnica para alterar secuencias codificantes de polipéptidos por una variedad de razones que incluyen, pero no están limitadas a, alteraciones que modifican la clonación, procesamiento, expresión y/o actividad del gen producto.

Para expresar un polipéptido deseado, una secuencia de nucleótidos que codifique para el polipéptido, o un equivalente funcional, puede ser insertada en un vector de expresión adecuado, es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Métodos que son bien conocidos por los expertos en la técnica pueden usarse para construir vectores de expresión que contengan secuencias que codifiquen para un polipéptido de interés y elementos de control de la traducción y transcripción adecuados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo. Dichas técnicas se describen en Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989), y en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1989).

Una variedad de sistemas de hospedero/vector de expresión se conocen y pueden usarse para contener y expresar secuencias de polinucleótidos. Estos incluyen, pero no están limitados a, microorganismos tales como bacterias transformadas con vectores de expresión de ADN recombinante de bacteriófagos, plásmidos o cósmidos; levaduras transformadas con vectores de expresión de levadura; sistemas de células de insecto infectadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, baculovirus); sistemas de células de plantas transformadas con vectores de expresión de virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Tí o pBR322); o sistemas de células animales.

Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión, son aquellas regiones no traducidas del vector -intensificadores, promotores y regiones no traducidas 3' y 5' -, que interactúan con las proteínas celulares del hospedero para llevar a cabo la transcripción y traducción. Dichos elementos pueden variar en su concentración y especificidad. Dependiendo del sistema de vector y hospedero usado, puede usarse cualquier número de elementos de la transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se realiza la clonación en sistemas bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como el promotor lacZ híbrido del fagémido PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o el plásmido PSPORT1 (Gibco BRL, Gaithersburg, Md.), y similares. En sistemas de células de mamífero, se prefieren generalmente promotores de genes de mamífero o de virus de mamífero. Si es necesario generar una línea de células que contenga copias múltiples de la secuencia que codifique para un polipéptido, vectores basados en SV40 o EBV pueden usarse en forma ventajosa con un marcador seleccionare adecuado.

En sistemas bacterianos, pueden seleccionarse muchos vectores de expresión, dependiendo del uso deseado para el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se necesiten grandes cantidades, pueden usarse vectores que dirijan la expresión de alto nivel de proteínas de fusión que sean fácilmente purificadas. Dichos vectores incluyen, pero no están limitados a, los vectores de expresión y clonación de E. coli multifuncionales, tales como BLUESCRIPT (Stratagene), en los cuales la secuencia que codifica para el polipéptido de interés puede ser ligada en el vector en el marco de lectura con secuencias para la Met amino-terminal y los 7 residuos subsiguientes de ß-galactosidasa, de modo que se produzca una proteína híbrida; vectores pIN (Van Heeke y Schuster, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509 (1989)); y similares. Pueden usarse también vectores pGEX (Promega, Madison, Wis.) para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S- transferasa (GST). En general, dichas proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente de células lisadas por adsorción de perlas de glutatión-agarosa seguida de elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas obtenidas en dichos sistemas pueden diseñarse para que incluyan heparina, trombina o sitios de digestión de proteasa del factor XA, de modo que el polipéptido clonado de interés pueda ser liberado de la porción de GST a voluntad.

En la levadura Saccharomyces cerevisiae, pueden usarse muchos vectores que contengan promotores constitutivos o inducibles tales como el factor alfa, alcohol oxidasa y PGH. Para revisiones, véase Ausubel et al. (citado anteriormente) y Grant et al., Methods Enzymol. 153: 516-544 (1987).

En casos en donde se usen vectores de expresión de plantas, la expresión de las secuencias que codifican para los polipéptidos puede ser dirigida por cualquiera de muchos promotores. Por ejemplo, promotores virales tales como los promotores 35S y 19S del CaMV pueden usarse solos o en combinación con la secuencia guía omega del TMV (Takamatsu, EMBO J. 6: 307-311 (1987)). En forma alternativa, pueden usarse promotores de plantas tales como la subunidad pequeña de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi et al., EMBO J. 3: 1671-1680 (1984); Broglie et al., Science 224: 838-843 (1984); y Winter et al., Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105 (1991)). Estas construcciones pueden ser introducidas en células de la planta por transformación de ADN directa o transfección mediada por el patógeno. Dichas técnicas se describen en muchas revisiones generalmente disponibles (véase, por ejemplo, Hobbs en McGraw Hill, Yearbook of Science and Technology, pp. 191-196 (1992)).

Puede usarse también un sistema de insecto para expresar un polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de dichos sistemas, se usa el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como un vector para expresar genes extraños en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican para el polipéptido pueden ser clonadas en una región no esencial del virus tal como el gen de poliedrina, y puestas bajo el control del promotor de poliedrina. La inserción exitosa de la secuencia que codifica para el polipéptido hará que el gen de poliedrina sea inactivo y produzca virus recombinantes que carecen de la proteína de la cubierta. Los virus recombinantes pueden usarse entonces para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las cuales el polipéptido de interés puede ser expresado (Engelhard et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 91 : 3224-3227 (1994)).

En células hospederas de mamífero, están disponibles generalmente muchos sistemas de expresión basados en virus. Por ejemplo, en casos en donde se use un adenovirus como un vector de expresión, las secuencias que codifican para un polipéptido de interés pueden ser ligadas en un complejo de traducción/transcripción del adenovirus que consista del promotor tardío y la secuencia guía tripartita. La inserción en una región E1 o E3 no esencial del genoma viral, puede usarse para obtener un virus viable que sea capaz de expresar el polipéptido en células hospederas infectadas (Logan y Shenk, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 57: 3655-3659 (1984)). Además, intensificadores de transcripción, tales como el intensificador del virus del sarcoma de Rous (RSV) o la región de promotor/intensificador de citomegalovirus (CMV) temprano/inmediato, pueden usarse para incrementar la expresión en células hospederas de mamífero.

Pueden usarse también señales de inicio específicas para lograr la traducción más eficiente de secuencias que codifican para un polipéptido de interés. Dichas señales incluyen el codón de inicio ATG y secuencias adyacentes. En casos en donde secuencias que codifican para el polipéptido, su codón de inicio y secuencias hacia el extremo 5' son insertadas en el vector de expresión adecuado, pueden no ser necesarias señales de control de la traducción o transcripción adicionales. Sin embargo, en casos en donde sólo la secuencia codificante o una porción de la misma es insertada, deben proveerse señales de control de la traducción exógenas que incluyan el codón de inicio ATG. Además, el codón de inicio debe estar en el marco de lectura correcto para garantizar la traducción de la inserción entera. Los codones de inicio y los elementos de traducción exógenos pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La eficiencia de la expresión puede ser aumentada por la inclusión de intensificadores que sean adecuados para el sistema de células particular que se use, tales como aquellos descritos en la literatura (Scharf er a/., Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162 (1994)).

Además, puede elegirse una cepa de células hospederas por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o procesar la proteína expresada en la forma deseada. Dichas modificaciones del polipéptido incluyen, pero no están limitadas a, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento posttraducción, el cual rompe una forma "prepro" de la proteína, puede usarse también para facilitar la inserción, el plegamiento y/o la función correctos. Diferentes células hospederas tales como CHO, HeLa, MDCK, HEK293 y W138, las cuales tienen una maquinaria celular específica y mecanismos característicos para dichas actividades post-traducción, pueden elegirse para garantizar la modificación y el procesamiento correctos de la proteína extraña.

Para la producción de alto rendimiento a largo plazo de proteínas recombinantes, se prefiere generalmente la expresión estable. Por ejemplo, líneas de células que expresan establemente un polinucleótido de interés pueden ser transformadas usando vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión endógenos y un gen marcador seleccionable en el mismo vector o en un vector separado. Después de la introducción del vector, puede dejarse que las células crezcan por 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de que sean cambiadas a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable, es conferir resistencia a la selección, y su presencia permite el crecimiento y la recuperación de las células que expresan exitosamente las secuencias introducidas. Puede hacerse que proliferen los clones resistentes de las células transformadas establemente, usando técnicas de cultivo de tejidos adecuadas para el tipo de célula.

Puede usarse cualquier número de sistemas de selección para recuperar las líneas de células transformadas. Estos incluyen, pero no están limitados a, los genes de timidina cinasa del virus del herpes simple (Wigler et al., Ce// 1 1 : 223-232 (1977)) y de adenina fosforribosiltransferasa (Lowy et al., Cell 22: 817-823 (1990)), los cuales pueden usarse en células tk o aprt, respectivamente. Asimismo, puede usarse la resistencia a antimetabolitos, antibióticos o herbicidas como la base para la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia a metotrexato (Wigler et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 77: 3567-70 (1980)); npt, que confiere resistencia a los aminoglucósidos neomicina y G-418 (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150: 1-14 (1981 )); y ais o pat, que confieren resistencia a clorsulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, citado anteriormente). Se han descrito otros genes seleccionabas, por ejemplo, trpB, que permiten que las células usen indol en lugar de triptófano, o hisD, que permite que las células usen histinol en lugar de histidina (Hartman y Mulligan, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 85: 8047-51 (1988)). El uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores tales como antocianinas, ß-glucuronidasa y su substrato GUS, y luciferasa y su substrato luciferina, siendo usados ampliamente no sólo para identificar transformantes, sino también para cuantificar la cantidad de expresión transitoria o estable de proteínas atribuible a un sistema de vector específico (Rhodes et al., Methods Mol. Biol. 55: 121-131 (1995)).

Se conoce en la técnica una variedad de protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por polinucleótidos, usando anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para el producto. Ejemplos incluyen prueba de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA) y distribución de células activada por fluorescencia (FACS). Estas y otras pruebas se describen, entre otros sitios, en Hampton et al., Serological Methods, a Laboratory Manual (1990) y Maddox et al., J. Exp. Meó. 158: 1211-1216 (1983).

Una amplia variedad de marcas y técnicas de conjugación son conocidas por los expertos en la técnica, y pueden usarse en varias pruebas con ácidos nucleicos y aminoácidos. Medios para producir sondas de PCR o hibridación marcadas para detectar secuencias relacionadas con los polinucleótidos incluyen oligomarcación, traducción de muesca, marcación de extremo o amplificación por PCR usando un nucleótido marcado. En forma alternativa, las secuencias, o cualquier porción de las mismas, pueden ser clonadas en un vector para la producción de una sonda de ARNm. Dichos vectores se conocen en la técnica, están disponibles comercialmente, y pueden usarse para sintetizar sondas de ARN in vitro por la adición de una ARN polimerasa adecuada tal como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos pueden llevarse a cabo usando una variedad de kits disponibles comercialmente. Marcas o moléculas de reportero adecuadas que pueden usarse, incluyen radionúclidos, enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromógenos, así como substratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y similares.

Células hospederas transformadas con una secuencia de polinucleótidos de interés, pueden cultivarse bajo condiciones adecuadas para la expresión y recuperación de la proteína del cultivo de células. La proteína producida por una célula recombinante puede ser secretada o contenida intracelularmente, dependiendo de la secuencia y/o el vector usados. Como lo entenderán los expertos en la técnica, pueden diseñarse vectores de expresión que contengan los polinucleótidos de la invención, para que contengan secuencias de señal que dirijan la secreción del polipéptido codificado a través de la membrana de una célula procariótica o eucariótica. Pueden usarse otras construcciones recombinantes para unir secuencias que codifican para un polipéptido de interés, con una secuencia de nucleótidos que codifique para un dominio de polipéptido que facilite la purificación de las proteínas solubles.

Composiciones de anticuerpos, fragmentos de los mismos y otros agentes de unión De conformidad con otro aspecto, la presente invención provee además agentes de unión, tales como anticuerpos y fragmentos de unión a antígeno de los mismos, que exhiben unión inmunológica a un polipéptido descrito en la presente, o a una porción, variante o derivado del mismo, y métodos de uso de los mismos. De preferencia, dichos agentes de unión son efectivos para modular una o más de las actividades no canónicas mediadas por un polipéptido de YRS de la invención, o para detectar la presencia o ausencia de polipéptidos de YRS seleccionados (por ejemplo, truncamientos, variantes de empalme alternas, mutantes) en una muestra, tal como una muestra biológica obtenida de un sujeto.

Por ejemplo, ciertas modalidades contemplan un método para identificar o caracterizar un polipéptido de YRS en un sujeto, que comprende obtener una muestra biológica del sujeto, poner en contacto la muestra biológica con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo o fragmento del antígeno se une específicamente a un polipéptido de YRS de la invención, y detectar la presencia o ausencia del anticuerpo unido, o fragmento de unión a antígeno del mismo, identificando o caracterizando de esta manera el polipéptido de YRS en el sujeto. En ciertos aspectos, el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, se une específicamente a un cierto polipéptido de YRS variante o truncado, tal como un muíante de YRS seleccionado o variante de empalme alterno, pero no se une específicamente a otros polipéptidos de YRS, tal como un polipéptido de YRS de tipo silvestre de longitud completa.

Se dice que un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, "se une específicamente", "se une inmunológicamente" y/o es "inmunológicamente reactivo" a un polipéptido de la invención, si reacciona a un nivel detectable (dentro de, por ejemplo, una ELISA) con el polipéptido, y no reacciona detectablemente con polipéptidos no relacionados bajo condiciones similares.

La unión inmunológica, como se usa en este contexto, se refiere generalmente a las interacciones no covalentes del tipo que ocurre entre una molécula de inmunoglobulina y un antígeno para el cual la inmunoglobulina es específica. La fuerza o afinidad de las interacciones de unión inmunológica puede expresarse en términos de la constante de disociación (Kd) de la interacción, en donde una Kd más pequeña representa una mayor afinidad. Las propiedades de unión inmunológica de los polipéptidos seleccionados pueden cuantificarse usando métodos bien conocidos en la técnica. Uno de dichos métodos consiste en medir las velocidades de formación y disociación del complejo de antígeno/sitio de unión al antígeno, en donde dichas velocidades dependen de las concentraciones de los miembros del complejo, la afinidad de la interacción, y de los parámetros geométricos que influyen igualmente sobre la velocidad en ambas direcciones. De esta manera, la "constante de velocidad activa" (Kon) y la "constante de velocidad inactiva" (K0ff) pueden determinarse por el cálculo de las concentraciones y las velocidades reales de asociación y disociación. La relación K0ff/K0n permite la cancelación de todos los parámetros no relacionados con la afinidad, y es de esta manera igual a la constante de disociación Kd. Véase, en general, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59: 439-473.

Un "sitio de unión a antígeno" o "porción de unión" de un anticuerpo, se refiere a la parte de la molécula de inmunoglobulina que participa en la unión al antígeno. El sitio de unión a antígeno es formado por los residuos de aminoácido de las regiones variables ("V") N-terminales de las cadenas pesada ("H") y ligera ("L"). Tres tramos altamente divergentes dentro de las regiones V de las cadenas pesada y ligera, son referidos como "regiones hipervariables", las cuales están interpuestas entre los tramos de flanqueo más conservados conocidos como "regiones de estructura" o "FRs". De esta manera, el término "FR" se refiere a las secuencias de aminoácidos que se encuentran naturalmente entre, y adyacentes a, las regiones hipervariables en las inmunoglobulinas. En una molécula de anticuerpo, las tres regiones hipervariables de una cadena ligera y las tres regiones hipervariables de una cadena pesada están dispuestas mutuamente en un espacio tridimensional para formar una superficie de unión al antígeno. La superficie de unión al antígeno es complementaria a la superficie tridimensional de un antígeno unido, y las tres regiones hipervariables de cada una de las cadenas pesada y ligera son referidas como "regiones determinantes de complementariedad", o "CDRs".

Un agente de unión puede ser, por ejemplo, un ribosoma, con o sin un péptido componente, una molécula de ARN o un polipéptido. En una modalidad preferida, un agente de unión es un anticuerpo o un fragmento de unión a antígeno del mismo. Pueden prepararse anticuerpos por cualquiera de una variedad de técnicas conocidas por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Laboratory, 1988. En general, pueden producirse anticuerpos por técnicas de cultivo de células, que incluyen la generación de anticuerpos monoclonales como se describe en la presente, o por medio de transfección de genes de anticuerpo en células hospederas de mamífero o bacteria adecuadas, que permitan la producción de anticuerpos recombinantes. En una técnica, un inmunógeno que comprenda el polipéptido es inyectado inicialmente en cualquiera de una amplía variedad de mamíferos (por ejemplo, ratones, ratas, conejos, ovejas o cabras). En este paso, los polipéptidos de esta invención pueden servir como el inmunógeno sin modificación. En forma alternativa, en particular para polipéptidos relativamente cortos, una respuesta inmune superior puede ser inducida si el polipéptido es unido a una proteína portadora, tal como albúmina de suero de bovino o hemocianína de la lapa Fissurella. El inmunógeno es inyectado en el animal hospedero, de preferencia de acuerdo con un plan predeterminado que incorpore una o más inmunizaciones de refuerzo, y los animales son sangrados periódicamente. Anticuerpos policlonales específicos para el polipéptido pueden purificarse entonces de dichos antisueros, por ejemplo, por cromatografía de afinidad usando el polipéptido acoplado a un soporte sólido adecuado.

Pueden prepararse anticuerpos monoclonales específicos para un polipéptido de interés, por ejemplo, usando la técnica de Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976, y mejoras a la misma. En resumen, estos métodos implican la preparación de líneas de células inmortales capaces de producir anticuerpos que tengan la especificidad deseada (es decir, reactividad con el polipéptido de interés). Dichas líneas de células pueden producirse, por ejemplo, de células de bazo obtenidas de un animal inmunizado como se describió anteriormente. Las células de bazo son inmortalizadas entonces, por ejemplo, por fusión con un miembro de fusión de célula de mieloma, de preferencia uno que sea singénico con el animal inmunizado. Puede usarse una variedad de técnicas de fusión. Por ejemplo, las células de bazo y las células de mieloma pueden combinarse con un detergente no iónico por unos cuantos minutos, y pueden sembrarse entonces a una baja densidad en un medio selectivo que sustente el crecimiento de células híbridas, pero no células de mieloma. Una técnica de selección preferida usa selección con HAT (hipoxantina, aminopterina, timidina). Después de un tiempo suficiente, usualmente aproximadamente 1 a 2 semanas, se observan colonias de híbridos. Se seleccionan las colonias individuales, y sus sobrenadantes de cultivo se ponen a prueba para actividad de unión contra el polipéptido. Se prefieren hibridomas que tengan alta reactividad y especificidad.

Pueden aislarse anticuerpos monoclonales de los sobrenadantes de colonias de hibridoma en crecimiento. Además, pueden usarse varias técnicas para aumentar el rendimiento, tales como inyección de la línea de células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un vertebrado hospedero adecuado, tal como un ratón. Pueden cosecharse entonces anticuerpos monoclonales del fluido de ascitis o de la sangre. Pueden removerse los contaminantes de los anticuerpos por técnicas convencionales, tales como cromatografía, filtración en gel, precipitación y extracción. Los polipéptidos de esta invención pueden usarse en el procedimiento de purificación en, por ejemplo, un paso de cromatografía de afinidad.

Muchas moléculas terapéuticamente útiles se conocen en la técnica, las cuales comprenden sitios de unión al antígeno que son capaces de exhibir propiedades de unión inmunológica de una molécula de anticuerpo. La enzima proteolítica papaína rompe preferiblemente las moléculas de IgG para dar varios fragmentos, dos de los cuales (los fragmentos "F(ab")) comprenden cada uno un heterodímero covalente que incluye un sitio de unión al antígeno intacto. La enzima pepsina es capaz de romper las moléculas de IgG para proveer varios fragmentos, incluyendo el fragmento "F(ab')2" que comprende ambos sitios de unión al antígeno. Un fragmento "Fv" puede producirse por digestión proteolítica preferencial de una IgM, y en raras ocasiones una molécula de inmunoglobulina de IgG o IgA. Sin embargo, los fragmentos Fv se derivan más comúnmente usando técnicas recombinantes conocidas en la materia. El fragmento Fv incluye un heterodímero VH::VL no covalente, que incluye un sitio de unión al antígeno que retiene gran parte de las capacidades de unión y reconocimiento del antígeno de la molécula de anticuerpo nativa. Véase Inbar et al. (1972) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 69: 2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15: 2706-2710; y Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096.

Un polipéptido Fv de cadena sencilla ("sFv") es un heterodímero VH:: VL enlazado covalentemente que es expresado de una fusión de genes que incluye genes que codifican para VH y VL enlazados por un enlazador que codifica para péptidos. Véase Huston et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85(16): 5879-5883. Muchos métodos se han descrito para discernir las estructuras químicas para convertir las cadenas de polipéptidos ligera y pesada naturalmente agregadas - pero químicamente separadas - de una región V de anticuerpo en una molécula sFv que se plegará en una estructura tridimensional sustancialmente similar a la estructura de un sitio de unión al antígeno. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,091 ,513 y 5,132,405, a Huston eí al.; y la patente de E.U.A. No. 4,946,778, a Ladner eí al.

Cada una de las moléculas descritas anteriormente incluye un juego de CDR de una cadena pesada y una cadena ligera, respectivamente, interpuesto entre un juego de FR de una cadena pesada y una cadena ligera, que proveen soporte para las CDRs y definen la relación espacial mutua de las CDRs. Como se usa en la presente, el término "juego de CDR" se refiere a las tres regiones hipervariables de la región V de cadena pesada o cadena ligera. Procediendo del extremo N-terminal de una cadena pesada o ligera, estas regiones se denotan como "CDR1 ", "CDR2" y "CDR3", respectivamente. Un sitio de unión al antígeno incluye, por lo tanto, seis CDRs, que comprenden el juego de CDR de cada una de la región V de cadena pesada y cadena ligera. Un polipéptido que comprende una CDR sencilla (por ejemplo, CDR1 , CDR2 o CDR3), es referido en la presente como una "unidad de reconocimiento molecular". El análisis cristalográfico de muchos complejos de anticuerpo-antígeno, ha demostrado que los residuos de aminoácido de las CDRs hacen contacto extensivo con el antígeno unido, en donde el contacto más extensivo con el antígeno es con la CDR3 de la cadena pesada. De esta manera, las unidades de reconocimiento molecular son principalmente responsables de la especificidad de un sitio de unión al antígeno.

Como se usa en la presente, el término "juego de FR" se refiere a las cuatro secuencias de aminoácidos de flanqueo que forman las CDRs de un juego de CDR de la región V de la cadena pesada o la cadena ligera. Algunos residuos de FR pueden entrar en contacto con el antígeno unido; sin embargo, las FRs son responsables principalmente del plegamiento de la región V en el sitio de unión al antígeno, en particular los residuos de FR unidos directamente a las CDRs. Dentro de las FRs, ciertos residuos de aminoácido y ciertas características estructurales están muy altamente conservados. A este respecto, todas las secuencias de la región V contienen un bucle de disulfuro interno de aproximadamente 90 residuos de aminoácido. Cuando las regiones V se pliegan en un sitio de unión, las CDRs son exhibidas como motivos de bucle salientes que forman una superficie de unión al antígeno. Se reconoce generalmente que existen regiones estructurales conservadas o FRs que influyen sobre la forma plegada de los bucles de la CDR en ciertas estructuras "canónicas" - sin tener en cuenta la secuencia de aminoácidos precisa de la CDR. Además, se sabe que ciertos residuos de la FR participan en contactos interdominio no covalentes que estabilizan la interacción de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo.

Se han descrito muchas moléculas de anticuerpo "humanizadas" que comprenden un sitio de unión al antígeno derivado de una inmunoglobulina no humana, incluyendo anticuerpos quiméricos que tienen regiones V de roedor y sus CDRs asociadas fusionadas a dominios constantes de humano (Winter et al. (1991 ) Nature 349: 293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138: 4534-4538; y Brown et al. (1987) Cáncer Res. 47: 3577-3583), CDRs de roedor injertadas en una FR de soporte de humano antes de la fusión con un dominio constante de anticuerpo humano adecuado (Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239: 1534-1536; y Jones et al. (1986) Nature 321 : 522-525) y CDRs de roedor soportadas por FRs de roedor recombinantemente ocultas (véase la publicación de la patente europea No. 519,596, publicada en diciembre 23 de 1992). Estas moléculas "humanizadas" están diseñadas para reducir al mínimo la respuesta inmunológica no deseada hacia las moléculas de anticuerpo anti-humano de roedor, lo cual limita la duración y efectividad de las aplicaciones terapéuticas de esas porciones en receptores humanos.

Como se usa en la presente, los términos "FRs ocultas" y "FRs recombinantemente ocultas", se refieren al reemplazo selectivo de residuos de FR de, por ejemplo, una región V de cadena ligera o pesada de roedor, con residuos de FR de humano, para proveer una molécula xenogénica que comprende un sitio de unión al antígeno que retiene sustancialmente toda la estructura de plegamiento del polipéptido de FR nativo. Las técnicas de revestimiento se basan en el entendimiento de que las características de unión al ligando de un sitio de unión al antígeno, son determinadas principalmente por la estructura y la disposición relativa de los juegos de CDR de cadena pesada y ligera dentro de la superficie de unión al antígeno. Véase Davies et al. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59: 439-473. De esta manera, puede preservarse la especificidad de unión al antígeno en un anticuerpo humanizado sólo en donde las estructuras de CDR, su interacción entre sí y su interacción con el resto de los dominios de la región V, se mantienen cuidadosamente. Mediante el uso de técnicas de revestimiento, los residuos de FR exteriores (por ejemplo, accesibles a solventes), los cuales son encontrados fácilmente por el sistema inmune, son reemplazados selectivamente con residuos de humano para proveer una molécula híbrida que comprende una superficie oculta débilmente inmunógena o sustancialmente no inmunógena.

En otra modalidad de la invención, los anticuerpos monoclonales de la presente invención pueden ser acoplados a uno o más agentes de interés. Por ejemplo, un agente terapéutico puede ser acoplado (por ejemplo, unido covalentemente) a un anticuerpo monoclonal adecuado, ya sea directamente o indirectamente (por ejemplo, por medio de un grupo enlazador). Una reacción directa entre un agente y un anticuerpo es posible, cuando cada uno posea un sustituyente capaz de reaccionar con el otro. Por ejemplo, un grupo nucleofílico, tal como un grupo amino o sulfhidrilo, puede ser capaz de reaccionar con un grupo que contenga carbonilo, tal como un anhídrido o un halogenuro de ácido, o con un grupo alquilo que contenga un buen grupo saliente (por ejemplo, un halogenuro) en el otro.

En forma alternativa, puede ser deseable acoplar un agente terapéutico y un anticuerpo por medio de un grupo enlazador. Un grupo enlazador puede funcionar como un espaciador a distancia de un anticuerpo de un agente, para evitar la interferencia con las capacidades de unión. Un grupo enlazador puede servir también para incrementar la reactividad química de un sustituyente en un agente o un anticuerpo, e incrementar de esta manera la eficiencia del acoplamiento. Un incremento en la reactividad química puede facilitar también el uso de agentes, o grupos funcionales en agentes, lo cual de otra manera no sería posible.

Será evidente para los expertos en la técnica, que una variedad de reactivos bifuncionales o polifuncionales tanto homofuncionales como heterofuncionales (tales como aquellos descritos en el catálogo de Pierce Chemical Co., Rockford, IL) pueden usarse como el grupo enlazador. Puede efectuarse el acoplamiento, por ejemplo, a través de grupos amino, grupos carboxilo, grupos sulfhidrilo o residuos de carbohidrato oxidados. Existen numerosas referencias que describen dicha metodología, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,671 ,958, a Rodwell et al.

En donde un agente terapéutico sea más potente cuando está libre de la porción de anticuerpo de los inmunoconjugados de la presente invención, puede ser deseable usar un grupo enlazador que sea digerible durante o después de la incorporación en la célula. Se han descrito muchos grupos enlazadores digeribles diferentes. Los mecanismos para la liberación intracelular de un agente de estos grupos enlazadores, incluyen digestión por reducción de un enlace disulfuro (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,489,710, a Spitler), por irradiación de un enlace fotolábil (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,625,014, a Senter et al.), por hidrólisis de cadenas laterales de aminoácidos derivatizadas (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,638,045, a Kohn et al.), por hidrólisis mediada por el complemento del suero (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,671 ,958, a RodweII et al.), e hidrólisis catalizada por ácido (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,569,789, a Blattler et al.).

Puede ser deseable acoplar más de un agente a un anticuerpo. En una modalidad, moléculas múltiples de un agente son acopladas a una molécula de anticuerpo. En otra modalidad, más de un tipo de agente puede ser acoplado a un anticuerpo. Sin tener en cuenta la modalidad particular, pueden prepararse inmunoconjugados con más de un agente en una variedad de formas. Por ejemplo, más de un agente puede ser acoplado directamente a una molécula de anticuerpo, o pueden usarse enlazadores que provean sitios múltiples para la unión.

Trombocitopenia y métodos de uso Como se indicó anteriormente, la presente invención se refiere generalmente a métodos para tratar y/o reducir los riesgos de que se desarrolle trombocitopenia u otras condiciones asociadas con el conteo disminuido de plaquetas. La trombocitopenia se caracteriza generalmente por el conteo reducido de plaquetas, en comparación con una escala normal de conteo de plaquetas para un sujeto típico. Por ejemplo, la trombocitopenia se refiere generalmente a una disminución en el conteo de plaquetas hasta aproximadamente 100,000/mm3 o menor en comparación con un conteo normal de plaquetas. Un conteo normal de plaquetas varía generalmente de aproximadamente 150,000 mm3 a aproximadamente 450,000 mm3 en un sujeto.

La trombocitopenia no causa con frecuencia signos o síntomas, pero puede ser identificada por medio de pruebas sanguíneas de rutina. Si está presente, signos y síntomas posibles de la trombocitopenia incluyen contusión fácil y/o hemorragia excesiva. Por ejemplo, la hemorragia en la piel puede ser el primer signo de un conteo reducido de plaquetas. Muchos puntos rojos diminutos (petequias) aparecen con frecuencia en la piel en las extremidades inferiores, y lesiones menores pueden causar pequeñas contusiones esparcidas. Además, las encías pueden sangrar, y puede aparecer sangre en las heces u orina. Los períodos menstruales pueden ser inusualmente intensos. La hemorragia puede ser difícil de detener.

La hemorragia empeora típicamente conforme disminuye el número de plaquetas. Las personas que tienen muy pocas plaquetas pueden perder grandes cantidades de sangre en el tracto digestivo, o pueden desarrollar hemorragia en el cerebro que pone en riesgo su vida, aún cuando no hayan sido lesionados. La velocidad con la cual se desarrollan los síntomas puede variar, dependiendo de la causa de la trombocitopenia.

La trombocitopenia puede ser congénita, adquirida y/o iatrogénica, y puede provenir de una variedad de causas o condiciones fisiológicas subyacentes. Por ejemplo, la trombocitopenia puede resultar generalmente de la producción disminuida de plaquetas, destrucción incrementada de plaquetas, consumo de plaquetas, entrampado/secuestro de plaquetas debidos a hiperesplenismo (es decir, bazo agrandado) o hipotermia, y/o de los efectos secundarios de ciertas medicaciones (es decir, trombocitopenia inducida por medicación). Además, ocurren formas idiopáticas de trombocitopenia, especialmente en niños, formas transitorias pueden seguir a las infecciones virales (por ejemplo, mononucleosis infecciosa o de Epstein-Barr), y las mujeres embarazadas pueden desarrollar trombocitopenia leve, con frecuencia cuando están cerca del parto.

Ejemplos de condiciones congénitas asociadas con la producción disminuida (es decir, producción disminuida o defectuosa) de plaquetas, incluyen síndrome de Wiskott-Aldrich, ingestión materna de tiazidas, trombocitopenia amegacariocítica congénita, síndrome de radio ausente en trombocitopenia, anemia de Fanconi, síndrome de Bernard-Soulier, anomalía de May-Hegglin, síndrome plaquetario de Grey, síndrome de Alport y rubéola neonatal. Ejemplos de condiciones adquiridas asociadas con la producción disminuida de plaquetas, incluyen anemia aplásica, síndrome mielodisplásico, infiltración de médula (por ejemplo, leucemias agudas y crónicas, tumores, cáncer de médula ósea), linfomas, deficiencias nutricionales (por ejemplo, de B12 o ácido fólico), el uso de agentes mielosupresores, el uso de fármacos que influyen directamente sobre la producción de plaquetas (por ejemplo, tiazidas, alcohol, hormonas), exposición a radiaciones (por ejemplo, radioterapia), exposición a químicos tóxicos (por ejemplo, plaguicidas, arsénico, benceno), producción disminuida de trombopoyetina por el hígado en insuficiencia hepática, sepsis bacteriana y ciertas infecciones virales (por ejemplo, varicela, parotiditis, parvovirus, sarampión, dengue, VIH, HCV).

Ejemplos de condiciones congénitas asociadas con la destrucción incrementada de plaquetas periféricas, incluyen condiciones no inmunes, tales como premadurez, eritroblastosis fetal e infección; y condiciones inmunes, tales como sensibilidad a fármacos, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) e ITP materna. Ejemplos de condiciones adquiridas asociadas con la destrucción incrementada de plaquetas periféricas, incluyen condiciones no inmunes tales como síndrome hemolítico-urémico, coagulación ¡ntravascular diseminada, púrpura trombocitopénica trombótica (TTP); condiciones inmunes, tales como trombocitopenia inducida por fármacos (por ejemplo, especialmente con quinina y quinidina), púrpura post-transfusión, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, trombocitopenia aloinmune neonatal, hemoglobinuria nocturna paroxismal, ITP aguda y crónica, sepsis y alcohol; además del uso de líneas y dispositivos invasivos (por ejemplo, catéteres venosos centrales o arteriales), bombas de globo ¡ntraaórtico, válvulas cardiacas protésicas, así como el uso de terapias relacionadas con heparina.

La trombocitopenia inducida por medicación puede resultar en particular de ciertos fármacos, tales como agentes quimioterapéuticos, agentes antiinflamatorios no esferoidales, sulfonamidas, vancomicina, clopidogrel, inhibidores de glucoproteína llb/llla, interferones, ácido valproico, abciximab, linezolid, famotidina, mebeverina, bloqueadores de histamina, agentes alquilantes, heparina, alcohol, agentes quimioterapéuticos, antibióticos, carbapenems, ureido-penicilinas y cefazolina, entre otros conocidos en la técnica. Ejemplos particulares de agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no están limitados a, cisplatino (CDDP), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán, clorambucilo, busulfán, nitrosourea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, etopósido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de unión al receptor de estrógeno, taxol, gemcitabina, navelbina, inhibidores de farnesil-proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina y metotrexato, temozolomida (una forma acuosa de DTIC), o cualquier análogo o derivado variante de los anteriores.

La presente invención se refiere generalmente a métodos para tratar, o reducir los riesgos de que se desarrolle, trombocitopenia (es decir, conteo disminuido de plaquetas) en un sujeto, tal como en un sujeto que tiene uno o más de los ejemplos de enfermedades o condiciones provistos en la presente, entre otros conocidos en la técnica, administrando al sujeto una composición que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa truncado y/o variante, o un polipéptido modificado del mismo. Las modalidades de la presente invención abarcan métodos de tratamiento destinados no sólo para incrementar o mejorar el conteo de plaquetas en un sujeto que tiene un conteo reducido, disminuido, anormal o bajo de plaquetas, sino para mantener un conteo normal de plaquetas en un sujeto que está en riesgo de que desarrolle un conteo bajo de plaquetas. Ciertas modalidades contemplan también el uso de polipéptidos de YRS para incrementar el conteo de plaquetas en un donador de plaquetas, incluyendo un donador de otra manera sano (es decir, un donador con un conteo normal dé plaquetas), tal como administrando un polipéptido de YRS al donador antes de, durante y/o después de, la donación de plaquetas o el procedimiento de aféresis.

Por consiguiente, ciertas modalidades incluyen métodos para incrementar el conteo de plaquetas en un sujeto, que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa truncado y/o variante, o un polipéptido modificado del mismo, incrementando de esta manera el conteo de plaquetas en el sujeto. Otras modalidades incluyen métodos para mantener un conteo normal de plaquetas en el sujeto, que comprenden administrar al sujeto una composición que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa truncado y/o variante, tal como en donde el sujeto está en riesgo de que desarrolle un bajo conteo de plaquetas. Ciertas modalidades pueden incluir métodos para estimular la trombopoyesis en un sujeto, tal como administrando al sujeto una composición que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa truncado y/o variante. En ciertos aspectos, el sujeto tiene un conteo reducido, disminuido o anormal de plaquetas, tal como un conteo de plaquetas de aproximadamente 100,000/mm3 o menos. En ciertos aspectos, los polipéptidos de YRS provistos en la presente pueden usarse para estimular la proliferación y/o diferenciación de megacariocitos y/o neutrófilos en un sujeto.

Un sujeto que tiene un conteo reducido de plaquetas puede estar también en riesgo de que desarrolle otros problemas asociados con la trombocitopenia, tales como sangrado o contusión, hemorragia, sangrado gastrointestinal, epistaxis (es decir, hemorragias de la nariz) o hemorragia intracraneal (es decir, hemorragia en el cerebro). Como un ejemplo particular, los pacientes sépticos con trombocitopenia tienen sangrado incrementado. Por consiguiente, ciertos aspectos de la invención pueden usar las composiciones trombopoyéticas provistas en la presente para reducir el riesgo de que se desarrollen estos tipos de problemas asociados con trombocitopenia, entre otros. En otros aspectos, el sujeto puede estar en riesgo de que desarrolle un conteo reducido, disminuido o de otra manera anormal de plaquetas, tal como de una condición adquirida asociada con niveles disminuidos de plaquetas (por ejemplo, ciertas terapias médicas, leucemias, entre otros).

En ciertos aspectos, los métodos de tratamiento descritos en la presente pueden usarse independientemente de otras modalidades terapéuticas, y pueden ser la única modalidad o la modalidad terapéutica primaria de la que depende manejar una condición trombocitopénica, y/o reducir de otra manera el riesgo no sólo de que se desarrolle trombocitopenia, sino de que se desarrollen otros problemas médicos asociados con la misma, tales como hemorragia. Por ejemplo, un sujeto que tiene trombocitopenia para la cual no existe causa subyacente conocida (por ejemplo, púrpura trombocitopénica idiopática), puede beneficiarse de los métodos de tratamiento provistos en la presente para incrementar y/o manejar los niveles de plaquetas.

En ciertos aspectos, los métodos y composiciones de la presente invención pueden usarse como parte de una terapia de combinación, tal como por la administración con otros agentes que puedan estimular las vías trombopoyéticas y/o hematopoyéticas en un sujeto. Ejemplos de otros agentes que pueden usarse como parte de una terapia de combinación, incluyen trombopoyetina, citocinas (por ejemplo, IL-11), quimiocinas y/o factores de crecimiento implicados en la trombopoyesis o hematopoyesis, incluyendo fragmentos o variantes biológicamente activos de los mismos.

En ciertos aspectos, los métodos de la presente invención pueden usarse en conjunto con otras modalidades terapéuticas, tales como aquellas implicadas en el tratamiento de la condición subyacente que causa la condición asociada con la trombocitopenia. Por ejemplo, un sujeto que tiene trombocitopenia amegacariocítica congénita (CAMT) puede sufrir finalmente un procedimiento de trasplante de médula ósea, pero puede beneficiarse también de un tratamiento separado, como se provee en la presente, para aumentar los niveles de plaquetas y/o mantener los niveles de plaquetas dentro de una escala normal. Los polipéptidos trombopoyéticos de la presente invención pueden usarse a este respecto y respectos similares. \ En ciertos aspectos, los métodos provistos en la presente pueden usarse en combinación con un sujeto que sufre otros tratamientos médicos, tales como tratamientos que causan trombocitopenia o incrementan el riesgo de que se desarrolle trombocitopenia. Por ejemplo, los métodos provistos en la presente pueden usarse con un sujeto que sufre, un sujeto que está cerca de sufrir y un sujeto que ha sufrido, radioterapia, quimioterapia u otro tipo de tratamiento, incluyendo varios tipos de tratamientos farmacéuticos, como se describe en la presente y se sabe en la técnica, puesto que dichos tratamientos se sabe que reducen el conteo de plaquetas en un sujeto. Por consiguiente, los métodos provistos en la presente pueden usarse antes, durante y/o después de otros tratamientos médicos, para reducir el riesgo de que se desarrolle trombocitopenia que resulta de dichos tratamientos, y/o para manejar o mejorar la trombocitopenia que resulta de dichos tratamientos.

En ciertas modalidades, los métodos provistos en la presente pueden usarse para tratar o manejar profilácticamente los síntomas trombocitopénicos asociados con dichas condiciones particulares, como se describe en la presente y como se sabe en la técnica.

Estimulación de células progenitoras de meqacariocitos, y métodos de uso Los polipéptidos de YRS de la presente invención pueden usarse también para estimular el crecimiento de células progenitoras de megacariocitos, incluyendo células progenitoras tempranas, es decir, los progenitores de linaje restringido más primitivos del linaje de megacariocitos. Incluidos son métodos para estimular la proliferación de células progenitoras de megacariocitos tempranas, que comprenden incubar un cultivo de células madre hematopoyéticas con un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, por un tiempo suficiente para permitir la proliferación de las células progenitoras de megacariocitos tempranas, estimulando de esta manera la proliferación de las células progenitoras de megacariocitos tempranas. En estas modalidades y en modalidades relacionadas, los polipéptidos de YRS de la invención pueden incubarse con HSCs purificadas, HSCs parcialmente purificadas, cultivos de médula ósea entera (por ejemplo, para trasplantes de médula ósea), sangre del cordón umbilical, u otros tipos de cultivos usados en terapias con injertos hematopoyéticos. Dichos métodos pueden resultar en un cultivo que es enriquecido para células progenitoras de megacariocitos tempranas. Los polipéptidos de YRS de la invención pueden administrarse también directamente a un sujeto (in vivo), para estimular la proliferación de células progenitoras de megacariocitos tempranas en ese sujeto.

El término "células madre hematopoyéticas (HSCs)" se refiere generalmente a "células madre" pluripotentes o multipotentes que dan lugar a los tipos de células sanguíneas, incluyendo los linajes mieloide (por ejemplo, monocitos y macrófagos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, eritrocitos, megacariocitos/plaquetas, células dendríticas) y linfoide (por ejemplo, células T, células B, células NK), y otros conocidos en la técnica. Las "células madre", son definidas típicamente por su capacidad para formar tipos de células múltiples (es decir, multipotencia), y su capacidad para auto-renovarse. Sin embargo, en ciertas modalidades, pueden incluirse progenitores oligopotentes y unipotentes. El término "hematopoyesis" se refiere generalmente al proceso de diferenciación celular o formación de células sanguíneas especializadas particulares de una HSC.

Pueden obtenerse HSCs de acuerdo con técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, pueden encontrarse HSCs en la médula ósea de adultos, que incluye fémures, cadera, costillas, esternón y otros huesos. Pueden obtenerse HSCs directamente por remoción de la cadera, usando una aguja y jeringa, o de la sangre, con frecuencia después del p re-tratamiento con citocinas, tales como el G-CSF (factor estimulador de colonias de granulocitos), que induce a las células para que sean liberadas del compartimiento de la médula ósea. Otras fuentes para uso clínico y científico incluyen sangre del cordón umbilical, placenta y sangre periférica movilizada.

Para propósitos experimentales, hígado fetal, bazo fetal y AGM (aorta-gónada-mesonefros) de animales, son también fuentes útiles de HSCs.

Pueden identificarse HSCs de acuerdo con ciertos marcadores fenotípicos o genotípicos. Por ejemplo, pueden identificarse HSCs por su pequeño tamaño, falta de marcadores de linaje (lin), poca tinción (población secundaria) con colorantes vitales tales como rodamina 123 (rodaminaDULL, llamada también rho10) o Hoechst 33342, y presencia de varios marcadores antigénicos sobre su superficie, muchos de los cuales pertenecen al grupo de la serie de diferenciación (por ejemplo, CD34, CD38, CD90, CD133, CD105, CD45 y c-kit, el receptor para el factor de células madre). Las HSCs son principalmente negativas para los marcadores que se usan típicamente para detectar el compromiso del linaje y, de esta manera, son referidas con frecuencia como células lin(-). La mayoría de las HSCs humanas pueden caracterizarse como CD34+, CD59\ Thy1/CD90+,CD38,o ", C-kit/CD117+ y lin(-). Sin embargo, no todas las células madre son abarcadas por estas combinaciones, ya que ciertas HSCs son CD347CD38". Asimismo, algunos estudios sugieren que las células madre más tempranas pueden carecer de c-kit sobre la superficie de la célula. Para las HSCs humanas, CD133 puede representar un marcador temprano, ya que se ha mostrado que las HSCs CD34+ y CD34' son CD133+.

Para la purificación de HSCs lin(-) por citometría de flujo, o FACS, puede usarse una disposición de anticuerpos marcadores de linaje de sangre madura para agotar las células lin(+) o progenitores multipotentes tardíos (MPP) incluyendo, por ejemplo, anticuerpos para CD13 y CD33 para células mieloides humanas, CD71 para células eritroides humanas, CD19 para células B humanas, CD61 para células megacariocíticas humanas, Mac-1 (CD11 b/CD18) para monocitos, Gr-1 para granulocitos, H 7Ra, CD3, CD4, CD5 y CD8 para células T, entre otros conocidos en la técnica. Otros métodos de purificación se conocen en la técnica, tales como aquellos métodos que usan la identificación particular de la familia de "moléculas de señalización de la activación de linfocitos" (SLAM) de moléculas de superficie de la célula.

Las HSCs, ya sea que se obtengan de, o estén presentes en, sangre del cordón umbilical, médula ósea, sangre periférica u otra fuente, pueden cultivarse o expandirse en cualquier medio definido adecuado de costumbre o disponible comercialmente, con o sin suero, según se desee (véase, por ejemplo, Hartshorn et al., Cell Technology for Cell Products, págs. 221-224, R. Smith, editor; Springer, Los Países Bajos, 2007, cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia). Por ejemplo, en ciertas modalidades, el medio libre de suero puede usar albúmina y/o transferrina, las cuales se ha mostrado son útiles para el crecimiento y la expansión de células CD34+ en medio libre de suero. Asimismo, pueden incluirse citocinas, tales como el ligando Flt-3, el factor de células madre (SCF) y trombopoyetina (TPO), entre otros. Las HSCs pueden cultivarse también en recipientes tales como biorreactores (véase, por ejemplo, Liu et al., Journal of Biotechnology 124: 592-601 , 2006, cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia). Un medio adecuado para la expansión ex vivo de HSCs, puede comprender también células que soportan HSCs, tales como células estromáticas (por ejemplo, células estromáticas linforreticulares), las cuales pueden derivarse, por ejemplo, de la desagregación de tejido linfoide, y las cuales se ha mostrado soportan el mantenimiento, crecimiento y diferenciación in vitro, ex vivo e in vivo de HSCs, así como su progenie.

El crecimiento o la expansión de las HSCs pueden medirse in vitro o in vivo, de acuerdo con técnicas de rutina conocidas en la materia. Por ejemplo, el documento WO 2008/073748, incorporado en la presente como referencia para estos métodos, describe métodos para medir la expansión de HSCs in vivo e in vitro, y para distinguir entre el crecimiento/expansión de HSCs y el crecimiento/expansión de otras células en una población potencialmente heterogénea (por ejemplo, médula ósea), tales como células progenitoras intermedias. El paso de administración o incubación, que resulta en el crecimiento o la expansión puede ocurrir in vivo, ex vivo o in vitro, aunque en ciertas modalidades, la administración o incubación ocurre durante el tratamiento ex vivo de las HSCs.

El crecimiento o la proliferación de células progenitoras de megacariocitos (por ejemplo, tempranas, intermedias, tardías, etc.), puede medirse también de acuerdo con técnicas de rutina conocidas en la materia, y como se describe en la presente (véase, por ejemplo, el ejemplo 10). Por ejemplo, entre otras características, los progenitores de megacariocitos tempranos pueden identificarse por inmunotinción como Lin" c-Kit+CD41+, y los progenitores de megacariocitos de etapa posterior pueden identificarse como Lin' c-K¡t" CD41+ (véase, por ejemplo, Pérez et al., PLoS ONE. 3: c3565, 2008; y Lefebvre et al., Journal of Hematotherapy & Stem Cell Research. 9: 913-92 , 2000, citas que se incorporan en su totalidad en la presente como referencia).

El término "sangre del cordón" o "sangre del cordón umbilical" se refiere generalmente a la cantidad relativamente pequeña de sangre (hasta aproximadamente 180 ml_) de un bebé recién nacido, que regresa a la circulación neonatal si el cordón umbilical no es sujetado prematuramente. La sangre del cordón es rica en HSCs, y puede cosecharse y almacenarse para uso posterior de acuerdo con técnicas conocidas en la materia (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 7,147,626 y 7,131 ,958, las cuales se incorporan en la presente como referencia por dichas metodologías). Asimismo, si el cordón umbilical no es sujetado finalmente, ocurre una sujeción fisiológica tras la interacción con el aire frío, en donde la sustancia gelatinosa interna, denominada jalea de Wharton, se hincha alrededor de las arterias y venas umbilicales. Sin embargo, la jalea de Wharton puede servir aún como una fuente de HSCs.

Como se indicó anteriormente, el término "ex vivo" se refiere generalmente a actividades que ocurren fuera de un organismo, tales como experimentación o mediciones hechas en o sobre tejido vivo en un ambiente artificial fuera del organismo, de preferencia con alteración mínima de las condiciones naturales. Más comúnmente, los procedimientos "ex vivo" implican células o tejidos vivos tomados de un organismo y cultivados en un aparato de laboratorio, usualmente bajo condiciones estériles, y típicamente por unas cuantas horas o hasta aproximadamente 24 horas, pero incluyendo hasta 48 ó 72 horas, dependiendo de las circunstancias. En ciertas modalidades, dichos tejidos o células pueden colectarse y congelarse, y descongelarse después, para tratamiento ex vivo. Se considera típicamente que los procedimientos o experimentos de cultivo de tejidos que tardan más de unos cuantos días usando células o tejido vivo están "in vitro", aunque en ciertas modalidades, este término puede usarse recíprocamente con ex vivo.

Los términos "administración ex vivo", "tratamiento ex vivo" o "uso terapéutico ex vivo", se refieren generalmente a procedimientos médicos en los cuales uno o más órganos, células o tejidos se obtienen de un sujeto vivo o recién fallecido, son opcionalmente purificados/enriquecidos, expuestos a un tratamiento o procedimiento para expandir las células madre (por ejemplo, un paso de administración ex vivo que implica incubar las células con una composición de la presente invención para aumentar la expansión de las células deseables, tales como HSCs o progenitores de megacariocitos), y administrados entonces al mismo sujeto o a un sujeto vivo diferente, después de ese tratamiento o procedimiento opcional. Como un ejemplo, puede aliviarse la trombocitopenia por la infusión de células progenitoras de megacariocitos (véase, por ejemplo, De Bruyn eí al., Stem Cells Dev. 14: 415-24, 2005, cita incorporada en la presente como referencia).

Dichas aplicaciones terapéuticas ex vivo pueden incluir también un paso de procedimiento o tratamiento in vivo opcional, tal como administrar un polipéptido de YRS de la invención una o más veces al sujeto vivo antes de, durante o después de, la administración del órgano, las células o el tejido. Se contemplan las administraciones local y sistémica para estas modalidades, de acuerdo con técnicas bien conocidas en la materia. La cantidad de polipéptido de YRS administrado a un sujeto, dependerá de las características de ese sujeto, tales como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia a fármacos, así como el grado, la severidad y el tipo de reacción al polipéptido y/o al trasplante de células.

Estimulación de células que expresan CXCR-2 Ciertas modalidades se refieren al descubrimiento de que los polipéptidos de YRS son capaces de estimular la migración de células que expresan CXCR-2. CXCR-2 es un miembro de la familia de receptores de quimiocinas CXC, expresado en una amplia variedad de tipos de células, que incluyen neutrófilos y otras células inmunes. Los receptores de quimiocinas CXC son proteínas de membrana integrales que se unen específicamente y responden, a citocinas de la familia de quimiocinas CXC. Estos receptores basados en CXC representan una subfamilia de receptores de quimiocinas, una gran familia de receptores enlazados a proteína G, referidos también como siete receptores de transmembrana. Existen actualmente siete receptores de quimiocinas CXC conocidos en mamíferos, nombrados como CXCR1 a CXCR7. CXCR-2 (y CXCR-1 altamente relacionado) es un receptor bien conocido que reconoce las quimiocinas C-X-C que poseen un motivo de aminoácido E-L-R inmediatamente adyacente a su motivo C-X-C. CXCL8 (es decir, interleucina-8) y CXCL6 pueden unirse a CXCR1 en humanos, mientras que las demás quimiocinas positivas para el motivo ELR, tales como CXCL1 a CXCL7, se unen sólo a CXCR2 (véase, por ejemplo, Tsai et al., Cell 1 10: 373-383, 2002; y Pelus et al., Exp Hematol. 34: 1010-20, 2006, cada una de las cuales se incorpora en su totalidad en la presente como referencia). Como se indicó anteriormente, CXCR-2 es expresado sobre la superficie de los neutrófilos, y puede desempeñar una función en la migración de los mismos (véase, por ejemplo, Ríos-Santos et al., American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 175: 490-497, 2007, cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia).

Por consiguiente, dada la función de CXCR-2 en la migración celular y señalización celular (por ejemplo, señalización/migración de neutrófilos), entre otras vías biológicamente relevantes, ciertas modalidades incluyen métodos para estimular la migración de una célula que expresa CXCR2, que comprenden poner en contacto la célula con un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, estimulando de esta manera la migración de las células que expresan CXCR-2.

Enfermedades pulmonares y métodos de uso Las modalidades de la presente invención se refieren también al descubrimiento inesperado de que los polipéptidos de YRS pueden proveer beneficios en el tratamiento de enfermedades pulmonares, tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). A este respecto, la migración de neutrófilos del sistema circulatorio hacia los pulmones está implicada en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (véase, por ejemplo, R. A. Stockley, Chest 121 : 151 S-155S, 2002, cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia). Como se indicó anteriormente, CXCR-2 es expresado sobre la superficie de los neutrófilos, y puede desempeñar una función en la migración de los mismos (véase, por ejemplo, Ríos-Santos et al., American Journal of Respiratory and Critica! Care Medicine 175: 490-497, 2007, cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia). Puesto que la señalización de CXCR-2 en neutrófilos está implicada en su migración hacia ciertos tejidos, tales como los pulmones, especialmente en respuesta a materia extraña, tales como irritantes, bacterias, lipopolisacárido (LPS), etc., puede estar implicada de esta manera en varias condiciones patológicas, tales como EPOC.

Dadas las observaciones de que los polipéptidos de YRS de la invención afectan la señalización de CXCR-2 y la migración de células polimorfonucleares (PMN) (véase, por ejemplo, los ejemplos 7 y 8), se cree que estos polipéptidos pueden ser útiles en el tratamiento o manejo de enfermedades pulmonares, tales como EPOC. Por ejemplo, sin que se desee que sea limitado por teoría alguna, los polipéptidos de YRS pueden usarse para desensibilizar los neutrófilos circulatorios a varios irritantes o alérgenos, reduciendo de esta manera la migración de estas células inmunes hacia los pulmones (véase, por ejemplo, el ejemplo 9). Por consiguiente, ciertas modalidades se refieren a métodos para tratar o manejar (por ejemplo, reducir las complicaciones de) inflamación pulmonar y/o enfermedades pulmonares, tales como EPOC, que comprenden administrar a un sujeto con inflamación pulmonar o EPOC, una concentración efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, reduciendo de esta manera la EPOC y/o sus síntomas, en el sujeto. Con frecuencia, en la desensibilización de las células inmunes, se requieren administraciones múltiples (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, etc.), típicamente a una frecuencia definida (número de administraciones por día, por semana, por mes, etc.).

El término EPOC se refiere generalmente a un grupo de enfermedades pulmonares que bloquean el flujo de aire y hacen que cada vez sea más difícil para los individuos afectados que respiren normalmente. Enfisema y bronquitis crónica son las dos condiciones principales dentro del grupo de la EPOC, pero la EPOC puede referirse también al daño causado por la bronquitis asmática crónica, entre otras condiciones conocidas en la técnica. En todos los casos, el daño a las vías respiratorias interfiere finalmente con el intercambio de oxígeno y dióxido de carbono en los pulmones. El tratamiento se enfoca principalmente en el control de síntomas y en la reducción al mínimo de más daño.

El enfisema representa un aspecto de la EPOC. El enfisema lleva a inflamación dentro de las paredes frágiles de los alvéolos, lo cual puede destruir algunas de las paredes y fibras elásticas, permitiendo que las vías respiratorias pequeñas se colapsen tras la exhalación, y deteriorando el flujo de aire desde los pulmones. Los signos y síntomas del enfisema incluyen, por ejemplo, brevedad de la respiración, especialmente durante las actividades físicas, jadeo y estrechez del tórax.

La bronquitis crónica representa otro aspecto de la EPOC. La bronquitis crónica se caracteriza por una tos progresiva, y lleva a inflamación y estrechamiento de los tubos bronquiales. Esta condición causa también producción incrementada de moco, lo cual puede bloquear adicionalmente los tubos estrechados. La bronquitis crónica ocurre principalmente en los fumadores, y se define típicamente como una tos que dura por cuando menos tres meses a un año por dos años consecutivos. Los signos y síntomas de la bronquitis crónica incluyen, por ejemplo, tener que despejar la garganta en primera instancia en la mañana, especialmente para los fumadores, una tos crónica que produce esputo amarillento, brevedad de la respiración en las etapas posteriores, e infecciones respiratorias frecuentes.

Como se indicó anteriormente, la EPOC se refiere principalmente a obstrucción en los pulmones que resulta de las dos condiciones pulmonares crónicas indicadas anteriormente. Sin embargo, muchos individuos con EPOC tienen ambas condiciones.

La bronquitis asmática crónica representa otro aspecto de la EPOC. La bronquitis asmática crónica se caracteriza usualmente como bronquitis crónica combinada con asma (broncoespasmo). Puede ocurrir asma cuando las secreciones inflamadas e infectadas irritan los músculos lisos en las vías respiratorias. Los síntomas son similares a los de la bronquitis crónica, pero incluyen también episodios intermitentes, o incluso diarios, de jadeo.

Principalmente, la EPOC es causada finalmente por el humo del cigarro y otros irritantes. En la vasta mayoría de los casos, el daño al pulmón que lleva a la EPOC es causado por el fumar cigarros a largo plazo. Sin embargo, otros irritantes pueden causar EPOC, incluyendo el humo del cigarro, humo derivado, humo de pipa, contaminación atmosférica y ciertos humos industriales. La enfermedad de reflujo gastroesofágico (GERD), que ocurre cuando los ácidos del estómago retroceden en el esófago, no sólo puede agravar la EPOC, sino puede causarla incluso en algunos individuos. En casos raros, la EPOC resulta de un trastorno genético que causa bajos niveles de una proteína denominada alfa-1 -antitripsina. Por consiguiente, los factores de riesgo para la EPOC incluyen exposición al humo del tabaco, exposición a polvos y químicos industriales (exposición a largo plazo a humos químicos, vapores y polvos que irritan e inflaman los pulmones), enfermedad de reflujo gastroesofágico (una forma severa de reflujo de ácido - el retroceso de ácido y otro contenido del estómago en el esófago), edad (la EPOC se desarrolla lentamente con los años, de modo que la mayoría de las personas tienen por lo menos 40 años de edad cuando comienzan los síntomas) y genética (un trastorno genético raro conocido como deficiencia de alfa-1 -antitripsina, es la fuente de unos pocos casos de EPOC).

Las complicaciones de la EPOC pueden incluir infecciones respiratorias, alta presión sanguínea, problemas cardiacos (por ejemplo, ataques al corazón), cáncer pulmonar (los fumadores con bronquitis crónica están en un mayor riesgo de que desarrollen cáncer pulmonar, que los fumadores que no tienen bronquitis crónica) y depresión, entre otras conocidas en la técnica.

Los sujetos con EPOC pueden identificarse de acuerdo con técnicas de diagnóstico de rutina conocidas en la materia. Por ejemplo, pruebas de la función pulmonar tales como la espirometría, miden qué tanto aire pueden retener los pulmones, y qué tan rápido un individuo puede expeler el aire de sus pulmones. La espirometría puede detectar la EPOC antes de la aparición de los síntomas, y puede usarse también para rastrear la progresión de la enfermedad y monitorear el tratamiento. Además, los rayos X de tórax muestran el enfisema, una de las causas principales de la EPOC, y pueden descartar también otros problemas pulmonares o insuficiencia cardiaca. Además, el análisis de los gases de la sangre arterial mide qué tan efectivamente los pulmones llevan el oxígeno en la sangre y remueven el dióxido de carbono, proveyendo una indicación de la EPOC. El examen del esputo, es decir, el análisis de las células en el esputo, puede identificar la causa de ciertos problemas pulmonares y ayudar a descartar ciertos cánceres pulmonares. Asimismo, la exploración por tomografía computada (CT) produce imágenes altamente detalladas de los órganos internos, lo cual puede ayudar a detectar el enfisema y, de esta manera, la EPOC.

Como en otra parte en la presente, la cantidad de polipéptido de YRS administrado a un sujeto con EPOC (o que está en riesgo de EPOC) dependerá de las características de ese sujeto, tales como salud general, edad, sexo, peso corporal y tolerancia a fármacos, así como el grado, la severidad y el tipo de reacción al polipéptido.

Formulaciones y composiciones farmacéuticas Las composiciones de la invención comprenden polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa, incluyendo truncamientos y/o variantes de los mismos, formulados en soluciones farmacéuticamente aceptables o fisiológicamente aceptables para administración a una célula o un animal, ya sea sólo, o en combinación con una o más de otras modalidades de terapia. Se entenderá también que, si se desea, las composiciones de la invención pueden administrarse también en combinación con otros agentes tales como, por ejemplo, otras proteínas o polipéptidos de varios agentes farmacéuticamente activos. No existe virtualmente límite a otros componentes que pueden incluirse también en las composiciones, siempre que los agentes adicionales no afecten adversamente los efectos trombopoyéticos o de otro tipo que se desean alcanzar.

En las composiciones farmacéuticas de la invención, la formulación de excipientes y soluciones de vehículo farmacéuticamente aceptables es bien conocida por los expertos en la técnica, como lo es el desarrollo de regímenes de tratamiento y dosificación adecuados para el uso de las composiciones particulares descritas en la presente en una variedad de regímenes de tratamiento que incluyen, por ejemplo, administración y formulación oral, parenteral, intravenosa, intranasal e intramuscular.

En ciertas aplicaciones, las composiciones farmacéuticas descritas en la presente pueden suministrarse por medio de administración oral a un sujeto. Como tales, estas composiciones pueden formularse con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable, o pueden ser incluidas en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, o pueden ser comprimidas en tabletas, o pueden ser incorporadas directamente con el alimento de la dieta.

En ciertas circunstancias, será deseable suministrar las composiciones farmacéuticas descritas en la presente parenteralmente, intravenosamente, intramuscularmente, o incluso intraperitonealmente como se describe, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,543,158; patente de E.U.A. No. 5,641 ,515 y patente de E.U.A. No. 5,399,363 (cada una incorporada específicamente en su totalidad en la presente como referencia). Pueden prepararse soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables en agua adecuadamente mezcladas con un agente tensoactivo, tal como hidroxipropilcelulosa. Pueden prepararse también dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservador que previene el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de dispersiones o soluciones inyectables estériles (véase la patente de E.U.A. No. 5,466,468, incorporada específicamente en su totalidad en la presente como referencia). En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida al grado de que exista fácil aplicación con jeringa. Debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento, y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos, y/o aceites vegetales. Puede mantenerse una fluidez adecuada, por ejemplo, por el uso de un recubrimiento, tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensoactivos. La prevención de la acción de los microorganismos puede ser facilitada por varios agentes antibacterianos y antimicóticos tales como, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede producirse por el uso, en las composiciones, de agentes que retarden la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Para administración parenteral en una solución acuosa, por ejemplo, la solución debe ser regulada en su pH convenientemente si es necesario, y debe hacerse primero que el diluyente líquido sea isotónico con suficiente solución salina o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares son especialmente adecuadas para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. A este respecto, un medio acuoso estéril que puede usarse será conocido por los expertos en la técnica a la luz de la presente descripción. Por ejemplo, una dosificación puede disolverse en 1 mi de solución isotónica de NaCI, y puede añadirse a 1000 mi de fluido de hipodermoclisis o puede inyectarse en el sitio de infusión propuesto (véase, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences, decimoquinta edición, pp. 1035-1038 y 1570-1580). Cierta variación en la dosificación ocurrirá necesariamente, dependiendo de la condición del sujeto que está siendo tratado. El experto responsable de la administración determinará, en cualquier caso, la dosis adecuada para el sujeto individual. Además, para administración en humanos, las preparaciones deben satisfacer la esterilidad, pirogenicidad y los estándares generales de seguridad y pureza que son requeridos por los estándares de la FDA Office of Biologics.

Pueden prepararse soluciones inyectables estériles, incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el solvente adecuado con los varios otros ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones incorporando los varios ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos, de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son técnicas de liofilización y secado al vacío, lo cual da un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril de la misma.

Las composiciones descritas en la presente pueden formularse en una forma de sal o forma neutra. Sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales ácidas de adición (formadas con los grupos amino libres de la proteína), y las cuales se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, los ácidos clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico, y similares. Sales formadas con los grupos carboxilo libres pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína, y similares. Tras la formulación, las soluciones se administrarán en una manera compatible con la formulación de dosificación y en una cantidad tal que sea terapéuticamente efectiva. Las formulaciones se administran fácilmente en una variedad de formas de dosificación tales como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco, y similares.

Como se usa en la presente, el término "vehículo" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, vehículos, recubrimientos, diluyentes, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y que retardan la absorción, reguladores de pH, soluciones de vehículo, suspensiones, coloides, y similares. El uso de dichos medios y agentes para sustancias activas farmacéuticas, es bien conocido en la técnica. Salvo mientras algún medio o agente convencional sea incompatible con el ingrediente activo, se contempla su uso en las composiciones terapéuticas. Pueden incorporarse también ingredientes activos complementarios en las composiciones.

La frase "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares y composiciones que no producen una reacción adversa similar o alérgica cuando se administran a un humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como un ingrediente activo, está bien entendida en la técnica. Típicamente, dichas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas; pueden prepararse también formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en, líquido antes de la inyección. La preparación puede ser también emulsificada.

En ciertas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden suministrarse por rocíos intranasales, inhalación y/u otros vehículos de suministro en aerosol. Se han descrito métodos para suministrar composiciones de genes, polinucleótidos y péptidos directamente hacia los pulmones por medio de rocíos nasales en aerosol, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,756,353 y la patente de E.U.A. No. 5,804,212 (cada una incorporada específicamente en su totalidad en la presente como referencia).

Asimismo, el suministro de fármacos usando resinas de micropartículas ¡ntranasales (Takenaga et ai, 1998) y compuestos de lisofosfatidil-glicerol (patente de E.U.A. No. 5,725,871 , incorporada específicamente en su totalidad en la presente como referencia), es también bien conocido en las técnicas farmacéuticas. Asimismo, el suministro transmucoso de fármacos en la forma de una matriz de soporte de politetrafluoroetileno se describe en la patente de E.U.A. No. 5,780,045 (incorporada específicamente en su totalidad en la presente como referencia).

En ciertas modalidades, el suministro puede ocurrir por el uso de liposomas, nanocápsulas, micropartículas, microesferas, partículas de lípido, vesículas, y similares, para la introducción de las composiciones de la presente invención en células hospederas adecuadas. En particular, las composiciones de la presente invención pueden formularse para suministro ya sea encapsuladas en una partícula de lípido, un liposoma, una vesícula, una nanoesfera, una nanopartícula, y similares. La formulación y el uso de dichos vehículos de suministro pueden llevarse a cabo usando técnicas conocidas y convencionales.

Todas las publicaciones, solicitudes de patente y patentes expedidas citadas en esta especificación, se incorporan en la presente como referencia como si se indicara que cada publicación, solicitud de patente o patente expedida individual fuese específicamente e individualmente incorporada en la presente como referencia.

Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle por medio de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad y entendimiento, será fácilmente evidente para los expertos en la técnica a la luz de las enseñanzas de esta invención, que pueden hacerse ciertos cambios y modificaciones a la misma sin que se aparten del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas. Los siguientes ejemplos se proveen sólo por medio de ilustración y no a manera de limitación. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no críticos que podrían ser cambiados o modificados para dar resultados esencialmente similares.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Estimulación de la trombopovesis in vivo Se midieron in vivo los efectos de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa sobre la trombopoyesis. El polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa usado en los experimentos descritos a continuación, es un truncamiento C-terminal que comprende los aminoácidos 1 a 364 de la tirosil-ARNt humana de longitud completa. Este polipéptido C-terminalmente truncado, fue fusionado a un marcador C-terminal de ocho aminoácidos (365-L-E-H-H-H-H-H-H-372) (SEQ ID NO: 5). La secuencia de aminoácidos de la tirosil-ARNt sintetasa humana de longitud completa se expone en SEQ ID NO: 1.

Para medir los efectos de los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa sobre la trombopoyesis, en una primera serie de experimentos, se inyectó subcutáneamente a ratones dos veces al día por siete días con 3 pg/kg del polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa C-terminalmente truncado. En una segunda serie de experimentos, se inyectó a ratones dos veces al día por siete días con 1 , 3 y 10 pg/kg del polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa C-terminalmente truncado. En una tercera serie de experimentos, se inyectó subcutáneamente a ratones dos veces al día por seis días con (i) 3 y 300 pg/kg del polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa C-terminalmente truncado, y una inyección diaria individual de (ii) 90 pg/kg de trombopoyetina (TPO), y (iii) 250 pg/kg de G-CSF.

Para la primera y segunda serie de experimentos descritos anteriormente, el conteo de plaquetas para cada animal se determinó tras concluir el protocolo de administración. Para la tercera serie de experimentos, se examinó la histología del bazo y la médula ósea al final del protocolo de administración.

La administración de una tirosil-ARNt sintetasa truncada por aproximadamente una semana mostró un incremento in vivo reproducible en la actividad trombopoyética, según se midió por el conteo incrementado de plaquetas o el número incrementado de megacariocitos. La figura 5A muestra el conteo de plaquetas para el experimento en el cual se inyectó a ratones con 1 , 3 y 10 pg/kg del polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa truncado, en comparación con un control de solución salina regulada en su pH con fosfato (PBS). La figura 5B muestra el conteo de plaquetas para el experimento en el cual se inyectó a ratones con 3 pg/kg del polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa truncado, en comparación con un control de PBS. En ambos experimentos, los ratones mostraron un incremento en el conteo de plaquetas sobre el control en respuesta al tratamiento con un polipéptido de tirosil-ARNt de la invención. La figura 6 muestra un incremento en el número de megacariocitos en respuesta a la administración del polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa truncado, en comparación con animales no tratados, lo cual es comparable al número incrementado observado después de la administración con TPO. Estos resultados muestran que los fragmentos del polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, y en particular los fragmentos C-terminalmente truncados, son capaces de estimular la trombopoyesis in vivo.

EJEMPLO 2 Mediciones de la trombopoyesis in vitro Los efectos sobre la trombopoyesis pueden medirse también in vitro. Se tratan células madre in vitro con un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa de la invención, para determinar su efecto sobre los progenitores hematopoyéticos de los linajes eritroide, mieloide y megacariocítico usando pruebas de células que forman colonias (CFC) (por ejemplo, inhibición, estimulación, toxicidad, sinergia con otras citocinas, defectos hematopoyéticos). Además, se tratan células progenitoras de megacariocitos CD34+ in vitro con un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa de la invención, para monitorear la expansión y diferenciación de los megacariocitos (por ejemplo, incremento en el número de células progenitoras, estimulación de diferenciación, incremento en poliploidía). Se llevan a cabo experimentos similares usando células de bazo y médula ósea derivadas de ratones tratados con un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa.

EJEMPLO 3 La terapia de combinación estimula la trombopovesis Para evaluar si un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa de la presente invención tiene un efecto sinérgico y/o aditivo sobre la proliferación y diferenciación de megacariocitos in vitro, se cultivan células CD34+ de la sangre de cordón umbilical en medio de cultivo líquido en presencia de formulaciones óptimas o subóptimas de citocinas (StemCell Technologies, Vancouver), tales como IL-1 1 , y se tratan con concentraciones crecientes de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa. La actividad o sinergia puede determinarse monitoreando el crecimiento y la diferenciación de las células progenitoras en las dos condiciones de formulación.

Asimismo, en un protocolo comparable al descrito en el ejemplo 1 , se inyecta a ratones con una cantidad limitativa de trombopoyetina y con cantidades crecientes de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, y pueden determinarse los efectos de la terapia de combinación sobre la trombopoyesis in vivo, por el conteo de plaquetas y megacariocitos. Además, puede evaluarse la terapia de combinación con cantidades limitadas de otras citocinas, quimiocinas y/o factores de crecimiento implicados en la hematopoyesis, usando el mismo tipo de régimen.

EJEMPLO 4 Actividad trombopovética de los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa en ratas Se midieron en ratas los efectos de dos polipéptidos de tirosil- ARNt sintetasa sobre la trombopoyesis. Los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa usados en los experimentos descritos a continuación, son: i) un truncamiento C-terminal que comprende los aminoácidos 1 a 364 de la tirosil-ARNt humana de longitud completa (SEQ ID NO: 3) fusionada a un marcador de histidina C-terminal de ocho aminoácidos (SEQ ID NO: 5), y ii) un mutante de la tirosil-ARNt sintetasa humana de longitud completa con una sola sustitución de aminoácido de tirosina a alanina en la posición 341 , referida como ?341?" (SEQ ID NO: 2).

Para medir los efectos de los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa sobre la trombopoyesis, se determinó el conteo de plaquetas para cada rata un día antes de la primera inyección programada, y se agrupó a los animales en siete grupos de acuerdo con su conteo inicial de plaquetas. Se inyectó intravenosamente a tres grupos de ratas una vez al día por siete días, con 0.1 , 10 y 1000 pg/kg del polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa C-terminalmente truncado, respectivamente. Se administraron a tres grupos adicionales las mismas dosificaciones de Y341A. Un grupo control recibió una inyección diaria de sólo regulador de pH (0.5 X PBS, DTT 2 mM), y un grupo control adicional fue inyectado diariamente con 90 pg/kg de trombopoyetina (R&D Systems, Minneapolis, MN).

La administración de los dos polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa resultó en una elevación notable en el conteo de plaquetas, comparable o superior a la observada en el grupo de trombopoyetina (véase la figura 19). Estos resultados muestran que los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa son capaces de estimular la trombopoyesis in vivo.

EJEMPLO 5 Los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa son quimioatraventes de megacariocitos Se cultivaron células M07e (DSMZ, Braunschweig, Alemania) en medio del RPMI-1640 complementado con FBS a 20% inactivado con calor y 10 ng/ml de IL-3 (R&D Systems, Minneapolis, MN). Se mantuvo a las células a una densidad de 2x105 a 1x 06/ml, y se usó medio del RPMI-1640 con BSA a 0.1 % como regulador de pH de migración. Antes de la prueba de migración, las células fueron despojadas del suero por 30 minutos en regulador de pH de migración, y cargadas con 8 pg/ml de calceína AM (Invitrogen, Carlsbad, CA).

Las células se centrifugaron a 200 g por 5 minutos sin freno, y se lavaron una vez con regulador de pH de migración para remover la calceína AM libre. Se ajustó la densidad de células a 1x107/ml, y se añadieron 100 µ? a inserciones de filtro de poro de 8.0 pm transcavidad de 6.5 mm (Costar, Cambridge, MA). 600 µ? de regulador de pH de migración que contenía PBS, una quimiocina control o los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa se añadieron a la cámara inferior, y se dejó que las células migraran por 4 a 16 horas (para el tiempo de migración de 16 horas, se tiñó a las células después de la migración). Las células que migraron hacia la cámara inferior se colectaron y se resuspendieron en 100 µ? de PBS, se transfirieron a una placa de Greiner opaca de 384 cavidades, y se hizo el conteo de las mismas por fluorescencia en un lector de placa. La figura 20 muestra que los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa estimulan la migración de los megacarioblastos MO7e.

EJEMPLO 6 Los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa promueven la adhesión de las células a las monocapas endoteliales, estimulando la expresión de VCAM-1 Se puso a prueba la capacidad de los polipéptidos de YRS para estimular la adhesión de células THP-1 a monocapas endoteliales de células HUVEC-2. Se cultivaron células HUVEC-2 (BD Biosciences, San José, CA) en medio EGM-2 (Lonza, Allendale, NJ), y se usaron antes de que alcanzaran 10 pasajes. Se cultivaron células THP-1 (ATCC, Manassas, VA) en medio del RPMI-1640 complementado con FBS a 10% inactivado con calor, y se mantuvieron a una densidad de 2-4x105/ml. Las células se sembraron a aproximadamente 1x104 células/cavidad en placas opacas de 96 cavidades recubiertas de fibronectina (10 \ig/m\, 2 horas a 37°C).

Se cultivaron células HUVEC-2 hasta que se formara una monocapa, y entonces fueron estimuladas durante la noche en medio EGM-2 con PBS, IL-1 ß o los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa. Se colectaron células THP-1 , y se incubaron por 30 minutos en medio del RPMI-1640 libre de suero conteniendo BSA a 0.1 % y calceína AM (6 µ?/ml). Las células se lavaron entonces en medio del RPMI-1640 libre de suero conteniendo BSA a 0.1 %, y se resuspendieron a una densidad de 1.5x105 células/ml en medio del RPMI conteniendo FBS a 10%. Se añadieron 100 µ? de células THP a la monocapa de células HUVEC, y se incubaron por 15 minutos. Las células THP-1 no unidas se lavaron dos veces con PBS, y las células restantes fueron fijadas con formaldehído a 2%, y se hizo el conteo de las mismas por fluorescencia en un lector de placa.

La figura 21 muestra la adhesión de células fluorescentes THP-1 a una monocapa endotelial que ha sido tratada con los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa.

Se midió la expresión de las moléculas de adhesión en monocapas endoteliales después de la exposición a los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa. Se sembraron 1x104 células HUVEC-2 en una placa de 96 cavidades, y se cultivaron por 48 horas como se describió en el párrafo anterior. Polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa, diluidos en medio de crecimiento, se añadieron a las cavidades, y se incubaron por 16 horas. El medio de cultivo se removió, y las células fueron fijadas con 50 µ? de fijador Z (Anatech Ltd, Battle Creek, MI) por 15 minutos a temperatura ambiente. Las cavidades fueron bloqueadas subsiguientemente con 50 µ? de caseína por 1 hora, seguido de lavados múltiples (200 µ?) con PBS. Todos los reactivos subsiguientes fueron diluidos en caseína, y todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente. Se añadieron por 1 hora anticuerpos dirigidos contra VCAM-1 y E-selectina (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA). Las cavidades se lavaron entonces como se indicó anteriormente, y se añadió por 1 hora un anticuerpo secundario marcado con HRP (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA). Las cavidades se lavaron y se añadió el substrato para HRP. 15 minutos después, se añadió un volumen igual de ácido sulfúrico 2 M, y se determinó la absorbancia a 450 nm.

La figura 22 muestra un incremento en la expresión de VCAM-1 después de la estimulación de las células endoteliales con los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa.

EJEMPLO 7 Los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa estimulan la migración de las líneas de células 293 y CHO transfectadas con el receptor CXCR-2 Se pusieron a prueba los efectos de los polipéptidos de tirosil- ARNt sintetasa sobre la señalización de CXCR-2, midiendo la migración de células que expresan CXCR-2 en respuesta a dichos polipéptidos. Se mantuvieron células 293/CXCR-2 en medio DMEM complementado con FBS a 10% inactivado con calor, estreptomicina-penicilina a 1% y 800 pg/ml de geneticina, todos adquiridos de Invitrogen, Carlsbad, CA. Se usó medio DMEM con BSA a 0.1% como regulador de pH de migración. Antes de la prueba de migración, las células fueron privadas de suero por 30 minutos en regulador de pH de migración, centrifugadas a 200 g por 5 minutos y resuspendidas en regulador de pH de migración a una densidad final de 1x106 células/ml. Se añadieron 100 µ? a inserciones de filtro transcavidad de 6.5 mm (Costar, Cambridge, MA), y 600 µ? de regulador de pH de migración que contenía una quimiocina control, los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa o el regulador de pH, se añadieron sólo a las cámaras inferiores de la placa. Se dejó que las células migraran por 4 horas, y las células restantes en la cámara superior (inserciones de filtro transcavidad) se removieron con un hisopo de algodón. Las inserciones del filtro se transfirieron entonces a una nueva placa de 24 cavidades que contenía 500 µ? de regulador de pH de disociación de células (Invitrogen, Carlsbad, CA) y 12 pg/ml de calceína AM (Invitrogen, Carlsbad, CA). Después de 1 hora de incubación a 37°C, las células se colectaron y se resuspendieron en 100 µ? de PBS, se transfirieron a una placa de Greiner opaca de 384 cavidades, y se hizo el conteo de las mismas por fluorescencia en un lector de placa.

Se mantuvieron células CHO-K1/CXCR-2 en medio F12 complementado con FBS a 10% inactivado con calor, penicilina-estreptomicina-glutamina a 1% y 800 pg/ml de geneticina. Se usó medio F12 con BSA a 0.5% como regulador de pH de migración. Antes de la migración, las células fueron privadas de suero por 30 minutos en regulador de pH de migración, colectadas usando regulador de pH de disociación de células, centrifugadas a 200 g por 5 minutos, y resuspendidas en regulador de pH de migración a una densidad final de 1x106 células/ml. Se añadieron 100 µ? a inserciones de filtro transcavidad de 6.5 mm, y 600 µ? de regulador de pH de migración que contenía una quimiocina control, los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa o regulador de pH se añadieron sólo a las cámaras inferiores de la placa. Se dejó que las células migraran por 3 horas, y las células restantes en la cámara superior (inserciones de filtro transcavidad) se removieron con un hisopo de algodón. Las inserciones del filtro se transfirieron entonces a una nueva placa de 24 cavidades que contenía 500 µ? de PBS y 12 pg/ml de calceína AM. Después de 30 minutos de incubación a 37°C, los filtros se transfirieron de nuevo a una nueva placa de 24 cavidades que contenía 500 µ? de tripsina libre de rojo de fenol. Después de 2 a 5 minutos de incubación, las células separadas se colectaron y se resuspendieron en 100 µ? de PBS, se transfirieron a una placa de Greiner opaca de 384 cavidades, y se hizo el conteo de las mismas por fluorescencia en un lector de placa.

La figura 23 demuestra la capacidad de los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa para inducir la migración de células transfectadas con CXCR-2.

EJEMPLO 8 Los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa estimulan la migración de células polimorfonucleares (PMN) Para poner a prueba los efectos de los polipéptidos de YRS sobre la migración de células PMN, se purificaron granulocitos humanos de sangre periférica humana fresca usando el kit de enriquecimiento de granulocitos humanos RosetteSep® (StemCell Technologies, Vancouver, BC), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se usó medio del RPMI libre de suero complementado con FBS a 0.5% como regulador de pH de migración. Se resuspendieron 4 x 107 células en 1 mi de regulador de pH de migración, y se incubaron por 30 minutos con 8 µ? de una solución de 1 mg/ml de calceína AM (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se colectaron las células, se centrifugaron a 200 g por 5 minutos sin freno, se lavaron una vez con regulador de pH de migración, y se resuspendieron en el mismo regulador de pH a una densidad final de 1x107/ml.

Se añadieron 100 µ? a inserciones de filtro transcavidad de 6.5 mm (Costar, Cambridge, MA), y 600 µ? de regulador de pH de migración que contenía una quimiocina control, los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa o regulador de pH, se añadieron sólo a las cámaras inferiores de la placa. Se dejó que las células migraran por 45 minutos en la incubadora, y las células que migraron hacia la cámara inferior se colectaron, se resuspendieron en 100 µ? de PBS, se transfirieron a una placa de Greiner opaca de 384 cavidades, y se hizo el conteo de las mismas por fluorescencia en un lector de placa.

La figura 24 muestra la curva de migración en forma de campana observada típicamente con las quimiocinas. Los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa indujeron una migración bifásica de PMN a bajas concentraciones pM y a mayores concentraciones µ?.

EJEMPLO 9 Los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa previenen la infiltración de neutrófilos en los pulmones después del desafio con lipopolisacárido (LPS) (ejemplo profético) La migración de neutrófilos del sistema circulatorio hacia los pulmones, está implicada en la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (véase, por ejemplo, R. A. Stockley, Chest 121: 151 S-155S, 2002). La expresión de CXCR-2 puede desempeñar una función en la migración de neutrófilos (véase, por ejemplo, Ríos-Santos et al., American Journal of Respiratory and Critica! Care Medicine 175: 490-497, 2007). Se desarrolló un modelo animal para poner a prueba la función de los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa en EPOC. Los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa se administran a animales intravenosamente a una concentración y a una frecuencia necesarias para lograr la desensibilización de los neutrófilos circulantes antes de, y durante, el desafío con un alérgeno (por ejemplo, entre 100 ng/kg y 5 mg/kg y, por ejemplo, a 12 horas, 1 hora pre-administración de LPS y 4 horas post-administración de LPS). Se somete entonces a los animales al desafío con el alérgeno (por ejemplo, instilación de LPS en los pulmones por medio de la vía de administración intranasal). Después de 4 a 8 horas, se somete a los animales a eutanasia, y se inserta un catéter traqueal para colectar muestras del lavado broncoalveolar (BAL) baldeando los pulmones con solución salina isotónica. Se analiza el fluido del BAL para el conteo total de células y la enumeración de células diferencial.

En este ejemplo, los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa son capaces de prevenir la migración de neutrófilos hacia el pulmón, en respuesta al desafío con LPS.

EJEMPLO 10 Los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa fijan firmemente las células progen iteras de megacariocitos en cultivos de células de médula ósea Para poner a prueba los efectos de los polipéptidos de YRS sobre células progenitoras de megacariocitos en cultivos de células de médula ósea, se evaluaron progenitores clonogénicos del linaje de megacariocitos (CFU-Mk; unidad de formación de colonias - megacariocitos) en medio libre de suero basado en colágena (MegaCult-C® 4950) complementado con concentraciones patentadas de citocinas (StemCell Technologies, Vancouver, BC). Se almacenaron células de densidad ligera de médula ósea humana normales (Lonza, Allendale, NJ) a -152°C hasta que se requirieran para la prueba. En el día del experimento, las células se descongelaron rápidamente a 37°C, el contenido del vial se diluyó en 10 mL de medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM) conteniendo suero de bovino fetal (FBS) a 2%, y se lavaron por centrifugación (1200 rpm por 10 minutos, temperatura ambiente). El sobrenadante se desechó, y la pella de células se resuspendió en un volumen conocido de IMDM conteniendo FBS a 2%. Se llevó a cabo un conteo de células (ácido acético glacial a 3%) y se evaluó la viabilidad de las mismas (prueba de exclusión con azul trípano).

Los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa (almacenados en glicerol a 50%/0.5X PBS/DTT 2 mM) fueron dializados en 0.5X PBS/DTT 2 mM por un total de 5 horas, con un cambio de regulador de pH después de 3 horas, para remover el glicerol. Después de diálisis, la muestra de regulador de pH y proteínas se filtró estéril, y se ajustó la concentración para compensar el incremento en volumen.

Se añadieron proteínas de prueba (polipéptidos de YRS) a tubos de medio libre de suero basado en colágena (MegaCult-C® 4950) complementado con citocinas (rhTpo, rhlL-3 y rhlL-6). Se iniciaron también cultivos control estándar (no conteniendo proteína de prueba), y cultivos control de solvente (no conteniendo proteína de prueba, pero concentraciones equivalentes de regulador de pH). Se añadieron entonces células de médula ósea a cada tubo de medio, para dar una concentración final de 1 x 105 células por portaobjetos. Se añadió entonces colágena de bovino, los tubos se sometieron a acción de remolino, y el contenido se dispensó en portaobjetos de doble cámara por triplicado. Todos los cultivos se incubaron por 10 a 12 días a 37°C, C02 a 5%.

Después de incubación, los cultivos se evaluaron microscópicamente para la formación de colonias antes de la deshidratación y la fijación del portaobjetos. Mediante el uso de un protocolo de tinción de anticuerpos para detectar la expresión de GPIIa/lllb (CD41), las colonias en el portaobjetos se tiñeron usando un sistema de detección de fosfatasa alcalina como se describe en el StemCell Technical Manual, "Assays for the Quantitation of Human and Murine Megakaryocyte Progenitors", sección 7, cita incorporada en su totalidad en la presente como referencia. El número de colonias fue calificado y evaluado por personal capacitado de StemCell. Se dividió a las colonias en las siguientes categorías, con base en su tamaño y morfología: i) CFU-Mk (2-20) - la pequeña colonia megacariocítica derivada de esta célula progenitora más madura contiene 2 a 20 células; ii) CFU-Mk - la colonia megacariocítica del medio derivada de esta célula progenitora más primitiva contiene 21 a 49 células, y iii) CFU-Mk (>50) - la colonia megacariocítica grande derivada de esta célula progenitora más primitiva restringida en linaje contiene >50 células.

Las figuras 25A-25C muestran el impacto de los polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa sobre los progenitores más primitivos restringidos en linaje (estimulación) (figura 25A), y sobre los progenitores más maduros (inhibición) (figuras 25A y 25B).

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1- Un medicamento, que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, para su uso en el tratamiento o reducción del riesgo de que se desarrolle trombocitopenia en un sujeto, o para incrementar o mantener el conteo de plaquetas en un sujeto.

2.- El uso de una composición que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en la fabricación de un medicamento para incrementar el conteo de plaquetas en un sujeto.

3. - El uso de una composición que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en la fabricación de un medicamento para tratar o para reducir el riesgo que se desarrolle trombocitopenia en un sujeto.

4. - El uso de una composición que comprende una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en la fabricación de un medicamento para estimular la trombopoyesis en un sujeto.

5. - El uso de una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en la fabricación de un medicamento para mantener el conteo de plaquetas en un sujeto.

6. - El uso de una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en la fabricación de un medicamento para estimular la proliferación, migración y/o diferenciación de megacariocitos en un sujeto.

7. - El uso de una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en la fabricación de un medicamento para estimular la proliferación de neutrófilos en un sujeto.

8. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el sujeto tiene, o está en riesgo de que tenga, una enfermedad o condición asociada con un conteo disminuido o reducido de plaquetas.

9. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el sujeto tiene un conteo de plaquetas de aproximadamente 150,000/mm3 o menor.

10. - El medicamento o uso de la reivindicación 8, en donde la enfermedad o condición asociada con un conteo disminuido o reducido de plaquetas, se selecciona de hemorragia, epistaxis, hiperesplenismo, hipotermia, infección por el virus de Epstein-Barr, mononucleosis infecciosa, síndrome de Wiskott-Aldrich, ingestión materna de tiazidas, trombocitopenia amegacariocítica congénita, síndrome de radio ausente en trombocitopenia, anemia de Fanconi, síndrome de Bernard-Soulier, anomalía de May-Hegglin, síndrome plaquetario de Grey, síndrome de Alport, rubéola neonatal, anemia aplásica, síndrome mielodisplásico, leucemia, linfoma, tumor, cáncer de médula ósea, deficiencia nutricional, exposición a radiaciones, insuficiencia hepática, sepsis bacteriana, sarampión, fiebre del dengue, infección por VIH o SIDA, premadurez, eritroblastosis fetal, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), ITP materna, síndrome hemolítico-urémico, coagulación intravascular diseminada, púrpura trombocitopénica trombótica (TTP), púrpura posttransfusión, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, trombocitopenia aloinmune neonatal, hemoglobinuria nocturna paroxismal, infección por virus de la hepatitis C (HCV), trombocitopenia inducida por medicación y trombocitosis inducida por quimioterapia (CIT).

11.- El medicamento o uso de la reivindicación 8, en donde la enfermedad o condición asociada con un conteo disminuido o reducido de plaquetas, es inducida por una medicación o fármaco.

12.- El medicamento o uso de la reivindicación 11 , en donde la medicación o fármaco se selecciona de agentes quimioterapéuticos, agentes antiinflamatorios no esferoidales, sulfonamidas, vancomicina, clopidogrel, inhibidores de glucoproteína llb/llla, interferones, ácido valproico, abciximab, linezolid, famotidina, mebeverina, bloqueadores de histamina, agentes alquilantes, heparina, alcohol, antibióticos y agentes quimioterapéuticos.

13.- El medicamento o uso de la reivindicación 12, en donde el agente quimioterapéutico se selecciona de cisplatino (CDDP), carboplatino, procarbazina, mecloretamina, ciclofosfamida, camptotecina, ifosfamida, melfalán, clorambucilo, busulfán, nitrosourea, dactinomicina, daunorrubicina, doxorrubicina, bleomicina, plicamicina, mitomicina, etopósido (VP16), tamoxifeno, raloxifeno, agentes de unión al receptor de estrógeno, taxol, gemcitabina, navelbina, inhibidores de farnesil-proteína transferasa, transplatino, 5-fluorouracilo, vincristina, vinblastina, metotrexato y temozolomida, y derivados de los mismos.

14.- El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende una tirosil-ARNt sintetasa de mamífero truncada en su extremo C-terminal.

15.- El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 1 a 50 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

16.- El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 50 a 100 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

17.- El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 100 a 150 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

18. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde por lo menos aproximadamente 150 a 200 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

19. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde por lo menos aproximadamente 200 a 250 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

20. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende una tirosil-ARNt sintetasa de mamífero truncada en su extremo C-terminal.

21. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 1 a 50 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

22. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 50 a 100 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

23. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 100 a 150 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

24. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde por lo menos aproximadamente 150 a 200 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

25. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde por lo menos aproximadamente 200 a 250 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

26. - El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa se selecciona de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; y (e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.

27.- El medicamento o uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa se selecciona de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; y (e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14.

28. - Una composición, que comprende un excipiente y/o vehículo fisiológicamente aceptable y una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en donde la composición es capaz de estimular la trombopoyesis y/o de incrementar el conteo de plaquetas en un sujeto.

29. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende una tirosil-ARNt sintetasa de mamífero truncada en su extremo C-terminal.

30. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 1 a 50 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

31. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 50 a 100 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

32. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 100 a 150 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

33. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde por lo menos aproximadamente 150 a 200 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

34. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde por lo menos aproximadamente 200 a 250 residuos de aminoácido están truncados de su extremo C-terminal.

35. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende una tirosil-ARNt sintetasa de mamífero truncada en su extremo N-terminal.

36. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 1 a 50 residuos de aminoácido están truncados de su extremo N-terminal.

37. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 50 a 100 residuos de aminoácido están truncados de su extremo N-terminal.

38. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14, en donde por lo menos aproximadamente 100 a 150 residuos de aminoácido están truncados de su extremo N-terminal.

39. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde por lo menos aproximadamente 150 a 200 residuos de aminoácido están truncados de su extremo N-terminal.

40. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8 ó 10, en donde por lo menos aproximadamente 200 a 250 residuos de aminoácido están truncados de su extremo N-terminal.

41 . - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa se selecciona de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2, en donde la alanina en la posición 341 no es sustituida con una tirosina; y (e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2.

42.- La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa se selecciona de: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 90% idéntica' a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (c) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; (d) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 98% idéntica a la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14; y (e) un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 1 , 2, 3, 6, 8, 10, 12 ó 14.

43. - La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque comprende además un segundo polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en donde los dos polipéptidos de tirosil-ARNt sintetasa forman un dímero.

44. - La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada además porque el dímero es un homodímero.

45. - La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el dímero es un heterodímero.

46. - La composición de conformidad con la reivindicación 45, caracterizada además porque el heterodímero comprende un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa de longitud completa y un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa truncado.

47.- La composición de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque comprende además un polipéptido heterólogo, en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa y el polipéptido heterólogo forman un heterodímero.

48.- Una composición que comprende un excipiente y/o vehículo fisiológicamente aceptable y una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa quimérico, en donde el polipéptido quimérico comprende dos o más fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en donde los dos o más fragmentos comprenden por lo menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 42, en donde los dos o más fragmentos son enlazados para formar un polipéptido quimérico, y en donde el polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa quimérico es capaz de estimular la trombopoyesis y/o de incrementar el conteo de plaquetas en un sujeto.

49. - Una composición que comprende un excipiente y/o vehículo fisiológicamente aceptable y una concentración trombopoyéticamente efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa quimérico, en donde el polipéptido quimérico comprende (a) uno o más fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en donde los uno o más fragmentos comprenden por lo menos 10 aminoácidos contiguos de un polipéptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 42; y (b) uno o más polipéptidos heterólogos, en donde los uno o más fragmentos de (a) y los uno o más polipéptidos heterólogos de (b) son enlazados para formar un polipéptido quimérico, y en donde el polipéptido quimérico es capaz de estimular la trombopoyesis y/o de incrementar el conteo de plaquetas en un sujeto.

50. - Un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, que se une específicamente a un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 28 a 49.

51. - Un método para identificar o caracterizar un polipéptido de YRS en una muestra, que comprende: (a) poner en contacto una muestra biológica previamente obtenida de un sujeto con un anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, de conformidad con la reivindicación 50; y (b) detectar la presencia o ausencia de unión específica por el anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno, a la muestra biológica, identificando o caracterizando de esta manera el polipéptido de YRS en la muestra.

52.- Una composición que comprende un polinucleótido aislado, en donde el polinucleótido se selecciona de: (a) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos por lo menos 80% idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11 , 13 ó 15; (b) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos por lo menos 90% idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11 , 13 ó 15; (c) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos por lo menos 95% idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11 , 13 ó 15; (d) un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos por lo menos 98% idéntica a la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11 , 13 ó 15; y (e) un polinucleótido que comprende la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 4, 7, 9, 11 , 13 ó 15, en donde el polinucleótido codifica para un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa que es capaz de estimular la trombopoyesis y/o de incrementar el conteo de plaquetas en un sujeto.

53.- Un vector que comprende el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 52.

54.- Una célula hospedera que comprende el vector de conformidad con la reivindicación 53.

55. - Un método para estimular la proliferación y/o diferenciación de células progenitoras de megacariocitos tempranas, que comprende incubar un cultivo de células madre hematopoyéticas con un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa por un tiempo suficiente para permitir la proliferación de las células progenitoras de megacariocitos tempranas, estimulando de esta manera la proliferación y/o diferenciación de células progenitoras de megacariocitos tempranas.

56. - El método de conformidad con la reivindicación 55, caracterizado además porque el método se lleva a cabo ex vivo o in vitro.

57.- El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el cultivo se obtiene de médula ósea.

58.- El método de conformidad con la reivindicación 56, caracterizado además porque el cultivo se obtiene de sangre del cordón umbilical.

59.- Un método para estimular la migración de una célula que expresa CXCR-2, que comprende poner en contacto la célula con un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, estimulando de esta manera la migración de la célula que expresa CXCR-2.

60. - El método de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado además porque el paso de puesta en contacto de la célula ocurre in vitro o ex vivo.

61. - El uso de una composición que comprende una concentración efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en la fabricación de un medicamento para estimular la migración de una célula que expresa CXCR-2 en un sujeto.

62. - El uso de una concentración efectiva de un polipéptido de tirosil-ARNt sintetasa, en la fabricación de un medicamento para reducir la inflamación pulmonar y/o sus síntomas en un sujeto.

63. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, en donde el sujeto tiene una enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC).

64. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 62, en donde el medicamento es efectivo para lograr la desensibilización de neutrófilos circulantes a un alérgeno.